KR20070062945A - 고분자량의 ｐｅｇ-유사 화합물을 포함하는 치료학적수송 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경상피 경로를 통하여 단백질 치료제를 함유하는 광범위한 화학 치료제 및 생물학적 치료제를 수송하기 위한 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 치료학적 화합물과 함께 사용하기 위한 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜-유사(HMW PEG-유사) 화합물을 포함한다. 임의로, 시스템은 덱스트란과 같은 보호 중합체 및/또는 L-글루타민과 같은 필수 병원균 영양분으로 보충한 하나 또는 그 이상의 HMW PEG-유사 화합물과 하나 또는 그 이상의 치료제를 함유하는 조성물을 포함한다. 단독으로 투여했을 때, HMW PEG-유사 화합물은 또한 치료학적 이점을 제공한다. 본 발명은 또한 HMW PEG-유사 화합물의 투여를 모니터하는 방법 뿐만 아니라 상피성 질환, 장애 또는 증상(예를 들어, 장내 병원균에 기인한 장-유도 패혈증 발병 위험이 있는 상피)을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.

고분자량의 폴리에틸렌 글리콜-유사(HMW PEG-유사) 화합물, 덱스트란, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 장 -유도 패혈증, 락토바실러스 GG(Lactobacillus GG)

Description

고분자량의 ＰＥＧ-유사 화합물을 포함하는 치료학적 수송 시스템{THERAPEUTIC DELIVERY SYSTEM COMPRISING A HIGH MOLECULAR WEIGHT PEG-LIKE COMPOUND}

연방 정부는 국립건강연구소로부터 허여 번호 제 DK47722 호, 제 DK42086 호, 제 T32 GM07019 호 및 제 K08 DK064840-01 호에 따라 본 발명에서 자신의 권리를 주장할 것이다.

본 발명은 인체와 같은 포유동물에게 치료학적 화합물 및 치료학적 조성물을 수송하거나 투여하기 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.

건강관리는 현대 사회 및 개인들에게 끊임없이 향상하는데 소요된 상당한 돈과 노력과 함께 가장 근본적인 관심사 중의 하나임이 틀림없다. 이러한 결과로 선진국에서는 인간을 포함하여 다른 생명체의 하나의 고통으로 확인된 거대한 수의 질환, 장애 및 증상을 치료하기 위해 점점 증가하는 다양한 치료학적 화합물을 제공하는 방법이 꾸준히 향상되어 왔다. 건강에 관한 우리의 생각이 증가함에 따라, 건강 전문 관리사는 건강 관리를 필요로 하는 생명체에 부여되는 제한점들을 점차적으로 인지하게 되었다. 예를 들어, 포유동물은 내부 기관계, 기관 및 조직, 각각의 특징적인 크기, 위치 및 조직화를 갖는다. 이러한 복잡한 내부 해부학은 세포에 유효량의 활성 치료제를 수송하는 능력을 제한하게 된다. 건강한 세포 및 경제 상의 해로운 영향은 일반적으로 다량의 치료제의 전신성 전달을 제어한다. 따라서, 많은 노력은 치료제 전달을 목표로 한 연구를 개발하는데 많은 공헌을 하였다. 현재, 이러한 연구들은 아직도 다목적이며 비용 효율적인 치료학적 화합물의 효과적인 약물표적화를 유도해야 한다. 또한, 표적화된 약물 수송에 관한 많은 연구들은 치료하려는 개체의 체적 내에서 약물의 표적에 도달해야 하는 상기 약물들의 내부 이동경로에 의해 부여되는 위험 등을 제기하지 않았다. 적절하게 약물이 표적화되었을 때 조차도, 불안정한 약물은 혈류, 위장관, 림프계 및 신체의 세포외 공간 내에서 효능을 상실하게 된다.

많은 치료제, 특히 단백질-기저 치료제인 경우에, 치료제 보호를 위한 기본적인 형태는 생체내에서 활성화되는 보다 안정한 약물 전구체 화합물을 수송하거나 또는 치료제를 함유한 용액의 pH 를 안정화시킴으로써 보호하게 된다. 약물 전구체 연구는 단계별 기초에 근거하여 후보 화합물을 확인하는데 비용이 많이 들며, 예측불가능한 연구를 수반한다. 실제적인 치료제를 안정화시키는 것(예를 들어, pH 안정화)은 치료하려는 유기체의 생체내 환경과 양립가능한 다수의 완충용액과 함께, 다양한 완충계의 개발을 유도하였다. 안정화는 또한 소의 혈청 알부민, 카제인 등과 같은 안정화되는 화합물의 함유물(inclusion)에 의해 용이해졌다. 그러나, 이러한 연구들은, 안정화제의 첨가로 비용이 추가되지만, 특정 치료제와 양립가능하고 효과적인 완충용액의 개발을 필요로하며 안정화제가 바람직한 치료학적 활성도를 저해하지 않거나 또는 그밖의 다른 유해한 결과(예를 들면, 면역원성)를 갖지 않는다는 연구를 필요로 한다.

안정화제의 또다른 유형은 단백질 치료제와 같은 치료제에 공유결합되는 것이다. 예를 들어, 단백질에 폴리에틸렌글리콜의 분자(예를 들어, 1-20 kD, 일반적으로 3-5 kD)의 공유결합을 통한 단백질의 폴리에틸렌글리콜화(PEGylation)는 단백질 치료제의 안정성을 향상시킨다고 보고되었다. Cantin et al., Am. J. 27 : 659-665 (2002) ; Specialty Chemicals Magazine, news article ID 7430 (March 25, 2004) ; Goldenberg, P&T 27(12) : 619-621 (2002). 그러나, 이러한 약제는 기술적 기술을 필요로하고, 치료제의 비용을 가중시키며 생체내 유해한 제 2 결과를 유도하지 않으면서 치료학적 활성도가 충분히 유지되는 것을 나타내는 신중한 시험을 필요로 한다. PEG(3-5 kD, 예를 들어, GoLytely^®)와 같은 안정화된 화합물은 또한 치료제를 함유하는 용액에 사용되어 왔다. GoLytely^®(3,340 kD)는 또한 그 자체가 예를 들어, 완화제(laxative)로 사용되어 왔다. 저분자량의 PEG(예를 들어, 3-12 kD)의 첨가로 의약품 사회에서 추구해오고 있는 결과를 항상 성취하는 것은 아니다. 따라서, 치료제-함유 용액에 저분자량의 PEGs(LMW PEGs)의 첨가는 추가적인 비용을 포함하고 상기 PEG 의 효능과 비-독성을 확인하기 위해 시험을 해야하며 신규한 치료제에 PEG 사용을 확장하는데 있어 필요한 다용도성이 결여되어 있다.

고분자량의 PEG 조성물(예를 들어, 20 kD)에 관하여, Hauet et al., kidney Int. 62(2) : 654-667 (2002)에는 이식 전에 신장 공여체를 보존하기 위해 20 kD PEG 를 함유한 용액을 사용하여 국소빈혈/재관류손상을 감소시킨다고 보고되어 있다. 그러나, 20 kD PEG 용액을 생체내 투여하지 않았다. HMW PEG 는 또한 생분해가능한 나노구(nanosphere)를 형성하는데 사용하기 위한 디-블록 중합체를 합성하기 위해 소수의 생체적합한 화합물 중 어느 하나에 공유결합되었다. Gref et al., Science 263 : 1600-1603 (1994) 참조하라. 나노구는 생체내 사용을 고려할 수 있지만, 이러한 나노구는 단지 상기 나노구가 확실하게 생분해가능함이 요구되는 생체적합한 화합물에 공유결합된다. 다른 생체내 잠재적 분자 (예를 들어, 리포솜, 점착성 플라스틱 다당류 히드로겔)와 같은 나노구는 치료되는 유기체 생체내 환경으로부터 다소 제거되며 담체의 내부에서 치료제를 격리시킴으로써 상기 치료제에 안정성 및 보호의 수단을 제공한다. 그러나, 안정화된 치료제에 관한 담체-기저 연구는 치료제-함유 담체의 제조 및 수송에서의 상당한 비용 뿐만 아니라 반드시 벌충해야하는 상당한 개발 비용을 포함한다. 담체-기저 연구는 또한 치료제 자체의 모든 표적(targeting) 기능을 상실하며 상기 표적 문제점은 이러한 기술들을 해결하지 못했다. 더욱이, 담체의 사용은 치료학적 내용물(cargo)이 수송되어서야 비로소 제거되거나 또는 분해되도록 설계되어야만 하는 담체 처리의 부가적인 문제가 부가된다. 따라서, 효능을 보존하고 안정한 약물이 치료학적 가치를 상실하기 전에 활동 부위에 화합물이 도달하도록 가능케하는 치료제의 수송에 관한 다양한 연구가 본 분야에 끊임없이 필요하다.

대부분의 경우에, 예를 들어, 활성 치료제의 수송으로 유기체 내에서 기능부전(예를 들어, 질환, 장애 또는 증상)을 치료하고, 개선시키거나 또는 예방하고자 한다. 암, 세포 변질성 질환(예를 들어, 알츠하이머병) 및 세균성 패혈증은 대표적인 기능부전의 형태이며, 이는 대다수의 건강에 관한 관심사의 수준을 야기시킬 수 있다. 이론에 의해 결부된 희망 없이, 기능부전 이전에 세포의 인접한 환경의 안정화로 상기 질환, 장애 또는 증상의 동화작용을 지연시키고, 개선시키거나 또는 예방하는데 있어 양성의 치료학적 효과를 가질 것이다. 따라서, 본 분야에서는 이전에 언급한 활성 치료제를 수송하기 위한 다목적의 시스템 이외에도, 기능부전의 위험이 있는 세포의 생체내 환경을 안정화시키는 조성물, 방법 및 시스템이 필요하다.

미생물-매개 상피성 질환 또는 비정상적인 증상은 세계적인 건강관리 시스템에 부담을 주어 인간 및 동물의 건강을 현저히 위협하고 있다. 상기 질환의 한 예인, 장-유도 패혈증(gut-derived sepsis)은 다양한 질환, 장애 또는 고통(예를 들어, 화상, 신생아 소장결장암, 중증의 호중구 감소증, 염증성 장질환 및 이식 후의 기관 거부반응) 중 어느 하나를 앓고 있는 인체 환자와 같은 유기체 사이에서의 주요 사망 원인이 된다. 소화관 병원소는 예를 들어, 위독하여 병원에 입원한 환자에게서 세균성-매개 패혈증의 잠재적인 사망의 병소가 되고 있다. 장내 상피성 장벽의 조절 기능을 혼란시키는 슈도모나스속, 예를 들어 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)와 같은 미생물 병원균의 능력은 장-유도 패혈증을 야기할 수 있는 기회(opportunistic) 유기체 사이에서의 규정된 특징일 것이다. 다수의 이러한 감염증에서, 슈도모나스 애루지노사가 원인이 되는 병원균으로 확인되었다. 현저하게 소화관이 슈도모나스 애루지노사와 같은 기회 병원균이 전이증식하는데 제 1 부위로 확인되었다.

장-유도 패혈증과 같은 미생물-매개 상피성 질환의 예방 또는 치료에 관한 통상적인 치료학적 연구는 불완전한 성공이었다. 항생물질-기저 연구는 남아있는 장내 세균총에 충격을 주지 않는 정도로 장내 병원균에 항생물질을 사용하는데 어려움으로 인해 제한되었다. 게다가, 슈도모나스 애루지노사로 예시되어 있는 대다수의 장내 병원균은 항생물질 도전(사용)에 종종 저항성을 갖게 되어 예방 또는 치료에 관한 연구는 비용이 비싸며, 현재 진행중이며 불완전한 상태이다. 문제들은 또한 면역요법 연구를 제한하였다. 특히, 슈도모나스 애루지노사와 같은 대다수의 장내 병원균은 상기 연구들이 최소한의 유효함을 부여하는 면역회피적(immunoevasive)이다.

장-유도 패혈증과 같은 질환의 예방 또는 치료에 관한 또다른 연구는 장내 세척(intestinal lavage)이다. 지난 몇년 동안 다양한 임상 및 실험 환경을 통해 장-유도 패혈증을 치료하는데 있어 PEG 가 몇몇 가망성을 보여주었음을 시사하는 몇몇 일화와 함께, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액을 사용하여 장내 세척을 해왔다. 이러한 용액에서 PEG 의 평균 분자량은 3,500 달톤이며 이 용액은 통상적으로 이용가능하다(예를 들어, Golytely). PEG 의 이러한 상대적인 저분자량(LMW) 용액이 장-유도 패혈증을 치료하거나 예방하는데 있어 치료학적 이점을 제공한다는 메커니즘은 공지되어 있지 않다. 일반적으로, 이러한 용액은 장-유 도 패혈증의 발병 위험이 있거나 이러한 패혈증을 앓고 있는 유기체의 소화관을 세척하거나 물로 씻어 내리는데 사용된다. 소화관에 이러한 LMW PEG 용액을 투여한 결과로서, 사용된 화합물의 분자량 및 농축 방법에 따라 치료하려는 장내 세균총 조성에 다양한 변화가 존재한다. 예를 들어, 약 20 % 보다 높은 PEG 의 농도를 갖는 용액은 외부 스트레스가 가해진 숙주의 소화관에서 잠재적으로 보호 미생물을 제거하게 되어 미생물 살생 작용을 하게된다. 또한, 저분자량 PEG 의 용액은 특정 유기체를 보존함에도 불구하고, 특정 유기체의 독성(virulence) 용량을 약화시키는데 있어 이들의 효능을 상실할 수 있다. 그러므로, 미생물 또는 인접한 미생물을 살생하지 않으면서 미생물의 독성 발현(미생물에 해로운 특성)을 저해하여 장내 미생물총(microflora)의 천연 생태계 보존의 이점을 제공하게 되는 용액이 본 분야에 필요하다. 예를 들어, 천연 세균총 조성의 보존은 기회 병원균에 대한 경쟁(competition)을 제공하며 그렇지않으면 장내 전이증식(colonize)할 수 있다.

세균총 조성에서의 변화와 동시에 유기체의 생리학에서도 변화가 있다. 이러한 생리학적 변화들은 락테이트 탈수소효소 농도와 같은 모든 다수의 특징적인 효소학적 활성도를 검정함으로써 모니터될 수 있다. 따라서, 장을 LMW PEG 로 처리하게 되면 치료된 유기체의 생리학에 있어서 예측할 수 없는 현저한 변화가 생성되어 잠재적으로 치료된 유기체의 건 강과 웰빙에 대하여 유해하며 장기간의 결과가 생성된다. 더욱이, 이러한 치료는 병원에 입원한 인체 환자와 같은 중병(critically ill)의 유기체에서 광범위한 장내 공간 형태에서 생리학적으로 바람직하지 않은 반응을 야기한다.

따라서, 치료된 유기체의 생리학의 현저한 변경을 통하여 다른 합병증의 가능성 없이 이점들을 수득하기 위한 방법과 함께, 미생물-매개 상피성 질환(예를 들어, 장-유도 패혈증) 및/또는 상기 질환과 관련된 징후를 예방하거나 치료하는데 효과적인 조성물을 제공하는 것이 또한 본 분야에 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 활성 치료제 수송 또는 활성 치료제 자체를 안정화시키는 환경을 제공하고, 미생물-매개 질환의 발병 위험이 있는 상피 표면이 특징적인 비정상적인 증상에 대한 효과적인 보호를 제공하는 고분자량(HMW)의 폴리에틸렌 글리콜-유사 조성물을 제공함으로써 본 분야에서 상기 전술한 요구들 중 적어도 하나를 만족시킨다. HMW PEG-유사 화합물에서 안정화된 수송에 적합한 치료제의 예로 소분자 치료제 뿐만 아니라 단백질 및 펩티드 치료제를 포함한다. 치료학적 이점을 제공하는 HMW PEG-유사 화합물로부터의 비정상적인 증상의 예로는 슈도모나스 애루지노사 를 포함하지만 이것으로 한정되지 않는 장내 병원균에 의한 장-유도 패혈증, 장내 세균총과 관련된 그밖의 다른 장내 장애/질환, 및 인간과 같은 포유동물의 상피 세포의 다양한 질환, 장애 및 증상을 포함한다. HMW PEG-유사 화합물의 예는 HMW PEG 이다. HMW PEG 는 장내 상피 표면과 슈도모나스 애루지노사와 같은 병원균과의 접촉을 저해하거나 예방한다. 게다가, 고분자량 PEG 는 정족수 인식(quorum sensing) 신호전달 네트워크를 포함할 수 있는 다양한 신호에 반응하는 병원균(예를 들어, 슈도모나스 애루지노사)에서 독성(virulence-미생물의 병원성 정도) 발현을 억제한다. 장내 병원균과 장내 상피 사이에서의 전염성 접촉면에서 저해하는 HMW PEG-유사 화합물(예를 들어, HMW PEG)의 능력은 장-유도 패혈증(예를 들어, 하기의 이화작용 스트레스)을 예방하거나 치료하기 위한 선택적 연구를 제공한다. 중요하게, HMW PEG-유사 화합물을 이용한 치료는 비용 효율이 높고 농업 가축류(예를 들어, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 닭, 칠면조, 오리, 거위 등), 애완동물 및 동물원 동물과 같은 다양한 유기체 뿐만 아니라 인체 환자에게 상대적으로 용이하게 수행된다.

본 발명의 한 양상은 라벨 포장 물질 및 상기 라벨 포장 물질 내에 함유된 유효량의 고분자량 폴리에틸렌 글리콜-유사(HMW PEG-유사) 화합물을 포함하는 제조물(an article of manufacture)을 제공하며, 상기 포장 물질은 HMW PEG-유사 화합물이 염증을 일으킨 상피 또는 장벽 기능장애를 포함하는 상피와 같은 비정상적인 상피 세포가 특징인 증상을 치료하고, 개선하거나 또는 예방하는데 사용될 수 있음을 나타내는 라벨 또는 사용설명서(package insert)를 포함한다. HMW PEG-유사 화합물은 다음과 같은 고분자량의 다양한 화합물일 것이다 : 양이온성 중합체, 폴리알칸, 폴리알켄 또는 폴리알킬렌 글리콜[예를 들어, HMW 폴리프로필렌 글리콜, HMW 폴리에틸렌 글리콜(HMW PEG) 또는 이의 혼합물], HMW 폴리메톡시 PEG 와 같은 HMW PEG 의 유도체, HMW 모노메톡시 PEG, HMW 폴리프로필렌 글리콜, 또는 이의 혼합물. 또한, HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기(예를 들어, 메톡시기), 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기, 또는 이의 혼합물과 같은 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 전술한 모든 화합물일 것이다. 제조물의 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알킬기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알킬기, 아릴기(예를 들어, 페닐기) 또는 이의 혼합물과 같은 링커를 더 포함할 것이다. 제조물은 또한 적어도 5 %(w/v) 또는 10 % 내지 20 %(w/v)의 농도로 존재하는 HMW PEG-유사 화합물과 함께, 수용액과 같은 용액에서 HMW PEG-유사 화합물을 포함할 것이다. 본 발명에 따른 HMW PEG-유사 화합물의 평균 분자량은 12,000 달톤보다 크거나, 또는 적어도 15,000 달톤이거나, 또는 15,000 달톤보다 크며, 20,000 달톤 미만이다.

청구범위 제 1 항에 따른 본원발명의 제조물의 라벨 포장 물질에 있어서, 라벨은 상피의 염증 또는 상피의 장벽 기능장애와 같은 비정상적인 상피 세포가 특징인 증상을 치료하고, 개선시키거나 또는 예방하기 위해 화합물을 투여하기 위한 지시사항(instructions)을 제공한다. 좀더 특별히, 본 발명의 상기 증상은 다음과 같은 증상으로 생각할 수 있다 : 장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상(burn injury), 상피에 화학적 접촉성 손상(chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태. 다음과 같은 증상 또한 포함할 것이다 : 백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애, 및 이의 혼합 및 조합 형태. 염증성 장질환의 치료, 개선 또는 예방하기 위한 제조물은 궤양성 대장염, 크론병 및 이의 혼합 형태를 치료하고, 개선시키거나 또는 예방하는데 유용할 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 치료제를 더 포함하는 상기한 제조물을 제공한다. 좀더 특별하게, 본 발명은 상피 세포의 질환, 장애 또는 증상을 치료하고, 개선시키거나 또는 예방하는데 유 용한 모든 치료제를 포함하며, 상기 치료제는 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : 프로바이오틱(probiotic) 미생물 제형, 적어도 하나의 프로바이오틱 미생물로부터 유도된 조성물, 진통성 화합물, 항-염증성 화합물, 면역계의 조절인자, 항생제, 항암제, 항궤양제, 성장 인자, 사이토카인, 단백질 호르몬, 트레포일(trefoil) 단백질 및 이의 혼합물. 치료제의 예로는 다음을 포함한다 : 5-아미노 살리실산염, 5-아미노 살리실산염 성분을 포함하는 화합물, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트 (methotrexate), 6-머캅토푸린, 사이클로스포린, 밴코마이신, 메트로니다졸, 세팔로스포린, 탁산, 탁산 성분을 포함하는 화합물, 캄토테신 (camptothecin), 캄토테신 성분을 포함하는 화합물, 5-플루오로우라실, 5-플루오로우라실 성분을 포함하는 화합물, 항-안드로겐 화합물, 항-에스트로겐 화합물, 상피세포 성장 인자, 장내 트레포일 인자(intestinal trefoil factor), 인슐린, 소마토스테틴, 인터페론 및 이의 혼합물. 몇몇 실시형태에서, 치료제는 다음을 포함한다 : 프로바이오틱 젖산균[probiotic lactic acid bacterium, 예를 들어, 락토바실러스 GG(Lactobacillus GG, LGG)], 스트렙토콕커스 살리바리우스 subsp.(Streptococcus salivarius subsp .), 스트렙토콕커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 액시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 델브루에키 subsp.(Lactobacillus delbrueckii subsp .), 락토바실러스 불 가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 비피도박테리아 롱검(Bifidobacteria longum), 비피도박테리아 인판티스(Bifidobacteria infantis) 또는 비피도박테리아 브레베(Bifidobacteria breve) 및 이의 복합물 또는 조합물(예를 들어, VSL#3), 또는 상기 모든 박테리아로부터 유도된 화합물이나 조성물.

본 발명의 다른 양상은 HMW PEG-유사 화합물 및 유효량의 치료제를 포함하는 조성물을 투여함을 포함하여 피실험자의 상피에 치료학적 조성물을 투여하는 방법을 기술하고 있다. 본 발명에 따른 제조물에 관하여, 본 발명의 치료 방법에 사용하기 적합한 치료제는 다음을 포함하지만 이것으로 한정하는 것은 아니다 : 프로바이오틱(probiotic) 미생물 제형, 적어도 하나의 프로바이오틱 미생물로부터 유도된 조성물, 진통성 화합물, 항-염증성 화합물, 면역계의 조절인자, 항생제, 항암제, 항궤양제, 성장 인자, 사이토카인, 단백질 호르몬, 트레포일(trefoil) 단백질 및 이의 혼합물. 치료제의 예로는 다음을 포함한다 : 5-아미노 살리실산염, 5-아미노 살리실산염 성분을 포함하는 화합물, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토푸린, 사이클로스포린, 밴코마이신, 메트로니다졸, 세팔로스포린, 탁산, 탁산 성분을 포함하는 화합물, 캄토테신 (camptothecin), 캄토테신 성분을 포함하는 화합물, 5-플루오로우라실, 5-플루오로우라실 성분을 포함하는 화합물, 항-안드로겐 화합물, 항-에스트로겐 화합물, 상피세포 성장 인자, 장내 트레포일 인자(intestinal trefoil factor), 인슐린, 소마토스테틴, 인터페론 및 이의 혼합물. 본 발명의 방법의 하나의 실시형태에서, HMW PEG-유사 화합물은 HMW PEG(예를 들어, HMW PEG 15-20 kD)이다. 치료제가 투여될 수 있는 상피는 다음을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다 : 장내 점막, 폐 점막, 비강 점막, 요로 점막, 식도 점막, 협측 점막 및 피부. 몇몇 실시형태에서, 치료제가 투여되는 피실험자는 인체와 같은 포유동물이다. 본 발명에서 고려된 모든 투여 방법은 다음을 포함하여 본 분야에 공지되어 있다 : 경구 투여, 직장 투여, 장내 세척, 국소 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 요도내 투여, 질(vaginal) 투여, 캐뉼라 삽입 및 보조 조절 호흡(assisted respiration) 또는 비보조 조절 호흡(unassisted respiration). 본 발명의 이러한 양상의 다양한 실시형태에서, 치료제는 단백질성 화합물이다. 본 발명의 방법은 또한 유효량의 PA-I 렉틴/부착인자(예를 들어, 슈도모나스 애루지노사 PA-I 렉틴/부착인자)의 투여를 포함할 것이며, PA-I 렉틴/부착인자의 투여는 특히 단백질성 치료제의 투여를 포함한 방법을 생각할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여함을 포함하여 피실험자의 상피의 미생물-매개 증상을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시 기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합 형태에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 이다. HMW PEG-유사 화합물은 적어도 10 % 및 20 % 미만의 HMW PEG-유사 화합물 (w/v)을 포함하는 수용액에 존재할 것이다. 피실험자는 인체와 같은 포유동물일 것이다. 상피는 장내 점막, 폐 점막, 비강 점막, 요로 점막, 질 점막, 식도 점막, 협측 점막 또는 피부일 것이다. 본 발명의 양상을 실행하는데 있어서, HMW PEG-유사 화합물이 투여될 수 있는 모든 경로는 다음을 포함하여 본 분야에 공지되어 있다 : 경구 투여, 직장 투여, 질 투여, 장내 투여, 국소 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 캐뉼라 삽입 및 보조 조절 호흡 또는 비보조 조절 호흡. 본 발명의 양상에 의해 치료 적합한 증상은 다음을 포함하지만 이것으로 한정하는 것은 아니다 : 장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상(burn injury), 상피에 화학적 접촉성 손상(chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태. 이와 관련된 양상에서, 본 발명은 다음과 같은 증상을 치료할 필요가 있는 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여하는 방법을 포함한다 : 백혈병, 림프종, AIDS, 건 선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애, 및 이의 혼합 및 조합 형태. 본 발명의 두 가지의 이러한 양상에서, HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합 형태에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 일 것이다. 미생물에 의해 유도된 것이든 아니든 간에 치료가능한 증상은 다음을 포함한다 : 장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상(burn injury), 상피에 화학적 접촉성 손상 (chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염 (pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염 (pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태. 특별히, 백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애 및 이의 혼합 형태와 같은 증상의 치료도 생각할 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여함을 포함하여 상기 언급한 모든 증상들 중에서 어느 하나의 징후를 개선시키는 방법을 제공하며, 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사 슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합 형태 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 이다.

본 발명의 또다른 양상은 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여함을 포함하여 증상을 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합 형태 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 이다. 본 발명은 장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상, 상피에 화학적 접촉성 손상, 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이들의 혼합 또는 조합 형태와 같은 증상들을 예방하는 방법을 생각할 수 있다.

본 발명의 또다른 양상은 다음과 같은 증상을 치료하기 위한 약제 제조시 상기 기재한 바와 같은 HMW PEG-유사 화합물의 용도에 관한 것이다 : 장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상, 상피 에 화학적 접촉성 손상, 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이들의 혼합 또는 조합 형태와 같은 증상들을 예방하는 방법을 생각할 수 있다. 특히 다음과 같은 면역 장애와 관련된 증상을 치료하기 위한 약제 제조시 유용한 화합물도 고려된다 : 백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화합요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애 및 이의 혼합 또는 조합 형태.

본 발명의 다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 유효량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 동물에게 투여함을 포함하는, 다음과 같은 질환 중에서 선택한 미생물-매개 질환의 발병 위험이 있는 상피 표면을 포함한 질환의 증상을 함유하는 비정상적인 증상이 있는 동물의 사망 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다 : 장-유도 패혈증, 화상, 신생아의 괴사성 소장결장염, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 염증성 장질환, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis) 및 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly). 적절한 동물로는 개, 고양이, 양, 염소, 소, 돼지 및 인체를 포함하지만 이것으로 한정하는 것은 아니다. 상기한 방법에서, PEG 의 평균 분자량은 바람직 하게 적어도 15,000 달톤이고, 바람직하게 5,000 내지 20,000 달톤, 또는 15,000 내지 20,000 달톤이다. 또한 PEG 의 평균 분자량은 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000 및 25,000 달톤이 바람직하다. 또한, PEG 는 5-20 % PEG, 바람직하게 10-20 % PEG(예를 들어, 10 % PEG)를 포함하는 수용액에 존재할 것이다. 본 발명의 방법의 한 실시형태에서, 증상은 장내의 슈도모나스 애루지노사 유기체의 존재와 연관되어 있으며 상기 슈도모나스 애루지노사의 세포막 보존성(integrity)은 검출가능할 정도로 변경되지 않았다. 본 발명의 방법의 또다른 실시형태에서, 슈도모나스 애루지노사의 성장 패턴은 검출가능할 정도로 변경되지 않았다.

본 발명의 다른 양상은 장과 같은 포유동물의 상피와 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 접촉시켜 장-유도 패혈증을 저해하는 방법이며, 여기에서 상기 PEG 의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이고, 바람직하게는 적어도 15,000 달톤이다. 이러한 방법의 한 실시형태에서, 포유동물의 장을 적어도 30 분 동안 PEG 와 접촉시켰다.

본 발명의 또다른 양상은 다음과 같은 방법을 포함한다 : 동물에게 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여함을 포함하는 상피의 병원균(예를 들어, 장내 병원균)에 PA-I 렉틴/부착인자 발현을 저해하는 방법 ; 동물에게 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여함을 포함하는 PA-I 렉틴/부착인자의 상피-유도(예를 들어, 장내 상피-유도) 활성을 저해하는 방법 ; 동물에게 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여함을 포함하는 상피의 병원균(예를 들어, 장내 병원균)의 C4-HSL-유도 형태학적 변화를 저해하는 방법 ; 동물에게 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여함을 포함하는 상피의 병원균(예를 들어, 장내 병원균)에 독성 발현을 감소시키는 방법 ; 동물에게 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여함을 포함하는 상피 표면과 미생물 독성 인자 (microbial virulence factor)와의 상호작용을 감소시키거나 예방하는 방법 ; 동물에게 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여함을 포함하는 병원성 정족수-인식 활성화(pathogenic quorum-sensing activation)의 형성을 예방함으로써 상피의(예를 들어, 장) 병인론을 개선시키는 방법 ; 및 폴리에틸렌 글리콜과 상피를 접촉시킴을 포함하는, 슈도모나스속(예를 들어, 슈도모나스 애루지노사)과 같은 박테리아와 척추동물의 상피(예를 들어, 장내 상피)와의 상호작용을 저해하는 방법. 본 발명의 이러한 모든 양상에서, PEG 의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이며 바람직하게 적어도 15,000 달톤이다.

본 발명의 또다른 양상은 폴리에틸렌 글리콜과 (장내) 상피층을 접촉시킴을 포함하는, 장내 상피층과 같은 포유동물의 상피층의 경상피 전기 저항(transepithelial electrical resistance, TEER)에서의 슈도모나스 애루지노 사-유도 감소를 저해하는 방법이며, 여기에서 상기 PEG 의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이며, 바람직하게 적어도 15,000 달톤이다. 바람직하게, PEG 의 평균 분자량은 15,000 내지 20,000 달톤이다. 바람직한 실시형태에서, 미생물(예를 들어, 슈도모나스 애루지노사)의 막의 보존성은 검출가능할 정도로 변경되지 않았다.

본 발명의 또다른 양상은 폴리에틸렌 글리콜과 장을 접촉시킴을 포함하는, 포유동물의 장과 같은 포유동물의 상피에 박테리아 세포의 부착을 저해하는 방법이며, 여기에서 상기 PEG 의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이며, 바람직하게 적어도 15,000 달톤이다. 이러한 방법과 함께, PEG 의 평균 분자량이 15,000 내지 20,000 달톤임이 바람직하다. PEG 는 5-20 % PEG 및 바람직하게 5-10 % PEG 를 포함하는 수용액에 존재할 것이다. 본 발명의 방법에 의해 부착을 저해하기 쉬운 전형적인 박테리아 세포는 슈도모나스 애루지노사와 같은 슈도모나스속이다.

본 발명의 또다른 양상은 폴리에틸렌 글리콜과 박테리아 세포를 접촉시킴을 포함하는 상기 박테리아 세포에서 PA-I 렉틴/부착인자의 발현을 감소시키는 방법이며, 여기에서 상기 PEG 의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이며, 바람직하게 15,000 달톤이며, 바람직하게 15,000 내지 20,000 달톤이다. 또한, PEG 는 5-20 % PEG 및 바람직하게 5-10 % PEG 를 포 함하는 수용액에 존재할 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은 포유동물의 장내 상피 세포 및 장내 박테리아 세포 중에서 선택한 세포에 부착되는 유효량의 화합물(예를 들어, PEG)을 투여하여 장-유도 패혈증, 화상, 신생아의 괴사성 소장결장염(NEC), 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 염증성 장질환, 장질환[예를 들어, 중병인(critically ill)], 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis) 및 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly) 중에서 선택한 미생물-매개 상피 질환을 나타내는 동물의 사망 가능성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 화합물은 국소해부학적 비대칭성 방법으로 세포에 부착되어 포유동물의 장내 상피세포와 박테리아 세포와의 상호작용을 저해한다. 바람직한 화합물은 표면활성물질이다. 본 발명의 방법의 하나의 실시형태에서, 화합물은 PEG 이고, PEG 의 평균 분자량은 적어도 15,000 달톤이 바람직하다. 본 발명의 방법의 다른 실시형태에서, 저해는 원자력 현미경(atomic force microscopy)으로 측정된다. 본 발명의 방법의 또다른 실시형태에서, 박테리아 세포는 장내 병원균이며 이러한 병원균의 성장 특성의 변형은 검출되지 않았다. 관련된 양상에서, 본 발명의 방법은 다음을 더 포함한다 : 동물의 장내로 유효량의 덱스트란 주입 및/또는 유효량의 L-글루타민, 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 덱스트란-코팅 부티르산, 하나 또는 그 이상의 프룩 토-올리고당, N-아세틸-D-갈락토사민, 덱스트란-코팅 만노스 및 갈락토스, 락툴로스(lactulose) 및 평형 완충용액(balancing buffer)과 안정화제(본 분야에 공지되어 있음)를 동물의 장내로 주입. 단일 조성물 형태로 함께 투여할 경우에, 다성분 단일-용액(multicomponent single-solution) 투여로 장내세균총 및 장의 장벽 기능의 붕괴(예를 들어, 다음의 심각한 이화작용의 스트레스, 수술적인 스트레스 및 외상의 스트레스가 발생한다)가 예상되는 소화관을 치료하고 완화시킬 것이다.

본 발명의 또다른 양상은 장내에 폴리에틸렌 글리콜을 투여하여 장-유도 패혈증과 같은 상피의 비정상적인 증상으로부터 기인된 모든 질환이나 증상, 또는 상기 비정상적인 증상의 특성과 관련있는 징후를 개선시키는 방법이며, 여기에서 상기 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이고, 바람직하게 적어도 15,000 달톤이며, 바람직하게 15,000 내지 20,000 달톤이다. PEG 는 5-20 % PEG 및 바람직하게 5-10 % PEG 를 포함하는 수용액에 존재할 것이다. 본 발명은 본원에 기재된 모든 질환이나 증상과 관련있는 징후를 개선시키는 것을 포함한다.

본 발명의 또다른 양상은 유선(mammary gland)의 상피 표면에 적어도 5,000 달톤 및 바람직하게, 적어도 15,000 달톤의 유효량의 폴리에틸렌 글 리콜을, 예를 들어, 국소 투여하여, 우유 생산량에 영향을 미치는 미생물-매개 질환의 발병 위험이 있는 상기 유선의 상피 표면 형태에 비정상적인 증상을 나타내는 동물에서 유즙분비 능력(lactating capacity)의 손실을 예방하는 방법이다. 동물의 예로는 양, 염소, 소, 돼지, 말 및 인체와 같은 포유동물을 포함한다. 이와 관련된 양상에서, 본 발명은 유선에 적어도 5,000 달톤 및 바람직하게 적어도 15,000 달톤의 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을, 예를 들어, 국소 투여하여, 우유 생산량에 영향을 미치는 유선의 상피 표면의 미생물-매개 질환이 특징인 동물에서 유즙분비 능력의 손실을 치료하는 방법을 제공한다. 관련된 또다른 양상에서, 본 발명은 동물에게 적어도 5,000 달톤 및 바람직하게 적어도 15,000 달톤의 유효량의 폴리에틸렌 글리콜을 투여하여 포유(수유) 중인 (nursing age) 동물의 미생물-매개 상피 질환의 발병을 예방하는 방법을 제공한다. 적절한 동물로는 인간, 가축, 애완동물 및 동물원의 동물과 같은 포유동물을 포함한다. 하나의 실시형태에서, PEG 는 본 분야에 공지된 모든 유아용 조제분유(infant formula)와 혼합된다.

관련된 본 발명의 양상은 유아용 조제분유 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 PEG 의 평균 분자량은 적어도 5,000 달톤이다. 또한, 두유를 기저로 한 조제분유(formulas based on soy milk) 뿐만 아니라 우유, 산양유 등과 같은 포유동물의 유즙 을 기저로 한 조제분유를 포함하여 본 분야에 공지된 모든 유아용 조제분유를 사용할 수 있다. 조제분유에는 또한 철분 강화를 포함하여 모든 비타민 및/또는 요소가 풍부할 것이다. 바람직하게, PEG 의 평균 분자량은 적어도 15,000 달톤이며, 유아용 또는 신생아용 조제분유의 재구성 또는 수화작용 시에, PEG 는 5-20 % 범위에 존재한다. 본 발명은 동물에게 유아용 조제분유 및 PEG 를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하여 상기 동물에게 영양분을 제공하는[바람직하게, 포유하는(nursing age)] 방법을 더 제공한다.

본 발명의 또다른 양상은 적어도 5,000 달톤, 바람직하게 15,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 및 적합한 아쥬반트, 담체 또는 희석제를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 관련된 양상에서, 조성물은 또한 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 덱스트란-코팅 부티르산, 하나 또는 그 이상의 프락토-올리고당, N-아세틸-D-갈락토사민, 덱스트란-코팅 만노스 및 갈락토스, 및 락툴로스 중에서 선택한 화합물 및 본 분야에 공지되어 있는 평형 완충용액 및 안정제를 함유한다.

본 발명의 추가적인 양상은 비정상적인 증상을 치료학적으로 처리하거나 예방하는 조성물의 용도가 기재되어 있는 프로토콜 및 상기한 약학적 조성물 중 하나를 포함하는, 장-유도 패혈증과 같은 미생물-매개 장애 의 발병 위험에 있는 상피 표면을 특징으로 하는 비정상적인 증상을 치료학적으로 처리하거나 예방하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트에 포함시키기에 적합한 프로토콜에는 본원에 기재되어 있는 치료방법 또는 예방방법 중 어느 하나가 기재되어 있다.

본 발명의 또다른 양상은 질환을 포함하는 미생물-매개 장애의 위험에 있는 상피 표면을 특징으로 하는 비정상적인 증상을 예방하는 방법에 관하여 기술하고 있다. 예를 들어, 본 발명은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 유효 투여량을 함유하는 조성물을 동물에게 투여하여 질환 또는 비정상적인 증상을 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명의 예방방법에 의해 치료가능한 적합한 질환 또는 비정상적인 증상은 외이도염, 급성 중이염, 만성 중이염, 환기장치-연관 폐렴, 장-유도 패혈증, 괴사성 소장결장염, 항생제-유도 설사, 가막성 대장염, 염증성 장질환, 과민성 장질환, 호중구감소성 소장결장염(neutropenic enterocolitis), 췌장염, 만성 피로 증후군, 장내불균형 증후군(dysbiosis syndrome), 현미경적 대장염, 만성 요로감염증, 성전염성 질환 및 감염증 중에서 선택한 것이다. 본 발명의 예방방법에 대하여 피실험자로서 적합한 동물은 개, 고양이, 양, 염소, 소, 돼지, 닭, 말 및 사람 중에서 선택한 것이다. PEG 는 적어도 15,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 것이 바람직하고 ; 또한 PEG 는 15,000 달톤과 20,000 달톤 사이의 평균 분자량을 갖는 것이 바람직하다. 또한, PEG 는 10-20 % PEG, 바람직하게 10 % PEG 를 포함하는 수용액이다. 투여될 조성물은 또한 수용액, 국부용 겔 및 분무시키기에 적합한 용액 중에서 선택한 부형제를 함유할 수 있다. 따라서, 조성물은 또한 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 덱스트란-코팅 부티르산, 프락토-올리고당, N-아세틸-D-갈락토사민, 덱스트란-코팅 만노스, 갈락토스 및 락툴로스 중에서 선택한 화합물을 함유할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 조성물은 PEG, 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 덱스트란-코팅 부티르산, 프락토-올리고당, N-아세틸-D-갈락토사민, 덱스트란-코팅 만노스, 갈락토스 및 락툴로스를 함유한다.

본 발명의 또다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 유효량을 함유하는 조성물을 동물에게 투여하여 피부 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다. 조성물은 또한 연고, 크림, 겔 및 로션 중에서 선택한 부형제를 함유할 수 있다. 본 발명은 감염증을 유발시키는 인자가 바실러스 안트라시스, 천연두 바이러스, 장관병원성 E.coli(EPEC), 장관출혈성 E.coli(EHEC), 장관흡착성 E.coli(EAEC), 클로스트리듐 디피실, 로타바이러스, 슈도모나스 애루지노사, 세라티아 마르세센스, 클럽시엘라 옥시토시아, 엔테로박테리아 클로아케, 칸디다 알비칸스 및 칸디다 글로브라타 중에서 선택된 것임을 고려한 것이 다.

본 발명의 다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 유효량을 동물에게 투여하여 호흡성 감염증을 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 예방방법으로 치료가능한, 호흡성 감염증은 환기장치와 연관된 폐렴(예를 들어, 환기장치-연관 폐렴), 공기-유발 감염 인자, 재채기와 같은 분무된 액체로 분산된 감염 인자 등을 포함하는, 본 분야에 공지되어 있는 모든 경로를 통해 감염 인자와 접촉함으로써 발병될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바실러스 안트라시스 및 천연두 바이러스 중에서 선택한 인자에 의한 호흡성 감염증을 예방한다.

본 발명의 또다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 를 함유하는 조성물의 유효량을 요도로 수송시켜 만성 요로 감염증을 예방하기 위해 적어도 일부분의 요도를 관주(irrigating)시키는 방법에 관한 것이다. 하나의 실시형태에서, 조성물은 적어도 방광을 포함하는 요도의 일부분에 투여한다.

본 발명의 다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 콘돔에 적용시켜 성전염성 질환을 예방하는 방법 에 관한 것이다. 본 발명의 관련된 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 로 코팅된 입자를 적어도 포함하는 콘돔에 관한 것이다. 또다른 관련된 양상은 콘돔 및 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하는 키트에 관한 것이다.

또한 본 발명은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유하는 조성물의 유효 투여량을 동물에게 투여하여 소화관 장애를 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명의 예방방법으로 치료가능한 일반적인 소화관 장애는 신생아 괴사성 소장결장염, 항생제-유도 설사, 가막성 대장염, 염증성 장질환, 과민성 장질환, 호중구감소성 소장결장염, 췌장염, 장내불균형 증후군 및 현미경적 대장염 중에서 선택한 것이다.

본 발명의 다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 표지된 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 함유하는 조성물의 유효량을 동물에게 투여하고 표지된 PEG 를 검출하여 동물에서 PEG 의 투여를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 표지된 PEG(예를 들어, 미생물과 연관된 PEG)의 양 및/또는 위치는 투여 효능을 평가하는데 유용한 정보를 제공한다. 모니터링 방법에 관한 하나의 실시형태에서, 표지는 형광단(예를 들어, 플루오레신, 로다민, Cy3, Cy5)이다. 상기 모니터링 방 법에 관한 다른 실시형태에서, 표지된 PEG 를 검출하는 것은 내시경 검사를 포함한다. 또한 상기 모니터링 방법은 표지된 PEG 가 분변 샘플에서 검출된다는 것(즉, 표지된 PEG 는 분변 샘플로부터 유래된, 미생물과 같은 성분과 연관되어 있다는 것)을 고려한 것이다. 게다가, 모니터링 방법은 또한 미생물에 대하여 특이적인 2 차 표지를 투여하고 상기 2 차 표지를 검출하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "특이적인" 은 표지가 적어도 하나의 미생물과 검출가능하게 연관되어 있음을 의미한다.

본 발명의 다른 양상은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 투여한 동물로부터 샘플을 수득하고, 상기 샘플과 상피세포를 접촉시킨 다음 상피세포에 대한 샘플에서 미생물의 부착을 측정하여 동물에게서 PEG 의 투여를 모니터링하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 PEG 의 양 및/또는 위치는 투여 효능을 평가하는데 유용한 정보를 제공한다. 측정은 현미경 검사로 수행할 수 있다.

본 발명의 다른 모니터링 방법은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 투여한 동물로부터 샘플을 수득하고, 상기 샘플과 상피 세포층을 접촉시킨 다음 상피층의 경상피 전기저항을 측정하여 동물에게서 PEG 의 투여를 모니터링하는 방법이며, 여기에서 효과 적인 투여는 대조군 값에 비해 경상피 전기 저항의 감소가 감소되었다는 것으로 나타낸다. 대조군 값은 내부적[즉, PEG 투여 전에 경상피 전기 저항(TEER)을 측정함] 또는 외부적(즉, 비교하기 위해 확실하게 사용되는 다른 연구에서 측정된 값)이다.

본 발명의 또다른 모니터링 방법은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 투여한 동물로부터 샘플을 수득하고, 상기 샘플로부터 미생물을 분리한 다음 미생물의 세포 표면 소수성을 측정하여 동물에게서 PEG 의 투여를 모니터링하는 방법이며, 여기에서 샘플 내 모든 미생물의 소수성은 투여 효능을 평가하는데 유용한 정보를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 "분리하는" 은 본 분야에서 이해되는 바와 같이, 소수성 측정이 충분히 가능하도록 샘플(예를 들어, 고형 물질)의 다른 성분을 분리시키는 것을 의미한다.

본 발명의 관련된 양상은 표지된 폴리에틸렌 글리콜 및 상기 PEG 투여를 모니터링할 때의 표지된 PEG 의 용도가 기재되어 있는 프로토콜을 포함하는, PEG 투여를 모니터링하기 위한 키트에 관한 것이다. 적합한 프로토콜은 PEG 의 투여, 수송 또는 적용과 관련된, 본원에 기재되어 있는 모든 방법 또는 본 분야에 공지되어 있는 모든 방법을 포함한다. 본 발명의 이러한 양상에 관한 몇몇 실시형태에서, 키트는 또한 자유 표지(free label)를 포함한다.

본 발명의 또다른 모니터링 방법은 적어도 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 투여한 동물로부터 샘플을 수득하고 샘플에서 PA-I 렉틴/부착인자 활성도를 검출하여 동물에게서 PEG 투여를 모니터링하는 방법이며, 여기에서 PA-I 렉틴/부착인자 활성도는 투여 효능을 평가하는데 유용한 정보를 제공한다. 이러한 방법에 관한 하나의 실시형태에서, PA-I 렉틴/부착인자는 특이적인 항-PA-I 렉틴/부착인자 항체 또는 렉틴/부착인자가 특이적으로 결합하는 탄수화물의 공지된 모든 유형과 같은 PA-I 렉틴/부착인자 결합 파트너에 결합시킴으로써 검출한다. 본 발명의 관련된 양상은 PA-I 렉틴/부착인자 결합 파트너 및 샘플에서 PA-I 렉틴/부착인자를 검출하기 위한 결합 파트너의 용도가 기재되어 있는 프로토콜을 포함하는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 투여를 모니터링하기 위한 키트에 관한 것이다. 적합한 프로토콜은 본원에 기재되어 있거나 또는 PEG 의 용도와 관련된 분야에 공지되어 있는 모든 방법을 포함한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 도면 및 실시예를 포함하는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.

도 1 은 허위 개복술 또는 30 % 수술적인 간절제술을 수행한 다음 맹장에 슈도모나스 애루지노사 PA27853 을 직접적으로 주사한 마우스에서 48 시에 측정한 사망률을 나타낸 것이다. 마우스에 30 % 무혈 좌엽 간절제술을 실시한 다음 바로 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 을 직접적으로 맹장 주사하였다. 각각의 군은 7 마리의 마우스로 구성되어 있다. 대조군 마우스에는 허위 개복술을 실시한 다음 동량의 PA27853 을 맹장에 주사하였다. PEG 군의 마우스에 대하여, 맹장 주사하기 전에 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 을 PEG 3.35(LMW PEG 3,350) 또는 PEG 15-20(HMW PEG 15,000 달톤 내지 20,000 달톤)에 현탁시켰다. PEG 15-20 에 대한 투여 반응 곡선은 도 1B 에 나타내었다. 도 1A 에서 PEG 15-20 의 통계학적으로 현저한 보호 효과는 피셔정밀검정으로 측정하였다(P<0.001). 도 1B 는 PEG 15-20 의 최소 보호 농도가 5 % 로 측정되었음을 나타낸 것이다(P<0.05). 도 1C 는 30 % 외과 간절제술 이후 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 을 직접적으로 맹장 주사한 다음 24 시에 맹장 내용물(분변), 세척한 맹장 점막, 간 및 혈액 내에 존재하는 정량적인 박테리아 배양물을 나타낸 것이다. 일원 분산분석(one-way ANOVA)으로 간절제술 이후 마우스의 맹장 내용물, 점막, 간 및 혈액에서 박테리아의 수가 통계학적으로 현저하게 증가되었음을 측정하였다(P<0.001). PEG 3350 에 대하 여 간 및 혈액에서의 박테리아 수의 현저한 감소(P<0.05)가 관찰되었으며, PEG 15-20 은 PA27853 이 마우스의 간 및 혈액에 유포되는 것을 완전하게 예방하였다.

도 2 는 경상피 전기 저항(TEER)으로서 평가되는, PA27853-유도 상피 장벽 기능부전에 대한 PEG 15-20 의 보호 효과를 나타낸 것이다. 도 2A 의 데이터는 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 에 8 시간 동안 3 중 배양물(n=7)을 정단 노출(apical exposure)시켰을 때 TEER 에 있어서 기준선으로부터 최대 감소된 평균±SEM % 값을 나타낸다. TEER 이 통계학적으로 현저하게 감소하였다는 것은 PA27853 에 노출된 Caco-2 세포에서 나타난다[일원 ANOVA (P<0.001)]. PA27853 에 의해 유도된 TEER 의 감소에 대한 통계학적으로 현저한 보호 효과는 PEG 15-20 에 대하여 나타난다(P<0.001). 도 2B 는 PEG 3.35 존재 하에 PA27853 에 정단 노출시킨 Caco-2 세포의 사진을 나타낸 것이다. 공동 배양한지 4 시간 후를 나타낸 사진에서 세포막에 대한 PA27853 의 부착을 나타내는 세포 구조물 상의 30 - 40 마이크론의 부유하는 세포에 의해 단층 보존성이 손실되었음을 알 수 있다. 도 2C 는 PEG 15-20 존재시 4 시간 후에 PA27853 에 Caco-2 세포를 정단적으로 노출시켰을 때, 시험된 모든 평판에서 부유하는 세포가 없다는 것을 나타낸다.

도 3 은 PA27853 에서의 PA-I 발현에 대한 PEGs 의 저해 효과를 나타낸 것이다. 도 3A 는 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 1mM 의 정족수-인식 신호전달 분자 C4-HSL 에 대한 PA27853 의 노출로 인해, 10 % PEG 3.35 의 존재시 부분적으로 저해되고 10 % PEG 15-20 으로는 좀 더 저해되는 PA-I 단백질 발현이 통계학적으로 현저하게 증가되었다(P<0.001 일원 ANOVA). 도 3A' 는 C4-HSL 유도 PA-I 발현에 대한 PEG 15-20 의 최소 저해 농도가 5 % 임을 나타낸 것이다(P<0.01). 도 3B 는 PEGs 가 존재하는 경우 및 존재하지 않는 경우에 C4-HSL 에 노출시킨 개별적인 박테리아 세포의 전자현미경법으로 C4-HSL 이 슈도모나스 애루지노사의 형태 및 섬모 발현에 형태학적 변화를 유발시킨다는 것을 측정하였음을 나타낸 것이다. C4-HSL-유도 형태학적 영향은 PEG 15-20 의 존재시에는 완전하게 소멸되지만 PEG 3.35 존재시에는 그렇지 않다. 할로-유형 효과(halo-type effect)는 PEG 15-20 에 노출된 PA27853 주위에서 관찰될 수 있다. 도 3C 는 노던 혼성화의 결과를 나타낸 것이다. 0.1 mM 의 C4-HSL 에 대한 PA27853 의 노출로 인해 10 % PEG 15-20 으로 뛰어나게 저해되는 PA-I mRNA 발현이 통계학적으로 현저하게 증가되었다(P<0.001, 일원 ANOVA). 도 3D 는 Caco-2 세포에 4 시간 동안 노출시킴으로써 유도된 PA-I mRNA 의 증가는 PEG 15-20 존재시 저해되지만, 반면에 PEG 3.35 존재시에는 저해되지 않는다(P<0.001, 일원 ANOVA)는 것을 나타낸다.

도 4 는 PA27853 의 박테리아 막 보존성이 빈약한 성장 패턴(bacterial membrane integrity arid growth pattern)에 대한 PEG 용액의 효과를 나타낸 것이다. 박테리아 막 보존성에 대한 2 종류의 PEG 용액의 효과는 SYTO 9 및 프로피디움 요오드화물로 구성된 염색방법으로 평가하였다. PEG 용액은 둘 다 박테리아 막 투과성에 영향을 미치지 않는다. 도 4B 는 PA27853 성장 패턴이 PEG-유리 TBS 배지(대조군)와 2 종류의 PEG 용액에서 동일하다는 것을 나타낸다.

도 5 는 PEGs 에 노출시킨 Caco-2 세포 및 박테리아 세포의 원자간력 현미경법(AFM) 사진을 나타낸 것이다. 도 5A, 도 5C 및 도 5E 는 배지만 존재하는 경우의 Caco-2 세포의 AFM 사진(도 5A), PEG 3.35 를 수반하는 배지가 존재할 경우 Caco-2 세포의 AFM 사진(도 5C) 및 PEG 15-20 을 수반하는 배지가 존재할 경우 Caco-2 세포의 AFM 사진(도 5E)을 나타낸 것이다. PEG 3.35 는 Caco-2 세포 상에 부드러운 양탄자 모양(도 5C)을 형성한 것처럼 보이고, 반면에 PEG 15-20 은 좀 더 국소해부학적으로 뚜렷한 덮개 모양(도 5E)을 형성한 것처럼 보인다. 도 5B, 도 5D 및 도 5F 는 PEG 3.35 및 PEG 15-20 에서의 PA27853 의 AFM 사진을 나타낸 것이다. PEG 3.35 는 각각의 박테리아 세포 주변에 부드러운 봉투 모양(도 5D)을 형성하고, 반면에 PEG 15-20 은 각각의 세포를 단단히 감싸고 있을 뿐만 아니라(도 5F) 중합체/박테리아 직경을 증가(도 5G, 도 5H)시켜, 이로 인해 각각의 박테리아는 서로 거리를 두고 떨어져 있게 되었다.

도 6 은 PA27853 의 분산/군집 패턴에 대한 PEG 용액의 효과를 나타낸 것이다. dTC3 접시에서 박테리아 세포의 분산 패턴은 63× 의 대물렌즈 배율에서 DIC 및 GEP 형광 여과기를 사용하는 Axiovert 100 TV 형광 도립 현미경으로 직접적으로 관찰하였다. 온도는 Biotechs 온도 조절기 온도 조절 시스템으로 조절하였다. 텅스텐 전구(100 v)를 DIC 및 GFP 흥분용으로 사용하였다. Intelligent Imaging Innovation 으로부터 입수한 3D 영상 소프트웨어(Slidebook)를 사용하여 GFP 여과기를 사용하는 Z 평면에서 박테리아 세포 분산 패턴을 이미지화하였다. Caco-2 세포가 없는 배지에서 일정하게 분산된 부유성 슈도모나스 애루지노사 세포는 DIC 이미지(도 6A₁) 및 Z 평면 재구성(도 6A₂) 상에 나타내었다. Caco-2 세포가 존재하는 경우, 박테리아 세포는 군집된 형상(도 6B₁)으로 이미지화되었고 Caco-2 세포에 부착된 것(도 6B₂)으로 나타났다. 10 % PEG 3350 은 박테리아의 운동성을 감소시키고 웰의 바닥에 부착(도 6C₂)되는 버섯-형상의 박테리아 마이크로콜로니(도 6C₁)의 형성을 유도한다. Caco-2 세포가 존재하는 경우, 박테리아 마이크로콜로니는 상피세포의 평면 상에서 8 마이크론과 유사하다(도 6D₁, 도 6D₂). 10 % PEG 15-20 은 슈도모나스 애루지노사 세포의 운동성을 현저하게 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, PEG 15-20 함유 배지에서 처음 0.5-1 시간 배양하는 동안 박테리아 세포는 웰의 바닥에 근접하여 거미-형상의 마이크로콜로니를 형성하였다(도 6E₁, 도 6E₂). 수시간 이내에, 거미 다리-형상의 마이크로콜로니가 배지의 전체적인 공간/부피를 차지하였다. Caco-2 세포가 존재하는 경우, 슈도모나스 애루지노사 세포는 거미-유사 형태가 없어지고 상피 평면 상에 높이 상승된 것처럼 보여진다(30-40 마이크론)(도 6F₁, 도 6F₂).

도 7 은 HMW PEG-유사 화합물(즉, HMW PEG 15-20 kD)을 함유하는 용액 및 HMW PEG-유사 화합물을 함유하지 않는 용액에 용해시킨 프로바이오틱 치료제(LGG)에 의한 장내 상피세포 치료 효과를 나타낸 것이다. 청소년 마우스 결장(Young Adult Mouse Colon ; YAMC)세포를 다양하게 처리(하기의 레인을 참조하라)한 다음 수학하고 웨스턴 블롯 분석으로 열쇼크 단백질 발현에 대하여 평가하였다. 레인 1 - 비처리 세포(음성 대조군) ; 레인 2 - 600 ul 의 고분자량 PEG 만을 첨가함 ; 레인 3 - 배지만 존재하는 조건 하에 600 ul 의 락토바실러스 GG(LGG)를 첨가함 ; 레인 4 - 세포에 먼저 600 ul 의 PEG 를 첨가한 다음 2 시간 후에 600 ul 의 LGG 를 첨가함 ; 레인 5 - 먼저 LGG 를 첨가한 다음 2 시간 후에 PEG 를 첨가함(레 인 4 에서와 동일한 부피로 첨가함) ; 레인 6 - 300 ul LGG 와 600 ul PEG 의 혼합물을 첨가함 ; 레인 7 - 1:1 의 비율의 600 ul LGG 와 600 ul PEG 의 혼합물 ; 레인 8 - 900 ul LGG 와 600 ul PEG 의 혼합물 ; 레인 9 - 600 ul LGG 와 300 ul PEG 의 혼합물 ; 레인 10 - 600 ul LGG 와 900 ul PEG 의 혼합물 ; 및 레인 11 - 열적 스트레스를 받은 세포(HS=열쇼크, 양성 대조군). 웨스턴 블롯을 수행하여 상기한 바와 같이 다양하게 처리함으로써 유도될 수 있는 열쇼크 단백질 hsp 72(상부 패널) hsp25(중간 패널)의 유도를 평가하였다. Hsc 73(하부 패널)은 모든 레인에 동일한 양의 단백질이 로딩되었음을 확인하기 위해 로딩 대조군으로 사용되었다.

도 8 은 HMW PEG-유사 화합물(즉, HMW PEG 15-20 kD)을 함유하는 용액 및 HMW PEG-유사 화합물을 함유하지 않는 용액에 용해시킨 프로바이오틱 치료제(VSL#3)에 의한 장내 상피세포 치료 효과를 나타낸 것이다. 청소년 마우스 결장(YAMC) 세포를 하기한 바와 같이 다시 다양하게 처리한 다음 16 시간 후에 수확하고 웨스턴 블롯 분석으로 열쇼크 단백질 발현에 대하여 평가하였다. 레인 1 - VSL#3 조정배지 배치 A 600 ul 을 세포에 첨가한 다음 16 시간 동안 방치하였음 ; 레인 2 - VSL#3 조정배지 배치 A 1200 ul 을 세포에 첨가한 다음 16 시간 동안 방치하였음 ; 레인 3 - VSL#3 조정배지 배치 B 600 ul 과 600 ul PEG 를 혼합하여 16 시간 동안 세포에 첨가하였음 ; 레인 4 - VSL#3 A/PEG 혼합물을 10 분 동안 방치 한 다음 제거하였음(배지를 교환하였음) ; 레인 5 - VSL#3 조정배지 배치 B 600 ul 을 세포에 첨가한 다음 16 시간 동안 방치하였음 ; 레인 6 - VSL#3 조정배지 배치 B 1200 ul 을 세포에 첨가한 다음 16 시간 동안 방치하였음 ; 레인 7 - VSL#3 조정배지 배치 B 600 ul 을 600 ul PEG 와 혼합하여 16 시간 동안 세포에 첨가하였음 ; 레인 8 - VSL#3 B/PEG 혼합물을 10 분 동안 방치한 다음 제거하였음(배지를 교환하였음) ; 레인 9 - VSL#3 조정배지 배치 B 600 ul 을 세포에 첨가한 다음 16 시간 동안 방치하였음 ; 레인 10 - VSL#3 조정배지 배치 H 1200 ul 을 세포에 첨가한 다음 16 시간 동안 방치하였음 ; 레인 11 - VSL#3 조정배지 배치 H 600 ul 을 600 ul PEG 와 혼합하여 16 시간 동안 세포에 첨가하였음 ; 레인 12 - VSL#3 H/PEG 혼합물을 10 분 동안 방치한 다음 제거하였음(배지를 교환하였음) ; 레인 13 - 비처리 세포(음성 대조군) ; 및 레인 14 - 열적 스트레스를 받은 세포(HS=열쇼크, 양성 대조군).

본 발명은 사람을 포함하는 다수의 포유동물을 괴롭히는 비정상적인 증상 및 질환인 다양한 상피 질환(예를 들어, 미생물-매개 상피 질환)의 치료 및/또는 예방을 제공할 뿐만 아니라, 안정하고 활성인 치료제의 수송을 수득하기 위한 단순하고 경제적인 연구를 종합적으로 제공하는 산물, 방법 및 시스템을 제공한다. 장-유도 패혈증을 포함하는 상피 장애 및 질환인, 모든 다수의 건강 또는 삶을 위협하는 비정상적인 증상의 위험에 있는 개체를 포함하는 동물에게 HMW 폴리에틸렌 글리콜-유사 화합물, 예를 들어, HMW PEG 와 같은 HMW PEG-유사 화합물과 같은 고분자량 극성 중합체를 투여함으로써 최소 비용 및 개업 약사들의 최소 훈련으로도 상기 동물을 치료할 수 있다. 일반적으로 용액으로서 투여되는 HMW PEG-유사 화합물의 부피는 수송될 치료제 및 치료제의 의도된 표적에 따라 달라지며, 예를 들어, 치료제가 장관의 전체 또는 부분적으로 활성인 경우에, 용액으로 장관 또는 이의 관련 부분을 효과적으로 코팅하기에 충분한 HMW PEG-유사 용액이 바람직하다. 치료제가 예를 들어, 장 내에서 수송되는 지점으로부터 떨어져서 작용하는 원격 부위를 가지며 이로 인해 용이하게 흡수될 수 있는 경우에, HMW PEG-유사 용액은 본 분야에서 이해되는 바와 같이 장내 루멘에서 치료제의 희석을 예방한다. 이론에 결부될 목적 없이, 본 발명에 의해 제공되는 이점은 미생물의 생존에 도움을 주는 환경을 확립함으로써 미생물-매개 상피 질환이 성공적으로 예방되고 개선되거나 치료될 수 있다는 원리와 일치한다. 하기한 본 발명의 상세한 설명 및 2004 년 2 월 6 일자로 출원된 공동-소유의 미국 특허 가출원 번호 제 60/542,725 호 ; 2004 년 4 월 20 일자로 출원된 발명자 유진 창 및 일레인 페트로프의 발명의 명칭이 "Cytoprotective and Anti-Inflammatory Factors Derived From Probiotic And Commensal Flora Microorganisms" 인 미국 특허 가출원(대리인 서류 번호 제 27373/40027 호) 및 2004 년 4 월 20 일자로 출원된 발명자 유진 창 및 일레인 페트로프의 발명의 명칭이 "Cytoprotective Fators Derived From Probiotic And Commensal Flora Microorganisms" 인 미국 특허 가출원(대리인 서류 번호 제 27373/40049 호)(이들 각각의 3 개의 출원은 본원에 인용문헌으로 인용하고 있음)에 의해 본원에 사용된 하기 용어의 의미가 확립된다.

"비정상적인 증상" 은 광범위하게 미생물-매개 장애의 발병 위험에 있는 상피 표면을 특징으로 하는 포유동물 질환, 포유동물 장애 및 포유동물의 모든 비정상적인 건강 상태를 포함함을 의미한다. 미생물-매개 장애의 발병 위험에 있는 상피 표면을 특징으로 하는 비정상적인 증상은 상피 표면에서 미생물-매개 장애가 발병한 증상을 포함한다. 일반적인 증상은 화상, 신생아의 소장결장염, 중증의 호중구 감소증, 염증성 장질환, 장질환(예를 들어, 중증인 장질환), 및 이식거부반응(예를 들어, 기관 이식거부반응)과 같은, 의학적 중재를 필요로 하거나 또는 의학적 중재로 인한 인체 질환 및 인체 장애를 포함한다.

"화상" 은 열, 예를 들어, 개방 화염, 증기, 뜨거운 액체 및 뜨거운 표면 등에 조직이 노출됨으로써 유발되는 포유동물 조직에 대한 손상을 의미한다.

"화학적 접촉" 손상은 화합물과 직접적으로 접촉함으로써 유발되는 손상을 의미하며, 화학적 화상 또는 다른 손상을 포함한다.

"중증의" 호중구 감소증은 일반적으로 순환하는 호중구의 수가 현저하게 감소되었음을 의미한다.

"이식거부반응" 은 숙주 유기체에 의해 물질이 궁극적으로 거부될 것으로 인지되는 이식된 물질(예를 들어, 기관)의 모든 발병을 의미한다.

"투여하는" 은 일반적으로 본 분야에서 인지되는 모든 적합한 수단에 의해 수송되는 것을 의미한다. 일반적인 투여 유형은 경구 투여, 항문 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 근육내 주사, 피하 주사 및 다른 유형의 주사를 포함하는 직접 천자 또는 주사, 국소 투여 및 분무(예를 들어, 분무 스프레이), 눈, 귀, 코, 입, 항문 및 요도 입구로의 겔 또는 액체 투여, 및 삽관을 포함한다.

"유효 투여량" 은 투여를 받은 유기체에 이로운 효과를 제공하는 물질의 양을 의미하며, 이는 투여량의 투여 목적, 투여를 받는 유기체의 크기 및 상태, 및 유효 투여량을 결정하는데 적합하도록 하는, 본 분야에서 인지되는 다른 변수에 의해 달라질 수 있다. 유효 투여량을 결정하는 방법은 본 분야의 기술 범주 내에 속하는 일반적인 최적화 방법을 포함한다.

"동물" 은 일반적으로 비-식물성, 비-단세포성의 살아있는 생명체를 의미한다. 바람직한 동물은 사람과 같은 포유동물이다.

본원에서, "필요" 는 유기체, 기관, 조직 또는 세포 상태인 유기체에 유효 투여량의 투여로 인해 효과가 나타날 수 있는 상기 상태를 의미한다. 예를 들어, 장-유도 패혈증 발병의 위험에 있거나 이의 증상이 존재하는 인체는 본 발명의 약학적 조성물과 같은 산물의 유효 투여량을 필요로 하는 유기체이다.

"평균 분자량" 은 일반적으로 평균 결정의 정확도를 고려하지 않은, 조성물의 성분(예를 들어, 분자)의 분자량의 산술적인 평균을 의미한다. 예를 들어, PEG 분자량의 산술적 평균이 여러 범위의 정확도에서 3.5 킬로달톤으로 측정되는 경우에, 3.5 킬로달톤의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG 는 본 분야에서 이해되는 바와 같이 산술적 평균의 어림값을 반영하는, 다양한 분자량의 PEG 분자를 포함할 수 있다. 유사하게, PEG 15-20 은 산술적 평균값이 15 킬로달톤과 20 킬로달톤 사이인 분자량을 갖는 PEG 를 의미하며, 상기 평균값은 상기한 주의에 따른다. 이러한 PEG 분자는 단순한 PEG 중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상대적으로 작은 PEG 분자(예를 들어, 7,000 달톤 내지 10,000 달톤)의 대다수는 선택적으로 페놀과 같은 링커 분자와 결합되어 보다 큰 분자량(예를 들어, 15,000 달톤 내지 20,000 달톤)을 갖는 단일 분자가 될 수 있다.

본 분야에서 이해되는 바와 같이, "세포막 보존성" 은 살아있는 세포의 작용 성분으로서의 세포막에 기능적으로 현저한 변형이 상대적으로 결여되어 있음을 의미한다.

본 분야에서 이해되는 바와 같이, "검출가능하게 변형된" 은 일반적으로 상황에 적합한 검출 수단을 사용하여 인지할 수 있는 변화를 의미한다.

"성장 패턴" 은 세포의 발생 또는 배가 시간, 세포의 발생기 군의 국소학적 외형 및 세포나 세포군의 성장 패턴을 이해하도록 하는, 본 분야에서 인지되는 다른 변수와 같은 특징적인 세포 성장으로서 본 분야에서 인지되는 세포나 또는 세포군(예를 들어, 세포의 군집)의 중요한 특성을 종합적으로 의미한다.

"저해하는" 은 일반적으로 감소 또는 예방을 수반하는 저해를 의미한다. 예를 들어, 형태학적 변화를 저해하는 것은 형태학적으로 변화시키는 것이 좀 더 어렵거나 전체적으로 예방된다는 것을 의미한다.

"PA-I 또는 PA-I 렉틴/부착인자 발현" 은 PA-I 렉틴/부착인자의 활성적인 특성이 생성되거나 또는 발생되는 것을 의미한다. 일반적으로, PA-I 렉틴/부착인자 발현은 PA-I 렉틴/부착인자의 적어도 하나의 활성적인 특성을 갖는 PA-I 렉틴/부착인자 폴리펩티드를 생성하는 PA-I 렉틴/부착인자-코딩 mRNA 의 번역을 포함한다. 선택적으로, PA-I 렉틴/부착인자는 또한 상기한 mRNA 를 생성하는 PA-I 렉틴/부착인자의 전사를 포함한다.

"상피-유도 활성화" 는 상피세포의 직접적이거나 간접적인 영향에 의해 주어진 표적의 활성도가 증가되는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서에서, 예를 들어, PA-I 렉틴/부착인자의 상피-유도 활성화는 상피세포 또는 상피세포들을 장내 병원균과 직접적으로 접촉시킴으로써 나타나는 상피의 직접적인 영향으로 인해 폴리펩티드의 활성도가 증가되는 것을 의미한다.

"형태학적 변화" 는 일반적으로 형태의 변화를 의미한다.

"장내 병원균" 은 사람과 같은 동물에게 전체 또는 부분적으로 장-유도 패혈증을 발병시킬 수 있는 병원성 미생물을 의미한다. 슈도모나스류(예를 들어, 슈도모나스 애루지노사)와 같은 그람 음성 바실러스를 포함하는, 본 분야에서 공지되어 장내 병원균은 상기 정의에 의해 포함된다.

"개선시키는" 은 일반적으로 정도 또는 심각성을 감소시킴을 의미한다.

본 분야에서 인지되는 바와 같이, "병원성 정족수" 는 유기체(예를 들어, 장내 병원균)의 역치 농도 또는 수가 존재하는 정족수 인지 신호 또는 전달을 개시하거나 유지하기 위한 충분한 수의 유기체(예를 들어, 슈도모나스 애루지노사)의 집합 또는 군집을 의미한다.

"상호작용" 은 일반적으로 분자, 세포 등과 같은 둘 또는 그 이상의 생물학적 산물 사이에서의 상호작용을 의미한다.

"경상피 전기 저항" 또는 TEER 은 본 분야에서 일반적인 문구이며, 이는 상피 조직을 통과하는 전기 저항의 측정치를 의미하며, 상피 조직 내 상피세포 사이의 밀접한 집합 상태를 평가하는데 비-배타적으로 유용하다.

"부착" 은 일반적으로 일시적인 기간보다 긴 시간 동안 물리학적으로 결합되는 것을 의미한다.

"국소해부학적으로 비대칭적인" 은 대칭적이지 않은 3 차원 물체(예를 들어, 세포)의 표면에 대한 영상, 지도 또는 다른 표시를 의미한다.

본 분야에서 이해되는 바와 같이, 주사 힘 현미경법(scanning force microscopy)로 공지되어 있는 "원자간력 현미경법(Atomic force microsopy)" 은 래스터 주사시 샘플의 표면을 통과하는 캔틸레버 프로브(cantilevered probe)를 가지며, 프로브 변형을 탐지하는 고감도 수단을 사용하여 고-해상도 지형도를 수득하는 기술이다.

"약학적 조성물" 은 인체 환자와 같은 살아있는 동물에게 치료학적으로 투여하기에 적합한 화합물의 제형을 의미한다. 본 발명에 따른 바람직한 약학적 조성물은 점도, 전해 프로필 및 삼투몰 농도에서 균형적인 용액을 포함하며, 전해질성 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 락툴로스, D-칼락토스, N-아세틸-D-갈락토사민 및 5-20 % PEG(15,000-20,000)를 함유하고 있다.

"아쥬반트", "담체" 또는 "희석제"는 각각 본 분야에서 일반적인 용어이다. 아쥬반트는 공동 투여된 면역원의 면역원성을 연장시키는 하나 또는 그 이상의 물질이다. 담체는 수송될 물질의 전좌와 같은 조작을 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 물질이다. 희석제는 희석제에 노출된 주어진 물질의 농도를 감소시키거나 희석시키는 하나 또는 그 이상의 물질이다.

"HMW PEG-유사 화합물" 은 3.5 킬로달톤(kD)보다 큰 평균 분자량을 갖는 화합물로 정의되는, 상대적으로 고분자량인 PEG 화합물을 의미한다. 바람직하게, HMW PEG 는 5 kD 보다 큰 평균 분자량을 가지며, 특정 실시형태에서, HMW PEG 는 적어도 8 kD, 12 kD 보다 큰 분자량, 적어도 15 kD 및 15 kD 과 20 kD 사이의 평균 분자량을 갖는다. 부가적으로, "HMW PEG-유사 화합물" 은 HMW PEG 유도체를 포함하며, 여기에서 각각의 유도체는 적어도 하나의 부가적인 작용기를 포함하는 HMW PEG 이다. 바람직한 HMW PEG 유도체는 양이온 중합체이다. 일반적인 작용기는 모든 알콕시류, 바람직하게 C1-C10, 모든 아릴옥시류, 페닐 및 치환된 페닐기를 포함한다. 이러한 작용기는 말단이나 중간 부분을 포함하는, HMW PEG 분자의 모든 부분에 결합될 수 있으며 ; 또한 보다 작은 PEG 분자 또는 이의 유도체에 결합되어 단일 HMW PEG-유사 화합물을 형성하는 페닐 또는 이의 치환기와 같은 작용기를 포함한다. 또한, 부가적인 작용기를 갖는 HMW PEG-유사 분자는 상기와 같은 하나의 기 또는 상기와 같은 하나보다 많은 기를 가질 수 있으며 ; 이러한 분자가 치료제의 수송기간 동안 적어도 하나의 치료제를 안정화시키는데 유용하거나 또는 상피세포의 질환, 장애 또는 증상을 치료하거나 개선시키거나 또는 예방하는데 유용한 경우에, 상기 각각의 분자는 부가적인 작용기의 혼합물을 가질 수 있다.

"배지들" 및 "배지" 는 출원서 전체에 걸쳐 세포 배양 배지 및 세포 배양 배지들을 의미한다. 명사의 단수형 또는 복수형은 각각의 용도에 있어서 본원에서 명백해질 것이다.

일반적으로, HMW PEG-유사 화합물은 단독으로 또는 치료제와 복합되어 치료될 증상에 적합한 모든 수단으로 투여할 수 있다. 화합물은 정제, 캡슐제, 과립, 분말 형태로 경구 투여하거나 또는 시럽을 포함하는 액상 제형으로 경구 투여하고 ; 설하, 협측 또는 경피적으로 투여하고 ; 비경구격으로 피하, 정맥내, 근육내 또는 흉골내(intrasternally)로 주사하거나 또는 주입하고(예를 들어, 주사가능한 멸균 수용액 또는 비-수용액, 또는 현탁액) ; 흡입 분무기를 통해 비측 투여하고 ; 좌제 형태로 직장 투여하며 ; 좌제기 또는 주입, 예를 들어, 삽관 또는 리포솜화(liposomally)를 통해 질내 또는 요도적으로 투여한다. 비-독성이며 약학적으로 용인가능한 부형제 또는 희석제를 함유하는 투여량 단위 제형을 투여할 수 있다. 상기 화합물은 속방성 또는 서방성에 적합한 형태로 투여할 수 있다. 속방성 또는 서방성은 본 분야에 공지되어 있는 적합한 약학적 조성물로 실시할 수 있다.

경구투여하기에 적합한 일반적인 조성물은 현탁제 및 속방형 정제를 포함하며, 상기 현탁제는 예를 들어 덩어리를 나누기 위한 미결정 셀룰로스, 현탁화제로서 알긴산 또는 알긴산나트륨, 점도 증강제로서 메틸셀룰로스 및 본 분야에 공지되어 있는 바와 같은 감미료 또는 향미료를 포함하고 ; 상기 속방형 정제는 예를 들어, 미결정 셀룰로스, 인산이칼슘, 녹말, 스테아르산마그네슘 및/또는 락토스, 및/또는 본 분야에 공지되어 있는 바와 같은 부형제, 결합제, 증량제, 붕괴제, 희석제 및 활택제를 포함한다. 본 발명의 화합물은 예를 들어, 성형시키거나 압축시키거나 또는 동결-건조시킨 정제로 설하 및/또는 협측 투여로 인하여 경구투여할 수 있다. 전형적인 조성물은 만니톨, 락토스, 수크로스 및/또는 시클로덱스트린과 같은 속-붕해성(fast-dissolving) 희석제를 포함한다. 또한 이러한 제형은 상대적으로 고분자량인 셀룰로스(AVICEL^®) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG ; GoLytely^®, 3.34 kD)과 같은 부형제 ; 및 히드록시프로필 셀룰로스(HPC), 히드록시프로필 메틸 셀룰로스(HPMC), 소듐 카르복시메틸 셀룰로스(SCMC) 및/또는 말산 무수물 공중합체(예를 들어, GANTREZ^®)와 같은 점막 부착에 도움을 주는 부형제를 포함한다. 활택제, 유동화제, 향미료, 착색제 및 안정화제 또한 형성 및 용도를 용이하게 하기 위해 첨가할 수 있다.

비측 에어로졸 또는 흡입 투여하기 위한 전형적인 조성물은 다음을 포함하는 용액을 함유한다 : 예를 들어, 벤질 알콜 또는 다른 적합한 방부제, 흡수 및/또는 생체내이용효율을 향상시키기 위한 흡수 촉진제, 및/또는 본 분야에 공지되어 있는 바와 같은 다른 용해보조제 또는 분산제.

장내 투여하기 위한 전형적인 조성물은 다음을 포함하는 용액 또는 현탁액을 함유한다 : 예를 들어, 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거액과 같은 안정하고 비-독성의 희석제 또는 용매, 등장성 염화나트륨 용액, 또는 합성한 모노 - 또는 디글리세리드 및 올레산을 포함하는 지방산을 포함하는 다른 적합한 분산제나 습윤제 및 현탁화제. 예를 들어, 코코아 버터, 합성 글리세리드 에스테르 또는 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, GoLytely^®)와 같은, 적합한 비-과민성 부형제를 포함하는 좌제도 본 발명에 함유된다.

본 발명의 화합물의 유효량은 본 분야의 숙련자들에 의해 결정될 수 있다. 모든 특정한 피실험자에 대한 특정 투여 정도 및 투여 빈도는 다양하며 사용되는 특정 화합물의 활성도, 상기 화합물의 대사 안정성 및 작용 정도(length of action), 피실험자의 종, 연령, 체중, 건강, 성별 및 식이, 투여 방법 및 투여 기간, 배설률, 약물 조성 및 특정 증상의 심각성을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 치료하기에 바람직한 피실험자는 장-유도 패혈증과 같은 미생물-매개 상피 증상 또는 질환 발병의 위험에 있는 동물, 가장 바람직하게 사람과 같은 포유동물 종, 및 개, 고양이, 말 등와 같은 가축용 동물을 포함한다.

하기의 실시예는 본 발명의 실시형태를 나타낸 것이다. 실시예 1 은 간적출된 마우스에게 발병된 장-유도 패혈증에 대한 고분자량 PEG 의 보호에 관한 것이다. 실시예 2 에는 장내 상피세포에 대한 병원균 부착을 HMW PEG 가 어떻게 예방하는지에 관하여 기재되어 있다. 실시예 3 은 일반적으로는 병원성 독성 발현에 대한 HMW PEG 의 저해방법, 특이적으로는 PA-I 렉틴/부착인자 발현에 대한 HMW PEG 의 저해방법에 관한 것이다. 실시예 4 에는 PEG 가 병원균의 성장 또는 세포벽 보존성에는 영향을 미치지 않음이 기재되어 있다. 실시예 5 는 원자간력 현미경법을 사용하여 나타낸 HMW PEG-코팅 병원균의 독특한 국소해부학적 형태에 관한 것이다. 실시예 6 은 HMW PEG 에 의해 영향을 받은 세포-세포 상호작용에 관한 것이다. 실시예 7 은 본 발명의 조성물을 사용하는 예방방법에 관한 것이다. 실시예 8 은 본 발명의 치료방법에 사용한 바와 같은 HMW PEG 의 투여를 모니터링하는 방법 및 대응되는 키트에 관한 것이다. 실시예 9 는 30 % 간절제술 이후의 장-유도 패혈증에 대한 HMW PEG-유사 화합물의 보호 효과에 관한 것이다. 실시예 10 및 11 은 프로바이오틱 치료제 락토바실러스 GG 또는 LGG(실시예 10) 및 VSL3(실시예 11)의 수송을 안정화시키는 HMW PEG-유사 화합물의 용도에 관한 것이다. 실시예 12 는 HMW PEG-유사 화합물을 사용하는 화학적 또는 생물적 치료제의 투여에 관한 것이다.

실시예 1

30 % 간절제술 이후의 장-유도 패혈증에 대한 HMW PEG 의 보호

수컷 Balb/c 마우스를 통상적인 프로토콜에 따라 마취시킨 다음 간절제술을 실시하였다. 부드러운 좌엽(floppy left lobe)을 따라 간의 30 % 무혈 절제술을 실시하였다. 대조군 마우스는 간절제술 없이 간을 조작하였다. 실험군 및 대조군은 각각 7 마리의 마우스로 구성되어 있다. 모든 마우스에서, 10⁷ cfu/ml 의 슈도모나스 애루지 노사 PA27853(Pseudomonas aeruginosa, ATCC 제 27853 호) 200 ul 부피를 식염수, PEG 3.350 또는 PEG 15-20(PEGs)에 희석시켜 직접 침천자에 의해 맹장의 바닥에 주사하였다. 상대적으로 저분자량인 PEGs 는 통상적으로 이용가능하며 ; 15,000 달톤 내지 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG 15-20 은 페닐 고리에 공유결합되는 PEG 7-8 및 PEG 8-10 의 복합체이다. PEG 7-8 은 7,000 달톤 내지 8,000 달톤의 평균 분자량을 갖고, PEG 8-10 은 8,000 달톤 내지 10,000 달톤의 평균 분자량을 갖는다. 본 분야의 숙련자들은 HMW PEGs 가, PEG 분자를 결합시키기에 적합한 작용기를 갖는 상대적으로 작은 분자인 하나 또는 그 이상의 링커 분자와 또는 서로 바람직하게 공유결합되는 다양한 모든 평균 분자량을 갖는 각각의 단위체를 수반하는 다양한 모든 PEG 단위체를 갖는 화합물을 포함한다는 것을 인지할 것이다. 적합한 링커는 HMW PEG 의 생물학적 활성도를 실질적으로 보존한다(본원에 기재한 바와 같은 유익한 예방효과 또는 치료효과를 나타내는 충분한 생물학적 활성도를 보존한다).

실험이 수행되는 48 시간 동안 PEG 를 일정하게 공급하기 위해, 바늘을 소장(회장)에 직접적으로 찌른 다음 1 ml 의 식염수, PEG 3.35 또는 PEG 15-20 을 근위 장 내로 주사하였다. 천자 부위를 견사제로 묶은 다음 맹장을 알콜로 소독하였다. 마우스를 다시 우리에 넣은 다음 다음 48 시간 동안 H₂0 만을 공급하였다.

PEG 15-20 에 대한 투여량 반응 곡선을 도 1B 에 나타내었다. 도 1A 에서 PEG 15-20 의 통계학적으로 현저한 보호 효과는 피셔정밀검정으로 측정하였다(P<0.001). 도 1B 는 PEG 15-20 의 최소 보호 농도는 5 % 로 측정되었음을 나타낸 것이다(P<0.001). 도 1C 는 30 % 수술적인 간절제술 이후에 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 을 직접 맹장 주사한 후 24 시에 맹장의 내용물(분변), 세척한 맹장 점막, 간 및 혈액 내에 존재하는 정량적인 박테리아 배양물을 나타낸 것이다. 일원 ANOVA 로 간절제술 이후 마우스의 맹장 내용물, 점막, 간 및 혈액에 존재하는 박테리아의 수가 통계학적으로 현저하게 증가되었음을 측정하였다(P<0.001). PEG 3350 에 대하여 간 및 혈액 내에 존재하는 박테리아의 수는 통계학적으로 현저하게 감소(P<0.05)되었으며, PEG 15-20 은 마우스의 간 및 혈액에 PA27853 이 유포되는 것은 완전하게 예방하였다.

슈도모나스 애루지노사 균주 ATCC 제 27853 호(PA27853)는 혈액 배양물에서 임상적으로 분리되는 비-점성 균주이다. 미리 30 % 무혈 수술적인 간절제술을 받은 마우스에게 균주 PA27853 을 직접 맹장 주사함에 따라 임상적 패혈증이 유발되었으며 48 시에는 모두 죽었다. 슈도모나스 애루지노사를 유사하게 주사한, 간절제술 없이 허위 개복술을 받은 마우스(대조군)는 패혈증의 임상적 징후 없이 완전하게 살아남았다(도 1A 참조). 이러한 모델에서 사망률을 저해하거나 약화시키는 PEG 용액의 능력을 측정하게 위해, 1×10⁷ cfu/ml 농도의 PA27853 200 ul 를 2 개의 10 %(w/v)의 PEG 용액(PEG 3.35 대 PEG 15-20) 중 하나에 현탁시켰다. PEG-3.35 는 지난 25 년 동안 임상적 용도로 사용해왔던 PEG(Golytely^®)의 분자량을 나타낸다. 대조적으로, 본 발명의 PEG 용액은 15-20 kD 사이의 다양한 분자량을 갖는 PEG 이다. PEG 3.35 는 간절제술을 받은 마우스의 사망률에 영향을 미치지 않지만, PEG 15-20 은 완전하게 보호한다. 사실상, 피셔정밀검정으로 측정한 바와 같이(P<0.001), PEG 15-20 은 통계학적으로 현저한 보호 효과를 나타낸다. 투여량-반응 실험으로 완전하게 보호되는 최소 농도의 PEG 15-20 이 5 % 용액임을 측정하였으나(P<0.05, 도 1B 참조), 그럼에도 불구하고 본 분야의 숙련자들은 5 % 보다 낮은 HMW PEG 용액이 몇몇의 보호 효과를 제공한다는 것이 예상되었다는 것을 인지할 것이며, 이는 본 발명의 범주 내에 속한다. 실험군 및 대조군의 마우스 내에 존재하는 박테리아의 수에 관하여, 일원 배치분산분석(ANOVA)으로 간절제술을 받은 마우스의 맹장 내용물, 점막, 간 및 혈액에서 박테리아의 수가 통계학적으로 현저하게 증가되었음을 측정하였다(P<0.001). PEG 3350 에 대하여 간 및 혈액 내의 박테리아 수는 현저하게 감소하였으며(P<0.05), PEG 15-20 은 마우스의 간 및 혈액에 PA27853 이 유포되는 것을 완전하게 저해하였다. PEG 15-20 은 간 및 혈류에서의 장내 PA27853 의 유포를 완전하게 저해하였다(도 1C 참조). 이러한 데이터는 PEG 용액의 작용이 비-살균성 메카니즘을 포함한다는 것을 나타낸다. 포유동물 세포에 대하여 비-독성인 PEG 농도(즉, ≤ 약 10 %)로 주어진 경우, 박테리아 성장 패턴에 대한 효과는 측정할 수 없다.

본 실시예는 HMW PEG 가 부분적 간절제술 형식으로 수술적인 중재를 받은 마우스에서 장-유도 패혈증에 기인하는 사망률을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 이러한 마우스 모델은 HMW PEG 치료법이 침입성 외과수술(예를 들어, 부분적 간절제술)과 같은 물리적인 스트레스를 받은 사람과 포유동물과 같은 동물종의 사망률을 감소(즉, 모든 주어진 유기체의 사망 가능성을 감소)시키는데 유용하다는 것을 나타낸다. HMW PEG 치료법이 물리적 스트레스 이후(예를 들어, 후-수술 간호 중)에 발병되는 패혈증과 관련된 사망 또는 중증을 예방하는 방법에 효과적이라는 것을 예상하였다. 또한, HWM PEG 치료법은 스트레스가 예상되는 환경에서 중증 또는 사망의 위험을 감소시키기 위해 물리적인 스트레스 이전(예를 들어, 전-수술 간호 중)에 사용될 수 있다. HMW PEG 치료법은 또한 장-유도 패혈증과 관련된 질환 또는 비정상적인 증상과 관련된 증상을 개 선시키는데 유용하다.

실시예 2

장내 상피에 대한 병원균 부착에 대한 HMW PEG 의 저해

폐쇄막은 포유동물 장관의 장벽 기능에서 중요한 역할을 수행하는 상피세포 세포골격의 동적 요소이다. 슈도모나스 애루지노사는 Caco-2 세포(ATCC 제 HTB 37 호) 및 T-84 세포(ATCC 제 CCL 248 호)의 경상피 전기 저항(TEER)에 의해 측정되는 바와 같이 폐쇄막 투과성에 심재성 변화를 유발한다. Caco-2 세포는 배양시 안정한 TEER 을 유지하는 잘-특성화된 인체 결장 상피세포이며, 이러한 세포주는 장내 병원균의 생체내 행동에 관한 인지된 생체외 모델을 제공한다. 배양된 Caco-2 단층의 TEER 에서의 슈도모나스 애루지노사 PA27853-유도 감소에 대한 PEG 의 보호 효과를 측정하기 위해, 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 을 10 % PEG 3.35 또는 10 % PEG 15-20 이 존재하는 두 Caco-2 세포 단층 상에 정단적으로 접종시켰다. TEER 은 8 시간 동안 연속적으로 측정하였으며 TEER 에서의 최대 감소를 기록하였다.

PEG 15-20 만이 TEER 에서의 슈도모나스 애루지노사-유도 감소를 현저하게 보호하였다(도 2A 참조). 도 2 에 나타낸 데이터는 1×10⁷ cfu/ml 의 PA27853 에 8 시간 동안 3 중 배양물(n=7)을 정단 노출시켰을 때 TEER 에 있어서 기준선으로부터 최대 감소된 평균±SEM % 값을 나타낸다. PA27853 에 노출시킨 Caco-2 세포에서 측정한 바와 같이, 일원 ANOVA 로 TEER 이 통계학적으로 현저하게 감소되었음을 밝혀냈다(P<0.001). PA27853 에 의해 유도되는 TEER 의 감소에 대한 통계학적으로 현저한 보호 효과는 PET 15-20 에 대하여 나타난다(P<0.001). 도 2B 는 PEG 3.35 의 존재 하에 PA27853 에 정단 노출시킨 Caco-2 세포를 나타낸 것이다. PEG 3.35 존재 하에 공동 배양한 지 4 시간 후에, 단층 구조물 상에 30-40 마이크론의 부유하는 세포를 수반하는, 초점적 부착 박테리아가 나타나는 Caco-2 세포 단층의 붕괴가 관찰되었다(도 2B 참조). 대조적으로, PEG 15-20 존재시 4 시간 동안 PA27853 에 정단 노출시킨 Caco-2 세포의 사진을 나타내는 도 2C 는 시험된 평면에서 부유하는 세포가 없다는 것을 나타낸다. Caco-2 세포 보존성에 대한 PEG 15-20 의 보호 효과는 1×10⁶ cfu/ml 의 PA27853 에 4 시간 동안 노출시킨 다음 세포 상청액에서 15 배 높은 박테리아의 회수율에 의해 반영되는 보다 적은 박테리아 부착과 관련된다.

TEER 의 보존에 의해 판단되는 바와 같이, 슈도모나스 애루지노사의 장벽-붕괴 효과에 대한 PEG-배양 인체 장내 상피세포의 저항은 병원균의 침입 위험에 작용하는 폐쇄막 장벽 기능을 안정화시키기 위한 실용적인 연구를 제공한다. PEG 15-20 의 치료학적 가치에 대한 다른 증거는 상피 수송 기능(Na⁺/H⁺ 교환, 글루코스 수송)이 이러한 화합물에 의해 영향을 받지 않는다는 것이다.

따라서, HMW PEG 는 장내 상피 장벽에 불활성이고, 이에 대한 안정화 효과를 나타낸다. 본 발명은 포유동물, 바람직하게 사람과 같은 동물에게 HMW PEG 를 투여하여 슈도모나스 애루지노사와 같은 장내 병원균과 관련된 장내 장벽 이상성을 치료하는 방법을 포함한다. 장내 장벽 이상성은 본 분야에서 공지되어 있는 모든 진단 기술 또는 다른 수단에 의해 알아낼 수 있다. 그러나 HMW PEG 치료 전에 장내 장벽 이상성을 확인할 필요는 없다. HMW PEG 치료와 관련된 저비용 및 높은 정도의 안정성은 장내 장벽 이상성의 적어도 하나의 증상 특성을 나타내는 동물에게 사용되는 치료방법 뿐만 아니라, 바람직하게 위험에 있는 유기체를 위한 예방방법에 적합하다. HMW PEG 치료방법은 장내 장벽 이상성과 관련된 증상을 개선시키고 ; 바람직하게, 상기 방법은 처리된 유기체에서 장-유도 패혈증의 영향을 감소시키거나 소멸시킨 다.

실시예 3

HMW PEG 는 병원균의 독성 발현을 저해함

슈도모나스 애루지노사 PA27853 에서의 PA-I 렉틴/부착인자의 발현은 간절제술을 받은 마우스의 맹장에서 증가되며, 마우스 장에서 슈도모나스 애루지노사의 치사 효과에 중요한 작용을 한다. PA-I 는 상피에 대한 PA27853 의 부착을 촉진시킬 뿐만 아니라 세포독소, 외독소 A 및 엘라스타에 대한 현저한 장벽 단점을 유발시킴으로써 마우스 장내에서 현저한 독소 결정인자로 작용한다. 슈도모나스 애루지노사에서의 PA-I 발현은 전사 조절인자 RhlR 및 이의 동원 활성인자 C4-HSL 에 의해 조절된다. PA27853 에서의 PA-I 발현은 C4-HSL 에 노출시킴으로써 증가될 뿐만 아니라 Caco-2 세포, Caco-2 세포 제제 및 Caco-2 세포 배양물의 상청액과 접촉시킴으로써 증가된다.

전사 수준에서 PA-I 발현을 분석하기 위해 노던 혼성화를 사용하였다. 슈도모나스 애루지노사의 총 RNA 는 변형된 3 차-세정 방법으로 분리하였다. 프로브는 다음의 프라이머를 사용하는 PCR 로 제조하였으며, 이는 pCR 2.1 벡터(인비트로겐 코포레이션에서 입수) 내로 클로 닝된다 : PA-I 프라이머 : F(ACCCTGGACATTATTGGGTG)(SEQ ID NO : 1), R(CGATGTCATTACCATCGTCG)(SEQ ID NO : 2) 및 16S 프라이머 : F(GGACGGTGAGTAATGCCTA)(SEQ ID NO : 3), R(CGTAAGGGCCATGATGACTT)(SEQ ID NO : 4). 이러한 삽입물은 PA-I 또는 16S 의 서열과 매치되는 서열을 갖는다. PA-I 및 16S 에 대한 특정 cDNA 프로브는 α³²P-dCTP 로 방사성표지하였다. 특정 방사능은 스토움 860 형광영상장치(Storm 360 phosphorimager ; 캐나다에 소재하는 Molecular Dynamics 에서 입수)로 측정하며, 대조군에 대한 상대적인 변화율은 PA-I 및 16S 의 강도 비율에 근거하여 계산하였다. PA-I 단백질 분석을 하기 위해 토끼 친화도-정제된 폴리클로날 항-PA-I 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 1 ml 의 슈도모나스 애루지노사 세포를 PBS 로 세척하고 100 ℃ 의 용해 완충용액(4 % SDS, 50 mM Tris-Hcl, pH 6.8)에서 가열하였고 ; 트리신 SDS-PAGE 후에 단백질의 전기이동에 의해 면역블롯 분석을 수행하였다. PA-I 렉틴은 ELC 시약(뉴저지에서 소재하는 Amersham 에서 입수)으로 검출하였다.

1 mM 의 정족수-인지 신호전달 분자 C4-HSL 에 대한 슈도모나스 애루지노사 PA27853 의 노출은 10 % PEG 3.35 에서 부분적으로 저해되고 10 % PEG 15-20 에서 보다 많이 저해되는 PA-I 단백질 발현을 통계학적으로 현저하게 증가시켰다(P<0.001, 일원 ANOVA) ; (도 3 참조). C4-HSL-유도 PA-I 발현에 대한 PEG 15-20 의 최소 완전 저해 농도는 5 % 이다(P<0.01, 일원 ANOVA). PEG 가 존재하고 존재하지 않는 조건 하에서 C4-HSL 에 노출시킨 각각의 박테리아 세포에 관한 전자 현미경 시험은 C4-HSL 이 슈도모나스 애루지노사의 형태 발현 및 섬모 발현시 형태학적 변화를 유발시킨 다는 것을 나타낸다(도 3B 참조). C4-HSL-유도 형태학적 영향은 PEG 15-20 의 존재시 완전하게 소멸되지만, PEG 3.35 의 존재시에는 완전하게 소멸되지 않는다. 할로-유형 효과는 PEG 15-20 에 노출된 PA27853 주위에 나타난다(도 3B 참조). 0.1 mM 의 C4-HSL 에 대한 PA27853 의 노출로 노던 블롯을 사용하는 평가시 PA-I mRNA 발현이 통계학적으로 현저하게 증가되었다(P<0.001, 일원 ANOVA). PA-I 발현은 10 % PEG 15-20 에 의해 현저하게 저해된다. 도 3D 는 Caco-2 세포에 노출시킨지 4 시간에 유도된 PA-I mRNA 의 증가가 PEG 15-20 에 의해서는 저해되나 PEG 3.35 에 의해서는 저해되지 않는다(P<0.001 일원 ANOVA)는 것을 나타낸다.

박테리아를 10 % PEG 15-20 으로 예비 처리하였을 때, 100 μM-1 mM 의 C4-HSL 에 의해 유도된 PA27853 에서의 PA-I 발현(단백질 및 mRNA)의 현저한 독성약화(3-4 배 감소)가 관찰되었음이 본원에 나타낸 데이터에 나타나 있다. 이러한 효과는 PEG 3.35 에 있어서 관찰되지 않았다(도 3A 참조). 독성약화의 정도가 10 % PEG 15-20 의 독성약화에 비해 현저 히 낮지만 C4-HSL-유도 PA-I 발현의 독성약화는 10 % PEG 3.35 에서 또한 관찰되었다. PA-I 단백질의 C4-HSL 유도 발현를 저해하는 PEG 15-20 의 최소 농도는 5 % 이다(도 3A 참조). C4-HSL 에 노출시킨 각각의 박테리아 세포를 전자 현미경으로 관찰하여 C4-HSL 이 PA27853 의 외형 및 선모(pili) 발현에서 형태적 변화를 일으킴이 관찰되었다. C4-HSL-유도 형태적 효과는 PEG 15-20 의 존재 하에서 완전히 제거되었지만 PEG 3.35 에서는 제거되지 않았다(도 3B 참조). Caco-2 세포에 4 시간 동안 노출시켜 유도된 PA-I 발현(mRNA)은 PEG 15-20 의 존재 하에서 저해되었지만, PEG 3.35 에서는 저해되지 않았다(도 3B 참조). PEG 15-20 와 함께 Caco-2 세포-유도 PA-I 발현의 방어작용은 밤새 노출시킨 실험에서 지속되었다.

HMW PEG 는 공지된 자극에 반응하여 슈도모나스 애루지노사의 독성 발현에 또한 영향을 주었다. 정족수-인식 신호전달이 이러한 병원균에 대한 독성 발현의 잘-확립된 메커니즘이라면 PA27853 에서의 C4-HSL-유도 PA-I 발현의 독성약화는 PEG 15-20 의 주요한 방어작용일 수 있다. PA-I 의 Caco-2 세포-유도 발현과 함께 PEG 15-20-유도 간섭은 PEG 15-20 의 방어작용의 중요한 양상임을 예측할 수 있다. PEG 15-20 은 30 % 간절제술을 한 다음에 마우스로부터 여과시킨 맹장 내용물(분변)에 반응하여 슈도모나스 애루지노사(PA27853) PA-I 발현의 독성약화를 통하여 숙주 동물에서 방어작용을 갖는다는 것을 발견하였다. 슈도모나스 애루지노사의 독성 발현을 증가시키는 숙주 인자(host factor)로부터 슈도모나스 애루지노사를 감싸는 PEG 15-20 의 능력은 장-유도 패혈증으로부터 유기체를 보호하는 또다른 메커니즘임을 예측할 수 있다.

따라서, 본 발명은 슈도모나스속의 하나와 같은 장내의 병원균에 의한 결정인자 또는 독성 요소의 발현에 의해 특징지어지는 증상을 예방하거나 치료하기 위해 동물에 HMW PEG 를 투여하는 방법 및 키트의 형태에서의 물질을 포함한다. 독성 결정인자는 독성에 직접적으로 또는 간접적으로 기여할 수 있다. 직접적인 기여의 예로는 장내 상피에 대한 장내 병원균의 유착으로 슈도모나스 애루지노사의 PA/I 렉틴/부착인자의 효과 및/또는 세포독소, 외독소 A 및 엘라스타제에 대한 장벽 결여의 생성이다.

실시예 4

PEG 는 병원균의 세포 성장 또는 세포막 보존성(integrity)에 영향을 미치지 않는다

박테리아 막 보존에서 두 가지 PEG 용액(PEG 3.35 및 PEG 15-20)의 효과를 SYTO 9 및 프로피디움 요오드화물로 구성된 염색방법에 의해 검정 하였다. 어떠한 PEG 용액도 박테리아 막 투과성에 어떠한 효과도 나타내지 않았다(도 4A 참조). 살아있는/죽은 박테리아 생존능력 키트 L-3152(Molecular Probes 에서 입수하였음)를 사용하여 막 보존을 측정하였다. 박테리아를 정량하였고 상이한 배양 시간에서 취한 10 배 희석물의 시료를 도말하여 cfu/ml 로서 계수를 나타내었다. 두 가지의 PEG 용액 둘 중 하나를 함유하는 TSB 배지에서 밤새 성장시킨 슈도모나스 애루지노사의 성장 곡선에서 나타낸 박테리아의 양에서 PEG 용액에 의해 저해 효과가 없음이 관찰되었다(도 4B 참조). 실제로, 각각의 PEG-함유 배지에서의 성장 패턴은 PEG-유리 TBS 배지에서의 성장 패턴과 비교할 수 없다. 에너지 대사 및 젖산탈수소수효소(LDH)에 영향을 끼치는 하우스키핑 효소(housekeeping enzyme)의 활성도를 성장의 지수기 및 정지기 동안에 다양한 시점에서 측정하였다. 결합된 디아포라아제 효소 검정으로 CytoTox 96(Promega 에서 입수하였음)으로부터의 기질 혼합물을 사용하여 LDH 활성도를 측정하였다. BCA 단백질 검정(Pierce 에서 입수하였음)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. PEGs 의 존재 하에서 성장한 슈도모나스 애루지노사의 세포-유리 상청액에서의 LDH 활성도는 변화가 없는 것으로 관찰되었다. 이러한 실험의 결과 HMW PEG 가 박테리아 성장 패턴에서 무시해도 좋은 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 방법 및 상응하는 산물(예를 들어, 키트)은 장내 세균총의 조성에 현저한 영향을 끼치지 않고 장-유도 패혈증과 연관된 질환 또는 비정상적인 증상을 예방하거나 치료하기 위한 장점을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명의 방법 및 산물은 장내 미생물 조성에 현저한 변화없이 이러한 질환 또는 비정상적인 증상과 연관된 징후를 개선시키기 위해 사용할 수 있다. 장내 세균총의 조성을 현저하게 교란시키지 않는 방법(및 키트)은 상기 교란으로부터 일어나는 2 차적인 건강 합병증을 유도하는 것으로 예측되지 않는 한 이러한 방법이 바람직함을 본 분야의 숙련자들은 인지할 수 있다.

실시예 5

PEG-코팅 병원균의 원자간력 현미경(Atomic force microscopy)

밤새 성장시킨 PA27853 의 배양물의 1 % 분할량을 10 % HMW PEG 가 함유되어있거나 또는 함유되지 않은 트립톤 처리한 대두 배지(tryptic soy broth, TSB)에서 4 시간 동안 37 ℃ 에서 계대배양하였다. 각각의 소량의 계대배양물을 회수하고 슈도모나스 애루지노사 PA27853 세포를 PBS 로 세척한 다음에 10 분 동안 운모(mica)의 표면에서 공기를 불어넣어 건조시키고 즉시 이미지화하였다. 탭핑-모드 AFM(tapping-mode AFM)으로 건조시킨 박테리아의 이미지를 멀티모드 나노스코피 IIIA 스캐닝 프로브 마이크로스코피(Multimode Nanoscope IIIA Scanning Probe Microscope, MMAFM)(Digital Instruments 에서 입수하였음)를 사용하여 공기 중에서 이미지화하였다. 서브컨플런트(subconfluent) Caco-2 세포를 4 시간 동안 10 % HMW PEG 로 처리하였고, PBS 로 세척하였다. 세포의 AFM 이미지를 오-링(O-ring)을 사용하지 않고 PBS 에서 실행하였다. 전자 현미경법을 위해, PA27853 을 1 mM C4-HSL 및 10 % HMW PEG 가 함유되어 있거나 또는 함유되지 않은 TSB 에 접종하고 밤새 배양하였다. 소량의 1 % 의 슈도모나스 애루지노사를 전자현미경 하에서 검사하기 전에 아세트산우라늄으로 염색하고 0.5 M NaCl 로 세척하였다.

원자간력 현미경으로 관찰한 Caco-2 세포는 솔가장자리 미세융모(brush border microvili)와 함께 표준적인 균일하지 않은 표면을 나타내었고, 반면에 PEG 3.35 에 노출시킨 Caco-2 세포는 상피세포의 표면에서 평탄한 평면상의 형태를 나타내었다(도 5A, 5C 참조). PEG 15-20 은 보다 복잡한 국소해부학적으로 뚜렷한 덮힘(covering)을 나타내는 국소해부학적으로 뚜렷한 평면(도 5E 참조)을 따라 비대칭으로 채움으로써 Caco-2 세포를 덮는 것으로 나타났다. 어느 정도의 유사한 방식으로, PEG 3.35 에 노출시킨 PA27853 세포는 흩어진 평탄한 형태로 박테리아 세포에 대한 중합체의 평탄한 코팅 형태를 나타내었고(도 5D 참조), 반면에 보다 국소해부학적으로 비대칭 방식으로 박테리아를 완곡하게 감싸고 둘러싸는 것으로 나타났다. PEG 15-20 에서의 박테리아 직경의 원자간력 측정의 횡단면 분석은 PEG 용액 내에서 박테리아/PEG 피막에서 현저한 증가를 나타내었다(도 5E, 5F 참조). 즉, PEG 3.35 는 각각의 박테리아 세포 주위에 평탄한 피막을 형성하였으며(도 5D 참조), 반면에 PEG 15-20 은 각각의 세포를 단단히 감싸고(도 5F 참조), 중합체/박테리아 직경을 증가시키며(도 5G, 5H 참조), 이로 인하여 서로 각각의 박테리아 세포를 떼어놓는다.

이론에 결부시키려는 목적 없이, HMW PEG 는 장내 상피로부터 떨어진 슈도모나스 애루지노사의 단순한 물리적 거리에 의해 이의 유익한 효과를 발휘할 것이다. 선택적으로, HMW PEG 는 병원성 세포의 세포-세포 상호작용으로부터 발생하는 병원성 정족수-인식 활성화 신호의 형성을 방해하는 이익을 제공할 것이다. 또한 이론에 결부시키려는 목적 없이, HMW PEG 로 생물학적 표면을 코팅하는 것은 코팅 PEG 사슬의 입체형태적 자유의 손실 및 접근하는 단백질의 반발을 결과로써 나타내는 것을 가능하게 한다. HMW PEG 및 Caco-2 세포 사이의 극성-극성 상호작용은 단백질을 반발하게 하는 분자 구조물에 특정 HMW PEG 곁사슬을 강요하는, PEG 사슬의 탄성에 영향을 줄 수 있다. 본원에서 나타낸 데이터는 아마도 Caco-2 세포와 HMW PEG 의 약간의 동력적인 상호작용의 결과로써 "입체형태적 엔트로피" 의 손실로 인하여 HMW PEG-코팅된 Caco-2 세포가 코팅되지 않은 Caco-2 세포에 비해 슈도모나스 애루지노사에 대해 보다 반발력을 가지는 결론을 뒷받침한다.

HMW PEG 처리가 이러한 세포의 표면 해부학에 현저하게 영향을 미치는, 처리된 세포에서 효과를 가지게 함을 이러한 실험의 결과로 확립되었다. 게다가, 이러한 세포에서의 HMW PEG 노출의 효과는 PEG 3.35 가 이러한 세포에서 나타낸 효과와 상이하다. 이론에 결부시키려는 목적 없이, 본원에 나타낸 결과는 PEG 3.35 와 같은 보다 낮은 분자량의 PEGs 에 대하여 HMW PEG 에 의해 제시된 세포에서 현저하게 상이한 효과에 대한 물리적인 관계를 제공한다.

실시예 6

HMW PEG 는 세포-세포 상호작용에 영향을 준다

슈도모나스 애루지노사의 공간적 방향에서 PEG 용액의 효과를 직접적으로 관찰하기 위해, 녹색 형광 단백질을 코드하는 egfp 유전자를 제공하는 살아있는 균주 슈도모나스 애루지노사 PA27853/EGFP 를 사용하여 실험하였다. Caco-2 세포의 존재 및 부재 하에서 실험을 수행하였다. 박테리아 및 배양된 표피와 이들의 상호작용에서 PEGs 의 효과를 이미지화하기 위해, 미분간섭(DIC) 현미경 및 GFP 영상을 사용하였다.

녹색 형광 단백질을 코드하는 EGFP 유전자를 주형으로서 pBI-EGFP 플라스미드(Clontech 에서 입수하였음)를 사용하여 증폭시켰다. 프라이머 TCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGGATG(SEQ ID NO : 5) 및 GCAGACTAGGTCGACAAGCTTGATATC(SEQ ID NO : 6)을 사용하여 Xbal 및 Pstl 제한부위를 도입하였다. PCR 산물을 TA-클로닝 키트(Invitrogen Corporation 에서 입수하였음)를 사용하여 pCR 2.1 벡터(Invitrogen Corporation 에서 입수하였음)내로 직접적으로 클로닝하고, E.coli DH5a (Invitrogen Corporation 에서 입수하였음) 내로 pCR2.1/EGFP 구성물을 형질전환시켰다. EGFP 유전자를 Xbal 및 Pstl 로 가수분해하여 이러한 구성물로부터 잘라내고, 절단된 유전자를 포함하는 단편을 동일한 제한효소로 가수분해한 E.coli-슈도모나스 애루지노사 셔틀 벡터 pUCP 24 내로 클로닝하였다. 상기 벡터 pUCP 24 는 pUCGM[pUC 19(ATCC 제 37254 호) + 850-bp Gm^r cassette]에서의 평활-말단 832-bp Gm^R 코딩 단편으로 pUCP 18[pUC 18(ATCC 제 37253 호) 상에서 1.9-kb Pst I 단편이 제공된 상태]에서 1352-bp ScaI-StuI 단편을 치환시킴으로써 수득하였다(하기 그림 참조). 셔틀 벡터 내에 EGFP 유전자를 함유하는 결과적으로 생성된 구성물(즉, pUCP 24/EGFP)을 PA27583 전기 수용능력이 있는 세포(electro-competent cell) 내로 25 μF 및 2500 V 로 일렉트로포레이션하였다. PA27853/EGFP 를 함유하는 세포를 100 ㎍/ml 겐타마이신(Gm)을 함유하는 LB- 한천평판에서 선별하였다.

PA27853/EGFP 를 함유하는 세포를 100 ㎍/ml Gm 을 함유하는 LB 에서 밤새 성장시키고 1 % 의 배양물을 50 ㎍/ml Gm 을 함유하는 새로운 LB 에 접종하여 사용하였다. 3 시간 성장시킨 후에, 0.5 mM 의 최종 농도에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 첨가하였고, 배양물을 추가적으로 2 시간 동안 배양하였다. HEPES 로 완충시킨, 10 % 우태아 혈청을 함유하는 1 ml 의 HDMEM 배지(HDMEM HF)(Gibco BRL 에서 입수하였음) 및 10 % HMW PEG 를 100μl 의 박테리아 배양물과 혼합하였다. 1 ml 의 박테리아 현탁액을 두께 0.15 mm 의 dTC3 디쉬(Bioptech 에서 입수하였음)에 부었다. HDMEM HF 에서 두께 0.15 mm 의 dTC3 디쉬(Bioptech 에서 입수하였음)에서 성장한 4 일된 Caco-2 세포를 HMW PEG 와 함께 또는 HMW PEG 없이 HDMEM HF 에서 한번 세척하였다. 상기와 같이 제조한 1 ml 의 박테리아 현탁액을 Caco-2 세포를 함유하는 dTC3 디쉬에 첨가하였다. dTC3 디쉬에서 박테리아 세포의 분산 형태를 63 X 의 객관적인 배율에서 DIC 및 GFP 형광 여과기를 사용하여 액시오버트 100 TV 형광도립현미경으로 직접적으로 관찰하였다. 온도를 바이오테크 항온기 온도 조절 시스템으로 조정하였다. 텅스텐 램프(100 V)를 DIC 및 GFP 흥분(excitation)시키기 위해 사용하였다. Intelligent Imaging Innovations 으로부터 입수한 3 D 영상 소프트웨어(Slidebook)를 GFP 여과기를 사용하여 Z 평면에서 박테리아 세포 분산 형태를 이미지화하였다. Caco-2 세포가 없는 배지에서 균일하게 분산된 부유성 슈도모나스 애루지노사 세포를 DIC 이미지(도 6A₁ 참조) 및 Z 평면 재구성(도 6A₂ 참조)에서 볼 수 있었다. Caco-2 세포의 존재 하에서, 박테리아 세포는 군집을 이룬 양상으로 성장하였고(도 6B₁ 참조) Caco-2 세포에 부착된 것으로 관찰되었다(도 6B₂ 참조). 10 % PEG 3350 의 용액은 박테리아 운동성을 감소시켰고 웰의 바닥(도 6C₂ 참조)에 부착된 버섯-형상의 박테리아 마이크로콜로니의 직접적인 형성(도 6C₂ 참조)을 유도하였다. Caco-2 세포의 존재 하에서, 박테리아 마이크로콜로니는 상피세포의 평면 위에 약 8 마이크론이다(도 6D₁, 6D₂ 참조). 10 % PEG 15-20 의 용액은 슈도모나스 애루지노사 세포의 운동성을 매우 감소시켰다. 그럼에도 불구하고, PEG 15-20 을 함유하는 배지에서 처음 0.5-1 시간동안 배양하여, 박테리아 세포는 웰의 바닥에 접하여 거미 다리-형상의 마이크로콜로니를 형성하였다(도 6E₁, 6E₂ 참조). 수시간 이내에, 거미 다리-형상의 마이크로콜로니는 배지의 전체 공간/부피를 차지하였다. Caco-2 세포의 존재 하에서, 슈도모나스 애루지노사 세포는 거미 다리-유사 입체배치를 잃고 상피의 평면 상에서 높이 상승(30-40 마이크론)됨이 관찰되었다(도 6F₁, 6F₂ 참조).

3 차원에서의 박테리아-상피세포 상호작용의 공간적 방향을 측정하기 위해, Z 평면 재구성을 수행하였다. 두 가지의 PEG 용액이 Caco-2 세포의 존재 또는 부재에 따라 슈도모나스 애루지노사의 응집 반응에서 상이한 효과를 가졌고 박테리아의 공간적 방향에 상이하게 영향을 미침을 이미지는 나타내었다. 배지만의 실험에서, 균일하게 분산된 형태를 나타내기 위해 슈도모나스 애루지노사를 살펴보았다(도 6A 참조). 그러나, Caco-2 세포의 존재 하에서 시험한 박테리아 세포는 웰의 바닥에서 군집을 이룬 양상으로 발달하였고 상피세포의 평면에 인접하게 관찰되었다(도 6B 참조). PEG 3.35 만이 존재하는 조건 하에서 시험한 박테리아 세포는 큰 군집을 이룬 집합체를 형성하였고, 배양 웰의 바닥에 잔존하였고(도 6C 참조), 반면에 PEG 3.35 를 함유하는 배지에서 Caco-2 세포와 시험한 박테리아 세포는 이들 군집을 이룬 양상을 유지하면서 상피세포의 평면(약 8 마이크론) 상에서 현탁된 상태로 잔존하였다(도 6D 참조). 오직 PEG 15-20 의 존재 하에서 검사한 박테리아 세포는 마이크로군집 (microclumping)의 균일한 형태를 나타내었고(도 6E 참조), 반면에 PEG 15-20 을 함유하는 배지에서 Caco-2 세포의 존재 하에 시험한 박테리아 세포는 군집을 이룬 형태로 상피의 평면(~ 32 마이크론) 상에 보다 높은 곳에서 현탁된 상태로 나타났다(도 6F 참조). 시기가 정해진 실험에서, 박테리아의 운동성은 PEG 3.35 에 의해 감소되었고 PEG 15-20 와 함께 보다 큰 정도로 감소됨이 관찰되었다.

실시예 5 에 기재된 실험과 유사한 방법으로, 본 실시예는 본원에 기재된 바와 같이 이의 유익한 예방학적 및 치료학적 활성도와 일치하는, 세포-세포 상호작용에서의 HMW PEG 의 관찰된 효과에 대한 물리적 상호 관계를 제공한다. HMW PEG 의 사용은 장-유도 패혈증과 연관된 질환 및/또는 비정상적인 증상의 위험을 감소시키는, 장내에서 해로운 세포-세포(예를 들어, 장내 상피세포와 슈도모나스속과 같은 장내 병원균 사이의) 상호작용을 감소시키거나 제거할 수 있음을 예상할 수 있다.

실시예 7

질환/비정상적인 증상을 예방하는 방법

본 발명은 또한 인체 및 다른 동물, 특히 다른 포유동물에서의 다양한 질환 및/또는 비정상적인 증상을 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, HMW PEG 의 유효량을 이를 필요로 하는 인체 환자 또는 동물 피실험자에게 투여하였다. 본 분야에서 공지된 일반적인 최적의 절차를 사용하여 결정된 투여 일정을 이용하여 PEG 를 투여하였다. 바람직하게, PEG 는 5,000-20,000 달톤 및 보다 바람직하게 10,000-20,000 달톤 사이의 평균 분자량을 갖는다. 적어도 5 % HMW PEG 를 투여하는 것을 계획하였다. HMW PEG 를 모든 적절한 형태, 예를 들어 용액, 겔 또는 크림, 분무하기에 적절한 용액(예를 들어, 흡입의 용도를 위해)으로 HMW PEG 를 포함하는 약학적 조성물 및 동물에게 주사하기에 적절한 멸균, 등장성 용액으로 투여할 수 있다. 모든 일반적인 경로를 사용하여 투여할 수 있다 ; 이는 HMW PEG 를 경구적으로 또는 국부적으로(예를 들어, 경피적으로) 투여할 수 있음을 특히 예상할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 투여된 HMW PEG 조성물은 추가로 다음 중에서 선택한 화합물을 포함한다 : 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 덱스트란-코팅 부티르산, 프락토-올리고당, N-아세틸-D-갈락토사민, 덱스트란-코팅 만노스, 갈락토스 및 락툴로스. 또다른 실시형태에서, 투여된 HMW PEG 조성물은 추가로 다음 중에서 선택한 화합물을 포함한다 : 덱스트란-코팅 L-글루타민, 덱스트란-코팅 이눌린, 덱스트란-코팅 부티르산, 하나 또는 그 이상의 프락토-올리고당, N-아세틸-D-갈락토사민, 덱스트란-코팅 만노스, 갈락토스 및 락툴로스.

본 발명은 다음과 같은 다양한 질환 및 비정상적인 증상을 예방하는 방법을 제공한다 : 외이도염, 급성 또는 만성 중이염, 환기장치-연관 폐렴, 장-유도 패혈증, 괴사성 소장결장염, 항생제-유도 설사, 가막성 대장염, 염증성 장질환, 과민성 장질환, 호중구감소성 소장결장염, 췌장염, 만성 피로 증후군, 장내불균형 증후군, 현미경적 대장염, 만성 요로 감염증, 성전염성 질환, 및 감염증[예를 들어, 바실러스 안트라스, 천연두 바이러스, 장관병원성 E. coli(EPEC), 장관출혈성 E. coli(EHEC), 장관흡착성 E. coli(EAEC), 클로스트리듐 디피실, 로타바이러스, 슈도모나스 애루지노사, 세라티아 마르세센스, 클렙시엘라 옥시토시아, 엔테로박테리아 클로아케, 칸디다 알비칸스 및 칸디다 글루브라다 등과 같은 바이오테러 인자(bioterror agent)에 의해 오염된 환경에 노출]. 만성 요로 감염 증을 예방하거나 이러한 감염증을 치료하는 방법의 바람직한 실시형태에서, HMW PEG 를 방광 세척액(bladder irrigant)의 형태로 수송하였다. 성전염성 질환의 예방을 위해, 본 발명의 조성물을 바람직하게 콘돔을 윤활하게 하기 위해 사용하였다. 바이오테러 인자에 의한 감염증을 예방하기 위한 방법의 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 국소적인 적용(application)에 적합한 겔 또는 크림의 형태를 제공한다. 이러한 국소적인 적용은 생존, 건강 또는 위안에 관하여 인체 또는 동물을 위협하는, 모든 바이오테러 인자와 연관되거나 또는 다양한 화학적 또는 물리화학적 제제와 연관된 다양한 질환/비정상적인 증상을 예방하는데 유용할 수 있음을 예측할 수 있다. 이러한 화학적 또는 물리화학적 제제는 피부를 타게하거나 그렇지 않으면 상처입게 할 수 있는 이러한 제제를 포함하며 이는 본 발명의 조성물에서 불활성이 되거나 불충분하게 용해된다.

예방하는 방법의 하나의 실시형태에서, 수컷 Balb/c 마우스를 마취시키고 PEG 15-20 의 수성 5 % 용액을 직접적인 침천자(needle puncture)로 맹장의 기저내로 주사하였다. 실험의 48 시간 지속시간 동안 PEG 를 일정하게 제공하기 위해, 바늘을 소장[회장(ileum)]내로 주입하였고 1 ml 의 PEG 15-20 을 인접한 장내로 주사하였다. 천공 부위(puncture site)를 견사제(silk suture)로 묶고 맹장을 알콜로 소독하였다. 마우스 를 우리로 돌려보내고 H₂O 만 주었다. 48 시간 뒤에, 마우스를 부드러운 좌엽(floppy left lobe)을 따라 30 % 의 무혈 간 적출을 수반하는 일반적인 간절제술을 받았다. 대조군 마우스는 간절제술 없이 간의 조작을 경험할 것이다. HMW PEG 의 투여를 수반하는 예방하는 치료는 마우스에서 수술-연관된 장-유도 패혈증의 빈도를 감소시키거나 제거함을 예측할 수 있다.

본 방법은 마우스, 기니피그, 개 및 고양이와 같은 애완동물, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 오리, 거위와 같은 농업적으로 중요한 동물 및 모든 다른 길들여진 동물의 예방 보호의 범위를 넘어서 적용할 수 있다. 게다가, 본 예방하는 방법은 외이도염, 급성 또는 만성 중이염, 환기장치-연관 폐렴, 장-유도 패혈증, 괴사성 소장결장염, 항생제-유도 설사, 가막성 대장염, 염증성 장질환, 과민성 장질환, 호중구감소성 소장결장염, 췌장염, 만성 피로 증후군, 장내불균형 증후군, 현미경적 대장염, 만성 요로 감염증, 성전염성 질환, 및 탄저 및 천연두를 포함하지만 이로 제한되지 않는 감염성 인자(예를 들어, 바이오테러 조성)와 같은 질환 및/또는 비정상적인 증상이 발병될 위험이 있는 많은 환자 또는 후보자의 건강 및 수명을 증진시키기 위해 인체에 적용할 수 있음을 예상할 수 있다. 상기에 나타낸 바와 같이, 예방하는 방법은 인체 또는 다른 동물에게 본 분야에서 공지되거나 또는 일반적인 투여 경로에 의해 적어도 5 % HMW PEG(5-20 kD)를 포함하는 조성물을 투여함을 포함한다. 바람직하게, 예방하는 방법은 상기에 기재한 하나 또는 그 이상의 질환 및/또는 비정상적인 증상이 발병될 위험이 있는 이러한 개인에게 실행하였으나, 본 발명의 조성물 및 방법은 인체 또는 다른 동물의 전체 집단 또는 소집단에게 이러한 질환 또는 비정상적인 증상을 널리 치료하거나 예방하기 위해 예방학적으로 또는 치료학적으로 유용할 수 있음을 예상할 수 있다.

실시예 8

HMW PEG 를 투여하여 모니터링하는 방법

본 발명은 또한 예를 들어, 치료방법에서 HMW PEG 를 투여하여 모니터링하는 방법을 예측할 수 있다. 이러한 모니터링 방법에서, 표지된 HMW PEG 를 단독으로 투여하거나 또는 표지되지 않은 HMW PEG 와 함께 배합하여 투여하고, 표지를 지속적이거나 또는 단순한 종점의 측정을 포함하는 때때로 중단된 일정에 따라 치료 동안에 측정하였다. 용어 "표지된" HMW PEG 는 표지 또는 검출가능한 화합물을 HMW PEG 에 직접적으로 또는 간접적으로 부착하거나, HMW PEG 를 HMW PEG 와 함께 표지와 연관되어 있는 리포터 화합물(reporter compound)에 부착시킨 것을 의미한 다(물론, HMW PEG 에 부착되지 않거나 이와 함께 연관시키기 위해 디자인된 표지는 하기에 기재된 바와 같이 본 발명에 의해 또한 예측할 수 있다). HMW PEG 를 본 분야에서 공지된 모든 검출가능한 표지를 사용하여 표지하였고, PEG 는 이를 검출할 수 있는 충분한 수준으로 표지되었다. 본 분야에서의 숙련자들은 수준이 표지 및 검출 방법에 따라 다양함을 인지할 수 있을 것이다. 본 분야에서의 숙련자들은 일반적인 최적화 방법을 사용하여 표지의 정도를 최적화할 수 있을 것이다. 사용 및 바람직하게 저장에서 안정한 비-공유결합 또는 공유결합으로 표지를 HMW PEG 에 화학적으로 결합시켰다. HMW PEG 에 공유결합으로 결합한 표지는 바람직하다. 표지 부착의 밀도를 HMW PEG 의 생물학적 활성도를 실질적으로 보존(본원에 기재한 바와 같은 유익한 예방학적 또는 치료학적 효과를 실현하기 위해 충분한 생물학적 활성도의 보존)하기 위해 조절하였다. 이를 본 분야에서 공지된 바와 같은 HMW PEG : 표지의 비율을 조절하여 일반적으로 수행하였다. HMW PEG 의 평균 분자의 상대적인 크기가 주어진다면, 다양한 표지는 이의 생물학적 활성도의 실질적인 보존과 함께 HMW PEG 에 부착하기에 적절할 것임을 예측할 수 있다.

본 발명에 의해 예측된 표지는 방사선표지, 색소포, 형광단 및 리포터(reporter)(리포터의 근처에서 검출가능한 화합물을 배치시키는 항체와 같은 결합 파트너 및 검출가능한 화합물의 생산을 촉진하는 효소를 포함)를 포함하는 본 분야에서 공지된 이러한 표지이다. 대표적인 효소 리포터는 발광 시스템의 효소성분 및 비색 반응(colorimetric reaction)의 촉매를 포함한다. 보다 바람직하게, 대표적인 리포터 분자는 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 및 효소(예를 들어, 서양 고추냉이 과산화효소, 발광효소, 분비된 알칼리성 인산가수분해효소(SEAP)를 포함하는 알칼리성 인산가수분해효소, β-갈락토시다제 ; β-글루쿠로니다제 ; 클로람페니콜 아세틸기전이효소)를 포함한다. 이러한 리포터의 용도는 본 분야에서 숙련자들에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 3,817,837 호, 미국 특허 번호 제 3,850,752 호, 미국 특허 번호 제 3,996,345 호 및 미국 특허 번호 제 4,277,437 호에 기재되어 있다. 리포터 효소에 의한 검출가능한 화합물로 변환되는 대표적인 효소 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드 또는 엑스갈(Xgal), 및 블로-갈(Bluo-gal)을 포함한다. 검출가능한 화합물로 변환될 수 있는 화합물인 효소 기질을 본 분야에서 이해된 바와 같이 특정 실시형태에서 또한 표지할 수 있다. 표지 및 이의 용도를 나타낸 미국 특허 문헌은 미국 특허 번호 제 3,817,837 호 ; 미국 특허 번호 제 3,850,752 호 ; 미국 특허 번호 제 3,936,350 호 및 미국 특허 번호 제 3,996,345 호를 포함한다. 대표적인 방사선표지는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³³P, ³⁵S 및 ¹²⁵I 이다 ; 대표적인 형광단은 플루오레세인(FITC), 로다민, Cy3, Cy5, 에쿼린 및 녹색 형광 단백질이다. 바람직한 표지는 플루오레세인과 같은 형광단이다.

본 발명의 모니터링 방법은 하나 이상의 표지를 또한 포함할 것이다. 하나의 실시형태에서, 첫 번째 표지는 치료한 후에 또는 치료 동안에 HMW PEG 의 위치를 확인하기 위해 사용되었고, 반면에 두 번째 표지는 적어도 하나의 미생물과 검출가능하게 연관되어 있는 한 하나 또는 그 이상의 미생물에 대해 특정하다. 예를 들어, 모니터링 방법은 HMW PEG 의 생물학적 활성도를 실질적으로 보존하는 의미로 HMW PEG 에 부착하는 플루오레세인을 포함할 수 있고, 원핵생물-특정 β-갈락토시다제 활성도의 검출을 위해 엑스갈 또는 블로-갈을 유리시킬 수 있다(즉, 부착시키지 않았다). 플루오레세인은 HMW PEG 을 나타내고, 반면에 착색된(청색) 산물은 슈도모나스속과 같은 락토스-대사 원핵생물 미생물의 존재를 나타낸다. 본 발명은 또한 모니터링 방법을 제공하며, 여기에서 단일 표지는 이러한 정보(즉, HMW PEG 의 위치 및 미생물의 존재의 표시)를 제공한다.

본 분야에서 공지된 모든 검출 기술은 본 발명의 모니터링 방법에 사용할 수 있다. 몇몇의 요인은 표지의 유형 및 모니터링될 생합성물질[예를 들어, 피부, 귀 도관(ear canal) 또는 장의 상피세포 ; 변, 점액 또는 조직 시료], 원하는 식별 수준, 예측되는 양의 측정 등을 포함하는 선택된 검출 기술에 영향을 줄 것이다. 적절한 검출 기술은 육안으로의 단순한 육안 검사, 적절한 광원 및/또는 기록을 위한 카메라가 장치된 내시경, 일반적으로 사용되는 가이거 계수기, x-레이 필름 및 섬광계수기 등과 같은 기기를 사용하는 육안 검사, 및 본 분야에서 공지된 모든 다른 검출 기술을 포함한다.

본 분야의 숙련자는 본 발명의 모니터링 방법이 치료방법을 최적화하는데 유용함을 인지할 것이다. 예를 들어, 모니터링 방법은 외이도염을 예방하거나 치료하기 위해 귀 도관의 상피세포와 같은 상피세포로 수송되는 HMW PEG 의 정량 및/또는 농도를 최적화하기 위해(예를 들어, HMW PEG 의 용액 또는 혼합물에 대한 원하는 점성을 수득하기 위해) 사용될 수 있다. 추가적인 실시예를 위하여, 표지된 HMW PEG 에 노출시킨 장관의 내시경 검사 또는 변 시료의 모니터링에 의해 내장 또는 장내 치료의 최적화를 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 모니터링 방법은 본 분야에서 공지된 모든 기술을 사용하여 미생물 및 장내 상피세포를 접촉시키고 상피세포에 대한 미생물의 부착성을 검출함을 포함하는, 장내 상피세포에 대한 부착 능력을 갖는 미생물에 대한 변 검정을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 마이크로플레이트 웰의 바닥 및/또는 옆면과 같은 적절한 표면에 장내 상피세포를 고정시켰다. 또다른 실시형태에서, 검출가능한 산물을 생성하는 리포터와 같은 직접적인 표지 또는 간접적인 표지는 검출 단계 전에 또는 동안에 첨가되었다. 모니터링 방법은 추가로 자유 표지의 첨가를 포함한다. 예를 들어, 유리 블로-갈을 락토스-대사 원핵생물 미생물을 함유하는 것으로 추정되는 시료에 첨가하였다 ; 만약 존재한다면, 미생물 효소 β-갈락토시다제는 블로-갈을 분해하여 검출가능한 청색 생성물을 산출할 것이다.

하나의 실시형태에서, 통상적으로 입수할 수 있는 장내 상피세포[예를 들어, Caco-2 세포(ATCC 제 HTB 37호) 및/또는 IEC-6 세포(ATCC 제 CRL 1592 호)]를 일반적인 기술을 이용하여 마이크로플레이트 디쉬의 웰에 고정시켰다. 변 시료를 수집하였고 인산염 완충식염수와 같은 액체와 함께 혼합하였다. 현탁된 미생물을 함유하는 액상의 혼합물을 수득하였으며[예를 들어, 적절한 여과(즉, 액체 현탁액에서 박테리아로부터 총 고형물의 분리) 또는 액체를 따르는 방법 등에 의해], PBS 에 1 : 100 으 로 희석하였다. 블로-갈을 생존한 미생물 현탁액에 첨가하였다. 이러한 미생물 현탁액을 24 ℃ 에서 1 시간 동안 마이크로플레이트 웰에 첨가한 다음에 결합하지 않은 미생물을 제거하기 위해 적절한 액체(예를 들어, PBS)로 웰을 세척하였다. 고정된 상피세포에 결합하지 않은 미생물 및/또는 결합한 미생물을 예를 들어, 편광현미경을 사용하여 계수하여 측정하였다. 선택적인 실시형태에서, 면역검정은 방사선 표지, 형광단 또는 발색단과 같은 표지를 임의로 부착시킨 미생물-특정 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 적절한 면역학적 시약과 함께 부착성을 검출하기 위해 사용하였다.

이러한 고정화는 상피세포에 부착된 미생물의 적확한 검출을 용이하게 할 수 있음에도 불구하고, 장내 상피세포 또는 미생물을 고정화시키는 것을 필요로 하지 않음을 본 분야에서의 숙련자들은 인지할 것이다. 예를 들어, 하나의 실시형태에서 고정화된 변 미생물은 고정되지 않은 장내 상피세포와 접촉을 일으킨다. 추가로, 본 분야에서 공지된 모든 적절한 액체는 모든 공지된 등장 완충액인 바람직한 액체와 함께 미생물 현탁액을 수득하기 위해 사용할 수 있음을 본 분야의 숙련자는 인지할 수 있다. 또한 상기에 기재한 바와 같이, 모든 공지된 표지는 세포 부착성을 검출하기 위해 사용할 수 있다.

관련된 양상에서, 본 발명은 상피세포를 포함하는 미생물 세포의 유착성을 검정하기 위한 키트 및 상피세포에 대한 미생물 세포 유착성을 검정하기 위한 프로토콜을 제공한다. 프로토콜은 미생물을 검출하는 공지된 방법을 기재하였다. 바람직한 키트는 장내 상피세포를 포함한다. 본 발명의 다른 키트는 추가로 형광단 또는 리포터와 같은 표지를 포함한다.

본 발명에 의해 예측되는 다른 모니터링 방법은 미생물 소수성에 대한 검정이다. 이러한 방법에서, 미생물 세포의 상대적인 또는 절대적인 소수성은 모든 일반적인 기술을 사용하여 측정하였다. 대표적인 기술은 본 분야에서 공지된 바와 같은 모든 미생물을 소수성 상호작용 크로마토그래피하는 것을 포함한다. Ukuku 등의 J. Food Prot. 65:1093-1099(2002)는 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되었다. 또다른 대표적인 기술은 모든 미생물의 비-극성 : 극성 액체 분리(예를 들어, 1-옥탄올 : 물 또는 크실렌 : 물)이다. Majtan 등의, Folia Microbiol(Praha) 47 : 445-449(2002)는 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되었다.

PEG 투여를 모니터링하기 위한 소수성 검정의 하나의 실시형태에서, 변 시료를 0.15 M NaCl 을 함유하는 50 mM 의 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 현탁시켰다. 현탁액에서의 미생물을 원심분리에 의해 수집하였고 동일한 완충액에 재현탁시켰으며, 원심분리-재현탁 주기를 반복하였다. 만약 실행할 수 있다면, 미생물을 660 nm 에서 0.4 의 흡광도에 대해 동일한 현탁액에 재현탁시켰으며, 이는 표지된 PEG 를 사용하지 않고 분광광도법으로 모니터링하는 것을 가능하게 할 것이다. 미생물 현탁액을 크실렌(2.5 : 1, v/v, Merck 에서 입수하였음)으로 처리하였고 현탁액을 강하게 2 분 동안 혼합하였으며, 현탁액을 실온에서 20 분 동안 두었다. 그리고 난 다음에, 수성상(aqueous phase)에서 미생물의 존재를 예를 들어 660 nm 에서 흡광도의 분광광도 정량에 의해 측정하였다. 백그라운드(background)를 제거하기 위해 인산나트륨 완충액을 함유하는 블랭크(blank)를 사용하였다.

이러한 방법에서 용도에 대한 변 시료로부터의 미생물 세포를 수득하기 위해, HMW PEG 는 미생물 현탁액을 수득하기 위해 사용된 액체에 상대적으로 불용성인 것이 바람직하고 모든 액체를 미생물 현탁액을 희석시키기 위해 사용하였다.

본 발명은 장내 상피세포를 포함하는 미생물 소수성에 대한 검정을 포함하는 모니터링 방법을 수행하기 위한 키트 및 미생물의 소수성을 정량하는 방법이 기재되어 있는 프로토콜을 추가로 제공한다. 바람직한 키트는 장내 상피세포를 포함한다. 관련된 키트는 추가로 형광단 또는 리포터와 같은 표지를 포함한다.

게다가 추가로, 본 발명은 장내 세균총의 시료를 수득함을 포함하고 PA-I 렉틴/부착인자 활성도를 검출함을 포함하는 모니터링 방법을 제공한다. 본 분야에서 공지된 PA-I 렉틴/부착인자 활성도를 검출하는 모는 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, PA-I 렉틴/부착인자를 PA-I 렉틴/부착인자를 특이적으로 인식하는 항체(폴리클로날, 모노클로날, Fab 단편과 같은 항체 단편, 단일 사슬, 키메라, 인간화 항체 또는 본 분야에서 공지된 다른 형태의 모든 항체)를 사용하여 측정할 수 있다. 면역검정은 본 분야에서 공지된 모든 면역검정의 형태, 예를 들어 ELISA, 웨스턴, 면역침강 등을 사용하였다. 선택적으로, 하나는 PA-I 렉틴/부착인자의 탄수화물 결합 능력을 검출할 수 있거나 또는 PA-I 렉틴/부착인자의 장내 상피 장벽을 파괴하는(breaching) 활성도를 시료에 노출시키기 전에 및/또는 노출시키는 동안에 상피층의 경상피 전기저항 또는 TEER 을 모니터링하여 측정하였다. 관련된 키트에서, 본 발명은 PA-I 렉틴/부착인자 결합 파트너 및 PA-I 렉틴/부착인자 활성도(예를 들어, 결합 활성도)를 측정하기 위한 프로토콜을 제공한다. 본 발명에 따른 다른 키트는 PA-I 렉틴/부착인자에 결합하는 공지된 모든 탄수화물 및 PA-I 렉틴/부착인자 활성도(예를 들어, 결합 활성도)를 측정하는 프로토콜을 포함한 다.

실시예 9

HMW PEG-유사 화합물을 사용한 장-유도 패혈증의 치료

실시예 1 에 기재된 바와 같이 수컷 Balb/c 마우스를 마취시키고 30 % 수술적인 간절제술을 하였고 생리식염수, PEG 3.350(10 % w/v) 또는 모노메톡시 PEG 15-20(mPEG)(10 % w/v)에 희석시킨, 직접적인 침전자에 의해 맹장 기저내로 주사한 200 μl 의 10⁷ cfu/ml 의 슈도모나스 애루지노사 PA27853 을 항원투여하였다. 생리식염수, LMW PEG 및 HMW mPEG 을 소장(회장)내로 적절한 바늘을 주입함으로써 일정하게 제공하였고, 1 ml 의 생리식염수, PEG 3.35 또는 HMW mPEG 를 인접한 장내로 주사하였다. 천공 부위(puncture site)를 견사제(silk suture)로 묶고 맹장을 알콜로 소독하였다. 상기 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 마우스를 우리로 돌려보내고 H₂O 만 48 시간 동안 주었다.

HMW PEG(15-20 kD)를 사용하여 수득한 결과와 비슷한 결과를 예측할 수 있고 도 1 및 실시예 1 를 참조하라. 모든 방어작용의 효과의 통계적 유의성을 피셔정밀검정(P<0.001)을 사용하여 측정하였다.

모든 HMW PEG-유사 화합물은 30 % 간절제술과 같은 수술적 요법 후에 장-유도 패혈증의 발병에 대비하여 방어작용에 대한 검정을 수정할 수 있음을 본 분야의 숙련자들은 이해할 수 있다. 피셔정밀검정(P<0.0001)에 의해 나타낸 바와 같은 통계적으로 중요한 방어작용을 부여하는 이러한 화합물은 본 발명에 따른 화합물로 쉽게 확인할 수 있다. 대조군으로서, 수술받은 유기체의 맹장 내용물, 점막, 간 및 혈액에서 박테리아 계수가 통계적으로 현저하게 증가(P< 0.001)됨을 확실하게 나타내기 위해, 맹장 내용물, 점막, 간 및 혈액에서 일원 ANOVA 하여 박테리아를 계수하였고, 슈도모나스 애루지노사를 HMW PEG-유사 화합물의 부재 하에서 항원투여하였다. 검정에서 포함할 수 있는 또다른 대조군은 간절제술을 받은 테스트 유기체의 경우에서 허위 개복술과 같은 "허위(sham)" 절차를 몇몇 유기체에 하였다. 간 및 혈액의 박테리아 계수에서 통계적으로 현저한 감소(P< 0.05)를 산출하고 바람직하게 검출할 수 있는 수준의 병원균의 모든 전파를 예방하기 위해, 본 발명에 따른 HMW PEG-유사 화합물을 예측할 수 있다. 게다가, 장-유도 패혈증에 감염되기 쉬운 모든 유기체를 이러한 검정에서 사용할 수 있고, 사건(event)이 장-유도 패혈증으로부터의 증가된 위험과 연관된 것으로 공지되었다면, 장-유도 패혈증이 발병될 위험이 있는 유기체에서 발생하는 사건은 보다 많거나 또는 보다 적은 간의 손실을 포함하는 수술적인 간절제술, 다른 수술적인 절차 또는 다른 완전한 사건과 같은 장-유도 패혈증으로부터의 증가 된 위험과 연관된 것으로 공지된 모든 사건일 수 있다. HMW PEG-유사 치료는 다음의 생리적인 스트레스를 수행하였을 때(예를 들어, 수술후 치료 동안), 패혈증과 연관된 죽음 또는 중병을 예방하는 방법에서 효율적일 수 있음을 예측할 수 있다. 추가로, HMW PEG-유사 치료는 중병 또는 죽음의 위험을 낮추기 위해 스트레스의 도입이 예상될 수 있는 환경 하에서 생리적인 스트레스(예를 들어, 예비-수술 치료)를 받기 전에 사용할 수 있다. HMW PEG-유사 치료는 장-유도 패혈증과 연관된 질환, 질병 또는 비정상적인 증상과 연관된 징후를 개선하는데 또한 유용하다.

실시예 10

HMW PEG-유사 화합물은 락토바실러스 GG , 프로바이오틱 치료제의 수송을 안정하게 한다

프로바이오틱 미생물 락토바실러스 GG(LGG)로부터의 조정배지는 장내 상피세포에서 세포를 보호하는(cytoprotective) 열쇼크 단백질 hsp25 및 hsp72 의 발현을 유도한다. 전체가 본원에 참고문헌으로 인용된, 발명자가 Eugene Chang 및 Elaine Petrof 인 2004 년 4 월 20 일에 출원한, "Cytoprotective Factors Derived from Probiotic and Commensal Flora Microorganisms," 으로 명명된, 가출원 미국 특허 번호 제 호(대 리인 문서 번호 제 27373/40049 호)를 참조하라. 만약 HMW PEG-유사 화합물의 존재 하에서 프로바이오틱 치료제를 투여하여 어떠한 개선이 나타났다면, 치료학적 조정배지의 수송을 측정하기 위해 조사하였다.

본 실시예에서 기재된 바와 같은 실험에 대해, HMW PEG(15-20 kD)를 HMW PEG-유사 화합물로서 사용하였고 YAMC(젊은 성인 마우스 결장) 세포를 검정의 피실험자로 사용하였다. MHC 클래스 II 프로모터의 인터페론-감마 민감성 부분의 조절 하에서 YAMC 세포는 온도-민감성 SV40 거대 T 항원(tsA58)의 이식유전자를 발현하는 임모티마우스(Immortimouse)로부터 유도된 잠정적으로 불사화된 마우스 결장 상피세포주이다. 세포는 Dr. R. Whitehead 의 풍부한 선물(미국 테네시 내시빌에 소재하는 Vanderbilt University 에서 입수하였음)이다. 본 분야에서의 숙련자들은 다른 쉽게 입수할 수 있는 말단으로 분화되지 않은(non-terminally differentiated) 장내 세포를 YAMC 세포의 위치에서 사용할 수 있음을 인지할 수 있다. ITS + Premix(미국 매사추세츠 베드퍼드에 소재하는 BD Biosciences 에서 입수하였음)로 보충한, 5 %(v/v)의 우태아혈청, 5 U/ml 쥐 인터페론-γ(IFN-γ ; 미국 뉴욕 그랜드아일랜드에 소재하는 GibcoBRL 에서 입수하였음), 50 μg/ml 스트렙토마이신, 50 U/ml 페니실린을 가진 RPMI 1640 배지에서의 허용 조건(33 ℃) 하에서 YAMC 세포를 유지하였다. 인터페론-감마(IFN-γ)가 존재하지 않는 37 ℃ 의 비-허용(비-형질전환시키는) 조건 하에서, 이러한 세포는 분화하였고, 폐쇄막의 형성(tight junction formation), 극성, 미세융모 첨단의 막 및 수송기능을 포함하는 성숙한 상피세포의 특성 및 기능을 가지도록 성장하였다.

60 mm 의 조직 배양 디쉬 당 2.5×10⁵ 의 밀도로 세포를 도말하였다. 세포 부착이 가능하도록 33 ℃ 에서 24 시간 성장시킨 후에, 배지를 IFN-유리 배지로 대체하고 세포를 분화시킨 콜론사이트 표현형 (coloncyte phenotype)의 성장을 가능하게 하기 위해 24 시간 동안 37 ℃(비-허용 조건)에서 세포를 움직였다. 세포를 LGG 조정배지(1 : 10 희석 또는 600 ul)에서 밤새 처리하거나 또는 본원에서 기재한 바와 같은 다른 조건에서 처리하고 난 다음에 세포를 용해시키고 웨스턴 블로트 분석하였다.

처리한 후에, 세포를 두 번 세척하고 난 다음에 얼음-냉각시킨 HBS(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES pH 7.4)에서 문질렀다. 세포를 펠릿화(실온에서 20 초 동안 14,000 xg)시키고 얼음-냉각시킨 용해 완충액[10 mM Tris pH 7.4, 5 mM MgCl₂, 50 U/ml DNAse 및 RNAse 에 더하여 완전한 단백질 가수분해효소 저해제 칵테일(미국 인디애나 인디애나폴리스에 소재하는 Roche Molecular Biochemicals 에서 입수하였음)]에서 재현탁시켰다. 단백질 농도를 비신코니닉산(bicinchoninic acid) 방법을 사용하여 검출하였다. 3 X 렘리 스톱 완충액(Laemmli Stop buffer)을 첨가한 후에 시료를 5 분 동안 75 ℃ 로 가열하고 난 다음에 - 80 ℃ 에서 저장하고 일주일 이내에 사용하였다.

웨스턴 블로트 검정 동안에, 레인(lane) 당 20 마이크로그램의 단백질을 12.5 % SDS-PAGE 에서 용해시키고 본 분야에서 공지된 바와 같이 1 X 토우빈 완충액(25 mM Tris, 192 mM 글리신, pH 8.8, 15 % vol/vol 메탄올의 조성물)에서 PVDF 멤브레인(미국 매사추세츠 보스턴에 소재하는 Polyscreen 에서 입수하였음, Perkin-Elmer NEN)으로 이동시켰다. 실온에서 1 시간 동안 TBS-Tween[0.05 % (v/v)의 Tween 20 과 함께 트리스-완충시킨 생리식염수(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7.4)]에 용해시킨 5 % (w/v) 탈지유에서 멤브레인을 차단하였다. 1 차 항원을 TBS-Tween 에 첨가하였고 특정 항-hsp 25 항체(캐나다 브리티쉬 컬럼비아 빅토리아에 소재하는 Stressgen 에서 입수하였음, SPA801), 항-hsp 72 항체(캐나다 브리티쉬 컬럼비아 빅토리아에 소재하는 Stressgen 에서 입수하였음, SPA810) 또는 항-hsc 73 항체(캐나다 브리티쉬 컬럼비아 빅토리아에 소재하는 Stressgen 에서 입수하였음, SPA815)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 과산화효소가 결합된 2 차 항체(미국 펜실베이니아 포트 워싱턴에 소재하는 Jackson Immunoresearch Labs, Inc. 에서 입수하였음)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양하기 전에 블로트를 실온에서 각각 10 분 동안 TBS-Tween 으로 5 번 세척하였다. TBS-Tween 으로 막을 세척(5 번×10 분)하고 난 다음에 TBS(Tween 없이)에서 최종적으로 세척하였다. 블로트를 증진된 화학발광 시스템 ECL 지시약(미국 일리노이 록퍼드 피어스에 소재하는 Supersignal 에서 입수하였음)으로 시각화하였고 제조업자의 지시사항에 따라 현상하였다.

HMW PEG 만은 장내 상피세포에서 열쇼크 단백질 발현을 일으키지 않았고(도 7 의 레인 2 을 참조), 만약 LGG 를 처리하기 전에 이를 처리한다면, LGG 를 처리하기 전에 HMW PEG 의 처리가 LGG 처리에서 일반적으로 보여진 hsp 발현의 도입을 막는 것(도 7 의 레인 3 및 4 를 비교하였음)으로 초기 결과는 나타내었다. 대조적으로, HMW PEG 를 처리하기 전에 LGG 의 처리는 LGG 만을 처리했을 때랑 차이가 없는 hsp 발현을 나타내었고(도 7 의 레인 3 및 5 를 참조), 이는 LGG 를 처리한 후에 HMW PEG 를 투여하였을 때 HMW PEG 가 hsp 발현의 도입을 저해하지 않음을 나타낸 것이다.

상이한 비율에서의 LGG + HMW PEG 의 다양한 혼합물을 이러한 배합이 보다 강한 열쇼크 단백질 반응을 일으키는지를 측정하고, 필요로 하는 최적의 배합을 측정하고 장내 상피세포를 치료하기 위해 사용하였다. 데이터는 1 : 1 비율의 LGG : HMW PEG(도 7 의 레인 7 를 참조) 및 1 : 1.5 비율의 LGG : HMW PEG(도 7 의 레인 10 을 참조)가 가장 강한 열쇼크 단백질 발현을 일으키는 두 가지 배합물임을 나타낸 것이다. 실제로, 후자 배합물은 열응력(thermal stress)보다 강한 신호를 결과로 나타내고, 이를 기준으로 열쇼크 단백질의 생산을 촉진하기 위해 일반적으로 사용되었다(도 7 의 레인 9 및 10 을 비교하였음).

HMW PEG-유사 화합물에 대해 치료제(예를 들어, LGG 조정배지)의 비율은 다양할 수 있으며 이러한 변형물은 본 분야에 의해 예측될 수 있음을 본 분야의 숙련자들은 인지할 수 있다. 물론, 특정 HMW PEG-유사 화합물은 사용하기 전에 효능에 대해 검정한, 주어진 HMW PEG-유사 화합물과 함께 또한 다양할 수 있다. HMW PEG 및 HMW mPEG 는 현재 바람직한 화합물일지라도, 다양한 범위의 HMW PEG-유사 화합물도 본 발명에서 사용하기 위해 예상할 수 있다. 추가적으로, LGG 의 세포를 보호하는 화합물은 조정배지에 존재함이 나타났고, 본 분야의 숙련자는 유효 화합물의 보다 순수한 조제물을 수득하기 위해 수많은 일반적인 기술을 사용할 수 있으며, HMW PEG-유사 화합물은 이러한 조제물의 투여에서 유용한 것임을 본 발명의 범주 내에서 예상할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 HMW-PEG 유사 화합물의 존재 하에서 열-안정성, 산-안정성 및 투여에 대해 10 kD 미만의 크기를 갖는, LGG 로부터 유도된 단백질 또는 펩티드 치료제를 예상할 수 있다. 보다 일반적으로, HMW PEG-유사 화합물은 조정배지, 부분적으로 정제된 조제물, 균질성을 위해 정제된 조제물 및 화학적으로 합성된 생성물 뿐만 아니라 전체 미생물을 포함하는 다양한 범위의 프로바이오틱 치료제를 투여하는데 유용한 것임을 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 HMW PEG-유사 화합물은 다양한 범위의 구조물(예를 들어, 펩티드, 단백질 및 소분자 작동인자 등) 및 치료학적 효과를 갖는 비-바이오틱 치료제를 수송하는데 또한 유용하다.

실시예 11

HMW PEG-유사 화합물은 VSL #3, 프로바이오틱 치료제의 수송을 안정시킨다

프로바이오틱 미생물 혼합물 VSL#3(미국 메릴랜드 게이더스버그에 소재하는 VSL Pharmaceuticals Inc. 에서 입수하였음)의 조정배지는 아마도 상피세포와 같은 세포 내에서 특정 프로테아좀 활성도에서의 이의 선별적인 효과(키모트립신-유사 활성도, 캐스페이즈-유사 활성도의 약한 저해, 트립신-유사 활성도의 검출할 수 없는 저해)를 통해, 열쇼크 단백질 hsp25 및 hsp 72 의 발현을 유도 및 인산화된 lkBα 를 포함하는 lkBα 의 분화를 저해하여 장내 상피세포에 영향을 끼치는 것으로 나타났다. 따라서, 유전자의 발현에 영향을 끼치는 VSL#3 은 NFkB 유전자 발현 조절을 받는다. 각각의 전체가 본원에 참고문헌으로 인용된, 2004 년 2 월 6 일에 출원한 가출원 미국 특허 번호 제 60/542,725 호, 및 "Cytoprotective and Anti-Inflammatory Factors Derived from Probiotic and Commensal Flora Microorganisms," 으로 명명된, 발명자가 Eugene Chang 및 Elaine Petrof 인 가출원 미국 특허 번호 제 호(대리인 문서 번호 제 27373/40027 호)를 참조하라. 만약 HMW PEG-유사 화합물의 존재 하에서 프로바이오틱 치료제를 투여하여 어떠한 개선이 나타났다면, 치료학적 조정배지의 수송을 측정하기 위해 조사하였다.

본원에서 기재된 바와 같은 실험은 YAMC 세포, VSL#3 의 조정배지 및 HMW PEG-유사 화합물과 같은 HMW PEG 를 사용하여 수행하였다.

본원에 기재된 바와 같은 LGG 조정배지에 대한 동량의 VSL#3 조정배지의 치환과 함께 실시예 11 에 기재된 바와 같이 YAMC 세포의 성장, IFNγ 의 추가, 비-허용 온도에서의 배양, HMW PEG-유사 화합물과 함께 또는 HMW PEG-유사 화합물없이 VSL#3 조정배지에 노출, 세포 용해 및 웨스턴 블로트 분석을 수행하였다.

VSL#3 조정배지는 이를 저장한 온도에 독립적인 것으로 나타내는 시간 의존적인 방법에서 이의 프로바이오틱스 생활성도를 잃는다. 열 쇼크 단백질을 유도하기 위한 이들의 생활성도 및 활성도를 잃은 것으로 출발한 VSL#3 조정배지의 몇몇의 배치(batch)를 이들의 효력을 회복시키기 위한 시도에서 HMW PEG 와 개별적으로 배합하였다. 보통, 600 ul 의 조정배지는 장 상피세포에서 열쇼크 반응을 유도하기 위해 사용된 최적의 양이다. VSL#3 조정배지의 독성을 약화시킨 배치는 효과를 관찰하기 위해 일반적으로 필요로하는 두 배의 양을 필요로하고, 이는 단지 반응을 약하게 유도할 수 있다(도 8 의 레인 2, 6 및 10 을 참조하라).

프로바이오틱-HMW PEG 혼합물에 대해 최적의 비율이 되게하기 위해 LGG 실험(실시예 10 을 참조)에서 상기에 측정된 동일한 비율로 유지시키면서, 600 ul 의 독성을 약화시킨 VSL#3 배지를 600 ul 의 HMW PEG 와 혼합하였고 상피세포의 표면에 적용하였다. 600 ul 의 VSL#3 만이 모든 열쇼크 반응을 유도할 수 없음에도 불구하고(도 8 의 레인 1, 5 및 9 를 참조), HMW PEG 의 첨가는 독성을 약화시킨 VSL#3 조정배지의 3 가지 분리된 배치의 효력을 회복시킬 뿐만 아니라 열쇼크 단백질 발현을 증진시킬 수 있다(도 8 의 레인 3, 7 및 11 을 참조). 배치 H 의 경우에서, HMW PEG 의 첨가는 완전하게 잃은(즉, 검출할 수 없는) 활성도를 회복시켰다(도 8 의 레인 9 및 10 과 레인 11 을 비교).

유실 실험(washout study)을 하여 HMW PEG 의 증진된 효과가 제거될 수 있는지를 측정하기 위해 실험을 수행하였다(즉, VSL-HMW PEG 혼합물을 적용하였고 10 분 동안 세포에 두고 난 다음에 빨아들이고 배지를 신선한 배지로 교체하였다). 세포를 16 시간 후에 수집하고 열쇼크 단백질 발현을 측정하였다. VSL#3 독성을 약화시킨 조정배지만으로 이러한 처리를 한 결과 신호가 감지되지 않았으나, VSL-HMW PEG 혼합물로 처리한 결과 강한 열쇼크 단백질의 유도가 모든 3 가지의 독성을 약화시킨 배치에서 발견되었다(도 8 의 레인 4, 8 및 12 를 참조). 프로바이오틱 혼합물에 대한 HMW PEG 의 첨가는 이들의 반감기를 연장시킬 뿐만 아니라 이들의 효력을 증진시킴을 도 8 은 나타내었다. 이론에 결부시키려는 목적 없이, 반감기의 증진은 유실 처리 후에도 프로바이오틱 생활성인자가 상피세포와 접촉한 채로 잔존하게 하는 HMW PEG 의 부착성 성질 때문에 발생한다. 또한 비-제한 이론상의 관찰로서 제공한 바와 같이, HMW PEG 는 또한 프로바이오틱 인자의 구조물을 안정화시킬 가능성이 있다. 또한 열쇼크 양성 대조군 세포(도 8 의 레인 14 를 참조) 및 처리하지 않은 음성 대조군 세포(도 8 의 레인 13 을 참조)를 나타내었다.

실시예 10 에서 기재한 바와 같이, 치료제(예를 들어, VSL#3 조정배지) 대 HMW PEG-유사 화합물의 비율은 다양할 수 있으며, 사용된 특정 HMW PEG-유사 화합물에서의 변형물로서의 이러한 변형물은 본 발명에 의해 예상할 수 있다. 추가적으로, VSL#3 조정배지에서의 유효 화합물의 보다 정제된 조제물을 예상할 수 있고 이는 본 발명의 범주내에 포함된다. 예를 들어, VSL#3 조정배지는 부가적으로 정제하여 10 kD 미만의 평균 분자량을 갖는, 산 안정성 및 에테르-추출가능한 단백질 또는 펩티드의 보다 정제된 조제물을 수득하였으며 이러한 치료제는 본 발명의 방법 및 용도에서 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 HMW PEG-유사 화합물은 다양한 범위의 구조물(예를 들어, 펩티드, 단백질, 소분자 작동인자 등)을 가지며 다양한 범위의 치료 효과를 나타내는 프로바이오틱 및/또는 비-프로바이오틱 치료제를 수송하는데 유용하다.

실시예 12

생체내 수송 동안에 치료제를 안정시키기 위한 HMW PEG-유사 화합물의 용도

다양한 범위의 화학적 및 생물학적 치료제 및 약물은 HMW PEG-유사 화합물을 포함하는 수송 시스템을 사용하여 상피세포로 수송하기 위해 적합하다. 본 발명에 따른 화합물을 보호하거나 안정화시키는 양상은 예를 들어 장내와 같은 상피 점막에 투여하기에 적절한 다양한 범주의 치료제를 예측할 수 있다. 현저한 예는 당뇨로 고통받는 많은 환자에게 매일 주사를 필요로 하는, 경구 수송할 수 없는 치료학적 단백질 인슐린이다. 적절한 단백질 치료제의 또다른 실시예는 호르몬 치료를 포함한다. 단백질성(예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드) 치료제를 투여하기 위한 수송 시스템의 용도에 대한 본 발명의 양상에 관하여, 본 발명은 단백질성 치료제의 흡수를 용이하게 하기 위해 예를 들어 장의 상피세포의 폐쇄막을 열게 하는 유효량의 PA-I 렉틴/부착인자의 첨가를 추가로 예상할 수 있다.

본 발명의 시스템에 의해 수송되기 위한 실례가 되는 범위의 치료제는 암 증상을 치료하는데 사용하기 위한 소분자 화학요법제와 같은 소분자 치료제이다. 본 분야에서 공지된 모든 범위의 방사화학적 치료제를 포함하는 화학적 치료제 및 단백질성 치료제를 포함하는 생물학적 치료제는 본원에 기재된 바와 같은 수송 시스템을 사용하여 적합성을 쉽게 검정할 수 있다. 수송을 위한 새로운 방법을 개발하거나 또는 치료제를 투여에 대한 공지된 경로를 증진시키는 수송 시스템을 이용하여 수많은 이러한 치료제를 투여할 수 있음을 예측할 수 있다. 이러한 치료제는 본원에서 제공된 지시사항에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1, 9, 10 및 11 을 참조하라.

본 발명의 이러한 양상의 다른 예증된 실시형태는 본 발명의 HMW PEG-유사 수송 시스템을 이용하여 성전염성 질환의 징후를 예방하거나 치료하거나 또는 개선시키기 위한 치료제의 투여이다. 예를 들어, AIDS 의 치료는 질, 경구 또는 직장(예를 들어, 좌약으로) 수송에 의해 HMW PEG 와 같은 HMW PEG-유사 화합물의 용액에 용해시킨 유효량의 항-HIV 치료제의 투여를 포함한다. 하나의 실시형태에서, 치료제는 이로부터 유도된 프로바이오틱 미생물 또는 유효 성분이다. 다른 실시형태에서, 치료제는 모든 공지된 항-HIV 치료제이다. 본원에 기재되거나 본 분야에서 공지된 이러한 치료제의 유효량 및 모든 치료제는 본 분야의 숙련자에 의해 쉽게 측정될 수 있고, 본 분야에서 이해될 수 있는 바와 같은 나이, 몸무게, 일반적인 건강 등과 같은 변수에 따라 좌우된다. 항-HIV 백신 개발은 임상적인 환경 하에서 백신을 제공하는데 있어서 10 년이 걸릴 수 있다는 사실을 고려해 볼 때 본 발명의 이러한 치료학적 수송 시스템은 현저한 건강상의 이점을 제공할 것임을 예측할 수 있다.

상기의 내용을 고려해 볼 때 본 발명의 수많은 변형 및 변이는 가능하며 이는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 본원에서 인용한 모든 발행물의 전체 명세서는 본원에 참고문헌으로 인용되었다.

Claims (48)

1. 라벨 포장 물질(label packaging material) 및 상기 포장 물질 내에 함유된 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜-유사(HMW PEG-like) 화합물의 유효량을 포함하는 제조물(article of manufacture)이되, 여기에서 상기 포장 물질은, 상기 HMW PEG-유사 화합물이 감염된 상피세포 및 장벽 기능장애를 포함하는 상피세포 중에서 선택한 증상을 치료하고, 개선시키거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있음을 나타내는 라벨 또는 사용설명서(package insert)를 포함하는 제조물.
2. 제 1 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 고분자량의 폴리알칸, 폴리알켄 또는 폴리알킬렌 글리콜임을 특징으로 하는 제조물.
3. 제 2 항에 있어서, 고분자량(HMW)의 폴리알칸, 폴리알켄 또는 폴리알킬렌 글리콜은 HMW 폴리프로필렌 글리콜, HMW 폴리에틸렌 글리콜(HMW PEG) 및 이의 혼합물 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 제조물.
4. 제 3 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 HMW PEG 임을 특징으로 하는 제조물.
5. 제 2 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 HMW PEG, HMW 폴리메톡시PEG, HMW 모노메톡시 PEG, HMW 폴리프로필렌 글리콜 및 이의 혼합물 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 제조물.
6. 제 5 항에 있어서, 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합물 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함함을 특징으로 하는 제조물.
7. 제 6 항에 있어서, 작용기는 메톡시기임을 특징으로 하는 제조물.
8. 제 2 항에 있어서, 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알킬기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알킬기, 아릴기 및 이의 혼합물 중에서 선택한 링커를 더 포함함을 특징으로 하는 제조물.
9. 제 8 항에 있어서, 링커는 페닐기임을 특징으로 하는 제조물.
10. 제 2 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 수용액에 존재함을 특징으로 하는 제조물.
11. 제 10 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 적어도 5 % (w/v) 농도로 용액에 존재함을 특징으로 하는 제조물.
12. 제 11 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 10 % 내지 20 % (w/v) 농도로 용액에 존재함을 특징으로 하는 제조물.
13. 제 2 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 12,000 달톤보다 큰 평균 분자량을 가짐을 특징으로 하는 제조물.
14. 제 13 항에 있어서, 평균 분자량이 적어도 15,000 달톤임을 특징으로 하는 제조물.
15. 제 14 항에 있어서, 평균 분자량이 15,000 달톤보다 크고, 20,000 달톤 미만임을 특징으로 하는 제조물.
16. 제 1 항에 있어서, 라벨 포장 물질은 상피세포의 염증 및 상피세포의 장벽 기능장애 중에서 선택한 증상을 치료하고, 개선시키거나 또는 예방하기 위해 화합물을 투여하기 위한 지시사항(instruction)을 제공함을 특징으로 하는 제조물.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 증상은 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 제조물

    장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상, 상피에 화학적 접촉성 손상(chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 증상은 다음 중에서 선택한 면역 장애임을 특징으로 하는 제조물

    백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애 및 이의 혼합 형태.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 증상은 궤양성 대장염, 크론병 및 이의 혼합 형태 중에서 선택한 염증성 장질환임을 특징으로 하는 제조물.
20. 제 1 항에 있어서, 치료학적 유효량의 치료제를 더 포함함을 특징으로 하는 제조물.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 치료제는 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 제조물

    프로바이오틱(probiotic) 미생물 제형, 적어도 하나의 프로바이오틱 미생물로부터 유도된 조성물, 진통성 화합물, 항-염증성 화합물, 면역계의 조절인자, 항생제, 항암제, 항궤양제, 성장 인자, 사이토카인, 단백질 호르몬, 트레포일(trefoil) 단백질 및 이의 혼합물.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 치료제는 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 제조물

    5-아미노 살리실산염, 5-아미노 살리실산염 성분을 포함하는 화합물, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토푸린, 사이클로스포린, 밴코마이신, 메트로니다졸, 세팔로스포린, 탁산, 탁산 성분을 포함하는 화합물, 캄토테신(camptothecin), 캄토테신 성분을 포함하는 화합물, 5-플루오로우라실, 5-플루오로우라실 성분을 포함하는 화합물, 항-안드로겐 화합물, 항-에스트로겐 화합물, 상피세포 성장 인자, 장내 트레포일 인자(intestinal trefoil factor), 인슐린, 소마토스테틴, 인터페론 및 이의 혼합물.
23. 제 21 항에 있어서, 상기 치료제는 프로바이오틱 젖산균(probiotic lactic acid bacterium) 임을 특징으로 하는 제조물.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 치료제는 락토바실러스 GG (Lactobacillus GG, LGG), VSL#3 및 이의 혼합물 중에서 선택한 미생물 제형(microorganism formulation) 임을 특징으로 하는 제조물.
25. HMW PEG-유사 화합물 및 유효량의 치료제를 포함하는 조성물을 투여하여 피실험자의 상피에 치료학적 조성물을 투여하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서, 치료제는 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법

    프로바이오틱(probiotic) 미생물 제형, 적어도 하나의 프로바이오틱 미생물로부터 유도된 조성물, 진통성 화합물, 항-염증성 화합물, 면역계의 조절인자, 항생제, 항암제, 항궤양제, 성장 인자, 사이토카인, 단백질 호르몬, 트레포일(trefoil) 단백질 및 이의 혼합물.
27. 제 25 항에 있어서, 치료제는 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법

    5-아미노 살리실산염, 5-아미노 살리실산염 성분을 포함하는 화합물, 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캅토푸린, 사이클로스포 린, 밴코마이신, 메트로니다졸, 세팔로스포린, 탁산, 탁산 성분을 포함하는 화합물, 캄토테신(camptothecin), 캄토테신 성분을 포함하는 화합물, 5-플루오로우라실, 5-플루오로우라실 성분을 포함하는 화합물, 항-안드로겐 화합물, 항-에스트로겐 화합물, 상피세포 성장 인자, 장내 트레포일 인자(intestinal trefoil factor), 인슐린, 소마토스테틴, 인터페론 및 이의 혼합물.
28. 제 25 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 HMW PEG 임을 특징으로 하는 방법.
29. 제 25 항에 있어서, 상피는 장내 점막, 폐 점막, 비강 점막, 요로 점막, 식도 점막, 협측 점막 및 피부 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
30. 제 25 항에 있어서, 피실험자는 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 피실험자는 인체임을 특징으로 하는 방법.
32. 제 25 항에 있어서, 조성물은 다음 중에서 선택한 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법

    경구 투여, 직장 투여, 장내 세척, 국소 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 요도내 투여, 질(vaginal) 투여, 캐뉼라 삽입 및 보조 조절 호흡 (assisted respiration).
33. 제 25 항에 있어서, 치료제는 단백질성 화합물임을 특징으로 하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 유효량의 PA-I 렉틴/부착인자(PA-I lectin/adhesin) 투여를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
35. 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여하여 피실험자의 상피의 미생물-매개 증상을 치료하는 방법이되, 여기에서 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합물 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 임을 특징으로 하는 상기 피실험자의 상피의 미생물-매개 증상을 치료하는 방법.
36. 제 35 항에 있어서, HMW PEG-유사 화합물은 적어도 10 % 및 20 % (w/v) 미만의 HMW PEG-유사 화합물을 포함하는 수용액에 존재함을 특징으로 하는 방법.
37. 제 35 항에 있어서, 피실험자는 포유동물임을 특징으로 하는 방법.
38. 제 37 항에 있어서, 피실험자는 인체임을 특징으로 하는 방법.
39. 제 35 항에 있어서, 상피는 장내 점막, 폐 점막, 비강 점막, 요로 점막, 질(vaginal) 점막, 식도 점막, 협측 점막 및 피부 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
40. 제 35 항에 있어서, 화합물은 다음 중에서 선택한 경로를 통하여 투여됨을 특징으로 하는 방법

    경구 투여, 직장 투여, 질(vaginal) 투여, 장내 투여, 국소 투여, 정맥내 주사, 복강내 주사, 캐뉼라 삽입 및 호흡.
41. 제 35항에 있어서, 상기 증상은 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법

    장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상, 상피에 화학적 접촉성 손상(chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태.
42. 제 35 항에 있어서, 상기 증상은 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법

    백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애 및 이의 혼합 형태.
43. 제 35 항에 있어서, 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합물 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 이며, 상기 증상은 장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상, 상피에 화학적 접촉성 손상(chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법.
44. 제 43 항에 있어서, 상기 증상은 다음 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 방법

    백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애 및 이의 혼합 형태.
45. 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여하여 제 43 항에 기재된 증상의 징후를 개선시키는 방법이되, 여기에서 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합물 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 임을 특징으로 하는 제 43 항에 기재된 증상의 징후를 개선시키는 방법.
46. 피실험자에게 유효량의 HMW PEG-유사 화합물을 투여하여 제 43 항에 기재된 증상을 예방하는 방법이되, 여기에서 상기 HMW PEG-유사 화합물은 곧은 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, 가지난 사슬의 C₁-C₁₀ 알콕시기, C₁-C₁₀ 아릴옥시기 및 이의 혼합물 중에서 선택한 적어도 하나의 공유결합된 작용기를 더 포함하는 HMW PEG 임을 특징으로 하는 제 43 항에 기재된 증상을 예방 하는 방법.
47. 다음 중에서 선택한 증상을 치료하기 위한 약제 제조시 제 25 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 기재된 HMW PEG-유사 화합물의 용도

    장-유도 패혈증, 염증성 장질환, 과민성 장증후군, 상피 화상, 상피에 화학적 접촉성 손상(chemical contact injury), 신생아의 괴사성 소장결장염, 면역 장애, 중증의 호중구 감소증, 독성 대장염, 장질환, 이식거부반응, 맹낭염(pouchitis), 익지 않은 돼지고기 섭취 후 박테리아로 인한 장내 감염(pig belly), 콜레라, 점막 염증, 피부 염증 및 이의 혼합 형태.
48. 제 47 항에 있어서, 상기 증상은 다음 중에서 선택한 면역 장애임을 특징으로 하는 용도

    백혈병, 림프종, AIDS, 건선, 염증성 장질환, 홍반성 루푸스, 경피증, 류마티스성 관절염, 화학요법-유도 면역 장애, 방사선-유도 면역 장애 및 이의 혼합 형태.

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