KR20070050104A - 생체 시료의 항산화 보존액 - Google Patents

생체 시료의 항산화 보존액 Download PDF

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Abstract

방대한 종류의 천연 또는 인공 화학물질이나 식품 등의 생물학적 유해성이나 유효성을 합리적으로, 그리고 간단하고 용이하게 평가하는 생물학적 평가방법을 제공한다. 상기 생물학적 평가방법은 피검물질(의약품, 농약, 기능성 식품 등)을 포함한 용액 중에 이미 알고 있는 양의 2＇－디옥시구아노신(dG)을 첨가하고, 필요에 따라 자외선 조사 및/또는 활성 산소종 발생제를 첨가한 후, 상기 용액 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신을 정량하고, 그 양에 따라 상기 시험물질의 독성 또는 유효성의 유무를 평가하는(8 OHdG가 많을 수록 피검물질의 유해성은 높고, 적을수록낮은 유해성 또는 유효성을 갖는다) 것으로 이루어진다. 또한, 본 발명은 상기 생물학적 평가방법을 바람직하게 실시하기 위한 측정 장치, 및 상기 측정 장치에서 사용되는 항산화 보존액도 제공한다.
2＇－디옥시구아노신, 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신, 생물학적 유해성, 화학물질, 식품, 항산화 보존액

Description

생체 시료의 항산화 보존액{Antioxidative preservative solution for a biological sample}
도 1은 본 발명의 생체 시료 측정 장치의 순서를 도시한 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 생체 시료 측정 장치를 이용해서 측정한 사람 뇨 중의 NO3 －／dG의 농도비와 8 OHdG/dG의 농도비의 관계를 나타낸 그래프이다.
도 3은 HPLC＋전기 화학 검출기(ECD) 법과 EIA법에 의해 얻어진 8 OHdG 농도의 상관을 나타낸 그래프이다.
도 4는 뇨 중의 8 OHdG 농도와 질산 이온(NO3 －) 농도와의 상관을 나타낸 그래프이다.
도 5는 모유 주체, 분유 주체 및 혼합 영양의 각각의 군에 대한 8 OHdG 농도, dG농도, 및 8 OHdG 농도와 dG 농도의 비를 나타낸 막대 그래프이다.
본 발명은 DNA 손상 지표를 이용한 천연 및 인공 화학물질의 간이 생물학적 평가법에 관한 것으로,
좀 더 구체적으로는 DNA의 구성 성분인 2＇－디옥시구아노신(dG)이 산화형의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG)으로 변화하는 반응에 있어서 또는 생체 세포 유래 산물 중에 함유된 8 OHdG/dG 비에 있어서, 피검물질 투여군과 대조군을 비교함으로써 의약품이나 농약 등의 천연 및 인공 화학물질의 유해성이나 유효성, 또는 각종 기능성 식품 등의 유해성이나 유효성을 간편하게 평가하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생체 시료 중의 DNA 산화 손상 지표의 고감도 측정 장치에 관한 것이다.
현재, 환경 중에는 본래 자연계에 존재하지 않는 각종의 인공 화학물질, 예를 들면, 의약품, 농약, 세제, 식품첨가물, 방부제 등을 기원으로 하는 다양한 발암물질, 내분비 교란 물질 등이 존재하고 있다. 또한 천연의 물질 중에서도,
1) 천연 소재 중에 유해 성분이 존재할 가능성이 있고,
2) 특히 엑기스화 했을 경우, 그 생물 독성이 증강될 가능성이 있고,
3) 각종 성분이 상승적으로 작용하여 독성이 있게 될 가능성이 있는 등의 이유로부터 그 독성에 대해 충분히 주위를 기울여야 할 물질이 존재한다.
그런데, 유전 정보는 아데닌(A), 티민(T), 구아닌(G) 및 시토신(C)의 염기로 암호화되어 있다. 이 DNA 정보는 자외선 조사나 DNA 복제의 오류, 또는 각종 발암물질이나 활성 산소종에의 폭로 등에 의해 일정 빈도로 손상을 받아 궁극적으로는 이 유전자 정보가 결여되어 없어지거나, 재편성 또는 변이 등이 발생하여 그 세포나 고체의 사멸이나, 반대로 새로운 생물종의 탄생의 원인이 된다. 상기 천연 및 합성 화학물질이 사람을 포함한 동물에 독성을 미치는 메카니즘의 일부는 이러한 DNA 손상에 의해 설명될 수 있다.
이러한 관점으로부터, DNA의 산화를 살펴보면 퓨린(purine) 핵을 가진 DNA(모노뉴클레오티드)인 2＇－디옥시구아노신(dG) 및 2＇－디옥시아데노신(dA)은 활성 산소종인 히드록시 라디칼(OH)과 결합하여 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG) 및 2－히드록시-2＇－디옥시아데노신(2 OHdA)으로 각각 산화되어 본래 G：C인 DNA 염기대가 T：A로, A：T가 G：C로 각각 변환하게 된다. 이러한 DNA 수준의 유전자 정보의 갱신 발생 빈도는 최근 의학계에 있어 각종 질환의 병의 용태와 상관하는 유력한 정보로 주목받고 있다.
종래, 화학물질의 생물학적으로 허용되는 안전 농도는
1) 실험동물에 투여시의 치사량,
2) 실험동물에 투여시의 발암이나 신경장애 등의 분명한 장기 장해를 발생시키는 양,
3) 생식 능력에 영향을 주는 양 등을 참고로 하여, 이들의 최저 유효량에 100배 내지 1000배의 안전률을 곱한 농도로 여겨져 왔다.
그러나, 평가 대상이 되는 화학물질의 종류가 약 10만종 이상으로 너무 많고, 생물 독성을 마우스나 래트를 사용해 정량화하는 경우, 일세대의 성립이 약 2개월, 세대를 넘는 영향을 평가하는 경우에는 적어도 그 2배 이상의 세월이 요구되며, 평가 시스템을 유지하기 위해 방대한 비용을 필요로 하는 등의 이유로부터 모든 물질의 생물학적 독성을 종래의 방법으로 평가하는 것은 시간적 및 비용적인 제 한에 의해 사실상 불가능하였다.
또한, 현재 시판되고 있는 많은 건강식품이나 기능성 식품 등의 식품류는 천연 소재를 엑기스화한 것, 또는 특정의 물질을 안전 허용량의 범위내에서 첨가한 것 등이 주류이다. 그러나, 상기 식품 등에 대한 유효성(실효성)에 관한 객관적인 평가 시스템이 확립되어 있지 않다.
한편, 종래에 백혈구, 실질 장기 또는 부유 세포 용액 등의 생체 시료로부터 상기와 같은 산화 DNA 물질의 하나인 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG)을 측정하는 방법은 이들의 세포 성분으로부터 해당 DNA를 추출하여 여러 가지 효소를 처리한 후, HPLC(고속 액체 크로마토그래피)를 통한 용리액을 전기 화학 검출기에 흘려, 모노뉴클레오티드의 형태로 측정하는 것이 일반적이었다. 이 방법은 측정 감도 10pg/ml 정도로 해당 DNA의 산화적 손상을 평가할 수 있지만, 산이나 알칼리 처리, 효소 반응 등의 단계 때문에 조작이 번잡하고, 이들 처리 조작에 의한 2차적인 DNA 산화를 피하기 어려워 실제로는 한정된 시설에서만 수행할 수 있었다.
동일하게, 8 OHdG를 그것이 대량으로 포함되어 있는 뇨(urine)로부터 측정하는 경우에도 단백질을 제거한 후, HPLC와 전기 화학 검출기에 통과시키는 방법이 이용되나, 뇨 자체가 매우 산화하기 쉬운 생체 시료이기 때문에 산화를 방지한 조건에서 단백질을 제거하는 것이 매우 어려웠다.
최근 이용되고 있는 8 OHdG의 정량법으로서 단일 클론 항체를 사용한 효소 항체법(EIA법)이 있다. 이 방법은 HPLC 및 전기 화학 검출기에 의한 방법과 다르게 모노뉴클레오티드의 상태가 아니라도 검출할 수 있는 특성이 있으나, 8 OHdG 이외 의 다른 물질과의 교차 반응, 및 검출 감도가 1ng/ml 정도로 낮은 결점이 있어 일반화하기에 어렵다.
한편, 생체 시료 중의 모노뉴클레오티드 자체는 그 핵 DNA 내의 절대량이 8 OHdG 등의 산화물의 약 10,000~100,000배로 비교적 다량으로 존재하고 있기 때문에, 검출이 비교적 용이하고, 그 화학 구조의 특징으로부터 일반적인 검출 방법으로서 자외선 흡수 측정 장치가 유효하게 이용되고 있다. 단, 측정 검체의 사전 처리는 전기 화학 검출기를 사용한 8 OHdG 측정의 경우와 같고, 기본적으로 동일한 문제점을 가지고 있다.
상기 인공 화학물질이나 식품류는 인간이 일상적으로 섭취, 투여 또는 접촉할 가능성이 있어 그러한 생물학적 독성이나 유효성, 특히 독성을 확인하는 것이 급무임에도 불구하고, 현황은 상술한 바와 같고, 장기간 고비용 등을 요구하는 문제가 있다. 따라서, 인공 화학물질의 생물학적 독성 또는 식품류의 유해성·유효성을 간편하고 저비용으로 평가하는 방법의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 이러한 요구에 따라 이루어진 것으로, 방대한 종류의 천연 물질이나 인공 화학물질 및 식품류의 생물학적 유해성이나 유익성을 합리적으로, 간편하게 평가하는 방법의 제공을 과제로 한다.
또한, 본 발명은 생물학적 평가법에 있어 지표가 되는 물질, 보다 넓게는 산화 DNA 물질, 특히, 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG), 2－히드록시-2＇－디옥시아데노신(2 OHdA) 등의 양을 그 생체 시료 중의 핵 DNA 양과 함께 간편한 방 법으로 재현성이 우수하게, 정확하게 정량하는 것이 가능한 측정 장치의 제공을 과제로 한다.
게다가, 본 발명은 상기 측정 장치에 있어서, 생체 시료 중의 DNA 산화 손상을 막을 수 있는 항산화 보존액을 제공하는 것도 과제로 한다.
본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하기 위해 광범위한 연구를 수행한 결과, 피검물질인 천연 또는 인공 화학물질을 함유하는 용액에 2＇－디옥시구아노신(dG)을 첨가하고 일정시간 경과 후, 상기 용액의 2＇－디옥시구아노신의 산화형인 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG)의 농도를 측정함으로써 피검물질의 산화능 또는 항산화능의 유무 및 그 정도를 알 수 있어 이를 지표로서 피검물질의 생물학적 유해성 및 무독성 또는 유익성을 평가할 수 있는 것을 발견하였고, 한층 더 검토하여 본 발명을 완성하였다. 또한, 상기 피검용액의 생물학적 평가법에 있어서, dG를 첨가하고, 상기 용액에 자외선 및/또는 브롬산칼륨을 첨가한 후, 상기 용액 중의 8 OHdG를 정량하여 상기 피검용액의 활성산소에서 유래하는 유전자 핵산의 산화손상에 대한 상가, 상승 또는 상쇄 효과의 유무를 평가할 수 있었다.
즉, 본 발명은 특정의 천연 또는 인공 화학물질을 포함한 용액 중에 이미 알고 있는 양의 2＇－디옥시구아노신을 첨가하고 상기 용액에 자외선을 조사한 후, 상기 용액 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신을 정량하고, 상기 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신의 양에 따라 상기 천연 또는 인공 화학물질의 활성 산소로부터 유래하는 유전자 핵산의 산화 손상에 대한 상가, 상승 또는 상쇄 효과의 유무를 지표로 하여 천연 또는 인공 화학물질의 유해성 또는 유익성을 평가하는 것으로 이루 어지는 천연 또는 인공 화학물질의 생물학적 평가법, 및 특정의 천연 또는 인공화학물질을 함유한 용액 중에 이미 알고 있는 양의 2＇－디옥시구아노신을 첨가하고 상기 용액에 브롬산칼륨을 첨가한 후, 상기 용액 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신을 정량하고, 상기 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신의 양에 따라 상기 천연 또는 인공 화학물질의 활성 산소로부터 유래하는 유전자 핵산의 산화 손상에 대한 상가, 상승 또는 상쇄 효과의 유무를 지표로 하여 천연 또는 인공 화학물질의 유해성 또는 유익성을 평가하는 것으로 이루어진 천연 또는 인공 화학물질의 생물학적 평가법에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 특정하지 않은 천연 또는 인공화학물질을 함유하는 음료수, 산업배수, 생활배수, 지하수, 하천수, 호소(湖沼)수, 및 해수로 이루어진 군으로부터 선택된 피검용액 중에 이미 알고 있는 양의 2＇－디옥시구아노신을 첨가한 후, 상기 용액 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신을 정량하고, 상기 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신의 양에 따라 상기 피검용액의 생물독성을 평가하는 것으로 이루어진 피검용액의 생물학적 평가법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 특정하지 않은 천연 또는 인공화학물질을 함유하는 음료수, 산업배수, 생활배수, 지하수, 하천수, 호소(湖沼)수, 및 해수로 이루어진 군으로부터 선택된 피검용액 중에 이미 알고 있는 양의 2＇－디옥시구아노신을 첨가하고, 상기 용액에 자외선을 조사한 후, 상기 용액 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신을 정량하고, 상기 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신의 양에 따라 자연환경 중에서 발생할 수 있는 상기 피검용액의 유전자 변이원성 리스크(risk)를 평가하는 것 으로 이루어진 피검용액의 생물학적 평가법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 특정하지 않은 화학물질을 함유하는 피검용액 중에 이미 알고 있는 양의 2＇－디옥시구아노신을 첨가한 후, 상기 용액 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신을 정량하고, 상기 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신의 양에 따라 상기 피검용액의 항산화능 또는 산화능을 평가하는 것으로 이루어진 피검용액의 생물학적 평가법에 관한 것이다.
본 발명은 특정의 화학물질 또는 식품을 일정기간 투여한 사람을 포함한 동물, 식물, 세균 또는 진균류로부터 채취한 생체 세포 유래 산물 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신과 2－디옥시구아노신의 함유비율에 따라, 상기 화학물질 또는 식품의 유해성 또는 유익성을 평가하는 것으로 이루어진 화학물질 또는 식품의 생물학적 평가법에 관한 것이다.
본 발명자들은 항산화 보존액에 혼입한 생체 시료를 분자량 20~50kD의 차단 기능을 갖는 투석막에 관류시키는 것, 즉 마이크로다이아리시스(micro dialysis) 처리에 의해 항산화 환경에서 상기 생체 시료로부터 단백질을 제거하고, 관류 후, 고속 액체 크로마토그래프를 통해 얻어지는 용출 성분에 대해 자외선 흡수 분석에 의한 DNA 물질의 정량과 전기 화학 검출에 의한 DNA 산화 손상물의 정량을 동시에 수행하여, 동일 조건하에서 쌍방의 값을 정확하게 측정하고, 정확하게 DNA 산화 손상 상태를 검출할 수 있음을 알아내었다.
따라서, 본 발명은 a) 액상 생체 시료와 혼합하여 냉각 보존하기 위한 상기 시료의 1~5배량으로 준비되는 항산화 보존액,
b) 상기 액상 생체 시료와 상기 항산화 보존액의 혼합 용액 중에 침지시킨 투석막 튜브내에, 글리세린 수용액으로 이루어진 관류액을 관류시켜 분자량 20~50kD 이상의 물질 통과를 저지함과 동시에, 회수액의 글리세린 농도 목표치를 10~20중량%로 하는 마이크로다이아리시스(micro dialysis) 처리를 실시하는 마이크로다이아리시스 장치,
c) 상기 마이크로다이아리시스 처리의 회수액으로부터 저분자 DNA 관련 물질을 분리하기 위한 컬럼을 갖는 고속 액체 크로마토그래프,
d) 상기 컬럼의 용출류를 자외선 흡수 분석하여, DNA 핵산의 양을 측정하는 자외선 흡수 분석 장치, 및
e) 상기 컬럼의 용출류를 전기 화학적으로 분석하여, DNA 산화 손상물의 양을 측정하기 위한 전기 화학 검출기를 갖추어,
f) 측정한 DNA 핵산의 양과 DNA 산화 손상물의 양의 비율로부터 상기 액상 생체 시료 중의 DNA 산화 손상 지표를 구하는 것을 특징으로 하는 DNA 산화 손상 지표의 측정 장치에 관한 것이다.
본 발명은 또한, a) 세포 성분을 포함한 생체 시료와 그 1~5 배량의 상기 항산화 보존액의 혼합 용액을 밀봉하고, 냉각 보존하기 위한 조직 세포파쇄용 튜브,
b) 상기 밀봉·냉각 후의 튜브내의 생체 시료 중에 포함되는 조직을 파쇄하여, 세포 내외의 유리 핵산을 보존액 중에 용출시키는 동시에 그 파쇄시료로부터 고형물을 분리·침강시키기 위한 세포파쇄 및 고형물 분리 장치,
c) 상기 액상 생체 시료와 상기 항산화 보존액의 혼합액 중에 침지시킨 투석 막 튜브내에, 글리세린 수용액으로 이루어진 관류액을 관류시키고, 분자량 20~50kD 이상의 물질 통과를 저지함과 동시에, 회수액의 글리세린 농도 목표치를 10~20중량%로 하는 마이크로다이아리시스 처리를 실시하는 마이크로다이아리시스 장치,
d) 상기 마이크로다이아리시스 처리의 회수액으로부터 저분자 DNA 관련 물질을 분리하기 위한 컬럼을 갖는 고속 액체 크로마토그래프,
e) 상기 컬럼의 용출류를 자외선 흡수 분석하여 DNA 핵산의 양을 측정하기 위한 자외선 흡수 분석 장치, 및
f) 상기 컬럼의 용출류를 전기 화학적으로 분석하여 DNA 산화 손상물의 양을 측정하기 위한 전기 화학 검출기를 갖추어,
g) 측정한 DNA 핵산의 양과 DNA 산화 손상물의 양의 비율로부터 상기 생체 시료 중의 DNA 산화 손상 지표를 구하는 것을 특징으로 하는 DNA 산화 손상 지표의 측정 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명자들은 상기 측정 장치에 있어서 생체 시료용의 항산화 보존액으로 0.5~2mM/l의 EDTA, 2~5중량%의 메탄올, 및 10~40중량%의 글리세린을 포함하는 수용액이 특히 유용한 것을 알아내었다.
따라서, 본 발명은 상기 항산화 보존액이 0.5~2 mM/l의 EDTA, 2~5중량%의 메탄올, 및 10~40중량%의 글리세린을 포함하는 수용액인 상기 DNA 산화 손상 지표의 측정 장치와, 0.5~2 mM/l의 EDTA, 2~5중량%의 메탄올, 및 10~40 중량%의 글리세린을 포함하는 수용액으로 이루어진 생체 시료의 항산화 보존액 자체에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 「유해성 또는 유익성(의 유무)을 평가한다」라는 말은 피검물질이 생물학적 유해성(산화적 스트레스의 부여, 발암성, 최기형성(teratogenicity), 생식능에의 악영향 등)의 유무 판단 기준, 또는 유해성 또는 유익성(유효성)의 유무 판단 기준, 및 상기 유해성 또는 유익성의 정도를 제시하는 것을 의미한다. 또한, 「항산화능 또는 산화능을 평가한다」라는 말은 피검용액이 항산화능, 환언하면 환원력을 갖는 지의 판단 기준, 또는 피검용액이 산화능(산화력)을 갖는 지의 판단 기준, 및 그러한 정도를 제시하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 2＇－디옥시구아노신은 DNA의 구성 성분인 디옥시퓨린 뉴클레오시드의 일종이다. 거의 모든 유전자 정보는 아데닌(A)과 티민(T), 구아닌(G)과 시트신(C)의 염기대에 의해 암호화되고 있으나, 이 유전자 정보는 자연 돌연변이(자외선 조사나 DNA의 복제 에러 등에 의한다)나 인공 산물에 의한 돌연변이(각종의 발암물질, 활성 산소 등에 의한다)에 의해 일정 빈도로 손상을 받아 궁극적으로는 유전자 정보의 결여에 의한 손실, 중복, 역위, 삽입, 전좌, 점변이 등이 일어나, 세포나 개체의 사멸을 유도하거나 반대로 새로운 생물종의 탄생의 발단이 되고 있다.
활성 산소는 체내에 받아들여진 산소로부터 생성되는 이외에, 생체에 섭취된 천연 및 인공 화학물질이 활성 산소의 기원이나 유도 인자가 되어 생체 성분인 단백질, 지방질, 유전자 핵산 등에 산화 손상을 주는 것으로 알려져 있다. 상기 dG의 경우, 활성 산소종인 히드록시 라디칼(OH) 등과 결합하면, 산화형의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG)이 생긴다. 이 8 OHdG는 본래의 G：C의 염기대를 T：A 의 염기대로 변환시킨다. 즉, 이 G：C에서 T：A로의 변환은 개개의 세포의 유전자가 일정한 빈도로 손상되고 있음을 의미하고, 그 빈도의 정도는 필연적으로 그 개체의 자기보존 능력이나 종 보존 능력을 평가하는 유력한 지표가 된다고 생각된다. 실제, 8 OHdG는 DNA의 대표적인 산화적 손상 지표로서 예를 들면 발암율이나 뇌의 변성 질환의 발병과 유의한 상관이 있고(「실험 의학」 제13권, 제15호, 제31~37 페이지, 1995), 세포사(아포토시스)와 밀접한 관계가 있는 것( 「최신 의학」 제51권, 제3호, 제42~47 페이지, 1996) 등으로 보고되어 있다.
*본 발명은 8 OHdG의 DNA 산화적 손상 지표로서의 사용을 한층 더 진행해 피검물질이 dG를 8 OHdG로 산화하는 능력의 유무 및 그 정도를 측정하는 것으로써, 해당 피검물질의 유해성이나 안전성을 평가하는 것이다. 환언하면, 본 발명은 피검물질이 dG를 8 OHdG로 변환하는 능력을 해당 물질의 유해성의 유무 등의 판단 기준으로 하는 것으로, 생체 시료들 중에 이미 존재하는 8 OHdG를 암이나 신경 변성 질환 발생의 위험성이나 노화 정도의 척도로 하고 있는 종래의 시스템과는 기술적 사상이 기본적으로 상이하다. 본 발명의 생물학적 평가법에 있어서 dG로부터 8 OHdG로의 변화는 생명 현상의 설계도인 DNA 손상의 정도를 반영하고 있어 인간을 포함한 생물의 각 개체의 자기보존능이나 종족 보존능에 대한 영향을 평가하기 위한 매우 합리적인 객관적 지표라고 할 수 있다.
본 발명에 의해 생물학적 평가를 실시하는 피검물질로는 천연 및 인공 화학물질, 예를 들면, 의약품, 농약, 세제, 식품첨가물, 방부제, 각종 발암물질, 내분 비 교란 물질 등에 부가하여, 대기오염 물질, 수질오염 물질 등, 및 천연 및 인공 화학물질을 포함한 건강식품 또는 기능성 식품의 식품류 등을 들 수 있다. 상기 식품류에는 일반 식품류 및 건강식품류 자체 외에, 그 성분 등도 포함된다. 또한, 본 발명의 상기 피검물질에는 특정하지 않은 물질을 포함한 수용액(조성이 불명료한 용액으로 본 명세서에서는 피검용액이라고도 기재한다.), 예를 들면, 생활 배수, 산업 배수, 하수, 수도물, 정화수, 천연수, 하천수, 해수, 호수 등도 포함된다.
본 발명의 방법은 피검물질인 인공 화학물질이나 식품류 또는 수도물 등의 피검용액 등과 dG를 함께 일정시간 방치 후, 생성되는 8 OHdG를 측정하는 것으로써 통상 수행되나, 그 밖에 활성 산소종 발생제를 첨가하거나 자외선을 조사하는 등으로, 자연계나 생체내에서 폭로할 가능성이 있는 산화 유도 인자를 더욱 부하함으로써, 이들과 피검물질과의 상호작용을 평가할 수도 있다.
이렇게 하여, 본 발명의 방법은 의약품, 농약 등의 인공 화학물질 및 천연 물질 또는 식품류의 유해성 또는 유익성을 간편하고 합리적으로, 게다가 저비용으로 평가할 수 있다. 게다가, 상기 방법에 의해 물질의 대략의 허용량이나 유효량의 기준이 얻어질 수 있고, 중요성이 높은 것에 대해서는 하기와 같은 세포 배양 평가법, 생체내 평가법으로 한층 더 엄밀하게 평가할 수 있고, 본 발명은 그러한 방법도 제공한다.
세포 배양 평가법：
피검물질을 첨가한 배양액 중의 동물세포(예를 들면, 마우스의 임파구의 세포계인 B9세포계), 식물세포(예를 들면, 담배 BY－2 세포), 진균류(예를 들면, 효 모균)에 필요에 따라 산화제의 첨가 및/또는 자외선 조사를 수행하여 일정시간 경과 후, 배양 세포 유래의 dG 및 8 OHdG 농도를 측정하여 처리 전후의 값을 비교한다.
하등인 동식물 세포도, 그것 자신이 하나의 생명 단위로서 다양한 환경에 적응하는 능력(인공 화학물질의 해독이나 활성 산소 소거 기능 등)을 가지고 있으나, 살아있는 세포를 취급하는 유용성은 이 생물이 가지고 있는 항상성 유지 기능에 피검물질이 어느 정도의 영향을 미치는 지를 평가할 수 있는 점에 있다. 이러한 의미에서 세포 평가법은 가장 간단하게 사용할 수 있는 바이오 마커(생물 지표)라고 할 수 있다. 배양 세포는 세대 교대가 매우 빨라 세포 분열시에 발생하기 쉬운 DNA 손상의 빈도를 고감도로 반영할 수 있고, dG 및 8 OHdG의 정량도 107~109개 정도의 세포수가 있으면, 충분히 측정 가능하므로 통상의 항온조에 의해 비교적 다수의 검사대상 물체를 취급하는 시스템을 구축할 수 있다.
생체내 평가법：
실험동물(예를 들면, 마우스)에게 피검물질을 일정기간 투여하여 뇨 중 및 생식기관(난소 또는 정소) 중의 dG 및 8 OHdG 농도를 측정한다. 종래, 인공 화학물질 등의 생물 독성은 다양한 측면(예를 들면, 수명, 체중 변화, 혈액 생화학 데이터, 질환의 발증 빈도 등)으로부터 평가되어 왔으나, 개개의 지표를 모두 포함하여 종합적으로 판단하는 것은 불가능하였다. 그러나, DNA 손상 지표는 생명 활동의 설계도의 질을 나타내는 것이고, 그 생성량은 모든 병의 용태에 공통되는 것으로 생각된다. 이러한 의미에서, 본 발명에 있어서 8 OHdG의 생성량 측정은 생명체의 건 강도를 추정할 수 있는 가장 단순하고, 합리적인 종합 지표라고 할 수 있다. 생명 활동의 본질은 자기보존과 종의 보존에 집약되므로 생식 독성을 평가하는 의의는 중요하고, 본 발명의 방법에 따르면, 수컷과 암컷의 생식 장기인 정소와 난소로만 표적을 좁혀, 차세대 생명의 설계도(DNA)가 어느 정도 손상되고 있는 지로, 피검물질의 기본적인 위험성을 평가할 수도 있다. 또한, 생체내 평가법은 일련의 평가법 중에서, 가장 수고와 시간을 필요로 하는 것이고, 폭로하는 농도가 높은 물질이나 저농도에서도 유해성이 높은 물질 등에 대해서는 최종적으로 사람에 준하는 동물(포유류 동물)에서의 검증이 필요하였다. 그러나, 본 발명은 DNA 손상능의 일점에 초점을 맞힌 평가법으로, 종래의 방법에 비해 시간이나 경비를 현저히 경감시킨다.
본 발명의 방법에 있어서의 8 OHdG 농도의 측정은 예를 들면 시료 용액 중에 포함되어 있는 dG와 8 OHdG를 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 분리하고, 이것과 연결된 자외선 흡수 분석 장치와 전기 화학 검출기에 의해 실시할 수 있다. 게다가, 이 방법에 의하면, dG와 8 OHdG의 농도를 동시에 검출하는 것이 가능하다. 또한, 8 OHdG 농도는 8 OHdG에 특이적으로 반응하는 항체, 바람직하게는 단일 클론 항체 등을 사용하여 측정하는 것도 가능하다.
또한, 생체 시료를 사용하는 경우, 마이크로다이아리시스법(투석막 관류법)에 의해 효율적으로 저분자의 DNA 구성 성분(dG, 8 OHdG 등)을 회수한 후, 8 OHdG 등의 측정을 실시하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 20kD~50kD의 고분자량 성분을 차단할 수 있는 투석막을 이용하여 관류를 실시한다. 생체 시료가 액상 시료(혈장, 뇨, 골수 등)의 경우, 상기와 같은 막을 이용해 투석을 실시하고, 투석 후의 혼합액이 8 OHdG등의 측정에 제공된다. 세포 성분을 포함한 시료(전혈, 세포 부유액, 조직 등)의 경우, 세포파쇄장치에 의해 조직이나 세포를 파쇄시키고, 세포질이나 핵내에 존재하는 핵산 성분을 용출시킨다. 그 후, 원심분리에 의해 고형 성분을 분리하고, 맑아진 액을 상기와 같은 투석막을 이용해 투석한 후, 회수된 투석액 중의 dG 및 8 OHdG를 측정한다.
또한, 피검물질로서 생체 시료를 사용하는 경우, dG에서 8 OHdG로와 같은 활성 산소에 의한 산화가 시료 채취 직후부터 시작되어, 평가 결과에 채취 직후의 상태가 정확하게 반영되지 않는 것이 있다. 이러한 경우, 양이온 킬레이트제, 항산화제 및 글리세린을 주성분으로 하는 항산화 보존액에 생체 시료를 침지하여, 시료 채취 후의 산화 진행을 막는 것이 바람직하다. 양이온 킬레이트제는 각종의 생체 반응이나 효소 반응을 효율적으로 정지하는 작용을 갖고, 예를 들면 에틸렌디아민테트라아세테이트 등이 사용된다. 항산화제는 히드록시 라디칼의 발생과 유리를 예방하는 것으로, 예를 들면 메탄올 등이 사용된다. 또한, 글리세린은 히드록실기에 의한 산화방지효과 외에, 생체 시료를 -20℃~4℃의 조건(통상의 생체 시료가 사용시까지 보존되는 조건)으로 안정된 보존 작용을 갖고, 예를 들면 20~50% 수용액이 사용된다. 게다가, 상기 항산화 보존액을 생체 시료 뿐만 아니라, 피검물질에 dG를 첨가한 후, 일정시간 방치한 후, 첨가하여 8 OHdG 측정까지 산화를 억제하여 일정시간 경과 후의 정확한 (항)산화능을 측정할 수 있다.
상기 항산화 보존액으로는 0.5~2mM/l의 EDTA, 2~5중량%의 메탄올, 및 10~40중량%의 글리세린을 포함한 수용액으로 이루어진 항산화 보존액이 바람직하다. 상 기 항산화 보존액은 특히 dG(디옥시구아노신)로부터 8 OHdG가 유도되는 것을 특이적으로 방지한다. 이는 첫번째로 양이온의 킬레이트제인 EDTA가 칼슘을 킬레이트화해서 생체 반응이나 효소 반응을 효율적으로 정지하고, 두번째로 항산화제인 메탄올이 히드록시 라디칼의 생성·유리를 예방하고, 세번째로, 글리세린 용액이 알코올기(OH기)에 의한 산화 방지 효과를 가짐과 동시에, 검체를 -20~4℃에서 안정적으로 보존하는 부동액으로 작용하기 때문이다. 글리세린은 또한 단백질 분해를 저지하여 효소 반응의 억제 효과도 갖는다.
상기 항산화 보존액의 유효성을 확인하기 위해 본 발명자는,
(１）각 170㎍/l 준비된 각종 보존액 성분에, 산화제(KBrO3, 50mg/ml용액)를 각 20㎕ 첨가하여 혼합하고,
(２）상기 혼합액에 시판의 dG표준 용액(2＇－디옥시구아노신, 400㎍/l)을 각각 10㎕씩 첨가하여 검체를 조제하고,
(３）30분 경과 후에 각 검체 50㎕를 등량(50㎕)의 20% 글리세린 수용액과 혼화하고,
(４）상기 혼화액을 항산화 보존액으로서 8 OHdG와 dG를 정량하여 각 검체의 산화 상태(8 OHdG의 증가)를 조사하였다.
결과를 이하의 표에 나타내었다. 또한, 산화제로서 KBrO3를 사용한 것은 이 물질이 빵의 표백제나 방부제와 같은 식품첨가물로 일반적으로 이용되기 때문이다.
시료에 혼화 또는 희석물 산화 조건 8OHdG×10-3 dG 8OHdG/dG×10-3 대 초기비배율
순수한 물 희석(직후) - 0.2710 1.0300 0.263 1
순수한 물 희석 KBrO3 30분 3.779 1.067 3.542 13.47
#1) EDTA/4Na 1mM KBrO3 30분 1.098 0.997 1.101 4.19
#2) 10%Gly. KBrO3 30분 1.572 1.044 1.506 5.73
#3) 1%Meth. KBrO3 30분 2.882 1.04 2.771 10.54
#4) 5%Meth. KBrO3 30분 2.359 1.054 2.238 8.51
#5) 10mg/ml Rafi. KBrO3 30분 3.278 1.045 3.137 11.93
#6) 1mg/ml Rafi. KBrO3 30분 2.327 0.926 2.513 9.55
#7) 10mg/ml Glu. KBrO3 30분 2.686 1.049 2.561 9.74
#8) 1mg/ml Glu. KBrO3 30분 2.515 1.029 2.444 9.29
#9) 10%Gly+2.5%Meth. KBrO3 30분 1.335 1.045 1.278 4.86
#10)10%Gly+2.5%Meth.+1mM EDTA/4Na KBrO3 30분 0.978 1.058 0.924 3.51
#11) KBrO3 10mg/ml (KBrO3) 15분 3.991 1.011 3.95
#12) 〃 〃 (KBrO3) 60분 3.677 1.014 3.63
#13) KBrO3 1mg/ml (KBrO3) 15분 0.715 0.975 0.73
#14) 〃 〃 (KBrO3) 60분 0.788 1.022 0.77
#15) 〃 〃 15분+보존액중 90분 0.727 1.018 0.71
#16) KBrO3 0.1mg/ml (KBrO3) 15분 0.222 1.02 0.22
#17) 〃 〃 (KBrO3) 60분 0.183 1.025 0.18
상기 표의 제1행에는, 상기 (1)에서 얻을 수 있는 혼합액 대신에 순수한 물을 이용하여 「순수한 물 검체」인 경우의 데이터를 나타내고, 제2행에는 보존액 성분 대신에 순수한 물을 이용하고, 산화제(KBrO3)는 규정 통과한 혼합액을 이용하여 「순수한 물/산화제 검체」인 경우의 데이터를 나타내었다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 순수한 물 검체의 dG 농도는 1.0300VS(자외선 흡광 분석 장치의 출력으로 표시한 값. 이 때 용해되어 있는 표준 dG 농도는 10㎍/ml이다.)이고, 그 조제·측정 단계에 있어 이미 존재하는 8 OHdG 농도는 0.2710mVs(전기 화학 검출기의 출력으로 표시한 값. 농도 5ng/ml의 표준 8 OHdG의 출력은 7.0mVs에 상당한다.)이고, 8 OHdG/dG비는 0.263×10－3이었다. 다음에 순수한 물/산화제 검체에서 30분 경 과하면, 8 OHdG 농도는 3.779mVs가 되고, 8 OHdG/dG비는 3.542×10－3로 순수한 물 검체의 경우의 13.47배가 되었다. 이하, 각종 보존액 성분의 효과를 검토하는데 있어, 8 OHdG/dG비를 이용하는데, 그 이유는 각 측정시 8 OHdG와 dG 측정값의 쌍방으로 같은 경향으로 나타난다고 예상되는 오차, 예를 들면 피검용액의 농도 및 용량에 대한 오차가 데이터에 주는 영향을 경감하기 위해서이다.
보존액 성분으로서 양이온 킬레이트제인 EDTA/4 Na(측정시 농도：1mM/l)를 이용한 것은 같은 산화 조건에서 8 OHdG/dG가 1.101×10－3로 초순수 검체의 경우의 4.19배로 억제시키고, 글리세린(측정시 농도：10중량%)을 이용한 것은 같은 산화 조건에서 동일한 값이 1.506×10－3으로 순수한 물 검체의 경우의 5.73배로 억제시켰다. 또한, 항산화제인 메탄올(측정시 농도：1중량% 및 5중량%)을 이용했을 경우에는, 각각 같은 산화 조건에서 동일한 값이 2.771×10－3 및 2.238×10－3이 되고, 각각 초순수한 물 검체의 경우의 10.54배 및 8. 51배로 억제되었다.
*상술한 보존액 성분(EDTA/4 Na, 글리세린 및 메탄올) 이외로, 각각 라피노스 및 글루코오스를 이용한 각각 2개의 경우도 상기 표에 나타냈다. 라피노스는 사탕무우로부터 얻을 수 있는 3당류의 일종으로, 그 물리화학적 안정성으로부터 정자 보존액이나 장기 보존액에 첨가되는 조직 안정화제로 이용되고 있다. 한편, 글루코오스는 가장 일반적인 단당류인 동시에, 생체내에 가장 대량으로 존재하는 강력한 항산화물질인 것으로 알려져 있다(후타키외편, 「항산화물질」, 학회 출판 센터, 1994년). 그러나, 상기 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 모두 8 OHdG/dG 비가 초순수한 물의 경우와 비교해 약 10~12배 정도로 비교적 커서 항산화 보존액 성분으로는 적합하지 않았다.
그 외, 생체 시료에 대해 항산화성을 발휘하는 대표적인 물질로 VC(아스코르빈산)나 NaN3(아지화 나트륨)가 있다. 그러나, VC는 그 자체가 지극히 강력한 항산화성(환원성)임에도 관계없이, 햇빛 금속 이온의 존재하에서는 반대로 강력한 산화제가 되어 실제, dG 용액에 첨가하여 공기에 접한 상태로 장기 보존하면, 8 OHdG를 대량으로 유도하는 것을 확인하였다. 또한, 아지화 나트륨은 핵산의 성분이나 각종 효소의 보존액(안정화제)으로 다용되고 있으나, 이것도 화학반응성이 강하고, 공기 중 및 시료 중의 산소와 반응하여 대량의 질소산화물을 유도하는 것이 확인되었다.
이에 대하여, 글리세린, 메탄올 및 EDTA는 지극히 안정한 화학물질이고, 미생물의 번식도 유도하지 않고, 상기 표에 나타낸 바와 같이, 글루코오스, 라피노스 등을 능가하는 항산화능 데이터를 나타내었다.
여기서, 바람직한 결과를 얻은 상기 3요소의 상승효과를 기초로, 항산화 보존액을 조제했다(No. 10 검체, 측정시 농도：글리세린 10중량%, 메탄올 2.5중량%, 및 EDTA/4Na1mM/l로 이루어진 혼화물). 상기 항산화 보존액을 이용한 것은 0.924의 8 OHdG/dG비, 및 3.51의 큰 초기값 배율을 나타내어, dG의 산화를 큰폭으로 억제하였다. 따라서 이 No. 10 검체의 성분(상기 3요소)이 항산화 보존액의 성분으로 적 당한 것이고, 상기의 배합비는 액체 크로마토그래프로부터 시작되는 측정계에 공급되기 위해, 각각 바람직한 성분 농도 범위내에 있다.
결국, 항산화 보존액의 성분 배합비는 마이크로다이아리시스 단백질 제거 처리의 관류액, 전형적으로는 20중량% 글리세린 수용액을 이용하는 것으로 변화하는 각 성분의 측정시 농도를 상기 No. 10 검체의 값(단, 측정시 글리세린 농도는 이 검체의 10중량%로부터 40중량%정도까지 높아져도 괜찮지만, 측정 직전의 단백질 제거 처리의 정밀도와의 관련하여 상한은 20 중량%정도가 한도가 된다. )에 접근하도록 EDTA가 0.5~2mM/l, 메탄올이 2~5중량%, 그리고 글리세린이 10~40중량%로 정해진 것이다.
게다가, 상기 표에서 No. 11~17 검체는 dG 표준 용액을 첨가하는 혼합액 중의 보존액 성분 대신에 순수한 물을 이용해 산화제(KBrO3)의 농도를 3 단계로 바꾼 각 경우의, 시간 경과에 수반하는 dG의 산화 상태를 나타내는 것이다. No. 11 및 12는 측정시 순수한 물/산화제 검사대상 물체와 같은 산화제 농도(KBrO3 10mg/ml)를 갖는 것이고, 그 15분 경과의 8 OHdG 농도 3.991 및 60분 경과의 8 OHdG 농도 3.677은 순수한 물/산화제 검체(30분)의 8 OHdG 농도 3.779에 가까운 값이다. 이들의 값은 KBrO3 농도가 1mg/ml 및 0.1mg/ml인 No. 13~17 검체의 경우에서 0.7~0.8 정도 및 0.2 정도와 비교해 지극히 높고, dG에 항산화 보존액을 수반하지 않고 산화제(KBrO3)를 첨가했을 때는 그 첨가량에 의존해 산화가 진행되는 것을 나타내고 있다.
이 결과로부터 KBrO3의 농도에 의존해 dG로부터 8 OHdG의 유도를 볼 수 있는 것, 및 15분후와 60분후의 사이에는 8 OHdG의 유도량에 실질적인 차이를 볼 수 없기 때문에, KBrO3에 의한 산화 반응은 신속하게 생긴 후에 일정화하는 것으로 추측된다. 따라서, 본 발명의 측정 장치에 의해 KBrO3를 시작해 일상적으로 경구 섭취하고 있는 각종의 식품첨가물의 DNA 산화 기능을 명확하게 파악하는 것이 가능하고, 그 허용 농도의 재검토에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 생물학적 평가법은 예를 들면 하기와 같이 수행된다. 먼저, 피검물질을 다단계로 희석한 용액 또는 피검용액 중에 이미 알고 있는 농도의 2＇－디옥시구아노신(dG)을 첨가하고, 저온으로부터 약 50℃, 바람직하게는 실온으로 일정시간 방치 후, 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신(8 OHdG)의 생성량을 측정한다(이 값을 A로 한다). 이것과 별도로 dG의 초순수한 물 용액을 상기와 같은 조건으로 일정시간 방치한 후, 8 OHdG의 양을 측정한다(이 값을 B로 한다). B에 비해 A가 크면 피검물질은 산화 유도능을 가지고, 반대로 B에 비해 A가 작으면 피검물질은 항산화능을 갖는 것으로 평가된다. 또한, 어느 경우에도 그 차이가 클수록, 산화 유도능 또는 항산화능의 정도가 크다고 판단된다.
활성 산소의 발생은 생명 활동을 수행하는데 있어 피할 수 없는 현상이다. 그러나, 그 생리 활성을 소거하는 시스템이 충분한 기능을 하지 못할 때에는 DNA의 산화 손상이 증가하여 발암이나 세포 활동성의 저하(노화), 나아가서는 세포사(아포토시스)가 유도되는 것이 알려져 있다. 본 발명에 의해 피검물질이 활성 산소의 독성을 DNA 핵산 레벨, 단일 세포 레벨, 한 개체 레벨로, 얼마나 소거할 수 있을지(유효성을 가질지), 또는 얼마나 증가시킬지(유독인지)를 간편하게 평가할 수 있다.
또한, 각종 건강식품이나 기능성 식품 등의 식품류의 유효성은 환언하면 생체내에서 발생하는 활성 산소의 독성을 어느 정도 효율적으로 소거할 수 있는지에 의존한다고 말할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 각종 식품류의 항산화능을 DNA 산화 손상을 지표로 객관화할 수 있다.
자외선은 핵 DNA에 직접 작용하여 DNA의 산화 손상을 일으키는 유력한 인자로 지구상에서 숨쉬는 생물은 그 영향으로부터 피할 수 없다. 또한, 자연 환경 중에 배출된 합성 물질 또는 자연스럽게 존재하는 천연 물질도 자외선 조사에 의해 활성화(라디칼화)할 가능성이 있어, 이들의 활성화된 합성 물질 등을 섭취하는 것 또는 상기 합성 물질 등과 접촉하는 것으로써 생기는 생물학적 독성도 무시할 수 없다. 본 발명에 의하면 이러한 합성 물질 등의 피검물질과 자외선과의 상가, 상승 또는 상쇄 효과를 간편하게 평가할 수 있다. 또한, 활성 산소종 발생제와 피검물질과의 상가, 상승 또는 상쇄 효과의 간편한 평가법도 본 발명은 제공한다. 게다가 본 발명에 의하면 유전자 산화 손상 작용을 갖는 것이 확인되고 있는 물질과 피검물질을 포함한 용액에 이미 알고 있는 양의 dG를 첨가하고, 상기 용액 중의 8 OHdG를 정량하여, 그 양에 따라 상기 피검물질의 유전자 손상 예방 작용의 유효성의 유무를 평가할 수도 있다. 여기서, 유전자 산화 손상 작용을 갖는 것이 확인되고 있는 물질로는 일상생활에 폭로할 가능성이 높은 것을 선택하여 보다 현실에 가까운 상태에서 피검물질의 작용을 평가할 수 있다. 특히, 피검물질을 식품류와 하는 것에 의해, 상기 식품류와 유전자 산화 손상성 물질과의 혼재에 의한 영향을 평가할 수 있다.
본 발명의 생물학적 평가법에서, 화학물질 또는 식품을 투여하거나, 섭취 또는 접촉시킨 사람을 포함한 동물, 식물, 세균 또는 진균류 등으로부터 채취한 생체 세포 유래 산물, 예를 들면, 혈액, 뇨, 다른 체액, 조직파쇄액 또는 세포파쇄액 등을 피검 대상으로 하고, 상기 피검대상 중의 8 OHdG와 dG와의 함유비(8 OHdG/dG)를 산출하여, 상기 함유비의 크기에 따라 상기 화학물질 또는 식품의 유해성 또는 유익성을 평가할 수 있다(상기 화학물질 또는 식품은 상기 함유비가 높을수록 유해성이 높고, 낮을수록 유익성이 높다).
또한, 본 발명의 생물학적 평가법에서 우수한 항산화능을 갖는 즉, 어떠한 원인에 의해 발생한 활성 산소를 효율적으로 소거할 수 있는 물질, 예를 들면 여러가지 천연 또는 인공 화학물질을 포함한 기능성 식품, 또는 그 조성이 불명확한 물질, 특히 물은 계속적으로 섭취하는 것에 의해 사람을 포함한 동물에 있어서의 여러가지 질환 및 장해를 치료, 개선 및 경감할 수 있다. 이러한 물질이 가져야 할 항산화능은 피검대상 중의 8 OHdG와 dG의 함유비가 초순수한 물을 이용했을 경우와 동일한 정도인 것이 하나의 기준이 될 수 있다.
본 발명의 측정 장치는 생체의 액상 시료, 즉, 전혈, 혈장, 혈청, 뇨, 골수액, 조직액 등의 피검물질을 용해한 수용액에 대해 적용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다. 먼저, 시료의 사전 처리로 액상 시료를 동일한 용량의 항산화 보존 액에 혼화하고, 그 후, 측정까지 보존하여, 마이크로다이아리시스 처리로부터 시작되는 측정 조작의 직전에 보존 검사대상 물체를 실온으로 되돌린다. 마이크로다이아리시스 처리에 의해 관류회수된 피검용액을 고속 액체 크로마토그래프에 공급하고, dG 피크 및 8 OHdG 피크를 포함한 그 용출류를 8 OHdG/dG 동시 측정 시스템에 공급해 측정을 실시한다. 상기 측정값으로부터 최종적으로 생체 시료 중의 DNA 산화 손상 지표를 연산한다.
본 발명의 측정 장치는 세포 성분을 포함한 생체 시료, 즉, 전혈, 세포 부유액, 장기, 조직 등, 파쇄를 필요로 하는 것에 적용하는 경우, 이하와 같이 실시할 수 있다. 먼저, 항산화 보존액을 먼저 조직파쇄용 튜브에 0.5~0.1ml 주입한다. 상기 조직파쇄용 튜브로는 물리적으로는 세포파쇄에 적절한 것과 동시에 생화학적으로는 DNA 효소 불감응성, 또는 RNA 효소 불감응성의 멸균 튜브, 예를 들면, 아메리카 합중국의 바이오 101사로부터 제조 판매되고 있는 Fast　DNA　튜브를 이용할 수 있다. 다음에, 생체 세포 시료 100~200mg를 상기 튜브에 넣고, 즉시 냉각시킨다. 세포파쇄 및 관련 조작의 준비가 갖추어지면, 전용 파쇄장치, 예를 들면, 아메리카 합중국의 바이오 101사로부터 제조 판매되고 있는 FastPrep　FP120 타입 장치를 이용해 조직을 파쇄하고, 세포 내외의 유리 핵산을 보존액 중에 용출시킨다. 상기 유리 핵산을 포함한 보존액으로부터 고형물을 원심분리하고, 그 후, 맑아 진 용액을 보존 검체로 한다. 보존 검체를 측정 직전에 실온으로 되돌려 마이크로다이아리시스 처리에 제공한다. 마이크로다이아리시스 처리에 의해 관류회수된 피검액을 고속 액체 크로마토그래프에 공급하고, dG 피크 및 8 OHdG 피크를 포함한 그 용출류를 8 OHdG/dG 동시 측정 시스템에 공급하여 측정한다. 상기 측정값으로부터 최종적으로 생체 시료 중의 DNA 산화 손상 지표를 연산한다.
*상기 항산화 보존액은 기본적으로 양이온의 킬레이트제와 항산화제를 10~40%의 글리세린 수용액에 용해시킨 것이고, 생체 시료를 혼입할 때까지 냉각조건 이하의 온도 및 차광 상태로 보관된다. 바람직한 조성 배합비는 이하와 같다.
글리세린：10~40중량%
메탄올：2~5중량%
EDTA/4Na：0.5~2mM/l
상기 조성 배합비 중, 메탄올 및 EDTA/4 Na에 대한 적당의 추가도 있을 수 있다. 조제된 보존액 자체, 또는 생체 시료 혼입 후의 보존은 모두 차광밀봉 상태에서, 다음과 같이 실시할 수 있다.
2~3 일정도의 단기 보존：냉장고(4℃).
반년 정도의 중기 보존：냉동고(－10~－20℃).
반년 이상의 장기 보존：시료 튜브내의 공기를 질소 가스와 치환 후, 냉동고(－80℃ 이하).
상기 마이크로다이아리시스(미세 투석)에서는 20~50kD의 고분자량 성분을 저지하는 차단 기능을 갖는 투석막 튜브를 검체 중에 침지시키고, 이 튜브내에 관류액을 통과시키는 관류시스템을 포함한 장치에 의해 검체로부터 효율적으로 저분자 의 DNA 성분을 회수한다. 회수 성분은 dG, C10H13N5O4, MW267, 8 OHdG, C10H13N5O5, MW283 등이다. 관류조건은 이하의 값을 기본으로 한다.
관류액：20% 글리세린 용액
관류온도：실온
관유속도: 0.5~2㎕/분
그러나, 회수율을 올리거나 목적 성분의 S/N비를 개선하기 위해서, 이들의 조건을 적당하게 변화시킬 수 있다.
마이크로다이아리시스에 의해 회수된 저분자 DNA 성분은 고속 액체 크로마토그래프의 컬럼에 이송되어 8 OHdG, dG 등의 성분 피크 마다 컬럼으로부터 용출시킨다. 컬럼 용출류를 먼저 자외선 흡수 분석 장치의 시료 셀에 보내 dG량을 측정한 후, 상기 화학 검출기에 보내 8 OHdG량을 측정한다.
상술한 바와 같이 본 발명의 측정 장치의 순서를 도 1의 흐름도에 따라 정리하면 다음과 같다.
스텝 1：생체 시료의 채취.
스텝 2：생체 시료를 보존액과 혼합하여 냉각 보존.
스텝 3：튜브내 보존액에 혼합한 세포 분석용 시료의 파쇄와 고형물 분리.
스텝 4：보존한 액상 시료, 또는 파쇄 및 분리 후의 세포 분석용 시료의 마이크로다이아리시스 처리.
스텝 5：다이아리시스에 의해 관류·추출된 시료 성분을 고속 액체 크로마토 그래프(HPLC)에 공급.
스텝 6：크로마토그래프 컬럼의 용출류를 자외선(UV) 흡수 분석 장치의 시료 셀에 보내 dG량을 측정.
스텝 7：상기 시료 셀을 통과한 컬럼용출류를 전기 화학 검출기에 통과시켜 8 OHdG량을 측정.
스텝 8：스텝 6 및 7의 측정값을 이용하여 8 OHdG/dG비 그 외의 데이터를 처리.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 좀 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
펜타클로로페놀(PCP, 제초제), 비스페놀 A(BPA, 수지 원료) 및 레스베라톨(RVT, 폴리페놀의 일종)의 각 농도 용액(0.0005ppm, 0.005ppm, 0.05ppm, 0.5ppm 및 5ppm)을 준비하고, 2개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 분주하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 한개의 플레이트는 그대로 실온으로 90분간 방치하며, 다른 한개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254nm, 860μW/㎠)을 90분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, HPLC［사용 컬럼：CA－5ODS(에이콤 사제), 이동상 용액：0.1M 인산 완충액, 3~10% 메탄올, SOS90~100mg에 의해 dG와 8 OHdG를 분리하고, 계속해서, 상기 HPLC에 연결된 자외선 흡수 분석 장치 및 전기 화학 검출기에 의해 쌍방의 뉴클레오티드를 정량하였다. 또한 비교를 위해, 초순수한 물에만 동일한 처리를 가하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 측정은 쌍방의 뉴클레오티드에 대해서 수행되었으나, 하기 표 1에서는 8 OHdG의 농도(ng/ml)만을 나타내었다(이하의 실시예에서도 동일).
피검물질 농도(ppm) 90분간 방치 90분간 UV조사
초순수한 물 0.267 0.529
PCP 5 0.340 5.730
0.5 0.282 0.396
0.05 0.285 0.431
0.005 0.236 0.451
0.0005 0.260 0.585
BPA 5 0.192 7.142
0.5 0.231 1.736
0.05 nd 0.614
0.005 0.315 0.794
0.0005 nd 0.689
RVT 5 nd 5.582
0.5 nd 1.378
0.05 nd 0.571
0.005 nd 0.690
0.0005 nd 1.026
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이고, 「nd」는 측정하지 않은 것을 의미한다.)
PCP는 농약 또는 가죽의 유연제이고, 5mg/kg가 안전 농도로 보고되어 있다. 그러나, 상기 결과로부터 5mg/kg에 상당하는 5ppm 자외선에 의한 산화 손상 작용이 극단적으로 상승하고, 유해성이 높아지는 것이 분명하게 확인되었다.
BPA는 대표적인 내분비 교란 물질(환경 호르몬)이고, 0.5ppm 이상의 자외선에 의한 산화 손상 작용이 분명하게 상승하여, 유해성이 높아지고 있다. 참고로 실제로 폭로될 가능성이 있는 BPA 농도를 이하에 나타낸다.
하천이나 호수와 늪안： 많은 곳으로 0.001ppm 정도
일반 산업 폐기물 처리장으로부터의 침출수：최대 20ppm 정도
PC제 식기(95℃에서 30분)：0.005~0.1ppm
음료용 캔의 코팅제로부터의 용출：0.1ppm 정도
치과용 시멘트제로부터의 용출：충치 치료 후의 타액중으로부터 1ppm 정도
어류：0.02~0.3ppm 정도　
또한, BPA에 대한 우리 나라에서의 기준은 용출분은 2.5ppm 이하, 재질분은 500ppm 이하이고, 허용 섭취량은 각국 공통으로 0.05mg/kg/일이다. 본 발명은 이들의 기준을 검토하는데 도움이 될 수 있다.
RVT는 대표적 폴리페놀이고, 붉은 와인 중에 2~10ppm 정도로 포함되어 있고 , 항동맥 경화 작용 등이 최근에 보고되어 있다.
그러나, 상기 결과에 의하면 0.5ppm 이상의 자외선에 의한 산화 손상 작용이 분명하게 상승하여 유해성이 높아지고 있다. 이와 같이, 본 발명은 종래 유효한 것으로 알려져 있는 물질의 유효성(또는 유해성)을 간단하게 합리적으로 검증할 수도 있다.
상기 시험에서 1회의 측정에 필요한 시료량은 10~100㎕로 적고, 시료 주입 후 5~10분 이내에 측정 피크를 검출할 수 있어 15분/시료의 페이스로 연속 측정이 가능하다. 따라서, 본 발명을 이용하여 1대의 HPLC를 주 120시간의 페이스로 가동했을 경우, 480검체/주, 그리고 약 2000검체/월의 측정이 가능해진다. 이는 본 발명에 따르면, 지금까지 보고된 적이 없는 하이 페이스로 피검물질의 독성 등을 평가할 수 있음을 의미한다.
또한, 실시예 1에서는 dG와 8 OHdG의 쌍방을 동시에 자외선 흡수 분석 장치 및 전기 화학 검출기에 의해 측정했지만, 8 OHdG 만의 측정을 실시하는 것도 가능하다. 그 경우, 단일 클론 항체를 이용한 측정 키트［예를 들면, 상품명 8－OHdG　Check(일본 노화 제어 연구소제)］를 사용하여 단시간에 다량의 시료 측정을 고감도로 실시할 수 있다.
실시예 2
비타민 C(VC), 비타민 E(VE), 카테킨(Cate) 및 타닌산(Tan)을 소정 농도의 용액으로 준비하고, 2개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 주입하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 한개의 플레이트는 그대로 실온에 90분간 방치하고, 다른 한개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254 nm, 860μW/㎠)을 90분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해, 증류수에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
피검물질 농도 90분간 방치 90분간 UV조사
증류수 0.15 1.23
VC 0.001 % 6.04 38.36
0.0001 % 0.63 1.51
0.00001 % 0.44 0.46
VE 0.05 % 0.44 0.42
0.005 % 0.45 0.18
0.0005 % 0.49 0.30
Cate 100g/ml nd nd
10g/ml 133.71 nd
1g/ml 9.07 nd
Tan 100g/ml 54.00 97.07
10g/ml 5.64 19.29
1g/ml 0.84 1.04
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이고, 「nd」는 측정하지 않은 것을 의미한다.)
상기의 결과로부터 이하의 결론을 유도할 수 있다.
·VC는 강력한 항산화물질이라고 말할 수 있으나, 수용성의 dG에 대해서는 매우 강한 산화 유도 물질로 작용한다.
·VE는 매우 안정된 항산화물질이다.
·Cate는 자외선 조사의 유무에 관계없이, 매우 강력하게 8 OHdG를 유도한다. 이 산화능이 Cate의 살균 작용이나 항바이러스 작용과 관련있는 것으로 생각된다. Cate의 경우와 같이, 물질이 나타내는 8 OHdG 유도능을 살균·정균 효과나 항바이러스 효과 등의 지표(유효 농도 지표)로 사용할 가능성이 높다.
·Tan는 높은 유전자 손상 유도 작용을 나타낸다.
*실시예 3
글리세롤(Gly) 및 메탄올(Meth)을 소정 농도의 용액으로 준비하고, 5개의 99 웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 주입하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 1개의 플레이트는 그대로 실온으로 90분간 방치하고, 다른 1개를 같이 실온으로 24시간 방치하며, 나머지 3개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254nm, 860μW/㎠)을 각각 60분간, 90분간 또는 120분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해, 초순수한 물에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 표 3에 나타내었다.
피검물질 농도 방치 UV 조사
90분간 24시간 60분간 90분간 120분간
초순수한 물 0.323 0.382 0.231 0.382 0.645
Gly 5 % 0.228 0.306 0.344 0.399 0.544
20 % 0.213 0.342 1.317 1.471 1.374
Meth 5 % 0.146 0.336 0.181 0.209 0.332
20 % 0.186 0.274 0.324 0.395 0.518
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이다.)
Gly 및 Meth는 모두 히드록시 라디칼에 의한 DNA 손상의 예방 효과를 갖는 것이 보고되어 있으므, 본 실시예의 결과로, 이들의 항산화능을 확인하였다. 특히, Gly는 실온 방치시에만 항산화능이 확인되었지만, Meth는 실온 방치시 및 자외선 조사시의 쌍방에서 강력한 항산화능이 확인되었다.
실시예 4
글루코오스(Glu), 라피노스(Raffi) 및 자당(Suc)을 소정 농도의 용액으로 준비하고, 4개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 주입하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 1개의 플레이트는 그대로 실온에서 90분간 방치하고, 그리고 나머지 3개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254nm, 860μW/㎠)을 각각 60분간, 90분간 또는 120분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해, 초순수한 물에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
피검물질 농도 90분간 방치 UV 조사
60분간 90분간 120분간
초순수한 물 0.195 0.392 0.901 1.183
Glu 1 mg/ml 0.220 0.094 0.099 0.237
100g/ml 0.200 0.132 0.274 0.414
10g/ml 0.240 0.291 0.458 0.277
1g/ml 0.260 0.384 0.595 0.385
0.1g/ml 0.295 0.399 0.702 0.410
Raffi 1 mg/ml 0.340 0.115 0.176 0.240
100g/ml 0.455 0.158 0.370 0.503
10g/ml 0.405 0.281 0.626 1.314
1g/ml 0.185 0.304 0.854 1.049
0.1g/ml 0.205 0.375 0.689 1.127
Suc 1 mg/ml 0.300 0.127 0.309 0.364
100g/ml 0.280 nd 0.379 0.648
10g/ml 0.235 0.333 0.690 1.279
1g/ml 0.185 0.358 0.708 1.143
0.1g/ml 0.235 0.299 0.756 1.073
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이고, 「nd」는 측정하지 않은 것을 의미한다.)
상기의 결과로부터 이하의 결론을 유도할 수 있다.
·항산화능의 강함은 실온 방치 및 자외선 조사의 어느 경우도, Glu＞Raffi≒Suc로 평가할 수 있다.
·정상의 혈당값을 약 50~100mg/dl(0.5~1 mg/ml)로 하면, 혈액 중에 존재하는 Glu는 자외선 조사에 대한 매우 유효한 항산화물질이라고 할 수 있다.
·Raffi는 천연 올리고당의 일종으로 청량 음료, 건강 음료, 건강식품 등 많은 식품에 첨가되고 있어 항산화능은 Glu정도는 아니지만, 10g/ml 이상의 농도이면 유효하다.
·Suc는 Raffi와 동일한 정도의 항산화능을 나타낸다.
실시예 5
모두 프로타민 관련 물질인 1－아르기닌(Arg), 1－시트룰린(Cit) 및 스페르민(Spe)을 소정 농도의 용액으로 준비하고, 2개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 주입하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 한개의 플레이트는 그대로 실온으로 90분간 방치하며, 다른 한개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254 nm, 860μW/㎠)을 90분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해 초순수한 물에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
피검물질 농도 90분간 방치 90분간 UV조사
초순수한 물 0.219 0.422
Arg 1 mg/ml 0.173 0.299
100㎍/ml 0.150 0.305
10㎍/ml 0.153 0.253
1㎍/ml 0.186 0.323
Cit 1 mg/ml 0.156 0.125
100㎍/ml 0.120 0.225
10㎍/ml 0.179 0.305
1㎍/ml 0.184 0.332
Spe 1 mg/ml 0.179 0.112
100㎍/ml 0.154 0.351
10㎍/ml 0.150 0.328
1㎍/ml 0.140 0.297
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이다. )
프로타민은 유전자의 입체 구조를 지지하는 단백질이고, 대표적인 알칼리성 아미노산인 아르기닌 함량이 극단적으로 높다(20~70%).
Arg, Cit 및 Spe 모두는 항산화능이 인정되고 Cit 및 Spe는 고농도(1mg/ml)의 경우, 그 항산화능은 특히 높았다.
데이터는 나타내고 있지 않으나 일반적으로, 산성 아미노산은 산화 유도, 알칼리성 아미노산은 산화 예방의 경향을 갖는 것이 본 발명에서 확인되었다.
실시예 6
요산의 각종 농도의 용액(용해액：증류수＋0.025%FBS)을 준비하고, 2개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 주입하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 한개의 플레이트는 그대로 실온으로 90분간 방치하며, 한개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254 nm, 860μW/㎠)을 90분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해, 상기 용해액에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 표 6에 나타내었다.
피검물질 농도 90분간 방치 90분간 UV조사
용해액 0.218 1.007
요산 10g/ml 0.147 15.619
1㎍/ml 0.175 2.369
0.1㎍/ml 0.193 0.966
0.01㎍/ml 0.176 1.064
(표중, 각 측정값은 2회의 측정값의 평균치이다. )
요산은 생체내의 대표적인 항산화물질이라고 알려져 있다. 그러나, 상기 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 생체내의 실제의 혈장 농도(40~80g/ml)에 대해서는 강한 산화적 환경이 아니면 8 OHdG의 유도를 억제 할 수 있으나, 자외선 공존의 경우에는 DNA 산화 손상의 정도는 높고, 그 독성이 증강된다.
실시예 7
브롬산칼륨(KBrO3)을 각종 농도의 용액으로 준비하고, 2개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 180㎕씩 주입하였다. 다음에 200㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 한개의 플레이트를 그대로 실온으로 15분간 방치하고, 다른 한개의 플레이트를 60분간 방치하였다. 방치 종료 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해, 초순수한 물에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 표 7에 나타내었다.
피검물질 농도 15분간 방치 60분간 방치
초순수한 물 0.155 0.289
KBrO3 10 mg/ml 2.851 2.626
1 mg/ml 0.511 0.563
0.1 mg/ml 0.159 0.131
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이다. )
브롬산칼륨은 빵의 표백제나 방부제로 범용되고 있는 식품첨가물이지만, 위의 결과로부터, 농도에 의존한 8 OHdG의 유도가 보여진다. 15분 방치와 60분 방치와에 큰 차이가 없는 것으로부터, 브롬산칼륨에 의한 산화 반응은 신속하게 일어난 후에, 일정화하는 것으로 생각된다. 종래의 평가 시험에서는 안전하다고 알려져 있는 브롬산칼륨도 본 발명의 방법에서는 독성이 있는 것으로 시사된다. 이와 같이, 일상적으로 경구 섭취하고 있는 각종 식품첨가물의 허용 농도를 본 발명에 따라 재검토할 수 있다.
실시예 8
1mM 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA) 용액, 10% 글리세롤(Gly) 용액, 1% 또는 2.5% 메탄올(Meth) 용액, 10% Gly와 2.5% Meth와의 혼합 용액, 및 10% Gly와 2.5% Meth와 1mM　EDTA와의 혼합 용액을 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 170㎕씩 주입하였다. 다음에 400㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 10㎕ 및 50mg/ml의 브롬산칼륨(KBrO3) 용액 20㎕를 각 웰에 첨가하고, 그대로 실온으로 30분간 방치하였다. 그 후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 비교를 위해, 초순수한 물에만 같은 처리를 하여 dG 및 8 OHdG를 측정하였다. 결과를 표 8에 나타낸다.
피검물질 30분간 방치
초순수한 물 2.699
1mM EDTA 0.784
10% Gly 1.123
1% Meth 2.059
2.5% Meth 1.685
10% Gly + 2.5% Meth 0.954
10% Gly + 2.5% Meth + 1mM EDTA 0.699
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이다.)
활성 산소 발생제로 작용하는 브롬산칼륨의 존재하에서, 10% Gly와 2.5% Meth와 1mM　EDTA와의 혼합 용액이 가장 높은 항산화능을 나타내었다. 이로부터, 이들 3종의 성분으로 이루어진 용액이 각종 피검용액이나 피검 시료의 항산화 보존액으로서 유효함을 알았다.
실시예 9
피검물질로서 초순수한 물 및 소정 농도의 비타민 C(VC), 비타민 E(VE) 및 글루코오스(Glu) 170㎕를 2개의 99웰 플라스틱 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 첨가액으로서 초순수한 물 또는 소정 농도의 비스페놀 A(BPA) 20㎕를 각 웰에 주입하였다. 다음에 400㎍/ml의 dG(초순수한 물에 용해) 10㎕를 각 웰에 첨가하고, 한개의 플레이트는 그대로 실온으로 90분간 방치하고, 다른 한개의 플레이트는 자외선 조사상 중에서 자외선(254nm, 860μW/㎠)을 90분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료후, 각 웰의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 결과를 표 9에 나타내었다.
피검물질(농도) 첨가액(농도) 90분간 방치 90분간 UV조사
초순수한 물 초순수한 물 0.21 0.64
BPA (50 ppm) 0.22 11.58
BPA (5 ppm) 0.31 6.19
BPA (0.5 ppm) 0.19 2.09
VC (0.001 %) 초순수한 물 16.3 5.75
VC (0.001 %) BPA (50 ppm) 1.51 12.53
VC (0.0001 %) BPA (50 ppm) nd 15.95
VC (0.00001 %) BPA (50 ppm) nd 14.96
VE (0.001 %) 초순수한 물 0.18 0.28
VE (0.001 %) BPA (50 ppm) 0.29 3.79
VE (0.0001 %) BPA (50 ppm) nd 8.27
VE (0.00001 %) BPA (50 ppm) nd 15.43
Glu (1 mg/ml) 초순수한 물 0.16 0.40
Glu (1 mg/ml) BPA (50 ppm) 0.24 4.46
Glu (0.1 mg/ml) BPA (50 ppm) nd 7.52
Glu (0.01 mg/ml) BPA (50 ppm) nd 14.93
(표중, 각 측정값은 2회 측정값의 평균치이고, 「nd」는 측정하지 않은 것을 의미한다.)
상기의 결과로부터 이하의 결론을 유도할 수 있다.
·BPA 첨가에 의해 자외선 조사시의 8 OHdG가 농도 의존적으로 증가한다.
·VE 및 Glu는 BPA 첨가와 자외선 조사에 의한 8 OHdG의 증가를 유의하게 억제한다.
·0.001%의 VC는 단독으로는 8 OHdG를 강력하게 유도하지만, BPA의 공존에 의해 그 작용은 없어진다. 그러나, 자외선 조사시 VC는 BPA에 의한 8 OHdG의 유도를 없어지지 않는다.
이상과 같이, BPA의 유전자 산화능은 공존하는 물질에 의해, 여러가지로 영향을 받는다.
따라서, 본 측정법을 이용하여, 유전자의 산화 손상을 유도하는 물질을 분류 가능할 뿐만 아니라, 그 산화 독성을 부정할 수 있는 해당 물질에 특이적인 항산화물질을 분류하고, 한층 더 그러한 항산화능을 정량적으로 평가할 수 있다.
실시예 10
각종의 음료수를 피검물질(피검용액)로서 그 항산화능 또는 산화능을 측정하였다.
농도가 10㎍/ml가 되도록 dG를 각종의 음료수에 용해한 용액 200㎕를 2개의 시험 용기(용액의 표면적 36㎟)에 주입하였다. 한개의 용기는 실온으로 90분간 방치하고, 다른 한개의 용기는 자외선 조사상 중에서 자외선(254nm, 860μW/㎠)을 90분간 조사하였다. 방치 또는 조사 종료 후, 각 용기의 용액을 등량의 20% 글리세롤 용액과 혼화하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다.
시험한 음료수는 이하와 같다.
초순수한 물：비저항 18Meg의 물(밀리포아시스템제), 산화 환원 전위는 360mV.
수도물：후쿠오카현 카스가시의 일반 수도물(1999년 7월에 채취), 산화 환원 전위는 727 mV.
처리수：상기 수도물을 시판의 정수기(활성탄, 강자석 및 세라믹 등에 물을 통과시키는 것으로 정화한다)에 의해 정화한 물, 산화 환원 전위는 518mV.
천연수：오이타현 히타시로부터 채취한 지하수(산성비나 비료 등의 지표의 오염으로부터 격리된 물, 용해된 질소산화물 농도 0.01 ppm 이하), 산화 환원 전위는 280mV.
결과를 표 10에 나타내었다.
피검용액 자외선1 ) 생성 8OHdG2 ) 초순수한 물에 대한 비율3 )
초순수한 물 (-) 0.131 1.00
(+) 1.049 1.00
수도물 (-) 0.342 2.61
(+) 12.561 11.97
처리수 (-) 0.157 1.20
(+) 0.584 0.56
천연수 (-) 0.091 0.69
(+) 0.516 0.49
1)(＋)는 자외선 조사를 수행했을 경우, (－)는 자외선 조사를 수행하지 않고 90분동안 실온에 방치했을 경우.
2) 각 측정값은 2회 측정값의 평균치.
3) 초순수한 물에서의 생성 8 OHdG의 값을 1로 했을 경우의 각 수치의 비율.
상기의 결과로부터 이하의 결론을 유도할 수 있다.
·수도물이 갖는 산화력은 살균·항균의 관점에서 매우 합리적이라고 판단된다.
·정수기로 처리한 물(처리수)은 8 OHdG의 유도를 현저하게 억제하고, 자외선 조사시의 8 OHdG의 유도는 실온 방치에 비해 낮은 값이다.
·천연수는 실온 방치 및 자외선 조사 모두 8 OHdG의 유도를 유의하게 억제하고 있다.
이와 같이, 본 발명에 따르면 물의 환원성(항산화능) 또는 산화능을 정량화하는 것이 가능하다. 이를 이용하여, 음료수와 각종 질병과의 상관(중상도, 병의 경과, 치료 효과, 예방 효과 등)을 검토할 수가 있고, 미지의 물질을 포함한 수용액의 유전자 손상 유도 작용을 종합 평가할 수도 있다.
실시예 11
건강한 사람으로부터 채취한 수시뇨를 실시예 8에 나타낸 10% Gly와 2.5% Meth와 1mM　EDTA와의 혼합 용액으로 이루어진 항산화 보존액과 용량비 1：1으로 혼화하고, 신속하게 냉동(약 -20℃) 보존하였다. 시험 직전에 상기 혼화액을 해동하고, 분자량 50kD 차단 기능을 갖는 투석막을 사용한 마이크로다이아리시스 처리에 의해 관류(1㎕/분)하였다. 이에 의해 추출된 저분자의 DNA 관련 성분(회수율은 약 30~40%)에 대해서, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 상기 정량과 더불어, 같은 피검시료 중에 포함된 질산 이온(NO3 －)을 고감도 질소산화물 검출기(ENO－10, 에이콤 사제)로 정량하였다.
결과를 도 2의 그래프에 나타내었다. 상기 그래프에 있어서 X축은 검출한 NO3 －농도(mol/l)와 dG농도(ng/ml)의 비(NO3 －／dG)이고, Y축은 검출된 8 OHdG 농도(pg/ml)와 dG농도(ng/ml)의 비(8 OHdG/dG)의 대수값이다. 또한, 뇨 중의 dG농도는 뇨의 농축율과 상관하므로, NO3 －및 8 OHdG의 각 농도값을 dG농도의 값으로 나누어 뇨의 농축율의 차이에 기인하는 데이터의 오차를 배제할 수가 있다. 게다가 유전자의 산화 손상의 리스크(Y축)를 산화형(8 OHdG)/환원형(dG)으로 나타내어 보다 합리적인 지표로 할 수 있다. 참고로 하기 표 11에 상기와 같은 측정 장치로 검출된 생체 시료 중의 대략의 8 OHdG 농도 및 dG농도를 나타내었다.
생체 시료 8 OHdG 농도 dG농도
인뇨 10-5000 pg/ml 50-2000 ng/ml
인혈장 1-50 pg/ml 5-25 ng/ml
사람골수액 2-15 pg/ml 50-200 ng/ml
마우스뇌조직 20-50 pg/g 200-1000 ng/g
마우스 정소 조직 50-100 pg/g 2000-5000 ng/g
도 2에 나타낸 결과로부터, 8 OHdG/dG의 대수값과 NO3 －／dG비가 정의 상관(p＜0.05)을 나타냄을 알 수 있다. 이는 8 OHdG/dG의 대수값이 생체에서 세균이 고분자물질을 생합성하는 대표적인 산화물인 초산 이온 농도와 정의 상관 관계에 있는 것을 의미하고, 8 OHdG/dG의 대수값이 생체의 산화 스트레스의 지표가 될 수 있음을 나타내고 있다.
또, 데이터는 나타내지 않았으나, 지금까지의 연구로부터 하기와 같은 것이 판명되었다.
·진행암의 환자나 선천성 유전자 이상의 환자에서는 8 OHdG/dG의 값이 정상인으로 플롯되는 근사선에서 위쪽으로 변위하고 있다(NO3 －／dG비로 나타내지는 개체 전체의 산화 지표보다 유전자의 산화 손상을 보다 강하게 반영하고 있다고 추측되는 8 OHdG/dG비 쪽이 비교적 높은 값을 나타낸다.).
·흡연자에서는 8 OHdG/dG비, NO3 －／dG비가 모두 높은 값을 나타내는 경향이 있다.
·동일인이라도, 비일상적인 상태(예를 들면, 숙취, 감기, 과잉 운동 후 등)에서는 8 OHdG/dG비, NO3 －／dG비의 값이 오른쪽 위쪽에 위치한다.
이상의 결과로부터, 이하의 결론을 유도할 수 있다.
·8OHdG/dG 값은 유력한 생체 산화의 지표가 될 수 있다.
·피검사자의 일상생활(식사, 운동, 휴양 등) 등에 의해, 8 OHdG/dG 값은 변화하고, 심리 사회적 인자를 포함하는 넓은 의미에서 스트레스 지표가 될 수 있다.
·정기적으로 생체에 섭취되는 천연 및 인공 화학물질이나 식품류가 이들의 지표에 미치는 영향을 정량하여, 상기 천연 및 인공 화학물질이나 식품류의 유해성(발암성, 최기형성, 생식 독성 등)이나 유익성(생체 산화나 유전자 핵산 산화 손상이 원인이 되는 각종 질환의 치료나 예방 효과, 피로 회복 효과, 노화 방지 효과 등)을 합리적으로 평가할 수 있다.
·8 OHdG의 측정 한계는 0.5pg/ml(시료량 50㎕)이고, 종래의 EIA법에서 측정 한계 1ng/ml를 크게 능가하고 있다. 또, dG의 측정 한계는 0.2ng/ml(시료량 50㎕)이었다.
실시예 12
수도물, 알칼리 이온수 및 심층해염미네랄수에 대해서, 이하의 3개의 실험을 실시하여 유익성에 대해 평가하였다.
실험 1　질소산화물의 정량
질산성 질소 및 아질산성 질소의 함유량을 측정하기 위해, 상기 3종의 시료중의 질소산화물을 정량하였다. 질소산화물의 높은 함유량은 유출한 비료 성분, 분뇨, 하수 등으로 과거에 강한 오염을 지시하고, 이는 수질 기준에서 10ppm 이하로 정해져 있다. 또한, 유아(6개월 미만)가 질소산화물을 고농도로 포함한 물을 섭취하면, 메트헤모그로빈혈증(methemoglobinemia)을 일으켜 호흡 작용이 저해되는 것도 알려져 있다.
측정은 NO3와 NO2를 미량의 샘플량으로 동시에 검출하는 고감도 질소산화물 분석기(에이콤 사제, ENO－10)를 사용하고, 환원 컬럼으로 NO3와 NO2를 분리한 후, 디아조 커플링 반응(diazo coupling reaction)에 의한 정색을 흡광도 540nm로 검출하였다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
NO2 - NO3 -
에어리어(mVs) 농도(ppm) 에어리어(mVs) 농도(ppm)
수도물 1.55 0.0016 3097.88 7.4009
알칼리 이온수 3.46 0.0036 2525.77 6.0341
심층해염미네랄수 4.87 0.0050 3265.38 7.8011
실험의 결과, 어느 시료도 수도물로서의 수질 기준 범위내에 있었다.
실험 2　산화 환원 전위의 측정
상기 3종의 시료에 대해서 산화 환원 전위의 측정을 실시했다. 또한, 대조로서 초순수한 물에 대해서도 실험을 실시했다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
ORP(mV)
초순수한 물 274.6
수도물 695.2
알칼리 이온수 -112.4
심층해염미네랄수 120.5
항산화능은 알칼리 이온수＞심층해염미네랄수＞수도물의 순서로 높았다.
실험 3　유전자 산화 손상 유도 시험
상기 3종의 시료에 대해서, 유전자의 산화적 손상을 유도하는 능력을 측정했다. 상기 측정에 대해서는 기존 농도의 dG 용액을 넣은 유리관에 각 시료를 각각 첨가하고, 자외선을 일정시간(0(=직후), 0. 5, 1 및 2시간) 조사하고, dG를 산화시켰다. 그 후, 반응 정지액으로 반응을 정지시켜, 고속 액체 크로마그래피로 dG와 그 산화물인 8 OHdG를 분리하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 정량하였다. 또한, 대조로서 초순수한 물에 대해서도 실험을 실시했다.
결과를 하기 표에 나타내었다.
초순수한 물
시간(hr) 8OHdG(mVs) dG(mVs) 8OHdG/dG×104
0 0.2534 1113.75 2.28
0.5 0.4563 1151.98 3.96
1 2.2136 1157.67 19.12
2 5.5788 1203.49 46.36
수도물
시간(hr) 8OHdG(mVs) dG(mVs) 8OHdG/dG×104
0 1.8889 1101.03 17.16
0.5 3.8958 1127.45 34.55
1 3.8858 1145.67 33.92
2 2.0812 1201.46 17.32
알칼리 이온수
시간(hr) 8OHdG(mVs) dG(mVs) 8OHdG/dG×104
0 0.1051 1107.94 0.95
0.5 0.7522 1114.67 6.75
1 0.9715 1120.04 8.67
2 1.5257 1161.09 13.14
심층해염미네랄수
시간(hr) 8OHdG(mVs) dG(mVs) 8OHdG/dG×104
0 0.1302 1078.80 1.21
0.5 0.5631 1117.39 5.04
1 0.5103 1125.07 4.54
2 0.9984 1157.90 8.62
결과로 하기의 결론이 유도된다. 또한, 8 OHdG/dG비의 값이 커질수록, 유전자의 산화 손상 작용은 강하다.
·수도물의 유전자 산화 손상 작용은 0.5시간에서 가장 강하고, 그 후 감소 경향을 나타낸다.
·초순수한 물과 비교하여, 알칼리 이온수 및 심층해염미네랄수는 모두 유전자의 산화 손상 작용이 낮았다.
·산화 손상 작용을 억제하는 힘(항산화력)을 비교하면, 심층해염미네랄수＞알칼리 이온수의 순서이었다.
이상과 같이, 본 발명의 생물학적 평가법에 따르면 조성을 명확하게 결정할 수가 없는 수도물, 알칼리 이온수, 심층해염미네랄 물 등에 대해서도 그 유익성을 평가할 수 있다.
실시예 13
이하의 시료에 대해 실시예 12와 같은 3종의 실험을 실시하고, 그 독성에 대해 평가하였다.
시료 A：소주 폐수 원액
시료 B：시료 A의 전기 분해 처리수
실험 1　질소산화물의 정량
실시예 12와 동일하게 하여 시료 A 및 B 중의 질소산화물을 정량하였다.
결과를 하기에 나타내었다.
에어리어(mVs) 농도(ppm)
NO2 - NO3 - NO2 - NO3 -
시료 A 10배 희석 0.80 614.32 0.0008 0.98
시료 B 10배 희석 31.78 13575.81 0.0319 21.60
시료 A NO2 －　0.008ppm＋ NO3 －　9.8ppm= NOx　9.808ppm
시료 B NO2 －　0.319ppm＋ NO3 －　216.0ppm= NOx　216.319ppm
결과에 의해 이하가 확인되었다.
·수도법 기준에서 질소산화물 농도의 상한은 10ppm로 정의되고 있으나, 시료 A는 기준의 상한에 가까운 질소산화물(9.8 ppm)을 포함하고 있었다.
·시료 B는 수도법의 상한의 20배 이상의 질소산화물(216.3ppm)을 포함하고 있었다.
실험 2　산화 환원 전위의 측정
시료 A에 대해서는 원액을 그대로, 시료 B에 대해서는 NO3 －농도를 10ppm으로 희석한 것을 이용해 산화 환원 전위(은염화은 전극)를 측정하였다.
측정의 결과, 시료 A의 산화 환원 전위는 184.8mV이고, 시료 B는 715.4 mV이었다.
실험 3　유전자 산화 손상 시험
dG 용액(200㎍/ml) 10㎕에 각 시료 90㎕를 첨가하여 5분간 교반했다. 그 후, 반응 정지액을 100㎕ 더하여 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 동시에 측정했다.
결과를 이하에 나타내었다.
dG 200㎍/mL 8OHdG/dG×105
dG(mVs) 8OHdG(mVs)
초순수한 물 1128.40 0.0163 1.445
시료 A 100배 희석 1104.00 0.0015 0.136
시료 A 1000배 희석 1098.00 0.0085 0.774
시료 B 100배 희석 109.52 2.7460 2507.300
시료 B 1000배 희석 971.34 5.8810 605.450
상기 결과로부터 하기와 같은 결과를 유도할 수 있다.
·시료 A의 유전자 산화 손상 유도성은 높지 않고, 시료 A중에서 미생물이 번식할 수 있음을 증명한다.
·시료 B는 dG 그 자체를 분해하는 강한 독성을 가지고, 1000배 희석했을 경우에도, 그 독성을 중화할 수 없다.
이상과 같이, 본 발명의 생물학적 평가법에서는 소주 폐수 및 전해 처리제의 소주 폐수에 대해서 그 독성을 평가할 수 있다.
실시예 14
실시예 13의 시료 B에 대해서 이하에 나타낸 것 같은 촉매를 더하여 처리를 수행하고, 질소산화물의 함유량 및 유전자 산화 손상 유도성의 변화를 조사하였다.
처리 조건：
① 시료 B+자철광(2g)+TiO2(0.5mg)
② 시료 B+자철광(2g)+C(0.5mg)
③ 시료B+(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)
④ 시료 B+자철광(2g)+TiO2(0.5mg)+자석
⑤ 시료 B+자철광(2g)+C(0.5mg)+자석
⑥ 시료 B+자철광(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)+자석
⑦ 시료 B+자철광(2g)+TiO2(0.5mg)+자석+US(42KHz, 300W)
⑧ 시료 B+자철광(2g)+C(0.5mg)+자석+US(42KHz, 300W)
⑨ 시료 B+자철광(2g)+TiO2(0.5mg)+C(0.5mg)+자석+US(42KHz, 300W)
*TiO2：이산화 티탄, C：활성탄, US：초음파
이상의 각 촉매를 넣은 갈색 병에, 시료 B 30ml를 첨가하고, 상온에서 15분간 방치했다. 그 후, 초음파를 적용하는 경우에는 30분간 초음파에 폭로했다.
실험 1　질소산화물의 정량
상기한 바와 같이 처리한 액을 20배로 희석하고, 실시예 12와 동일하게, 질소산화물의 정량을 실시했다.
결과를 이하에 나타내었다.
자철광 TiO2 C 자석 US NO3 에어리어(mVs) NO3 농도(ppm)
시료 B 4338 189
처리① ＋ ＋ 4217 183
처리② ＋ ＋ 4128 179
처리③ ＋ ＋ ＋ 4003 174
처리④ ＋ ＋ ＋ 3885 169
처리⑤ ＋ ＋ ＋ 3895 169
처리⑥ ＋ ＋ ＋ ＋ 3670 159
처리⑦ ＋ ＋ ＋ ＋ 3962 172
처리⑧ ＋ ＋ ＋ ＋ 3905 170
처리⑨ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 4155 181
결과로부터, 이하의 결론을 유도할 수 있다.
·NO3의 농도는 처리 조건 ①~⑨의 어느 하나에서도 시료 B의 전해 처리액에 비해 감소했다.
·TiO2와 활성탄은 단독으로 사용하는 것이 아니라 혼합해 사용하는 것으로, NO3의 감소 효율이 좋아졌다.
·자석을 더하여 NO3의 감소 효과를 한층 더 상승시켰다.
·초음파를 적용하여, NO3는 오히려 증가 경향을 나타내었다. 이는 초음파의 적용에 의해, 산화 반응을 포함한 여러가지 화학반응이 일어나고 있기 때문이라고 추측된다.
·조건⑥은 NO3의 감소 효율이 가장 높고, 시료 B에 비해 약 16%의 NO3가 감소했다(189ppm →159ppm).
·촉매량 등의 조건을 검토하여 한층 더 NO3의 감소 효율을 상승시키는 것이 가능할 것으로 생각된다.
실험 2　유전자 산화 손상 시험
시료 B 및 시료 B에 처리⑨를 실시한 용액에 대해서, 유전자 산화 손상 시험을 실시하여 유전자 산화 손상 유도성의 변화를 관찰하였다.
*상기 시험에서, 시료 90㎕에 dG(200㎍/ml) 10㎕를 첨가하여, 5분간 교반했다. 그 후, 반응 정지액 100㎕을 첨가하여 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 동시에 측정하였다.
촉매 처리를 2일간 수행한 경우 및 촉매 처리를 1개월 수행한 경우의 각각 결과를 하기에 나타내었다.
［촉매 처리 2일간］
dG 200㎍/mL
dG(mVs) 8OHdG(mVs)
초순수한 물 1054 0.010
시료 B　원액 0.29 nd
시료 B　10배 희석 nd 32.820
시료 B　100배 희석 14.28 nd
시료 B　1000배 희석 1008 2.045
시료 B　10000배 희석 1108 nd
시료 B의 촉매⑨　원액 2.82 nd
시료 B의 촉매⑨　10배 희석 946 0.135
시료 B의 촉매⑨　100배 희석 1135 0.060
시료 B의 촉매⑨　1000배 희석 1112 0.053
［촉매 처리 1개월］
dG 200㎍/mL
dG(mVs) 8OHdG(mVs)
초순수한 물 1101.67 1.97
시료 B의 촉매⑨　원액 1040.27 4.94
시료 B의 촉매⑨　10배 희석 1138.57 4.09
시료 B의 촉매⑨　100배 희석 1094.50 5.89
시료 B의 촉매⑨　1000배 희석 1087.78 2.70
결과를 이하에 나타내었다.
·시료 B는 dG 자체를 분해하고, 그 독성을 중화 하기 위해 적어도 10000배 이상의 희석을 필요로 한다.
·시료 B를 처리⑨에 따라 처리한 용액은 10배 이상 희석하여 독성이 격감했다. 따라서, 처리⑨의 처리는 전해 처리수의 생물 독성을 해독할 수 있을 가능성이 높다.
·처리⑨에 따른 처리를 1개월 계속하여 용액의 독성은 격감했다. 따라서, 처리⑨에 따른 처리는 시간과 함께 진행하는 것을 확인했다.
이상과 같이, 본 발명의 생물학적 평가법은 여러가지 방법에 의해 처리한 용액의 독성에 대해서 평가함으로써 최적의 처리법을 결정하기 위해 도움이 될 수 있다.
실시예 15
이하의 처리를 실시한 각각의 공업 폐수에 대해 질소산화물의 정량 및 유전자 산화 손상 시험을 쌍방으로 실시하여 폐수 처리 결과에 대해 조사했다.
시료 C：공업 폐수를 백금 전극으로 전기 분해 처리한 것
처리 완료시의 COD：350ppm
처리 완료시의 차아염소산 농도：3,013ppm
시료 D：공업 폐수를 백금이리듐 전극으로 전기 분해 처리한 것
처리 완료시의 COD：2,600ppm
처리 완료시의 차아염소산 농도：1,560ppm
실험 1　질소산화물의 정량
시료 C 및 D를 각각 100배에 희석한 후, 실시예 12와 동일하게 하여 시료 A 및 B 중의 질소산화물을 정량하였다.
결과를 이하에 나타내었다.
에어리어(mVs) 농도(ppm)
NO2 - NO3 - NO2 - NO3 -
시료 C 100배 희석 1.99 2158.65 0.00216 2.6269
시료 D 100배 희석 20.65 3707.87 0.02245 4.5122
실험 2　유전자 산화 손상 시험
시료 C 및 D에 대해 유전자 산화 손상 시험을 실시하여 유전자 산화 손상 유도성의 변화를 관찰하였다.
상기 시험에서는, 각 시료 90㎕에 dG(200㎍/ml) 10㎕를 첨가하고, 5분간 교반했다. 그 후, 반응 정지액 100㎕을 더하고, 실시예 1과 동일하게 dG 및 8 OHdG를 동시 측정했다.
결과를 이하에 나타내었다.
dG 200㎍/mL 8OHdG 100ng/mL(mVs)
dG(mVs) 8OHdG(mVs)
초순수한 물 1114.2 0.16 9.72
시료 C 원액 0.35 0.02 nd
시료 C 10배 희석 0.04 0.72 4.88
시료 C 100배 희석 687.3 2.19 0.04
시료 C 1000배 희석 1149.8 2.01 0.42
시료 C 10000배 희석 1095.7 2.88 8.81
시료 C 100000배 희석 1116.3 3.67 8.83
시료 D 원액 1085.5 4.90 9.21
시료 D 10배 희석 1096.1 4.36 6.70
시료 D 100배 희석 1078.1 4.60 8.50
시료 D 1000배 희석 1094.5 3.72 9.42
시료 D 10000배 희석 1081.4 3.94 9.74
시료 D 100000배 희석 1076.1 2.98 9.00
상기 결과로부터 이하의 결론이 유도되었다.
시료 C의 원액은 매우 강한 독성이 있다. 그 독성을 중화하기 위해서는 10000배 이상의 희석을 필요로 한다.
시료 D의 독성은 거의 소실하고 있었다. 처리 조건의 변경이 시료 C와의 현저한 차이를 일으켰다고 생각된다.
이상과 같이, 본 발명의 생물학적 평가법에서는 처리 후의 용액을 시험하여 이용한 처리법의 유용성을 평가할 수 있다.
실시예 16
유아의 밀크 영양과 뇨 중의 8 OHdG 배설량과의 상관에 대해서 이하의 순서로 시험했다.
먼저, 생후 1~3개월의 유아를 대상으로 하여 모유 주체(n=6), 분유 주체(n=8), 혼합 영양(n=6)으로 분류했다. 이들의 유아로부터 수시로 채취한 뇨를 동결 보존하고, 8 OHdG 농도를 단일 클론 항체를 사용한 8 OHdG 효소 면역 항체(EIA) 측정 키트(일본 유지 사제, 측정 감도＞1ng/ml)를 사용하여 측정하였다. 게다가, 동일한 동결 시료 100㎕를 해동한 후, 40% 글리세롤, 10% 메탄올 및 2mM　EDTA로 이루어진 항산화 보존액 200㎕를 포함한 보존 튜브에 첨가하고, 피소변 검사와 보존액의 혼합 용액을 조제했다. 그 후, 상기 혼합 용액 중에서, 마이크로다이아리시스시스템(50KD 차단 셀룰로오스막, 막장 10 mm, 에이콤 사제)을 사용해, 1㎕/분 (37℃)의 속도로 환류액(20% 글리세롤 용액)을 흘려, 회수한 환류액을 냉각시켰다. 단, 동일한 조건에서의 8 OHdG 및 dG의 표준액의 회수율(30~40%)은 마이크로다이아리시스의 프로브 마다 사전에 확인했다. 상기 환류액 10㎕를 자동 주입 장치(4℃)를 사용해 실시예 1과 같은 8 OHdG/dG 동시 측정 시스템에 자동 주입하여 측정했다. 또한, 상기 혼합 용액을 100% 메탄올액으로 10배에 희석하고, 원심분리에 의해 단백질 성분을 침전시키고, 맑아진 액 중의 질산 이온 농도를 고감도 질소산화물 측정기(ENO－10, 에이콤 사제)를 사용해 측정했다.
얻어진 결과를 도 3~5에 나타내었다.
도 3에 의해 하기와 같은 것이 밝혀진다.
·ECD법과 EIA법과의 사이에는, 상관계수 R2=0.767의 정의 상관을 볼 수 있었다.
·이번 결과에서는, ECD에서의 측정값이 EIA의 측정값보다 상대적으로 높았다. 이는 검체 채취로부터 보존액 첨가까지 수개월의 시간 차이가 있어, 이것이 검체의 자연 산화를 유도한 가능성이 높다.
또한, 도 4에 의해 하기와 같은 것이 밝혀진다.
8 OHdG와 NO3 －농도와의 사이에는, 상관계수 R2=0.627의 정의 상관을 볼 수 있었다.
일반적으로 뇨 중의 NO3 －농도는 생체의 산화 스트레스 지표로 생각되고 있다. 따라서, 8 OHdG와 NO3 －농도가 정의 상관을 나타낸 것으로부터, 8 OHdG 농도가 일반적인 생체 산화 스트레스의 지표로 유용함을 시사한다.
*도 5에 의해 하기와 같은 것이 밝혀진다.
뇨 중의 8 OHdG 배설량은 분유군으로 모유 영양군보다 유의하게 높은 값을 나타내었다. 그러나, dG의 배설량도 동시에 높은 값을 나타내어 8 OHdG/dG비에 대해서는 군 간에 차이가 없었다.
최근, 피험자의 건강 상태를 평가할 때, 뇨 중에의 분비된 8 OHdG의 양에만 주목한 보고를 볼 수 있지만, 이번 결과로부터 뇨 중에 분비된 총핵산량이 섭취하는 영양 조성에 의해 크게 달라, 뇨 중의 분비된 8 OHdG의 양은 dG 분비량(일반적으로 8 OHdG의 약 10배)을 동시에 고려하지 않으면 합리적인 유전자의 산화 손상 지표가 될 수 없음이 확인되었다.
이와 관련에서, 본 발명에 따른 측정장치는 동일한 샘플 중의 8 OHdG와 dG를 항상 동시에 측정할 수가 있어 그 외의 측정법(EIA법이나 LC－MAS법) 보다 큰 장점을 갖는다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 DNA 손상 지표를 이용하는 천연 및 인공 화학물질의 생물학적 평가법은 천연, 인공 화학물질 또는 식품류 등의 피검물질의 생물학적 독성, 유익성 또는 안전성 등을 시험관내에서 매우 간편하고 염가로 평가할 수 있다. 또한, 해당 피검물질의 중요도에 따라 배양 세포 또는 실험동물 등의 생체내에서의 평가를 실시할 수가 있다.
주된 것만으로도 10만종 이상 있다고 알려져 있는 인공 화학물질의 각각에 대해 종래의 본격적인 동물 실험이나 임상 실험을 실시하는 것은 사실상 불가능하 다. 따라서, 개개의 화학물질에 대해 구체적인 DNA 손상 지표를 간편하게 제시할 수 있는 본 발명의 방법은 광범위한 안전기준 농도를 설정하거나 또는, 본격적인 동물 실험이나 임상 실험의 필요성을 검토하는데 있어서 매우 유용한 정보를 제시할 수 있다. 이로부터, 본 발명의 생물학적 평가법은 여러 가지의 천연 또는 인공 화학물질의 생물학적 독성, 식품류의 유해성·유익성 등을 간편하게 스크리닝 하는 수단을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 방법은 시판 또는 개발 중의 건강식품이나 기능성 식품의 유익성이나 유해성을 객관적으로 정량화할 수 있다. 즉, 본 발명에 따라 개발 중의 식품류에는 필수인 유익성, 안전성 등의 평가를 확실하고 간편하게 실시하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 현재 시장에서 판매되고 있는 식품류의 유익성이나 안전성을 재확인하는 것도 가능해진다.
게다가, 시험 물질(피검물질)에 대한 자외선 조사의 영향이나, 활성 산소종 발생제 또는 유전자 산화 손상성 물질과의 공존에 의한 상기 물질에의 영향도, 본 발명에 따라 간편하게 평가할 수 있어 자연계에서의 피검물질의 독성 등을 보다 정확하게 평가하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 방법에서 미지의 물질을 포함한 수용액을 피검용액으로 하여, 상기 수용액의 유전자 손상 유도 작용을 종합 평가할 수 있다. 따라서, 조성이 판명되어 있지 않은 수도물, 천연 물 등에 대한 생물 독성 지표를 정확·간단하고, 용이하게 얻을 수 있다.
본 발명에 의하면 화학물질 또는 식품을 투여한 사람을 포함한 동물 등으로 부터 채취한 뇨나 혈액 등의 생체 세포 유래 산물 중의 8－히드록시-2＇－디옥시구아노신과 2－디옥시구아노신의 함유비로부터, 상기 화학물질 또는 식품의 유해성 또는 유익성을 정확·간단하고 용이하게 평가할 수 있다.
본 발명의 측정 장치에 의한 높은 측정 감도, 및 그 측정 결과의 신뢰성은 생체 시료(특히, 핵산 성분)의 항산화 보존액과 항산화 환경하에서의 단백질 제거 처리(마이크로다이아리시스법의 응용)와 본 발명의 8 OHdG/dG 동시 측정 시스템의 모두가 합쳐졌을 때에 가장 바람직하게 발휘되어, 거의 모든 생체 시료에 대해서 획기적인 DNA 산화 손상 지표의 측정 장치를 제공 할 수 있다. 즉, 전기 화학 검출기로 검출 가능한 핵산 산화물, 예를 들면, 8 OHdG와 동일하게 A：T에서 G：C로의 변환을 일으키는 2 OHdA나, 그 환원형의 dA의 동시 측정도 8 OHdG/dG와 거의 같은 측정 조건으로 검출 가능하다.
본 발명의 측정 장치 중에 이용되는 마이크로다이아리시스 처리는 액상 시료나 세포 함유 시료의 어느 것에도 대응할 수 있다. 또한, 단백질 제거 처리에 산, 알칼리 및 효소 반응을 이용하지 않고, 전체 조작을 저온하에서 실시할 수 있기 때문에, 검사대상 물체의 열화가 적고, DNA 관련물의 추출 효율은 투석막으로부터의 회수율에 의존하기 때문에, 관류조건을 일정화하는 것으로 오차를 감소시킬 수 있는 이점도 있다. 게다가 관류액을 보존액과 동일하게 사용하면, 관류 후의 검사대상 물체의 장기 보존도 가능하다.
본 발명의 8 OHdG/dG 동시 측정 방법에서는 동일 시료로 비산화형과 산화형의 뉴클레오티드를 동시에 정량할 수 있고, 양자를 비율로서 데이터 처리하여 검사 대상 물체 주입량 등의 오차 요인을 배제 또는 경감할 수 있다. 또한, 1회의 주입 시료량이 10~100㎕의 극소량에서 측정 가능하고, 컬럼에 주된 주입액이 투석막 관류액이기 때문에, 측정 노이즈가 작아 종래와 비교해 고감도를 기대할 수 있으며, 컬럼의 사용 연수가 길고, 측정 시료가 저온으로 안정되어 있어 항온 냉각 장치가 장착된 오토 인젝터(injector) 장치와 연결하는 것으로써 시스템의 힘을 덜어주는 것이 가능해지기 때문에 운용의 경제성이 각 단계에서 향상된다.
본 발명의 항산화 보존액은 채취 직후부터 산화 경향이 있는 생체 시료에 대해 산화물 농도가 한층 더 높아질 우려가 있는 종래의 단순한 동결 또는 냉장 보존과는 다르게 보존 중의 산화를 실질적으로 억제할 수 있다. 특히, 핵산 유래의 뉴클레오티드 및 그 산화물의 농도 변동이 최소화 되도록 조정하고 있기 때문에, DNA 산화 손상 지표의 측정용 검사대상 물체의 보존에 최적이다. 게다가, 상기 항산화 보존액은 조성이 비교적 단순하기 때문에 염가이고, 내용 성분도 안정되어 장기 보존이 가능하다.

Claims (1)

  1. 0.5~2mM/l의 EDTA, 2~5중량%의 메탄올 및 10~40중량%의 글리세린을 포함한 수용액으로 이루어진 것을 특징으로 하는 생체 시료의 항산화 보존액.
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