KR20070047251A - Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 항체 및 관련 분자 - Google Patents

Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 항체 및 관련 분자 Download PDF

Info

Publication number
KR20070047251A
KR20070047251A KR1020067027763A KR20067027763A KR20070047251A KR 20070047251 A KR20070047251 A KR 20070047251A KR 1020067027763 A KR1020067027763 A KR 1020067027763A KR 20067027763 A KR20067027763 A KR 20067027763A KR 20070047251 A KR20070047251 A KR 20070047251A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
psca
antibody
protein
cancer
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020067027763A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101215611B1 (ko
Inventor
진 구다스
아야 쟈코보비츠
시아오-치 지아
로버트 켄달 모리슨
카렌 제인 메이릭 모리슨
후이 샤오
피아 엠. 챨리타-에이드
아서 비. 라이타노
Original Assignee
어젠시스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2004/017231 external-priority patent/WO2005014780A2/en
Priority claimed from PCT/US2005/017412 external-priority patent/WO2005118864A2/en
Application filed by 어젠시스 인코포레이티드 filed Critical 어젠시스 인코포레이티드
Publication of KR20070047251A publication Critical patent/KR20070047251A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101215611B1 publication Critical patent/KR101215611B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

신규한 PSCA 단백질에 결합하는 항체 및 그로부터 유래하는 분자, 및 이들의 변이체가 설명되며 여기서 PSCA는 정상적인 성인 조직에서 조직 특이적으로 발현하며 표 I에 제시된 암에서는 비정상적으로 발현된다. 결과적으로, PSCA는 암의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료적 표적을 제공해준다. PSCA 유전자 또는 그의 단편, 또는 그가 코딩하는 단백질 또는 그의 변이체, 또는 그의 단편은 체액성 또는 세포성 면역 반응을 도출하는데 이용될 수 있고; PSCA와 반응하는 항체 또는 T 세포들은 능동 면역 또는 수동 면역에서 사용될 수 있다.
PSCA, 종양, 암

Description

ＰＳＣＡ 단백질에 결합하는 항체 및 관련 분자{ANTIBODIES AND RELATED MOLECULES THAT BIND TO PSCA PROTEINS}
관련 출원
[0001] 본 특허 출원은 2003년 5월 30일 출원된 미국 가특허출원 제60/475,064호의 우선권 주장 출원인 2004년 5월 28일자 미국 가특허출원 제10/857,484호와 관련되어 있다; 본 출원은 2004년 10월 5일자 미국 가특허출원 제60/616,381호; 2004년 10월 12일자 미국 가특허출원 제60/617,881호; 2004년 10월 21일자 미국 가특허출원 제60/621,310호; 2004년 12월 2일자 미국 가특허출원 제 60/633,077호; 및 2005년 4월 14일자 미국 가특허출원 (출원번호 미발부)와 관련되어 있다. 본 출원은 2004년 5월 28일자 PCT 특허출원 제PCT/US2004/017231호와 관련되어 있다. 이 문단에 열거된 각각의 출원발명의 내용은 그 내용 전체가 본 발명에 참조된다.
연방 후원 하에 진행된 발명에 대한 권리 진술
[0002] 해당 없음
기술 분야
[0003] 본 발명은 PSCA라 명명된 단백질에 결합하는 항체, 그의 결합 단편 및 그로부터 조작된 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 PSCA를 발현하는 암을 다 루는데 유용한 진단, 예지, 예방 및 치료 방법 및 이를 치료하는데 유용한 조성물에 관한 것이다.
[0004] 암은 관상 질환에 이어 인류의 두번째 사망 원인이다. 전세계적으로 매년 수백만명이 암으로 죽어가고 있다. 미국 암협회의 보고에 따르면 미국에서만 암으로 인한 사망자가 연간 50만명이 넘고, 매년 120만명이 넘는 사람들이 새롭게 암에 걸린 것으로 진단되고 있다. 심장질환으로 인한 사망율은 크게 줄어들고 있는 반면, 암으로 인한 사망은 일반적으로 증가 추세에 있다. 다음 세기 초반에는, 암이 가장 큰 사망 원인이 될 것으로 예상된다.
[0005] 세계적으로, 몇가지 암이 주요한 사망 원인으로 두드러지고 있다. 특히, 폐, 전립선, 유방, 결장, 췌장 및 난소의 암종은 암으로 인한 사망의 주요 원인이 되고 있다. 이러한 암종과 그 밖의 실질적인 모든 암종은 공통적으로 치명적인 특성을 공유한다. 극히 적은 예외를 제외하고는, 암종으로 인한 전이성 질환은 치명적이다. 뿐만 아니라, 초기 원발암을 이겨내고 살아남은 암 환자들에 있어서도, 그 환자들의 인생이 극적으로 변화되는 경험을 겪게 된다. 많은 암 환자들은 암의 재발이나 치료 실패 가능성을 자각하기 때문에 이로 인해 극심한 불안을 겪는다. 많은 암 환자들은 치료후 육체적으로 쇠약해진다. 뿐만 아니라, 많은 암 환자들 중 다수가 암의 재발을 경험한다.
[0006] 세계적으로, 전립선암은 남성에게 있어 4번째로 많이 일어나는 암이다. 북미와 북유럽에서는, 남성의 경우 가장 흔한 암이고 남성의 암으로는 두번째 의 사망 원인이 되고 있다. 미국에서만, 연간 30,000명이 넘는 남성들이 이 질환으로 사망하는데, 이는 폐암에 이어 두번째의 사망원인이다. 사망자 수가 이와 같이 엄청남에도 불구하고, 전이성 전립선 암의 효과적인 치료방법은 아직까지 없는 실정이다. 외과적인 절제술, 방사선 요법, 호르몬 절제 요법, 외과적 거세 및 화학 요법이 주요한 치료 기법이 되어 왔다.
[0007] 진단 분야의 최전선에서는, 초기 단계의 국소화된 종양을 정확하게 검출해낼 수 있는 전립선 종양 마커가 부재함으로 해서 이 질환을 진단 및 치료하는데 있어 중대한 걸림돌이 되고 있다. 비록 혈청 전립선 특이 항원 (PSA) 분석법이 매우 유용한 도구로 이용되어 왔지만, 그의 특이성과 일반적 유용성은 몇가지 중요한 관점에서 볼 때 대체적으로 미흡한 것으로 여겨지고 있다.
[0008] 쥐의 질환의 서로 다른 단계를 반복할 수 있는 전립선암 이종이식편의 생산에 의해 전립선암의 부가적인 특이적 마커를 동정하는데 진전을 보았다. LAPC (Los Angeles Prostate Cancer) 이종이식편은 중증혼합면역결핍증 (SCID: severe combined immune deficient) 마우스에서 대를 이어 생존하고 안드로겐 의존성으로부터 안드로겐 비의존성으로의 전이를 모사하는 능력을 나타낸 바 있는 전립선암 이종이식편이다 (Klein 외, 1997, Nat. Med. 3:402). 보다 최근에 동정된 전립선암 마커로 PCTA-1 (Su 외, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7252), 전립선 특이막 (PSM) 항원 (Pinto 외, Clin Cancer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, 외, Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Dec 7; 96(25): 14523-8) 및 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA) (Reiter 외, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1735)을 들 수 있다.
[0009] PSA, PSM, PCTA 및 PSCA와 같은 이전에 동정된 마커들로 인해 전립선암의 진단과 치료가 수월하여지긴 했지만, 보다 개선된 진단과 치료를 위해서는 전립선암 및 관련암의 부가적인 마커와 치료적 표적의 동정이 요구되고 있다.
[0010] 신장 세포 암종 (RCC)는 성인 암의 약 3%를 차지한다. 일단 선종의 직경이 2 내지 3 cm에 달하게 되면, 악성 종양이 존재할 가능성이 있다. 성인의 경우, 두가지 주요 악성 신장 종양은 신장 세포 선암종 및 신우와 요관의 이행 세포 암종이다. 신장 세포 선암종의 발병률은 1998년도에 미국의 경우 29,000명 이상으로 파악되어, 이 질환으로 인해 11,600명이 넘는 환자들이 사망하였다. 이행 세포 암종은 이보다는 빈도가 적어서 미국에서 연간 약 500명 정도의 발병율을 나타내고 있다.
[0011] 신장 세포 선암종의 경우 지난 수십년간 외과 수술이 주요한 치료법으로 이용되어 왔다. 최근까지도, 전이성 질환은 어떤 전신 요법으로도 난치성이었다. 전신 치료법의 최근 발달과 함께, 특히 면역 치료법에 의해, 전이성 신장 세포 암종의 경우, 반응 내구력 가능성이 있는 적절한 환자에서는 강도 높은 접근 방식을 이용할 수도 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 환자에 있어서 효과적인 치료법에 대한 요구는 여전히 존재한다.
[0012] 미국의 모든 새로운 암의 경우, 방광암은 남성의 경우 약 5 퍼센트 (5번째로 흔한 신생물)이고 여성의 경우는 3 퍼센트 (8번째로 흔한 신생물)이다. 그 발병률은 점차 증가 추세에 있고 고령 인구 집단에서 더 두드러진다. 1998년도 에는 남성 39,500명과 여성 15,000명을 비롯하여 54,500명에서 이 병이 보고되었다. 미국의 경우 연령 상관 발병도를 보면 남성은 100,000명당 32명, 여성은 100,000명당 8명이다. 3/1이라는 시대적인 남성/여성 비율은 여성 흡연 인구의 증가와 함께 앞으로는 감소될 수 있다. 1998년 한해에 11,000명이 방광암으로 사망한 것으로 추산되었다 (남성 7,800명, 여성 3,900명). 방광암의 발병률과 사망률은 나이가 많아질수록 크게 증가하며 고령화 사회가 되어 갈수록 이 문제는 더욱 심각해질 것이다.
[0013] 대부분의 방광암은 방광에서 재발한다. 방광암은 방광의 요도경유절제술 (TUR: transurethral resection)과 방광내 화학요법 또는 면역요법으로 치료되고 있다. 그러나 방광암의 재발 특성과 다병소성으로 인해 TUR의 효용에는 한계가 있다. 대부분의 근육 침투형 암은 TUR 단독으로는 치유되지 않는다. 근치방광절제술과 요로전환술은 이 암을 제거하는 가장 효과적인 수단이지만 비뇨기능과 성기능에 부정할 수 없는 충격을 준다. 따라서 방광암 환자에 이로운 치료 기법이 절실히 요청되고 있다.
[0014] 93,800명의 결장암과 36,400명의 결장암을 포함하여, 2000년도에 미국에서 130,200명의 직장결장암이 발생된 것으로 추산되었다. 직장결장암은 남성과 여성에서 세번재로 흔한 암이다. 발병률은 1992-1996년도에 크게 감소하였다 (연간 -2.1%). 연구 결과 이러한 감소 추세는 검색 및 폴립 제거가 증가하고, 폴립이 침입성 암으로 진행하는 것을 방지한데 기인한 것으로 여겨진다. 2000년도에 이 질환으로 인해 56,300명이 사망한 것으로 추산되는데 (결장암 사망 47,700명, 직장암 사망 8,600명) 이는 미국의 전체 암 사망률의 약 11%를 차지하는 것이다.
[0015] 현재, 외과 수술은 직장결장암의 가장 흔한 치료법이고, 확산되지 않은 암의 경우에는 잘 치유된다. 암이 장벽에 깊숙히 침투되거나 임파절까지 확산된 대다수의 암환자들에게는 외과수술 전 또는 외과수술 후에 화학요법 또는 화학요법 플러스 방사선 요법을 실시한다. 결장암의 경우에는 영구적인 결장절제술 (체내 폐기물 제거를 위해 복부 개구부를 만듦)이 종종 필요하며 직장암에서는 이보다 덜 필요하다. 따라서 결장직장암의 효과적인 진단과 치료 기법에 대한 요구가 여전히 절실하다.
[0016] 2000년도에는 폐암과 기관지암이 164,100건 발생하였는데, 이는 미국 암진단 전체 건수의 14%에 해당한다. 폐암과 기관지암의 발병률은 남성의 경우 1984년 100,000명 당 86.5명으로 최고치를 기록하던 것이 1996년에는 70.0명 꼴로 크게 줄었다. 1990년대에는, 여성에 있어서의 증가율이 둔화되기 시작하였다. 1996년, 여성에 있어서의 이 질환들의 발병률은 100,000명 당 42.3명이었다.
[0017] 폐암과 기관지암으로 인한 사망자는 2000년도에 156,900명으로 추산되며, 이는 전체 암 사망자의 28%에 해당하는 것이다. 1992-1996년 동안, 폐암으로 인한 사망률은 남성의 경우 크게 감소한 반면 (연간 -1.7%) 여성의 경우는 여전히 크게 증가하였다 (연간 0.9%). 1987년 이후, 매년, 보다 많은 여성들이, 지난 40년간 여성의 주요한 암 사망 원인이었던, 유방암보다 폐암으로 더 많이 사망하였다. 폐암 발병률과 사망률의 감소는 지난 30년간 흡연율의 감소로 인한 것이 주원인이지만; 여성의 흡연 형태 감소는 남성보다는 뒤쳐진다. 성인의 흡연율이 감소하고는 있지만, 청소년의 흡연율이 다시 증가하는 것으로 나타나 우려되고 있다.
[0018] 폐암과 기관지암의 치료 옵션은 암의 종류와 진전 상태, 및 외과수술, 방사선요법 및 화학요법에 의해 결정된다. 많은 국소화 암의 경우, 외과 수술이 일반적인 치료방법으로 선택된다. 이 질환은 발견될 무렵엔 대개 퍼져있기 때문에, 방사선요법과 화학요법이 외과수술과 병용될 필요가 종종 있다. 비소세포폐암의 경우 화학요법을 단독으로 또는 방사선요법과 병용하는데; 이 치료법의 경우, 다수의 환자들이 관해를 경험하고, 몇몇 경우에는 관해가 장기간 지속되기도 한다. 그러나, 폐암과 기관지암의 경우에는 지속적이고도 효과적인 치료 및 진단적 접근이 요구된다.
[0019] 2000도에는 미국에서 182,800명의 여성이 새로운 침입성 유방암에 걸릴 것으로 예측되고 있다. 도한, 약 1,400건의 새로운 유방암이 2000년 남성에게서 진단될 것으로 예상되었다. 1980년데 연간 약 4% 증가한 후, 여성의 유방암 발병률은 1990년대 들어 100,000명 당 약 110.6명으로 저하하였다.
[0020] 미국에서만, 유방암으로 2000년에 41,200명 (여성 40,800명, 남성 400명)이 사망한 것으로 추산된다. 유방암은 여성에 있어서 두번째 가는 암 사망원인이다. 가장 최근의 데이터에 따르면, 1992-1996년에는 백인과 흑인의 젊은 여성들에 있어서 이 질환으로 인한 사망률이 크게 저하된 것으로 나타났다. 이러한 사망률 저하는 아마도 조기 발견과 개선된 치료에 따른 듯하다.
[0021] 의료 환경과 환자의 선호도를 고려해서, 유방암의 치료에 종괴절제술 (종양의 국소 제거)과 팔 밑의 임파절 제거; 유방절제술 (유방의 외과수술적 제거) 과 팔 밑의 임파절 제거; 방사선요법; 화학요법 또는 호르몬요법을 이용할 수 있다. 종종, 두가지 이상의 방법이 병용된다. 수많은 연구 결과 이 질환의 조기 단계에서, 종괴절제술 플러스 방사선요법 시술 후의 장기간 생존률은 변형된 방사선 유방절제술 후의 생존율과 유사한 것으로 밝혀졌다. 복구 기술의 지대한 발전에 힘입어 유방절제술 후 유방 복구를 위한 여러가지 옵션이 제공되었다. 최근, 이러한 복구술은 유방절제술과 동시적으로 행해져왔다.
[0022] 인 시투 도관 암종 (DCIS: ductal carcinoma in situ)을 적절한 양의 주변 정상 유방 조직과 함께 국소적으로 절제하면 DCIS의 국소적 재발을 방지할 수 있다. 유방에 방사선을 조사하고/조사하거나 타목시펜을 사용하면 나머지 유방 조직에서 DCSI가 일어날 기회를 감소시킬 수 있다. 이것은, DCIS가 치료되지 않은 채로 방치될 경우 침입성 유방암으로 발전할 수 있기 때문에 중요하다. 그럼에도 불구하고, 이러한 치료법에는 심각한 부작용이나 후유증이 따른다. 따라서, 효과적인 유방암 치료법이 요망되고 있다.
[0023] 2000년에 미국에서 23,100건의 난소암이 새롭게 발병된 것으로 추산되었다. 이는 여성의 모든 암의 4%에 해당하며 부인과 암의 2번째를 차지한다. 1992-1996년 동안 난소암 발병률은 크게 줄었다. 난소암으로 인해, 2000년도에 14,000명이 사망하였다. 난소암은 여성 생식계의 여타 다른 암 중에서도 사망률이 더 높다.
[0024] 난소암 치료 방법으로 외과수술, 방사선요법 및 화학요법을 들 수 있다. 외과수술로는 대개 하나 또는 두개 모두의 난소의 제거, 난관 제거 (난관난소 절제술), 및 자궁 제거 (자궁절제술)를 들 수 있다. 몇가지 매우 초기의 종양의 경우, 특히 임신을 희망하는 젊은 여성의 경우 관련된 난소만을 제거하기도 한다. 질환이 진전된 경우에는, 화학요법의 효과를 증강시키기 위해 모든 복강내 질환을 제거하려는 시도를 행한다. 난소암의 유효한 치료 선택지를 높이는 것 역시 매우 중요하다.
[0025] 미국의 경우 2000년도에 췌장암은 28,300건 발생한 것으로 추산되었다. 과거 20년간, 남성의 췌장암 발병률은 감소 추세에 있다. 여성의 발병률은 거의 일정하게 유지되고 있지만 감소가 시작될 수 있다. 췌장암으로 인한 사망자 수는 2000년도 미국에서 28,200명이었다. 지난 20년간, 남성의 경우 사망률이 약간 그러나 유의적으로 감소한 반면 (연간 -0.9%) 여성의 경우 그 비율은 약간 증가하였다.
[0026] 외과술, 방사선요법 및 화학요법은 췌장암의 치료 방법이 된다. 이러한 치료 옵션은 환자들의 생존률을 증가시키고/증가시키거나 증상을 완화시킬 수 있지만 대부분의 환자를 치료시켜준다고 볼수는 없다. 췌장암의 치료와 진단을 위한 부가적인 선택 방법에 대한 요구가 절실하다. 여기에는 치료종으로서의 항체, 백신 및 소분자들의 사용이 포함된다. 또한, 모든 부류의 암 치료 및 암 연구 분야에서 이들을 진단, 검색, 모니터링하기 위한 연구 도구로서 사용할 필요가 있다.
[0027] 모노클로날 항체 (mAbs) (G. Kohler and C. Milstein, Nature 256:495-497 (1975))의 치료적 유용성이 현실화되고 있다. 모노클로날 항체는 이제 이식, 암, 감염성 질환, 심잘혈관 질환 및 염증 분야에서 치료제로서 인정되고 있 다. 상이한 이소형은 상이한 이펙터 기능을 갖는다. 이러한 기능 차이는 여러가지 임머뉴글로불린 이소형에 대한 독특한 3차원 구조로 반영되었다 (P.M. Alzari et　al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)).
[0028] 마우스는 면역화시키기 쉽고 대부분의 인간 항원을 외래의 것으로 인식하기 때문에, 치료 잠재력이 있는 인간 표적에 대한 mAbs는 대개 마우스에 기원하는 것이 많다. 그러나, 마우스의 mAbs는 인간을 치료하는데 근본적인 단점이 있다. 이들은 인간 체내에서의 반감기가 인간 항체보다 짧기 때문에 보다 자주 투약하여야 한다. 더욱 심각한 것은, 사람의 면역계에 마우스 항체를 반복 투여하면 사람의 면역계가 마우스 단백질을 외래의 것으로 인식하도록 반응하게 되어서 인간의 항마우스 항체 (HAMA: human 항-mouse 항체) 반응이 일어나게 된다. 이러한 HAMA 반응은 알러지 반응을 야기할 수 있고 계로부터 마우스 항체를 신속히 소거시킴으로 해서 마우스 항체에 의한 치료법을 쓸모없이 만들 수 있다. 이러한 영향을 피하기 위하여, 마우스 내에 사람의 면역계를 만들려는 시도가 행해져왔다.
[0029] 초기의 시도는 인간의 서열을 갖는 항체로 항원에 반으할 수 있는 ㅌ트랜스제닉 마우스를 만들려 했으나 (참조: Bruggemann 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)), 이용가능한 클로닝 비히클에 의해 안정적으로 유지될 수 있었던 DNA의 양에 의해 제한되었다. 효소의 인공 염색체 (yeast artificial chromosome:YAC) 클로닝 벡터는 사람의 Ig 로커스의 대형 배선 단편을 트랜스제닉 포유동물 내로 도입할 수 있는 길을 열었다. 기본적으로 인간 게놈 및 인간의 불변부에서 발견되는 동일 간격으로 배열된 사람의 V, D, 및 J 영역 유전자 들의 대다수가 YAC를 이용하여 마우스 내로 도입되었다. 이러한 트랜스제닉 마우스 스트레인 중 한가지는 XenoMouse(r) 마우스로 알려져 있으며 Abgenix, Inc. (Fremont CA)가 시판하고 있다.
발명의 요약
[0030] 본 발명은 PSCA 단백질 및 PSCA 단백질의 폴리펩타이드 단편에 결합하는 항체 및 그의 결합 단편 및 그로부터 조작된 분자들을 제공한다. 본 발명은 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 마우스 및 기타 포유동물의 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 완전한 인간 항체, 및 검출가능한 마커로 표지된 항체 또는 치료제를 포함한다. 특정 구체예에서는, 도 3의 전장 핵산 서열이 코딩되지 않고/않거나 도 2의 전장 아미노산 소열이 준비되지 않는다는 단서가 붙는다. 특정 구체예에서, 도 3의 전장 핵산 서열이 코딩되지 않고/않거나 도 2의 전장 아미노산 서열이 준비되지 않는데, 이들 중 어느 하나는 인간의 해당 투약 단위 제형이다.
[0031] 본 발명은 또한 다양한 생물학적 시료 중의 PSCA 폴리뉴클레오타이드 및 단백질의 존재 여부와 상태의 검출 방법 및 PSCA를 발현하는 세포의 동정 방법도 제공한다. 본 발명의 일 구체예는 암과 같이 비정상적인 성장 형태를 나타내거나 나타내는 것으로 의심되는 조직 또는 혈액 시료에서 PSCA 유전자 산물을 모니터링하는 방법도 제공한다.
[0032] 본 발명은 PSCA 뿐만 아니라 암 백신의 전사, 번역, 기능 프로세싱을 억제하는데 목적을 둔 치료법을 비롯하여, 표 I에 수록된 조직의 암과 같은 PSCA를 발현하는 암을 치료하기 위한 여러가지 면역원성 또는 치료용 조성물 및 전략을 제 공한다. 한가지 측면에서, 본 발명은 인간에 있어서 PSCA를 발현하는 암을 치료하기 위한 조성물 및 치료방법을 제공하며, 여기서 상기 조성물은 PSCA의 기능이나 생산을 억제하는 1종 이상의 제제의 인간용 투약 단위와 인간에 사용하기에 적합한 담체를 포함하여 이루어진다. 바람직하게는, 상기 담체는 인간만을 위한 담체인 것이 좋다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 이러한 제제는 PSCA 단백질과 면역반응성인 부분이다. 이러한 부분의 비제한적인 예로는, 항체 (예컨대 단쇄, 모노클로날, 폴리클로날, 인간화, 키메라 또는 인간 항체), 그의 기능적 등가물 (자연발생적인 것 또는 인공적인 것) 및 이들의 조합물을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 항체는 진단 또는 치료 부분과 접합될 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 제제는 본 명세서에 정의되는 바와 같은 소형분자이다.
섹션별 개요
I.) 정의
II.) PSCA 폴리뉴클레오타이드
II.A.) PSCA 폴리뉴클레오타이드의 용도
II.A.1.) 유전학적 이상 상태의 모니터링
II.A.2.) 안티센스 구체예
II.A.3.) 프라이머 및 프라이머 쌍
II.A.4.) PSCA-코딩 핵산 분자의 분리
II.A.5.) 재조합 핵산 분자 및 숙주-벡터계
III.) PSCA-관련 단백질
III.A.) 모티프-산생 단백질 구체예
III.B.) PSCA-관련 단백질의 발현
III.C.) PSCA-관련 단백질의 변형
III.D.) PSCA-관련 단백질의 용도
IV.) PSCA 항체
V.) PSCA 세포성 면역 반응
VI.) PSCA 트랜스제닉 동물
VII.) PSCA의 검출 방법
VIII.)PSCA-관련 유전자 및 이들의 산물의 모니터링 방법 및 상태
IX.) PSCA와 상호반응하는 분자들의 동정
X.) 치료 방법 및 조성물
X.A.) 항암 백신
X.B.) 항체 기반 치료법에 있어서 표적으로서의 PSCA
X.C.) 세포성 면역 반응에 있어서 표적으로서의 PSCA
X.C.1. 미니유전자 백신
X.C.2. CTL 펩타이드와 헬퍼 펩타이드와의 조합
X.C.3. CTL 펩타이드와 T 세포 프라이밍 제제와의 조합
X.C.4. CTL 및/또는 HTL 펩타이드로 펄스된 DC를 함유하는
백신 조성물
X.D.) 후천성 면역요법
X.E.) 치료적 또는 예방적 목적을 위한 백신 투여
XI.) PSCA의 진단 및 예후적 구체예.
XII.) PSCA 단백질 기능의 억제
XII.A.) 세포내 항체를 이용한 PSCA의 억제
XII.B.) 재조합 단백질을 이용한 PSCA의 억제
XII.C.) PSCA 전사 또는 번역의 억제
XII.D.) 치료적 전략에 대한 일반적 고찰
XIII.) PSCA 모듈레이터의 동정, 특징화 및 용도
XIV.) RNAi 및 소형 간섭 RNA (siRNAs)의 치료적 용도
XV.) 키트/제조용구
I.) 정의:
[0069] 달리 언급하지 않는 한, 본 발명에서 사용된 모든 용어, 주석 및 기타 과학적 용어들은 본 발명이 속한 분야의 당업자들에게 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된 것이다. 몇몇 경우, 명확성 및/또는 수월한 참조성을 위해 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 용어에 관한 정의를 제시하며 이러한 정의가 본 발명이 포함된다 해서 기술 분야에 일반적으로 이해되고 있는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 이해될 필요는 없다. 본 발명에서 설명 또는 참조된 다양한 기술과 방법들은 예컨대 Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 제2판 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y에 설명된 널리 사용되고 있는 분자클로닝 방법학을 통해 익히 알려지고 실시되는 것이다. 적절하다면, 시판되는 키트와 시약의 사용 방법은 달리 언급하지 않는 한 제조자가 정의한 프로토콜 및/또는 변수에 따라 일반적으로 수행한다.
[0070] "진행된 전립선암", "국소적으로 진행된 전립선암", "진행된 질환" 및 "국소적으로 진행된 질환'이라는 용어는 전립선 피막을 통해 뻗어 있는 전립선암을 가리키는 것으로, American Urological Association (AUA) 시스템 하의 C 단계 질환, Whitmore-Jewett 시스템의 C1-C2 단계 질환, 및 TNM (종양, 절, 전이)시스템의 T3 - T4 및 N+ 질환이 여기에 포함된다. 국소적으로 병이 진행된 환자의 경우우, 외과 수술은 일반적으로 권장되지 않으며, 이러한 환자들은 임상적으로 국소화된 (장기-국한된) 전립선암에 걸린 환자들에 비해 덜 긍정적인 결과를 맞게된다. 국소적으로 진행된 질환은 전립선의 외측면에 걸친 경화의 촉지가능한 증거나, 전립선 기저상의 경화 또는 비대칭에 의해 임상적으로 정의된다. 국소적으로 진행된 전립선암은 종양이 전립선 피막을 침입 또는 관통한 경우, 외과수술 한계까지 연장되거나 정낭을 침입한 경우,근치전립선샘절제술에 이어 임상적으로 현재 진단된다.
[0071] "천연 글리코실화 패턴의 변경"이라 함은 본 발명에서 천연의 서열 PSCA에서 발견되는 탄수화물 부분의 하나 이상의 결실 (화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 글리코실화를 결실시키거나 기저 글리코실화 부위를 제거함으로써), 및/또는 천연의 PSCA 서열에는 존재하지 않는 글리코실화 부위를 하나 이상 부가하는 것을 의미한다. 또한, 이 표현은 존재하는 다양한 탄수화물 부분의 특성 변화를 비롯한, 천연 단백질의 글리코실화의 정성적 변화도 포함하는 것이다.
[0072] "유사체"라는 용어는 다른 분자와 구조적으로 유사하거나 또는 유사하거나 대응하는 특질을 공유하는 분자를 가리킨다 (예컨대 PSCA-관련 단백질). 예컨대, PSCA 단백질의 유사체는 PSCA에 특이적으로 결합하는 T 세포나 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있다.
[0073] 본 발명에서 "항체"라는 용어는 최광의로 사용된다. 따라서, "항체"는 자연 발생적인 것이거나 통상의 하이브리도마 기술에 의해 생산된 모노클로날 항체와 같은 인공의 것일 수 있다. 항PSCA 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체와 항원 결합 도메인 및/또는 이들 항체의 보체 결정 대역을 1종 이상 함유하는 단편을 포함한다. 본 발명에서, "항체"라는 용어는 PSCA에 특이적으로 결합하고/결합하거나 소망되는 생물학적 활성을 나타내는 여하한 형태의 항체나 그의 단편을 가리키며, PSCA에 특이적으로 결합하고/결합하거나 소망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체)를 특히 포괄한다. 어떠한 특이적인 항체도 본 발명의 방법과 조성물에 이용가능하다. 따라서, 한가지 구체예에서, "항체"라는 용어는 표적 항원에 대한 특정 결합 부위를 조합적으로 형성하는 중쇄 분자로부터의 1 이상의 가변부와 경쇄 면역글로불린 분자로부터의 1 이상의 가변부를 포함하는 분자를 포괄한다. 일 구체예에서, 항체는 IgG 항체이다. 예컨대, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 본 발명의 방법과 조성물에서 유용한 항체들은 세포 배양, 파지 또는 다양한 동물, 예컨대, 소, 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터, ㄱ기니픽, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 영장류와 같은 동물에서 생산될 수 있다. 따라서, 한가지 구체예에서, 본 발명의 항체는 포유류 항체이다. 파지 기술을 이용하여 초기 항체를 분리하거나 또는, 특이성 또는 결합활성적 특징이 변경된 변이체를 만들 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 것으로 기술 분야에 잘 알려져 있다. 한가지 구체예에서, 항체는 기술 분야에 알려진 재조합 수단에 의해 제조된다. 예컨대, 그 항체를 코딩하는 DNA 서열을 갖는 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션시킴으로써 재조합 항체를 만들 수 있다. 숙주 세포에서 적어도 하나의 VL 및 하나의 VH 대역을 발현하는 DNA 서열을 트랜스펙션시키기 위해 1 이상의 벡터를 사용할 수 있다. 항체 생산 및 발생의 재조합 수단에 대한 예시적인 설명은 Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); Shephard, 외, MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, 최신판)에 설명되어 있다. 본 발명의 항체를 재조합 수단에 의해 변형시켜 소망 기능을 매개하는데 있어서 그 항체의 효능을 증강시킬 수 있다. 따라서, 재조합 수단을 이용하여 치환함으로써 항체를 변형시키는 것 역시 본 발명의 범위에 속한다. 일반적으로, 치환은 보존적 치환이 될 것이다. 예컨대, 항체의 불변부 중의 적어도 하나의 아미노산을 다른 잔기로 대체시킬 수 있다. 예컨대, 미국특허 No. 5,624,821, 미국특허 No. 6,194,551, 출원 No. WO 9958572; 및 Angal, 외, Mol. Immunol. 30 : 105-08 (1993) 참조. 아미노산의 변형으로는 아미노산의 결실, 부가, 치환을 들 수 있다. 몇가지 경우, 바람직하지 못한 작용, 예컨대, 보체-의존성 세포독성을 감소시키기 위해 이러한 변경이 가해진다. 종종, 공유적 또는 비공유적으로 검출가능한 시그널을 제공하는 어떤 물질을 결합시킴으로써 항체를 표지시키기도 한다. 광범위한 표지 및 접합 기술이 공지이며 과학 문헌과 특허 문헌 모두에 자세히 논의되어 있다. 이러한 항체들은 정상 또는 비정상적인 PSCA에 대한 결합 여부에 대해 스크리닝될 수 있다. 예컨대, ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996) 참조. 증식, 이동, 부착, 연질 한천 성장, 혈관생성, 세포-세포 소통, 세포자멸사, 교통, 시그널 형질도입과 같은 시험관내 (in vitro) 분석법, 및 종양 성장 억제와 같은 세포내 (in vivo) 분석에 따라 소망되는 생물학적 활성을 갖는 적절한 항체들을 동정할 수 있다. 본 발명에서 제공되는 항체들 역시 진단 용도로 유용하다. 포획 또는 비무력화 항체로서, 이들은 항원의 생물학적 활성 또는 수용체-결합력을 억제함이 없이, 특정 항원에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 무력화 항체로서, 이 항체는 경쟁적 결합 분석에서 유용하다. 이들은 또한 PSCA 또는 그의 수용체를 정량하는데도 이용될 수 있다.
[0074] 본 발명에서 "항체 단편"이라 함은 그의 표적, 즉 항원 결합 대역에 결합하는 면역글로불린 분자의 가변부의 적어도 일부인 것으로 정의된다. 일례에서, 이 용어는 단일 항PSCA 항체와 그의 클론 (작동제, 길항제 및 무력화 항체를 포함한다) 및 폴리에피토프 특이성을 갖는 항PSCA 항체 조성물을 모두 포괄한다. 본 발명의 방법의 항체 및 조성물은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. 항체는 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단쇄 가변부 등을 포함한 항원 결합 항체의 형태일 수 있다. ㅂ본래 온전한 분자의 단편들은 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 생산할 수 있으며 여기에는 효소적 분해 및 재조합 수단이 포함된다.
[0075] 본 발명에서, 여하한 형태의 "항원"을 이용하여 PSCA에 특이적인 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 유발 항원은 단일 에피토프, 복수 에피토프, 또는 전체 단백질 단독 또는 기술 분야에 알려진 1 이상의 면역원성 증강 제제와의 조합일 수 있다. 유발 항원은 분리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질 (예컨대, 항원의 적어도 일부분으로 트랜스펙션된 세포를 이용하여 면역화), 또는 가용 단백질 (예컨대, 그 단백질의 세포외 도메인 부분만으로 면역화)일 수 있다. 항원은 유전학적으로 변형된 세포에서 생산될 수 있다. 항원을 코딩하는 DNA는 게놈 또는 비게놈 (예컨대 cDNA)일 수 있으며 적어도 세포외 도메인을 일부 함유한다. 본 발명에서 "부분(portion)"이라는 용어는 문제의 항원의 면역원성 에피토프를 적절히 구성하는 아미노산 또는 핵산의 최소 갯수를 가리킨다. 아데노바이러스 벡터, 플라스미드, 비바이러스성 벡터, 예컨대 양이온성 지질을 비롯하여, 목적하는 세포의 형질전환에 적합한 여하한 유전학적 벡터를 사용할 수 있다. 일례에서, 본 발명의 방법과 조성물의 항체는 목적하는 PSCA의 세포외 도메인의 적어도 일부에 특이적으로 결합한다.
[0076] 본 발명에서 제공되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 "생물활성적 제제"와 접합될 수 있다. 본 발명에서 "생물활성적 제제"라 함은 항원에 결합하고/결합하거나 목적하는 생물학적 효과를 매개하여 세포-사멸 독소를 증강시키는 모든 합성 또는 자연발생적인 화합물을 칭한다.
[0077] 한가지 구체예에서, 본 발명에서 유용한 결합 단편들은 생물학적 활성 단편들이다. 본 발명에서 "생물학적으로 활성적인"이라는 용어는 소망되는 항원 에피토프에 결합하여 생물학적 효과를 직접 또는 간접적으로 발휘할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 가리킨다. 직접 효과로는 성장 시그널의 모듈레이션, 자극, 및/또는 억제, 항세포자멸사 또는 괴사 시그널의 모듈레이션, 자극, 및/또는 억제, ADCC 캐스케이드의 모듈레이션, 자극, 및/또는 억제, 및 CDC 캐스케이드의 모듈레이션, 자극 및/또는 억제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
[0078] "이중특이적 (bispecific)" 항체 역시 본 발명의 방법과 조성물에서 유용하다. 본 발명에서, "이중특이적 항체"라 함은 특히 적어도 2개의 서로 다른 항원 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체, 일반적으로 모노클로날 항체를 가리킨다. 한가지 구체예에서, 에피토프는 동일한 항원으로부터 기원한다. 또 다른 구체예에서, 에피토프는 두가지 서로다른 항원으로부터 기원한다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 기술 분야에 공지이다. 예컨대, 이중특이적 항체는 두개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍 공동 발현을 재조합적으로 이용함으로써 제조될 수 있다. 예컨대, Milstein 외, Nature 305:537-39 (1983) 참조. 또는, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조할 수도 있다. 예컨대, Brennan, 외, Science 229:81 (1985) 참조. 이중특이적 항체는 이중특이적 항체 단편을 포함한다. 예컨대, Hollinger, 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), Gruber, 외, J. Immunol. 152:5368 (1994) 참조.
[0079] 본 발명에서 모노클로날 항체는 특히 "키메라" 항체를 포함하는데 이 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하거나, 특징 종으로부터 유래되는 항체의 대응 서열과 동일 또는 상동적인 반면, 그 사슬(들)의 나머지는 표적 항원에 특이적으로 결합하고/결합하거나 소망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 다른 종 또는 다른 항체 클래스나 서브클래스 및 그러한 항체의 단편으로부터 유도된 항체 중의 대응 서열과 동일 또는 상동적인 것이다 (미국특허 No. 4,816,567; 및 Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
[0080] "화학요법 제제"라는 용어는 종양 성장을 억제하는데 효과가 있는 모든 화학적 화합물을 가리킨다. 화학요법 제제의 비제한적인 예로는 알킬화 제제; 예컨대, 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물 및 알킬 설포네이트; 항대사산물'; 예컨대, 엽산, 퓨린 또는 피리미딘 길항제; 유사분열 억제제; 예컨대, 빈카 알칼로이드 및 포도필로톡신의 유도체, 세포독성 항체, DNA 발현을 손상 또는 간섭하는 화합물, 및 성장 인자 수용체 길항제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 화학요법 제제에는 세포독성 제제 (본 명세서에서 정의되는 바와 같다), 항체, 생물학적 분자 및 소분자가 포함된다.
[0081] "코돈 최적화 서열"이라는 용어는 사용 빈도가 약 20% 미만인 여하한 코돈을 대체함으로써 특정 숙주종에 대해 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 가리킨다. 코돈 최적화에 더하여, 거짓 폴리아데닐화 서열의 제거, 엑손/인트론 스플라이싱 신호의 제거, 트랜스포존 유사 반복체의 제거 및/또는 GC 함량의 최적화에 의하여, 주어진 숙주 종에 있어서 발현이 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 본 발명에서 "발현 증강 서열"이라고 칭한다.
[0081] "복합 라이브러리"는 시약과 같은 화학적 "빌딩 블록들"을 몇가지 복합시킴으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생산된 다양한 화학적 화합물의 컬렉션을 말한다. 예컨대, 폴리펩타이드 (예컨대 뮤테인) 라이브러리와 같은 선형 복합 화학적 라이브러리는 주어진 화합물 길이 (즉 폴리펩타이드 화합물의 아미노산 수)만큼 가능한 모든 방법으로 아미노산이라는 화학적 빌딩 블록의 세트를 복합시킴으로써 형성된다. 화학적 빌딩 블록의 이러한 복합적 혼합을 통해 수많은 화학적 화합물이 합성된다 (Gallop 외, J. Med. Chem. 37(9): 1233-1251 (1994)).
[0082] 복합 라이브러리의 작성 및 스크리닝은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 복합 화학적 라이브러리로는 펩타이드 라이브러리 (예컨대, 미국특허 5,010,175, Furka, Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991), Houghton 외, Nature, 354:84-88 (1991)), 펩토이드 (PCT 공개 No WO 91/19735), 코딩된 펩타이드 (PCT 공개 No. WO 93/20242), 랜덤 바이오올리고머 (PCT 공개 WO 92/00091), 벤조디아제핀 (U.S. Pat. No. 5,288,514), 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩타이드와 같은 다이버조머(diversomers) (Hobbs 외, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), 비닐계 폴리펩타이드 (Hagihara 외, J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), 베타-D-글루코스 스캐폴딩을 갖는 비펩타이드계 펩티도미메틱스 (Hirschmann 외, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), 소화합물 라이브러리의 유사 유기합성효소 (Chen 외, J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), 올리고카르바네이트 (Cho, 외, Science 261:1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트 (Campbell 외, J. Org. Chem. 59:658 (1994))를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 다음을 참조하라: Gordon 외, J. Med. Chem. 37:1385 (1994), 핵산 라이브러리 (see, e.g., Stratagene, Corp.), 펩타이드 핵산 라이브러리 (예컨대 U.S. Patent 5,539,083), 항체 라이브러리 (예컨대, Vaughn 외, Nature Biotechnology 14(3): 309-314 (1996), 및PCT/US96/10287 참조), 탄수화물 라이브러리 (예컨대, Liang 외, Science 274:1520-1522 (1996), 및 미국특허 5,593,853 참조), 및 소형 유기분자 라이브러리 (예컨대, 벤조디아제핀, Baum, C&EN, Jan 18, 33페이지 (1993); 이소프레노이드, 미국특허 5,569,588; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국특허 5,549,974; 피롤리딘, 미국특허 5,525,735 및 5,519,134; 모르플리노 화합물, 미국특허 5,506, 337; 벤조디아제핀, 미국특허 5,288,514; 등 참조).
[0084] 복합 라이브러리 제조를 위한 장비는 상업적으로 구입가능하다 (예컨대, 357 NIPS, 390 NIPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A, Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050, Plus, Millipore, Bedford, NIA). 용액상 화학을 위해 몇가지 잘 알려진 로보트 시스템도 개발되었다. 이러한 시스템은 Takeda Chemical Industries, Ltd. (일본, 오사카)에 의해 개발된 자동화 합성 장치 및 화학자들에 의해 수행되는 수동 합성 조작을 모방한 다양한 로보트 시스템 이용 로보트팔 (Zymate H, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass.; Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)과 같은 자동화 워크스테이션을 포함한다.전술한 장비의 어느 것이든 본 발명에 사용하는데 적합하다. 보 발명에 논의된대로 작동될 수 있도록 이들 장비를 개조시키는 것이나 이의 특성은 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 수많은 복합 라이브러리가 그 자체로 시판되고 있다 (예컨대 ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, RU; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD; 등).
[0085] 본 발명에서, "보존적 치환"이라는 용어는 당업자에게 잘 알려진 아미노산 치환을 가리키며 결과적인 분자의 생물학적 활성이 일반적으로 변경되지 않는 치환을 가리킨다. 당업자라면, 일반적으로 폴리펩타이드의 비필수 대역에서의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다 (예컨대, Watson, 외, MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4판 1987) 참조). 이러한 예시적인 치환은 표 III (a-b)에 제시된 바에 따라 만들어지는 것이 바람직하다. 예컨대, 이러한 변경에는 이소류신 (I), 발린 (V), 및 류신 (L)으로 기타의 소수성 아미노산을 치환하는 것; 글루탐산 (E)를 아스파르트산(D)로 치환하는 것 또는 그의 역; 아스파라긴(N)을 글루타민 (Q)로 치환하는 것 또는 그의 역; 쓰레오닌(T)를 세린(S)로 치환하는 것 또는 그의 역이 포함된다. 기타의 치환 역시 특정 아미노산 및 단백질의 3차원 구조에서의 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 여겨질 수 있다. 예컨대, 글리신(G)과 알라닌(A)는 종종 호환가능하며 알라닌(A)와 발린(V)도 그러하다. 비교적 소수성인 메티오닌(M)은 종종 류신 및 이소류신과 호환될 수 있으며 때로는 발린과 호환되기도 한다. 라이신(K)과 아르기닌 (R)은 아미노산 잔기의 유의적 특성이 그의 전하에 기인하고 이들 두 아미노산 잔기의 pK'를 달리하는 것이 유의적이지 않은 부위에서 종종 상호교환가능하다. 다른 변경들도 특히 환경에서 "보존적"으로 고려될 수 있다 (예컨대, 본 발명의 표 III(a); 13-15 페이지 "Biochemistry" 제2판, Lubert Stryer 편 (Stanford University); Henikoff et al ., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al ., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6 참조). 다른 종류의 치환 역시 허용가능하며 실험적으로 결정되거나 또는 공지의 보존적 치환에 따라 결정될 수 있다.
[0086] "세포독성제"라는 용어는 세포의 발현 활성, 세포의 기능을 저해 또는 방지하고/방지하거나 세포의 파괴를 일으키는 물질을 가리킨다. 이 용어는 방사능 동위원소 화학요법제, 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 소분자 독소와 같은 독소, 및 이들의 단편 및/또는 변이체를 포괄한다. 세포독성제의 예로는 오리스타틴, 오리스타틴 e, 오로마이신, 마이탄시노이드, 이트륨, 비소, 리신, 리신 A쇄, 콤브레스타틴, 듀어카마이신, 돌로스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 택솔, 시스플라틴, cc1065, 에티디움 브로마이드, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 큐리신, 크로틴, 칼리케마이신, 사포나리아 오피시날리스 (Sapaonaria officinalis 저해제, 및 글루코코르티코이드 및 기타 화학요법제 뿐만 아니라, 방사능 동위원소, 예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32 및 Lu177를 비롯한 Lu의 방사능 동위원소를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 전구약물을 그의 활성형으로 전환시킬 수 있는 항암 전구약물 활성화 효소에 항체를 접합시킬 수도 있다.
[0087] 본 발명에서 "다이아바디(diabodies)"라는 용어는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 가리키는 것으로서, 이들 단편들은 동일한 폴리펩타이드 사슬 (VH-VL) 내에서 경쇄 가변부 (VL)에 연결된 중쇄 가변부 (VH)로 이루어진다. 동일 사슬 상에서 두개의 대역 사이에 쌍을 이루도록 하기에는 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인들로 하여금 다른 사슬의 상보 대역과 TKd을 이루도록 하여 두개의 항원 결합 부위를 만든다. 다이아바디는 예컨대 EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)에 보다 상세히 설명되어 있다.
[0088] "유전자 산물"이라 함은 mRNA의 펩타이드/단백질을 가리킨다. 예컨대, "본 발명의 유전자 산물"은 때로 "암의 아미노산 서열", "암 단백질", " 표 I에 열거된 암 단백질", "암의 mRNA" " 표 I에 열거된 암의 mRNA" 등을 가리킨다. 한가지 구체예에서, 암 단백질은 도 1의 핵산에 의해 코딩된다. 암 단백질은 단편이거나, 또는 도 1의 핵산에 의해 코딩된 전장 단백질일 수 있다. 한가지 구체예에서, 암의 아미노산 서열은 서열 동일성 또는 유사성을 결정하는데 이용된다. 또 다른 구체예에서, 이들 서열들은 도 1의 핵산에 의해 코딩된 단백질의 자연 발생적인 대립형질 변이체이다. 또 다른 구체예에서, 이들 서열은 서열 변이체이며 이에 관해서는 이하에 상술한다.
[0089] "헤테로컨쥬게이트" 항체는 본 발명의 방법과 조성물에서 유용하다. 본 발명에서, "헤테로컨쥬게이트 항체"라 함은 2개의 공유적으로 결합된 항체들을 가리킨다. 이러한 항체들은 가교제를 사용하는 것을 포함하여, 합성 단백질 화학 분야의 공지 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 미국특허 No. 4,676,980 참조.
[0090] 특정 핵산이나 단백질 산물의 존재, 부재, 정량 또는 기타 특성 분석을 위한 "고처리능 스크리닝"은 당업자에게 잘 알려져 있다. 마찬가지로, 결합 분석법과 리포터 유전자 분석법도 잘 알려져 있다. 예컨대 미국특허 5,559,410에는 단백질의 고처리능 스크리닝법이; 미국특허 5,585,639에는 핵산 결합 (즉, 어레이에서)의 고처리능 스크리닝법이; 그리고 미국특허 5,576,220와 5,541,061에는 리간드/항체 결합에 대한 고처리능 스크리닝법이 개시되어 있다.
[0091] 또한, 고처리능 스크리닝 시스템은 상업적으로 입수가능하다 (예컨대, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ; Zymark Corp., Hopkinton, MA; Air Technical Industries, Mentor, OH; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, CA; Precision Systems, Inc., Natick, MA; 등 참조). 이러한 시스템들은 모두, 분석에 적합하도록 시료와 시약의 피펫 조작, 액체 분산, 시간 조절된 인큐베이션 및 검출기(들) 중의 마이크로플레이트의 최종 판독을 비롯한 전공정의 자동화로 수행된다. 이와 같이 설정 변경이 가능한 시스템은 고처리능과 신속한 개시 뿐만 아니라 고도으 유연성과 맞춤성을 함께 제공해준다. 이러한 시스템의 제조업체는 여러가지 고처리능 시스템에 대한 상세한 프로토콜을 제공하고 있다. 예컨대, Zymark Corp.은 유전자 전사 조절, 리간드 결합 등을 검출하기 위한 스크리닝 시스템을 설명하는 기술적 게시물을 제공하고 있다.
[0092] "상동체"라 함은 다른 분자에게 상동성을 나타내는 분자, 예컨대, 대응하는 좌위에서 동일 또는 유사한 화학적 잔기의 서열을 갖는 분자를 가리킨다.
[0093] 한가지 구체예에서, 본 발명에서 제공되는 항체는 "인간 항체"이다. 본 발명에서, "인간 항체"라 함은 경쇄 서열과 중쇄 사열의 전체 서열들이, 상보성 결정 대역 (CDRs)을 비롯하여, 모두 사람의 유전자로부터 기원한 것을 가리킨다. 한가지 구체예에서, 인간의 모노클로날 항체는 트리오마 기술, 인간의 B 세포 기술 (예컨대, Kozbor, 외, Immunol. Today 4: 72 (1983), EBV 형질전환 기술 (예컨대, Cole 외 MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985) 참조), 또는 파지 디스플레이 기술 (예컨대, Marks 외, J. Mol. Biol. 222:581 (1991) 참조)를 이용하여 제조된다. 특정 구체예에서, 인간 항체는 트랜스제닉 마우스에서 생성된다. 이러한 부분적 내지 완전한 인간 항체의 제조 기술은 기술 분야에 공지이며 이러한 기술 중 어느 것이든 이용가능하다. 특히 바람직한 구체예에서는, 전적으로 인간 유래의 항체 서열을 인간의 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 만든다. 사람의 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스의 제조에 관한 예시적인 설명은 WO 02/43478 및 미국특허 6,657,103 (Abgenix) 및 그의 관련 출원에서 찾아볼 수 있다. 소망되는 항체를 생산하는 트랜스제닉 마우스로부터 얻은 B 세포를 융합시켜 항체의 연속 제조를 위한 하이브리도마 세포주를 만든다. ㅇ예컨대, 미국 특허 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 및 5,545,806; 및 Jakobovits, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); Green, 외, J. Exp. Med. 188:483-95 (1998).
[0094] "인간의 백혈병 항원" 또는 "HLA"이라 함은 인간의 클래스 I 또는 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 단백질을 의미한다 (예컨대, Stites, 외, IMMUNOLOGY, 8TH ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994) 참조).
[0095] 본 발명에서, "인간화된 항체"라 함은 인간 항체 뿐만 아니라 비인간 (예컨대, 마우스) 항체로부터의 서열도 함유하는 항체 형태를 가리킨다. 이러한 항체들은 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열 (minimal sequence)을 함유하는 키메라 항체들이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 일반적으로 두개의 가변부를 함유하며, 여기서 초가변부 루프의 모든것 또는 실질적으로 모든 것은 비인간 면역글로불린의 그것에 대응하고, FR 대역의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 면역글로불린 서열의 그것에 대응한다. 인간화된 항체는 또한 임의로 면역글로불린 불변부 (Fc), 일반적으로는 인간의 면역글로불린의 불변부를 적어도 일부분 함유한다. 예컨대, Cabilly U.S. Patent No. 4,816,567; Queen 외 (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; 및 ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996) 참조.
[0096] 폴리뉴클레오타이드와 관련해서 "하이브리다이즈하다", "하이브리다이즈하는" 등의 표현은 통상적인 하이브리다이제이션 조건, 바람직하게는, 50% 포름아미드/6XSSC/0.1% SDS/100 ㎍/ml ssDNA, 하이브리다이제이션 온도는 섭씨 37도보다 높고 0.1XSSC/0.1% SDS 에서의 세척 온도는 섭씨 55를 넘는 것과 같은 조건과 관련한다.
[0097] "분리된" 또는 "생물학적으로 순수한"이라는 표현은 천연 상태라면 보통 그 물질과 함께 발견되는 성분들이 그 물질에 실질적으로 또는 기본적으로 없는 것을 가리킨다. 따라서, 본 발명에서 분리된 펩타이드는 바람직하게는 그의 in situ 환경에서 일반적으로 연관되는 물질을 함유하지 않는다. 에컨대, 어떤 폴리펩타이드가 PSCA유전자 이외의 유전자에 대응하거나 그에 상보적인 오염 폴리뉴클레오타이드를 실질적으로 함유하지 않거나, PSCA 유전자 산물 또는 그의 단편 이외의 폴리펩타이드를 코딩하는 오염 폴리뉴클레오타이드를 실질적으로 함유하지 않을 때, 그 폴리펩타이드를 "분리되었다"고 칭한다. 당업자라면 분리된 PSCA 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위한 핵산 분리 공정을 쉽게 사용할 수 있을 것이다. 예컨대, PSCA 단백질을 그 단백질과 보통 연관된 세포 성분으로부터 제거하는데 물리적, 기계적, 화학적 방법이 사용된 경우 그 단백질은 '분리되었다'고 표현한다. 당업자라면 분리된 PSCA 단백질을 얻는 표준 정제법을 쉽게 사용할 수 있을 것이다. 또한, 분리된 단백질은 화학적 수단에 의해 제조가능하다.
[0098] 적절한 "표지(label)"로는 라디오뉴클라이드, 효소, 기질, 코팩터, 억제제, 형광 부분, 화학발광 부분, 자기 입자 등을 들 수 있다. 이러한 표지의 사용 기술을 설명하는 특허로는 미국특허 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; 및 4,366,241을 들 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공되는 항체들은 형광체의 항원 결합 성분으로서 사용될 수도 있다. 예컨대, Zeytun 외, Nat. Biotechnol. 21:1473-79 (2003) 참조.
[0099] "포유동물"이라 함은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말 및 사람으로 분류되는 모든 생물을 가리킨다. 본 발명의 일례에서, 포유동물은 마우스이다. 또 다른 예로서 포유동물은 사람이다.
[0100] "전이성 전립선암" 및 "전이성 질환"이라는 용어는 부위 임파절이나 원위부까지 확산된 전립선암을 의미하며, AUA 시스템의 D 단계 질환 및 TNM 시스템의 TxNxM+ 단계를 포괄한다. 국소 진행 전립선암의 경우와 마찬가지로, 전이성 질환이 있는 환자에게는 일반적으로 외과수술이 시술되지 않으며, 호르몬 (안드로겐 절제) 요법이 바람직한 치료 기법이다. 전이성 전립선암을 앓는 환자는 치료 개시 12 내지 18개월 이내에 안드로겐 불응 상태가 일어날 수 있다. 이러한 안드로겐 불응 환자의 대략 절반 가량은 이러한 상태가 발달한지 6개월 이내에 사망한다. 전립선암 전이의 대부분의 전이 부위는 뼈이다. 전립선암 골전이는 골용해성이라기보다는 골형성성이다 (즉, 전체적인 골형성을 초래함). 골전이는 척추에서 가장 많이 발병하고, 이어서, 대퇴골, 골반, 흉곽, 두개골 및 상완골의 순이다. 그 밖의 빈번한 골전위 부위로는 임파적, 폐, 간 및 뇌가 포함된다. 전이성 전립선암은 일반적으로 오픈 또는 라파라스코프 골반 림프절제술, 전신 방사선핵종 스캔, 골격 방사선촬영술 및/또는 골병변 생검법에 의해 진단된다.
[0101] "조절자" 또는 '테스트 화합물" 또는 "약물 후보" 또는 본 발명에서 이들 용어의 문법상 등가물은 암 표현형, 암 서열, 에컨대 핵산 또는 단백질 서열, 또는 암 서열의 효과 (예컨대, 시그널링, 유전자 발현, 단백질 상호반응 등)을 직접 또는 간접적으로 변경시키는 능력에 대해 시험될, 예컨대 단백질, 올리고펩타이드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 등을 가리킨다. 한가지 관점에서, 조절자는 본 발명의 암 단백질의 효능을 무력화시킬 것이다. "무력화"라 함은 어떤 단백질의 활성이 저해 또는 차단되면서 결과적으로 세포에 그러한 효과를 미침을 가리킨다. 또 다른 관점에서, 조절자는 상기 단백질의 수준을 정상화시킴으로써, 본 발명의, 유전자 및 그에 대응하는 단백질의 효과를 무력화시킬 것이다. 바람직한 구체예에서, 조절자는 본 발명에 제공된 발현 프로파일, 또는 발현 프로파일 핵산 또는 단백질 또는 하류의 이펙터 경로를 변경시킨다. 일례에서, 조절자는 암의 표현형을, 예컨대, 정상적인 조직 핑거프린트로 억제한다. 또 다른 구체예에서, 조절자는 암 표현형을 유도하였다. 일반적으로, 다수의 분석 혼합물을 시약의 농도를 달리하여 함께 병용함으로써 여러가지 농도에 대한 상이한 응답을 얻는다. 대개, 이러한 농도들 중 한가지는 제로 농도 또는 검출 수준 미만, 즉, 음성 대조군 역할을 한다.
[0102] 조절자, 약물 후보 또는 테스트 화합물은 일반적으로 유기 분자, 바람직하게는, 분자량이 100 달톤보다 크고 약 2,500 달톤 미만인 소형 유기 화합물인 경우가 많지만, 광범위한 화학물질을 포괄한다. 바람직한 소형 분자는 분자량이 2000 달톤 미만, 또는 1500 달톤 미만 또는 1000 달톤 미만 또는 500 달톤 미만이다. 후보 물질은 단백질과 구조적으로 상호반응하는데 필요한 관능기, 특히 수소 결합, 및 일반적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복실기, 바람직하게는, 적어도 두개의 관능성 화학기를 포함하는 것이 좋다. 후보 물질은 종종 고리형 탄소 또는 헤테로시클릭 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함하여 이들은 하나 이상의 전술한 관능기로 치환된다. 조절자는 또한 펩타이드, 다당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이의 유도체, 구조적 유사체 또는 조합체와 같은 바이오분자도 포함한다. 조절자의 한 부류는 예컨대 약 5 내지 35개 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 약 20개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 7 내지 약 15 아미노산의 펩타이드이다. 바람직하게는, 암 조절 단백질이 가용성인 것이 좋고, 비트랜스막 대역을 갖고/갖거나, 가용성을 보조하기 위한 N-말단 Cys를 함유하는 것이 좋다. 일례에서, 그 단편의 C-말단은 유리산으로서 유지되고 N-말단은 예컨대 시스테인에 대한 커플링 보조를 위한 유리 아민이다. 일례에서, 본 발명의 암 단백질은 본 발명에서 논의된 면역원성 제제에 접합된다. 일례에서, 암 단백질은 BSA에 접합된다. 바람직한 길이의 본 발명의 펩타이드는 서로 링크되거나 다른 아미노산에 링크되어 보다 긴 펩타이드/단백질을 만들어낸다. 조절 펩타이드는 위에서 개략한 바와 같은 천연 단백질, 랜덤 펩타이드 또는 "치우쳐진' 랜덤 펩타이드의 절단물일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 펩타이드/단백질 기재 조절자는 상기 정의된 바와 같은 항체, 및 그의 단편이다.
[0103] 암의 조절자는 핵산일 수도 있다. 핵산 조절제는 천연 핵산, 랜덤 핵산 또는 '치우쳐진" 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 단백질에 대해 위에서 개략적으로 설명한 것과 유사한 방식으로 사용할 수 있다.
[0104] "모노클로날 항체"라 함은 실제로 동질의 항체들의 집단, 즉, 그 집단을 이루는 항체들이, 소량으로 존재하는 자연발생적 돌연변이의 가능성을 제외하고 서로 동일한 항체들의 집단으로부터 얻어진 것을 가리킨다. 모노클로날 항체는 단일 항원 에피토프에 대해 고도로 특이적이면서 그것에 지향되어 있다. 이와 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 일반적으로 여러가지 상이한 에피토프에 지향된 (지향되거나 또는 그에 특이적임) 항체를 복수개 포함한다. 일례에서, 폴리클로날 항체는 복수개의 항원 에피토프를 함유하는 단일 항원 내에서 상이한 에피토프 특이성, 친화성, 또는 결합활성을 갖는 모노클로날 항체들을 복수개 함유한다. 변형자 "모노클로날"은 그 항체의 특징이 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터 얻어졌음을 의미하며, 어떤 특정 방법에 의해 항체를 생산할 것이 요구되는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 Kohler 외, Nature 256: 495 (1975)에 의해 최초로 설명된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국특허 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예컨대, Clackson 외, Nature 352: 624-628 (1991) 및 Marks 외, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)에 설명된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수도 있다. 이들 모노클로날 항체들은 대개 ELISA로 측정시 대개 적어도 약 1 μM의, 더욱 일반적으로는 적어도 약 300 nM, 일반적으로는 적어도 약 30 nM, 바람직하게는 적어도 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3 nM의 Kd와 결합한다.
[0105] PSCA-관련 단백질의 생물학적 모티프에서와 같이 "모티프"라는 표현은 어떤 단백질의 특정 기능 (예컨대 단백질-단백질 상호반응, 단백질-DNA 상호반응 등) 또는 수식 (에컨대, 포스포릴화, 글리코실화 또는 아미드화), 또는 국소화 (예컨대 분비 서열, 핵산 국소화 서열 등)와 연관된 일차 서열 부분, 또는 체액성 또는 세포성인 면역원성과 상관관계가 있는 서열 부분을 형성하는 아미노산 패턴을 가리키는 것이다. 모티프는 어떤 기능이나 특성과 일반적으로 상관된 특정 위치에 인접하거나 그에 대해 정렬될 수 있다. HLA 모티프에서, "모티프"란 대개 클래스 I HLA 모티프의 경우 약 8 내지 약 13 아미노산, 클래스 II 모티프의 경우 약 6 내지 약 25 아미노산이라는 정의된 길이를 갖는, 특징 HLA 분자에 의해 인식되는 펩타이드 잔기의 패턴을 가리킨다. HLA 결합에 대한 펩타이드 모티프는 일반적으로 각각의 인간 HLA 대립형질에 의해 코딩되는 각각의 단백질마다 다르며 일차 및 이차 앵커 잔기의 패턴도 다르다. 빈번히 발생하는 모티프를 표 V에 열거하였다.
[0106] "약학적 부형제"에는 애쥬번트, 담체, pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 보습제, 방부제 등과 같은 물질이 포함된다.
[0107] "약학적으로 허용가능한"이라 함은 비독성, 불활성 및/또는 사람이나 다른 포유동물과 생리적으로 적합한 것을 가리킨다.
[0108] "폴리뉴클레오타이드"라는 표현은 길이가 적어도 10개의 염기 또는 염기쌍인 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드 또는 이러한 뉴클레오타이드 중 어느 한 종류의 변형체인 뉴클레오타이드의 폴리머 형태로서, DNA 및/또는 RNA의 단일 및 이중가닥 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 기술 분야에서, 이 용어는 "올리고뉴클레오타이드"와 곧잘 혼용된다. 폴리뉴클레오타이드는 예컨대 도 2에 도시된 바와 같이, 티미딘 (T)이 우라실 (U)일 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있고; 이러한 정의는 DNA와 RNA의 화학적 구조 간의 차이에 기인하는 것으로, 특히 RNA의 4개의 주요 염기 중 하나가 티미딘 (T) 대신 우라실 (U)인 경우 관찰된다.
[0109] "폴리펩타이드"라는 용어는 적어도 약 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 아미노산의 폴리머이다. 본 명세서에서는 아미노산을, 표준 3문자 또는 1문자로 표기한다. 이 분야에서, 이 용어는 종종 "펩타이드" 또는 "단백질"과 상호 교환적으로 쓰인다.
[0110] HLA "일차 앵커 잔기"는 면역원성 펩타이드와 HLA 분자 간에 접촉점을 제공하는 것으로 이해되는 펩타이드 서열의 어떤 특이적 좌위의 아미노산이다. 일반적으로 정의된 길이의 펩타이드 중 1 내지 3개, 대개 2개의 일차 앵커 잔기가 면역원성 펩타이드의 "모티프"를 정의한다. 이러한 잔기는 HLA 분자의 펩타이드 결합 그루브과 밀접하게 접촉되어 있는 한편 그의 측쇄는 결합 그루브의 특정 포켓에 매립된 것으로 여겨지고 있다. 일례에서, HLA 클래스 I 분자의 일차 앵커 잔기는 본 발명에 따른 펩타이드 에피토프의 카르복시 말단 좌위 8, 9, 10, 11 또는 12 및 좌위 2 (아미노 말단 위치로부터)에 위치한다. 또는 다른 구체예에서, 펩타이드의 일차 앵커 잔기는 HLA 클래스 II 분자에 결합하고 일반적으로 펩타이드가 적어도 9개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드의 말단보다는 서로 상대적으로 이격된다. 각각의 모티프와 수퍼모티프의 일차 앵커 좌위를 표 IV(a)에 나타내었다. 예컨대, 표 IV에 나타낸 일차 및/또는 이차 앵커 좌위에서 특정 잔기의 존재 또는 부재를 변경시킴으로써 유사체 펩타이드를 만들수 있다. 이러한 유사체를 이용하여 특정 HLA 모티프나 수퍼모티프를 함유하는 펩타이드의 결합 친화성 및/또는 집단 커버리지를 조절할 수 있다.
[0111] "방사능 동위원소"에는 다음이 포함되나 이에 한정되지 않는다 (비제한적인 예시적 용도 역시 표 IV(I))에 제시되어 있다).
[0112] 핵산과 단백질과 관련하여 사용되는 "무작위화" 또는 그의 문법적인 동의어는 각각의 핵산과 펩타이드가 각각 기본적인 무작위 뉴클레오타이드 및 아미노산으로 구성되어 있음을 가리킨다. 이들 무작위 펩타이드 (또는 핵산, 본 발명에서 논의됨)는 어떤 좌위에서든 어떤 뉴클레오타이드나 아미노산이던지 인코포레이션할 수 있다. 무작위화 단백질 또는 핵산 생성을 위한 합성 공정을 고안하여, 서열 길이 전반에 걸쳐 가능한 조합의 모두 또는 대부분을 형성함으로써, 무작위화된 후보 생물활성 단백질 제제의 라이브러리를 형성할 수 있다.
[0113] 한가지 구체예에서, 어떤 좌위에서든 어떤 서열도 선호되거나 일정하지 않다면 그 라이브러리는 "완전히 무작외화된" 것이다. 또 다른 구체예에서, 라이브러리는 "편중된 무작위" 라이브러리이다. 즉, 서열 중 어떤 좌위가 불변이거나 또는 한정된 가능한 갯수로부터 선택되는 경우이다. 예컨대, 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 소정의 클래스, 예컨대, 소수성 아미노산, 친수성 잔기, 입체적으로 편중된 (예컨대 작거나 큰) 잔기, 핵산 결합 도메인의 생성에 대해, 시스테인 생성, 가교, SH-3 도메인의 프롤린, 포스포릴화 좌위에 있어서 세린, 쓰레오닌, 티로신, 또는 히스티딘, 또는 퓨린에 대한 것과 같은 한정된 부류에서 무작위화된다.
[0114] "재조합" DNA 또는 RNA 분자는 시험관내에서 분자 조작이 행하여진 DNA 또는 RNA 분자이다.
[0115] 본 발명에서 "단쇄 Fv" 또는 "scFv" 또는 "단쇄" 항체라 함은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편으로서, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 존재하는 것이다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 ㅍ폴리펩타이드 링커를 더 포함하고, 이로 인해 sFv는 소망되는 항원 결합 구조를 형성할 수 있다. sFv에 관해서는 Pluckthun, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)을 참조할 수 있다.
[0116] "소분자 (small molecules)"의 비제한적인 예로는 PSCA와 결합 또는 상호반응하는 화합물, PSCA 단백질에 결합하여 PSCA 단백질 기능을 선별적으로 억제하는 호르몬을 비롯한 리간드, 뉴로펩타이드, 케모카인, 오도란트, 인지질, 및 그의 기능성 등가물을 들 수 있다. 이러한 비제한적인 소분자는 바람직하게는 분자량이 약 10 kDa 미만, 더욱 바람직하게는 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5 또는 약 4 kDa 미만인 것이 좋다. 특정 구체예에서, 소분자는 물리적으로 PSCA 단백질과 연계되거나 이에 결합되ㅇ 있으며; 자연발생적인 대사 경로에서는 발견되지 않고/않거나, 비수성 용액보다 수성 용액에서 더 잘 녹는다.
[0117] 본 발명에서, "특이적"이라는 용어는 표적 항원 에피토프에 대한 항체의 선택적인 결합을 가리킨다. 주어진 일련의 조건 하에서 적절한 항원에 대한 결합과 무관한 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합을 비교함으로써 그 항체의 결합 특이성을 검정할 수 있다. 만일 그 항체가 무관한 항원이나 항원 혼합물보다 적절한 항원에 대해 적어도 2배, 5배, 7배 및 바람직하게는 10배 더 잘 결합한다면, 그 항체는 특이적인 것으로 간주된다. 한가지 구체예에서, 특이적 항체는 PSCA 항원에만 결합하고, 무관한 항원에는 결합하지 않는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 특이적 항원은 인간의 PSCA 항원에는 결합하지만, PSCA 항원과 아미노산 상동성이 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 비인간 PSCA 항원과는 결합하지 않는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 특이적 항체는 인간의 PSCA 항원과 결합하고 마우스의 PSCA 항원과 결합하지만, 인간의 항원과 더 고도로 결합하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 특이적 항체는 인간의 PSCA 항원과 결합하고 영장류의 PSCA 항원과 결합하지만 인간의 항원과 더 고도로 결합하는 것이다. 또 다른 구체예에서, 특이적 항체는 인간의 PSCA 항원 및 여하한 비인간 PSCA 항원과 결합하지만, 인간의 항원이나 그의 여하한 조합물과 더 고도로 결합하는 것이다.
[0118] 하이브리다이제이션 반응의 "스트린젠시"는 당업자라면 용이하게 결정가능하고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 실험적으로 산출할 수 있다. 일반적으로 프로브가 길수록 적당한 어닐링에 보다 고온이 필요한 반면, 프로브가 짧을수록 온도가 더 낮을 필요가 있다. 하이브리다이제이션은 일반적으로 변성된 핵산이 상보 가닥이 그의 융점 미만의 환경에서 존재할 경우 재어닐링할 수 있는 능력에 의존한다. 프로브와 하이브리다이제이션 할 수 있는 서열간의 소망 상동성의 정도가 높을수록, 이용가능한 상대 온도도 더 높다. 그 결과, 비교적 고온인 경우 반응은 보다 엄중해지고 (stringent), 온도가 낮으면 덜 그러하다. 하이브리다이제이션 반응의 스트린젠시와 관련한 부가적인 상세 설명은 Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)에 제시되어 있다.
[0119] 본 발명에서 "스트린젠트 조건" 또는 "고스트린젠시 조건"이라 함은, (1) 세척을 위해 고온과 낮은 이온 강도, 예컨대 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 구연산나트륨/ 0.1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하는 것; (2) 42℃에서 하이브리다이제이션 동안 포름아미드와 같은 변성제, 예컨대 50% (v/v) 포름아미드와 0.1% 소의 혈청 알부민/0.1% Ficoll/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5 alc 750 mM 염화나트륨, 75 mM 구연산나트륨을 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 구연산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리한 연어 DNA (50 mg/ml), 0.1% SDS, 및 덱스트란 설페이트, 42℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/구연산나트륨) 세척 및 55℃에서 50% 포름아미드, 이어서 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1 x SSC로 고스트린젠시 세척하는 것을 말하나, 이에 한정되지 않는다. "온화한 스트린젠트 조건"은 Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 설명되어 있는 것과 전술한 것보다는 덜 엄격한 세정액 및 하이브리다이제이션 조건 (예컨대 온도, 이온 강도 및 %SDS)이 포함된다. 온화한 스트린젠트 조건의 예로는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 구연산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt's 용액, 10% 덱스트란 서페이트 및 20 mg/mL 변성 쉬어처리한 영어 정자DNA를 함유하는 용액 중 37℃에서 하룻밤 인큐베이션시킨 다음, 약 37-50에서 1 x SSC로 여액을 세정하는 것을 들 수 있다. 당업자라면 프로브 길이 등과 같은 인자에 적합화시키는데 필요한 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인식할 것이다.
[0120] HLA "수퍼모티프"라 함은 2개 이상의 HLA 대립유전자가 코딩하는 HLA 분자에 의해 공유되는 펩타이드 결합 특이성이다. 서로 다른 인종 집단에서의 HLA-수퍼타입의 전반적인 표현형 빈도를 표 IV(F)에 제시하였다. 여러가지 수퍼타입의 비제한적인 구성원을 다음에 나타내었다:
A2: A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A* 0205, A*0206, A*6802, A*6901, A*0207
A3: A3, A11, A31, A*3301, A*6801, A*0301, A*1101, A*3101
B7: B7, B*3501-03, B*51, B*5301, B*5401, B*5501, B*5502, B*5601, B*6701, B*7801, B*0702, B*5101, B*5602
B44: B*3701, B*4402, B*4403, B*60 (B*4001), B61 (B*4006)
A1: A*0102, A*2604, A*3601, A*4301, A*8001
A24: A*24, A*30, A*2403, A*2404, A*3002, A*3003
B27: B*1401-02, B*1503, B*1509, B*1510, B*1518, B*3801-02, B*3901, B*3902, B*3903-04, B*4801-02, B*7301, B*2701-08
B58: B*1516, B*1517, B*5701, B*5702, B58
B62: B*4601, B52, B*1501 (B62), B*1502 (B75), B*1513 (B77)
상이한 HLA-수퍼타입 조합에 의해 제공되는 산출된 집단 커버리지를 표 IV (g)에 제시하였다.
[0121] 본 발명에서 "치료하다" 또는 "치료적" 및 이와 관련된 문법적 용어들은 생존 연장, 사망률 감소 및/또는 또 다른 치료기법의 부산물인 부작용의 감소와 같은 질병의 여하한 결과를 개선시키는 것을 의미하며 질병을 완전히 치유하는 것까지 요구하는 것은 아니다.
[0122] "트랜스제닉 동물" (예컨대, 마우스나 래트)은 임신중, 예컨대 배아 단계에서 동물 또는 그 동물의 선조대에 트랜스유전자를 도입시킨, 트랜스유전자를 함유하는 세포를 갖는 동물을 가리킨다. "트랜스유전자"는 트랜스제닉 동물이 그로부터 발달하는 세포의 게놈 내로 통합되는 DNA이다.
[0123] 본 발명에서, HLA 또는 세포성 면역 반응 "백신"은 본 발명의 펩타이드 하나 이상을 함유하거나 코딩하는 조성물이다. 이러한 백신의 수많은 구체예로는 하나 이상의 개별적 펩타이드의 칵테일; 폴리에피토프 펩타이드로 이루어진 본 발명의 하나 이상의 펩타이드; 또는 이러한 개별적 펩타이드나 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 예컨대 폴리에피토프 펩타이드를 코딩하는 미니유전자를 들 수 있다. "하나 이상의 펩타이드"에는 1-150 또는 그 이상의 정수, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145 또는 150개 이상의 본 발명의 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 지질화, 표적화 또는 기타 서열의 부가와 같은 방식에 의해 임의로 변형시킬 수 있다. 본 발명의 HLA 클래스 I 펩타이드는 세포독성 T 임파구와 헬퍼 T 임파구 두가지 모두의 활성화를 용이화하기 위해, HLA 클래스 II 펩타이드와 혼합하거나 이에 링크시킬 수 있다. HLA 백신 역시 예컨대 수지상 세포와 같은 펩타이드-펄스형 항원 제시 세포를 포함할 수 있다.
[0124] "변이체"라는 용어는 특정하여 설명된 단백질 (예컨대 도 1에 도시된 PSCA 단백질)의 대응 좌위(들)에 있어서 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기를 갖는 단백질과 같이, 설명된 종류 또는 표준체로부터 변이를 나타내는 분자를 가리킨다. 유사체는 변이체 단백질의 일례이다. 스플라이스 이소형과 단일 뉴클레오타이드 다형증 (SNPs)는 변이체의 또 다른 예이다.
[0125] 본 발명의 "PSCA-관련 단백질"에는 본 발명에서 명시된 것들 뿐만 아니라 본 발명에 개략된 방법 또는 기술분야에서 쉽게 이용할 수 있는 방법에 따라 과도한 실험 없이 분리/생산 및 특징화될 수 있는 대립유전자 변이체, 보존적 치환 변이체, 유사체 및 상동체가 포함된다. 상이한 PSCA 단백질 또는 그의 단편의 부분들이 조합된 융합 단백질과 PSCA 단백질과 이종 폴리펩타이드와의 융합 단백질도 포함된다. 이러한 PSCA 단백질은 집합적으로 PSCA-관련 단백질, 본 발명의 단백질 또는 PSCA이라 칭한다. "PSCA-관련 단백질"이란 아미노산 길이가 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 25개가 넘는 아미노산; 또는, 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 또는 576개 이상의 아미노산인 PSCA 단백질 서열 또는 폴리펩타이드 단편을 가리킨다.
II.) PSCA 폴리뉴클레오타이드
[0126] 본 발명의 한 관점에 따라 PSCA 유전자, mRNA 및/또는 코딩 서열의 전체 또는 일부에 대응하거나 상보적인, 바람직하게는 분리된 형태의 폴리뉴클레오타이드가 제공되며, 여기에는 PSCA-관련 단백질 및 그의 단편, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 관련 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, PSCA 유전자 또는 mRNA 서열 또는 그의 일부에 상보적인 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드, 및 PSCA 유전자, mRNA에 하이브리다이즈하거나 또는 PSCA 코딩 폴리뉴클레오타이드에 하이브리다이즈한느 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드가 포함된다 (집합적으로, "PSCA 폴리뉴클레오타이드"). 본 섹션에서는 모든 경우, 도 1에서 T는 U일 수 있다.
[0127] PSCA 폴리뉴클레오타이드의 예로는 다음을 들 수 있다; 도 1에 도시된 서열, 도 1에 도시된 PSCA의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 PSCA 폴리뉴클레오타이드; 도 1에 도시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드; 또는 T가 U인 도 1에 도시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드.
[0128] PSCA 단백질의 비교적 긴 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 예컨대, PSCA 단백질의 아미노산 약 1 (또는 20 또는 30 또는 40 등)부터 아미노산 약 20 (또는 30, 또는 40 또는 50 등)을 코딩하는 폴리펩타이드 또는 도 1 또는 도 3에 도시된 "변이체"를 기술 분야에 잘 알려진 다양한 기술에 의해 생산할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 단편들은 도 1에 도시된 바와 같은 PSCA 서열의 여하한 일부를 포함할 수 있다.
II.A.) PSCA 폴리뉴클레오타이드의 용도
II.A.1.) 유전학적 이상 (abnormalities)의 모니터링
[0129] 전술한 단락의 폴리뉴클레오타이드는 몇가지 상이한 특정 용도를 갖는다. 실시예에 제시된 염색체 위치에 관한 사람의 PSCA 유전자 지도를 "PSCA의 염색체 지도 작성"이라는 제하에 다루었다. 예컨대, 이 염색체에 대한 PSCA 유전자 지도로 인하여, PSCA 단백질의 다른 대역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 여러가지 암과 관련된 것으로 동정되는 비정상과 같은 이 염색체 자리의 세포유전학적 이상을 특징화시키는데 이용된다. 어떤 유전자에서는, 재배열을 비롯한 다양한 염색체 이상이 몇가지 상이한 암에서 빈번한 세포유전학적 이상으로서 동정된 바 있다 (예컨대, Krajinovic 외, Mutat. Res. 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson 외, Blood 86(10): 3905-3914 (1995) 및 Finger 외, P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988) 참조). 따라서, PSCA 단백질의 특정 대역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 이전보다 훨씬 더 높은 정확성으로, 악성 표현형에 기인하는 것일 수 있는 PSCA를 코딩하는 염색체 대역에서의 세포유전학적 이상을 잘 설명해주는 도구를 제공 할 수 있다. 이러한 측면에서, 이들 폴리뉴클레오타이드들은 보다 정교하고 덜 흔한 염색체 이상을 동정하기 위한 염색체 스크리닝법의 감도를 증대시키기 위한 기술 분야의 요구사항을 충족하는 것이다 (예컨대, Evans et al ., Am. J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994) 참조).
[0130] 또한, PSCA는 전립선암과 다른 암에서 고도로 발현하는 것으로 나타났기 때문에, PSCA 폴리뉴클레오타이드는 정상적인 조직 대 암 조직에서 PSCA 유전자 산물의 상태를 평가하는 방법에도 유용하다. 일반적으로, PSCA 단백질의 특정 대역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 하나 이상의 모티프를 함유하는 대역과 같은 PSCA 유전자의 특정 대역에 있어서의 변태 (예컨대 항원 등의 손실을 결과시키는 결실, 삽입, 점돌연변이 또는 변경)의 존재여부를 평가한다. 예시적인 평가법으로는 RT-PCR 분석법과 단일가닥 입체배열 다형성 (SSCP) 분석법을 모두 들 수 있으며 (예컨대, Marrogi et al ., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999) 참조), 이들 두가지는 모두 단백질 내의 이들 대역을 조사하기 위해, 단백질의 특정 대역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이용한다.
II.A.2.) 안티센스 구체예
[0131] 본 발명에서 개시된, 특별히 고려되는 다른 핵산 관련 구체예는 게놈 DNA, cDNAs, 리보자임 및 안티센스 분자와 또 다른 골격에 기초한 핵산 분자, 또는 천연 또는 합성 유래의 염기이며 PSCA의 RNA 또는 단백질 발현을 억제할 수 있는 분자가 이에 포함된다. 예컨대, 안티센스 분자는 염기쌍 의존 방식으로 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하는 포스포로티오에이트 유도체와 같은 비핵산 분자 또는 펩타이드 핵산 (PNAs)를 비롯한 RNA 또는 다른 분자일 수 있다. 당업자라면 본 발명에 개시된 PSCA 폴리뉴클레오타이드와 폴리뉴클레오타이드 서열을 이용하여 이들 부류의 핵산 분자를 쉽게 얻을 수 있다.
[0132] 안티센스 기술은 세포 내에 위치하는 표적 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 외인성 올리고뉴클레오타이드의 투여를 수반한다. "안티센스"라는 용어는 이러한 올리고뉴클레오타이드가 그들의 세포내 표적, 예컨대 PSCA에 상보적이라는 사실을 가리킨다. 예컨대, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; 및 Synthesis 1:1-5 (1988) 참조. 본 발명의 PSCA 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 개선된 암세포 성장 저해 활성을 나타내는 S-올리고뉴클레오타이드 (S-올리고의 포스포로티오에이트 유도체, Jack Cohen의 상기문헌 참조)와 같은 유도체를 포함한다. S-올리고 (뉴클레오사이드 포스포로티오에이트)는 포스페이트기의 비가교 산소 분자가 황원자에 의해 치환된 올리고뉴클레오타이드 (O-올리고)의 등전자 유사체이다. 본 발명의 S-올리고는 대응하는 O-올리고를 황전달 시약인 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드로 처리함으로써 제조할 수 있다. 예컨대, Iyer, R. P. et al ., J. Org. Chem. 55:4693-4698 (1990); and Iyer, R. P. et al ., J. Am. Chem. Soc. 112:1253-1254 (1990) 참조. 본 발명의 부가적인 PSCA 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 기술 분야에 공지인 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한다 (예컨대, Partridge et al ., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175 참조).
[0133] 본 발명의 PSCA 안티센스 올리고뉴클레오타이드들은 PSCA 서열이나 대응하는 mRNA의 최초 100개의 5' 코돈 또는 최후 100개의 3' 코돈에 상보적이고 이들과 안정하게 하이브리다이즈하는 RNA 또는 DNA일 수 있다. 비록 고도의 상보성이 바람직하긴 하지만, 절대적인 상보성이 요구되는 것은 아니다. 이 대역에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 사용하면 단백질 키나아제의 다른 조절 서브유닛을 특정하는 mRNA가 아니라 PSCA mRNA에 선택적으로 하이브리다이즈한다. 일 구체예에서, 본 발명의 PSCA 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PSCA mRNA에 하이브리다이즈하는 서열을 갖는 안티센스 DNA 분자의 15 내지 30-mer 단편들이다. 임의로, PSCA 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 PSCA의 최초 10개 5'코돈 또는 최후 10개 3' 코돈 중의 대역에 상보적인 30-mer 올리고뉴클레오타이드이다. 다른 한편, 안티센스 분자들은 PSCA 발현을 저해하는데 있어서 리보자임을 사용하도록 변형된다. 예컨대, L. A. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996) 참조.
II.A.3.) 프라이머 및 프라이머 쌍
[0134] 본 발명의 이들 뉴클레오타이드들의 추가의 특이적인 구체예들에는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 여하한 특이적 부분의 특이적 증폭을 가능케 해주는프라이머 및 프라이머쌍, 보노 발명의 핵산 분자들 또는 그의 여하한 일부에 특이적 또는 선택적으로 하이브리다이즈하는 프로브가 포함된다. 프로브들은 예컨대 방사능동위원소, 형광 화합물 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소와 같은 검출가능한 마커로 표지시킬 수 있다. 이러한 프로브와 프라이머들은 시료 중의 PSCA 폴리뉴클레오타이드의 존재 여부를 확인하는데, 그리고 PSCA 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위한 수단으로서 사용된다.
[0135] 이러한 프로브의 예로는 도 1에 도시된 사람 PSCA cDNA 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 들 수 있다. PSCA mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍의 예는 실시예에서 설명되어 있다. 당업자라면 잘 이해하는 바와 같이, 본 발명에서 제공되는 서열에 기초해서, 그리고 PSCA mRNA를 증폭 및/또는 검출하는데 있어 대단히 많은 여러가지 프라이머와 프로브가 사용될 수 있다.
[0136] 본 발명의 PSCA 폴리뉴클레오타이드는 다양한 목적에 유용하며, 예컨대 PSCA 유전자(들), mRNA(들), 또는 그의 단편을 증폭 및/또는 검출하기 위한 프로브 및 프라이머로서; 전립선암 및 기타 암의 진단 및/또는 예지를 위한 시약으로서; PSCA 폴리뉴클레오타이드의 발현에 지향될 수 있는 코딩 서열로서; PSCA 유전자(들)의 발현 및/또는 PSCA 전사물의 번역을 조절 또는 저해하기 위한 도구로서; 그리고 치료제로서 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
[0137] 본 발명은 본 발명에서 설명된 여하한 프로브의, 사람 또는 다른 포유동물과 같은 천연원으로부터의 PSCA 또는 PSCA 관련 핵산 서열 및, 및 사용된 프로브에서 발견되는 모든 또는 대부분의 서열을 포함할 분리된 핵산 서열 자체를 동정 및 분리하기 위한 용도를 포함한다.
II.A.4.) PSCA-코딩 핵산 분자의 분리
[0138] 본 발명에 설명된 PSCA cDNA 서열은 PSCA 유전자 산물 동족체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 스플라이스된 이소형, 대립유전자 변이체, 및 PSCA 유전자 산물의 돌연변이 형태 및 PSCA-관련 단백질의 유사체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라, PSCA 유전자 산물(들)을 코딩하는 다른 폴리뉴클레오타이드의 분리도 가능케 해준다. PSCA 유전자를 코딩하는 전장 cDNA를 분리하는데 사용될 수 있는, 다양한 분자 클로닝 방법은 잘 알려져 있다 (예컨대, Sambrook, J. 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel 외, Eds., Wiley and Sons, 1995). 예를 들어, 시판되는 클로닝 시스템 (예컨대 Lambda ZAP Express, Stratagene)을 이용하는 람다 파지 클로닝 기법이 간편하게 이용될 수 있다. PSCA 유전자 cDNAs를 함유하는 파지 클론은 표지된 PSCA cDNA 또는 그의 단편으로 프로빙시킴으로써 동정가능하다. 예컨대, 일 구체예에서, PSCA cDNA (예컨대 도 1) 또는 그의 일부를 합성하여 프로브로서 사용함으로써 PSCA 유전자에 대응하는 중복 및 전장 cDNA를 도출할 수 있다. PSCA 유전자는 그 자체로 게놈 DNA 라이브러리, 세균 인공 염색체 라이브러리 (BACs), 효모 인공 염색체 라이브러리 (YACs), 등을 PSCA DNA 프로브 또는 프라이머를 이용하여 스크리닝함으로써 분리할 수 있다.
II.A.5.) 재조합 핵산 분자 및 숙주-벡터계
[0139] 본 발명은 또한 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, YACs, BACs, 및 기술 분야에 공지인 다양한 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터를 비롯하여, PSCA 폴리뉴클레오타이드, 그의 단편, 유사체 또는 동족체를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자, 및 이러한 재조합 DNA 또는 RNA 분자에 의해 형질전환 또는 형질 감염된 세포도 제공한다. 이러한 분자의 제조 방법은 잘 알려져 있다 (예컨대, Sambrook 외, 1989, 상기문헌 참조).
[0140] 본 발명은 또한 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포 중에서 PSCA 폴리뉴클레오타이드, 그의 단편, 유사체 또는 동족체를 함유하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주-벡터계도 제공한다. 적절한 진핵 숙주 세포의 예로는 효모 세포, 식물 세포 또는 동물 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포 (에컨대, Sf9 또는 HighFive 세포와 같은 배큘로바이러스-감염가능한 세포)를 들 수 있다. 적절한 포유동물 세포의 예로는 DU145 및 TsuPr1과 같은 다양한 전립선 암세포주, 기타의 형질 감염가능한 또는 형질도입가능한 전립선 암세포주, 일차 세포 (PrEC) 및 재조합 단백질 발현에 통상적으로 사용되는 몇가지 포유동물 세포 (예컨대, COS, CHO, 293, 293T 세포)를 들 수 있다. 보다 구체적으로, PSCA 코딩 서열 또는 그의 단편, 유사체 또는 동족체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 통상적으로 사용되거나 당업계에 널리 알려진 몇가지 숙주-벡터계를 이용하여 PSCA 단백질이나 그의 단편을 만드는데 이용할 수 있다.
[0141] PSCA 단백질 또는 그의 단편을 발현시키는데 적합한 광범위한 숙주-벡터계가 입수가능하며, 그 예가 예컨대 Sambrook 외, 1989, 상기문헌; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, 상기문헌에 기재되어 있다. 바람직한 포유동물 발현 벡터의 예로는 pcDNA 3.1 myc-His-tag (Invitrogen) 및 레트로바이러스 벡터pSRatkneo (Muller 외, 1991, MCB 11:1785)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이들 발현 벡터를 사용하여, 예컨대 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 및 TsuPr1를 비롯한 몇가지 전립선암 및 비전립선 세포주에서 PSCA를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 숙주-벡터계는 PSCA 단백질 또는 그의 단편을 생산하는데 유용하다. 이러한 숙주-벡터계를 이용하여 PSCA 및 PSCA 돌연변이 또는 유사체의 기능적 특성을 연구할 수 있다.
[0142] 재조합 인간 PSCA 단백질 또는 그의 유사체나 동족체 또는 단편은 PSCA-관련 뉴클레오타이드를 코딩하는 구조물로 포유동물 세포를 형질 감염시킴으로써 얻을 수 있다. 예컨대, 293T 세포를 PSCA 또는 그의 단편, 유사체 또는 동족체를 코딩하는 발현 플라스미드로 형질 감염시켜 293T 세포에서 PSCA-관련 단백질을 발현시킨 다음, 이 재조합 PSCA 단백질을 표준 정제 기술 (예컨대 항PSCA 항체를 이용한 친화도 정제)에 따라 분리하는 것이다. 또 다른 구체예에서는 PSCA 코딩 서열을 레트로바이러스 벡터인 pSRaMSVtkneo 내로 서브클로닝시키고 PSCA 발현 세포주 확립을 위한 NIH 3T3, TsuPr1, 293 및 rat-1과 같은 다양한 포유동물 세포주를 감염시킨다. 기술 분야에 알려진 기타 다양한 발현 시스템들 역시 사용가능하다. PSCA 코딩 서열에 인 프레임 연결된 선도 펩타이드를 코딩하는 발현 구조물을 이용하여 재조합 PSCA 단백질의 분비 형태를 제조할 수 있다.
[0143] 전술한 바와 같이, 유전자 코드의 중복성은 PSCA 유전자 서열의 다양성을 제공해준다. 특히, 특이적인 숙주종은 종종 특이적인 코돈 선호도를 갖기 때문에, 개시된 서열을 소망 숙주에 바람직하게 적응시킬 수 있다. 예컨대, 바람직한 유사체 코돈 서열은 일반적으로 보다 빈번한 코돈으로 대체되는 희귀한 코돈 (즉, 소망되는 숙주의 공지 서열에서 약 20% 미만의 사용 빈도를 갖는 코돈)을 갖는다. 특정종에 있어서의 코돈 선호도는 예컨대, URL dna.affrc.go.jp/~nakamura/codon.html과 같이 인터넷 상에서 입수가능한 코돈 사용표를 이용함으로써 산출할 수 있다.
[0144] 부가적인 서열 변형이 세포성 숙주에서의 단백질 발현을 증강시키기 위해 알려져 있다. 이들의 예로는 거짓 폴리아데닐화 시그널, 엑손/인트론 스플라이스 좌위 시그널, 트랜스포존 유사 반복물, 및/또는 유전자 발현에 해로운 잘 특징화된 기타 서열을 들 수 있다. 서열의 GC 함량은 숙주 세포에서 발현되는 공지 유전자를 참조로 산출되는 바와 같이, 주어진 세포성 숙주에 대해 평균적인 수준으로 조절한다. 가능하다면, 예상되는 헤어핀 2차 mRNA 구조가 회피되도록 서열을 변형시킨다. 다른 유용한 변형예로는 Kozak, Mol . Cell Biol ., 9:5073-5080 (1989)에 설명된 바와 같이, 오픈 리딩 프레임 개시부에 번역 개시 콘센서스 서열을 부가하는 것을 들 수 있다. 당업자라면 진핵 리보좀은 5' 근위부 AUG 코돈에서만 번역을 개시한다는 일반적 규칙은 드문 조건에서만 폐기됨을 이해할 것이다 (예컨대, Kozak PNAS 92(7): 2662-2666, (1995) and Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987) 참조).
III.) PSCA-관련 단백질
[0145] 본 발명의 또 다른 측면은 PSCA 관련 단백질을 제공한다. PSCA 단백질의 특정 구체예는 도 1, 바람직하게는 도 1A에 도시된 바와 같은 인간의 PSCA의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또는, PSCA 단백질의 구체예들은 도 1에 도시된 PSCA의 아미노산 서열이 변경된 변이체, 동족체 또는 유사체 폴리펩타이드를 포함한다.
[0146] PSCA 폴리펩타이드의 구체예에는 다음이 포함된다: 도 1에 도시된 서열을 갖는 PSCA 폴리펩타이드, T가 U인 도 1에 도시된 PSCA의 펩타이드 서열; 도 1에 도시된 서열을 갖는 폴리펩타이드의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드; 또는 T가 U인 도 1에 도시된 서열을 갖는 폴리펩타이드의 적어도 10개의 인접 뉴클레오타이드들.
[0147] 아미노산 약어를 표 II에 나타내었다. 보존적 아미노산 치환은 단백질의 배열이나 기능을 변경함이 없이 그 단백질 중에서 빈번하게 수행된다. 본 발명의 단백질들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개의 연속적 치환을 포함할 수 있다.
[0148] 본 발명의 구체예들은 아미노산 삽입, 결실 및 치환을 갖는 폴리펩타이드와 같은 PSCA 단백질의 광범한 기술상 허용되는 변이체 또는 유사체를 포함한다. PSCA 변이체는 좌위 지향된 돌연변이, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이와 같은 공지 방법을 이용하여 만들 수 있다. 좌위 지향적 돌연변이 (Carter 외, Nucl . Acids Res ., 13:4331 (1986); Zoller 외, Nucl . Acids Res ., 10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 (Wells 외, 유전자, 34:315 (1985)), 제한효소 선택 돌연변이 (Wells 외, Philos . Trans . R. Soc . London SerA, 317:415 (1986)) 또는 기타 공지 기술을 클론된 DNA에 대해 수행하여 PSCA 변이체 DNA를 제조할 수 있다.
[0149] 단백질-단백질 상호작용과 같은 특이적인 생물학적 활성과 연관된 인접 서열과 함께 하나 이상의 아미노산을 동정하는데 스캐닝 아미노산 분석법을 사용할 수도 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 소형의 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산에는 알라닌, 글라이신, 세린, 및 시스테인이 포함된다. 알라닌은 베타-탄소의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 변형을 덜 일으키기 때문에 대체로 이 그룹 중에서도 선호되는 스캐닝 아미노산이다. 알라닌은 또한 일반적으로 가장 흔한 아미노산이기 때문에도 바람직하다. 또한, 이것은 매립부와 노출부 모두에서 발견된다 (Creighton, The Proteins , (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). 알라닌 치환에 의해 변이체가 적정량으로 생산되지 못할 경우 등전 아미노산을 사용할 수 있다.
[0150] 본 발명에서 정의된 바와 같이, PSCA 변이체, 유사체 또는 상동체는 도 1의 아미노산 서열을 갖는 PSCA 단백질과 "교차 반응성"인 에피토프를 적어도 한개 갖는다는 독특한 속성을 갖는다. 본 문장에서 "교차 반응성"이라는 의미는 PSCA 변이체에 특이적으로 결합하는 T 세포 또는 항체가 도 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는 PSCA 단백질에도 특이적으로 결합함을 의미한다. 폴리펩타이드가 출발 PSCA 단백질에 특이적으로 결합하는 T 세포나 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 더 이상 함유하지 않게 되면, 그 폴리펩타이드는 더 이상 도 1에 도시된 단백질의 변이체가 아니다. 당업자라면 단백질을 인식하는 항체들이 여러가지 크기의 에피토프에 결합한다는 것과, 인접하건 인접하지 않건, 약 4개 또는 5개의 아미노산 정도의 그루핑이 최소 에피토프 중의 전형적인 아미노산의 전형적인 수인 것으로 간주됨을 이해할 것이다. 예컨대, Nair 외, J. Immunol 2000 165(12): 6949-6955; Hebbes 외, Mol Immunol (1989) 26(9):865-73; Schwartz 외, J Immunol (1985) 135(4):2598-608 참조.
[0151] 다른 부류의 PSCA 관련 단백질 변이체는 도 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편과 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 또는 그 이상의 유사성을 공유한다. PSCA 단백질 변이체 또는 유사체의 또 다른 특정 부류는 본 발명에서 설명되거나 기술 분야에 현지 공지된 하나 이상의 PSCA 생물학적 모티프를 함유한다. 따라서, 본 발명은 출발 단편에 대해 변경된 기능 (예컨대 면역원성) 특성을 갖는 PSCA 단편 (핵산 또는 아미노산)의 유사체도 포괄한다. 현재 또는 앞으로 기술의 일부가 될 모티프도 도 1의 핵산 또는 아미노산 서열에 적용될 것으로 생각된다.
[0152] 전술한 바와 같이, 본 발명의 구체예들은 도 1에 도시된 PSCA 단백질의 전장 미만의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 예컨대, 본 발명의 대포적인 구체에들은 도 1에 도시된 PSCA 단백질의 여하한 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 인접 아미노산을 갖는 펩타이드/단백질을 포함한다.
[0153] PSCA 관련 단백질은 표준 합성 기술을 이용하거나 기술 분야에 잘 알려진 화학적 절단법을 이용하여 생산된다. 또는, 재조합법을 이용하여 PSCA 관련 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 만들수도 있다. 일례에서, 핵산 분자는 PSCA 단백질 (또는 그의 변이체, 상동체 또는 유사체)의 소정 단편을 생산하는 수단을 제공한다 .
III.A.) 모티프-산생 단백질 구체예
[0154] 본 명세서에 개시된 본 발명의 부가적인 구체예에는 도 1에서 제시된 PSCA 폴리펩타이드 서열 중에 함유된 하나 이상의 생물학적 모티프의 아미노산 잔기를 포함하는 PSCA 폴리펩타이드가 포함된다. 여러가지 모티프가 기술 분야에 알려져 있으며, 공공에게 접근가능한 몇군데의 인터넷 사이트 (예컨대, URL 주소: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; cbs.dtu.dk/; ebi.ac.uk/interpro/scan.html; expasy.ch/tools/scnpsit1.html; EpimatrixTM and EpimerTM , Brown University, brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; 및 BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/.)에 의해 이러한 모티프의 존재 여부에 대해 단백질을 평가하는 것이 가능하다.
[0155] 모티프를 산생하는 모든 PSCA 변이체 단백질의 서브서열들을 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 제시 및 동정하였다.
[0156] 표 V에 pfam 연구 (예컨대 URL 주소 pfam.wustl.edu/ 참조)에 기초한 몇가지 빈번하게 발생하는 모티프를 제시하였다. 표 V의 컬럼에 (1) 모티프명 약칭, (2) 모티프 패밀리의 상이한 구성원들 사이에서 발견되는 동질성 백분율, (3) 모티프명 또는 설명 및 (4) 가장 흔한 기능; (그 모티프가 위치와 관련이 있는 것이면 위치에 관한 정보도 포함시킴)을 수록하였다.
[0157] 전술한 PSCA 모티프를 하나 이상 함유하는 폴리펩타이드들은 전술한 PSCA 모티프들이 성장 조절불능과 연관이 있다는 관찰과, PSCA는 특정 암에서 과발현된다는 점에서 악성 표현형의 특이적인 특성을 조명하는데 유용하다 (예컨대 표 I 참조). 카제인 키나아제 II, cAMP 및 캠프(camp)-의존성 단백질 키나아제, 및 단백질 키나아제 C들은 악성 표현형의 발달과 연관이 있는 것으로 알려진 효소들의 예이다 (예컨대, Chen 외, Lab Invest., 78(2): 165-174 (1998); Gaiddon 외, Endocrinology 136(10): 4331-4338 (1995); Hall 외, Nucleic Acids Research 24(6): 1119-1126 (1996); Peterziel 외, Onco유전자 18(46): 6322-6329 (1999) and O'Brian, Oncol. Rep. 5(2): 305-309 (1998) 참조). 뿐만 아니라, 글리코실화 및 미리스토일화는 두가지 모두 암 및 암의 진행과 연관이 있는 단백질 변형이다 (예컨대, Dennis 외, Biochem. Biophys. Acta 1473(1):21-34 (1999); Raju 외, Exp. Cell Res. 235(1): 145-154 (1997) 참조). 아미드화는 암 및 암의 진행과 연관된 또 다른 단백질 변형이다 (예컨대, Treston 외, J. Natl. Cancer Inst. Monogr. (13): 169-175 (1992) 참조).
[0158] 또 다른 구체예에서, 본 발명의 단백질은 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 제시된 펩타이드와 같이, 기술 분야에 허용되는 방법에 따라 동정된 나 이상의 면역반응성 에피토프를 함유한다. CTL 에피토프는 특정된 HLA 대립유전제에 최적 결합할 수 있는 PSCA 단백질 내에서 펩타이드들을 동정하기 위한 특이적 알고리듬을 이용하여 결정될 수 있다 (예컨대, 표 IV; EpimatrixTM 및 EpimerTM, Brown University, URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html; 및 BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/. 참조) 뿐만 아니라, PSCA 분자에 대한 충분한 결합 친화성을 가지면서 면역원성 에피토프와 관련이 있는 펩타이드의 동정 공정은 기술 분야에 잘 알려져 있으며 과도한 실험 부담 없이 수행된다. 또한, 면역원성 에피토프인 펩타이드를 동정하기 위한 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 시험관내 또는 생체내에서 과도한 실험 없이 수행된다.
[0159] 면역원성을 변경시키기 위하여 이러한 에피토프의 유사체를 만드는 원리 역시 기술 분야에 공지이다. 예컨대, CTL 또는 HTL 모티프 (예컨대, 표 IV의 HLA 클래스 I 및 HLA 클래스 II 모티프/수퍼모티프)를 산생하는 에피토프로 시작한다. 에피토프를 특정한 하나의 좌위에서 아미노산을 치환하고 이를 그 위치에 특이적인 다른 아미노산으로 대체함으로써 에피토프를 유사화시킨다. 예컨대, 표 IV에 정의된 잔기에 기초할 때, 바람직한 잔기와 같은 다른 잔기로 결손 잔기를 치환할 수 있고; 덜 바람직한 잔기를 바람직한 잔기로 치환할 수 있으며; 또는 최초발생된 바람직한 잔기를 다른 바람직한 잔기로 대체시킬 수 있다. 치환은 일차 앵커 좌위 또는 펩타이드의 다른 좌위에서 일어날 수 있다: 예컨대, 표 IV 참조.
[0160] 광범한 참조문헌들이 목적하는 단백질 뿐만 아니라 그의 유사체에 있어서의 에피토프의 동정 및 생산에 관하 논의하고 있다. 예컨대, WO 97/33602 (Chesnut 외); Sette, Immunogenetics 1999 50(3-4): 201-212; Sette 외, J. Immunol. 2001 166(2): 1389-1397; Sidney 외, Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo 외, Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney 외, J. Immunol. 1996 157(8): 3480-90; 및 Falk 외, Nature 351: 290-6 (1991); Hunt 외, Science 255:1261-3 (1992); Parker 외, J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker 외, J. Immunol. 152:163-75 (1994)); Kast 외, 1994 152(8): 3904-12; Borras-Cuesta 외, Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander 외, J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander 외, PMID: 7895164, UI: 95202582; O'Sullivan 외, J. Immunol. 1991 147(8): 2663-2669; Alexander 외, Immunity 1994 1(9): 751-761 and Alexander 외, Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92 참조.
[0161] 본 발명의 관련 구체예는 표 IV(a), IV(b), IV(c), IV(d), 및 IV(h) 에 제시된 상이한 모티프들 및/또는 표 V-XVIII 및 XXII-LI의 예상된 CTL 에피토프 하나 이상, 및/또는 표 XLVIII-LI의 예상된 HTL 에피토프 하나 이상, 및/또는 기술 분야에 공지인 T 세포 결합 모티프 하나 이상의 조합으로 된 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 이들 모티프의 어느 한쪽에 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 잔기를 몇가지 포함하는 구체예들 역시 바람직하다 (예컨대, 모티프가 위치한 폴리펩타이드 구조물의 보다 큰 부분을 포함하는 것). 일반적으로, 모티프의 어느 한쪽 상의 N 말단 및/또는 C 말단 아미노산의 수는 아미노산 잔기 약 1 내지 약 100개, 바람직하게는 아미노산 잔기 약 5 내지 약 50개인 것이 좋다.
[0162] PSCA 관련 단백질은 다양한 형태로 구체화되나, 분리된 형태인 것이 바람직하다. 정제된 PSCA 단백질 분자는 실질적으로 항체, T 세포 또는 다른 리간드에 대한 PSCA의 결합력을 훼손시키는 다른 분자나 단백질을 함유하지 않는다. 분리 및 정제의 특성과 정도는 목적하는 용도에 좌우된다. PSCA 관련 단백질의 구체예는 정제된 PSCA 관련 단백질 및 기능적인 가용성 PSCA 관련 단백질을 포함한다. 일례에서, 기능적인 가용성 PSCA 단백질 또는 그의 단편은 항체, T 세포 또는 기타 리간드에 의해 결합되는 능력을 유지한다.
[0163] 본 발명은 또한 도 1에 도시된 PSCA 아미노산의 생물학적 활성 단편을 함유하는 PSCA 단백질도 제공한다. 이러한 단백질은 출발 PSCA 단백질과 연관된 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 생산을 유도할 수 있는 능력; 그러한 항체에 결합하는 능력; HTL 또는 CTL의 활성화를 도출하는 능력; 및/또는 출발 단백질에 특이적으로 결합하는 HTL 또는 CTL에 의해 인식되는 능력과 같은, 출발 PSCA 단백질의 특성을 나타낸다.
[0164] 특히 흥미로운 구조를 함유하는 PSCA 관련 폴리펩타이드는 예컨대 Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz or Jameson-Wolf 분석법 또는 면역원성에 기초한 방법을 비롯하여 기술 분야에 잘 알려진 다양한 분석 기술을 이용하여 예상 및/또는 동정할 수 있다. 이러한 구조를 함유하는 단편들은 PSCA에 결합하는 세포성 인자를 동정하거나 T 세포 또는 서브유닛 특이적인 항PSCA항체를 생산하는데 특히 유용하다. 예컨대, Hopp, T.P. 및 Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828의 방법을 이용함으로써, 친수성 프로파일을 작성하여, 면역원성 펩타이드 단편을 동정할 수 있다. Kyte, J. and Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132의 방법을 이용함으로써, 수치요법 프로파일을 작성하여 면역원서 펩타이드 단편을 동정할 수 있다. Janin J., 1979, Nature 277:491-492의 방법을 이용하여 접근가능한 잔기 백분율(%) 프로파일을 작성하여 면역원성 펩타이드 단편을 동정할 수 있다. 평균 유연성 프로파일을 Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255의 방법을 이용하여 작성ㅎ여, 면역원성 펩타이드 단편을 동정할 수 있다. 또한 Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294의 방법을 이용하여, 베타-턴 프로파일을 작성하여, 면역원성 펩타이드 단편을 동정할 수 있다.
[0165] CTL 에피토프는 특정 HLA 대립유전자에 최적으로 결합할 수 있는 PSCA 단백질 중의 펩타이드를 동정하는 특이적인 알고리듬을 이용하여 결정할 수 있다 (예컨대, World Wide Web URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/의 SYFPEITHI를 이용함으로써; 표 IV(A)-(E); EpimatrixTM 및 EpimerTM, Brown University, URL (brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); 및 BIMAS, URL bimas.dcrt.nih.gov/을 이용한다). 사람의 MHC 클래스 I 분자, 예컨대, HLA-A1, A2, A3, A11, A24, B7 및 B35 측면에서 제시되는 PSCA로부터의 펩타이드 에피토프가 예측되었다 (예컨대, 표 VIII-XXI, XXII-XLIX). 특히, PSCA 단백질의 완전한 아미노산 서열과 다른 변이체의 관련 부분, 즉, HLA 클래스 I 예측의 경우,점돌연변이 또는 엑손 정션 중 어느 한쪽에서 9개의 플랭킹 잔기, HLA 클래스 II 예측의 경우 그 변이에 대응하는 점돌연변이나 엑손 정션의 어느 한쪽의 14 플랭킹 잔기들을 URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/.의 SYFPEITHI 사이트에 더해서, 전술한 Bioinformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS) 웹사이트에서 발견되는 HLA Peptide Motif Search 알고리듬에 대입하였다.
[0166] HLA 펩타이드 모티프 연구 알고리듬은 HLA 클래스 I 분자의 그루브, 특히 HLA-A2의 특이적이니 펩타이드 서열의 결합에 기초하여 Dr. Ken Parker가 개발하였다 (예컨대, Falk 외, Nature 351: 290-6 (1991); Hunt 외, Science 255:1261-3 (1992); Parker 외, J. Immunol. 149:3580-7 (1992); Parker 외, J. Immunol. 152:163-75 (1994) 참조). 이 알고리듬은 수많은 기타의 HLA 클래스 I 분자 및 예상된 HLA-A2에 대한 결합에 대해 완전한 단백질 서열로부터의 8-mer, 9-mer, 및 10-mer 펩타이드의 위치선정 및 랭킹을 가능케한다. 많은 HLA 클래스 I 결합 펩타이드는 8-, 9-, 10 또는 11-mers이다. 예컨대, 클래스 II HLA-A2의 경우, 에피토프들은 좌위 2에서는 류신(L) 또는 메티오닌 (M), 그리고 C 말단에서는 발린 (V)이나 류신 (L)을 함유하는 것이 바람직하다 (예컨대, Parker 외, J. Immunol. 149:3580-7 (1992) 참조). PSCA 예상 결합 펩타이드의 선택된 결과를 본 명세서의 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 나타내었다. 표 V-XVIII 및 XXII-XLVIII에서, 선택된 후보들인 각각의 패밀리 구성원에 대해 9-mers와 10-mers를 그들의 위치, 각각의 특정 펩타이드의 아미노산 서열 및 평가된 결합 점수와 함께 나타내었다. 표 XLVI-XLIX에서, 각 패밀리 구성원에 대해 선택된 후보들, 15-mers을 그의 위치, 각각의 특정 펩타이드의 아미노산 서열, 및 평가된 점수와 함께 나타내었다. 결합 점수는 37℃, pH 6.5에서 펩타이드를 함유하는 복합체의 해리 시간의 절반에 대응한다. 결합 점수가 가장 높은 펩타이드들은 가장 장기간 동안 세포 표면상의 HLA 클래스 I에 가장 단단히 결합되는 것으로 예상되므로 T 세포 인식을 위한 최상의 면역원성 표적이 된다.
[0167] HLA 대립유전자에 대한 펩타이드의 실질적인 결합은, 항원-프로세싱 결함 세포주 T2상에서의 HLA 발현의 안정화에 의해 평가할 수 있다 (예컨대, Xue et al., Prostate 30:73-8 (1997) 및 Peshwa et al., Prostate 36:129-38 (1998) 참조). 특정 펩타이드의 면역원성은 수지상 세포와 같은 항원 제시세포의 존재 하에 CD8+ 세포독성 T 임파구 (CTL)의 자극에 의해 시험관내에서 평가할 수 있다.
[0168] 당업계에서 입수가능하거나 표 IV에 제시된 바와 같이 당 기술분야의 일부가 되는 BIMAS 사이트, EpimerTM 및 EpimatrixTM 사이트에 의해 예상되는 모든 에피토프 또는 HLA 클래스 I 또는 클래스 II 모티프에 의해 특정되는 모든 에피토프들은 (또는 World Wide Web 사이트 URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/, or BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/을 이용하여 결정되는) 본 발명에 따른 PSCA 단백질에 "적용 (applied)" 된다. 본 문맥상 "적용된다"라는 의미는 PSCA 단백질이, 예컨대, 당업자가 인식하는 바와 같이, 컴퓨터에 기반한 패턴 발견법에 의해 또는 가시적으로 PSCA 단백질을 평가한다는 것을 의미한다. HLA 클래스 I 모티프를 산생하는 8, 9, 10, 또는 11개 아미노산 잔기의 PSCA 단백질의 모든 서브서열 ㄸ는 HLA 클래스 II 모티프를 산생하는 9개 이상의 아미노산 잔기의 서브서열은 모두 본 발명의 범위에 속한다.
III.B.) PSCA 관련 단백질의 발현
[0169] 후술하는 실시예에서 설명되는 구체예 중에서, PSCA는 C 말단 6XHis 및 MYC 태그와 함꼐 PSCA를 코딩하는 CMV-구동 발현 벡터 (pcDNA3.1/mycHIS, Invitrogen 또는 Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN)와 같은 시판되는 발현 벡터로 형질 감염된 세포 (예컨대 293T 세포)에서 간편하게 발현될 수 있다. Tag5 벡터는 형질 감염된 세포에서 분비된 PSCA 단백질의 생산을 용이하게하는데 이용될 수 있는 igGK 분비 시그널을 제공한다. 배양 배지 중에 분비된 HIS-태그된 PSCA는 예컨대 표준 기술에 따라 니켈 컬럼을 이용함으로써 정제가능하다.
III.C.) PSCA 관련 단백질의 변형
[0170] 공유 변형 (covalent modifications)과 같은 PSCA 관련 단백질의 변형도 본 발명의 범위에 포함된다. 공유 변형의 한 종류는 PSCA 단백질의 N 또는 C 말단 잔기 또는 선택된 측쇄와 반응할 수 있는 유기 유도제와 PSCA 폴리펩타이드의 표적화된 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 본 발명의 범주에 드는 또 다른 종류의 PSCA 폴리펩타이드의 공유적 변형법은 본 발명의 단백질의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. PSCA의 또 다른 종류의 공유적 변형은 미국특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌과 같은 다양한 비단백질성 폴리머 중 하나에 PSCA 폴리펩타이드를 링크시키는 것을 포함한다.
[0171] 본 발명의 PSCA 관련 단백질을 변형시켜서 다른 이종 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열에 융합되는 PSCA를 포함하는 키메라 분자를 형성할 수 있다. 이러한 키메라 분자는 화학적으로 또는 재조합적으로 합성될 수 있다. 키메라 분자는 다른 종양 관련 항원 또는 그의 단편에 융합된 본 발명의 단백질을 가질 수 있다. 다른 한편, 본 발명에 따른 단백질은 그의 전장에 걸쳐, 도 1에 도시된 아미노산 또는 핵산 서열과 직접 상동적이지 않은 분자가 만들어지도록 PSCA 서열 (아미노산 또는 핵산)의 단편의 융합체를 포함할 수 있다. 이러한 키메라 분자는 PSCA의 동일한 서브서열을 복수개 함유할 수 있다. 키메라 분자는 고정 니켈이 시토카인 또는 성장 인자와 함께 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는, 폴리히스티딘 에피토프 태그와 PSCA 관련 단백질과의 융합체를 포함할 수 있다. 에피토프 태그는 일반적으로 PSCA 단백질의 아미노 또는 카르복실 말단에서 일반적으로 위치한다. 또 다른 구체예에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 대역과 PSCA 관련 단백질과의 융합체를 함유할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태의 경우 ("면역부착소"라고도 칭함), 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 대역일 수 있다. Ig 융합체는 Ig 분자내의 적어도 하나의 가변부 대신 PSCA 폴리펩타이드의 가용형 (트랜스막 도메인이 결실 또는 불활됨) 치환을 포함하므로 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 면역글로불린 융합체는 IgG1 분자의 힌지 CH2 및 CH3, 또는 힌지 CH1, CH2 및 CH3 대역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생산에 관해서는 예컨대 1995년 6월 27일자로 등록된 미국특허 5,428,130를 참조할 수 있다.
III.D.) PSCA-관련 단백질의 용도
[0172] 본 발명의 단백질들은 몇가지 상이한 특정 용도를 갖는다. PSCA는 전립선 및 기타 암에서 고도 발현되므로, PSCA 관련 단백질은 정상 조직 대 암 조직에서 PSCA 유전자 산물의 상태를 평가하는 방법에 사용되며, 따라서 악성 표현형을 조명할 수 있다. 일반적으로, PSCA 단백질의 특정 대역으로부터의 폴리펩타이드를 이용하여 그들 대역 (하나 이상의 모티프를 함유하는 대역)에서의 변태 (결실, 삽입, 점돌연변이등)의 존재 여부를 평가할 수 있다. 예시적인 분석법으로 정상 조직 대 암 조직에서 이 대역에 특징적인 사항을 평가하거나 에피토프에 대한 면역 반응을 도출하기 위해 PSCA 폴리펩타이드 서열 중에 함유된 생물학적 모티프 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 항체 또는 T 세포 표적화 PSCA 관련 단백질을 이용하는 것을 들 수 있다. 또는, PSCA 단백질의 생물학적 모티프의 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 PSCA 관련 단백질을 이용하여 PSCA의 대역과 상호반응하는 인자들을 스크리닝한다.
[0173] PSCA 단백질 단편/서브서열들은 PSCA 또는 그의 특정 구조 도메인에 결합하는 제제 또는 세포 인자를 동정하는데, 그리고 진단 분석, 암 백신 및 그러한 백신을 제조하는 방법을 비롯한 다양한 진단 용도 및 치료 용도(그러나 이에 한정되지 않음)에 특히 유용하다.
[0174] PSCA 유전자 또는 그의 유사체, 상동체 또는 단편이 코딩하는 단백질들은 항체 생산 및, 생산된 PSCA 유전자에 결합하는 세포 구성원과 기타 제제 및 리간드의 동정 을 비롯한 여러 용도를 갖는다. PSCA 단백질 또는 그의 단편에 대해 발생한 항체들은 진단 및 예후 분석과 표 I에 수록된 것들과 같은 PSCA 단백질의 발현으로 특징지어지는 인간의 암을 처리하는데 있어서의 조영법과 방법론에 있어 유용하다. 이러한 항체들은 세포내 발현될 수 있으므로 이러한 암을 앓는 환자들의 치료방법에 유용하다. PSCA 관련 핵산 또는 단백질 역시 HTL 또는 CTL 반응에서 유용하다.
[0175] 방사선면역분석법, 효소결합면역흡착법 (ELISA), 효소결합 면역형광법 (ELILFA), 면역세포화학법을 비롯하여, PSCA 단백질을 검출하는데 유용한 다양한 면역학적 분석법이 이용된다. 항체를 표지하여, PSCA 발현 세포를 검출할 수 있는 면역학적 조영 시약으로서 사용할 수 있다 (예컨대, 방사능섬광조영법 등에서). PSCA 단백질은 또한 후술되는 바와 같이, 암 백신을 생산하는데 특히 유용하다.
IV.) PSCA 항체
[0176] 본 발명의 또 다른 측면은 PSCA 관련 단백질에 결합하는 항체를 제공하는 것이다. 바람직한 항체들은 PSCA 관련 단백질에 특이적으로 결합하고 생리적 조건 하에서 PSCA 관련 단백질이 아닌 단백질이나 펩타이드에는 결합하지 않는다 (또는 약하게 결합함). 이러한 맥락에서, 생리적 조건의 예로는 다음이 포함된다: 1) 포스페이트 완충염수; 2) 25mM Tris 및 150 mM NaCl을 함유하는 Tris-완충염수; 또는 일반식염 (0.9% NaCl); 4) 사람의 혈청과 같은 동물 혈청; 또는 5) 1) 내지 4)의 조합체; 이러한 반응은 pH 7.5, 또는 pH 7.0 내지 8.0, 또는 pH 6.5 내지 8.5에서 일어나며; 또한, 이러한 반응은 4℃ 내지 37℃에서 일어난다. 예컨대, PSCA에 결합하는 항체는 그의 상동체나 유사체와 같은 PSCA 관련 단백질에 결합할 수 있다.
[0177] 본 발명의 PSCA 항체는 암 (예컨대 표 I 참조)의 진단 및 예후 분석, 및 조영방법학에 특히 유용하다. 마찬가지로, 이러한 항체는 다른 암의 치료, 진단 및/또는 예지에 유용하다 (PSCA가 이들 다른 암에서 발현 또는 과발현되는 한도 내에서). 뿐만 아니라, 세포내 발현된 항체 (예컨대, 단쇄 항체)는 진행된 전립선암 또는 전이된 전립선암과 같이 PSCA의 발현이 관련된 암을 치료하는데 치료적으로 유용하다.
[0178] 본 발명은 또한 PSCA 및 돌연변이 PSCA 관련 단백질의 검출과 정량화에 유용한 다양한 면역학적 분석법도 제공한다. 이러한 분석법은 적절한 PSCA 관련 단백질을 인식 및 이에 결합할 수 있는 하나 이상의 PSCA 항체를 포함할 수 있다. 이러한 분석법은 방사선면역분석법, 효소결합면역흡착법 (ELISA), 효소결합면역형광법 (ELIFA)을 비롯하여 기술 분야에 잘 알려진 다양한 면역학적 분석 포맷으로 수행된다.
[0179] 본 발명의 면역학적 비항체분석법은 또한 T 세포 면역원성 분석 (저해 또는 촉진)과 주조직접합복합체 (MHC) 결합 분석도 포함한다.
[0180] 또한, 전립선암 및 PSCA를 발현하는 기타의 암을 검출할 수 있는 면역학적 조영법 역시 본 발명에 의해 제공되며, 표지된 PSCA 항체를 이용하는 방사능섬광조영법을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 이러한 분석법은 전립선암과 같은 PSCA 발현 암을 검출, 모니터링 및 예지하는데 임상적으로 유용하다.
[0181] PSCA 항체는 PSCA 관련 단백질을 정제하고 PSCA 상동체 및 관련 분자를 분리하는 방법에서도 유용하다. 예컨대, PSCA 관련 단백질을 정제하는 방법은 고상 매트릭스에 커플링되어 있는 PSCA 항체를 PSCA 관련 단백질을 함유하는 용해물 또는 다른 용액과 함께, PSCA 항체가 PSCA 관련 단백질에 결합할 수 있는 조건 하에서 인큐베이션시키고; 고상 매트릭스를 세척하여 불순물을 제거한 다음; 커플링된 항체로부터 PSCA 관련 단백질을 용출시키는 것을 포함한다. 본 발명에 따른 PSCA 항체의 다른 용도로서 PSCA 단백질을 모사하는 항이디오타입 항체를 생산하는 것을 들 수 있다.
[0182] 항체 제조를 위한 다양한 방법이 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대, 분리 또는 면역접합 형태의 PSCA 관련 단백질, 펩타이드 또는 단편을 이용하여 적절한 포유동물 숙주를 면역화시킴으로써 항체를 만들 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, 및 Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989) 참조). 또한, PSCA GST-융합 단백질과 같은 PSCA의 융합 단백질도 사용할 수 있다. 특정 구체예에서는, 도 1의 아미노산 서열을 거의 또는 전부 포함하는 GST 융합 단백질을 제조한 다음, 이를 면역원으로서 사용하여 적절한 항체를 만든다. 또 다른 구체예에서는, PSCA 관련 단백질을 합성하여 면역원으로서 사용한다.
[0183] 또한, 기술 분야에 공지인 네이키드(naked) DNA 면역화기술을 이용하여 (정제된 PSCA 관련 단백질 또는 PSCA 발현 세포의 존재 또는 부재하에), 코딩된 면역원에 대한 면역 반응을 발생시키기도 한다 (Donnelly et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648 참조).
[0184] 항체 생산을 위한 PSCA 단백질의 특이적 대역을 선택하기 위하여 도 1에 도시된 바와 같은 PSCA 단백질의 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 예컨대, PSCA 아미노산 서열의 소수성과 친수성 분석을 이용하여 PSCA 구조의 친수성 대역을 동정한다. 면역원 구조 및 다른 대역과 도메인을 나타내는 PSCA 단백질은 Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz 또는 Jameson-Wolf 분석법과 같은 기술 분야에 잘 알려진 여러가지 방법에 의해 쉽게 동정할 수 있다. 친수성 프로파일은 Hopp, T.P. 및 Woods, K.R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:3824-3828의 방법을 이용하여 작성할 수 있다. 하이드로패씨시트 프로파일은 Kyte, J. 및 Doolittle, R.F., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-132의 방법에 의해 만들 수 있다. 접근가능한 잔기 백분율(%) 프로파일은 Janin J., 1979, Nature 277:491-492의 방법에 의해 작성가능하다. 평균 유연성 프로파일은 Bhaskaran R., Ponnuswamy P.K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255의 방법에 따라 만들 수 있다. 베타-턴 프로파일은 Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294의 방법으로 작성가능하다. 따라서, 이들 프로그램이나 방법 에 의해 동정된 각각의 대역은 본 발명의 범주에 속한다. PSCA 항체의 생산 방법을 이하의 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다. 면역원으로서 사용될 단백질이나 폴리펩타이드의 제조 방법은 기술 분야에 공지이다. BSA, KLH 또는 기타 담체 단백질과 같은 담체와 단백질과의 면역원성 컨쥬게이트를 제조하는 방법 역시 잘 알려져 있다. 몇가지 환경에서는, 예컨대 카르보디이미드 시약을 이용한 직접 접합이 사용된다; 다른 경우에는 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)사가 공급하는 것과 같은 링킹 시약이 효과적이다. PSCA 면역원의 투여는 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 적절한 기간 동안 적절한 애쥬번트를 사용하여 주사함으로써 종종 수행된다. 면역화 스케쥴이 진행되는 동안, 항체 적정을 수행하여 항체 형성 적합성을 결정할 수 있다.
[0185] PSCA 모노클로날 항체는 기술 분야에 잘 알려진 여러가지 수단에 의해 생산할 수 있다. 예컨대, 소망되는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화 세포주를 Kohler 및 Milstein의 표준 하이브리도마 기술 또는 잘 알려진 바와 같이 항체 생산 B 세포를 불멸화시키는 변형법을 이용하여 제조한다. 소망되는 항체를 분비하는 불멸화 세포주는 항원이 PSCA 관련 단백질인 면역분석법에 의해 스크리닝한다. 적절한 불멸화 세포배양체가 동정되면, 그 세포를 증폭시켜 시험관내 배양체 또는 복수로부터 항체를 생산할 수 있다.
[0186] 본 발명의 항체나 단편은 재조합 수단으로도 제조 가능하다. PSCA 단백질의 소망 대역에 특이적으로 결합하는 대역들 역시 다중 종 기원의 키메라 또는 상보성 결정 대역 맥락에서 생산될 수 있다. 인간화되거나 인간의 PSCA 항체 역시 제조될 수 있고 치료 목적에 바람직하다. 쥐 및 기타 비인간 항체를, 비인간 항체 CDRs 하나 이상으로 대응하는 인간 항체 서열을 대체시킴으로써, 인간화시키는 방법은 잘 알려져 있다 (예컨대, Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536 참조). 또한, Carter et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 and Sims et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296도 참조할 수 있다.
[0187] 전적으로 인간 유래의 모노클로날 항체의 제조 방법은 파지 디스플레이법 및 트랜스제닉법을 포함한다 (Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 535-539 참조). 전적으로 인간 유래의 PSCA 모노클로날 항체는 대형 인간 Ig 유전자 조합 라이브러리를 이용하는 클로닝 기술에 의해 제조할 수 있다 (즉, 파지 디스플레이) (Griffiths and Hoogenboom, Building an in vitro immune system: human antibodies from phage display libraries. In: Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man, Clark, M. (Ed.), Nottingham Academic, pp 45-64 (1993); Burton and Barbas, Human Antibodies from combinatorial libraries. Id., pp 65-82). 전적으로 인간 유래의 PSCA 모노클로날 항체 역시, 1997년 12월 3일 공개된 Kucherlapati and Jakobovits et al.의 PCT 특허출원 WO98/24893에 설명된 사람의 면역글로불린 유전자 위치를 함유하도록 조작된 트랜스제닉 마우스를 이용하여 제조할 수 있다 (Jakobovits, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; 2000년 12월 19일 등록된 U.S. patents 6,162,963; 2000년 11월 12일 등록된 6,150,584; 및, 2000년 9월 5일 등록된 6,114,598호를 참조할 수 있다). 이 방법은 파지 디스플레이 기술에서 요구되는 시험관내 조작을 회피하며 고친화도의 정통한 사람 항체를 효과적으로 제조한다.
[0188] PSCA 관련 단백질과 PSCA 항체와의 반응성은 몇가지 공지 수단, 예컨대 PSCA 관련 단백질, PSCA 발현 세포 또는 그의 추출물을 적절히 이용하여 웨스턴 블롯, 면역침강법, ELISA, 및 FACS 분석법에 의해 수립할 수 있다. PSCA 항체 또는 그의 단편에 검출가능한 마커를 표지시키거나 두번째 분자에 접합시킬 수 있다. 적절한 검출가능한 마커로는 방사능동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 두개 이상의 PSCA 에피토프에 특이적인 이중특이적 항체들은 기술 분야에 일반적으로 알려진 방법을 이용하여 제조한다. 동종이량 항체 역시 기술 분야의 기술들을 교차 결합시켜 제조할 수 있다 (예컨대, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-2565).
[0189] 한가지 구체예에서, 본 발명은 Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.20, Ha1-4.121, Ha1-4.37로 동정된 모노클로날 항체에 관한 것으로, 이들을 (Federal Express를 통해) 2005년 5월 4일자로 American Type Culture Collection (ATCC)에 송달하여 각각 수탁번호 PTA-6698 및 PTA-6703 및 PTA-6699 및 PTA-6700 및 PTA-6701 및 PTA-6702을 부여받았다.
V.) PSCA 세포성 면역 반응
[0190] T 세포가 항원을 인식하는 메카니즘이 설명된 바 있다. 본 발명의 효율적인 펩타이드 에피토프 백신 조성물은 세계적인 인구 집단의 대단히 광범한 세그먼트에서 치료적 또는 예방적 면역 반응을 유도한다. 세포성 면역 반응을 이끌어내는 본 발명의 조성물의 가치와 효능에 대한 이해를 돕기 위하여, 면역학 관련 기술에 관한 간단한 리뷰를 이하에 제공하기로 한다.
[0191] HLA 분자와 펩타이드 항원과의 복합체는 HLA-제한형 T 세포에 의해 인식되는 리간드로서 작용한다 (Buus, S. et al., Cell 47:1071, 1986; Babbitt, B. P. et al., Nature 317:359, 1985; Townsend, A. and Bodmer, H., Annu. Rev. Immunol. 7:601, 1989; Germain, R. N., Annu. Rev. Immunol. 11:403, 1993). 단일 아미노산 치환형 항원 유사체에 대한 연구와 내인적으로 결합된, 천연 가공형 펩타이드의 서열 결정을 통하여, HLA 항원 분자에 특이적으로 결합하는데 필요한 모티프에 대응하는 중요한 잔기들을 동정하고 이를 표 IV에 제시하였다 (또한 예컨대, Southwood, et al., J. Immunol. 160:3363, 1998; Rammensee, et al., Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee et al., SYFPEITHI, World Wide Web at URL (134.2.96.221/scripts.hlaserver.dll/home.htm)로 접속가능; Sette, A. and Sidney, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, V. H., Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette, A. and Grey, H. M., Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992; Sinigaglia, F. and Hammer, J. Curr. Biol. 6:52, 1994; Ruppert et al., Cell 74:929-937, 1993; Kondo et al., J. Immunol. 155:4307-4312, 1995; Sidney et al., J. Immunol. 157:3480-3490, 1996; Sidney et al., Human Immunol. 45:79-93, 1996; Sette, A. and Sidney, J. Immunogeneics 1999 Nov; 50(3-4):201-12, Review를 참조할 수 있다).
[0192] 또한, HLA-펩타이드 복합체의 X선 결정그래프 분석에 의해 HLA 분자의 펩타이드 결합 틈새/그루브내에 포켓이 있으며, 이것은 대립유전자-특이적 방식으로, 펩타이드 리간드가 생성하는 잔기들을 수용한다는 것이 밝혀졌다; 이 잔기들은 이번에는 이들이 존재하는 펩타이드의 HLA 결합 능력을 결정한다 (예컨대, Madden, D.R. Annu . Rev . Immunol. 13:587, 1995; Smith, et al ., Immunity 4:203, 1996; Fremont et al., Immunity 8:305, 1998; Stern et al., Structure 2:245, 1994; Jones, E.Y. Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown, J. H. et al., Nature 364:33, 1993; Guo, H. C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8053, 1993; Guo, H. C. et al., Nature 360:364, 1992; Silver, M. L. et al., Nature 360:367, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257:927, 1992; Madden et al., Cell 70:1035, 1992; Fremont, D. H. et al., Science 257:919, 1992; Saper, M. A. , Bjorkman, P. J. and Wiley, D. C., J. Mol. Biol. 219:277, 1991 참조.)
[0193] 따라서, 클래스 I 및 클래스 II 대립유전자-특이적 HLA 결합 모티프, 또는 클래스 I 또는 클래스 II 수퍼모티프의 정의는 단백질 중 특정 HLA 항원(들)에 대한 결합과 연관되어 있는 대역들을 동정하도록 해준다.
[0194] 이리하여, HLA 모티프 동정 공정에 의해, 에피토프 기재 백신 후보를 동정하였다; 이러한 후보들은 결합 특성의 측정 및/또는 에피토프와 그의 대응 HLA 분자와의 연계 기간을 측정하기 위한 HLA-펩타이드 결합 분석에 의해 부가적으로 평가될 수 있다. 이들 백신 후보들 중에서도, 집단 커버능, 및/또는 면역원 관점에서 바람직한 특성을 갖는 에피토프들을 선별하기 위해 부가적인 확인 작업을 수행할 수 있다.
[0195] 세포성 면역원성을 평가하기 위해 다음을 비롯한 다양한 전략을 이용할 수 있다:
1)정상적인 개체로부터 일차 T 세포 배양체 평가 (예컨대, Wentworth, P. A. et al., Mol. Immunol. 32:603, 1995; Celis, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2105, 1994; Tsai, V. et al., J. Immunol. 158:1796, 1997; Kawashima, I. et al., Human Immunol. 59:1, 1998 참조). 이 공정은 정상적인 개체로부터의 말초 혈액 임파구 (PBL)를 수주일간 시험관내에서 항원 제시 세포 존재 하에 테스트 펩타이드로 자극하는 것을 포함한다. 이 기간 동안 활성화된 펩타이드에 특이적인 T 세포들을 예컨대, 펩타이드 민감형 표적 세포를 이용하는 51Cr-방출 분석 또는 림포카인-분석을 이용하여 검출한다.
2) HLA 트랜스제닉 마우스의 면역화 (예컨대, Wentworth, P. A. et al., J. Immunol. 26:97, 1996; Wentworth, P. A. et al., Int. Immunol. 8:651, 1996; Alexander, J. et al., J. Immunol. 159:4753, 1997 참조). 예컨대, 이러한 방법에서는 불완전 Freund' 애쥬번트 중의 펩타이드를 HLA 트랜스제닉 마우스에 피하 투여한다. 면역화한지 수주일 경과 후, 비장을 제거하고 테스트 화합물의 존재 하에 약 1주일간 시험관 배양한다. 내인성으로 생산되는 항원을 발현하는 표적 세포와 펩타이드 민감형 표적 세포와 관련된 61Cr-방출 분석과 같은 기술을 이용하여 펩타이드 특이적인 T 세포를 검출한다.
3) 효과적으로 예방접종된 면역 개체로부터 및/또는 만성적으로 아픈 환자로부터의 리콜 T세포 반응의 입증 (예컨대, Rehermann, B. et al., J. Exp. Med. 181:1047, 1995; Doolan, D. L. et al., Immunity 7:97, 1997; Bertoni, R. et al., J. Clin. Invest. 100:503, 1997; Threlkeld, S. C. et al., J. Immunol. 159:1648, 1997; Diepolder, H. M. et al., J. Virol. 71:6011, 1997 참조). 따라서, 리콜 반응은 질병으로 인해 항원에 노출되고 그로 인해 면역 반응을 "자연적으로' 일으키는 개체로부터의 PBL 또는, 항원에 대해 예방접종된 바 있는 환자로부터의 PBL을 배양함으로써 검출된다. 개체로부터의 PBL은 "나이브" T 세포와 비교되는 바와 같이, "메모리" T 세포의 활성화를 가능케 하기 위해 테스트 화합물 플러스 항원 제시 세포 (APC)의 존재 하에 1-2 주일간 시험관내에서 배양한다. 배양 말기에, 61Cr-방출과 관련된 펩타이드 민감형 표적, T 세포 증식 또는 림포카인 방출을 비롯한 분석법을 이용하여 T 세포 활성을 측정한다.
VI.) PSCA 트랜스제닉 동물
[0196] PSCA 관련 단백질을 코딩하는 핵산들도 트랜스제닉 동물이나 "녹 아웃" 동물을 제조하는데 이용될 수 있고, 이러한 동물은 다시 치료적으로 유용한 시약을 개발 및 스크리닝한느데 이용된다. 수립된 기술에 따라, PSCA를 코딩하는 cDNA를 이용하여 PSCA를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝한다. 이어서, 클로닝된 게놈 서열을 이용하여 PSCA를 코딩하는 DNA를 발현하는 세포를 함유하는 트랜스제닉 동물을 만들 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 마우스나 래트와 같은 동물의 제조 방법은 널리 실시되는 기술이 되었고, 예컨대, 1988년 4월 12일 등록된 미국특허 4,736,866 및 1989년 9월 26일 등록된 4,870,009에 설명되어 있다. 일반적으로, 조직 특이적 촉진제와 함께 PSCA 트랜스유전자 혼입을 위해 특정 세포를 표적화시킨다.
[0197] PSCA를 코딩하는 DNA의 증가된 발현 효과를 시험하기 위해 트랜스유전자 코딩 PSCA의 카피를 포함하는 트랜스제닉 동물을 이용할 수 있다. 이러한 동물들은 예컨대 그의 과발현과 관련있는 질병 상태로부터의 보호시킬 수 있을 것으로 여겨지는 시약에 대한 테스트 동물로서 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에 따라, 동물들을 시약으로 처리하고, 트랜스 유전자를 산생하는 미처리 동물과 비교하여, 감소된 병인 발생 조건에서 처리하여, 병일 발생 조건에 대한 잠재적인 치료적 매개가 나타날 것이다.
[0198] 또는, PSCA의 비인간 상동체를 이용하여 PSCA를 코딩하는 내인성 유전자와 그 동물의 배아 세포내로 도입된 PSCA를 코딩하는 변형된 게놈 DNA 간의 상동적 재조합의 결과로서 PSCA를 코딩하는 변형된 유전자 또는 결손 유전자를 갖는 PSCA "녹 아웃" 동물을 만들 수 있다. 예컨대, PSCA를 코딩하는 cDNA를 이용하여 수립된 기술에 따라 PSCA를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. PSCA를 코딩하는 게놈 DNA의 일부를 통합을 모니터링하는데 이용될 수 있는 선택가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 다른 유전자로 대체시키거나 결실시킬 수 있다. 일반적으로, 수 킬로베이스의 비변형 플랭킹 DNA (5' 및 3' 말단 모두에서)를 벡터 내에 포함시킨다 (상동적 재조합 벡터에 관해서는 예컨대, Thomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)참조). 벡터를 배아 줄기 세포주 (예컨대 전기영동에 의하여)에 도입하고, 내인성 DNA와 상동적으로 재조합된 도입 DNA를 갖는 세포를 선별한다 (예컨대, Li et al., Cell, 69:915 (1992) 참조). 선별된 세포들을 동물 (예컨대 마우스나 래트)의 포배에 주입하여 응집 키메라를 형성시킨다 (예컨대, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152 참조). 이어서 이 키메라 배아를 적절한 거짓임신 여성 대리모 동물에 이식하여, 배아를 "녹 아웃" 동물는 기간 동안 키운다. 그의 배아 세포 중에서 상동적으로 재조합된 DNA를 산생하는 자손들은 스트랜드 기술에 의해 동정가능하며 그 동물의 모든 세포들이 상동적으로 재조합된 DNA를 함유하도록 키울 수 있다. 녹 아웃 동물들을 예컨대, 특정 질병 조건에 대한 그의 방어 능력 또는 PSCA 폴리펩타이드의 부재로 인한 질병 조건의 발병에 대해 특성화시킬 수 있다.
VII.) PSCA의 검출 방법
[0199] 본 발명의 또 다른 측면은 PSCA 폴리뉴클레오타이드 및 PSCA 관련 단백질의 검출 방법과 PSCA를 발현하는 세포의 동정 방법이다. PSCA의 발현 프로파일은 이를, 전이된 질환에 대한 진단 마커로서 이용할 수 있게 해준다. 따라서, PSCA 유전자 산물의 상태는 진전된 질환에 대한 감수성, 진행률, 및/또는 종양 공격성을 비롯한 다양한 인자를 예측하는데 유용한 정보를 제공해준다. 본 명세서에 상술된 바와 같이, 환자 표본 에 있어서의 PSCA 유전자 산물의 상태는 면역조직화학분석법, 인 시투 하이브리다이제이션을 비롯한 다양한 노던 블라팅 기술, RT-PCR 분석법 (예컨대 레이저 포획 마이크로절단 시료에 대한 분석), 웨스턴 블롯 분석 및 조직 오레이 분석을 비롯하여, 기술 분야에 공지인 다양한 프로토콜에 의해 분석할 수 있다.
[0200] 보다 구체적으로, 본 발명은 정자, 뼈, 전립선 및 기타 조직, 뇨, 정액, 세포 조제물 등과 같은 생물학저거 시료 중에서 PSCA 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 분석법을 제공한다. 검출가능한 PSCA 폴리뉴클레오타이드로는 예컨대, PSCA 유전자 또는 그의 단편, PSCA mRNA, 대체 슬라이스 변이체 PSCA mRNA, 및 PSCA 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자를 들 수 있다. PSCA 폴리뉴클레오타이드의 증폭 및/또는 존재여부를 검출하는 여러가지 방법이 기술 분야에 잘 알려져 있으며 본 발명의 이러한 관점에서 실시될 수 있다.
[0201] 일 구체예에서, 생물학적 시료 중에서 PSCA mRNA를 검출하기 위한 방법은 적어도 하나의 프라이머를 이용하여 역전사에 의해 시료로부터 cDNA를 생산하고; 상기와 같이 생산된 cDNA를, 그 안의 PSCA cDNAs를 증폭시키기 위해 센스 및 안티센스 프라이머로서 PSCA 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 증폭시키고; 증폭된 PSCA cDNA의 존재 여부를 검출하는 것을 포함하여 이루어진다. 임의로, 증폭된 PSCA cDNA의 서열을 결정할 수 있다.
[0202] 또 다른 구체예에서, 생물학적 시료 중의 PSCA 유전자를 검출하는 방법은 먼저 시료로부터 게놈 DNA를 분리하고; 분리된 게놈 DNA를, 센스 및 안티센스 프라이머로서 PSCA 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 증폭시키고; 증폭된 PSCA 유전자의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하여 이루어진다. PSCA 뉴클레오타이드 서열 (예컨대 도 1)로부터 여하한 수의 적절한 센스 및 안티센스 프로브 조합을 설계할 수 있으며, 이러한 목적으로 사용할 수 있다.
[0203] 본 발명은 또한 조직 또는 기타 생물학적 시료, 예컨대, 혈청, 정액, 뼈, 전립선, 뇨, 세포 조제물 등에서의 PSCA 단백질의 존재 여부를 검출하는 분석법도 제공한다. PSCA 관련 단백질의 검출 방법 역시 공지이며 예컨대 면역침강법, 면역조직화학분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 분자 결합 분석법, ELISA, ELIFA 등을 들 수 있다. 예컨대, 생물학적 시료 중에 PSCA 관련 단백질이 존재하는지를 검출하는 방법은 먼저 시료를 PSCA 항체, 그의 PSCA 반응성 단편 또는 PSCA 항체의 항원 결합 대역을 함유하는 재조합 단백질과 접촉시키고; 이어서 시료 중의 PSCA 관련 단백질의 결합을 검출하는 단계를 포함하여 이루어진다.
[0204] PSCA를 발현하는 세포의 동정 방법 역시 본 발명의 범주에 포괄된다. 일 구체예에서, PSCA 유전자를 발현하는 세포를 동정하기 위한 분석법은 세포 중 PSCA mRNA의 존재여부를 검출하는 단계를 포함한다. 세포 중 특정 mRNAs의 검출 방법은 공지이며, 예컨대, 상보적인 DNA 프로브를 이용하는 하이브리다이제이션 분석법 (예컨대 표지된 PSCA 리보프로브를 이용하는 인 시투 하이브리다이제이션, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 분석법 (예컨대, PSCA에 특이적인 상보적 프라이머를 이용하는 RT-PCR, 및 예컨대 가지달린 DNA, SISBA, TMA 등과 같은 기타 증폭형 검출 방법)이 이에 포함된다. 또는, PSCA 유전자를 발현하는 세포의 동정 분석법은 세포에 의해 분비되거나 세포 내의 PSCA 관련 단백질의 존재 여부를 검출하는 것을 포함한다. 단백질의 다양한 검출 방법이 기술 분야에 잘 알려져 있으며 PSCA 관련 단백질 및 PSCA 관련 단백질을 발현하는 세포의 검출에 이용될 수 있다.
[0205] PSCA 발현 분석법은 또한 PSCA 유전자 발현을 조절하는 제제를 동정 및 평가하기 위한 도구로서도 유용하다. 예컨대, PSCA 발현은 전립선암에서 유의적으로 상향조절되며, 표 I에 수록된 조직의 암에서 발현된다. 암세포에서의 PSCA의 발현 또는 과발현을 억제하는 분자 또는 생물학적 제제를 동정하는 것은 치료적으로 가치가 있다. 예컨대, 이러한 제제는 RT-PCR, 핵산 하이브리다이제이션 또는 항체 결합에 의한 PSCA 발현을 정량하는 스크린을 사용함으로써 동정가능하다.
VIII.) PSCA 관련 유전자 및 이들의 산물의 상태를 모니터링하는 방법
[0206] 종양발생(oncogenesis)은 세포 성장이 점진적으로 조절불가하게 되어, 세포가 정상적인 생리적 상태로부터 전암단계로 진행한 다음 암 단계로 진행하는 다단계 프로세스로 알려져 있다 (예컨대, Alers et al., Lab Invest. 77(5): 437-438 (1997) 및 Isaacs et al., Cancer Surv. 23: 19-32 (1995) 참조). 이러한 맥락에서, 세포성장의 조절 곤란 (암에서의 비정상적인 PSCA 발현과 같은)의 입증을 위하여 생물학적 시료를 검사하는 것은 치료적 선택지가 보다 제한되거나 예후가 악화되는 단계로 암이 진행된 것과 같은 질병 상태가 되기 전에 이러한 비정상적인 생리상태를 조기 발견할 수 있게 해준다. 이러한 검사에서, 목적하는 생물학적 시료 중의 PSCA의 상태를 예컨대, 대응하는 정상 시료 (예컨대, 어떤 질병에 영향을 받지 않은 그 개체로부터의 시료 또는 다른 개체로부터의 시료) 중의 PSCA 상태와 비교할 수 있다 생물학적 시료 중에서 PSCA의 상태를 변경함으로써 조절곤란한 세포 성장 증거를 제공한다. 질병에 걸리지 않은 생물학적 시료를 정상 시료로서 이용하는 것에 더하여, mRNA 발현의 소정의 정상 수준과 같은 소정의 표준값을 이용하여 시료 중의 PSCA 상태를 비교할 수도 있다 (예컨대, Grever et al., J. Comp. Neurol. 1996 Dec 9; 376(2): 306-14 및 미국특허 5,837,501 참조).
[0207] 문맥상 "상태"라는 용어는 기술분야에서 수용되는 의미에 따르며 유전자 및 그의 산물의 상태나 조건을 칭하는 것이다. 일반적으로, 당업자는 유전자와 그의 산물의 조건이나 상태를 평가하기 위해 몇가지 변수들을 이용한다. 여기에는 발현된 유전자 산물의 위치 (PSCA 발현 세포의 위치를 포함한다) 및 발현된 유전자 산물 (PSCA mRNA, 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드)의 수준, 및 생물학적 활성이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 대체로, PSCA 상태의 변경에는 PSCA 및/또는 PSCA 발현 세포의 위치 변경 및/또는 PSCA mRNA 및/또는 단백질 발현의 증가가 포함된다.
[0208] 시료 중의 PSCA 상태는 면역조직화학분석법 인 시투 하이브리다이제이션, 레이저 포획 마이크로절단 시료에 대한 RT-PCR 분석법, 웨스턴 블롯 분석법 및 조직 어레이 분석법을 비롯한 여러가지 공지 기술에 의해 분석가능하나 이들 방법들로 제한되지 않는다. PSCA 유전자와 유전자 산물의 상태를 평가하는 일반적인 프로토콜은 예컨대, Ausubel 외 편., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (노던 블로팅), 4 (서던 블로팅), 15 (면역블로팅) 및 18 (PCR 분석)을 참조할 수 있다. 따라서, 생물학적 시료 중의 PSCA의 상태는 당업자라면 게놈 서던 분석 (예컨대, PSCA 유전자 중의 변태를 검사하기 위하여), PSCA mRNA의 노던 분석법 및/또는 PCR 분석법 (예컨대, PSCA mRNAs의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 발현 수준에서의 변경), 및 웨스턴 및/또는 면역조직화학 분석법 (예컨대 폴리펩타이드 서열의 변경, 시료 중의 폴리펩타이드 위치 변경, PSCA 단백질의 발현 수준 및/또는 PSCA 단백질과 폴리펩타이드 결합 파트너와의 연계 변경)을 이용하여 평가할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 검출가능한 PSCA 폴리뉴클레오타이드에는 예컨대, PSCA 유전자 또는 그의 단편, PSCA mRNA, 대체성 스플라이스 변이체, PSCA mRNAs, 및 PSCA 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자가 포함된다.
[0209] PSCA의 발현 프로파일은 PSCA로 하여금 국소 질환 및/또는 전이 질환에 대한 진단 마커로서의 역할을 하게 해주며 생물학적 시료 중의 종양유전자 잠재성 또는 그의 성장에 관한 정보를 제공해준다. 특히, PSCA의 상태는 특정 질환의 단계, 진행정도, 및/또는 종양 공격성에 관한 감수성을 예측하는데 유용한 정보를 제공해준다. 본 발명은 PSCA 상태를 결정하고 표 I에 수록된 조직의 암과 같은, PSCA를 발현하는 암을 진단하기 위한 분석법을 제공한다. 예컨대, PSCA mRNA는 정상적인 전립선 조직에 비해 전립선암 및 기타 암에서 굉장히 고도로 발현되기 때문에, 어떤 생물학적 시료 중의 PSCA mRNA 전사물 또는 단백질의 수준을 이용하여 PSCA 조절곤란을 겪는 질환을 진단할 수 있고, 적절한 치료적 옵션을 정의하는데 유용한 예후적 정보를 제공하는 것이 가능하다.
[0210] PSCA의 발현 상태는 형성이상세포, 전암세포 및 암세포의 존재여부, 단계 및 위치를 비롯한 정보를 제공해주어 질환의 여러 단계에 대한 감수성을 예측할 수 있게 해주고/또는 공격성을 가늠하게 해준다. 결론적으로, 본 발명은 한 측면에서 암과 같이, 세포 성장 조절이 곤란하다는 특징을 갖는 질병에 걸리거나, 걸린 것으로 의심되는 개체로부터의 시료와 같은 생물학적 시료 중의 PSCA 상태를 검사하기 위한 다양한 분자 수준의 예후 및 진단법에 관한 것이다.
[0211] 전술한 바와 같이, 생물학적 시료 중의 PSCA의 상태는 기술 분야에 잘 알려진 몇가지 방법으로 검사할 수 있다. 예컨대, 신체의 특정 부위로부터 채취한 생물학적 시료 중의 PSCA의 상태를, PSCA 발현 세포 (예컨대, PSCA mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포들)의 존재 여부에 대해 그 시료를 평가함으로써 검사할 수 있다. 이러한 검사는 예컨대 PSCA 발현 세포가, 그러한 세포 (예컨대 임파절)를 보통은 함유하지 않는 생물학적 시료에서 발견될 경우, 생물학적 시료 중의 PSCA의 상태의 이러한 변경은 종종 조절곤란한 세포 성장과 연관이 있는 것이므로 조절곤란한 세포 성장의 증거를 제공해줄 수 있다. 특히, 조절곤란한 세포 성장의 한가지 지표는 본래의 장기(예컨대 전립선)로부터 신체의 다른 부분 (예컨대 임파절)로 암 세포가 전이되는 것이다. 이러한 맥락에서, 예컨대, 잠재적인 임파절 전이가 전립선암 환자의 실질적인 비율에서 검출될 수 있으므로 조절곤란한 세포 성장의 증가는 중요할 수 있으며, 이러한 전이는 질병 진행의 공지 예측인자와 연계된다 (예컨대, Murphy et al., 전립선 42(4): 315-317 (2000);Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1): 17-28 (2000) and Freeman et al., J Urol 1995 Aug 154(2 Pt 1):474-8).
[0212] 한가지 측면에서, 본 발명은 조절곤란한 세포 성장 (예컨대 과다형성 또는 암)과 연관된 질병을 앓는 것으로 의심되는 개체로부터의 세포에 의해 발현되는 PSCA 유전자 산물의 상태를 측정한 다음 이렇게 측정된 상태를 대응하는 정상 시료 중의 PSCA 유전자 산물의 상태와 비교함으로써, PSCA 유전자 산물을 모니터링하는 방법을 제공한다. 정상 시료에 비해 테스트 시료 중에 비정상적인 PSCA 유전자 산물이 존재하면 이는 그 개체의 세포 중에 조절곤란한 세포 성장이 존재함을 가리키는 것이다.
[0213] 또 다른 측면에서, 본 발명은 대응하는 정상 세포나 조직에서의 발현 수준에 비해 테스트 세포 또는 조직 시료 중의 PSCA mRNA 또는 단백질 발현의 유의적인 증가를 검사하는 단계를 포함하는, 개체에 있어서 암의 존재 여부를 결정하는데 유용한 분석법을 제공한다. PSCA mRNA의 존재는 예컨대, 표 I에 수록된 조직들을 비롯한 조직 (그러나 이에 한정되지 않음)에서 평가된다. 이러한 조직 중 유의적인 PSCA 발현의 존재 여부는, 대응하는 정상 조직은 PSCA mRNA를 발현하지 않거나 발현한다 해도 낮은 수준으로 발현하므로, 암의 긴급성, 존재여부 및/또는 위중도를 지시하는데 유용하다.
[0214] 관련 구체예에서는, PSCA 상태를 핵산 수준이 아니라 단백질 수준에서 결정한다. 예컨대, 이러한 방법은 테스트 조직 시료에서 세포에 의해 발현된 PSCA 단백질의 수준을 측정하고, 이렇게 측정된 수준을 대응하는 정상 시료에서 발현된 PSCA의 수준과 비교하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, PSCA 단백질의 존재를 예컨대, 면역조직화학법에 의해 평가한다. PSCA 단백질 발현을 검출할 수 있는 PSCA 항체 또는 결합 파트너를 이러한 목적으로 기술분야에 잘 알려진 다양한 분석 포맷에 이용한다.
[0215] 또 다른 구체예에서는 생물학적 시료 중의 PSCA 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열의 상태를, 이러한 분자 구조 중의 변태를 동정하기 위해 평가할 수 있다. 이러한 변태에는 삽입, 결실, 치환 등이 포함될 수 있다. 이러한 평가는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 중의 변태가 성장조절곤란한 표현형과 관련된 다수의 단백질에서 관찰되기 대문에 유용하다 (예컨대, Marrogi et al., 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8):369-378 참조). 예컨대, PSCA 서열 중의 돌연변이는 종양의 존재 또는 진행을 알리는 것이다. 이러한 분석법은 따라서 PSCA 중의 돌연변이가 종양 성장의 증가 또는 기능의 잠재적 손실을 가리켜주는 진단 및 예지적 가치를 갖는다.
[0216] 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 중의 변태를 관찰하기 위한 광범한 분석법이 잘 알려져 있다. 예컨대, PSCA 유전자 산물의 핵산이나 아미노산 서열의 크기 및 구조를 전술한 노던, 서던, 웨스턴, PCR 및 DNA 서열결정 프로토콜에 의해 관찰한다. 또한, 단일 가닥 배열 다형성 분석과 같은 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 중의 변태를 관찰하는 다른 방법도 기술 분야에 알려져 있다 (예컨대, 1999년 9월 7일자 등록된 미국특허 5,382,510 및 1995년 1월 17일 등록된 5,952,170).
[0217] 또한, 생물학적 시료 중의 PSCA 유전자의 메틸화 상태를 검사할 수 있다. 유전자 5' 조절 대역 중의 CpG섬의 비정상적인 탈메틸화 및/또는 과메틸화는 불멸화 및 형질전환 세포주에서 빈번히 발생하며, 여러가지 유전자의 발현을 변경시킬 수 있다. 예컨대, 파이-클래스 글루타치온 S-트랜스퍼라제 (정상적인 전립선에서는 발현되지만 전립선 암종의 >90%에서는 발현되지 않는 단백질)의 프로모터 과메틸화는 이 유전자의 전사를 영구적으로 전사시키는 것으로 보이며 전립선 암종에서 가장 빈번히 검출되는 게놈 변형이다 (De Marzo et al., Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)). 또한, 이러한 변경은 고급 전립선 상피내종양 (PIN)의 적어도 70%에서 존재한다 (Brooks et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536). 또 다른 예에서, LAGE-I 종양 특이적인 유전자 (정상적인 전립선에서는 발현되지 않지만 전립선암의 25-50%에서는 발현되는)의 발현은 임파아구 세포에서 데옥시-아자시티딘에 의해 유도되는데, 이는, 체액성 발현이 탈메틸화에 기인함을 시사하는 것이다(Lethe et al., Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)). 유전자의 메틸화 상태를 검사하는 다양한 분석법이 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대, 서던 하이브리다이제이션 접근법에서, 메틸화 CpG 좌위를 함유하는 서열들을 절단하지 못하는 메틸화-민감성 제한 효소를 이용하여 CpG섬의 메틸화 상태를 평가할 수 있다. 또한, MSP (메틸화 특이적 PCR)는 주어진 유전자의 CpG섬에 존재하는 모든 CpG 좌위의 메틸화 상태를 신속하게 프로파일링할 수 있다. 이 방법은 소듐 바이설파이트에 의한 DNA의 초기 변형 (메틸화되지 않은 모든 시토신을 우라실로 변형시킬 것이다)에 이어 메틸화 DNA 대 비메틸화 DNA에 특이적인 플라이머들을 이용한 증폭 단계를 수행하는 것이다. 메틸화 간섭과 관련된 프로토콜은 또한 예컨대 Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995에도 설명되어 있다.
[0218] 유전자 증폭은 PSCA의 상태를 평가하는 부가적인 방법이다. 유전자 증폭은 예컨대, mRNA의 전사를 정량하기 위한 통상적인 서던 블로팅 또는 노던 블로팅에 의해 (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205), 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 본 발명에서 제공되는 서열들에 기초하여 적절하게 표지된 프로브를 이용하는 인 시투 하이브리다이제이션에 의해 시료 중에서 직접 측정된다. 또는 DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 비롯한 특이적인 듀플렉스들을 인식하는 항체들을 이용한다. 이러한 항체를 표지시켜 듀플렉스가 결합하는 표현에서 분석을 수행함으로써, 표면에 듀플렉스가 형성에 의해, 듀플렉스에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있다.
[0219] 예컨대, 노던, 도트 블롯 또는 RT-PCR 분석법을 이용하는 암세포의 존재여부에 대해 생검 조직 또는 말초 혈액을 간편하게 분석하여 PSCA 발현을 검사할 수 있다. RT-PCR 증폭가능한 PSCA mRNA가 존재한다는 것은 암 전구체의 존재를 가리키는 것이다. RT-PCR 분석법은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 말초 혈액 중의 종양 세포에 대한 RT-PCR 검출법은 사람의 몇가지 고형 종양에서의 진단 및 조작에서의 유용성에 관해 현재 평가중에 있다. 전립선암 분야에서, 여기에는 PSA와 PSM을 발현하는 세포들의 검색을 위한 RT-PCR 분석법이 포함된다 (Verkaik et al., 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein et al., 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688).
[0220] 본 발명의 또 다른 측면은 개체가 진행중인 암에 대해 갖는 감수성의 평가이다. 일 구체예에서, 암에 대한 감수성을 예상하기 위한 방법은 조직 시료 중의 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질을 검출하는 것이다 (그의 존재가 암에 대한 감수성을 나타내고, PSCA mRNA 발현의 정도가 감수성의 정도에 관련이 있는 것이다). 특정 구체예에서, 전립선 또는 기타 조직에 PSCA가 존재하는지를 검사하여, 시료 중에 PSCA가 존재하면 전립선암 감수성이 있는 것을 나타내는 것이다 (또는 전립선 종양의 출현 또는 존재). 마찬가지로, 삽입, 결실, 치환 등과 같은 분자 구조 중의 변태를 동정하기 위하여, 생물학적 시료 중의 통합 PSCA 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 평가할 수 있다. 시료 중의 PSCA 유전자 산물에 하나 이상의 변태가 존재하면 암 감수성 (또는 종양의 출현 또는 존재)이 있음을 가리키는 것이다
[0221] 본 발명은 또한 종양 공격성을 측정하는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 종양의 공격성을 측정하기 위한 방법은 종양 세포에 의해 발현된 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질 수준을 측정하고 이렇게 측정된 수준을 동일한 개체 또는 동일한 조직 레퍼런스 시료로부터 취한 대응하는 정상 조직에서 발현된 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질의 수준과 비교하는 단계를 포함하며, 이 때, 정상 시료에 비해 종양 시료에서 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질의 발현도는 공격성 정도를 가리킨다. 특정 구체예에서, 종양의 공격성은 종양 세포에서 발현되는 PSCA의 정도를 측정함으로써 평가하며, 발현 수준이 높을수록 공격성이 큰 종양이다. 또 다른 구체예는 삽입, 결실, 치환 등과 같은 분자 구조에서의 변태를 측정하기 위하여, 생물학적 시료에서 통합 PSCA 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 평가하는 것이다. 하나 이상의 변태가 존재하면 보다 공격적인 종양이라는 것을 나타낸다.
[0222] 본 발명의 또 다른 구체예는 개체에 있어서 악성 종양의 시간 경과에 따른 진행 상황을 관찰하는 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 개체에 있어서 경시적인 악성종양의 진전의 관찰 방법은 종양 시료 중에서 세포에 의해 발현되는 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질 수준을 결정하고, 이렇게 결정된 수준을 상이한 시간대에 동일한 개체로부터 채취한 등가 조직 시료에서 발현되는 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질의 수준과 비교하여, 종양 시료 중의 시간에 따른 PSCA mRNA 또는 PSCA 단백질 발현의 정도가 종양의 진행에 관한 정보를 제공해주는 것으로 한다. 특정 구체예에서, 종양의 진행은 종양 세포 중의 PSCA 발현을 측정함으로써 경시적으로 평가하고, 이 때 경시적으로 발현이 증가하면 암이 진행된 것임을 가리키는 것이다. 또한, 삽입, 결실, 치환 등과 같은 분자 구조상의 변태를 동정하기 위하여, 생물학적 시료 중의 통합 PSCA 뉴클레오타이드와 아미노산 서열을 평가할 수 있으며, 여기서 하나 이상의 변태가 존재하면 암이 진행된 것임을 가리키는 것이다.
[0223] 전술한 진단적 접근법은 기술 분야에 잘 알려진 광범한 진단 및 예후적 프로토콜과 조합될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 다른 구체예는 조직 시료의 상태를 진단 및 예지하기 위한 수단으로서, PSCA 유전자 및 PSCA 유전자 산물 (또는 PSCA 유전자 및 PSCA 유전자 산물 중의 변태)의 발현과 악성종양과 연관된 인자의 발현 간의 일치를 관찰하기 위한 방법에 관한 것이다. 악성종양과 연관된 광범위한 인자들, 예컨대 악성종양과 관련된 유전자 발현 (예컨대 전립선암의 PSA, PSCA 및 PSM 발현 등) 및 총체적인 세포학적 관찰 (예컨대 Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74-88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24 참조)을 이용할 수 있다. PSCA 유전자 및 PSCA 유전자 산물 (또는 PSCA 유전자 및 PSCA 유전자 산물 중의 변태) 및 악성종양과 연관된 다른 인자들 사이의 일치를 관찰하는 방법은 예컨대, 질환과 일치하는 일련의 특정 인자들의 존재가 조직 시료의 상태를 진단 및 예지하는데 불가결한 정보를 제공해주기 때문에 유용하다.
[0224] 일례에서, PSCA 유전자 및 PSCA 유전자 산물 (또는 PSCA 유전자 및 PSCA 유전자 산물 중의 변태) 및 악성종양과 연관된 다른 인자 사이의 일치를 관찰하는 방법은 조직 시료 중의 PSCA mRNA 또는 단백질의 과발현의 검출, 조직 시료 중의 PSCA mRNA 또는 단백질의 과발현 (또는 PSCA 또는 PSM 발현)의 검출, 및 PSCA mRNA 또는 단백질 및 PSCA mRNA 또는 단백질 과발현 (또는 PSCA 또는 PSM 발현)의 일치를 관찰하는 것을 수반한다. 특정 구체예에서, 전립선 조직 중의 PSCA 및 PSCA mRNA의 발현을 검사하고, 여기서 시료 중의 PSCA 및 PSCA mRNA 과발현의 일치는 전립선암, 전립선 암 감수성 또는 전립선 종양의 출현이나 상태를 가리키는 것이다.
[0225] PSCA mRNA 또는 단백질의 발현을 검출 및 정량하는 방법을 본 발명에 설명하였으며, 표준 핵산 및 단백질 검출과 정량화 기술은 관련 분야에 잘 알려져 있다. PSCA mRNA의 검출 및 정량을 위한 표준법으로는 노던 블롯 표지된 PSCA 리보프로브을 이용하는 in situ 하이브리다이제이션 및 PSCA 폴리뉴클레오타이드 프로브를 이용하는 관련 기술, PSCA에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR 분석법 및 예컨대 가지달린 DNA, SISBA, TMA, 등과 같은 기타 증폭형 검출법을 들 수 있다. 특정 구체예에서, 반정량적 RT-PCR을 이용하여 PSCA mRNA 발현을 검출 및 정량할 수 있다. PSCA를 증폭시키리 수 있는, 본 발명에서 특정하여 설명된 다양한 프라이머 세트를 비롯하여, 몇개인가의 프라이머를 이러한 목적에 이용할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 생검 조직의 면역조직화학 분석법에, 야생형 PSCA 단백질과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 이용할 수 있다.
IX.) PSCA와 상호반응하는 분자들의 동정
[0226] 본 발명에 개시된 PSCA 단백질 및 핵산 서열은 당업자로 하여금 PSCA와 상호반응하는 단백질, 소분자 및 기타 제제 뿐만 아니라, 기술 분야에서 수용되는 다양한 프로토콜을 통하여 PSCA에 의해 활성화되는 경로를 동정할 수 있게 하여 준다. 예컨대, 소위 상호반응 트랩 시스템 ("two-hybrid assay"라고도 칭한다) 중 한가지를 이용할 수 있다. 이러한 시스템에서는, 분자들이 상호반응하여 리포터 유전자의 발현을 지향시키는 전사 인자를 재구축하고, 그 후, 리포터 유전자의 발현을 분석한다. 기타의 시스템들은 진핵 전사 활성화제의 재구축을 통하여 생체내에서의 단백질-단백질 상호반응을 동정한다, 예컨대, 1999년 9월 21일 등록된 미국특허 5,955,280, 1999년 7월 20일 등록된 5,925,523, 1998년 12월 8일 등록된 5,846,722 및 1999년 12월 21일 등록된 6,004,746 참조. 단백질 기능의 게놈에 기초한 예측을 위한 알고리듬 역시 기술 분야에서 이용가능하다 (예컨대, Marcotte, et al., Nature 402: 4 November 1999, 83-86 참조).
[0227] 또는, PSCA 단백질 서열과 상호반응하는 분자들을 동정하기 위하여 펩타이드 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이러한 방법에서는, 아미노산의 랜덤 또는 조절된 컬렉션을 코딩하는 라이브러리를 스크리닝함으로써 PSCA와 결합하는 펩타이드들을 동정한다. 라이브러리에 의해 코딩된 펩타이드는 박테리오파지 피막 단백질의 융합 단백질로서 발현되며, 이어서 박테리오파지 입자를 PSCA 단백질(들)에 대해 스크리닝한다.
[0228] 따라서, 치료적, 예후적, 또는 진단적 시약과 같은 광범위 용도를 갖는 펩타이드가 예상된 리간드 또는 수용체 분자 구조에 대한 사전 정보 없이 동정된다. PSCA 단백질 서열과 상호반응하는 분자들을 동정하는데 이용될 수 있는 스크리닝 방법 및 펩타이드 라이브러리는 예컨대 1998년 3월 3일자 미국특허 5,723,286 및 1998년 3월 31일자 미국특허 5,733,731에 개시되어 있다.
[0229] 또는, PSCA를 발현하는 세포주들을 이용하여 PSCA에 의해 매개된 단백질-단백질 상호반응을 동정한다. 이러한 상호반응은 면역침전 기술을 이용하여 검사할 수 있다 (예컨대, Hamilton B.J., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51 참조). 항PSCA 항체를 이용하여 PSCA 발현 세포주로부터 PSCA 단백질을 면역침전시킬 수 있다. 또는, PSCA와 His-tag (전술한 벡터)의 융합체를 발현하도록 조작된 세포주에서 His-tag에 대한 항체를 이용할 수 있다. 웨스턴 블롯, 단백질의 36S-메티오닌 표지 처리, 단백질 마이크로시퀀싱, 은염색 및 2차원 겔 전기영동과 같은 방법에 의해 단백질 회합에 대해 면역침전된 복합체를 검사할 수 있다.
[0230] PSCA와 상호반응하는 소분자 및 리간드를 이러한 스크리닝 분석의 관련 구체예를 통해 동정할 수 있다. 예컨대, PSCA이 인산화 및 탈인산화를 매개하는 능력, 세포 사이클의 조절 지표로서 DNA 또는 RNA 분자들과의 상호반응, 제2 메신저 시그널링 또는 종양 생성을 매개하는 능력을 간섭하는 분자를 비롯하여, 단백질 기능을 간섭하는 소분자들을 동정할 수 있다. 마찬가지로, PSCA 관련 이온 채널, 단백질 펌프, 또는 세포 소통 기능을 조절하는 소분자들을 동정하여 PSCA를 발현하는 암을 앓는 환자들을 치료하는데 이용한다 (예컨대, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 제2판, Sinauer Assoc., Sunderland, MA, 1992 참조). 뿐만 아니라, PSCA 기능을 조절하는 리간드들을 PSCA에 결합하는 능력 및 리포터 구조물을 활성화시키는 그들의 능력에 기초하여 동정할 수 있다. 전형적인 방법은 1999년 7월 27일 등록된 미국특허 5,928,868에 설명되어 있고, 적어도 하나의 리간드가 소분자인 하이브리드 리간드를 형성하는 방법이 이에 포함된다. 설명적 구체에에서, PSCA와 DNA-결합 단백질과의 융합 단백질을 발현하도록 조작된 세포를 이용하여 하이브리드 리간드/소분자 및 cDNA 라이브러리 전사 활성화제 단백질의 융합 단백질을 공동발현시킬 수 있다. 세포는 또한 리포터 유전자를 부가적으로 함유하는데, 이러한 리포터 유전자의 발현은 제1 및 제2 융합 단백질의 상호 근접부에서 조건화되며, 하이브리드 리간드가 두개의 하이브리드 단백질 모두에 대한 표적 부위에 결합하는 경우에만 일어난다. 리포터 유전자를 발현하는 세포들을 선택하고 미지의 소분자 또는 미지의 리간드를 동정한다. 이 방법은 PSCA를 활성화 또는 억제하는 조절자를 동정하는 수단을 제공해준다.
[0231] 본 발명의 일 구체예는 도 1에 도시된 PSCA 아미노산 서열과 상호반응하는 분자의 스크리닝법을 제공하며, 이 방법은 분자 집단을 PSCA 아미노산 서열과 접촉시키는 공정, 분자 집단과 PSCA 아미노산 서열을 상호반응을 쉽게 하는 조건 하에서 상호반응시키는 공정, PSCA 아미노산 서열과 상호반응하는 분자들의 존재를 결정하는 공정, 및 이어서 PSCA 아미노산 서열과 상호반응 분자들로부터 상호반응하지 않는 분자들을 분리하는 공정을 포함하여 이루어진다. 특정 구체예에서, 이 방법은 PSCA 아미노산 서열과 상호반응하는 분자들을 정제, 특징화 및 동정하는 공정을 부가적으로 포함한다. 동정된 분자들은 PSCA에 의해 수행되는 기능을 조절하는데 이용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, PSCA 아미노산 서열을 펩타이드의 라이브러리와 접촉시킨다.
X.) 치료 방법 및 조성물
[0232] 제한적인 세트의 조직에서는 대개 발현되나 표 I에 수록된 암에서도 발현되는 단백질로서 PSCA를 동정함으로써 이러한 암 치료에 대한 몇가지 치료적 접근 가능성이 생긴다.
[0233] 주의할 것은, 표적화 단백질이 정상 조직, 심지어 생명에 필수적인 정상적인 장기 조직에서도 발현되는 경우에도 표적화 항종양 요법이 이용되어 왔다는 것이다. 생명에 필수적인 장기란 심장이나 결장처럼 생명을 부지하는데 필요한 장기이다. 생명에 비필수적인 장기라 함은 그 장기를 제거하여도 그 개체가 여전히 생존할 수 있는 장기이다. 생명에 비필수적인 장기의 예로는 난소, 유방 및 전립선을 들 수 있다.
[0234] 예컨대, 헤르셉틴 (Herceptin
Figure 112006097924236-PCT00001
)은 그의 활성 성분으로서 HER2, HER2/neu, 및 erb-b-2로 다양하게 알려진 단백질과 면역반응하는 항체를 갖는 FDA로부터 승인된 약제이다. 이 약제는 Genentech사가 시판하며 항종양제로서 상업적으로 성공을 거두었다. 헤르셉틴 판매량은 2002년도에 4억 달러에 달하였다. 헤르셉틴은 HER2 양성 전이 유방암의 치료제이다. 그러나, HER2의 발현은 이렇나 종양에만 국한되는 것은 아니다. 이와 동일한 단백질이 몇몇 정상 조직에서도 발현된다. 특히, HER2/neu는 정상적인 신장과 심장에 존재한다는 것이 알려져 있으므로, 이러한 조직은 헤르셉티의 모든 사람 수용체에 존재하는 것이다. 정상적인 신장에 HER2/neu가 존재한다는 것은 Latif, Z., et al., B.J.U. International (2002) 89:5-9에 의해서도 확인된다. 이 논문 (신장 세포 암종이 헤르셉틴과 같이 항HER2 항체에 대해 바람직한 지표가 되는지를 평가하였음)에 설명된 바와 같이 단백질과 mRNA 두가지 모두 양성 신장 조직 중에서 생산된다. HER2/neu 단백질이 양성 신장 조직에서 강력하게 과발현되었다는 것은 주목할 만한 일이다.
[0235] HER2/neu이 심장 및 신장과 같은 생명에 필수적인 조직에서 발현됨에도 불구하고, 헤르셉틴은 매우 유용하고, FDA로부터 승인을 받은데다가 상업적으로도 성공을 거둔 약물이다. 심장 조직에 미치는 헤르셉틴의 효과, 즉 "심독성"은 단지 이 치료의 부작용일 뿐이다. 환자들을 헤르셉틴 단독으로 치료하자, 매우 적은 백분율의 환자들에게서 심각한 심독성이 일어났다.
[0236] 비록 신장 조직이 정상적인 발현을 나타내는 것으로 지적되고, 심장 조직보다 더 많이 발현될 가능성에도 불구하고, 신장은 이렇다할만한 인지가능한 헤르셉틴 부작용을 나타내지 않는다. 뿐만 아니라, HER2가 발현되는 정상조직의 다양한 어레이에서도, 부작용은 거의 나타나지 않는다. 오직 심장 조직에서만이 인지가능한 부작용이 나타나는 것이다. HER2neu 발현이 특히 주목되는 신장과 같은 조직은 어떠한 부작용의 기초도 되지 않았다.
[0237] 뿐만 아니라, 상피성장인자 수용체 (EGFR)를 표적하는 항종양 요법의 경우 바람직한 치료 효과가 발견되었다. EGFR은 수많은 정상 조직에서도 발현된다. 항 EGFR 치료제의 용도에 따른 정상 조직에서 부작용은 매우 제한적이었다. EGFR 치료와 관련하여 발생되는 일반적인 부작용은 치료를 받은 환자들에서 100% 관찰되는 심한 피부 발진이다.
[0238] 따라서, 정상 조직, 심지어는 생명에 필수적인 정상 조직에서의 표적 단백질의 발현도 그 단백질 역시 과발현되는 특정 종양에 대한 치료제로서의 그 단백질의 표적화제의 용도를 폄하하지는 않는다. 예컨대, 필수 장기에서의 발현은 그 자체로 해롭지는 않다. 또한, 전립선 및 난소처럼 없어도 되는 것으로 간주되는 장기들은 생명에 영향을 미침이 없이 제거될 수 있다. 마지막으로, 몇몇 필수 장기들은 면역우성 때문에 정상적인 장기 발현에 의해 영향받지 않는다. 면역우세적인 장기들은 혈액-장기 장벽에 의해 혈액으로부터 보호되는 장기들이기 때문에, 면역요법으로는 접근할 수 없다. 면역우세적인 장기의 예로는 뇌와 고환을 들 수 있다.
[0239] 따라서, PSCA 단백질의 활성을 억제하는 치료적 접근은 PSCA를 발현하는 암을 앓는 환자들에게 유용하다. 이러한 치료적 접근법은 일반적으로 세가지 부류로 나뉜다. 첫번째 부류는 PSCA 기능을 변경시키는 것으로 이는 이것이 종양 세포 성장과 관련이 있기 때문으로, 종양 세포 성장의 억제 또는 지연이나 그의 사멸을 유발한다. 두번째 부류는 PSCA 단백질과 그의 결합 파트너 또는 다른 단백질과의 결합 또는 연합을 저해하기 위한 다양한 방법으로 이루어진다. 세번째 부류는 PSCA 유전자의 전사나 PSCA mRNA의 번역을 저해하기 위한 다양한 방법으로 이루어진다.
X.A.) 항암 백신
[0240] 본 발명은 PSCA 관련 단백질 또는 PSCA 관련 핵산을 포함하는 암 백신을 제공한다. PSCA 발현에 비추어 볼 때, 암 백신은 비표적 조직에 대해서는 거의 또는 최소한의 효과로 PSCA 발현 암을 예방 및/또는 치료해준다. 항암 치료법으로서 체액 및/또는 세포 매개성 면역 반응을 발생시키는 백신에 종양 항원을 사용하는 것은 기술 분야에 잘 알려져 있으며 사람의 PSCA와 설치류의 PAP 면역원을 이용하여 전립선암에서 사용되어 왔다 (Hodge et al., 1995, Int. J. Cancer 63:231-237; Fong et al., 1997, J. Immunol. 159:3113-3117).
[0241] 이러한 방법은 PSCA 면역원을 발현 및 산생할 수 있는 PSCA 관련 단백질 또는 PSCA 코딩 핵산 분자와 재조합 벡터 (보통 몇가지 항체 또는 T 세포 에피토프를 포함한다)를 사용함으로써 용이하게 실시가능하다. 당업자라면 면역반응성 에피토프 전달을 위한 광범위한 백신 시스템이 기술분야에 공지임을 이해할 것이다 (예컨대, Heryln et al., Ann Med 1999 Feb 31(1):66-78; Maruyama et al., Cancer Immunol Immunother 2000 Jun 49(3):123-32 참조). 요약하면, 포유동물에서 면역반응 (예컨대, 체액성 및/또는 세포매개성)을 일으키는 이러한 방법은, 그 포유동물의 면역계를 면역반응성 에피토프 (예컨대 도 1에 도시된 PSCA 단백질 또는 그의 유사체나 상동체에 존재하는 에피토프)에 노출시킴으로써, 그 포유동물이 그 에피토프 (예컨대 그 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 에피토프)에 특이적인 면역 반응을 일으키게 하는 공정을 포함하여 이루어진다.
[0242] PSCA 단백질 전체, 그의 면역원성 대역 또는 에피토프를 조합시켜 여러가지 수단으로 전달할 수 있다. 이러한 백신 조성물은 예컨대 리포펩타이드 (예컨대, Vitiello, A. et al., J. Clin. Invest. 95:341, 1995), 폴리 (DL-락티드-co-글리콜리드) ("PLG") 마이크로스피어에 캡슐화된 펩타이드 조성물 (예컨대, Eldridge, et al., Molec. Immunol. 28:287-294, 1991: Alonso et al., Vaccine 12:299-306, 1994; Jones et al., Vaccine, 13:675-681, 1995 참조), 면역촉진복합체 (ISCOMS) 중에 함유된 펩타이드 조성물 (예컨대, Takahashi et al., Nature 344:873-875, 1990; Hu et al., Clin Exp Immunol. 113:235-243, 1998), 다발성 항원 펩타이드 시스템 (MAPs) (예컨대, Tam, J. P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5409-5413, 1988; Tam, J.P., J. Immunol. Methods 196:17-32, 1996 참조), 다가 펩타이드로서 조성된 펩타이드; 탄도전달 시스템에서 사용되는 펩타이드, 전형적으로는 결정형 펩타이드, 바이러스 전달 벡터 (Perkus, M. E. et al., In: Concepts in faccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 379, 1996; Chakrabarti, S. et al., Nature 320:535, 1986; Hu, S. L. et al., Nature 320:537, 1986; Kieny, M.-P. et al., AIDS Bio/Technology 4:790, 1986; Top, F. H. et al., J. Infect. Dis. 124:148, 1971; Chanda, P. K. et al., Virology 175:535, 1990), 바이러스 기원 또는 합성 기원의 입자들 (예컨대, Kofler, N. et al., J. Immunol. Methods. 192:25, 1996; Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993; Falo, L. D., Jr. et al., Nature Med. 7:649, 1995), 어쥬번트 (Warren, H. S., Vogel, F. R., and Chedid, L. A. Annu. Rev. Immunol. 4:369, 1986; Gupta, R. K. et al., Vaccine 11:293, 1993), 리포좀 (Reddy, R. et al., J. Immunol. 148:1585, 1992; Rock, K. L., Immunol. Today 17:131, 1996), 또는, 네이키드 또는 입자 흡수형 cDNA (Ulmer, J. B. et al., Science 259:1745, 1993; Robinson, H. L., Hunt, L. A., and Webster, R. G., Vaccine 11:957, 1993; Shiver, J. W. et al., In: Concepts in vaccine development, Kaufmann, S. H. E., ed., p. 423, 1996; Cease, K. B., and Berzofsky, J. A., Annu. Rev. Immunol. 12:923, 1994 and Eldridge, J. H. et al., Sem. Hematol. 30:16, 1993 참조). Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts)의 것과 같은 수용체 매개형 표적화라고도 알려져 있는 독소-표적형 전달 기술 역시 사용가능하다.
[0243] PSCA 관련 암을 앓는 환자들에 있어서는, IL-2, IL-12, GM-CSF, 등과 같은 면역 애쥬번트와 병용하는 것을 비롯하여, 본 발명의 백신을 암에 사용되는 다른 치료법, 예컨대, 외과 수술, 화학요법, 약물요법, 방사선요법 등과 같은 다른 치료법과 연계하여 사용할 수 있다.
세포성 백신:
[0244] PSCA 단백질 중의, 대응하는 HLA 대립유전자에 결합하는 펩타이드를 동정하기 위한 특정 알고리듬 (예컨대, 표 IV; EpimerTM 및 EpimatrixTM , Brown University (URL brown.edu/Research/TB-HIV_Lab/epimatrix/epimatrix.html); 및, BIMAS, (URL bimas.dcrt.nih.gov/; SYFPEITHI at URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/)을 이용하여 CTL 에피토프를 결정할 수 있다. 바람직한 구체예에서, PSCA 면역원은 표 V-XVIII 및 XXII-LI에 도시된 서열 또는 HLA 클래스 I 모티프/수퍼모티프에 의해 특정된 8, 9, 10 또는 11 아미노산의 펩타이드 (예컨대, 표 IV (A), 표 IV (D), 또는 표 IV (E)) 및/또는 HLA 클래스 II 모티프/수퍼모티프를 함유하는 적어도 9개의 아미노산으로 된 펩타이드 (예컨대, 표 IV (B) 또는 표 IV (C))와 같이, 기술 분야에 공지인 기술에 의해 동정된 아미노산 서열을 하나 이상 함유한다. 기술 분야에서 인정되고 있는 바와 같이, HLA 클래스 I 결합 그루브는 필수적으로 폐쇄 종결형이며 따라서 특정 크기 범위의 펩타이드들만이 그루브에 맞아들어가 결합할 수 있는데, 대체로 HLA 클래스 I 에피토프는 8, 9, 10, 또는 11 아미노산 길이이다. 이와 대조적으로, HLA 클래스 II 결합 그루브는 기본적으로 개방 종결형이므로; 약 9개 이상의 아미노산의 펩타이드가 HLA 클래스 II 분자에 의해 결합될 수 있다. HLA 클래스 I과 II간의 결합 그루브 차이로 인해, HLA 클래스 I 모티프는 길이 특이적이고, 즉, 클래스 I 모티프의 제 2위는 펩타이드의 아미노에서 카르복실 방향의 두번째 아미노산이다. 클래스 II 모티프에 있어서 아미노산 좌위는 오직 서로에 대해서만 상대적일 뿐 전체적으로는 상대적이 아니다, 즉, 모티프 산생 서열의 아미노 및/또는 카르복실 말단에 부가적인 아미노산을 부착하는 것이 가능하다. HLA 클래스 에피토프는 종종 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 길이, 또는 25개를 초과하는 아미노산 길이이다.
[0245] 포유동물에 있어서 면역반응을 일으키기 위한 많은 방법이 기술 분야에 알려져 있다 (예컨대, 하이브리도마의 생산시 제1단계로서). 포유동물에서 면역 반응을 일으키는 방법은 그 포유동물의 면역계를 단백질 (예컨대 PSCA 단백질) 상의 면역원성 에피토프에 노출시켜 면역 반응을 발생시키는 것이다. 전형적인 구체예는 숙주에서 PSCA에 대한 면역 반응을 일으키기 위한 방법으로서, 숙주를 적어도 하나의 PSCA B 세포 또는 세포독성 T 세포 에피토프 또는 그의 유사체 충분량과 접촉시키고; 그 후 적어도 1회의 주기적 간격을 두고 숙주를 PSCA B 세포 또는 세포독성 T 세포 에피토프 또는 그의 유사체와 재접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예는 PSCA 관련 단백질 또는 인공 멀티에피토프 펩타이드에 대한 면역 반응을 발생시키는 방법으로서; 백신 제제 중의 PSCA 면역원 (에컨대 PSCA 단백질 또는 그의 펩타이드 단편, PSCA 융합 단백질 또는 유사체 등)을 사람 또는 다른 포유동물에게 투여하는 것이다. 일반적으로, 이러한 백신 제제는 적절한 애쥬번트 (예컨대, 미국특허 6,146,635) 또는 PADRETM 펩타이드 (Epimmune Inc., San Diego, CA; 예컨대,Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164(3): 1625-1633; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 and Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2): 79-92)와 같은 범용성 헬퍼 에피토프를 부가적으로 함유한다. 또 다른 방법은 개체의 근육이나 피부에 생체내로 PSCA 면역원을 코딩하는 DNA 서열, DNA 서열의 발현을 조절하는 조절적 서열에 작동적으로 링크된 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자를 투여함으로서 개체 내에서 PSCA 면역원에 대한 면역 반응을 일으키는 것이다; 여기서, 상기 DNA 분자는 세포에 의해 취해져서, 세포중에서 발현되며 면역 반응은 그 면역원에 대해 일어난다 (예컨대, 미국특허 5,962,428 참조). 임의로 음이온 지질; 사포닌; 렉틴; 에스트로겐 화합물; 히드록실화 저급 알킬; 디메틸 설폭사이드; 및 우레아와 같은 유전자 백신 촉진자도 투여할 수 있다. 또한, 표적 항원에 대한 반응을 일으키기 위해, PSCA를 모사하는 항이디오타입 항체를 투여할 수도 있다.
핵산 백신 :
[0246] 본 발명의 백신 조성물은 핵산 매개형 종류를 포함한다. 본 발명의 단백질(들)을 코딩하는 DNA 또는 RNA를 환자에게 투여할 수 있다. 유전적 면역화법을 이용하여 PSCA를 발현하는 암세포에 대해 지향된 예방적 또는 치료적 체액성 및 세포성 면역 반응을 일으킬 수 있다. PSCA 관련 단백질/면역원을 코딩하는 DNA 및 적절한 조절 서열을 함유하는 구조물을 개체의 근육이나 피부에 직접 주사하여 근육 또는 피부의 세포가 그 구조물을 흡수하여, 코딩된 PSCA 단백질/면역원을 발현하도록 할 수 있다. 또는, 백신은 PSCA 관련 단백질을 함유한다. PSCA 관련 단백질 면역원의 발현은 PSCA 단백질을 산생하는 세포에 대하여 예방적 또는 치료적 체액성 면역 및 세포성 면역의 발생을 야기한다. 기술 분야에 알려진 다양한 예방적 및 치료적 유전학적 면역 기술을 이용할 수 있다 (예컨대 인터넷 주소 genweb.com에 공개된 정보와 참고문헌을 참조할 수 있다). 핵산 기반 전달은 에컨대, Wolff et. al., Science 247:1465 (1990), 및 미국특허 5,580,859; 5,589,466; 5,804,566; 5,739,118; 5,736,524; 5,679,647; WO 98/04720에 설명되어 있다. DNA 기반 전달 기술의 예에는 "네이키드 DNA", 용이화된 (부피비카인, 폴리머, 펩타이드-매개형) 전달, 양이온성 지질 복합체 및 입자매개형 ("유전자총") 또는 압력매개형 전달 (예컨대 미국특허 5,922,687)를 들 수 있다.
[0247] 치료적 또는 예방적 면역화 목적을 위해, 본 발명의 단백질을 바이러스성 또는 세균성 벡터를 통해 발현시킬 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는 다양한 바이러스 유전자 전달 시스템으로는 백시니아, 조류폭스, 카나리폭스, 아데노바이러스, 인플루엔자, 폴리오바이러스, 아데노관련 바이러스, 렌티바이러스 및 신드비스 바이러스 (예컨대, Restifo, 1996, Curr. Opin. Immunol. 8:658-663; Tsang et al. J. Natl. Cancer Inst. 87:982-990 (1995))를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. PSCA 관련 단백질을 코딩하는 네이키드 DNA를 환자에게 도입하여 (예컨대 근육내 또는 피내) 항종양 반응을 유발하는 비바이러스형 전달계도 이용가능하다.
[0248] 예컨대 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현하기 위한 벡터로서 백시니아 바이러스를 사용한다. 숙주내로 도입되면, 재조합 백시니아 바이러스는 단백질 면역원성 펩타이드를 발현하기 때문에 숙주 면역 반응을 이끌어낸다. 면역화 프로토콜에 유용한 백시니아 벡터 및 방법은 예컨대 미국특허 4,722,848에 설명되어 있다. 또 다른 벡터는 BCG (Bacille Calmette Guerin)이다. BCG 벡터는 Stover et al., Nature 351:456-460 (1991)에 설명되어 있다. 예컨대 아데노 및 아데노 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 살모넬라 타이피 (Salmonella typhi) 벡터, 해독된 탄저독소 벡터 등과 같이 본 발명의 펩타이드의 치료적 투여 또는 면역화에 유용한 광범위한 기타의 벡터들은 본 발명에 설명된 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
[0249] 따라서, 유전자 전달 시스템은 PSCA 관련 핵산 분자를 전달하는데 유용하다. 일 구체예에서, 사람의 전장 PSCA cDNA를 사용한다. 또 다른 구체예에서는, 특이적인 세포독성 T 임파구(CTL) 및/또는 항체 에피토프를 코딩하는 PSCA 핵산 분자가 사용된다.
생체외 백신
[0250] 면역 반응을 일으키기 위해 다양한 생체외 (ex vivo) 전략을 사용할 수도 있다. 한가지 접근법은 수지상 세포 (DC)와 같은 항원 제시 세포 (APCs)를 사용하여 환자의 면역계에 PSCA 항원을 제시하는 것이다. 수지상 세포는 MHC 클래스 I 및 II 분자, B7 공동촉진자, 및 IL-12를 발현하므로 고도로 특이적인 항원 제시 세포이다. 전립선암에서는, 전립선 특이적인 막 항원 (PSMA)의 펩타이드로 펄스시킨 자가 수지상 세포를 I상 임상 시험에 사용하여 전립선암 환자들의 면역계를 자극한다 (Tjoa et al., 1996, 전립선 28:65-69; Murphy et al., 1996, Prostate 29:371-380). 따라서, 수지상 세포는 MHC 클래스 I 또는 II 분자 관점에서 T 세포에 PSCA 펩타이드를 제시하는데 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 자가 수지상 세포를 MHC 클래스 I 및/또는 II 분자와 결합할 수 있는 PSCA 펩타이드로 펄스시킨다. 또 다른 구체예에서, 수지상 세포를 완전한 PSCA 단백질로 펄스시킨다. 또 다른 구체예는 아데노바이러스 (Arthur et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4:17-25), 레트로바이러스 (Henderson et al., 1996, Cancer Res. 56:3763-3770), 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스, DNA 형질 감염 (Ribas et al., 1997, Cancer Res. 57:2865-2869), 또는 종양 유발형 RNA 형질 감염 (Ashley et al., 1997, J. Exp. Med. 186:1177-1182)과 같이, 기술 분야에 공지인 여러가지 실시 벡터를 이용하여 수지상 세포에서 PSCA 유전자를 과발현시키는 조작을 포함한다. PSCA를 발현하는 세포들 역시 GM-CSF와 같은 면역 조절자를 발현하도록 조작할 수 있으며 면역화 제제로서 사용할 수 있다.
X.B.) 항체 기반 치료법을 위한 표적으로서의 PSCA
[0251] PSCA는 항체 기반 치료법 전략에 있어서 매력적인 표적이다. 몇가지 항체 전략이 세포외 분자 및 세포내 분자의 두가지 모두를 표적화하기 위한 기술 분야에 알려져 있다 (예컨대, 인트라바디의 사용 뿐만 아니라 보체 및 ADCC 매개형 사멸 참조). PSCA는 대응하는 정상 세포에 대해 상대적으로 다양한 리니지의 암세포에 의해 발현되기 때문에, 독성이 없이 탁월한 민감성을 나타내면서, 비표적 장기 및 조직에 대한 면역반응성 조성물의 결합에 의해 야기되는 비특이적 및/또는 비표적 효과를 나타내는 전신 투여용 PSCA-면역반응성 조성물이 제조된다. PSCA 도메인과 즉이적으로 반응하는 항체들은 독소 또는 치료제와 컨쥬게이트로서, 또는 세포 증식이나 기능을 억제할 수 있는 네이키드 항체로서, PSCA을 발현하는 암을 전신적으로 치료하는데 유용하다.
[0252] PSCA 항체는 환자에게 그 항체가 PSCA에 결합하여 결합 파트너와의 상호반응과 같은 기능을 변경시키고, 종국적으로 종양 세포의 파괴를 매개하고/매개하거나 종양 세포의 성장을 억제하도록 도입될 수 있다. 이러한 항체가 치료 효과를 발휘하는 메카니즘으로는 보체-매개형 세포용해, 항체-의존성 세포성 세포독성, PSCA의 생리적 기능 변경, 리간드 결합 또는 시그널 형질도입 경로의 억제, 종양 세포 분화의 변경, 종양 혈관형성 인자 프로파일의 변경, 및/또는 세포자멸사를 들 수 있다. 비호지킨씨 임파종에 대해서는 Rituxan
Figure 112006097924236-PCT00002
, 전이성 유방암의 경우에는 Herceptin
Figure 112006097924236-PCT00003
, 그리고 결장직장암의 경우에는 Erbitux
Figure 112006097924236-PCT00004
이 예시된다.
[0253] 당업자라면 항체를 이용하여 도 1에 도시된 PSCA 서열의 면역원성 대역과 같은 면역원성 분자들을 특이적으로 겨냥하여 결합할 수 있음을 이해할 것이다. 이에 더해, 당업자들은 항체를 세포독성 제제에 컨쥬게이션시키는 것도 통상적임을 이해할 것이다 (예컨대, Slevers 외, Blood 93:11 3678-3684 (June 1, 1999) 참조). 예컨대 세포독성 제제 및/또는 치료제를 세포에 의해 발현되는 분자에 특이적인 항체에 컨쥬게이션시킴으로써 세포독성 제제 및/또는 치료제를 세포에 직접 전달할 경우, 그 세포독성 제제는 그의 알려진 생물학적 효과 (즉, 세포독성)을 이들 세포에 대해 발휘할 것이다.
[0254] 세포 사멸을 위해 항체-세포독성 제제 컨쥬게이트를 사용하는 다양한 방법과 조성물이 기술 분야에 알려져 있다. 암과 관련해서, 일반적인 방법들은 세포 표면 상에 결합되거나 국소화되어 발현된 마커 (예컨대, PSCA)에 결합하는 표적화 제제 (예컨대, 항체-PSCA 항체)에 겨합된 선택된 세포독성 제제 및/또는 치료제를 포함하는 컨쥬게이트를, 종양을 앓는 동물에게 생물학적 유효량만큼 투여하는 것을 포함한다. 전형적인 구체예는 세포독성 제제를 PSCA 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체에 세포독성 제제를 컨쥬게이션시키고, 상기 세포를 항체-제제 컨쥬게이트에 노출시키는 단계를 포함하여 이루어지는, PSCA를 발현하는 세포에게 세포독성 제제 및/또는 치료제를 전달하는 방법이다. 또 다른 예시적인 구체예는 전이형 암에 걸린 것으로 여겨지는 개체를 치료하는 방법으로서, 이 방법은 상기 개체에게 세포독성 제제 및/또는 치료제와 컨쥬게이션된 항체의 치료적 유효량을 함유하는 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 단게를 포함하여 이루어진다.
[0255] 항PSCA 항체를 이용하는 암 면역치료법은 비제한적인 예로서 결장암 (Arlen 외, 1998, Crit. Rev. Immunol. 18:133-138), 다발성 골수종 (Ozaki 외, 1997, Blood 90:3179-3186, Tsunenari 외, 1997, Blood 90:2437-2444), 위암 (Kasprzyk 외, 1992, Cancer Res. 52:2771-2776), B 세포 임파종 (Funakoshi 외, 1996, J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101), 백혈병 (Zhong 외, 1996, Leuk. Res. 20:581-589), 결장직장암 (Moun 외, 1994, Cancer Res. 54:6160-6166; Velders 외, 1995, Cancer Res. 55:4398-4403), 및 유방암 (Shepard 외, 1991, J. Clin. Immunol. 11:117-127)을 비롯한 서로 다른 종류의 암을 치료하는데 성공적으로 사용되어 온 다양한 접근법에 따라 수행될 수 있다. 몇몇 치료적 접근법은 네이키드 항체를 독소나 방사능 동위원소에 컨쥬게이션시키는 것을 포함하며, 예컨대, Y91 또는 I131을 항CD20 항체와 각각 컨쥬게이션시키는 것을 들 수 있으며 (예컨대, ZevalinTM, IDEC Pharmaceuticals Corp. or BexxarTM Coulter Pharmaceuticals), 또는 다른 방법은 항체와 다른 치료제를 함께 투여하는 것, 예컨대, HerceptinTM (trastuzuMAb)을 파클리탁셀(Genentech, Inc.)과 함께 투여하는 것을 들 수 있다. 항체는 치료제에 컨쥬게이션될 수 있다. 예컨대, 전립선암을 치료하기 위해, PSCA 항체를 방사능 요법, 화학요법 또는 호르몬 소거와 함께 병용하여 투여할 수 있다. 또한, 항체들을 칼리케아마이신과 같은 독소 (예컨대, MylotargTM, Wyeth-Ayerst, Madison, NJ, 항종양 항생제 칼리케아마이신에 컨쥬게이션된 인간화된 재조합 IgG4 캅파 항체) 또는 메이탄시노이드 (예컨대, 탁산-기재 종양-활성화 전구약물 TAP, 플랫폼, ImmunoGen, Cambridge, MA, 미국특허 5,416,064호 참조) 또는 Auristatin E (Nat Biotechnol. 2003 Jul; 21(7):778-84. (Seattle Genetics))와 컨쥬게이션시킬 수도 있다.
[0256] PSCA 항체 요법은 모든 단계의 암에 대해 이용가능하지만, 항체 요법은 특히 진행된 암이나 전이된 암에 특히 적합하다. 본 발명의 항체 요법에 의한 치료는 화학요법을 1순환 이상 처치받은 환자들에 대해 처방된다. 또는, 본 발명의 항체 요법은 화학치료법 처치를 받은 바 없는 환자들에 있어서 화학치료법이나 방사능 요법과 병용될 수 있다. 또한, 항체 요법은 부수적인 화학요법에 사용되는 투여량을 감소시킬 수 있는데, 특히, 화학치료제를 잘 견디지 못하는 환자에 있어서 그 투약량을 줄이는데 이용될 수 있다. Fan 외 (Cancer Res. 53:4637-4642, 1993), Prewett 외 (International J. of Onco. 9:217-224, 1996), 및 Hancock 외 (Cancer Res. 51:4575-4580, 1991)에는 화학치료 제제를 이용하여 여러가지 항체를 함께 사용하는 것이 설명되어 있다.
[0257] PSCA 항체 요법은 모든 단계의 암에 대해 이용가능하지만, 항체 요법은 특히 진행된 암이나 전이된 암에 특히 적합하다. 본 발명의 항체 요법에 의한 치료는 화학요법을 1순환 이상 처치받은 환자들에 대해 처방된다. 또는, 본 발명의 항체 요법은 화학치료법 처치를 받은 바 없는 환자들에 있어서 화학치료법이나 방사능 요법과 병용될 수 있다. 또한, 항체 요법은 부수적인 화학요법에 사용되는 투여량을 감소시킬 수 있는데, 특히, 화학치료제를 잘 견디지 못하는 환자에 있어서 그 투약량을 줄이는데 이용될 수 있다.
[0258] 암환자들을 PSCA 발현 수준과 존재에 대해 평가할 수 있다. 바람직하게는 종양 조직의 면역조직화학적 평가, 정량적 PSCA 조영 또는 PSCA 발현도 및 존재여부를 신뢰성있게 가리켜주는 기타의 기술을 이용하여 평가할 수 있다. 종양 생검 또는 외과적 표본의 면역조직화학적 분석법은 이 목적에 바람직하다. 종양 조직의 면역조직화학적 분석법도 기술 분야에 잘 알려져 있다.
[0259] 전립선암 및 기타 암을 치료하는 항PSCA 모노클로날 항체로는 종양에 대해 효력있는 면역 반응을 개시하는 것들 또는 직접 세포독성인 것들을 들 수 있다. 이와 관련하여, 항PSCA 모노클로날 항체 (MAbs)는 보체 매개형 또는 항체의존성 세포 세포독성 (ADCC) 메카니즘에 의해 종양 세포 용해를 이끌어낼 수 있는데, 상기 두가지는 모두 보체 단백질 상의 이펙터 세포 Fc 수용체와의 상호반응을 위해 면역글로불린 분자의 고유한 Fc 부분을 필요로 한다. 또한, 종양 성장에 대해 직접적인 생물학적 효과를 발휘하는 항PSCA mAbs는 PSCA를 발현하는 암을 치료하는데 유용하다. 직접적으로 세포독성인 mAbs가 작용하는 메카니즘에는 다음이 포함된다: 세포 성장의 저해, 세포성 분화의 조절, 종양 혈관형성인자 프로파일의 조절, 및 세포자멸사의 유발. 특정 항PSCA mAb가 항종양 효과를 일으키는 메카니즘(들)은 기술분야에 일반적으로 알려져 있는 ADCC, ADMMC, 보체 매개형 세포 용해 등과 같은 세포 사멸을 평가하는 몇가지 시험관내 분석법에 의해 평가된다.
[0260] 몇몇 환자에서는, 쥐나 기타 비인간 모노클로날 항체 또는 인간/마우스 키메라 mAbs를 사용함으로써 비인간 항체에 대한 중간 강도 내지 강한 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 이것은 순환계로부터 항체를 소거하여 효능을 저하시키는 결과를 초래할 수 있다. 가장 심한 경우에는, 이러한 면역 반응이 면역 복합체의 집중적 형성을 유발하여, 잠재적으로 신부전을 일으킬 수도 있다. 따라서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 바람직한 모노클로날 항체는 높은 친화성을 나타내나 환자에서 전혀 또는 낮은 항원성을 나타내는 표적 PSCA 항원에 특이적으로 결합하며 완전히 인간의 또는 인간화된 것인 항체들이다.
[0261] 본 발명의 치료 방법은 단일 항PSCA mAbs 뿐만 아니라 다른 mAbs와의 조합체 또는 칵테일을 투여하는 것도 포괄한다. 이러한 mAbs 칵테일은 상이한 에피토프를 표적화하는 mAbs를 이들이 함유하는만큼 명백히 유리하며, 면역 이펙터 기능에 의존하는 mAbs와 세포독성 mAbs에 직접적으로 결합하거나 여러가지 이펙터 메카니즘을 이용한다. 이와 같이 병용되는 mAbs는 상승적인 치료 효과를 나타낼 수 있다. 이에 더하여, 항PSCA mAbs는 여러가지 화학치료제, 안드로겐-차단제, 면역조절자 (예컨대, IL-2, GM-CSF), 외과수술 또는 방사선요법과 같은 다양한 기타의 치료 기법 (상기 나열한 것들로 한정되지 않음)을 실시하면서 동시적으로 투여될 수 있다.
[0262] 항PSCA 항체 포뮬레이션은 항체를 종양 세포에 전달할 수 있는 여하한 경로를 통해 투여된다. 투여 경로에는 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내, 피내 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 치료는 일반적으로 항PSCA 항체 제제를 정맥 주사 (IV)와 같은 허용되는 투여 경로를 통해, 체중 1 kg 당 약 0.1, .2, .3, .4, .5, .6, .7, .8, .9., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 또는 25 mg의 투여량 범위로 반복 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 1주일간 mAb 10 - 1000 mg을 투여하는 것이 효과적이면서 잘 관용된다.
[0263] 전이성 유방암 치료에 HerceptinTM mAb를 사용한 임상 경험을 바탕으로, 최초에는 환자 체중 1 kg 당 항PSCA mAb 제제를 약 4 mg의 로딩 투여량으로 IV 투여하고, 이어서 주일간 약 mg/kg의 양으로 IV 투여하는 것은 허용가능한 투여 요법인 것으로 나타났다. 바람직하게는 최초 로딩 투여량을 90분간 또는 그 이상의 기간 동안 주입하는 것이 좋다. 최초 투여량이 잘 관용되었으면, 30분 또는 그 이상의 기간 동안 주기적으로 투여량을 유지시켜 투여한다. 당업자에게 잘 인식되는 바와 같이, 특정 경우마다 다양한 인자들이 이상적인 투여 요법에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자로는 예컨대, 사용된 Ab 또는 mAbs의 결합 친화성이나 반감기, 환자에 있어서 PSCA 발현 정도, 쉐드 (shed) PSCA 항원의 순환 정도, 소망되는 정체상태 항체 농도 수준, 치료 빈도, 및 본 발명의 치료방법과 병용되는데 사용되는 다른 제제 또는 화학요법제의 영향 및 특정 환자의 건강 상태를 들 수 있다.
[0264] 필요에 따라, 가장 효과적인 투여량 요법등의 결정을 보조하기 위해, 주어진 시료 중의 PSCA의 수준에 대해 환자를 평가한다 (예컨대 순환 PSCA 항원 및/또는 PSCA 발현 세포의 수준). 이러한 평가는 또한 치료 전반에 걸친 모니터링 목적에도 사용되며, 다른 변수 (예컨대, 뇨세포학 및/또는 방광암 요법에 있어서 ImmunoCyt 수준, 또는 유사성, 전립선암 치료법에 있어서 혈청 PSA 수준)의 평가와 조합시의 치료 성공률을 가늠하는데도 유용하다.
[0265] 항이디오타잎 항PSCA 항체는 또한 PSCA 관련 단백질을 발현하는 세포에 대한 면역 반응을 유발하기 위한 백신으로서 항암 치료에 사용될 수 있다. 특히, 항이디오타입 항체의 제조는 기술 분야에 잘 알려져 있고; 이 방법학은 PSCA 관련 단백질 상의 에피토프를 모사하는 항이디오타입 항PSCA 항체를 만들도록 쉽게 순응시킬 수 있다 (예컨대, Wagner et al., 1997, Hybridoma 16: 33-40; Foon et al., 1995, J. Clin. Invest. 96:334-342; Herlyn et al., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76 참조). 이러한 항이디오타입 항체는 암백신 전략에 사용될 수 있다.
[0266] 본 발명의 한가지 목적은 PSCA를 발현하는 종양 세포의 성장을 억제하거나 지연시키는, PSCA 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 포유동물, 바람직하게는 인간에 있어서, 이러한 PSCA 항체 및 방사능 요법 및 화학요법 중 적어도 한가지와 병용되는 PSCA 항체를 이용하여 혈관신생 및 다른 생물학적 기능을 억제하는 것이다.
[0267] 한가지 구체예에서, 인간 종양을 비롯한 종양을 화학요법제제 또는 방사능 요법 또는 이들의 조합과 함께 병용하는 경우 상승 효과를 거둘 수 있다. 즉, PSCA 항체에 의한 종양 성장의 억제는 화학요법 제제 또는 방사능 요법 및 이들의 조합과 병용될 경우 예상했던 것보다 더 개선된다. 상승작용은 예컨대, PSCA 항체만을이용하는 경우 또는 PSCA 항체와 화학요법 제제 또는 방사능 요법을 이용한 부가적인 치료시 예상되는 것보다 병용 치료시 종양 성장 억제가 더 잘되는 경우이다. 바람직하게는, 상승작용은 네이키드 PSCA 항체 또는 PSCA 항체와 화학요법제제 또는 방사능의 부가적인 조합을 이용한 치료로부터는 암의 퇴행이 예상되지 않을 경우 암의 퇴행에 의해 입증된다.
[0268] PSCA 항체 및 화학요법이나 방사능요법 또는 두가지 모두와의 병용법을 이용하는 종양 세포의 성장 억제 방법은 화학요법 또는 방사능 요법의 시술전, 시술중 또는 시술 후, 또는 이들의 여하한 조합 (즉, 하학요법 및/또는 방사능 요법의 시술전 및 시술중, 시술전 및 시술후, 시술중 및 시술후 또는 시술전, 시술중, 및 시술후) PSCA 항체를 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 예컨대, PSCA 항체는 방사능 요법 및/또는 화학요법을 시술하기 일반적으로 1 내지 60일, 바람직하게는 3 내지 40일, 더욱 바람직하게는 5 내지 12일 전에 투여한다. 그러나, 치료 프로토콜 및 환자의 특정 요구에 따라, 이 방법은 가장 효율적인 치료 효과를 제공하는 방식으로, 그리고 환자의 생명을 궁극적으로 연장시키는 방식으로 수행된다.
[0269] 화학요법 제제의 투약은 비경구 및 경장 경로에 의한 전신 경로를 비롯한 다양한 방법으로 수행할 수 있다. 한가지 구체예에서, PSCA 항체와 화학요법 제제를 별도의 분자로서 투여한다. 또 다른 구체예에서는 PSCA 항체를 예컨대, 화학요법 제제에 컨쥬게이션에 의해 부착시킨다 (예컨대, "인간의 항PSCA 항체의 생체내 이용을 통한 인간 암종의 치료 및 진단을 위한 인체 임상 시도"라는 제하의 실시예) 및 (항체 기반 치료법을 위한 표적으로서의 PSCA" 섹션) 참조. 화학요법 제제 또는 화학요법의 특정에로는 시스플라틴, 다카르바진 (DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 카르무스틴 (BCNU) 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 (아드리아마이신), 다우노루비신, 프로카르바진, 미토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트,5-플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 파클리탁셀(탁솔), 도세탁셀(택소티어), 알데스류킨, 아스파라지네이즈, 부술판, 카르보플라틴, 클라드리빈, 다카르바진, 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 인터페론 알파, 리프로리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르게이즈, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 프트렙토조신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈,클로람부실, 탁솔 및 이들의 조합물을 들 수 있다.
[0270] PSCA 항체와 병용되어 사용되는 방사능원은 치료되는 환자의 외부 또는 내부의 것일 수 있다. 방사능원이 환자에 대해 외부적인 경우, 그 요법은 외부빔 방사능요법 (EBRT:external beam radiation therapy)라 칭해진다. 방사능원이 환자 내부의 것인 경우, 그 치료법은 근접치료(BT: brachytherapy)라 칭해진다.
[0271] 방사능은 AECL Theratron and Varian Clinac과 같이, 이 목적을 위해 제조된 표준 장비를 이용하여 공지의 표준 기술에 따라 조사된다. 방사능 선량은 기술 분야에 잘 알려진 수많은 인자에 따라 결정된다. 이러한 인자로는 치료받는 장기, 조사 과정 중 불시에 악영향을 받을 수 있는 건강한 장기, 방사능 요법에 대한 환자의 관용성, 및 치료를 요하는 체표면적 등을 들 수 있다. 선량은 대게 1 내지 100 Gy, 더욱 구체적으로는 2 내지 80 Gy의 범위이다. 보고된 몇가지 선량은 척수에 대해서는 35 Gy, 신장의 경우 15 Gy, 간에 대해서는 20 Gy, 전립선의 경우 65-80 Gy로 보고된 바 있다. 그러나, 본 발명은 이러한 특정 선량으로 한정되는 것이 아님을 강조하고자 한다. 선량은 전술한 인자들을 포함한 주어진 상황에서 특정 인자들에 따라 담당의의 재량에 따라 정해진다.
[0272] 외부 방사능원과 환자 내부로의 도입지점 사이의 거리는 표적 세포의 사멸과 부작용의 최소화를 허용가능하게 균형시킬 수 있는 거리이다. 일반적으로, 외부 조사원은 환자 체내 도입 지점으로부터 70 내지 100 cm 거리에 있다.
[0273] 근접치료법은 일반적으로 방사능 조사원을 환자 체내에 두어 수행된다. 일반적으로, 조사원은 치료받는 조직으로부터 약 0-3 cm에 위치한다. 공지 기술에는 근접치료(interstitial), 강간요법 (intercavitary) 및 표면 근접치료법이 포함된다. 방사능 활성종은 영구적으로 또는 일시적으로 이식시킬 수 있다. 영구적 이식에 사용되어 온 몇몇 전형적인 방사능활성 원자로는 요오드-125 및 라돈을 들 수 있다. 일시적 이식에 사용된 몇가지 전형적인 방사능활성 원자에는 라듐, 세슘-137 및 이리듐-192가 포함된다. 근접치료에 사용된 몇가지 부가적인 방사능활성 원자에는 아메리슘-241과 금-198이 포함된다. 근접치료를 위한 방사능 선량은 외부 빔 방사능 요법의 경우와 같을 수 있다. 외부 빔 방사능 요법의 선량을 결정하는 전술한 인자 이외에, 근접치료시 선량을 결정하는데는, 사용된 방사능활성 원자의 특성도 고려된다.
X.C.) 세포성 면역 반응을 위한 표적으로서의 PSCA
[0274] 본 발명에 설명된 바와 같은 하나 이상의 HLA 결합 펩타이드의 면역학적 유효량을 함유하는 백신 및 백신의 제조 방법은 본 발명의 추가적인 구체예이다. 또한, 본 발명에 따른 백신은 청구된 펩타이드 한가지 이상의 조성물을 포괄한다. 펩타이드는 백신 중에 개별적으로 존재할 수 있다. 또는, 펩타이드는 동일 펩타이드의 복수개의 카피를 함유하는 호모폴리머 (동종중합체)로서 또는 다양한 펩타이드들의 헤테로폴리머 (이종중합체)로서 존재할 수도 있다. 폴리머는 증가된 면역학적 반응성을 갖는다는 장점을 가지며 (폴리머를 구성하는데 여러가지 상이한 펩타이드 에피토프들이 사용됨), 면역 반응에 표적화된 종양 관련 펩타이드 또는 병인성 생명체의 상이한 항원 결정인자와 반응하는 항체 및/또는 CTLs를 유발하는 부가적인 능력을 갖는다. 조성물은 항원의 천연 대역일 수도 있고, 예컨대 재조합적으로 또는 화학 합성에 의해 제조될 수도 있다.
[0275] 본 발명의 백신과 함께 사용될 수 있는 담체들은 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예컨대, 티로글로불린, 사람의 혈청 알부민과 같은 알부민, 파상풍 독소, 폴리아미노산, 예컨대, 폴리 L-라이신, 폴리 L-글루탐산, 인플루엔자, B형 간염 바이러스 코어 단백질 등이 여기에 포함된다. 백신은 물, 또는 염수, 바람직하게는 인산염 완충염수와 같이 생리적으로 관용가능한 (즉, 허용가능한) 희석제를 함유할 수 있다. 백신은 또한 일반적으로 애쥬번트도 함유한다. 불완전 Freund's 애쥬번트, 인산알루미늄, 수산화알루미늄 또는 명반과 같은 애쥬번트는 기술 분야에 잘 알려진 물질의 예이다. 또한, 본 발명에 설명된 바와 같이, CTL 반응은 본 발명의 펩타이드들을, 트리팔미토일-S-글리세릴시스테이닐세릴-세린 (P3CSS)와 같은 지질에 접합시킴으로써 프라임시킬 수 있다. 또한, 합성 시토신-포스포로티올화-구아닌-함유 (CpG) 올리고뉴클레오타이드와 같은 애쥬번트는 CTL 반응을 10- 내지 100-배 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (예컨대, Davila and Celis, J. Immunol. 165:539-547 (2000) 참조).
[0276] 본 발명에 따른 펩타이드 조성물을 주사, 에어로졸, 경구, 경피, 점막경로, 흉막내, 경막내, 또는 기타 적절한 경로로 투여함으로써 면역화시키면, 숙주의 면역계가 소망되는 항원에 특이적인 CTLs 및/또는 HTLs를 대량생산함으로써 백신에 반응한다. 결론적으로, 숙주는 PSCA 항원을 발현 또는 과발현하는 세포의 후기 발달에 적어도 부분적으로 면역을 갖게 되며, 또는 그 항원이 종양과 관련된 경우 적어도 소정의 치료적인 잇점을 취할 수 있다.
[0277] 몇가지 구체예에서, 클래스 I 펩타이드 성분을 항체 무력화를 유발 또는 수월하게 하는 성분 및 또는 표적 항원에 지향된 헬퍼 T 세포 반응과 조합시키는 것이 요망될 수 있다. 이러한 조성물의 바람직한 구체예는 본 발명에 따른 클래스 I 및 클래스 II 에피토프를 함유한다. 이러한 조성물의 대체적인 구체예는 본 발명에 따른 클래스 I 및/또는 클래스 II 에피토프와 함께, PADRETM (Epimmune, San Diego, CA) 분자 (예컨대 미국특허 5,736,142에 설명되어 있음)와 같은 교차반응성 HTL 에피토프를 포함한다.
[0278] 본 발명의 백신은 또한 수지상 세포 (DC)와 같은 항원 제시 세포 (APC)를 본 발명의 펩타이드를 제공하기 위한 비히클로서 함유할 수 있다.백신 조성물은 수지상 세포 동원 및 수확에 이어 시험관내에서 제조할 수 있는데, 이에 따라, 수지상 세포의 로딩은 시험관내에서 일어난다. 예컨대, 수지상 세포를 본 발명에 따른 미니유전자를 이용하여 형질 감염시키거나 펩타이드를 이용하여 펄스시킨다. 이어서 수지상 세포를 환자에게 투여하여 생체내에서 면역 반응을 이끌어낸다. DNA 기재건 펩타이드 기재건 백신 조성물은 또한 수지상 동원과 병용하여 생체내 투여될 수 있으며, 이에 따라, 수지상 세포의 로딩은 생체내에서 일어난다.
[0279] 바람직하게는 백신으로 사용될 폴리에피토프 조성물내로 봉입될 에피토프 어레이를 선택할 경우, 또는 백신에 포함될 불연속적 에피토프들을 선택할 경우 및/또는 미니유전자와 같은 핵산에 의해 코딩될 경우 다음의 이론들이 이용된다. 다음 이론들 각각을 균형있게 조화시켜 선택한다. 주어진 백신 조성물 중에 인코포레이션될 다중 에피토프는, 에피토프가 유래된 천연 항원의 서열에 인접할 수 있으나, 반드시 인접할 필요는 없다.
1.) 투여시 종양 소거와 관계있는 것으로 관찰된 면역 반응을 모방하는 에피토프들을 선택한다. HLA 클래스 I의 경우 적어도 하나의 종양 관련 항원 (TAA)로부터 얻어진 3-4개의 에피토프가 여기에 포함된다. HLA 클래스 II의 경우 유사반 이론이 적용된다: 다시 3-4개의 에피토프를 적어도 하나의 TAA로부터 선택한다 (예컨대, Rosenberg et al., Science 278:1447-1450 참조). 하나의 TAA로부터의 에피토프들은 하나 이상의 부가적인 TAAs로부터의 에피토프와 병용시켜 빈번하게 발현되는 TAAs의 다양한 발현 패턴을 갖는 종양을 표적화하는 백신을 만든다.
2.) 면역원성과 상관이 있도록 확립된 필수적인 결합 친화도를 갖는 에피토프를 선택한다: HLA 클래스 I의 경우 IC50은 500 nM 이하, 때로 200 nM 이하이며; 클래스 II의 경우 IC50은 1000 nM 이하이다.
3.) 충분한 수퍼모티프 산생 펩타이드 또는 대립유전자-특이적인 모티프 산생 펩타이드의 충분한 어레이를 선택하여 광범한 집단을 포괄한다. 예컨대, 적어도 80%의 집단 커버리지를 갖는 것이 좋다. 기술 분야에 통계 평가법으로 알려진 Monte Carlo 분석법을 이용하여 폭 또는 집단 커버리지의 중복성을 평가할 수 있다.
4.) 암관련 항원으로부터 에피토프를 선택할 경우, 환자는 천연 에피토프에 대해 내성을 일으킬 수 있었기 때문에 유사체를 선택하는데 종종 유용하다.
5.) 특히 관련있는 것은 "네스티드 에피토프"라 칭해지는 에피토프이다. 테스티드 에피토프는 주어진 펩타이드 서열에서 적어도 2개의 에피토프가 중복된 경우 발생한다. 네스티드 펩타이드 서열은 B 세포, HLA 클래스 I 및/또는 HLA 클래스 II 에피토프를 함유할 수 있다. 네스티드 에피토프를 제공할 경우, 일반적인 목적은 서열 하나당 에피토프수를 최대로 제공하는 것이 일반적인 목표이다. 따라서, 한가지 측면은 펩타이드에서 카르복시 말단 에피토프의 카르복시 말단 및 아미노 말단 에피토프의 아미노 말단이 아닌 펩타이드의 제공을 피하는 것이다. 네스티드 에피토프를 포함하는 서열과 같은 멀티에피토프 서열을 제공할 경우,병인적 또는 유해한 생물학적 특성을 갖지 않는지 확인하기 위해 서열을 스크리닝하는 것이 대체로 중요하다.
6.) 폴리에피토프 단백질이 만들어지거나 또는 미니유전자를 만들 때, 한가지 목적은, 목적하는 에피토프를 포괄하는 최소의 펩타이드를 생산하는 것이다. 이 이론은, 네스티드 에피토프를 함유하는 펩타이드를 선별하는 경우와 동일하지는 않다 해도 유사하였다. 그러나, 인공 폴리에피토프 펩타이드의 경우, 크기 최소화 목적은, 폴리에피토프 단백질의 에피토프들 간에 여하한 스페이서 서열을 통합하려는 필요성에 상쇄된다. 스페이서 아미노산 잔기는, 예컨대, 정션 에피토프 (면역계에 의해 인식되는 에피토프로서, 표적 항원에는 존재하지 않고 인공 에피토프의 근접부위에 의해서만 생산되는 에피토프)를 회피하기 위해, 또는 에피토프들간의 절단을 용이하게 함으로써 에피토프 제시를 향상시키기 위해 도입된다. 정션 에피토프는 일반적으로 회피되느데, 이는 수용체가 그 비천연 에피토프에 대한 면역반응을 일으킬 수 있기 때문이다. 특히 우려되는 것은 "우점 에피토프"인 정션 에피토프이다. 우점 에피토프는 다른 에피토프들에 대한 반응이 감소 또는 억제되는 이러한 시샘 반응(zealous response)을 야기할 수도 있다.
7.) 동일한 표적 단백질의 복수개의 변이체들의 서열이 존재할 경우, 잠재적인 펩타이드 에피토프들 역시 그의 보존성을 기초로 선택될 수 있다. 예컨대, 보존성에 관한 한가지 기준은 HLA 클래스 I 결합 펩타이드의 전체 서열 또는 클래스 II 결합 펩타이드의 전체 9-mer 코어가 특이적인 단백질 항원에 대해 평가된 서열들의 소정의 백분율로 보존되어야 한다는 것이다.
X.C.1. 미니유전자 백신
[0280] 복수개의 에피토프의 동시 전달을 가능케 하는 몇가지 상이한 접근법이 이용가능하다. 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산들은 본 발명의 특히 유용한 구체예이다. 미니유전자 중의 봉입을 위한 에피토프들은 전술한 섹션에 제시된 지침에 따라 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 핵산의 바람직한 투여 수단은 본 발명의 에피토프를 하나 또는 복수개 함유하는 펩타이드를 코딩하는 미니젠 구조물을 이용하는 것이다.
[0281] 멀티-에피토프 미니유전자의 용례를 후술하며, 이는 Ishioka et al., J. Immunol. 162:3915-3925, 1999; An, L. and Whitton, J. L., J. Virol. 71:2292, 1997; Thomson, S. A. et al., J. Immunol. 157:822, 1996; Whitton, J. L. et al., J. Virol. 67:348, 1993; Hanke, R. et al., Vaccine 16:426, 1998에 설명되어 있다. 예컨대, 수퍼모티프- 및/또는 모티프-산생 에피토프 유래 PSCA를 코딩하는 멀티-에피토프 DNA 플라스미드, PADRE
Figure 112006097924236-PCT00005
범용 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 PSCA로부터의 복수개의 HTL 에피토프 (예컨대, 표 VIII-XXI 및 XXII 내지 XLIX 참조), 및 소포체-전위 시그널 서열이 조작될 수 있다. 백신은 또한 다른 TAAs로부터 유래된 에피토프를 포함할 수도 있다.
[0282] 멀티-에피토프 미니유전자의 면역원성은 테스트된 에피토프에 대한 CTL 유발 반응의 강도를 평가하기 위한 트랜스제닉 마우스에서 확인가능하다. 또한, 생체내 DNA-코딩형 에피토프의 면역원성은 DNA 플라스미드로 형질 감염된 표적 세포에 대한 특이적 CTL 라인의 시험관내 반응과 상관이 있을 수 있다. 이러한 실험들은 미니유전자가 1) CTL 반응을 생산하는 역할과 2) 유발된 CTLs이 코딩된 에피토프를 발현하는 세포들을 인식하는 두가지 역할을 모두 한다는 것을 보여줄 수 있다.
[0283] 예컨대, 사람 세포에서의 발현을 위한 선별된 에피토프 (미니유전자)를 코딩하는 DNA 서열을 만들기 위해, 에피토프의 아미노산 서열을 역번역할 수 있다. 사람의 코돈 사용 표를 이용하여 각 아미노산에 대한 코돈 선택의 지침으로 삼을 수 있다. 이러한 에피토프-코딩 DNA 서열을 직접 결합시켜 번역시, 연속적인 폴리펩타이드 서열이 만들어지도록 한다. 발현 및/또는 면역원성을 최적화하기 위해, 부가적인 요소들을 미니유전자 설계 내로 통합시킬 수 있다. 역번역될 수 있고 미니유전자 서열 중에 포함되는 아미노산 서열들의 예로는 다음을 들 수 있다: HLA 클래스 I 에피토프, HLA 클래스 II 에피토프, 항체 에피토프, 유비퀴틴화 시그널 서열, 및/또는 소포체 표적화 서열. 또한, CTL 및 HTL 에피토프의 HLA 제시는 CTL 또는 HTL 에피토프에 인접한 합성 (예컨대 폴리-알라닌) 또는 천연 플랭킹 서열을 포함시킴으로써 개선될 수 있다; 에피토프(들)을 포함하는 이들 보다 큰 펩타이드들은 본 발명의 범위에 포괄된다.
[0284] 미니유전자 서열은 미니유전자의 플러스 및 마이너스 가닥들을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드들을 조립함으로써 DNA로 전환될 수 있다. 중복 올리고뉴클레오타이드들 (30-100 염기 길이)은 잘 알려진 기법을 이용함으로써 적절한 조건 하에서 합성, 인산화, 정제 및 어닐될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 말단들을 예컨대 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결시킬 수 있다. 에피토프 폴리펩타이드를 코딩하는이 합성 미니유전자를 소망하는 발현 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다.
[0285] 당업자에게 잘 알려진 표준 조절 서열을 벡터에 포함시켜 표적 세포에서의 발현을 확실히 하는 것이 바람직하다. 몇몇 벡터 요소들이 요망된다: 미니유전자 삽입을 위한 하류 클로닝 부위를 갖는 프로모터; 효율적인 전사 종결을 위한 폴리아데닐화 시그널; E. coli 복제 원점; 및 E. coli 선택자으한 마커 (예컨대 암피실린 또는 카나마이신 내성). 이 목적을 위해 수많은 프로모터들, 예컨대 사람의 시토메갈로바이러스 (hCMV) 프로모터를 사용할 수 있다. 다른 적절한 프로모터 서열에 관해서는 예컨대 미국특허 5,580,859 및 5,589,466 참조.
[0286] 미니유전자의 발현과 면역원성의 최적화를 위해 부가적인 벡터 변형이 요망될 수도 있다. 몇가지 경우, 효율적인 유전자 발현을 위해 인트론이 필요하며 하나 이상의 합성 또는 천연 인트론을 미니유전자의 전사된 대역 내로 통합시킬 수 있다. 미니유전자 발현을 증가시키기위해 mRNA 안정화 서열 및 포유동물 세포에서의 복제를 위한 서열들의 봉입을 고려할 수도 있다.
[0287] 일단 발현 벡터가 선택되면, 프로모터 하류의 폴리링커 대역내로 미니유전자를 클로닝시킨다. 이 플라스미드를 적절한 E. coli 균주 내로 형질전환시켜, 표준 기술을 이용하여 DNA를 제조한다. 미니유전자의 DNA 서열과 배향, 벡터 중에 포함된 기타 요소들을 제한효소 지도 및 DNA 서열 분석을 이용하여 확인한다. 정확한 플라스미드를 산생하는 세균 세포들을 마스터 세포 은행 및 작업 세포 은행으로서 보관할 수 있다.
[0288] 또한, 면역자극 서열 (ISSs 또는 CpGs)은 DNA 백신의 면역원성에 어떤 역할을 한느 것으로 보인다. 이러한 서열들은 면역원성 증강이 요망될 경우, 벡터 내에서, 미니유전자 코딩 서열 외부로 봉입될 수 있다.
[0289] 몇가지 구체예에서, 미니유전자-코딩 에피토프와 제2 단백질 (면역원성을 증가 또는 감소시키기 위해 포함됨)의 두가지 모두를 생산하는 바이-시스트로닉 발현 벡터를 사용할 수 있다. 공동발현될 경우 면역 반응을 유리하게 증강시킬 수 있는 단백질이나 폴리펩타이드의 예로는 시토카인 (예컨대, IL-2, IL-12, GM-CSF), 시토카인-유발 분자 (예컨대, LeIF), 공동자극 분자, 또는 HTL 응답의 경우, 범-DR 결합 단백질 (PADRE
Figure 112006097924236-PCT00006
Epimmune, San Diego, CA)를 들 수 있다. 헬퍼 (HTL) 에피토프는 세포내 표적 시그널에 결합되어 발현된 CTL 에피토프로부터 독립적으로 발현된다; 이것은 HTL 에피토프의 배향을 CTL 에피토프의 그것과는 다른 세포 구획으로 향하게 한다. 필요하다면, 이것은 HTL 에피토프의 HLA 클래스 II 경로로의 진입을 보다 효율적으로 용이하게 해줌으로써, HTL 유발을 개선시켜준다. HTL 또는 CTL 유발과 대조적으로, 면역억제 분자 (예컨대 TGF-β)의 공동 발현에 의해 면역 반응을 특이적으로 감소시키는 것이 어떤 질환에서 유리할 수 있다.
[0290] 플라스미드 DNA의 치료적 정량은 예컨대, E. coli에서의 발효 및 뒤이은 정제에 의해 생산될 수 있다. 작업 세포은행으로부터의 일정 부분들을 이용하여 성장 배지에 접종하고, 공지 기술에 따라 쉐이커 플라스크 또는 바이로반응기에서 포화시까지 생육시킨다. 플라스미드 DNA를 QUIAGEN, Inc. (Valencia, California)가 공급하는 고상 음이온 교환 수지와 같은 표준 바이오분리 기술을 이용하여 정제할 수 있다. 필요한 경우, 겔 전기영동 또는 다른 방법을 이용하여 개방 고리형 및 선형으로부터 수퍼코일된 DNA를 분리할 수 있다.
[0291] 정제된 플라스미드 DNA는 여러가지 포뮬레이션을 이용하여 주사용으로 제조될 수 있다. 이들 중 가장 간단한 것은 멸균 인산염 완충염수 (PBS) 중에 동결건조된 DNA를 재조성 하는 것이다. "네이키드 DNA"로 알려진 이러한 접근법은, 임상 시험에서 근육내 (IM) 투여용으로 현재 사용되고 있다. 미니유전자 DNA 백신의 면역치료적 효능을 극대화시키기 위해, 정제된 플라스미드 DNA를 조성하기 위한 또 다른 방법이 요구될 수 있다. 다양한 방법이 설명되어 왔으며, 새로운 기술도 이용가능하게 될 것이다. 양이온 지질, 당지질 및 융합생성 리포좀을 포뮬레이션에 이용할 수도 있다 (예컨대, WO 93/24640; Mannino & Gould-Fogerite, BioTechniques 6(7): 682 (1988); 미국특허 5,279,833; WO 91/06309; 및 Felgner, et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7413 (1987) 참조). 또한, 집합적으로 보호적, 상호반응적, 비축합형 화합물 (PINC)로 칭해지는 펩타이드 및 화합물들 역시 정제된 플라스미드 DNA로 복합화되어 안정성, 근육내 분산성 또는 특정 장기나 세포 종류에의 트래피킹과 같은 변수에 영향을 미칠 수 있다.
[0292] 미니유전자-코딩 CTL 에피토프의 HLA 클래스 I 제시 및 발현을 위한 기능적 분석으로서 표적 세포 감작화를 이용할 수 있다. 예컨대, 플라스미드 DNA를 표준 CTL 크롬 방출 분석용 표적으로서 적합한 포유동물 세포주 내로 도입한다. 이용된 형질 감염법은 최종 포뮬레이션에 의존할 것이다. 전기영동을 "네이키드" DNA에 사용할 수 있는 반면, 양이온 지질은 직접적인 시험관내 형질 감염을 가능케 한다. 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 플라스미드는 형광 활성화 세포 소팅 (FACS)를 이용하는 형질 감염된 세포의 강화를 가능케 하도록 공동형질 감염될 수 있다. 이러한 세포를 이어서 크롬-51 (51Cr) 표지시키니 다음 에피토프-특이적 CTL 라인용 표적 세포로서 사용한다;51Cr 방출에 의해 검출되는 세포 용해는 미니유전자-코딩 CTL 에피토프의 생산과 HLA 제시를 두가지 모두 가리키는 것이다. HTL 에피토프의 발현은 HTL 활성을 평가하기 위한 분석을 이용하여 유사한 방식으로 평가될 수 있다.
[0293] 생체내 면역원성은 미니유전자 DNA 포뮬레이션의 기능적 테스팅을 위한 두번째 접근법이다. 적절한 사람의 HLA 단백질을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 DNA 산물로 면역화시킨다. 투여 경로 및 투여량은 포뮬레이션 의존성이다 (에컨대, PBS 중 DNA IM, 지질 복합형 DNA의 경우 복강내 (i.p.)). 면역화로부터 21일 후, 비장을 수확하고 테스트된 각각의 에피토프를 코딩하는 펩타이드 존재하에 1주일간 재자극시킨다. 그 후, CTL 이펙터 세포의 경우, 펩타이드 로딩된 51Cr-표지된 표적 세포의 세포용해를 표준 기술에 따라 수행한다. 미니유전자-코딩 에피토프에 대응하는 펩타이드 에피토프가 로딩된 HLA에 의해 감작화된 표적 세포의 용해는 CTLs의 생체내 유도에 있어서의 DNA 백신 기능을 입증해준다. HTL 에피토프의 면역원성은 유사한 방식으로 트랜스제닉 마우스에서 확인된다.
[0294] 또는, 예컨대, 미국특허 5,204,253에 설명된 탄도전달을 이용하여 투여될 수 있다. 이 기술을 이용하여, DNA만으로 이루어진 입자들이 투여된다. 또 다른 대체적인 구체예에서는 DNA를 금입자와 같은 입자에 흡착시킬 수 있다.
[0295] 기술 분야에 잘 알려진 기타의 세균 또는 바이러스 전달계를 이용하여 미니유전자를 전달하여 본 발명의 에피토프를 코딩하는 발현 구조물을 백시니아와 같은 바이러스 벡터 내로 통합시킬 수 있다.
X.C.2. CTL 펩타이드와 헬퍼 펩타이드와의 조합제
[296] 본 발명의 CTL 펩타이드를 함유하는 백신 조성물은 예컨대 유사체화시키는 등에 의해 변형시킴으로써 개선된 혈청 반감기, 확장된 집단 커버리지 또는 증강된 면역원성과 같은 소망되는 특성을 제공할 수 있다.
예컨대, CTL 활성을 유발하는 펩타이드의 능력은 펩타이드를 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 에피토프를 적어도 하나 함유하는 서열에 링크시킴으로서 증강시킬 수 있다. CTL 펩타이드가 비록 T 헬퍼 펩타이드에 직접 링크될 수는 있지만, 종종 CTL 에피토프/HTL 에피토프 컨쥬게이트는 스페이서 분자에 의해 링크된다. 스페이서는 일반적으로 실질적으로 생리적 조건하에서 전하를 띠지 않는, 예컨대 아미노산 또는 아미노산 모사체와 같이 비교적 작고, 중성인 분자들로 이루어진다. 스페이서들은 일반적으로 예컨대, Ala, Gly 또는 비극성 아미노산이나 중성 극성 아미노산의 기타 중성 스페이서 중에서 선택된다. 임의로 존재하는 스페이서는 동일한 잔기로 이루어질 필요는 없고 따라서 헤테로 또는 호모-올리고머일 수 있다. 존재할 경우, 스페이서는 대개 적어도 하나 또는 두개의 잔기, 보다 일반적으로는 3 내지 6개의 잔기, 때로 10개 이상의 잔기 길이이다. CTL 펩타이드 에피토프는 CTL 펩타이드의 아미노 또는 카르복시 말단에서 스페이서를 통해 또는 직접적으로 T 헬퍼 펩타이드 에피토프에 링크될 수 있다. 면역원성 펩타이드 또는 T 헬퍼 펩타이드의 어느 한쪽의 아미노 말단은 아실화 될 수 있다.
[0298] HTL 펩타이드 에피토프 역시 그의 생물학적 특성을 변경하도록 변형될 수 있다. 예컨대, 이들은 프로테아제에 대한 그의 내성을 증가시킴으로써 혈청 반감기를 연장하도록 D-아미노산을 포함하도록 변형될 수 있으며, 또는 이들은 지질, 단백질, 탄수화물 등과 같은 다른 분자들과 접합되어 그의 생물학적 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 예컨대, T 헬퍼 펩타이드는 아미노 말단이나 카르복실 말단 중 어느 한쪽에서 하나 이상의 팔미트산과 접합될 수 있다.
X.C.3. CTL 펩타이드와 T 세포 프라이밍 제제와의 조합제
[0299] 몇몇 구체예에서 본 발명의 약학적 조성물은 B 임파구나 T 임파구를 초회감작 (priming)시키는 성분을 적어도 한가지 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 지질은 생체내에서 CTL을 초회감작시킬 수 있는 제제인 것으로 동정되었다. 예컨대, 팔미트산 잔기는 라이신 잔기의 ε- 및 α-아미노기에 부착되어, 예컨대, Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser 등과 같은 하나 이상의 링킹 잔기를 통해 면역원성 펩타이드에 링크될 수 있다. 이렇게 지질화된 펩타이드는 리포좀에 통합되거나 불완전 Freund' 애쥬번트와 같은 애쥬번트 중에 유화된 형태로 미셀 또는 입자에 직접 투여된다. 바람직한 구체예에서, 특히 효과적인 면역원성 조성물은 예컨대 Ser-Ser 결합을 통하여 면역원성 펩타이드의 아미노 말단에 부착된, Lys의 ε- 및 α-아미노기에 부착된 팔미트산을 함유한다.
[0300] CTL 반응의 지질 초회감작의 또 다른 예는, 적절한 펩타이드에 공유적으로 부착된 경우, S-글리세릴시스테인리세릴-세린(P3CSS)과 같은 E. coli 지단백질을 이용하여 바이러스 특이적인 CTL 초회감작시키는 것이다 (예컨대, Deres, et al., Nature 342:561, 1989 참조). 본 발명의 펩타이드는 P3CSS, 예컨대, 표적 항원에 대한 면역 반응을 특이적으로 초회감작시키기 위해 개체에 투여되는 리포펩타이드에 커플링될 수 있다. 뿐만 아니라, 무력화 항체의 유발 역시 P3CSS-접합 에피토프에 의해 초회감작될 수도 있기 때문에, 이러한 조성물들 두가지를 조합하여 체액 매개성 및 세포 매개성 응답의 두가지 모두를 효과적으로 이끌어낼 수 있다.
X.C.4. CTL 및/또는 HTL 펩타이드로 펄스된 DC를 포함하는 백신 조성물
[0301] 본 발명에 따른 백신 조성물의 일 구체예는 PBMC에 대한 에피토프 산생 펩타이드 또는 환자 혈액으로부터 분리된 DC를 생체외 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 예컨대 ProgenipoietinTM (Pharmacia-Monsanto, St. Louis, MO) 또는 GM-CSF/IL-4와 같이, DC 수확을 용이하게 하는 약학적 물질이 사용될 수 있다. DC를 펩타이드로 펄스시킨 후 그리고 환자에게 재주입하기 전에, DC를 세척하여 미결합 펩타이드를 제거한다. 이 구체예에서, 백신은 백신은 펩타이드-펄스형 DCs를 함유하는데 이것은 HLA 분자와 복합된 펄스형 펩타이드 에피토프를 그 표면상에 제시한다.
[0302] DC는 펩타이드들의 칵테일과 함께 생체외에서 펄스될 수 이고, 이들 중 일부는 PSCA에 대한 CTL 반응을 자극한다. 필요에 따라, 천연 또는 인공의 느슨하게 제한된 HLA 클래스 II 펩타이드와 같은 헬퍼 T 세포 (HTL) 펩타이드를 포함시켜 CTL 반응을 보조할 수도 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백신은 PSCA를 발현하거나 과발현하는 암을 치료하는데 이용된다.
X.D.) 후천성 면역요법
[0303] 항원성 PSCA 관련 펩타이드를 이용하여 생체외에서도 CTL 및/또는 HTL 반응을 이끌어낸다. 결과적인 CTL 또는 HTL 세포들을 다른 종류의 통상적인 치료법에는 반응하지 않거나, 특정 항원에 대한 생체외 (Ex vivo) CTL 또는 HTL 반응은 조직 배양으로 환자의, 또는 유전적으로 양립가능한, CTL 또는 HTL 전구체 세포를, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포 (APC)의 소스 및 적절한 면역원성 펩타이드와 함께 배양함으로써 유도된다. 전구체 세포들이 활성화되어 이펙터 세포 내로 확장되는 적절한 인큐베이션 시간 (대개 약 7-28일)이 경과한 후, 세포들을 환자에게 다시 주입하면, 이들은 특이적인 표적 세포 (예컨대, 종양 세포)를 파괴하거나 (CTL) 또는 파괴를 촉진 (HTL)할 것이다. 형질 감염된 수지상 세포 역시 항원 제시 세포로서 이용될 수 있다.
X.E.) 치료적 또는 예방적 목적을 위한 백신의 투여
[0304] 본 발명의 약학적 조성물과 백신 조성물은 일반적으로 PSCA를 발현 또는 과발현하는 암을 치료 및/또는 예방하는데 사용된다. 치료적 목적에서, 항원에 대해 효과적인 B 세포, CTL 및/또는 HTL 반응을 도출하는데 충분한 양으로, 그리고 적어도 부분적으로 증상 및/또는 합병증을 완화시키거나 정지시키는 양으로 환자에게 펩타이드 및/또는 핵산 조성물을 투여한다. 이러한 목적을 달성하는데 적합한 양을 "치료적으로 효과적인 투여량"이라고 한다. 이 용도에 유효한 양은 예컨대 투여되는 특정 조성물, 투여 방식, 치료하고자 하는 질병의 상태 및 위중도, 환자의 체중 및 일반적인 건강 상태, 및 주치의의 판단에 따라 달라진다.
[0305] 약학적 조성물의 경우, 본 발명의 면역원성 펩타이드, 또는 이들을 코딩하는 DNA는 일반적으로 PSCA를 발현하는 종양에 이미 걸린 개체에게 투여한다. 이들을 코딩하는 DNA 또는 펩타이드를 개별적으로 또는 하나 이상의 펩타이드 서열의 융합체로서 투여할 수 있다. 환자들은 이 면역원성 펩타이드로 별도로, 또는 적절한 경우 외과수술과 같은 다른 치료방법과 병용 치료될 수 있다.
[0306] 치료적 용도에서, 투여는 일반적으로 PSCA 관련 암이 최초로 진단된 때 개시하여야 한다. 이어서 적어도 증상이 실질적으로 경감될 때까지 그리고 얼마간 후에 부스팅 투여량을 투여한다. 환자에게 전달되는 백신 조성물의 구체예 (즉, 비제한적인 예로서 펩타이드 칵테일, 폴리에피토프 폴리펩타이드, 미니유전자, 또는 TAA-특이적인 CTL 또는 펄스된 수지상 세포를 함유한다)는 질병의 진행 단계나 환자의 건강 상태에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, PSCA를 발현하는 종양에 걸린 환자의 경우, PSCA 특이적인 CTL을 함유하는 백신은, 다른 구체예보다, 질병이 진행된 환자에서 종양 세포를 사멸시키는데 보다 효과적일 수 있다.
[0307] 투여 방식에 의해 전달되는 펩타이드 에피토프를 세포독성 T 세포 반응을 효과적으로 자극하는데 충분한 양으로 제공하는 것이 일반적으로 중요하다; 헬퍼 T 세포 반응을 자극하는 조성물 역시 본 발명의 이러한 구체예에 따라 주어질 수 있다.
[0308] 초기 치료적 면역화를 위한 투여량은 일반적으로 단위 투여량 범위로 제공되며 그 하한값은 체중 70 kg 환자 1명 당 약 1, 5, 50, 500, 또는 1,000 ㎍이고 그 상한값은 약 10,000; 20,000; 30,000; 또는 50,000 ㎍이다. 70 kg의 환자 당 일반적인 사람의 투여량 범위는 약 500 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍이다. 수주일에서 수개월에 걸친 부스팅 요법에 따른, 약 1.0 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍의 양의 펩타이드 부스트 투여량을, 환자의 혈액으로부터 얻어지는 CTL 및 HTL의 특이적 활성을 측정함으로써 결정되는 환자의 상태와 반응에 따라 투여할 수 있다. 그로부터 일정기간 후, 적어도 임상적 증상이나 실험적 테스트가 신생물이 제거되었거나, 감소되었음을 나타낼 때까지 투약을 계속하여야 한다. 투여량, 투여 경로 및 투여 스케쥴은 기술 분야에 알려진 방법론에 따라 조정한다.
[0309] 특정 구체예에서, 본 발명의 펩타이드와 조성물은 위중한 질병 상태, 즉, 생명을 위협하거나 잠재적으로 생명을 위협하는 상황에서 사용된다. 이러한 경우, 본 발명의 바람직한 조성물에서 펩타이드의 비교적 비독성적인 특성과 외인성 물질의 최소량을 사용하기 때문에, 치료의는 이들 언급된 투여량에 비해 이들 펩타이드 조성물을 실질적인 과량으로 투여하는 것이 가능하고 요망된다고 느낄 수 있다.
[0310] 본 발명의 백신 조성물은 또한 예방적 제제로서 순수하게 사용될 수 있다. 일반적으로 초기 예방적 면역화를 위한 투여량은 그 하한치가 약 1, 5, 50, 500, 또는 1000 ㎍이고 상한치는 약 10,000; 20,000; 30,000; 또는 50,000 ㎍인 단위 투여량 범위로 제공된다. 사람의 투여량 값은 일반적으로 약 70 kg 환자에 대해 500 ㎍ 내지 50,000 ㎍ 범위이다. 이후에 백신 초기 투여시기부터 약 4주일 내지 6개월의 소장 간격을 두고, 약 1.0 ㎍ 내지 약 50,000 ㎍의 부스트 투여량의 펩타이드를 투여한다. 백신의 면역원성은 환자의 혈액 시료로부터 수득한 CTL 및 HTL의 특이적인 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.
[0311] 치료를 위한 약학적 조성물은 비경구, 국소, 경구, 코, 경막내, 또는 국부 (예컨대 크림 또는 국소용 연고) 투여 경로로 사용된다. 바람직하게는, 이러한 약학적 조성물은 비경구적으로, 예컨대 정맥내, 피하, 피내 또는 근육내로 투여되는 것이 좋다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해 또는 현탁된 면역원성 펩타이드 용액으로 된 비경구 투여용 조성물을 제공한다.
[0312] 예컨대 물, 완충수, 0.8% 염수, 0.3% 글리신, 히알루론산 등과 같은 다양한 수성 담체를 사용할 수 있다. 이러한 조성물은 통상적인 공지 살균 기술에 의해 살균할 수도 있고 살균 여과시킬 수도 있다. 얻어진 수용액을 그대로 포장하거나, 또는 동결건조시켜, 동결건조된 제형을 투여전에 멸균 용액과 조합하여 사용한다.
[0313] 이러한 조성물은 적절한 생리적 조건의 요구에 따라, pH 조절제 및 완충제, 등장성 조절제, 보습제, 방부제 등과 같은 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대, 아세트산나트륨, 젖산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등을 함유할 수 있다.
[0314] 약학적 포뮬레이션 중의 본 발명의 펩타이드 농도는 크게 변할 수 있으며, 예컨대, 약 0.1 중량%, 대개 적어도 약 2 중량% 내지 많게는 20 내지 50 중량% 또는 그 이상의 양이 선택된 특정 투여 형식에 따라, 유체부피, 점도 등에 의해 주로 선택될 것이다.
[0315] 사람에 대한 조성물의 단위 투여 제형은 일반적으로 허용가능한 담체, 일례에서 수성 담체의 사람에 대한 단위 투여량을 함유하며, 부피/양으로 투여되는데, 이는 사람에게 이러한 조성물을 투여하는데 있어서 공지인 기술이다 (에컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 제17판, A. Gennaro, Editor, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1985). 예컨대, 초기 면역화를 위한 펩타이드 투여량은 70kg 환자에 대해 약 1 내지 약 50,000 ㎍, 일반적으로 100-5,000 ㎍이다. 예컨대, 핵산의 경우, 여러 부분에서 IM (또는 SC나 ID) 경로로 투여되는 네이키드 핵산 형태로 발현 벡터를 0.5-5 mg의 양으로 이용하여 초기 면역화를 수행할 수 있다. 핵산 (0.1 내지 1000 ㎍)은 또한 유전자총을 이용하여 투여될 수 있다. 3-4주일의 인큐베이션 기간 후에, 부스터 투여량을 투여한다. 부스터는 5-107 내지 5X109 pfu의 투여량으로 투여되는 재조합 조류폭스 바이러스일 수 있다.
[0316] 항체의 경우, 치료는 약 0.1 내지 약 10 mg/kg 체중의 범위의 투여량으로, 정맥 주사 (IV)와 같은 허용가능한 투여 경로를 통해 항PSCA 항체 제제를 반복 투여하는 것이 일반적이다. 일반적으로 1주일에 10-500 mg 범위의 투여량이 효과적이며 잘 관용된다. 뿐만 아니라, 약 4 mg/kg 환자 체중의 초기 로딩 투여량을 IV 투여한 다음 허용가능한 투여량 요법을 나타내는 항PSCA mAb 제제를 주당 약 2 mg/kg의 양으로 IV투여한다. 당업자에게 잘 인식되는 바와 같이, 여러가지 인자가 특정 경우의 이상적인 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자로는 예컨대, 조성물의 반감기, Ab의 결합 친화도, 물질의 면역원성, 환자의 PSCA 발현도, 순환 쉐드 PSCA 항원의 정도, 소망되는 항정상태 농도 수준, 치료 빈도 및 본 발명의 치료 방법과 병용되는 다른 화학요법 또는 다른 제제의 영향 및 특정 환자의 건강 상태를 들 수 있다. 사람에 있어서 비제한적인 단위 투여량은 예컨대, 500㎍ - 1mg, 1mg - 50mg, 50mg - 100mg, 100mg - 200mg, 200mg - 300mg, 400mg - 500mg, 500mg - 600mg, 600mg - 700mg, 700mg - 800mg, 800mg - 900mg, 900mg - 1g, 또는 1mg - 700mg이다. 특정 구체예에서, 이 투여량은 2-5 mg/kg 체중 범위이고, 예컨대, 주당 투여량 1-3 mg/kg; 예컨대, 2주일, 3주일, 또는 4주일간 주당 투여량이 체중 1 kg 당 0.5mg, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 mg의 양; 이어지는 2주일, 3주일 똔느 4주일간 주당 투여량 0.5-10 mg/kg 체중; 1m2의 체표면적 당 1주일 당 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400 mg의 투여량; 1m2의 체표면적 당 1주일에 1-600mg m2의 투여량; 1m2의 체표면적 당 1주일에 225-400 mg이며; 이러한 투여량은 그 후에도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 19, 11, 12 또는 그 이상의 주일동안 이어질 수 있다.
[0317] 일례에서, 폴리뉴클레오타이드의 사람에 대한 단위 투여 제형은 여하한 치료적 효과를 제공하는 적절한 투여량 범위 또는 유효량을 포함한다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 치료 효과는 폴리뉴클레오타이드의 서열, 폴리뉴클레오타이드의 분자량 및 투여 경로를 비롯한 여러가지 인자에 좌우된다.투여량은 일반적으로 즐상의 위중도, 환자의 병력 등 기술 분야에 알려진 다양한 인자에 따라 주치의 또는 기타 건강 관리 전문인이 선택한다. 일반적으로, 약 20 염기 길이의 폴리뉴클레오타이드의 경우에는, 투여량 범위는 예컨대, 독립적으로 선택된 하한치가 약 0.1, 0.25, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 또는 500 mg/kg이고, 독립적으로 선택된 상한치는 하한치보다 많은 투여량으로 하여, 약 60, 80, 100, 200, 300, 400, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10,000 mg/kg이다. 예컨대, 투여량은 대략 다음 중 어느 하나일 수 있다: 0.1 내지 내지 100 mg/kg, 0.1 내지 50 mg/kg, 0.1 내지 25 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg, 1 내지 500 mg/kg, 100 내지 400 mg/kg, 200 내지 300 mg/kg, 1 내지 100 mg/kg, 100 내지 200 mg/kg, 300 내지 400 mg/kg, 400 내지 500 mg/kg, 500 내지 1000 mg/kg, 500 내지 5000 mg/kg, 또는 500 내지 10,000 mg/kg이다. 일반적으로, 비경구적인 투여 경로는 병소 조직에 뉴클레오타이드를 보다 직접적으로 투여하는 경우에 비해서, 폴리뉴클레오타이드의 투여량을 [더 많이 요구할 것이며, 이는폴리뉴클레오타이드의 길이가 길어질수록 그러하다.
[0318] 일례에서, 사람에 있어서 T 세포의 단위 투여량은 여하한 치료 효과를 제공해주는데 효과적인 양 또는 적절한 투여량 범위이다. 당업자에게 인지되는 바와 같이, 치료 효과는 여러가지 인자에 의존한다. 투여량은 일반적으로 증상의 위중도, 환자의 병력 등과 같이 기술 분야에 알려진 몇가지 인자에 따라 치료의 또는 기타 건강 관리 전문인이 선택한다. 그 투여량은 약 104 세포 내지 약 106 세포, 약 106 세포 내지 약 108 세포, 약 108 내지 약 1011 세포, or 약 108 내지 약 5 x 1010 세포. 투여량은 또한 약 106 세포/m2 내지 약 1010 세포/m2, or 약 106 세포/m2 내지 약 108 세포/m2일 수 있다.
[0319] 본 발명의 단백질(들), 및/또는 그 단백질(들)을 코딩하는 핵산은 또한 리포좀을 통해 투여될 수 있으며, 이 리포좀은 1) 임파양 조직과 같은 특정 조직에 단백질(들)을 표적화 하고; 2) 병든 세포들을 선택적으로 표적화하거나; 또는 3) 펩타이드 조성물의 반감기를 증가시키는 역할도 한다. 리포좀은 유제, 포말제, 미셀, 불용성 단층, 액정, 인지질 분산액, 라멜라층 등을 포함한다. 이러한 제제에서, 전달하고자 하는 펩타이드를 단독으로 또는 CD45 항원에 결합하는 모노클로날 항체와 같은, 임파양 세포중에 우점적인 수용체에 결합하는 분자 또는 기타 치료적 또는 면역원적 조성물과 병용하여, 리포좀의 일부로서 통합시킨다. 따라서, 본 발명의 소망되는 펩타이드로 채워지거나 수식된 리포좀은 임파양 세포 부위로 지향될 수 있으며, 이 임파양 세포 부위에서 리포좀은 펩타이드 조성물을 전달한다. 본 발명에 따라 사용되기 위한 리포좀은 표준 낭포 형성성 지질로부터 형성되며, 이것은 일반적으로 콜레스테롤과 같이 중성 및 음전하를 띤 인지질 및 스테롤을 포함한다. 지질의 선택시에는 일반적으로 예컨대 혈류에서의 리포좀의 안정성, 리포좀 크기, 및 산 불안정성과 같은 사항들을 고려한다. Szoka et al, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), 및 미국특허 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, 및 5,019,369 참조.
[0320] 면역계의 세포 표적화를 위해, 리포좀 내로 통합될 리간드는 예컨대 소망되는 면역계 세포의 세포 표면 결정인자에 특이적인 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 펩타이드를 함유하는 리포좀 현탁액은 치료하고자 하는 질병의 상태, 전달되는 펩타이드, 투여 방법에 따라 달라지는 투여량으로 정맥내, 국소, 국부적으로 투여될 수 있다.
[0321] 고형 조성물의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체를 이용할 수 있으며, 여기에는 예컨대, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 탈컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘, 등이 포함된다. 경구 투여의 경우, 약학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 앞서 언급한 바 있는 담체들과 같은 통상 사용되는 여하한 부형제를, 본 발명의 1종 이상의 펩타이드인 활성 성분에 대해 대체로 10-95%, 더욱 바람직하게는 25-75%의 농도로 포함시킴으로써 형성된다.
[0322] 에어로졸 투여시에는, 면역원성 펩타이드를 계면활성제와 분사제를 함께 사용하여 미세분산 형태로 공급하는 것이 바람직하다. 펩타이드의 전형적인 백분율은 약 0.01-20 중량%, 바람직하게는 약 1-10 중량%이다. 계면활성제는 물론 비독성이어야 하며, 분사제 중에 가용성인 것이 바람직하다. 이러한 제제의 대표예는 지방족 다수산기 알코올 또는 그의 고리형 무수물과 카프르산, 옥탄산, 라우르산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레스테르산, 및 올레산과 같은 탄소원자 수가 약 6-22인 지방산의 에스테르 똔느 부분 에스테르이다. 계면활성제는 조성물을 약 0.1 내지 20% 함유하며, 바람직하게는 약 0.25-5%를 함유한다. 조성물의 잔량은 대개 분사제이다. 필요한 경우, 예컨대 코를 통한 전달시에는 레시틴과 같은 담체도 포함시킬 수 있다.
XI.) PSCA의 진단 및 예후적 구체예
[0323] 본 발명에 개시된 바와 같이, PSCA 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 반응성 세포독성 T 세포 (CTL), 반응성 헬퍼 T 세포 (HTL) 및 항폴리펩타이드 항체들은 암, 특히 표 I에 수록된 바와 같은 암과 같이 세포 성장이 조절곤란한 증상을 검사하는 공지의 진단적, 예후적 및 치료적 분석법에 사용된다 (예컨대, "Expression analysis of PSCA in normal tissues, and patient specimens"라는 제하의 실시예에 설명된 바와 같이 조직 발현의 그의 특이적인 패턴과 특정 암에 있어서의 그의 과발현 두가지 모두).
[0324] PSCA는 전립선암의 존재여부를 동정 및 모니터링하기 위해 수년간 의학분야의 실무자들이 사용하여온 원형적인 마커이다 (예컨대, Merrill et al., J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al., J. Urol. Aug; 162(2):293-306 (1999) and Fortier et al., J. Nat. Cancer Inst. 91(19): 1635-1640(1999) 참조). p53 및 K-ras 를 비롯한 다른 다양한 진단 마커들 역시 유사한 맥락에서 사용되고 있다(예컨대, Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 and Minimoto et al., Cancer Detect Prev 2000;24(1):1-12 참조). 따라서, 이러한 PSCA 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 개시 (및 이들 분자들의 존재여부를 동정하기 위해 사용되는 PSCA 폴리뉴클레오타이드 프로브 및 항PSCA 항체) 및 이들의 특성은 당업자로 하여금 예컨대, 암과 관련된 증상을 검사하는 것에 관한 다양한 진단 분석법과 같이, 이들과 유사한 방법에 이들 분자를 사용하게끔 해준다.
[0325] PSCA 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 반응성 T 세포 및 항체들을 이용하는 진단 방법의 전형적인 구체예는 PSCA 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 반응성 T 세포 및 항체를 사용하는, 잘 수립된 진단 분석법으로부터의 방법들과 유사하다. 전립선암의 PSCA 과발현 또는 전이를 모니터링하는 방법에서 PSCA mRNA의 존재여부 및/또는 수준을 관찰하기 위하여 예컨대, PSCA 폴리뉴클레오타이드가 프로브 (예컨대 노던 분석에 있어서, 예컨대, Sharief et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567-74(1994) 참조) 및 프라이머 (예컨대 PCR 분석에서, 예컨대, Okegawa et al., J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)참조)가 사용되는 것처럼, 본 발명에 설명된 PSCA 폴리뉴클레오타이드는 전립선암 및 이 유전자를 발현하는 다른 암의 PSCA 과발현 또는 전이를 검출하는 것과 동일한 방법으로 이용될 수 있다. 또는, PSA 단백질의 과발현 (예컨대, Stephan et al., Urology 55(4):560-3 (2000))) 또는 전립선 세포의 전이 (예컨대, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996))을 모니터링하기 위한 방법에서 PSCA 단백질의 존재여부 및/또는 수준을 관찰하는데 사용될 수 있는 PSCA에 특이적인 항체를 생산하는데 PSCA 폴리펩타이드를 이용하는 것과 마찬가지로, 본 발명에 설명된 PSCA 폴리펩타이드는, 전립선암 및 이 유전자를 발현하는 다른 암의 세포의전이 또는 PSCA 과발현을 검출하는데 필요한 항체를 만드는데 사용될 수 있다.
[0326] 특히, 전이는 기원이 되는 장기 (폐 또는 전립선샘 등)로부터 시체의 다른 부위 (임파절 등)로 암 세포를 이동시키는 것을 포함하기 때문에, PSCA 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 존재여부에 대해 생물학적 시료를 검사하는 분석법을 이용하여 전이의 증거를 제공할 수 있다. 예컨대, 보통은 PSCA 발현 세포를 함유하지 않는 조직 (임파절)으로부터의 생물학적 시료가 LAPC4 및 LAPC9, 임파절 및 뼈 전이로부터 분리된 이종이식편에서 보여지는 PSCA 발현과 같은 PSCA 발현 세포를 함유하는 것으로 밝혀지면, 이러한 발견은 곧 전이가 있음을 가리키는 것이다.
[0327] 또는 PSCA 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드는 예컨대, 보통은 PSCA를 발현하지 않거나 다른 수준으로 PSCA를 발현하는 생물학적 시료 중의 세포가 PSCA를 발현하거나 PSCA를 증가된 수준으로 발현하는 것으로 밝혀질 경우 (예컨대, 표 I에 수록된 암 첨부된 도면에 도시된 바와 같이 환자 시료에서의 PSCA 발현), 암의 증거를 제공하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석법에서 당업자들은 PSA, PSCA 등과 같은 제2의 조직 제한 마커 (PSCA에 더하여)의 존재에 대해 생물학적 시료를 테스트함으로써 전이의 보충적인 증거를 추가로 제공하기를 바랄 수 있을 것이다 (예컨대, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996) 참조).
[0328] 어떤 조직 섹션 중에서 PSCA 폴리펩타이드의 존재 여부를 동정하기 위한 면역조직화학의 사용은 그 조직에서의 특정 세포들의 변경된 상태를 가리킬 수 있다. 본 발명이 속한 기술 분야에서는 암 세포에서 발현되는 폴리펩타이드를 국소화하는 항체의 능력은 질병의 존재, 질병 상태, 종양의 진행 및/또는 공격성을 진단해주는 한가지 방법이라는 것이 이해되고 있다. 이러한 항체는 대응하는 비악성 조직에 비교되는 바와 같이, 암세포에서 폴리펩타이드의 변경된 분포 역시 검출할 수 있다.
[0329] PSCA 폴리펩타이드 및 면역원성 조성물은 또한 질병 상태에서 국소화된 변경된 서브셀(subcellular) 단백질의 현상을 고려할 때도 유용하다. 정상 상태에서 질병상태로의 세포의 변경은 세포 형태학의 변화를 야기하고 이는 종종 서브셀 단백질 국소화/분포의 변화와 관계가 있다. 예컨대, 정상 세포에서 극성 형태로 발현된 세포막 단백질은 질병에서 변경되어, 전체 세포 표면에 걸쳐 단백질을 비극성 방식으로 분포시키는 결과를 초래할 수 있다.
[0330] 질병 상태에서 변경된 서브셀 단백질 국소화 현상은 면역조직화학적 수단의 사용에 의해 MUC1 및 Her2 단백질 발현에 따라 입증되었다. 정상적인 상피 세포는 당단백질의 어떤 핵상 국소화에 더해, 전형적으로 MUC1의 첨단 분포를 갖는 반면 악성 병변은 종종 비극성 염색 패턴을 갖는 것으로 입증된다 (Diaz et al, The Breast Journal, 7; 40-45 (2001); Zhang et al, Clinical Cancer Research, 4; 2669-2676 (1998): Cao, et al, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 45: 1547-1557 (1997)). 또한, 정상적인 유방 상피는 Her2 단백질에 대해 음성이거나 기저외측부적 분포만을 나타내는 반면, 악성 세포는 세포표면 전체에 걸쳐 단백질을 발현할 수 있다 (De Potter, et al, International Journal of Cancer, 44; 969-974 (1989): McCormick, et al, 117; 935-943 (2002)). 또는, 단백질의 분포는 표면만의 국소화로부터 질병 상태에서 확산 세포질 발현을 포함하도록 변경될 수 있다. 이러한 예는 MUC1에서 찾아볼 수 있다 (Diaz, et al, The Breast Journal, 7: 40-45 (2001)).
[0331] 세포 중 단백질의 국소화/분포의 변경은, 면역조직화학법에 의해 검출되는 바와 같이, 특정 치료 기법의 선호도와 관련된 귀중한 정보도 제공할 수 있다. 마지막 논점은 단백질이 정상 조직에서 세포내에 존재하지만, 악성 세포에서는 세포 표면에 존재할 경우; 그 세포 표면 국소화가 그 세포로 하여금 항체 기반 진단 및 치료 요법에 잘 순응하도록 만들어준다는 상황으로 설명된다. 이러한 단백질 국소화의 변경이 PSCA에 대해 일어나면, PSCA 단백질 및 그에 관련된 면역 반응은 매우 유용하다. 따라서, 서브셀 단백질 국소화의 변경이 24P4C12에 에 대해 일어났는지를 결정하는 능력은 PSCA 단백질 및 그와 관련된 면역반응을 매우 유용하게 만들어준다. PSCA 조성물을 사용함으로써 당업자들은 중요한 진단적 및 치료적 결단을 내릴 수 있다.
[0332] PSCA에 특이적인 면역조직화학적 시약은 PSCA가 보통은 생산되지 않는 조직에서 폴리펩타이드가 나타날 경우 PSCA를 발현하는 종양의 전이를 검출하는데도 유용하다.
[0333] 따라서, PSCA 폴리펩타이드 및 그에 대한 면역 반응으로부터 결과되는 항체들은 당업자에게 잘 알려진 진단, 예후, 예방 및/또는 치료 목적과 같은 다양하고 중요한 맥락에서 유용하다.
[0334] PSA 폴리뉴클레오타이드 단편 및 폴리뉴클레오타이드 변이체가 PSA의 모니터링 방법에서 당업자들에 의해 사용되는 것과 유사한 방식으로, PSCA 폴리뉴클레오타이드 단편 및 폴리뉴클레오타이드 변이체가 사용된다. 특히, PSA를 모니터링하는 방법에서 전형적인 PSA 폴리뉴클레오타이드는 PSA cDNA 서열의 단편들로 구성된 프로브 또는 프라이머이다. 이를 설명하기 위해, PSA 폴리뉴클레오타이드를 PCR 증폭하는데 사용된 프라이머들은 폴리머라제 사슬 반응에서 기능하는데 있어 전체 PSA 서열 미만의 서열을 함유하여야 한다. 이러한 PCR 반응 맥락에서 당업자들은 일반적으로 증폭 조건을 최적화하거나 목적하는 폴리뉴클레오타이드의 다른 부분들을 증폭하기 위해 프라이머로서 사용될 수 있는 여러가지 상아힌 폴리뉴클레오타이드 단편들을 만들고 있다 (예컨대, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998) 참조). 이러한 단편의 사용에 관한 부가적인 설명은 "정상 조직, 및 환자의 표본에 있어서 PSCA의 발현 분석"이라는 제하의 실시예에 제공되며, 여기서는 PSCA 폴리뉴클레오타이드 단편을 프로브로서 사용하여 암 세포에서의 PSCA RNAs의 발현을 보여준다. 또한, 변이체 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 PCR 및 노던 분석법에서, 대응하는 mRNAs에 대한 프로브와 프라이머로서 사용된다 (예컨대, Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. 1996 Nov-Dec 11(6):407-13 and Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995)). 폴리뉴클레오타이드 단편 및 변이체는 이러한 관점에서 유용하며 여기서 이들은 고스트린젠시 조건 하에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 (예컨대 도 1에 도시된 PSCA 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 변이체)에 결합할 수 있다.
[0335] 또한, 그 에피토프에 특이적으로 결합하는 T 세포 또는 항체에 의해 인식될 수 있는 에피토프를 함유하는 PSA 폴리펩타이드를 PSA를 모니터링하는데 사용한다. PSCA 폴리펩타이드 단편 및 폴리펩타이드 유사체 또는 변이체들도 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 폴리펩타이드 단편 또는 폴리펩타이드 변이체를 이용하여 항체 (항PSA 항체 또는 T 세포)를 만드는 것은 실무자들에 의해 사용되는 융합 단백질과 같은 광범위한 시스템에서 일반적이다 (예컨대, Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995 참조). 이러한 관점에서, 각각의 에피토프(들)은 항체 또는 T 세포와 반응성인 구조물을 제공해주는 기능을 한다. 일반적으로, 숙련가들은 목적하는 폴리펩타이드의 다른 부분에 특이적인 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수 있다 (예컨대, 미국특허 5,840,501 및 미국 특허 5,939,533 참조). 예를 들어, 본 발명에서 설명된 PSCA 생물학적 모티프 중 하나 또는 기술 분야에서 입수가능한 모티프에 기초해서 당업자가 쉽게 동정할 수 이는 모티프-산생 서브서열을 포함하는 폴리펩타이드를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 관점에서 폴리펩타이드 단편, 변이체 또는 유사체는, 표적 폴리펩타이드 서열 (예컨대 도 1에 도시된 PSCA 폴리펩타이드)에 특이적인 항체 또는 T 세포를 발생할 수 있는 에피토프를 함유하는 한 일반적으로 유용하다.
[0336] 본 발명에 설명된 바와 같이, PSCA 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 (그리고 PSCA 폴리뉴클레오타이드 프로브 및 항PSCA 항체 또는 이러한 분자들의 존재를 동정하는데 사용되는 T 세포)는 표 I에 수록된 것들과 같은 암을 진단하는데 유용한 특이적인 활성을 나타낸다. PSA의 경우 성공적으로 수행되었던 것처럼, 전립선암과 같이, 본 명세서에 설명된 질병 상태의 존재 또는 개시를 평가하기 위해, PSCA 유전자 산물을 측정하는 진단적 분석법을 이용하여 예방적 수단으로서 또는 부가적인 모니터링을 위해 환자들을 동정한다. 뿐만 아니라, 이러한 물질들은 예컨대, PSA 단독을 이용한 테스트에 기초해서는 전립선 기원의 정확한 전이 진단 여부를 수행할 수 없는 상황에서, PSA와 유사하거나 상보적인 특징들을 갖는 분자에 대한 기술 분야의 요구사항을 만족시켜주므로 (예컨대, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996) 참조), 결론적으로, PSCA 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 (및 PSCA 폴리뉴클레오타이드 프로브 및 이러한 분자의 존재 여부를 동정하는데 사용되는 항PSCA 항체)와 같은 물질들은 전립선 기원의 전이를 확인하는데 있어서 필요하다.
[0337] 마지막으로, 진단 분석법에 있어서의 이들의 용도에 더하여, 본 명세서에 개시된 PSCA 폴리뉴클레오타이드는 PSCA 유전자 지도가 그려진 염색체 대역에 있어서 종양유전자 관련 염색체 이상을 동정하는데 있어서의 이들의 용도와 같이 몇가지 다른 용도들을 갖는다 (예컨대, 하기의 "PSCA의 염색체지도 작성"이라는 제하의 실시예 참조). 또한, 진단 분석법에 있어서의 용도에 더하여, 본 발명에 개시된 PSCA 관련 단백질 및 폴리펩타이드들은 미지 기원의 조직의 법의학적 분석에 있어서도 유용하다 (예컨대, Takahama K Forensic Sci Int 1996 Jun 28;80(1-2): 63-9 참조).
[0338] 이에 더하여, 본 발명의 PSCA 관련 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드들은 PSCA의 과발현으로 특징지어지는 질병 상태를 치료하는데 이용될 수 있다. 예컨대, 도 1의 아미노산이나 핵산 서열 또는 그의 단편을 이용하여 PSCA 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다. PSCA와 반응하는 다른 분자 또는 항체들을 이용하여 이 분자의 기능을 변경시킴으로서 치료적 잇점을 얻을 수 있다.
XII.) PSCA 단백질 기능의 저해
[0339] 본 발명은 PSCA가 그의 결합 파트너에 결합하는 것 또는 다른 단백질(들)과의 연계를 저해하는 여러가지 방법과 조성물 및 PSCA 기능을 저해하는 방법을 포함한다.
XII.A.) 세포내 항체를 이용한 PSCA의 저해
[0340] 한가지 접근법에서, PSCA에 특이적으로 결합하는 단일 사슬 항체를 코딩하는 재조합 벡터들을 유전자 전달 기술을 통해 PSCA 발현 세포 내로 도입한다. 따라서, 코딩된 단일 사슬 항PSCA 항체는 세포내에서 발현되어, PSCA 단백질에 결합함으로써 그의 기능을 억제한다. 이러한 세포내 단일 사슬 항체를 조작하는 방법은 잘 알려져 있다. "내부물질 (intrabodies)"이라고도 알려진 이러한 세포내 항체들은 세포에서 특정 구획에 특이적으로 표적화되어, 치료의 저해 활성의 촛점을 맞추게 되는 대조군을 제공하여 준다. 이러한 기술은 기술 분야에서 성공적으로 응용되어 왔다 (예컨대, Richardson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3137-3141; Beerli et al., 1994, J. Biol. Chem. 289: 23931-23936; Deshane et al., 1994, Gene Ther. 1: 332-337 참조).
[0341] 단일 사슬 항체는 유연성 링커 펩타이드에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄의 가변부를 함유하며, 단일 폴리펩타이드로서 발현된다. 필요에 따라, 단일 사슬 항체들은 경쇄 불변부에 연결된 단일쇄 가변부 단편으로서 발현된다. 공지의 세포내 트래피킹 (intracellular trafficking) 시그널을, 소망되는 세포내 구획으로 내부물질을 정확히 표적화시키기 위해 그러한 단일 사슬 항체들을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드 벡터내로 조작한다. 예컨대, 소포체 (ER)에 표적화된 내부물질을 선도 펩타이드를 통합하도록, 그리고 필요에 따라, KDEL 아미노산 모티프와 같은 C 말단 ER 보유 시그널을 통합하도록 조작한다. 핵에서 활성을 나타내도록 의도된 내부물질을, 핵국소화 시그널을 포함하도록 조작한다. 지질 부분들을 내부물질에 연결시켜 내부물질을 형질막의 세포질쪽으로 결박한다. 내부물질은 또한 세포질에서 기능을 나타내도록 표적화될 수도 있다. 예컨대, 세포질의 내부물질을 이용하여 세포질 내에서 인자들을 격리시킴으로써, 이들이 이들의 천연 세포 목적점까지 이동하는 것을 방지한다.
[0342] 일 구체예에서, 내부물질들을 이용하여 핵 내에서 PSCA를 포획함으로써, 핵에서의 그의 활성을 방지한다. 목적하는 표적화를 달성하기 위해, 핵 표적화 시그널을 이러한 PSCA 내부물질로 조작한다. 이러한 PSCA 내부물질은 특정 PSCA 도메인에 특이적으로 결합하도록 설계된다. 또 다른 구체예에서, PSCA 단백질에 특이적으로 결합하는 세포질 내부물질을 이용하여 PSCA가 핵에 접근하는 것을 방지함으로서, 핵에서 어떤 생물학적 활성도 나타내지 못하게 방지한다 (예컨대, PSCA가 다른 인자들과의 전사 복합체를 형성하는 것을 방지함).
[0343] 이러한 내부물질의 발현을 특정 세포에 특이적으로 지향시키기 위해, 내부물질의 전사를 적절한 종양 특이적인 프로모터 및/또는 인핸서의 조절적 조절 하에 수행한다. 내부물질의 발현을 전립선에 특이적으로 표적화하기 위해, PSA 프로모터 및/또는 프로모터/인핸서를 사용할 수 있다 (예컨대 1999년 7월 6일 등록된 미국특허 5,919,652호 참조).
XII.B.) 재조합 단백질을 이용한 PSCA의 억제
그 밖의 접근법으로서, 재조합 분자는 PSCA에 결합하고, 따라서 PSCA 기능을 억제한다. 예를 들면, 이러한 재조합 분자는 PSCA가 이들의 결합 파트너(들)과 접근/결합하는 것 또는 다른 단백질(들)과 결합하는 것을 억제 또는 예방한다. 이러한 재조합 분자는, 예를 들면, PSCA 특이적 항체 분자의 반응성 부분(들)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서는, PSCA 결합 파트너의 상기 PSCA 결합 영역은 이량체 퓨전 단백질로 설계되었다. 여기서 상기 퓨전 단백질은 인간 IgG1와 같은 인간 IgG의 Fc 부분에 연결된 두개의 PSCA 리간드 결합 영역을 포함한다. 이러한 IgG 부분에는, 예를 들면, CH2 및 CH3 영역 및 힌지 부위를 포함할 수 있으나 CH1 영역은 포함하지 않는다. 이러한 이량체 퓨전 단백질은 가용형태로 PSCA 발현에 관계된 암을 앓고 있는 환자에세 투여한다, 이렇게 함으로서 상기 이량체 퓨전 단백질은 특이적으로 PSCA에 결합하여 PSCA의 결합 파트너와의 상호작용을 차단한다. 이러한 이량체 퓨전 단백질은 알려진 항체 연결 기술을 이용하여 추가로 다량체 단백질에 결합할 수 있다.
XII.C.) PSCA 전사 또는 번역의 억제
[0345] 본 발명은 PSCA 유전자의 전사를 억제하기 위한 다양한 방법 및 조성물을 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명은 또한 PSCA mRNA을 단백질로 번역하는 것을 억제하는 방법 및 조성물을 제공한다.
[0346] 한 접근법에서, PSCA 유전자의 전사를 억제하는 방법은 PSCA 유전자를 PSCA 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 접촉하는 것을 포함한다. 또 다른 접근법으로서, PSCA mRNA 번역을 억제하는 방법은 PSCA mRNA를 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 접근법으로는, PSCA 특이적 리보자임을 PSCA 메시지를 분해하기 위해 사용하여, 번역을 억제하는 것이다. 이러한 안티센스 및 리보자임에 근거한 방법은 PSCA 프로모터 및/또는 인헨서 성분 등의 PSCA 유전자의 조절부위에 관한 것이다. 이와 유사하게, PSCA 유전자 전사 인자를 억제가능한 단백질이 PSCA mRNA 전사를 억제하는데 사용된다. 전술한 방법에 유용한 다양한 폴리뉴클레오타이드 및 조성물을 이전에 설명하였다. 안티센스 및 리보자임 분자를 전사 및 번역을 억제하기 위하여 사용하는 용도는 업계에 널리 알려져 있다.
[0347] PSCA 전사 활성을 방해하여 PSCA의 전사를 억제하는 그 밖의 인자는 PSCA를 발현하는 암의 치료에 유용하다. 이와 유사하게, PSCA 처리를 방해하는 인자는 PSCA를 발현하는 암의 치료에 유용하다. 이러한 인자를 활용한 암 치료 방법은 본 발명의 범위에 포함된다.
XII.D.) 치료 전략에 대한 일반적인 고려사항
[0348] 유전자 이식 및 유전자 치료 기술은 치료적 폴리뉴클레오타이드 분자 (즉, 안티센스, 리보자임, 세포내 항체를 코드화하고 있는 폴리뉴클레오타이드 및 그 밖의 PSCA 억제 분자)를 PSCA를 합성하는 종양 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 많은 수의 유전자치료 접근법이 업계에 알려져 있다. PSCA 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 리보자임, PSCA 전사를 방해하는 인자 등을 암호화한 재조합 벡터를 이러한 유전자치료 접근법을 사용한 표적 종양 세포에 전달할 수 있다.
[0349] 전술한 치료적 접근법은 다양한 외과적, 화학 요법 또는 방사선 치료법 중의 하나와 조합할 수 있다. 상기 본 발명의 치료적 접근법은 화학 요법 (또는 그 밖의 요법)의 복용량을 감소시키고 및/또는 덜 빈번한 투여를 하게 한다. 모든 환자 및 특히 화학 요법의 독성을 참지 못하는 환자에게 바람직하다.
[0350] 특정 조성물 (예컨대, 안티센스, 리보자임, 세포내 항체), 또는 이러한 조성물의 조합의 항암 활성은 다양한 시험관내 및 생체 내 분석 시스템을 사용하여 평가될 수 있다. 치료적 활성을 평가하는 시험관내 분석에는 세포 성장 분석, 반고형 한천 분석 및 종양 프로모팅 활성을 지시하는 그 밖의 분석 및 치료적 조성물이 PSCA가 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 정도를 결정하는 결합 분석을 포함한다.
[0351] 생체 내에서, PSCA 치료적 조성물의 효과는 적합한 동물 모델로 평가할 수 있다. 예를 들면, 이종 전립선암 모델이 사용될 수 있으며, 여기서, 인간 전립선암 외식 또는 대이음 이종이식 조직이 누드 또는 SCID 마우스 (Klein et al, 1997, Nature Medicine 3:402-408)와 같은 면역 조절 동물에 도입되었다. 예를 들면, PCT 출원 W098/16628 및 미국특허 제6,107,540호에서는 원발 종양, 미소 전이, 및 말기 단계의 골형성 전이의 발생을 되풀이할 수 있는 인간 전립선암의 다양한 이종이식 모델을 설명하였다. 종양 형성, 종양 퇴화 또는 전이 등의 억제를 측정하는 분석을 사용하여 효능을 예측할 수 있다.
[0352] 세포자멸사를 증진시키는 것을 평가하는 생체 내 분석이 치료 조성물의 평가에 유용하다. 한가지 구체예에서, 미치료 대조구 종양이식 마우스와 비교하여 치료적 조성물로 치료한 종양을 지닌 마우스의 이종이식에서 세포자멸사 부위의 존재를 조사하였다. 치료된 마우스의 종양 내의 자기 사멸 부위의 정도가 상기 조성물의 치료 효능을 나타내었다.
[0353] 전술한 방법에 사용된 상기 치료적 조성물은 소망하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 적합한 담체에는 치료적 조성물에 결합하여, 치료적 조성물의 항암 작용을 보유하게 하며, 일반적으로 환자의 면역 시스템에 무반응성인 어떠한 물질도 가능하다. 그 예에는 염수로 완충된 무균 포스페이트, 정균수 등의 많은 표준 약학적 담체를 포함하나 이에 한정되지 않는다 (일반적으로, Remington's Pharmaceutical Sciences 16 Edition, A. Osal., Ed., 1980 참조).
[0354] 치료적 제형은 가용화될 수 있으며, 치료적 조성물을 종양 부위에 전달할 수 있는 모든 방법을 통해 투여할 수 있다. 잠재적으로 효과적인 투여 경로에는 정맥, 비경구, 복강 내, 근육 내, 종양 내, 피부 내, 기관 내, 동소 등이 포함되나 이에 한정하지 않는다. 정맥 주사용의 선호되는 제형은 치료적 조성물의 보존 정균 수용액, 무균 비보존 수용액, 및/또는 희석된 0.9% 무균 소듐 클로라이드를 함유한 주사용 폴리비닐클로라이드 또는 폴리에틸렌 백, USP가 있다. 치료적 단백질 제조를 위해 무균 분말과 같이 동결 건조되고 좋기로는 진공하에 저장되며, 그 후 주사 전에 정균수 (예를 들면, 벤질 알콜 보존제를 함유) 또는 무균수 내에서 가공된다.
[0355] 전술한 방법을 사용한 암 치료를 위한 복용량 및 투여 프로토콜은 방법 및 표적 암에 따라 다양하며, 일반적으로 알려진 많은 그 밖의 인자에 따라 달라진다.
XIII.) PSCA 조절제의 확인, 특징화 및 용도
조절제의 확인 및 사용 방법
[0356] 한가지 구체예에서, 특정 발현 특성을 유도 또는 억제하고, 특이적 경로를 억제 또는 유도하고, 좋기로는 관계된 표현형을 형성하는 조절제를 확인하기 위하여 선별을 행하였다. 다른 구체예에서, 식별된 차등적으로 발현된 유전자를 지니는 것은 특정단계에서 중요하다; 선별은 개개의 유전자의 발현을 증가 또는 감소하도록 변경시키는 조절제를 확인하기 위하여 수행된다. 또 다른 구체적 실시 상태에서, 선별은 차등적으로 발현된 유전자의 발현 산물의 생물학적 기능을 변경시키는 조절제를 확인하기 위해서 수행한다. 즉, 특정 단계의 유전자의 중요성을 확인하였다면, 선별은 유전자 산물의 생물학적 활성을 결합 및/또는 조절하는 약제를 확인하기 위하여 수행한다.
[0357] 추가적으로, 선별은 후보 약물에 반응을 유도하는 유전자를 위하여 행한다. 조절제(암 발현 패턴을 억제하여 정상 발현 패턴을 이끄는 것 또는 정상 조직 내의 유전자 발현을 이끄는 암 유전자의 조절제)의 확인 후에는 선별이 약물에 반응하는 특이적으로 조절된 유전자를 확인하기 위하여 수행된다. 정상 조직 및 약물 치료 암 조직 간의 발현 특성 비교를 통하여 정상 조직 또는 암 조직 내에서 발현하지 않으나, 약물 치료 조직에서만 발현하는 유전자 및 그 반대의 유전자를 알아내었다. 이러한 약물-특이적 서열이 암 유전자 또는 단백질을 위한 전술한 방법을 사용하여 확인되었다. 특히, 이러한 서열 및 이들이 암호화한 단백질이 약물 치료 세포를 표지하고 확인하는데 사용되었다. 추가적으로, 항체가 약물 유도성 단백질에 대항하여 증가하였으며, 표적화하기 위하여 치료된 암조직 시료에 신규의 치료제가 사용되었다.
조절제-관련 확인 및 선별 분석:
유전자 발현-분석
[0358] 본 발명의 단백질, 핵산 및 항체가 선별 분석에 사용되었다. 이러한 서열을 함유한 상기 암-관련 단백질, 항체, 핵산, 변형 단백질 및 세포가 폴리펩타이드의 발현 특성 또는 생물학적 기능의 변경 등의 "유전자발현 특성"에 대한 약물 후보의 효과를 평가하는 선별 분석에 사용되었다. 한가지 구체예에서, 상기 발현 특성이 사용되었으며, 좋기로는 후보 약제로 치료 후 유전자의 발현 특성을 모니터링하기 위하여 초고속 선별법에 관한 특성이 사용되었다 (예컨대, Davis, GF, et al, J Biol Screen 7:69 (2002); Zlokarnik, etal., Science 279:84-8 (1998); Heid, Genome Res 6:986-94,1996).
[0359] 암 단백질, 항체, 핵산, 변형 단백질 및 기존의 또는 변형 암 단백질 또는 유전자를 지닌 세포가 선별 분석에 사용되었다. 즉, 본 발명은 본 발명의 암 단백질의 암 표현형 또는 생리학적 기능을 조절하는 조성물을 위한 선별 방법을 포함한다. 이는 유전자 자체 "유전자 발현 특성" 또는 생물학적 기능에 대한 약물 후보의 효과에 대한 평가에 의하여 수행된다. 한가지 구체예에서, 상기 발현 특성이 사용되었으며, 좋기로는 후보 약제로 치료 후 유전자의 발현 특성을 모니터링하기 위하여 초고속 선별법에 관한 특성이 사용되었다. 전술한 Zlokamik 참조.
[0360] 다양한 분석이 본 발명의 유전자 및 단백질에 관하여 사용되었다. 분석을 개개의 핵산 또는 단백질 농도에 대하여 행하였다. 즉, 암에서 조절된 특정 유전자를 확인하면서, 시험 화합물은 유전자발현 조절능 또는 본 발명의 암 단백질 결합에 대하여 선별되었다. 본 명세서의 문맥상 "조절"은 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 것을 포함한다. 선호되는 조절량은 정상 대 암 조직의 유전자 발현의 원래 변화에 따르며, 이 변화는 적어도 10%, 좋기로는 50%, 더 좋기로는 100 내지 300%, 일부 한가지 구체예에서는 300 내지 1000% 또는 그 이상이다. 그러므로, 만일, 정상 조직에 비해 암 조직 내에서 유전자가 4 배 증가하였다면, 약 4 배의 감소가 소망된다; 이와 유사하게, 정상 조직에 비해 암 조직 내에서 유전자가 10 배 감소하였다면, 시험 화합물에 의하여 10 배 증가 표적치가 종종 소망된다. 예컨대, 추가 분석에서 상향 조정된 표적과 같이암에서 보이는 유전자발현형을 악화시키는 조절제가 또한 유용하다.
[0361] 유전자발현의 양은 핵산 탐침 및 유전자발현 수준의 수량화를 통하여 모니터링된다. 대안적으로는, 유전자 산물 자체가 예컨대, 암 단백질에 대한 항체 및 표준 면역분석을 통하여 모니터링된다. 단백질공학 및 분리 기법을 발현의 수량화에 사용하였다.
유전자 발현을 변형하는 화합물을 확인하기 위한 발현 모니터링
[0362] 한가지 구체예에서, 유전자발현 모니터링, 즉, 발현 특성이 동시에 다수의 독립체에 대하여 모니터링되었다. 그러한 특성은 전형적으로 도 1의 하나 이상의 유전자에 관련되어 있다. 이 구체적 실시 상태에서, 예컨대, 암 핵산 탐침은 특정 세포의 암 서열을 검출하고 수량화하기 위하여 바이오칩에 부착되어있다. 대안적으로는, PCR을 사용할 수 있다. 그러므로, 연속체, 예컨대, 마이크로타이터(microtiter) 플레이트의 웰이 소망하는 웰 안에서 투여된 프라이머와 함께 사용된다. PCR 반응이 그 뒤에 수행되었고, 각각의 웰에 대하여 분석되었다.
[0363] 발현 모니터링은 하나 이상의 암 관련 서열의 발현을 변형한 화합물을 확인하기 위하여 수행되었다, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 서열을 도 1에 나타내었다. 일반적으로, 시험 조절제가 분석 전에 세포에 첨가되었다. 더욱이, 선별은 본 발명의 암 단백질에 결합하거나, 본 발명의 암 단백질이 항체 또는 그 밖의 결합 파트너와의 결합을 방해하는 암 조절제, 본 발명의 암 단백질 조절제의 확인을 위하여 제공되었다.
[0364] 한가지 구체예에서, 초고속 선별 방법은 잠재적 치료적 화합물 (후보 화합물)의 많은 수를 함유하는 라이브러리를 제공하는 것과 관련되어 있다. 하나 이상의 분석에서 이러한 "조합 화학적 라이브러리"에서 그러한 소망하는 측정 활성을 나타내는 라이브러리 원소 (특정 화학 종 또는 아종)가 선별된다. 상기 확인된 화합물은 그러므로 선별을 위한 화합물 또는 치료제로서 종래의 "선도 화합물"로 작용할 수 있다.
[0365] 특정 구체예에서, 잠재적 조절제의 조합 라이브러리는 암 폴리펩타이드에 결합하는 능력 또는 활성을 조절하는 능력에 따라 선별되었다. 종래에는, 유용한 특성을 지닌 새로운 화학적 물질은 일부 소망하는 물성 또는 활성 예컨대, 억제 활성을 지닌 화학적 화합물 ("선도 화합물")을 확인하고 선도 화합물의 변형체를 만들고 이러한 변형 화합물의 물성 및 활성을 평가하여 생성시켰다. 종종, 초고속 선별 (HTS) 방법이 이러한 분석에 사용되었다.
[0366] 전술한 바와 같이, 조절제 후보 (예컨대, 단백질, 핵산 또는 작은 분자)를 ㅌ스트하는데 유전자 발현 모니터링을 간편하게 이용한다. 후보 약물을 첨가한 후, 상기 세포를 일정기간 동안 배양하였다. 상기 분석될 표적 서열을 함유하는 시료를 바이오칩에 첨가하였다.
[0367] 필요하다면, 표적 서열은 알려진 기법을 사용하여 제조되었다. 예를 들면, 시료를 알려진 용해 완충액, 전기천공 등을 사용하여 적절히 정제 및/또는 PCR 등으로 증식시켜 처리하여 세포를 용해시켰다. 예를 들면, 뉴클레오타이드에 공유결합되어 표지된 시험관내 전사를 수행하였다. 일반적으로, 상기 핵산은 바이오틴-FITC 또는 PE, 또는 cy3 또는 cy5로 표지된다.
[0368] 표적 서열은 예컨대, 형광, 화학 발광, 화학적, 또는 방사성 신호로 표지되어 탐침과 표적 서열의 특이적 결합을 검출하는 수단을 제공한다. 상기 표지는 알카리성 포스페타아제 또는 홍당무과산화효소 등의 효소가 될 수도 있다. 이들은 적절한 기질에 제공된 경우 검출되는 생성물을 생산한다. 또는, 상기 표지는 결합되어 효소에 의해 분해되거나 변형되지 않는 효소 억제제와 같은 화합물 또는 소분자에 표지된다. 상기 표지는 특이적으로 스트렙타비딘에 결합하는 에피토프 태그 또는 바이오틴과 같은 부분 또는 화합물이 돨 수도 있다. 바이오틴의 경우, 전술한 바와 같이 스트렙타비딘 표지시킴으로써, 결합된 표적 서열에 검출 가능 신호를 제공한다. 결합되지 않은 표지된 스트렙타비딘은 통상 검출 전에 제거된다.
[0369] 당업자가 이해하는 바와 같이, 이러한 분석은 하이브리다이제이션 분석에 관한 것이며 또는 다중 탐침을 사용하는 "샌드위치 분석"을 포함한다. 이들은 일반적으로 미국 특허 제5,681,702호; 제5,597,909호; 제5,545,730호; 제5,594,117호; 제5,591,584호; 제5,571,670호; 제5,580,731호; 제5,571,670호; 제5,591,584호; 제5,624,802호; 제5,635,352호; 제5,594,118호; 제5,359,100호; 제5,124,246호; 및 제5,681,697호에 설명되어 있다. 이러한 구체적 실시 상태에서, 일반적으로, 표적 핵산을 전술한 바와 같이 제조하였으며, 그 뒤 하이브리다이제이션 복합체를 형성하는 조건하에 다수의 핵산 탐침으로 구성된 바이오칩에 첨가하였다.
[0370] 상기한 고스트린젠시, 중간 스트린젠시, 및 저스트린젠시 조건을 포함하는 다양한 하이브리다이제이션 조건이 본 발명에서 사용되었다. 분석은 일반적으로 표적의 존재 하에서만 상기 표지 탐침 하이브리다이제이션 복합체가 형성되는 반응 조건하에서 수행되었다. 반응 조건은 열역학적 변수인 단계적인 매개 변수를 변경함으로써 조절된다. 이러한 변수에는 온도, 포름아미드 농도, 염 농도, 무질서화제 염 농도 pH, 유기 용매 농도 등이 있다. 이러한 매개 변수는 비특이적 결합을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 이는 일반적으로 미국 특허 제5,681,697호에 설명되어 있다. 그러므로, 비특이적 결합을 줄이기 위해서는 고도의 반응 조건으로 특정 공정을 수행하는 것이 바람직하다 .
[0371] 본 명세서에서 설명된 반응은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 다음에 설명할 선호되는 구체적 실시상태에서 반응 성분은 동시 또는 순차적으로 또는 서로 다른 순서로 첨가될 수 있다. 추가적으로, 상기 반응은 다양한 그 밖의 시약을 포함할 수 있다. 이러한 것에는 염, 완충제, 알부민 등의 천연 단백질, 세정제 등이 포함된다. 이들은 최적 하이브리다이제이션 및 검출 및/또는 비특이적 또는 배경 상호작용을 촉진하기 위하여 사용된다. 분석의 효율을 높이는 그 밖의 시약, 예를 들어, 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물 제제 등은 시료 제조 방법 및 표적의 순도에 따라 적절히 사용될 수 있다. 분석 데이터를 분석하여 개개 유전자의 발현 수준, 및 여러 상태 사이의 발현 수준 변화를 측정하여, 유전자 발현 프로파일을 만든다.
생물학적 활성 관련 분석
[0372] 본 발명은 암 관련 유전자 또는 단백질의 활성을 조절하는 화합물의 확인 또는 선별방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 정의된 시험 화합물을 본 발명의 암 단백질을 포함하는 세포에 첨가하는 것을 포함한다. 상기 세포에는 본 발명의 암 단백질을 코딩한 재조합 핵산을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 후보 약물의 라이브러리를 다수의 세포에 대해 시험한다.
[0373] 한가지 측면에서, 분석은 생리학적 신호, 예컨대, 호르몬, 항체, 펩타이드, 항원, 사이토카인, 성장 인자, 활동 전위, 화학 요법, 방사선, 발암원을 포함하는 약리제제, 또는 그 밖의 세포 (즉, 세포-세포 접촉) 등의 존재 또는 부재, 또는 이전 또는 이후에 평가된다. 그 밖의 실시예에서는, 상기 세포 주기의 다양한 단계에서 측정되었다. 이러한 방법으로, 본 발명의 유전자 또는 단백질을 조절하는 화합물이 확인되었다. 약리 활성을 지닌 화합물은 본 발명의 암 단백질의 활성을 증진 또는 방해할 수 있다. 일단 확인되면, 유사한 구조를 평가하여 화합물의 핵심적인 구조적 특징을 확인한다.
[0374] 한가지 구체예에서, 암 세포 분열의 조절 (예컨대, 억제) 방법이 제공되었다; 상기 방법에는 암 조절제를 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 암 조절 (예컨대, 억제) 방법이 제공되었다; 상기 방법은 암 조절제. 추가적인 구체적 구체예에서, 암을 지닌 세포 또는 개인을 치료하는 방법을 제공하였다; 상기 방법은 암 조절제를 투여하는 것을 포함한다.
[0375] 한가지 구체예에서, 본 발명의 유전자를 발현하는 세포의 상태를 조절하는 방법이 제공된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상태는 예컨대, 세포의 성장, 증식, 생존, 기능, 세포자멸사, 노화, 위치, 효소 활성, 신호 전달 등의 업계에서 허용가능한 매개 변수를 포함한다. 한가지 구체예에서, 암 억제제는 전에 논의된 항체이다. 또 다른 구체예에서, 암 억제제는 안티센스 분자이다. 본 명세서에서 설명한 바와 같이 다양한 세포 성장, 증식, 및 전이 분석이 당업자에게 알려져 있다.
조절제 확인을 위한 초고속 선별법
[0376] 적합한 조절제를 확인하기 위한 분석은 초고속 선별법을 따른다. 선호되는 분석은 그러므로 암 유전자전사의 증진 또는 억제, 폴리펩타이드 발현의 증진 또는 억제 및 폴리펩타이드 활성의 증진 또는 억제를 검출한다.
[0377] 한가지 구체예에서, 초고속 선별 방법에 의해 평가된 조절제는 단백질이며, 이들은 종종 천연 단백질 또는 천연 단백질의 단편이다. 그러므로, 예컨대, 단백질을 포함한 세포 추출물, 또는 무작위 또는 표적 소화된 단백질성 세포 추출물이 사용된다. 이러한 방법으로, 본 발명의 방법으로 선별하기 위한 단백질 라이브러리가 만들어졌다. 특히 선호되는 구체예는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 및 포유류 단백질의 라이브러리이고, 후자가 선호되며, 인간 단백질이 특히 선호된다. 특히 유용한 시험 화합물은 그 표적이 속하는 단백질 클래스로서, 예컨대, 효소에 대한 기질, 또는 리간드 및 수용체이다.
조절제의 동정 및 특징화를 위한 연질 한천 성장 및 집락 형성의 사용
[0378] 정상 세포는 부착하고 성장하기 위한 고체 기질이 필요하다. 세포가 형질전환된 경우, 이들은 자신의 표현형을 잃고, 기질로부터 분리되어 성장한다. 예를 들면, 형질전환 세포는 교반되는 현탁 배양되거나 또는 반고형 한천과 같은 반고형 배지에서 현탁되어 성장한다. 상기 형질전환 세포가 종양 억제 유전자로 형질전환 감염된 경우 정상 표현형을 재생성할 수 있으며, 다시 고체 기질에 결합하여 성장한다. 분석에서는 암 서열의 조절제를 확인하기 위하여 반고형 한천 성장 또는 집락 형성이 사용되었다. 이러한 조절제는 숙주 세포에서 발현되는 경우, 비정상 세포 증식 및 형질전환을 억제한다. 조절제는 고체 또는 반고체 배지 (한천)에서 현탁하여 성장하는 숙주 세포의 능력을 감소시키거나 제거한다.
현탁액 내에서 반고형 한천 성장 또는 집락을 형성하는 분석 기법은Freshney, Culture of Animal Cell a Manual of Basic Technique (3rd ed., 1994)에 설명되어 있다. 또한 전술한 Garkavtsev et al., (1996)의 방법 부분을 참조할 것.
조절제의 동정 및 특징화를 위한 접촉 억제 및 성장 밀도 제한의 평가
[0380] 정상 세포는 다른 세포에 접촉하기 전까지 전형적으로 세포 배양시 직선 및 조직화된 패턴으로 성장한다. 상기 세포들이 서로 접촉하는 경우, 이들은 접촉이 억제되거나 성장을 멈춘다. 형질전환 세포는 그러나 접촉 억제가 되지 않고 비조직화된 부위에서 고밀도로 계속 성장한다. 그러므로, 형질전환 세포는 정상 세포에 비하여 고도로 포화되도록 성장한다. 무계획적인 단일층 세포 또는 그 부위 내의 세포의 형성에 의해 형태학적으로 검출된다. 대안적으로는, 포화 밀도의 (3H)-티미딘으로 표지하여 성장의 밀도 제한을 측정하기 위하여 사용하였으며, 이와 유사하게 MTT 또는 Alamar blue 분석에 의하여 세포의 증식 능력 및 동일한 효과를 주는 조절제의 능력을 알아내었다. 전술한 Freshney (1994) 참조. 형질전환 세포는 종양 억제 유전자로 형질전환 감염된 경우에 정상 표현형을 재생성할 수 있으며, 접촉 억제되고 저밀도로 성장하게 된다.
[0381] 이 분석에서는, 포화 밀도의(3H)-티미딘 표지는 성장의 밀도 제한 측정에 선호되는 방법이다. 형질전환 숙주 세포는 암 관련 서열로 형질전환 감염되었으며, 비제한 배지 조건하에서 24 시간 동안 포화 밀도로 성장하였다. (3H)-티미딘 세포 표지의 백분률은 포함된 cpm에 의하여 측정되었다.
[0382] 접촉 독립 성장을 사용하여 비정상 세포 증식 및 형질전환을 일으키는 암 서열의 조절제를 확인하였다. 조절제는 접촉 독립 성장을 감소시키거나 제거하며, 상기 세포를 정상 표현형으로 회복시킨다.
조절제를 확인 및 특성화하기 위한 성장 인자 또는 혈청 의존성의 평가
[0383] 형질전환 세포는 정상 세포보다 낮은 혈청 의존성을 지닌다(예컨대, Temin, J.Natl. Caner Inst. 37:167-175 (1966); Eagle etal., J. Exp. Med 131:836-879 (1970) 참조); 전술한 Freshney 참조. 이는 부분적으로 형질전환 세포에 의한 다양한 성장 인자의 방출에 기인한다. 형질전환 숙주 세포의 성장 인자의 수준 또는 혈청 의존성을 대조구와 비교할 수 있었다. 예를 들면, 세포의 성장 인자 또는 혈청 의존성은 본 발명의 암 관련 서열을 조절하는 화합물의 확인 및 특성화하는 방법으로 모니터링되었다.
조절제를 확인 및 특징화하기 위한 종양-특이적 표지자 농도의 사용
[0384] 종양 세포는 정상 세포에 비하여 증가된 특정 인자 (이하 "종양 특이적 표지자")의 양을 방출한다. 예를 들면, 플라스미노겐 활성제 (PA)는 인간 신경아교종에서 정상의 뇌세포보다 고농도로 방출한다 (예컨대, Gullino, 혈관형성, 종양 Vascularization, and Potential 간섭 with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pp.178-184 (Mihich (ed.) 1985) 참조). 이와 유사하게, 종양 혈관형성 인자 (TAF)는 종양 세포에서 정상 세포보다 고농도로 발현된다 (예컨대, Folkman, Angiogenesis and Cancer, Sem Cancer Biol. (1992) ). 반면에 bFGF는 내피 종양에서 방출된다(Ensoli, B et al.).
[0385] 이러한 인자를 측정하기 위한 다양한 기법이 전술한 Freshney (1994)에 설명되어 있다. 또한, Unkless et al., J. Biol. Chem. 249:4295-4305 (1974); Strickland & Beers, J. Biol. Chem. 251:5694-5702 (1976); Whur etal., Br. J. Cancer 42:305 312 (1980); Gullino, Angiogenesis, Tumor Vascularization, and Potential 간섭 with Tumor Growth, in Biological Responses in Cancer, pp. 178-184 (Mihich (ed.) 1985); Freshney, AntiCancer Res. 5:111-130 (1985). 예를 들면, 종양 특이적 표지자 농도는 본 발명의 암-관련 서열을 조절하는 화합물의 확인 및 특성화 방법으로 모니터링한다 .
조절제 확인 및 특성화하기 위한 매트리겔 내로의 침입
[0386] 매트리겔 또는 세포외 매트릭스 성분 침입 정도가 암 관련 서열을 조절하는 화합물의 확인 및 특성화를 위한 분석에 사용되었다. 종양 세포는 악성 종양 및 매트리겔 또는 그 밖의 세포외 매트릭스 성분 내로 세포의 침입 간에 정비례함을 보여주었다. 이 분석에서, 종양발생 세포는 전형적으로 숙주 세포로 사용된다. 이러한 숙주 세포의 종양 억제 유전자 발현은 숙주 세포 침입을 감소시킨다. 전술한 Cancer Res. 1999; 59: 6010; Freshney (1994)에 설명된 기법이 사용되었다. 요약하자면, 숙주 세포 침입의 수준은 매트리겔 또는 그 밖의 세포외 매트릭스 성분으로 피막된 필터를 사용하여 측정된다. 젤을 투과 또는 필터의 말단면을 통과하는 것이 침입으로 측정되며, 필터의 말단면 또는 용기의 바닥에서 병리학적으로 세포의 수 및 움직인 거리 또는 1251로 사전 표지된 세포 및 방사성을 계수함으로써 측정한다. 예컨대, 전술한 Freshney (1984) 참조.
조절제를 확인 및 특성화를 위한 종양 성장 생체 내 평가
[0387] 세포 성장에 관한 암-관련 서열의 효과가 유전자삽입 또는 면역 억제 동물로 시험되었다. 트랜스제닉 동물은 업계에서 허용되는 방법으로 제조되었다. 예를 들면, 넉아웃 트랜스제닉 동물, 예컨대, 마우스와 같은 포유류를 만들었다. 이들은 암 유전자가 파괴되었거나 암 유전자가 삽입되었다. 넉아웃 트랜스제닉 마우스는 이형 유전자 조합에 의하여 표지자 유전자 또는 그 밖의 이형 유전자를 마우스 게놈의 내부 암 유전자 부위에 삽입하여 만들었다. 이러한 마우스는 내부 암 유전자를 돌연변이형 암 유전자로 치환하거나, 또는 내부 암 유전자를 돌연변이화하여, 예컨대, 발암원에 노출시켜 만들 수 있다.
[0388] 트랜스제닉 키메라 동물, 예컨대, 마우스를 제조하기 위하여, DNA 구조를 배아 줄기 세포의 핵에 도입한다. 새로 설계된 유전적 병변을 함유한 세포를 숙주 마우스 배아에 주입하였다, 이들은 암컷 수혜자에게 재이식되었다. 이러한 배아의 일부는 발생하여 키메라 마우스가 되었으며 이들은 배세포를 지녔고, 이들 중 일부는 돌연변이 세포주로부터 분화되었다. 그러므로, 키메라 마우스를 양육함으로써, 도입된 유전자 병변을 함유한 새로운 계통의 마우스를 얻을 수 있었다 (예컨대, Capecchi et al., Science 244: 1288 (1989)참조). 키메라 마우스는 미국 특허 제 6,365,797호 (2 April 2002 발행); 미국 특허 제6,107,540호 (22 August 2000 발행); Hogan et al., Manipulating the 마우스 배아: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 및 Teratocarcinomas and Embyonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., IRL Press, Washington, D. C.,(1987)에 의하여 유도되었다.
[0389] 대안적으로는, 다양한 면역-억제 또는 면역-결핍 숙주 동물이 사용되었다. 예를 들면, 유전공학적 무흉선 "누드"마우스 (예컨대, Giovanella et al., J. Natl. Cancer inst. 52:921 (1974)참조), SCID 마우스, 흉선 절제 마우스, 또는 방사선 조사 마우스 (예컨대, Bradley et al., Br. J. Cancer 38:263 (1978); Selby et al., Br. J. Cancer 41:52 (1980) 참조)가 숙주로 사용되었다. 동종 숙주로 주입된 이식가능한 종양 세포 (전형적으로 약 106 세포)는 침해적 종양을 높은 비율로 생성하였으나, 반면, 유사한 기원의 정상 세포는 그렇지 않았다. 침해적 종양을 발생시킨 숙주의 경우, 암-관련 서열을 발현하는 세포는 피하 주사 또는 동일위치에 주사되었다. 마우스는 그 뒤 대조구 및 (예컨대 조절제로 치료된) 치료 실험군을 포함하는 몇 개의 군으로 분리되었다. 적절한 시간 경과 후, 좋기로는 4-8주 후, 종양 성장이 측정되었고 (예컨대, 체적 또는 2개의 최대치 또는 체중) 대조구와 비교하였다. 통계적으로 상당수 감소한 종양은 (예컨대, Student's T 시험법 사용) 억제 성장되었다.
조절제 확인 및 특성화를 위한 시험관내 분석
조절 활성을 갖는 화합물을 동정하기 위한 분석을 시험관내에서 수행할 수 있다. 예컨대, 암 폴리펩타이드를 먼저 잠재적 조절제와 접촉시켜 적절한 시간, 예컨대 0.5 내지 48 시간 동안 인큐베이션한다. 한가지 구체예에서, 상기 암 폴리펩타이드 농도는 단백질 또는 mRNA를 측정하여 생체 외에서 측정된다. 단백질의 농도는 암 폴리펩타이드 또는 이들의 부분에 선택적으로 결합되는 항체를 가지고 면역분석, 예컨대 웨스턴 블로팅, ELISA 등에 의하여 측정되었다. mRNA 측정에 있어서, 예컨대, PCR, LCR, 또는 하이브리다이제이션분석, 예컨대, 노던 하이브리다이제이션, RNAse 보호, 도트 블로팅 등의 증대가 선호된다. 단백질 또는 mRNA의 농도는 표지된 검출시약을 직, 간접적으로 사용하여 측정된다. 예컨대, 전술한 바와 같은 형광 또는 방사성 표지된 핵산, 방사성 또는 효소적 표지된 항체 등이 있다.
[0391] 또는, 루시페라아제, 녹색 형광 단백질, CAT, 또는 P-gal 등의 리포터 유전자에 연결된 암 단백질 프로모터를 사용하여 리포터 유전자시스템을 사용할 수 있다. 상기 리포터 구조는 일반적으로 세포 내로 트랜스펙션된다. 잠재적 조절제로 치료 후, 리포터 유전자 전사, 번역, 또는 활성의 양을 당업자에 알려진 표준 기법에 의하여 측정하였다 (Davis GF, 전술; Gonzalez, J. & Negulescu, P. Curr. Opin. Biotechnol. 1998:9:624).
전술한 바와 같이, 시험관내 선별이 개개의 유전자 및 유전자산물에 대하여 측정되었다. 즉, 특정 단계에서 중요한 특정한 차등적으로 발현된 유전자를 확인하면서, 유전자 또는 유전자산물 자체 발현의 조절제를 선별하였다.
[0393] 한가지 구체예에서, 특이적 유전자(들) 발현 조절제의 선별이 수행되었다. 일반적으로는, 오직 하나 또는 몇개의 유전자의 발현을 평가한다. 또 다른 구체예에서, 선별법은 차등적으로 발현된 단백질에 결합하는 화합물을 우선 발견하도록 설계되었다. 이러한 화합물은 이후 차등적으로 발현된 활성을 조절하는 능력에 의하여 평가되었다. 더욱이, 최초 후보 화합물이 확인되면, 그 변형체는 추가로 구조와 활성간의 간계를 평가하기 위하여 추가로 선별되었다.
조절제 확인 및 특성화를 위한 결합 분석
[0394] 본 발명의 결합 분석에 있어서, 본 발명의 정제된 또는 단리된 유전자산물이 일반적으로 사용되었다. 예를 들면, 항체는 본 발명의 단백질로 생성되었고 면역분석을 단백질의 양 및/또는 위치를 측정하기 위하여 수행하였다. 대안적으로는, 암 단백질을 지닌 세포가 분석에 사용되었다.
[0395] 그러므로, 이 방법은 본 발명의 암 단백질과 리간드와 같은 후보 화합물을 결합시킨 다음 상기 화합물의 본 발명의 암 단백질에 대한 결합을 측정하는 것을 포함하여 이루어진다. 선호되는 한가지 구체예에서는 인간 암 단백질을 활용하였으며; 인간 질병을 발생시킬 수 있는 동물 모델이 사용되었다. 또한, 그 밖의 포유류 단백질 유사체가 사용된다. 더욱이, 몇몇 구체예에서는 변형체 또는 유도체인 암 단백질이 사용된다.
[0396] 일반적으로, 본 발명의 암 단백질 또는 리간드는 비확산적으로 불용성 지지체에 결합되어 있다. 상기 지지체는, 예컨대, 단리된 시료 제공 영역을 지닌다 (마이크로타이터 플레이트, 어레이 등.). 상기 불용성 지지체는 결합할수 있는 어떠한 조성물로도 만들 수 있으며, 가용성 물질로 분리될 수 있으며, 그 밖의 전반적인 선별 방법과 호환될 수 있다. 지지체의 표면은 고체 또는 다공성이나 어떠한 편의적 모양도 가능하다.
[0397] 적합한 불용성 지지체의 예에는 마이크로타이터 플레이트, 어레이, 멤브레인 및 비드가 포함된다. 이러한 것은 전형적으로 유리, 플라스틱 (예컨대, 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론, 니트로셀룰로오스 또는 테프론 등으로 제조되었다. 마이크로타이터 플레이트 및 어레이는 특히 작은 양의 시약 및 시료를 사용하여 다수의 분석을 동시에 할 수 있기 때문에 편리하다. 조성물과 지지체의 특정 결합 방식은 본 발명의 전반적인 방법 및 시약과 호환할 수 있으며, 조성물의 활성을 유지하고 비확산적인 한 중요한 것은 아니다. 선호되는 결합 방법에는 단백질이 지지체의 "접착단" 또는 이온성 부위에 직접에 결합할 때, 리간드 결합 부위 또는 활성 서열을 입체적으로 차단하지 않는 항체, 화학적 교차결합, 표면에서의 단백질 또는 시약의 합성 등이 사용된다. 단백질 또는 리간드/결합제가 상기 지지체에 결합한 뒤, 과량의 미결합 물질이 세척으로 제거되었다. 상기 시료 제공 영역은 그 뒤 소 혈청 알부민 (BSA), 카제인 또는 그 밖의 무해한 단백질 또는 그 밖의 부분에 의한 배양으로 차단되었다.
[0398] 본 발명의 암 단백질이 상기 지지체에 결합되면, 시험 화합물을 첨가하여 분석하였다. 대안적으로는, 후보 결합제는 상기 지지체에 결합되고, 본 발명의 암 단백질이 그 후 첨가되었다. 결합제에는 특이적 항체, 화학적 라이브러리의 선별로 확인된 인공 결합제, 펩타이드 유사체 등이 포함된다.
[0399] 특히 관심을 끄는 분석은 사람 세포에 대해 독성이 낮은 제제를 동정하는 것이다. 다양한 분석이 이 목적을 위하여 사용되었으며, 여기에는 증식 분석, cAMP 분석, 표지된 생체 외 단백질-단백질 결합 분석, 전기 천공 이동도 옮김 분석, 단백질 결합에 대한 면역분석, 기능적 분석 (인산화 분석 등.) 등이 포함된다.
[0400] 시험 화합물 (리간드, 결합제, 조절제, 등.)과 본 발명의 암 단백질의 결합의 결정을 여러 방법으로 수행하였다. 상기 시험 화합물은 표지되었으며, 예컨대, 본 발명의 암 단백질의 전부 또는 부분이 고체 지지체에 결합하고, 표지된 후보 화합물(예컨대, 형광 표지)을 첨가하고, 과량의 시약을 세척하여, 상기 표지가 고체 지지체 상에 존재하는지 여부를 결정함으로써 결합은 직접 결정되었다. 다양한 차단 및 세척 공정이 적절히 사용되었다.
[0401] 특정 구체예에서는, 오직 하나의 성분, 예컨대, 본 발명의 단백질이나 리간드만을 표지시킨다. 또는, 1종 이상의 성분을 서로 다른 표지, 예컨대, 단백질은 1125에 의해, 화합물은 형광단으로 표지시킨다. 근접 시약, 예컨대, 퀸칭 또는 에너지 전달 시약이 또한 유용하다.
조절제를 동정 및 특징화하기 위한 경쟁적 결합
[0402] 한가지 구체예에서, "시험 화합물"의 결합을 "경쟁자"를 이용한 경쟁적 결합 분석에 의하여 결정한다. 경쟁자는 표적 분자 (예컨대, 본 발명의 암 단백질)가 결합하는 결합 부분이다. 경쟁자에는 항체, 펩타이드, 결합 파트너, 리간드 등의 화합물을 포함한다. 특정 환경 하에서, 시험 화합물 및 경쟁자 간의 경쟁적 결합 은 시험 화합물을 치환하였다. 한가지 구체예에서, 시험 화합물이 표지되었다. 시험 화합물, 경쟁자, 또는 양자 모두를 결합에 충분한 시간동안 단백질에 첨가였다. 최적 활성을 촉진하는, 전형적으로 4 내지 40℃의 온도로 배양을 실시하였다. 배양 주기는 예컨대, 급속 초고속 선별을 촉진하기위해서 전형적으로 최적화되었다; 전형적으로 0 내지 1시간이 충분하다. 과량의 시약이 일반적으로 제거되었으며 제거되었다. 2차 성분이 첨가되었으며 결합을 지시하는 성분의 존재 또는 부재를 조사하였다.
[0403] 한가지 구체예에서, 상기 경쟁자를 먼저 첨가하고, 이어 시험 화합물을 첨가한다. 경쟁자의 치환에 의하여 시험 화합물이 암 단백질에 결합하였다는 것을 나타낸다. 그러므로 이는 결합이 가능하여 암 단백질의 활성을 잠재적으로 조절하는 것이다. 이 구체적 구체예에서, 둘 중 어떤 성분이든 표지시킬 수 있다. 그러므로, 예컨대, 경쟁자가 표지되었다면, 시험 화합물 세척 후 용액 내의 표지의 존재는 시험 화합물에 의한 치환을 나타낸다. 대안적으로는, 시험 화합물이 표지되었다면, 상기 지지체상의 표지의 존재가 치환을 나타내는 것이다.
[0404] 또 다른 구체예에서, 상기 시험 화합물을 먼저 첨가하여 배양 및 세척을 하였고, 이어 경쟁자를 첨가하였다. 경쟁자에 의한 결합의 부재는 시험 화합물이 경쟁자보다 높은 친화도로 암 단백질에 결합되었다는 것을 나타낸다. 그러므로, 시험 화합물이 표지되었다면, 경쟁자 결합의 부재와 결부된 상기 지지체 상의 표지는 시험 화합물이 결합되어, 잠재적으로 본 발명의 암 단백질을 조절한다는 것을 나타낸다.
[0405] 따라서, 경쟁적 결합 방법은 본 발명의 암 단백질의 활성을 조절할 수 있는 시약을 확인하기 위한 차등적 선별법을 포함한다. 이 구체적 구체예에서, 상기 방법에는 1차 시료에서 암 단백질 및 경쟁자가 결합하는 것을 포함한다. 2차 시료에는 시험 화합물, 암 단백질 및 경쟁자를 포함한다. 경쟁자의 결합은 두 시료 및 및 변화에 의하여 결정되고, 또는 두 시료 간의 결합 차이는 암 단백질과 결합 할수 있는 시약 및 잠재적으로 조절 이들의 활성을 나타낸다. 즉, 경쟁자의 결합이 1차 시료가 2차 시료와 다르다면, 상기 시약은 암 단백질에 결합할 수 있는 것이다.
[0406] 또는, 차등 선별은 선천성 암 단백질에는 결합하나 변형 암 단백질에는 결합하지 않는 약물 후보를 확인하는데 사용되었다. 예를 들면, 암 단백질의 구조가 형성되어, 그 위치와 상호작용하나, 일반적으로 위치-변형 단백질에는 결합하지 않는 시약을 합성하기 위한 이론적 약물 설계에 사용되었다. 더욱이, 선천성 암 단백질의 활성에 영향을 미치는 이러한 약물 후보의 단백질의 활성을 증진 또는 감소시키는 능력이 선별 약물에 의하여 확인되었다 .
[0407] 양성 대조구 및 음성 대조구가 분석에 사용되었다. 대조구 및 시험 시료는 적어도 3회 수행하여 통계적으로 의미있는 결과를 있는것이 바람직하며, 모든 시료의 배양은 시약과 단백질의 결합이 일어나도록 충분한 시간 동안 수행한다. 배양 후에, 시료는 비특이적 결합 물질이 없어지도록 세척하고, 일반적으로 표지된 시약의 양이 측정되었다. 예를 들면, 방사성 표지가 사용된 경우, 상기 시료는 섬광계수기로 계수되어 결합된 화합물의 양을 측정하였다.
[0408] 그 밖의 다양한 시약이 선별 분석에 사용될 수 있다. 이러한 것에는 염, 천연 단백질, 예컨대 알부민, 세정제, 등의 시약이 포함된다. 이들은 최적 단백질-단백질 결합을 촉진 및/또는 비특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키기 위해 사용된다. 분석의 효율을 높이기 위해, 프로테이즈 억제제, 뉴클레이즈 억제제, 항생제 시약 등이 사용될 수 있다. 성분의 혼합물이 필요한 결합을 제공하기 위하여 첨가되었다.
본 발명의 단백질의 하향 조절 또는 억제를 위한 폴리뉴클레오타이드의 용도
[009] 암의 폴리뉴클레오타이드 조절제는 리간드-결합 분자에 컨쥬게이션을 형성함으로써 표적 뉴클레오타이드 서열을 함유한 세포에 혼입될 수 있다. 이는 WO 91/04753에 설명되어있다. 적합한 리간드-결합 분자에는 세포 표면 수용체, 성장 인자, 그 밖의 사이토카인, 또는 세포 표면 수용체에 결합하는 그 밖의 리간드를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 리간드 결합 분자의 컨쥬게이션이 실질적으로 리간드 결합 분자가 이들의 상응하는 분자 또는 수용체, 또는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 블럭 엔트리 또는 이들의 세포로 콘쥬게이트된 형태와 결합하는 것을 방해하지 않는것이 바람직하다. 또는, 암의 폴리뉴클레오타이드 조절제는 예컨대, 폴리뉴클레오타이드-지질 복합체의 형성에 의하여, 표적 핵산 서열을 함유한 세포로 혼입될 수 있다. 이는 WO90/10448에 설명되었다. 상기 선별 분석에 안티센스 분자 또는 넉아웃 및 넉인 모델이 사용될 수 있으며, 추가적으로 치료 방법도 사용할 수 있음을 이해하여야 한다.
억제 및 안티센스 뉴클레오타이드
[0410] 특정 구체예에서, 암-관련 단백질의 활성이 안티센스 폴리뉴클레오타이드 또는 예컨대, 본 발명의 암 단백질, mRNA, 또는 이들의 부위 등의 암호화된 mRNA 핵산 서열에 상보적인, 따라서, 특이적으로 하이브리다이제이션될 수 있는 억제성 작은 핵 RNA (snRNA)에 의하여 하향 조정 또는 전적으로 억제되었다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드가 mRNA에 결합하여 번역 및/또는 mRNA의 안정성을 저하시켰다.
[0411] 본 명세서의 문맥상, 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 천연 뉴클레오타이드, 또는 천연 아단위 또는 이들의 근친 유사체로부터 형성된 합성 종을 포함한다. 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 또한 당 부분 또는 당 내부 결합이 변경될 수 있다. 이러한 것의 예에는 포스포로티오에이트 및 그 밖의 업계에 알려진 황 함유 종이 있다. 유사체는 이들이 효과적으로 본 발명의 뉴클레오타이드와 하이브리다이제이션하는 본 발명에 의하여 구성된다. 예컨대, Isis Pharmaceuticals, Carlsbad, CA; Sequitor,Inc., Natick, MA 참조.
[0142] 이러한 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 재조합 수단을 사용하여 손쉽게 합성될 수 있으며, 생체 외에서 합성될 수도 있다. 이러한 합성 기구는 Applied Biosystem를 포함한 몇몇 업자들에 의하여 판매된다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체 등의 그 밖의 올리고뉴클레오타이드의 제조는 업계에 잘 알려져 있다.
[0143] 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오타이드를 포함한 본원에서 사용된 안티센스 분자. 센스 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 안티센스 가닥에 결합함으로서 전사를 차단하는데 사용될 수 있다. 상기 안티센스 및 센스 올리고뉴클레오타이드는 암 분자의 표적mRNA (센스) 또는 DNA (안티센스) 서열에 결합할 수 있는 단일 가닥 핵산 서열 (RNA 또는 DNA)을 포함한다. 본 발명의 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오타이드는 적어도 약 12 개의 뉴클레오타이드, 좋기로는 약 12 내지 30 개의 뉴클레오타이드로 이루어진 절편을 포함한다. 주어진 단백질의 cDNA 서열에 기초하여 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오타이드를 유도할 능력은, 예컨대, Stein & Cohen (Cancer Res. 48:2659 (1988); van der Krol et al. (BioTechniques 6:958 (1988))에 설명되어 있다.
리보자임
[0414] 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 더해, 리보자임은 암-관련 뉴클레오타이드 서열의 전사를 표적화하거나 억제하기 위하여 사용할 수 있다. 리보자임은 다른 RNA 분자를 촉매 분해할 수 있는 RNA 분자이다. 여러가지 종류의 리보자임, 예컨대, 그룹 I 리보자임, 망치머리형 리보자임, 헤어핀형 리보자임, RNase P, 및 도끼머리형 리보자임을 비롯한 여러 리보자임이 알려져 있다 (다양한 리보자임의 특성에 관하여는 예컨대, Castanotto et al., Adv. in Pharmacology 25:289-317 (1994) 참조).
[0415] 머리핀형 리보자임의 일반적인 특징은, 예컨대, Hampel et al., Nucl. Acids Res. 18:299-304 (1990); 유럽 특허 공보 제0360257호; 미국 특허 제5,254,678호에 설명되어 있다. 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.(예컨대, WO 94/26877; Ojwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344 (1993); Yamada et al., Humane Genetherapy 1:39-45 (1994); Leavitt et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 92:699-703 (1995); Leavitt et al., Humane Genetherapy 5:1151-120 (1994); 및 Yamada et al., Virology 205:121-126 (1994)참조).
표현형 선별에 있어서 조절제의 용도
[0416] 한가지 구체예에서, 시험 화합물은 관련된 암 발현 특성을 지닌 암세포의 군집에 투여된다. 본원의 "투여" 또는 "접촉"은 흡입 및 세포내 작용에 의하여 조절제가 상기 세포의 표면에 작용하게 하는 방식으로 조절제를 상기 세포에 첨가하는 것을 의미한다. 구체적 실시상태에서, 예컨대, PCT US 97/01019와 같이 단백질계 시약 (즉, 펩티드)을 암호화한 핵산을 아데노바이러스 또는 레트로바이러스 구조와 같은 바이러스 구조에 주입하고 상기 세포에 첨가하여, 펩티드 시약이 발현되도록 한다. 조절가능한 유전자치료 시스템을 사용할 수도 있다. 조절제가 상기 세포에 투여되면, 필요하다면 상기 세포를 세척하고 일정 기간동안 바람직한 생리학적 조건하에서 배양한다. 그 뒤 상기 세포를 수확하고, 새로운 유전자발현 특성이 나타나게되었다. 그러므로, 예컨대, 암조직을 암 표현형을 유도 또는 억제하는 조절제로 선별한다. 적어도 1종의 유전자, 좋기로는 다수의 유전자의 발현 특성이 변화하였다는 것은 상기 시약이 암 활성에 효과가 있다는 것을 나타낸다. 이와 마찬가지로, 생물학적 기능 또는 신호 경로를 변경시키는 것은 조절제 활성을 의미한다. 이러한 암 표현형의 정의에 의하여, 표현형을 변화시키는 새로운 약물의 선별법이 고안되었다. 이러한 접근법에 의하여, 약물 표적은 알려질 필요도 없고, 본래의 유전자/단백질 발현 선별 플랫폼에서 제시될 필요도 없으며, 더욱이 표적 단백질의 전사 농도도 변경할 필요가 없다. 이러한 조절제 억제 기능은 대리 표지자로서 작용할 것이다.
[0417] 전술한 바와 같이, 선별을 행하여 유전자 또는 유전자 산물을 평가하였다. 즉, 특정 단계에서 중요한, 특히 차등적으로 발현된 유전자를 확인하면서, 유전자 또는 유전자산물 자체의 발현을 조절하는 조절제의 선별을 수행하였다.
본 발명 펩티드에 영향을 미치는 조절제의 용도
[0418] 다양한 분석법을 사용하여 암 폴리펩티드 활성 또는 암 표현형의 측정을 수행하였다. 예를 들어, 전술한 매개 변수를 시험하여 암 폴리펩티드(들)에 작용하는 조절제의 효과를 측정하였다. 활성에 영향을 미치는 생리학적 변화를 사용하여 시험 화합물이 본 발명의 폴리펩티드에 미치는 영향을 평가하였다. 미손상 세포 또는 동물을 사용하여 함수적 결과가 측정된 경우, 고체 종양, 종양 성장, 종양 전이, 혈관생성, 호르몬 방출, 알려진 및 특성화되지 않은 유전학적 표지자 (예컨대, 노던 블롯에 의한)로의 전사 변화, 세포 성장 또는 pH 변화와 같은 세포 물질대사 변화 및 cGNIP 등의 세포 내 2차 메신저의 변화 등에 관련된 암의 경우에 있어서, 다양한 효과가 평가될 수 있다.
암-관련 서열을 동정 및 특징화하는 방법
[0419] 다양한 유전자 서열의 발현이 암과 관련되어 있다. 따라서, 돌연변이 또는 변형 암 유전자에 기인한 장애가 측정되었다. 구체적 실시상태에서, 본 발명은 변형 암 유전자를 지닌 세포를 확인하는 방법을 제공한다. 예컨대, 세포 내의 적어도 1종의 내부 암 유전자 서열의 전부 또는 일부의 존재를 결정한다. 이는 여러 종류의 시퀀싱 기법을 사용하여 수행된다. 본 발명은 개개의 암 유전형을 확인하는 방법을 포함한다. 예컨대, 개체 내에서 적어도 1종의 유전자 서열의 전부 또는 일부를 결정한다. 이는 일반적으로 개체의 적어도 1종의 조직에서 수행된다. 예컨대, 표 1에서 설명한 조직 및 다수의 조직 또는 동일 조직의 그 밖의 시료의 평가를 포함할 수 있다. 상기 방법에는 서열화된 유전자 서열을 암 유전자, 즉, 야생형 유전자의 서열과 비교하여 동족원, 상동체, 돌연변이 또는 변형체의 존재를 결정하는 ㄳ을 포함한다. 유전자 전부 또는 일부의 서열과 알려진 암 유전자 서열을 비교하여존재할수 있는 차이를 결정할 수 있다. 이는 BLAST, Bestfit, 등의 모든 상동 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 본원에서 설명한 바와 같이 환자의 암 유전자와 알려진 암 유전자 간의 서열에 있어서의 차이는 질병 상태 또는 질병의 성향과 관련되어 있다.
[0420] 바람직한 구체예에서, 암 유전자는 게놈 내의 암 유전자의 복제본의 수를 결정하기 위한 탐침으로 사용된다. 상기 암 유전자는 암 유전자의 염색체의 위치선정을 결정하기 위한 탐침으로 사용된다. 염색체 위치선정 등의 정보에 의하여 특히, 위치이동 등의 염색체 이상의 경우, 암 유전자위치 내에서 진단 또는 예후의 확인을 제공하는 용도를 발견하였다
XIV.) RNAi 및 소형 간섭 RNA(siRNAs)의 치료적 용도
[0421] 본 발명은 siRNA 올리고뉴클레오타이드, 특히, 적어도 PSCA 코딩 대역의 단편 또는 5" UTR 대역, 또는 보체, 또는 PSCA 서열에 특이적인 여하한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 이중 가닥 RNAs에 관한 것이기도 하다. 한가지 구체예에서, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 PSCA의 기능을 조명하는데 이용되거나, 또는 PSCA 기능이나 발현의 조절자를 스크리닝 하거나 평가하기 위해 사용된다. 또 다른 구체예에서는, PSCA의 유전자 발현을 siRNA 트랜스펙션에 의해 감소시켜 내재적으로 항원을 발현하는 형질전환된 암 세포의 증식 능력을 유의적으로 감소시킬 수 있다; 특이적인 PSCA siRNA로 처리된 세포들은 예컨대, 세포 생존능의 대사 판독에 의해 측정할 경우 생존률 감소를 나타냈는데, 이는 감소된 증식 능력과 연관이 있다. 따라서, PSCA siRNA 조성물은 PSCA 단백질 또는 그의 서브서열의 핵산 ORF 서열에 대응하는 siRNA (이중 가닥 RNA)를 함유한다; 이러한 서브서열들은 대체로 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 또는 35를 상회하는 인접 RNA 뉴클레오타이드이며 mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보적이거나 비상보적인 서열을 함유한다. 바람직한 구체예에서, 이 서브서열은 19-25 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 21-23 뉴클레오타이드 길이이다.
[0422] RNA 간섭은 시험관내 및 생체내에서 유전자를 침묵시키는 새로운 접근방법이며, 따라서, 작은 이중가닥 RNAs(siRNAs)는 가치있는 치료제이다. 특이적인 유전자 활성을 침묵시키는 siRNA의 능력은 동물의 질병 모델에 접목되었으며 사람에 대해서도 사용되고 있다. 예컨대, 특정 표적에 대한 siRNA가 있는 마우스 내로 siRNA 용액을 수력학적으로 인퓨젼시키는 것을 치료적으로 효과가 있는 것으로 나타났다.
[0423] Song 등에 의한 선구자적인 연구 결과 전적으로 천연적인 어떤 종류의 핵산, 소형 간섭 RNAs (siRNAs)는 심지어 부가적인 화학적 변형이 없이도 치료제로서 기능하는 것으로 밝혀졌다 (Song, E., et 　 al . siRNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis" Nat. Med. 9(3): 347-51(2003)). 이 연구는 siRNA의 동물 내로의 인퓨젼이 질환을 경감시킬 수 있다는 최초의 생체내 증거를 제공해주었다. 그 경우에 있어서, 저자들은 FAS 단백질 (염증성 반응이 일어나는 동안 과활성화될 경우 간세포와 다른 세포들을 사멸에 이르게 하는 세포 사멸 수용체)을 침묵시키기 위해 디자인된 siRNA를 마우스에게 주입하였다. 다음 날, 동물에게 Fas에 특이적인 항체를 투여하였다. 대조구 마우스는 며칠 내에 급성 간부전으로 죽은 반면, siRNA-처리된 마우스의 80% 이상은 심각한 질환을 앓지 않고 살아 남았다. 이들의 간 세포의 약 80% 내지 90%는 네이키드 siRNA 올리고뉴클레오타이드를 인코포레이션하였다. 또한, RNA 분자들은 3주일 후 실활되기 10일 전까지는 기능을 하였다.
[0424] 사람에 대한 치료에 사용하기 위해, siRNA를 장기간 지속되는 RNAi 활성을 유발하는 효율적인 시스템에 의해 전달된다. 임상 용도에 있어서 경계해야할 주요한 사항은 siRNAs를 적절한 세포에 전달하여야 한다는 것이다. 간세포는 외인성 RNA에 대해 특히 수용적인 것으로 보인다. 현재로서는, 간에 위치하는 표적들이 매력적인데, 이는 간이 핵산 분자와 바이러스 벡터에 의해 용이하게 표적화될 수 있는 장기이기 때문이다. 그러나, 다른 조직과 장기 표적들도 바람직하다.
[0425] 세포막을 통한 이동을 촉진하는 화합물과 siRNA와의 포뮬레이션을 이용하여 siRNAs의 투여를 개선시킬 수 있다. 뉴클레아제에 내성이면서 혈청 안정성을 갖는 화학적으로 변형된 합성 siRNA는 RNAi 유효 기간이 부수적으로 연장되며, 본 발명의 부가적인 구체예이다.
[0426] 따라서, siRNA 기술은 표 1에 열거된 것과 같은, 암에 걸린 개체에게 PSCA에 지향된 siRNA 분자를 전달함으로써 인체의 암을 치료해준다. 이러한 siRNAs의 투여는 PSCA를 발현하는 암 세포 성장을 둔화시켜 항종양 요법을 제공하며, 암과 연관된 이병율 및/또는 사망률을 감소시켜준다.
[0427] 유전자 산물 넉다운의 이러한 양상(modality) 효능은 시험관내 또는 생체내에서 측정시 유의적이다. 시험관내 효능은 배양 세포에게 siRNA를 적용시킴으로써 (전술한 바와 같이) 또는 PSCA 단백질의 감소된 발현을 검출하는데 시험관내 방법이 사용될 경우, 암환자 생검 분주물에 siRNA를 적용시킴으로써 쉽게 입증할 수 있다.
XV.) 키트/제조용구
[0428] 실험실 용도에 있어서, 예후적, 예방적, 진단적 및 치료적 응용을 본원에서 설명하였다, 이러한 키트는 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 키트는 운반체, 포장, 또는 바이알, 튜브 등의 하나 이상의 용기를 넣기위해 구획화된 용기를 포함하며, 각각의 용기(들)은 상기 방법에 사용될 하나의 분리된 성분을 포함하고, 전술한 용도 등에 사용하기 위한 안내를 포함한 표지 또는 삽입물이 따른다. 예를 들면, 용기(들)은 검출 가능하도록 표지된 탐침을 포함할 수 있다. 이러한 탐침은 각각 단백질 또는 유전자 또는 메시지에 대하여, 항체 또는 폴리뉴클레오타이드 특이적일 수 있다. 상기 방법은 핵산 잡종화를 활용하여 표적 핵산을 검출할 수 있기 때문에, 상기 키트는 표적 핵산 서열을 증대시키기 위한 뉴클레오타이드(들)을 함유한 용기를 포함할 수 있다. 키트는 아비딘 또는 스트렙타비딘 등의 바이오틴-결합 단백질과 같은 리포터를 포함하는 용기를 포함하며, 효소, 형광, 또는 방사성 동위원소 표지와 같은 리포터 분자에 결합한다 ; 이러한 리포터는 예컨대, 핵산 또는 항체와 함께 사용될 수 있다. 키트는 도 1, 도 2 또는 도 3의 아미노산 서열의 전부 또는 일부, 또는 그러한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.
[0429] 본 발명의 상기 키트는 전형적으로, 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기; 담체, 포장, 용기, 성분이 표시된 비알 및/또는 튜브 및/또는 사용 설명서, 및 사용설명서가 삽입된 포장이 포함된 전술한 용기 및 소비자 또는 상업적 견지에서 바람직한 물질로 구성된 하나 이상의 다른 용기를 포함할 수 있다.
[0430] 표지는 용기 상에 또는 용기와 함께 제시되어 특이적 치료 또는 예후적, 예방적, 진단적 또는 실험실용 등의 비치료적으로 사용되는 조성물을 나타내며, 생체 내 또는 생체 외 용도를 지시할 수 있다, 이러한 것은 본원에서 설명하였다. 지시사항 및/또는 그 밖의 정보는 키트 상의 삽입물(들) 또는 표지(들)에 포함될 수 있다. 상기 표지는 용기 상에 또는 용기에 결합되어있을 수 있다. 용기 상의 표지는 용기 자체에 성형되거나 에칭된 문자, 숫자, 그 밖의 도형일 수 있다; 용기를 고정할 수 있는 운반체 또는 고정기 내에서 제공되는 경우, 표지는 예컨대, 포장에 삽입하는 것과 같이 용기에 결합되어 있을 수 있다. 상기 표지는 조성물이 표 1에서 설명한 조직의 신생물과 같은 상태의 진단용, 치료용, 예방용 또는 예후용으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
[0431] "키트" 및 "제조용구"라는 용어는 같은 의미이다.
[0432] 본 발명의 다른 구체적 실시 상태에서, 표 1에서 설명한 조직의 신생물의 진단, 예후, 예방 및/또는 치료용으로 유용한 물질인 아미노산 서열(들), 작은 분자(들), 핵산 서열(들), 및/또는 항체(들) 등과 같은 상기 조성물을 함유한 제조용구(들)이 제공되었다. 상기 제조용구는 전형적으로, 적어도 하나의 용기 및 적어도 하나의 표지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들면, 병, 비알, 주사기, 및 시험관이 포함된다. 상기 용기는 유리, 금속 또는 플라스틱 등의 다양한 물질로 형성될 수 있다. 상기 용기는 아미노산 서열 (들), 작은 분자 (들), 핵산 서열 (들), 세포 군집(들) 및/또는 항체(들)을 고정할 수 있다. 구체적 실시상태에서, 상기 용기는 세포의 mRNA 발현 특성을 조사하기 위한 폴리뉴클레오타이드와 함께 이러한 목적을 위한 시약을 고정할 수도 있다. 다른 구체적 실시 상태에서, 용기에는 적절한 실험실, 예후적, 진단적, 예방적 및 치료적 목적으로 세포 및 조직 내에서 282P1G3 단백질 발현을 평가하기 위한 항체, 이들의 결합 절편 또는 특이적 결합 단백질을 포함한다; 이러한 용도의 표시사항 및/또는 지시사항이 이러한 용기 상에 또는 함께 포함될 수 있으며, 이러한 목적으로 사용되는 시약 및 그 밖의 조성물 또는 도구도 포함될 수 있다. 다른 구체적 실시 상태에서, 용기는 관련 표시사항 및/또는 지시사항과 함께 세포 또는 체액성 면역 반응을 유도하는 물질을 포함할 수 있다. 다른 구체적 실시 상태에서, 용기에는 관련 표시사항 및/또는 지시사항과 함께 세포독성 T 세포 (CTL) 또는 헬퍼(helper) T 세포 (HTL) 등의 입양 면역 치료용; 이러한 목적의 시약 및 그 밖의 조성물 또는 도구도 포함될 수 있다.
[0433] 상기 용기는 대안적으로는 질환의 치료, 진단, 예후 또는 예방에 효과적인 조성물을 고정할 수 있으며, 무균 접근 포트를 지닐수 있다(예를 들면, 용기는 피하 주사 바늘에 의한 정밀한 멈춤장치를 지닌 정맥주사용액 백 또는 비알 일 수 있다). 조성물 내의 활성 시약은 특이적으로 PSCA에 특이적으로 결합하거나 PSCA의 기능을 조절할 수 있는 항체일 수 있다.
[0434] 제조용구는 인산염 완충염, 링거액 및/또는 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 완충액을 함유하는 제2 용기를 부가적으로 함유할 수 있다. 또한 상업적 관점과 사용자 관점에서 요망되는 기타의 물질, 예컨대, 다른 완충액, 희석제, 필터, 교반기, 주사바늘, 시린지, 및/또는 포장삽입물을 사용 지침서 및/또는 지시사항과 함께 부가적으로 포함할 수 있다.
[0033] 도 1. PSCA의 cDNA 및 아미노산 서열 ("PSCA v1" 또는 "PSCA 변이체 1"이라고도 칭한다)이 도 1A에 도시되어 있다. 개시 메티오닌에 밑줄을 그었다. 오픈 리딩 프레임은 종결 코돈을 포함하여 핵산 18-389에 걸쳐져 있다.
[0034] 도 1B는 PSCA 변이체 2 ("PSCA v.2"이라고도 칭한다)의 cDNA와 아미노산 서열을 도시한 것이다. 개시 메티오닌의 코돈에 밑줄을 그었다. 오픈 리딩 프레임은 종결 코돈을 포함하여 핵산 56-427에 걸쳐져 있다.
[0035] 도 1C는 PSCA 변이체 3 ("PSCA v.3"이라고도 칭한다)의 cDNA와 아미노산 서열을 도시한 것이다. 개시 메티오닌에 밑줄을 그었다. 오픈 리딩 프레임은 종결 코돈을 포함하여 핵산 423-707에 걸쳐져 있다.
[0036] 도 1D는 PSCA 변이체 4 ("PSCA v.4"라고도 칭한다)의 cDNA와 아미노산 서열을 도시한 것이다. 개시 메티오닌에 밑줄을 그었다. 오픈 리딩 프레임은 종결 코돈을 포함하여 핵산 424-993에 걸쳐져 있다.
[0037] 도 1E는 PSCA 변이체 5 ("PSCA v.5"라고도 칭한다)의 cDNA와 아미노산 서열을 도시한 것이다. 개시 메티오닌에 밑줄을 그었다. 오픈 리딩 프레임은 종결 코돈을 포함하여 핵산 910-1479에 걸쳐져 있다.
[0038] 도 1F는 PSCA 변이체 6 ("PSCA v.6" 또는 "PSCA 변이체 6"이라고도 칭한다)의 cDNA와 아미노산 서열을 도시한 것이다. 개시 메티오닌에 밑줄을 그었다. 오픈 리딩 프레임은 종결 코돈을 포함하여 핵산 83-427에 걸쳐져 있다.
[0039] 도 1G. PSCA v.2, PSCA v.7 내지 v.18 SNP 변이체. PSCA v.7 내지 v.18 단백질은 123개의 아미노산을 갖는다. 변이체 PSCA v.7 내지 v.18은 PSCA v.2 와는 뉴클레오타이드가 한개 다르고, v.2와 동일한 단백질을 코딩한다. 비록 이들 SNP 변이체들을 별도로 도시하였으나, 이들 역시 어떠한 조합으로든 그리고 전술한 도 1A 내지 도 1F의 전사 변이체로든 발생가능하다.
[0040] 도 1H. PSCA v.4, PSCA v.19 내지 v.30의 SNP 변이체. PSCA v.19 내지 v.30 단백질은 189개의 아미노산을 갖는다. 변이체 PSCA v.19 내지 v.30는 PSCA v.4와는 뉴클레오타이드 하나가 다르다. PSCA v.9, v.10, v.11, v.24 및 v.25 단백질은 PSCA v.1과는 아미노산이 하나가 다르다. PSCA v.23, v.28, v.29 및 v.30은 v.4와 동일한 단백질을 코딩한다. 이들 SNP 변이체들을 별도로 도시하였으나, 이들은 어떠한 조합으로든 그리고 전사물 변이체 v.3 및 v.4의 어느 것으로도 발생가능하다.
[0041] 도 1I. PSCA 변이체의 발현 ((1I(a)) 변이체 PSCA v.1/v.2/v.4, PSCA v.3 및 PSCA v.5 사이를 구별하도록 프라이머를 디자인하였다. 도면에서 엑손 윗 부분의 작은 화살표 표시가 된 프라이머 A 및 B는 PSCA v.1/v.2/v4의 경우 425 bp의 PCR 산물을, PSCA v3의 경우는 300 bp의 PCR 산물을, 그리고 PSCA v.5의 경우에는 910 bp의 PCR 산물을 결과시켰다. (1I(b)) 정상적인 방광, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 전립선, 비장, 골격근, 고환, 췌장, 결장, 위장, 전립선암, 방광암, 신장암, 결장암, 폐암, 난소암, 유방암, 전이성암 및 췌장암 풀로부터 첫번째 cDNA 가닥을 제조하였다. 액틴에 대한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 노멀라이제이션을 수행하였다. 여러가지 특이적인 프라이머를 이용하여 30 사이클의 증폭으로 반정량적 PCR을 수행하였다. 그 결과 유방암, 전이성암, 및 췌장암에서는 주로 PSCA v.5이 발현되고, 결장암과 폐암에서는 이보다 낮은 수준으로 발현된 것으로 나타났다. PSCA v.1/v.2/v.4 PCR 산물이 전립선암, 방광암, 신장암, 결장암, 폐암, 난소암, 유방암, 전이성암 및 췌장암에서 검출되었다. 정상 조직 중에서는, PSCA v.1/v.2/v.4 PCR 산물이 오직 전립선, 위장에서만 검출되었고 신장과 폐에서는 그보다 낮은 수준으로 검출된 반면, PSCA v. 5는 정상적인 모든 조직에서 검출되지 않았다. PSCA v.3 PCR 검출 산물은 테스트된 샘플 중 어떠한 것에서도 검출되지 않았다.
[0040] 도 1J. PSCA v.4 및 PSCA v.5의 발현. 1J(a) 도면에서 화살표 ㅍ표푯표시된 B 및 C에 의해 나타내진 바와 같이 PSCA v.4 와 PSCA v.5를 구별하도록 프라이머를 디자인하였다. PSCA v.4에 특이적인 프라이머는 460 bp의 PCR 산물을 유도한 반면, PSCA v.5에 특이적인 프라이머는 945 bp 크기의 PCR 산물을 유도하였다. 1J(b) 정상적인 방광, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 전립선, 비장, 골격근, 고환, 췌장, 결장, 위장, 전립선암, 방광암, 및 멀티-이종이식편 풀 (전립선암, 신장암 ㅁ및 방광암 이종이식편)부터 첫번째 cDNA 가닥을 제조하였다. 액틴에 대한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 노멀라이제이션을 수행하였다. 여러가지 특이적인 프라이머를 이용하여 30 사이클의 증폭으로 반정량적 PCR을 수행하였다. 그 결과 전립선암, 방광암 및 멀티-이종이식편 풀, 정상적인 신장 및 전립선에서 PSCA v.4가 발현된 것으로 나타났다. PSCA v5는 정상적인 전립선 및 방광암에서만 검출되었다.
[0043] 도 2. PSCA 항체의 아미노산 서열. 도 2A. Ha1-4.117 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2B. Ha1-4.117 VL의 아미노산 서열. 밑 줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2C. Ha1-4.120 VH의 아미노산 서열. 도2D. Ha1-4.120 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2E. Ha1-5.99 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2F. Ha1-5.99 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2G. Ha1-4.121 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2H. Ha1-4.121 VL c.5의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2I. Ha1-4.121 VL c.26의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2J. Ha1-1.16 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2K. Ha1-1.16 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2L. Ha1-4.5 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2M. Ha1-4.5 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2N. Ha1-4.40 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2O. Ha1-4.40 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2P. Ha1-4.37 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2Q. Ha1-4.37 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2R. Ha1-1.43 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2S. Ha1-1.43 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 2T. Ha1-1.152 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 2U. Ha1-1.152 VL의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다.
[0044] 도 3. PSCA 항체의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열. 도 3A. Ha1-4.117 VH의 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3B. Ha1-4.117 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3C. Ha1-4.120 VH 의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3D. Ha1-4.120 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3E. Ha1-5.99 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3F. Ha1-5.99 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3G. Ha1-4.121 VH 3H의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3H. Ha1-4.121 VL c.5의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3I. Ha1-4.121 VL c.26의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3J. Ha1-1.16 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3K. Hal-1.16VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3L. Ha1-4.5 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3M. Ha1-4.5 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3N. Ha1-4.40 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3O. Ha1-4.40 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3P. Ha1-4.37 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3Q. Ha1-4.37 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3R. Ha1-1.43 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3S. Ha1-1.43 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다. 도 3T. Ha1-1.152 VH의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 중쇄 불변부이다. 도 3U. Ha1-1.152 VL의 cDNA 및 아미노산 서열. 밑줄친 부분은 경쇄 불변부이다.
[0045] 도 4. 배선 (germline) V-D-J 서열에 대한 PSCA 항체의 정렬. 도 4A. 인간 VH4-31에 대한 Ha1-4.117 VH (SEQ ID NO: 13)의 정렬. 도 4B. 인간 L19에 대한 Ha1-4.117 VL (SEQ ID NO: 14)의 정렬. 도 4C. 인간 VH4-31에 대한 Ha1-4.120 VH (SEQ ID NO: 15)의 정렬. 도 4D. 인간 O2에 대한 Ha1-4.120 VL (SEQ ID NO: 16)의 정렬. 도 4E. 인간 VH4-34에 대한 Ha1-5.99 VH (SEQ ID NO: 17)의 정렬. 도 4F. 인간 A27에 대한 Ha1-5.99 VL (SEQ ID NO: 18)의 정렬. 도 4G. 인간 VH4-34에 대한 Ha1-4.121 VH (SEQ ID NO: 19)의 정렬. 도 4H. 인간 O8에 대한 Ha1-4.121 c.5 VL (SEQ ID NO: 20)의 정렬. 도 4I. 인간 A3에 대한 Ha1-4.121 c.26 VL (SEQ ID NO: 21)의 정렬. 도 4J. 인간 VH6-1에 대한 Ha1-1.16 VH (SEQ ID NO: 22)의 정렬. 도 4K. 인간 B3에 대한 Ha1-1.16 VL (SEQ ID NO: 23)의 정렬. 도 4L. 인간 VH4-31에 대한 Ha1-4.37 VH (SEQ ID NO: 28)의 정렬. 도 4M. 인간 O2에 대한 Ha1-4.37 VL (SEQ ID NO: 29)의 정렬.
[0046] 도 5. 재조합 마우스, 래트 및 인간 세포주에 있어서 PSCA 단백질의 발현. 표시된 마우스, 래트 및 인간 세포주들을 인간 PSCA cDNA 및 네오마이신 내성 유전자를 지니는 레트로바이러스나 또는 네오마이신 내성 유전자만을 지니는 대조군 바이로스로 감염시켰다. 안정한 재조합 세포주를 G418 존재 하에 선별하였다. 1G8 항-PSCA MAb (5 ug/ml)를 이용한 FACS 염색에 의해 PSCA 발현을 측정하였다. 도시된 것은 PSCA 감염주에서만 형광 쉬프트를 나타내는 각각의 세포주의 PSCA 프로파일로서 세포 표면 PSCA 발현을 나타낸다. 이들 세포주들은 MAb 개발시 면역원, MAb 스크리닝 시약으로서, 그리고 기능 분석에서 유용하다.
[0047] 도 6. E. Coli로부터의 PSCA 단백질의 정제. E.　 coli. 균주 BL21 pLysS를 PSCA cDNA의 아미노산 21-94를 코딩하는 pET-21b 벡터로 형질전환시켰다. IPTG에 의해 대수기 배양을 유도하여 PSCA 단백질을 발현시키고 용해된 세균의 가용성 또는 불용성 분획으로부터 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용출된 분획의 SDS-PAGE 쿠마씨 블루 염색 젤을 도시하였다. 이 단백질은 MAb 및 pAb 면역원 및 항체 스크리닝 시약으로서 유용하다.
[0048] 도 7. 293T 세포로부터 발현된 재조합 글리코실화된 PSCA 단백질의 정제. 293T 세포를 PSCA cDNA 코딩 아미노산 28-100을 지니는 psecTag2 벡터로 트랜스펙션시켰다. 하이그로마이신 B를 이용한 약물 선별에 의해 안정한 재조합 PSCA-분비 세포주를 만들었다. 조건화 배지 중에 존재하는 PSCA 단백질을 1G8 MAb를 이용한 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 낮은 pH 용출 분획의 쿠마씨 블루 염색된 SDS-PAGE 젤을 도시하였다. 이 단백질의 넓은 분자량 스미어는 내재적으로 발현되는 PSCA에서 관찰되는 바와 같은 재조합 PSCA 단백질의 글리코실화를 입증해주는 것이다.
[0049] 도 8. E.Coli로부터의 GST-PSCA 단백질의 정제. E.　 coli 균주 BL21 DE3를 글루타치온-S-트랜스페라제 (GST)와 융합된 PSCA의 아미노산 18-98을 코딩하는 pGEX-2T로 형질전환시켰다. 대수기 배양체로부터 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)를 이용하여 GST-PSCA 단백질을 유도한 다음 글루타치온 아가로스 매트릭스를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 용해 세균으로부터 정제하였다. GST-PSCA를 함유하는 글루타치온 용출 분획의 SDS-PAGE 쿠마씨 블루 염색된 젤을 도시하였다. 본래의 GST-PSCA 융합 단백질과 GST를 함유하는 마이너 분해 산 물을 나타내었다. 이 단백질은 MAb 및 pAb 면역원으로서, 그리고 Ab 스크리닝 시약으로서 유용하다.
[0050] 도 9. FACS에 의한 인간 PSCA 항체 스크리닝. 상등액으로부터의 항체 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. (순수한) 50ul/웰을 96-웰 FACS 플레이트에 ㅊ처첨가한 다음 계대 희석하였다. PSCA-발현 세포들을 첨가하고 (내인성 또는 재조합, 50,000 세포/웰) 이 혼합물을 4℃에서 2시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후, 세포들을 PSCA 완충액으로 세척하고 100 ul의 검출 항체 (항-hIgG-PE)와 함께 4℃에서 45분간 추가로 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 말기에, 세포들을 FACS 완충액으로 세척하고, 포름알데히드로 고정한 다음 FACScan을 이용하여 분석하였다. CellQuest Pro software를 이용하여 데이터를 분석하였다. 색칠된 히스토그램은 음성 대조군 세포로부터의 데이터를, 색칠되지 않은 히스토그램은 PSCA-양성 세포로부터의 데이터를 나타낸다.
[0051] 도 10. FACS에 의한 PSCA Mabs의 상대적 친화도 순위. 각각의 PSCAgkdcpdml 21 계대 1:2 희석물을 밤새도록 4℃에서 SW780 세포 (웰 당 50,000 세포)와 함께 인큐베이션시켰다 (최종 MAb 농도는 40 nM 내지 0.038 pM). 인큐베이션 말기에 세포들을 세척하고 항-hIgG-PE 검출 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후 미결합 2차 항체, 세포들을 FACS에 의해 분석하고 S자형 투여량-반응 (가변 ㄱ기기울기) 방정식을 이용하여 각 포인트의 평균 형광 강도를 CellQuest Pro 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. PSCA MAb 4.121에 대한 결합 적정을 설명하는 대표적인 FACS 분석을 도면에 나타내었다.
[0052] 도 11. 293T 세포에서의 마우스 및 사이노몰구스 원숭이 PSCA의 발현 ㅁ및 항-인간 PSCA MAbs에 의한 인식. 293T 세포들을 일시적으로 cells were transiently transfected with 마우스의 PSCA cDNA, 원숭이의 PSCA cDNA를 지니는pCDNA3.1 벡터, 또는 아무것도 함유하지 않는 벡터 (neo)로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션시킨 지 2일 후, 세포들을 수확하고 사람의 항-PSCA MAb Ha1-4.117 또는 마우스의 MAb 1G8 (5 ug/ml)로 염색시켰다. 도시된 도면은 FACS 프로파일로서 ㅅ사사람의 PSCA 단백질에 대해 야기된 MAb Ha1-4.117이 293Ttpvhdptj 발현된 마우스 및 원숭이의 PSCA 단백질 두가지 모두에 대해 결합함을 보여준다. 마우스의 1G8 MAb는 원숭이의 PSCA에는 결합하느 마우스의 PSCA에는 결합하지 않는다. 이러한 결과는 다른 종으로부터의 항원과 교차반응하는 MAbs를 선별할 수 있음을 입증하는 것이다. 교차반응하는 MAbs는 이들 종들에 있어서의 발현 및 독성을 연구하는데 유용할 것이다.
[0053] 도 12. Mab 4.121과의 인큐베이션 후 PSCA의 내재화(internalization). PSCA MAb 4.121를 4℃에서 90분간 PC3-PSCA 세포와 함께 인큐베이션시켜 이 항체들을 세포 표면에 결합시켰다. 이어서 세포를 두가지 분주액으로 나눈 다음 37℃ (항체가 내재화되도록) 또는 4℃ (대조군: 내재화 없음)에서 인큐베이션시켰다. 37℃ 또는 4℃에서 인큐베이션시킨 후, 세포 표면에 결합된 나머지 PSCA MAb 4.121을 산 세척에 의해 제거하였다. 이어서 2차 검출 항체를 이용한 침투 및 인큐베이션에 의해 내재화된 PSCA MAb 4.121를 검출하였다. FACS를 이용하여 세포들을 분석하거나, 형관 현미경 하에서 관찰하였다. 대략 30%의 PSCA Mab 4.121가 37℃에서 2시간 인큐베이션 후 내재화되었다.
[0054] 도 13. PSCA에 대한 항체는 PSCA 발현 세포에서 사포린 의존성 ㅅ사사멸을 매개한다. 제1일에 B300.19 세포 (750 세포/웰)을 96 웰 플레이트에 접종하였다. 다음날, 사포린 독소 (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)와 접합된 2배 과량의 항-인간 (Hum-Zap) 또는 항-염소(Goat-Zap) 폴리클로날 항체와 함께 표시 농도의 2X 농도의 일차 항체를 함유하는 동 부피의 배지를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포들을 37℃에서 5일간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 말기에, MTS (Promega)를 각각의 웰에 첨가하고 다시 4시간 더 인큐베이션시켰다. 450 nM 에서의 OD를 측정하였다. 도 13(A)의 결과는 PSCA 항체 HA1-4.121 및 HA1-4.117 이 B300.19-PSCA 세포에서 사포린 의존성 세포독성을 매개한 반면, 대조군인 비특이적IgG1 항체는 아무런 효과도 나타내지 않았음을 보여준다. 도 13(B)의 결과는 인간 Fc를 인식하지 못했던 2차 사포린 접합된 항체의 부가는 세포독성을 매개하는데 실패하였음을 보여준다.
[0055] 도 14. PSCA Mabs의 상보성 매개형 세포독성. PSCA 항체 (0-50 ㎍/ml)를 RHB 완충액 (RPMI 1640, Gibco Life Technologies, 20 mM HEPES)으로 희석시켰다. B300.19-PSCA 발현 세포들을 RHB 완충액으로 세척하고 106 세포/ml의 밀도로 재현탁새켰다. 전형적인 분석으로, PSCA 항체 50 ㎕, 희석된 토끼 보혈청 (complement serum) (Cedarlane, Ontario, Can) 50 ㎕, 및 세포 현탁액 50 ㎕를 함께 평저 조직 배양 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이 혼합물을 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켜 보체-매개형 세포 용해를 용이화시켰다. 50 ㎕의 Alamar Blue (Biosource Intl. Camarillo, CA)를 각각의 웰에 첨가하고 37℃에서 4-5시간 더 인큐베이션시켰다. 각각의 웰의 형광을 530 nm에서의 여기 및 590 nm에서의 방출을 이용하여 96-웰 형광 측정기로 판독하였다. 그 결과, IgG1 (HA1-4.121) 또는 IgG2 이소형 (HA1-5.99.1)은 갖지만 IgG4 이소형 (HA1-6.46)은 갖지 않는 PSCA 항체들은 표적 세포의 보체 의존성 용해를 매개할 수 있는 것으로 나타났다.
[0056] 도 15. 펩신 분해에 의한 MAb Ha1-4.121의 F(ab')2 단편의 생성. 20mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.5 중 20 mgs의 MAb Ha1-4.121를 지정된 기간 동안 고정화 펩신 (Pierce. Rockford IL) 존재 또는 부재 하에 인큐베이션시켰다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 본래의 MAb와 분해된 Fc 단편들을 제거하였다. SDS-PAGE 쿠마씨 염색된 젤을 도시하였다. 본래의 분해되지 않은 비환원 Mab, 지정 기간에 채취된 분해 물질의 비환원 부분 표본(aliquot) 및 분해된 최종 분해된 F(ab')2 산물의 환원 샘플을 도시하였다.
[0057] 도 16. 유량 세포분석법에 의한 PSCA에 대한 재조합 항-PSCA 인간 mAb의 결합. (16A) 항-PSCA 인간 mAb의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 발현 구조물로 293T 세포를 트랜스펙션시켰다. 상등액을 48시간 후에 수집하고 PSCA에 대한 결합에 관하여 분석하였다. (16B) 항-PSCA 인간 mAb를 하이브리도마 상등액으로부터 정제하여 PSCA 결합 분석에 사용하였다. PSCA 결합은 다음과 같이 시험하였다. PC3 ㅁ친세포 또는 PC3-PSCA 세포들을 전술한 항-PSCA 인간 mAbs와 함께 30분간 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 세포들을 세척하고 PE-접합된 항-인간 Ig와 함께 30분간 얼음 상에서 인큐베이션시켰다. 세포들을 세척한 다음 유량 세포분석법으로 평가하였다.
[0058] 도 17. 면역조직화학법에 의한 PSCA 단백질의 검출. 암환자로부터의 종양 표본에서의 PSCA 단백질의 발현을 항체 HA1-4.117을 이용하여 검출하였다. 포르말린 고정된 파라핀 내장 조직을 4 마이크론 섹션으로 절단하여 유리 슬라이드 위에 장착하였다. 이 섹션들로부터 밀랍을 제거하고, 재수화시킨 다음, 고온에서 항원 회수 용액 (Antigen Retrieval Citra Solution; BioGenex, 4600 Norris Canyon Road, San Ramon, CA, 94583)으로 처리하였다. 이어서 이 섹션들을 4℃에서 16시간 동안 플루오레신 접합된 인간의 모노클로날 항-PSCA 항체, Hal-4.117 중에서 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 완충액에서 3회 세척한 다음 토끼의 항-플루오레신과 함께 1시간 인큐베이션시키고, 완충액에서 세척한 후, DAKO EnVision+ TM 퍼옥시다제-접합된 염소의 항-토끼 면역글로불린 2차 항체 (DAKO Corporation, Carpenteria, CA)에 30분간 침지시켰다. 이어서 섹션들을 완충액 중에서 세척하고, DAB 키트 (SIGMA Chemicals)를 이용하여 전개시킨 다음, 헤마톡실린을 이용하여 대조염색시킨 후 명시야 현미경법에 의해 분석하였다. 그 결과, 전립선 선암종 (패널 A, 패널B), 방광 전이형 암종 (패널 C) 및 췌장의 도관형 선암종 (패널 D)의 종양 세포들에 서 PSCA가 발현된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 인간의 암에서 PSCA가 발현되었음과 이 항원에 지향된 항체들이 진단 시약으로서 유용함을 가리키는 것이다.
[0059] 도 18. PSCA MAb Ha1-4.120는 피하 전립선암 이종이식편의 성장을 억제한다. LAPC-9AI 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에 피하 주사하였다. 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (각 그룹 당 n=10), 표시된 바와 같이 제0일에 HA1-4.120 또는 이소형 MAb 대조군으로 복강내 (i.p.) 개시 처치하였다. 연구 기간인 제28일까지 동물들을 1주일에 2회 총 7회 투약하였다. 표시된 바와 같이 매 3 ~ 4일마다 칼리퍼 측정을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 그 결과 인간의 항-PSCA 모노클로날 항체 Ha1-4.120은 SCID 마우스에 피하 이식된 인간 전립선 암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다 (p< 0.05).
[0060] 도 19. PSCA MAb Ha1-5.99는 SCID 마우스에 있어서 수립된 전립선암 이종이식편의 성장을 억제한다. LAPC-9AI 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양 부피가 50 mm3 에 달했을 때 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (각 그룹 당 n=10), 표시된 바와 같이, HA1-5.99.1 또는 이소형 MAb 대조군으로 복강내 (i.p.) 개시 처치하였다. 연구 기간인 제14일까지 동물들을 1주일에 2회 총 5회 투약하였다. 표시된 바와 같이 매 3 ~ 4일마다 칼리퍼 측정을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 그 결과 전적으로 인간의 항-PSCA 모노클로날 항체 Ha1-5.99는 SCID 마우스에 피하 이식된 수립된 안드로겐-비 의존형 인간 전립선 암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다 (p< 0.05).
[0061] 도 20. PSCA Mab HA1-4.121은 수립된 안드로겐-의존형 인간 전립선 암 이종이식편을 억제한다. LAPC-9AD 종양 세포 (2.5 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양 부피가 40 mm3 에 달했을 때 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (각 그룹 당 n=10), 표시된 바와 같이, HA1-4.121 또는 이소형 MAb 대조군을 농도를 늘려가면서 으로 복강내 (i.p.) 개시 처치하였다. 연구 기간인 제21일까지 동물들을 1주일에 2회 총 7회 투약하였다. 표시된 바와 같이 매 3 ~ 4일마다 칼리퍼 측정을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 이 연구 결과 Ha1-4.121은 SCID 마우스에서 수립된 피하 인간 안드로겐-의존형 전립선 이종이식편의 성장을 억제하는 것으로 나타났다 (p< 0.05, Kruskal-Wallis 테스트, two-sided with α= 0.05).
[0062] 도 21. 환자-유도형, 안드로겐-의존형 LAPC-9AD 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스의 전립선의 등쪽 로브내로 주입하였다. 약 10일간 종양이 자라도록 한 다음 무작위적으로 마우스를 여러 그룹으로 나누었다. 종양을 이식한지 10일 후 인간의 500 ug의 HA1-4.117, HA1-4.121 또는 이소형 대조군 MAb 로 처리하기 시작하였다. 항체들을 일주일에 2회 총 7회 복강 투약하였다. 최후 투약일로부터 4일 후, 동물들을 희생시켜 일차 종양을 절제하여 칭량하였다.그 결과, 인간의 항-PSCA 모노클로날 항체 Ha1-4.121 (p< 0.01) 및 Ha1-4.117 (p< 0.05)은 SCID 마우스에 동소이식된 LAPC-9AD 전립선 암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다.
[0063] 도 22. PSCA MAb HA1-4.121은 수립된 동소이식된 인간 안드로겐-의존성 전립선 종양이 있는 SCID 마우스의 생존을 연장시켜준다. 환자-유도형, 안드로겐-의존형 LAPC-9AD 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스의 전립선의 등쪽 로브내로 주입하였다. 약 9일간 종양이 자라도록 한 다음 무작위적으로 마우스를 여러 그룹으로 나누었다. 생존 그룹으로 무작위 분류된 마우스들은 이소형 MAb 대조군의 11 마리와 HA1-4.121 처리군 12마리였다. 동물들을 1000 ug HA1-4.121 또는 1000 ug 이소형 Mab 대조군으로 1주일에 2회씩 총 9회 복강 투약하였다. 그 결과 HA1-4.121은 인간의 안드로겐-의존성 전립선 종양이 있는 SCID 마우스의 생전을 유의적으로 (로그-랭크 테스트: p<0.01) 연장시켜 준 것으로 나타났다. HA1-4.121 처리 그룹의 두마리는 최종 처리 후 110일 후에도 만져지는 종양이 없는 채로 유지되었다.
[0064] 도 23. HA1-4.21 및 택소티어 병용 요법에 의한 전립선 종양 성장의 억제 증진. LAPC-9AI 종양 세포 (마리 당 2 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 부피가 65 mm3에 달하면, 표시된 바와 같이 마우스들을 무작위적으로 4개의 그룹으로 나누었다 (각 그룹 당 n=10). 제0일에 시작해서, Ha1-4.121 또는 이소형 MAb 대조군을 500 ug의 투약량으로 1주일에 2회 총 6회 복강 ㅌ투약하였다. 마지막 투약을 제17일에 실시하였다. 택소티어는 제0일, 제3일, 및 제7일에 5 mg/kg의 투약량으로 정맥 투여하였다. 종양 성장을 칼리퍼 측정에 의해 3~4일마다 모니터링하였다. 이 연구 결과, 단독 제제로서 HA1-4.121는 제28일에, 대조군 항체만으로 처리된 경우에 비해 SCID 마우스에서 안드로겐-비의존성 전립선 이종이식편의 성장을 45% 억제한 것으로 나타났다 (ANOVA/Tukey test: p<0.05). 이소형 MAb 대조군 플러스 택소티어를 투여한 경우에는 대조군 항체만으로 단독 ㅊ처nt치된 경우에 비해 종양 성장을 28% 억제하였으며, 이것은 통계적으로 유의적인 것이 아니었다. HA1-4.121를 택소티어와 병용하여 투여한 경우에는, 억제 효과를 증강시켜, 대조군 항체 단독의 경우에 비해 종양 성장을 69% 억제하였다 (ANOVA/Tukey test: p<0.01). HA1-4.121 플러스 택소티어 병용 그룹을 HA1-4.121 또는 이소형 MAb 대조군 플러스 택소티어 그룹과 비교한 경우에도 통계적으로 유의적인 차이가 입증되었다 (ANOVA/Tukey test: p<0.05).
[0065] 도 24. 인간의 PSCA MAbs는 SCID 마우스/인간 HPAC에서 췌장암 이종이식편의 성장을 억제한다. 췌장암 세포 (2 x 106/마우스)를 면역결핍 ICR SCID 마우스 (Taconic Farm, Germantown, NY)에게 피하 주사하였다. 이 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (n= 10 마리/그룹), 표시된 인간 PSCA 모노클로날 항체를 이용한 치료를 같은 날 개시하였다. 항체 (500 mg/마우스)를 1주일에 2회 총 8회 복강내로 투약하였다. 그 결과 인간의 항-PSCA 모노클로날 항체 Ha1-4.121, Ha1-4.117 및 Ha1-1.16는 SCID 마우스에 피하 이식된 인간 췌장암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 입증되었다. t 검정법 (two-sided, α=0.05)을 이용하여 통계학적 분석을 실시하였다.
[0066] 도 25. PSCA MAb HA1-4.121은 SCID 마우스에 동소이식된 췌장 종양의 성장을 억제한다. HPAC 세포 (3.0 x 106 세포)를 SCID 마우스의 췌장내로 동소이식하였다. 표시된 바와 같이 마우스들을 무작위적으로 3개의 그룹으로 나누었다 (각 그룹 당 n=9). HA1-4.121 (250 ug 또는 1000 ug) 또는 이소형 MAb 대조군 (1000 ug)을 이용한 처치를 이식 당일로부터 개시하였다. 항체는 1주일에 2회씩 총 10회 복강 투약하였다. 최종 투약으로부터 13일 후에, 동물들을 희생시키고 일차 종양을 절제하여 칭량하였다. 이 연구 결과는 HA1-4.121이 시험된 두가지 투약 수준 모두에서 SCID 마우스에서 인간 췌장암 이종이식편의 동소 성장을 유의적으로 억제하였음을 입증한다. 250 ug 및 1000 ug AGS-PSCA를 이용한 처치는 종양 성장을 각각 66% 및 70% 억제하였다 (Kruskal-Wallis/Tukey test: 각각 p<0.01 및 p<0.01).
[0067] 도 26. PSCA MAb HA1-4.121는 암의 전이를 억제한다. 부검시, 대조군 항체 처리 그룹에서 임파절과 원위 기관으로의 가시적인 전이가 관찰되었다. 2가지 모두의 HA1-4.121 처리 그룹에서는 가시적인 전이는 관찰되지 않았다. 임파절, 폐 및 간을 모든 동물로부터 제거하여 전이성 종양의 존재 여부를 조직학적으로 시험하였다. 각 동물로부터 제거된 폐와 임파절로부터의 섹션들을 인간의 사이토케라틴으로 염색하고 전이 갯수를 현미경으로 결정하였다. 이 조직학적 분석으로부터 얻은 결과는 HA1-4.121로 처리된 동물의 경우 임파절 (LN) 전이가 현저히 감소되었음을 입증해준다 (p= 0.0152: Fisher의 정확성 검정에 의해 평가). 폐 전이는 1.0 mg 투약량의 HA1-4.121로 처리된 마우스에서만 유의적으로 감소되었다 (p= 0.0498: Fisher의 정확성 검정에 의해 평가).
[0068] 도 27. 인간의 PSCA MAbs는 SCID 마우스에서 SW780 방광 종양을 억제한다. 인간의 SW780 방광암 세포 (2 x 106/마우스)를 면역결핍 ICR SCID 마우스 (Taconic Farm, Germantown, NY)에게 피하 주사하였다. 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (n= 10 마리/그룹) 표시된 인간 PSCA MAb을 이용한 처치를 같은 날 개시하였다. 항체 (250 mg/마우스)를 1주일에 2회 총 7회 복강 투약하였다. 그 결과 HA1-4.117 (p= 0.014), HA1-4.37 (p=0.0056), HA1-1.78 (p=0.001), Ha1-5.99 (p=0.0002) 및 HA1-4.5 (p=0.0008)는 SCID 마우스에서 피하 이식된 SW780 방광 종양의 성장을 유의적으로 억제한 것으로 입증되었다. 통계학적 ㅂ부분ifㅅic서석을 t 검정법 (two-sided, α=0.05)을 이용하여 수행하였다.
[435] 본 발명의 다양한 측면들을 이하의 몇몇 실시예들을 들어 더욱 상세히 설명하나, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
정상 조직과 환자의 표본에서 PSCA 변이체의 발현 분석
[0436] 여기에서 PSCA v.1로 언급되는 PSCA는 이전에는 전립선암에서 발현되는 항원으로 인식되었다. 이의 발현은 원발성 전립선암의 80% 이상에서와 대부분의 전립선 전이에서 검출되었다. 이는 또한, 방광암, 난소암 및 췌장암에서도 발견되 었다. 이러한 암은 표 1에 나타낸다. 면역 조직 화학적 분석에 의하여, PSCA는 대부분의 전이성 요로 상피 암종의 세포 표면과, 원발성 췌장 선암종 60%에서 과발현된다. PSCA 발현 데이터는 특허 공개 공보 (PCT/US98/04664, PCT/US/28883, PCT/US00/19967)와 상호 검토된 논문(Saffran et al., Proc Natl Acad Sci U. S. A. 2001 Feb 27; 98(5):2658-2663; Amara et al., Cancer Res. 2001 Jun 15; 61(12):4660-65; Reiter et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Feb 17;95(4):1735-40; Argani et al., Cancer Res. 2001 Jun 1; 61 (11): 4320-24)에서 보고되고 있다.
[0437] 다른 PSCA 변이체의 특이적인 발현은 정상 및 암 환자 표본에서 연구되었다. PSCA v.1/v.2/v.4, PSCA v.3 및 PSCA v.5가 서로 구별되도록 프라이머들을 디자인하였다. PSCA v.1/v.2/v.4는 425bp 크기의 PCR 산물로, PSCA v.3은 300bp의 PCR 산물로, 반면 PSCA v.5는 910bp의 PCR 산물로 생성되었다 (도 1I(a)).
[0438] 첫 번째 가닥 cDNA은 정상 방광, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 전립선, 비장, 골격근, 고환, 췌장, 결장, 위, 전립선암의 집단, 방광암, 신장암, 결장암, 폐암, 난소암, 유방암, 암 전이 및 췌장암으로부터 제조하였다(도 1I(b). 정상화는 액틴에 대한 프라이머를 이용하여 PCR로 수행하였다. 변이체 특이적 프라이머를 사용하는 반 정량적 PCR은 30 사이클의 증폭에서 실시하였다.
[0439] 결과는 주로 유방암, 암전이 및 췌장암에서 PSCA v.5가 발현하고, 결장암 및 폐암에서는 낮은 수준으로 발현하는 것을 보여준다. PSCA v.1/v.2/v.4 PCR 생성물은 전립선암, 방광암, 신장암, 결장암, 폐암, 난소암, 유방암, 암전이 및 췌 장암에서 검출되었다. 정상 조직 중에서, PSCA v.1/v.2/v.4 PCR 산물은 전립선, 위에서만 검출되었고, 신장과 폐에서 낮은 수준으로 검출된 반면, PSCA v.5는 어떠한 정상 조직에서도 검출되지 않았다.
[0440] PSCA v.4와 PSCA v.5가 서로 구별되도록 프라이머들을 디자인하였다(도 1J(a). PSCA v.4는 460bp의 PCR 산물로 생성되었으나, PSCA v.5는 945bp 크기의 PCR 산물로 생성되었다.
[0450] 첫 번째 가닥 cDNA은 정상 방광, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 전립선, 비장, 골격근, 고환, 췌장, 결장, 위, 전립선암의 집단, 방광암 및 다중-이종이식 집단 (전립선 암, 신장암 및 방관 암 이종이식)으로부터 제작하였다(도 1J(b). 정상화는 액틴에 대한 프라이머를 이용하여 PCR로 수행하였다. 변이체 특이적 프라이머를 사용하는 반 정량적 PCR은 30 사이클의 증폭에서 실시하였다.
[0442] 결과는 췌장암, 방광암, 다중-이종이식 집단, 정상 신장 및 전립선에서 PSCA v.4의 발현을 보여준다. PSCA v.5는 정상 전립선 및 방광암에서만 관찰되었다.
[0443] 정상 조직에서 PSCA 변이체의 제한된 발현과 암 환자 표본에서 관찰되는 발현은 PSCA 변이체가 인간 암의 치료적, 예후적, 예방적 및 진단적 표적임을 보여준다.
실시예 2
PSCA의 스플라이스 변이체
[0444] 본 발명에서, 변이체는 전사물 변이체와 단일 염기 다형성 (SNP)을 포함하는 개념이다. 전사물 변이체는 동일 유전자로부터의 성숙 mRNA의 변이체이고, 이들은 교호적인 전사 또는 스플라이싱에 의해 발생한다. 교호적인 전사는 동일 유전자로부터의 전사이긴 하나, 다른 지점에서 전사가 시작된다. 스플라이스 변이체는 동일 전사체로부터 다르게 스플라이싱된 mRNA 변이체이다. 진핵 세포에서, 다-엑손(multi-exon) 유전자가 게놈성 DNA로부터 전사될 때, 초기 RNA는 스플라이싱되어 기능성 mRNA를 생성하고, 이는 엑손만을 포함하며 아미노산 서열로 번역된다. 따라서, 주어진 유전자는 0 내지 수많은 다른 전사물을 가지고, 각각의 전사물은 0 내지 수개의 스플라이스 변이체를 가질 수 있다. 각 전사물 변이체는 고유의 엑손 구조를 가지고, 원 전사물과는 다른 코딩 및/또는 비-코딩 (5' 또는 3' 말단) 부위를 갖는다. 전사물 변이체는 동일 또는 유사 또는 다른 단백질의 유전 암호를 지정하고, 이러한 단백질은 동일, 유사 또는 다른 기능을 갖는다. 변이체 단백질은 동시에 같은 조직에서, 동시에 다른 조직에서, 또는 다른 시간에서 같은 조직에서, 또는 다른 시간에서 다른 조직에서 발현될 수 있다. 전사물 변이체에 의해 코딩되는 단백질은 유사하거나 다른 세포 이하의 또는 세포 외의 국소화를 가질 수 있다 (예, 분비된 vs 세포 내).
[0445] 전사물 변이체는 다양한 방법에 의해 확인된다. 예를 들어, 다른 전사물 및 스플라이스 변이체는 전장 클로닝을 이용하거나, 전장 전사물 및 EST 서열을 이용하여 확인된다. 첫 번째, 모든 인간 EST를 서로 직접 또는 간접 동일성을 나타내는 군집 내로 그룹화하였다. 두 번째, 같은 군집 내의 EST를 추가로 서브-군집으로 그룹화하고, 공통 서열로 모집하였다. 원 유전자 서열을 공통 서열 또는 다 른 전장 서열과 비교한다. 각각의 공통 서열은 그 유전자에 대하여 잠재적인 스플라이스 변이체이다. 노던 분석, 전장 클로닝또는 프로브 라이브러리를 이용한 변이체의 동정과 같은, 몇몇 확인 양식이 본 기술분야에 알려져 있다. 전장 클론이 아닌 변이체가 동정될 때에도, 변이체의 일부분은 예를 들어, 본 분야에 잘 알려진 기술을 이용한 항원 생산, 전장 스플라이스 변이체의 추가 클로닝을 위한 연구 도구로서 매우 유용하다.
[0446] 더욱이, 게놈 서열을 기초로 하여 전사물 변이체를 동정하는 컴퓨터 프로그램을 본 기술 분야에서 이용할 수 있다. 게놈-기반형 변이체 동정 프로그램은 FgenesH (A.Salamov 및 v. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA" Genome Research. 2000 April; 10(4):516-22); Grail (URL compbio. ornl. gov/Grail-bin/EmptyGrailForm) 및 GenScan (URL genes. mit. edu/GENSCAN. html)을 포함한다. 스플라이스 변이체 동정의 일반적인 분석을 위한 프로토콜은 예를 들어 다음을 참조한다: Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 2001 Jun 8; 498(2-3): 214-8; de Souza, S. J., et al., Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7;97(23): 12690-3.
[0447] 전사물 변이체의 파라미터를 추가로 확인하기 위해, 전장 클로닝, 프로테옴성 확인, PCR-기초 확인 및 5'RACE 확인과 같은 다양한 기술이 본 분야에서 이용될 수 있다 (프로테옴성 확인: Brennan, S. O., et al., Albumin banks peninsula: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 1999 Aug 17; 1433(1-2):321-6; Ferranti P, et al., Differential splicing of pre-messenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(s1)-casein, Eur J Biochem. 1997 Oct 1;249(1):1-7. PCR-기초 확인의 경우: Wellmann S, et al., Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variant by LightCycler technology, Clin Chem. 2001 Apr; 47(4) 654-60; Jia, H. P., et al., Discovery of new human beta-defensins using a genomics-based approach, Gene. 2001 Jan 24;263(1-2):211-8. PCR -기초 5' RACE 확인: Brigle, K.E., et al., Organization of the murine reduced folate carrier gene and identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 1997 Aug 7; 1353(2): 191-8 참조).
[0448] 암에서 조절되는 게놈성 부위는 본 기술 분야에 알려져 있다. 어떤 유전자 지도에 대한 게놈성 부위가 특정한 암에서 조절될 때, 그 유전자의 다른 전사물 또는 스플라이스 변이체도 조절된다. PSCA가 암에 관련된 특정의 발현 수준을 갖는 것은 여기에 기재되어 있다(예, 표 1 참조). PSCA의 다른 전사물 및 스플라이스 변이체 역시 암에, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 이들 조직과 특정의 추가적인 조직에 관여한다. 따라서, 변이체는 종양 관련 마커/항원으로서 작용한다.
[0449] EST 서열과 함께 전장 PSCA 유전자를 사용하여, 4개의 추가 전사물 변이체를 확인하고 이를, PSCA v.2, v.3, v.4 및 v. 5로 명명하였다. 원 전사물, PSCA v.1에서 엑손의 범위는 표 Vl에 나타내었다. PSCA 및 PSCA 변이체의 의 서열을 도 1에 나타내었다.
실시예 3
PSCA의 단일 염기 다형성
[0450] 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)은 특정 위치에서 누클레오타이드 서열에 있어서 단일 염기쌍의 변형이다. 게놈의 어느 주어진 위치에서, 4가지의 가능한 염기 염기쌍이 있다: A/T, C/G, G/C, 및 T/A. 여기에서 사용되는 것처럼, 대립 유전자는 주어진 유전자의 일련의 다른 형태 중 하나이며, DNA 서열에서 차이가 있으며, 산물에 영향을 미친다 (RNA 및/또는 단백질).
[0451] cDNA에서 발생하는 SNP를 cSNP라 한다. 이러한 cSNP는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산을 바꿀 수 있으며, 따라서, 단백질의 기능을 변화시킨다. 몇몇의 SNP는 유전 질병을 유발하고, 다른 몇몇은 표현형에 있어서 양적 변화와 개인 간의 식사 및 약제를 포함한 환경적 요인에 대한 반응에 영향을 미친다. 따라서, SNP 및/또는 대립 유전자의 조합의 존재는 유전병의 진단, 약제 반응 및 사용량의 확인, 질병에 관여하는 유전자의 동정 및 개체간 유전적 관련성에 관한 분석과 같은, 많은 다양한 용도를 가진다 (P. Nowotny, J. M. Kwon and A. M. Goate,"SNP analysis to dissect human traits," Curr. Opin. Neurobiol. 2001 Oct;11(5):637-641; M. Pirmohamed and B. K. Park," Genetic susceptibility to adverse drug reactions," Trends Pharmacol. Sci. 2001 Jun; 22(6): 298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai and A. Roses, "The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1): 39-47; R. Judson, J. C. Stephens and A. Windemuth, "The predicctive power of haplotypes in clinical response " Pharmacogenomics. 2000 Feb; 1(1): 15-26).
[0452] SNP는 다양한 방법에 의해 확인될 수 있다 (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am. Clin. Lab. 2001 Oct-Nov; 20(9): 18-20; K. M. Weiss, "In search of 인간 variation," Genome Res. 1998 Jul;8(7):691-697; M. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies," Clin. Chem. 2001 Feb; 47(2): 164-172). 예를 들어, SNP는 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 및 변성 경사 겔 전기영동(DGGE)과 같은 겔을 기초로 한 방법에 의해 다형성을 보여주는 DNA 단편 시퀀싱에 의해 확인된다. 또한, 다른 개체로부터 획득한 DNA 샘플의 직접적인 DNA 시퀀싱에 의하거나, 다른 DNA 샘플로부터의 서열을 비교함으로써 확인된다. 공중 및 개인 데이타베이스에 있는 서열 데이터의 빠른 축적으로, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 서열을 비교함으로써 SNP를 확인할 수 있다 (Z. Gu, L. Hillier and P. Y. Kwok,"Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace," Hum. Mutat. 1998; 12 (4): 221-225). SNP는 확인될 수 있고, 개인의 유전자형 또는 표본은 직접 시퀀싱 및 고효율 마이크로어레이를 포함하는 다양한 방법으로 확인될 수 있다 (P. Y. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2: 235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines and A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. 2000 Dec; 5 (4): 329-340).
[0453] 상기 언급된 방법을 사용하여, 13개 SNP가 PSCA v.2를 위한 전사물에서 확인되었다. 예를 들어, 변이체 1 보다는 변이체 2를 사용하였는데, 이는 변이체 2가 변이체 1 보다 더 적은 불확실한 염기를 가지기 때문이다. 그 결과, SNP는 PSCA v.2 내에서 57(t/c), 367(c/t), 424(a/c), 495(c/g), 499(c/t), 563(c/t), 567(g/a), 627(g/a), 634(t/g), 835(g/a), 847(g/a), 878(g/a) 및 978(c/g) 위치에서 확인되었다. 다른 대립 유전자를 가지는 전사물 또는 단백질을 변이체 PSCA v.6에서부터 v.18로 명명하였고, 도 1B 및 도 1G에 나타내었다.
[0454] v.6에서 염기 변화가 v.1의 개시 코돈을 변경하고, 따라서, 번역은 다음 ATG (mRNA 내의 AUG)까지 일어나지 않는다. 그 결과, v.1 단백질보다 더 짧은 단백질 9AA가 만들어진다.
[0455] 이러한 13개의 SNP 중 12개는 또한, 도 12b 및 표 LⅥ에 나타낸 바와 같이 변이체 4에 나타났다. PSCA v.4에 관련한 12개 SNP 변이체를 PSCA v.19에서부터 v.30로 명명하였다. 변이체 19 내지 27은 다른 아미노산을 코딩한다 (도 1H).
실시예 4
원핵 세포계에서의 재조합 PSCA의 생산
[0456] 재조합 PSCA 및 PSCA 변이체를 원핵 세포에서 발현시키기 위해서, 전체 또는 부분 길이 PSCA 및 PSCA 변이체 cDNA 서열을 본 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 발현 벡터 중 어느 하나로 클로닝하였다. PSCA 변이체의 다음 부위 중 하나 또는 그 이상이 발현되었다: 도 1에 표현된 전장 서열, 또는 PSCA, 변이체 또는 이들의 아날로그로부터 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 그 이상의 연속 아미노산.
A. 시험관내 전사 및 번역 구조체
[0457]
pCRⅡ: 원위치(in situ) 조사에서 PSCA 센스 및 RNA에 대한 안티센스 RNA 프로브를 생산하기 위해, PSCA cDNA의 전체 또는 부분을 코딩하는 pCRⅡ 구조체(InⅥtrogen, Carlsbad CA)를 생산하였다. pCRⅡ 벡터는 Sp6 및 T7 프로모터 플랭킹 삽입부위를 가지고 있으며, RNA 원위치 혼성화 실험에서 프로브로서 사용하기 위하여 PSCA RNA의 전사를 유발한다. 이러한 프로브는 RNA 수준에서 PSCA의 세포 및 조직 발현을 분석하는데 사용된다. PSCA 유전자의 cDNA 아미노산 코딩 부위를 나타내는 전사된 PSCA RNA는 PSCA 단백질을 합성하기 위하여, TnTTM Coupled Reticulolysate System (Promega, Corp., Madison, WI)과 같은 시험관 내 번역 시스템에 사용된다.
B. 박테리아 구조체:
[0458] pGEX 구조체: 박테리아에서 글루타치온 S-트란스페라제 (GST) 단백질에 융합된재조합 PSCA 단백질을 생산하기 위해서, PSCA cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 GST-융합 벡터의 pGEX계(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로 클로닝한다. 이들 구조체는 아미노 말단에 융합된 GST와 카르복 시 말단에 6개의 히스티딘 에피토프(6X His)를 가지는 재조합 PSCA 단백질 서열의 조절된 발현을 가능하게 한다. GST와 6X His택은 적절한 친화성 메트릭스를 이용하여 유도된 박테리아로부터의 재조합 융합 단백질의 정제를 가능하게 하고, 항-GST 및 항-His 항체를 가진 융합 단백질을 인지하게 한다. 6X His택은 6개의 히스티딘 코돈을 예를 들어, 오픈 리딩 프레임(ORF) 3'말단에서 콜로닝 프라이머에 첨가함으로써 생성된다. pGEX-6P-1에서 PreScissionTM 인식 부위와 같은, 단백질 가수 분해성 절단 부위는 PSCA-관련 단백질로부터 GST 택의 절단을 가능하게 한다. 암피실린 내성 유전자 및 pBR322 기원은 이.콜라이에서 pGEX 플라스미드의 선택 및 유지를 가능하게 한다.
[0459] pMAL 구조체: 박테리아에서, 말토스-결합 단백질(MBP)에 융합된 재조합 PSCA 단백질을 생산하기 위하여, PSCA cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 pMAL-c2X 및 pMAL-p2X 벡터(New England Biolabs, Beverly, MA)내로 클로닝함으로써, MBP 유전자에 융합시킨다. 이들 구조체는 아미노 말단에 융합된 MBP와 카르복시 말단에 6X His 에피토프 택을 가지는 재조합 PSCA 단백질 서열의 조절된 발현을 가능하게 한다. MBP와 6X His택은 적절한 친화성 메트릭스를 이용하여, 유도된 박테리아로부터의 재조합 단백질의 정제를 가능하게 하고, 항-MBP 및 항-His 항체를 가진 융합 단백질을 인지하게 한다. 6X His 에피토프 택은 6개의 히스티딘 코돈을 3' 콜로닝 프라이머에 첨가함으로써 생성된다. 인자 Xa 인식 부위는 PSCA로부터 pMAL 택의 절단을 가능하게 한다. pMAL-c2X 및 pMAL-p2X 벡터는 각각 세포질 또는 원형질 막공간에서 재조합 단백질의 발현하기 위해 최적화된다. 원형질막 발현은 디설피드 결합을 가진 단백질의 폴딩을 증가시킨다.
[0460] pET 구조체: 박테리아 세포에서, PSCA를 발현하기 위해서, PSCA cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 pET계 벡터(Novagen, Madison,WI)로 클로닝한다. 이러한 벡터는 박테리아에서, NusA 및 티오레독신(Trx)과 같은 용해도를 증가시키는 단백질과 재조합 단백질의 정제와 검출을 돕는 6X His와 S-Tagw과 같은 에피토프 택에 융합이 있는 재조합 PSCA 단백질과, 융합이 없는 재조합 PSCA 단백질의 엄격하게 조절된 발현을 가능하게 한다. 예를 들어, 구조체는 pET NusA 융합 시스템43.1을 사용하여 제작되고, PSCA 단백질 부위는 NusA에 아미노 말단 융합으로써 발현된다.
C. 효모 구조체
[0461] pESC 구조체: 재조합 단백질의 발생과 기능 연구를 위한 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cereⅥsiae)에서 PSCA를 발현하기 위해서, PSCA cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부를 4개의 선택가능한 마커, HIS3, TRP1, LEU2 및 URA3 중 하나를 함유하는 pESC 계 벡터(Stratagene, La Jolla, CA)로 각각 클로닝한다. 이들 벡터는 같은 효모 세포에서 2개까지 다른 유전자의 같은 플라스미드 또는 동일한 효모 세포에서 FlagTM 또는 Myc 에피토프 택을 함유하는 콜로닝된 서열로부터 조절된 발현을 가능하게 한다. 이들 시스템은 PSCA의 단백질 간 상호작용을 확인하는데 유용하다. 게다가, 효모 내에서의 발현은, 진핵 세포에 서 발현될 때 발견되는 당쇄화 및 인산화와 같은 유사 전사 후 수식을 나타낸다.
[0462] pESP 구조체: 효모 사카로마이세스 세레비지에에서 PSCA를 발현하기 위해서, PSCA cDNA 단백질 코딩 서열의 전부 또는 일부가 pESP계 벡터로 클로닝된다. 이들 벡터는 아미노 또는 카르복시 말단에서 재조합 단백질의 정제를 돕는 GST에 융합된 PSCA 단백질 서열의 높은 수준의 조절된 발현을 가능하게 한다. FlagTM 에피토프 택은 항-FlagTM 항체를 가진 재조합 단백질의 검출을 가능하게 한다.
실시예 5
고등 진핵 세포계에서의 재조합 PSCA 의 생산
A. 포유동물의 구조체들:
[0463] 진핵 세포에서 재조합 PSCA를 발현시키기 위하여, 전장 또는 부분 PSCA cDNA 서열 또는 그들의 변이체들을 당업계에서 알려진 다양한 발현 벡터들 중 어느 하나로 클로닝할 수 있다. PSCA의 다음 부위 중 어느 하나 이상이 이 구조체들에서 발현된다: 아미노산 1 내지 123, 또는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 중 어느 하나, 또는 PSCA v.1로부터 더 인접한 아미노산들, PSCA 변이체들 또는 그들의 유사체들.
[0464] 그 구조체들은 293T 세포와 같은 매우 다양한 포유동물 세포들 중 어느 하나로 트랜스펙트될 수 있다. 트랜스펙트된 293T 세포 용해물은 여기에서 기술된 항-PSCA 폴리클로날 혈청으로 프로브될 수 있다.
[0465]pcDNA4 / HisMax 구조체: 포유동물 세포에서 PSCA를 발현시키기 위해서, PSCA ORF, 또는 그들의 부분, 또는 PSCA를 pcDNA4/HisMax 버젼 A(Invitrogen, Calsbad, CA)로 클로닝하였다. 단백질 발현은 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV)의 프로모터 및 SP16 전사 인핸서로 작동된다. 재조합 단백질은 XpressTM 및 아미노-말단에 융합된 6개의 히스티딘(6X His) 에피토프들을 가지고 있다. 그 pcDNA4/HisMax 벡터는 또한 많은 T 항원을 발현시키는 세포주에서 에피솜 복제(episomal replication) 및 단순한 벡터 레스큐(vector rescue)를 위한 SV40 오리진과 함께 mRNA 안정성을 증강시키는 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, BGH) 폴리아델닐레이션 시그널 및 전사 종결 서열을 포함하고 있다.
지오신(Zeocin) 저항성 유전자는 그 단백질을 발현시키는 포유동물 세포를 선별하기 위해 사용되고, 앰피실린 저항성 유전자 및 ColE1 오리진은 E.coli에서 그 플라스미드를 선별 및 유지하도록 한다.
[0466]pcDNA3 .1/ MycHis 구조체: 포유동물 세포 PSCA를 발현시키기 위하여, 컨센서스 코작(kozak) 번역 개시 자리를 갖는 PSCA ORF, 또는 그들의 부분, 또는 PSCA를 pcDNA3.1/MycHis 버젼 A(Invitrogen, Calsbad, CA)로 클로닝하였다. 단백질 발현은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터로 작동되었다. 재조합 단백질은 myc 에피토프 및 카르복실-말단에 융합된 6X His 에피토프를 가지고 있다. 그 pcDNA3.1/MycHis 벡터는 또한 많은 T 항원을 발현시키는 세포주에서 에피솜 복제(episomal replication) 및 단순한 벡터 레스큐(vector rescue)를 위한 SV40 오리진과 함께 mRNA 안정성을 증강시키는 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, BGH) 폴리아델닐레이션 시그널 및 전사 종결 서열을 포함하고 있다. 네오마이신 저항성 유전자는 그 단백질을 발현시키는 포유동물 세포들의 선별을 위해 사용할 수 있고, 앰피실린 저항성 유전자 및 ColE1 오리진은 E.coli에서 그 플라스미드를 선별 및 유지하도록 사용될 수 있다.
[0467]pcDNA3 .1/ CT - GFP - TOPO 구조체: 포유동물 세포에서 PSCA를 발현시키고 형광을 이용하여 재조합 단백질을 검출하기 위하여, 컨센서스 코작(kozak) 번역 개시 자리를 갖는 PSCA ORF, 또는 그들의 부분들을 pcDNA3.1/CT-GEP-TOPO(Invitrogen, CA)로 클로닝하였다. 단백질 발현은 사이토메갈로바이러스(CMV)의 프로모터로 작동된다. 재조합 단백질은 비-침습적(non-invasive), in vivo 측정 및 세포 생물학 연구를 용이하게 하는, 카르복실-말단에 융합된 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)를 가지고 있다. 그 pcDNA3.1CT-GFP-TOPO 벡터는 또한 많은 T 항원을 발현시키는 세포주에서 에피솜 복제 및 단순한 벡터 레스큐(vector rescue)를 위한 SV40 오리진과 함께 mRNA의 안정성을 증강시키는 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 시그널 및 전사 종결 서열을 포함한다. 네오마이신 저항성 유전자는 그 단백질을 발현시키는 포유동물 세포들의 선별을 위해 사용하고, 앰피실린 저항성 유전자 및 ColE1 오리진은 E.coli에서 그 플라스미드를 선별 및 유지하도록 한다. 아미노-말단 GFP 융합을 가진 부가적인 구조체들이 PSCA 단백질의 전장에 이르는 pcDNC3.1/NT-GFP-TOPO로 제조된다.
[0468] PAPtag: PSCA ORF 또는 그들의 부분들을 pAPtag-5(GenHunter Corp. Nashville, TN)으로 클로닝하였다. 이 구조체는 IgGκ 시그널 서열이 아미노-말단에 융합되는 동안 PSCA 단백질의 카리복실-말단에서 알칼라인 포스파타아제 융합을 형성한다. 구조체는 또한 아미노-말단의 IgGκ 시그널 서열을 갖는 알칼라인 포스파타아제가 PSCA 단백질의 아미노-말단에 융합되도록 한다. 그 결과 생성된 재조합 PSCA 단백질들은 트랜스펙트된 포유동물 세포의 배지로의 분비를 위해 최적화되고 PSCA 단백질과 상호작용을 하는 리간드 또는 수용체와 같은 단백질을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 발현은 CMV 프로모터로 작동이 되고, 그 재조합 단백질은 또한 측정과 정제를 용이하게 하는 myc 및 카르복실-말단에서 융합된 6X His 에피토프를 포함한다. 그 벡터에 존재하는 지오신 저항성 유전자는 재조합 단백질을 발현시키는 포유동물의 세포들을 선별하는데 이용되고 앰피실린 저항성 유전자는 E.coli에서 그 플라스미드를 선별하는데 이용된다.
[0469] ptag5: PSCA ORF 또는 그들의 부분들을 pTag-5로 클로닝하였다. 이 벡터는 알칼라인 포스파타아제 융합이 없는 것을 제외하고는 pAPtag와 유사하다. 이 구조체는 아미노-말단의 IgGκ 시그널 서열 및 측정과 친화적 정제에 유용한, myc 및 카르복실-말단에 융합된 6X His 에피토프 태그를 갖는 PSCA 단백질을 생성한다. 그로인한 재조합 PSCA 단백질은 트랜스펙트된 포유동물의 세포의 배지로의 분비를 위해 최적화되고, PSCA 단백질과 상호작용을 하는 리간드 또는 수용체와 같은 단백질을 동정하기 위한 면역원 또는 리간드로서 이용된다. 단백질 발현은 CMV 프로모터로 작동된다. 그 벡터에 존재하는 지오신 저항성 유전자는 그 단백질을 발현시키는 포유동물의 세포를 선별하기 위해 이용되고, 앰피실린 저항성 유전자는 E. coli에서 그 플라스미드의 선별에 이용된다.
[0470]PsecFc: PSCA OFR 또는 그들의 부분들을 psecFc로 클로닝하였다. 그 psecFc 벡터는 인간 면역글로블린 G1 (IgG) Fc(힌지, CH2, CH3 부위)를 pSecTag2(Invitrogen, California)로 클로닝시킴으로써 제조되었다. 이 구조체는 PSCA 단백질의 N-말단으로 IgGK 시그널 서열을 융합시키는 동안, PSCA 단백질의 카르복실-말단에서 IgG1 Fc 융합을 형성한다. 쥐과 동물의 IgG1 Fc 부위를 이용하는 PSCA 융합체가 또한 이용된다. 그 결과로 생성된 재조합 PSCA 단백질은 트랜스펙트된 포유동물의 세포 배지로의 분비를 위해 최적화되고, PSCA 단백질과 상호작용을 하는 리간드 또는 수용체와 같은 단백질을 동정하기 위해 면역원으로서 이용될 수 있다. 단백질 발현은 CMV 프로모터로 작동된다. 그 벡터에 존재하는 히그로마이신 저항성 유전자는 그 재조합 단백질을 발현시키는 포유동물 세포의 선별을 위해 이용되고, 앰피실린 저항성 유전자는 E.coli에서 그 플라스미드의 선별을 위해 이용된다.
[0471] 도 8은 293T 세포로부터 PSCA.psecFc 단백질의 발현 및 정제를 보여준다.
[0472] pSR α 구조체: 구조적으로 PSCA를 발현시키는 포유동물 세포주를 형성하기 위하여, PSCA ORF 또는 그들의 부분들 또는 PSCA를 pSRα구조체로 클로닝하였다. 앰포트로픽(Amphotropic) 및 에코트로픽(ecotropic) 레트로바이러스는 pSRα 구조체를 293T-10A1이 팩킹된 라인으로 트랜스펙션시키거나 pSRα 및 (삭제된 패킹 서열을 포함하는) 헬퍼 플라스미드를 293 세포로 각각 상호-트랜스펙션시킴으로써 생성되었다. 그 레트로바이러스는 숙주세포주로 클로닝된 유전자인 PSCA가 통합되되록 다양한 포유동물의 세포를 감염시키는데 이용된다. 단백질 발현은 LTR(Long terminal repeat)에서 작동된다. 그 벡터에 존재하는 네오마이신 저항성 유전자는 그 단백질을 발현시키는 포유동물의 선벽을 위해 이용되며, 앰피실린 저항성 유전자 및 ColE1 오리진은 E.coli에서 그 플라스미드를 선별 및 유지하기 위해 이용된다. 그러므로, 그 레트로바이러스 벡터는 예를 들면 PC3, NIH 3T3, TsuPr1, 293 또는 rat-1 세포들을 이용한 다양한 세포주의 감염 및 생성을 위해 이용될 수 있다.
[0473] 도 6은 PSCA.pSRα 구조체를 이용한 재조합 쥐과 동물, 쥐 및 인간 세포 주에서의 PSCA의 발현을 보여준다. 지적된 쥐과 동물, 쥐 및 인간 세포 주들은 인간 PSCA cDNA 및 네오마이신 저항성 유전자를 담지하는 레트로바이러스로 감염되거나, 또는 오직 네오마이신 저항성 유전자만을 담지하는 레트로바이러스로 감염되었다. 안정한 재조합 세포주들은 G418 약 선별에 의해 야기되었다. PSCA 발현은 1G8 항-PSCA MAb (5 ug/㎖)로 염색된 FACS에 의해 결정되었다. 세포표면 PSCA 발현을 지시하는 PSCA 감염된 세포주에 있어서 오직 형광 쉬프트를 보여주는 각 세포주의 FACS 프로파일이 보여진다. 이들 세포주들은 면역원, MAb 스크리닝 시약으로서 Mab 개발 및 기능적 어세이에 있어서 유용한다.
[0474] 부가적인 pSRα 구조체가 항-Flag 항체를 이용한 관측이 가능하도록 PSCA 서열의 카르복실-말단에 FLAG™ 태그와 같은 에피토프 태그를 융합하여 제조되었다. 예를 들어, 그 FLAG™ 서열 5'gat tac aag gat gac gac gat aag 3' (SEQ ID NO:76)이 OFR의 3' 말단에서 프라이머를 클로닝하기 위해 추가되었다. 부가적인 pSRα 구조체는 양 아미노-말단 및 카르복실-말단의 GFP 및 전장-PSCA 단백질의 myc/6X His 융합 단백질을 생산하기 위해 제조된다.
[0475] 부가적인 바이러스 벡터들: 부가적인 구조체들은 바이러스-매개 수송 및 PSCA의 발현을 위해 제조된다. 높은 수준의 PSCA 발현을 유도하는 높은 바이러스 타이터(virus titer)는 아데노바이러스의 벡터 및 헤르페스 엠플리콘 벡터(herpes amplicon vectors)와 같은 바이러스 수송 체계에 의해서 성취된다. PSCA 코딩 서열 또는 그들의 단편들은 PCR에 의해 증폭되어 AdEasy 셔틀 벡터(Stratagene)으로 서브클론된다. 재조합 및 바이러스 패키징은 아데노바이러스 벡터를 생산하는 업체들의 메뉴얼에 따라 수행하였다. 다른 한편으로, PSCA 코딩 서열 또는 그들의 단편들을 헤르페스 바이러스 벡터를 생산하기 위해 HSV-1 벡터(Imgenex)로 클로닝하였다. 그러므로, 그 바이러스 벡터들은 PC3, NIH 3T3, 293 또는 rat-1 세포들과 같은 다양한 세포주의 감염을 위해 이용된다.
[0476] 조절된 발현 시스템: 포유동물의 세포에서 PSCA의 발현을 조절하기 위하여, PSCA 코딩 서열 또는 그들의 부분들을 T-Rex 시스템 (Invitrogen), GeneSwitch 시스테 (Invitrogen) 및 tightly-regulated Ecdysone 시스템 (Sratagene)과 같은 조절된 포유동물의 발현 시스템으로 클로닝하였다. 이들 시스템들은 재조합 PSCA의 시간적 및 농도 의존적 효과의 연구가 가능하게 한다. 그러므로, 이들 벡터들은 PC3, NIH 3T3, 293 또는 rat-1 세포들과 같은 다양한 세포주에서 PSCA의 발현을 조절하는데 이용될 수 있다.
B. 배큘로바이러스 발현 시스템
[0477] 배큘로바이러스(baculovirus) 발현시스템에 있어서 재조합 PSCA 단백질을 생산하기 위하여, PSCA OFR 또는 그들의 부분들을 N-말단에 His-태그를 제공하는 배큘로바이러스 트랜스퍼 벡터 pBlueBac 4.5 (Invitrogen)으로 클로닝하였다. 특히, pBlueBac-PSCA는 재조합 배큘로바이러스를 생산하기 위하여 헬퍼 플라스미드 pBac-N-Blue (Invitrogen)로 SF9 (Spodoptera frugiperda) 곤충 세포를 상호-트랜스펙션시킨다 (상세한 것은 Invitrogen instruction의 메뉴얼을 참조하기 바란다). 그때, 배큘로바이러스는 세포 상청액으로부터 수집되어 플라크 어세이(plaque assay)에 의해 정제된다.
[0478] 재조합 PSCA 단백질은 정제된 배쿨로바이러스로 HighFive 곤충 세포의 감염에 의해 생산된다. 재조합 PSCA 단백질은 항-PSCA 또는 항-His-태그 항체를 이용하여 측정할 수 있다. PSCA 단백질은 정제될 수 있고 다양한 세포-관련 어세이에서 이용되거나 PSCA에 특이한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 이용될 수 있다.
C. PSCA 오르솔로그(PSCA Orthologs)를 위한 발현 벡터들
[0479] PSCA의 생쥐 및 원숭이 오르솔로그를 pcDNA3.1/MycHis 버젼 A(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 클로닝하였다. 단백질 발현은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터로 작동된다. 그 재조합 단백질은 myc 에피토프 및 카르복실-말단에 융합된 6X His 에피토프를 가지고 있다. 이들 벡터들은 모노클로날 항-인간 PSCA 항체들의 교차 반응성을 측정하기 위해 PSCA 오르솔로그를 발현시키도록 한다.
[0480] PSCA의 생쥐 및 원숭이 오르솔로그들을 pSRα 구조체로 클로닝하였다. 그 pSRα 구조체는 구조적으로 PSCA 오르솔로그들을 발현시키는 포유동물 세포를 생성한다. 단백질 발현은 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터로 작동된다. 그 재조합 단백질은 myc 에피토프 및 카르복실-말단에 융합된 6X His 에피토프를 가지고 있다. 이들 벡터들은 모노클로날 항-인간 PSCA 항체들의 교차-반응성을 측정하기 위해, 그리고 PSCA 오르솔로그들의 기능적 활성을 연구하기 위해 PSCA 오르솔로그들을 발현시키도록 한다. 앰포트로픽 및 에코트로픽 레트로바이러스들은 pSRα 구조체들을 293T-10A1 패키징 라인으로의 트랜스펙션에 의해, 또는 pSRα 및 (삭제된 패키징 서열을 포함하는) 헬퍼 플라스미드의 각각 293 세포들로의 co-트랜스펙션에 의해 제조된다. 그 레트로바이러스는 숙주 세포-주에 클론된 유전자인 PSCA 오르솔로그가 통합되도록 다양한 포유동물의 세포주를 감염시키는데 이용된다.
[0481] 도 7은 생쥐 및 원숭이 PSCA.pcDNA3.1/MycHis의 293T 세포들로의 트랜스펙션 후의 발현을 보여준다. 293T 세포들은 생쥐 PSCA.pcDNA3.1/MycHis 또는 원숭이 PSCA.pcDNA3.1/MycHis 중 어느 하나 또는 pcDNA3.1/MycHis 벡터 컨트롤로 트랜스펙션되었다. 40시간 후에, 세포들을 수집하여 항-PSCA 모노클로날 항체들을 이용하여 플로우 사이토미트리(flow cytometry)로 분석하였다.
실시예 6:
항원성 프로파일과 2차 구조
[0482] PSCA 변이체 1, 3 및 4의 5개 아미노산의 프로파일은 ExPasy molecular biology server 내의 ProtScale 웹사이트 (URL www. expasy.ch/cgi- bin/protscale.pl)에 접속함으로써 접근할 수 있다.
[0483] 이들 프로파일: 친수성, (Hopp T. P., Woods K. R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 3824- 3828); 수치요법 (Kyte J., Doolittle R. F., 1982. J. Mol. Biol. 157: 105-132); 접근가능 잔기의 비율 (Janin J., 1979 Nature 277: 491-492); 평균 탄력성 (Bhaskaran R., and Ponnuswamy P. K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255); 베타-턴 (Deleage, G., Roux B. 1987, Protein Engineering 1: 289-294); 및 ProtScale 웹사이트와 같은 본 기술 분야에서 임의적으로 이용가능한 다른 것이 각 PSCA 변이체 단백질의 항원성 부위를 확인하는데 사용되었다. PSCA 변이체의 상기 아미노산 프로파일 각각은 분석을 위하여 아래의 ProtScale 파라미터를 이용하여 도출되었다: 1) 윈도우 크기 9; 2) 윈도우 중심과 비교된 100 중량%의 윈도우 가장자리; 및 3) 0과 1사이에 존재하는 정상화된 아미노산 프로파일 수치.
[0484] 친수성, 수치요법 및 접근 가능 잔기의 비율 프로파일은 친수성 아미노산 (예, 친수성 및 접근 가능 잔기 비율 프로파일에서 0.5를 초과한 수치, 수치요법 프로파일에서 0.5 미만의 수치)의 범위를 확인하기 위해 사용되었다. 이러한 부위는 수성 환경에 노출되기 쉬워, 단백질의 표면에 존재하기 쉽다. 따라서, 항체와 같은 면역 인지에 이용된다.
[0485] 평균 탄력성과 베타-턴 프로파일은 베타 쉬트 및 알파 헬릭스와 같은 2차 구조에 영향을 주지 않는 아미노산 (예, 베타-턴 프로파일 및 평균 탄력성 프로파일에서 0.5를 초과하는 수치)의 범위를 확인한다. 또한, 이러한 부위는 단백질 표면에 노출되기 쉬워, 항원과 같은 면역 인지에 이용된다.
[0486] 예를 들어, 전술한 프로파일에 의해 표현되는 PSCA 변이체 단백질의 항원성 서열은 치료적, 진단적 항-PSCA 항체를 생산하는 면역원을 제조하거나, 이를 코딩하는 펩타이드 또는 핵산을 제조하기 위해 사용된다. 면역원은, 도 1에 기재된 PSCA 변이체 단백질로부터 얻은 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 그 이상의 연속 아미노산 또는 이를 코딩하는 대응 핵산 중 어느 것이 될 수 있으며, 또한, 변이체가그와 동일한 서열을 포함하고 있기 때문에 유추될 수도 있다. 특히, 본 발명의 펩타이드 면역원은 전체 수 증가분에서 도 1의 최소 5개 아미노산의 펩타이드 부위로서, 친수성 프로파일에서 0.5를 초과하는 수치를 가지는 아미노산 부위를 함유하는 부위; 전체 수 증가분에서 도 1의 최소 5개 아미노산의 펩타이드 부위로서 수치요법 프로파일에서 0.5 미만의 수치를 가지는 아미노산 부위를 함유하는 부위; 전체 수 증가분에서 도 1의 최소 5개 아미노산의 펩타이드 부위로서 접근가능 잔기의 비율 프로파일에서 0.5를 초과하는 수치를 가지는 아미노산 부위를 함유하는 부위; 전체 수 증가분에서 도 1의 최소 5개 아미노산의 펩타이드 부위로서 평균 탄력성 프로파일에서 0.5를 초과하는 수치를 가지는 아미노산 부위를 함유하는 부위; 및 전체 수 증가분에서 도 1의 최소 5개 아미노산의 펩타이드 부위로서 베타-턴 프로파일에서 0.5를 초과하는 수치를 가지는 아미노산 부위를 함유하는 부위를 포함할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 면역원은 또한, 상기 기재된 펩타이드의 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
[0487] 본 발명의 모든 면역원, 펩타이드 또는 핵산은 인간 단위 용량 형태로 또는 인간 생리와 양립가능한 약제학적 첨가제를 함유하는 조성물에 포함될 수 있다.
[0488] PSCA 변이체 단백질 1, 3, 4 및 6의 2차 구조, 즉, 알파 헬릭스, 확장된 가닥 및 임의적인 코일의 예상된 존재 및 위치는 ExPasy molecular biology server(http://www.expasy.ch/tools/)로 부터 접근되는 HNN-Hierarchical Neural Network 방식(NPSPSCA: Network Protein Sequence Analysis TIBS 2000 March vol. 25, No 3 [291]: 147-150 Combet C., Blanchet C., Geourjon C. and Del age G., http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa~automat.pl?page=npsa_nn.html)을 이용하여 1차 아미노산 서열로부터 예측된다. 이 분석은 PSCA 변이체 1이 30.89%의 알파 헬릭스, 21.95%의 확장된 가닥 및 47.15% 임의적 코일로 이루어져 있음을 나타낸다. PSCA 단백질 변이체 3은 14.89%의 알파 헬릭스, 8.51%의 확장된 가닥 및 76.60%의 임의적 코일로 이루어져 있다. PSCA 단백질 변이체 4는 9.52%의 알파 헬릭스, 8.99%의 확장된 가닥 및 81.48% 임의적 코일로 이루어져 있다. PSCA 단백질 변이체 6은 24.56%의 알파 헬릭스, 21.93%의 확장된 가닥 및 53.51%의 임의적 코일로 이루어져 있다.
[0489] 단백질 변이체의 막 도메인의 잠재적 존재에 대한 분석은 ExPasy molecular biology server (http://www.expasy.ch/tools/)로부터 접근되는 다양한 막 예측 알고리즘을 이용하여 수행하였다.
실시예 7:
PSCA 폴리클로날 항체의 생산
[0490] 폴리클로날 항체를 포유 동물 내에서 생산할 수 있는데, 예를 들어, 면역 유발 약제 와, 원하는 경우, 애쥬번트를 1번 이상 주입함으로써 생산한다. 일반적으로, 면역 유발 약제 및/또는 애쥬번트는 피하 또는 복강으로 수회 주사하여 포유동물에게 주입된다. 전장 PSCA 단백질 변이체를 이용한 면역화 외에, 컴퓨터 알고리즘은 항원성을 가지는 아미노산 서열 분석에 기초한 면역원 디자인에 이용되고, 면역화된 숙주의 면역계에 의한 인지에 유용하다 ("항원성 프로파일 및 2차 구조"로 명명된 실시예 참조). 이러한 부위는 친수성, 탄력적이고, 베타-턴 구조일 것이며, 단백질의 표면에 노출될 것이다.
[0491] 예를 들어, PSCA 단백질 변이체의 친수성, 탄력적, 베타-턴 부위를 함유하는 재조합 박테리아 융합 단백질 또는 펩타이드는 뉴질랜드 화이트 래빗에서 폴리클로날 항체를 또는 "PSCA 모노클로날 항체 (MAbs)의 생산"이라는 제하의 실시예 에 기재된 것처럼 모노클로날 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 이용된다. 예를 들어, PSCA 변이체 1에서 이러한 부위는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노산 28~56 및 아미노산 66~94를 함유한다. 변이체 3에서, 이러한 부위는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노산 7~39 및 아미노산 70~94를 함유한다. 변이체 4에서, 이러한 부위는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노산 6~18, 아미노산 27~39, 아미노산 103~133 및 177~189를 함유한다. 변이체 6에서, 이러한 부위는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아미노산 19~35 및 아미노산 57~85를 함유한다. 표유동물을 면역화할 때, 면역원성이 있는 단백질에 면역 유발 약제를 결합하는 것이 유용하 다. 이러한 면역원성 단백질의 예는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 키홀림펫헤모시아닌(KLH), 혈청 알부민, 소 티로글로빈 및 콩 트립신 억제제가 있다. 하나의 실시 형태에서, 변이체 4의 아미노산 103~133를 코딩하는 펩타이드는 KLH에 결합되어 래빗를 면역화한다. 다르게는, 면역 유발 약제는 PSCA 단백질 변이체, 이들의 아날로그 또는 이들의 융합 단백질의 전부 또는 일부를 포함한다. 예를 들어, PSCA 변이체 아미노산 서열은 글루타치온-S-트란스페라제(GST) 및 HIS 택 융합 단백질과 같은, 본 기술 분야에서 알려진 다양한 융합 단백질 파트너의 어느 하나에 재조합 DNA 기술을 이용하여 결합될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, PSCA 변이체 1 서열, 아미노산 18~98은 재조합 기술을 이용하여 pGEX 발현 벡터 내에서 GST에 융합되고, 발현, 정제되어, 래빗이나 마우스 모두를 면역화하여 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 각각 유발시킬 수 있다. 이러한 융합 단백질은 유도된 적절한 친화성 메트릭스를 이용하여 박테리아로부터 정제된다.
[0492] 이용될 수 있는 다른 재조합 박테리아 융합 단백질은 말토스 결합 단백질, LacZ, 티오레독신, NusA, 또는 면역 글로불린 불변 영역을 포함한다 ("원핵 세포 시스템에서의 PSCA의 생산"으로 명명된 부분 및 Molecular Biology, volume 2, Unit 16, Frederick M. Ausubul et al. eds., 1995; Linsley, P. S., Brady, W., Urnes, M., Grosmaire, L., Damle, N., and Ledbetter, L., (1991) J. Exp. Med. 174,561-566에 기재된 프로토콜 참조).
[0493] 박테리아 유도 융합 단백질 외에, 포유동물로부터 발현된 단백질 항원도 또한 이용할 수 있다. 이러한 항원은 Tag5 및 Fc-융합 벡터와 같은 포유동물 발현 벡터로부터 발현되고 ("진핵세포계에서의 재조합 PSCA의 생산"으로 명명된 부분 참조), 천연 단백질에서 발견되는 당쇄화와 같은 전사 후 수식을 유지한다. 하나의 실시 형태에서, N-터미널 리드 펩타이드와 C-터미널 GPI 앵커를 제외한 PSCA 변이체 1의 cDNA를 Tag5 포유동물 분비 벡터 내로 클로닝하여, 293T 세포에서 발현하였다. 재조합 단백질은 재조합 벡터를 안정적으로 발현하는 293T 세포의 조직 배양 상청액으로부터 금속 킬레이트 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 Tag5 PSCA 단백질을 그 후, 면역원으로 이용하였다.
[0494] 면역화 프로토콜 중에서, 숙주 동물의 면역 반응을 증가시키는 애쥬번트 내에서 항원을 혼합 또는 에멀젼화하는 것이 유용하다. 애쥬번트의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 완전 프로인트 애쥬번트 (CFA) 및 MPL-TDM 애쥬번트 (monophosphoryl Lipid A, synthetic trehalose dicorynomycolate)가 있다.
[0495] 일반적인 프로토콜에서, 래빗은 초기에 완전 프로인트 애쥬번트 내에서 혼합된 KLH에 결합한 융합 단백질 또는 펩타이드의 200㎍까지, 일반적으로 100~200㎍로 피하주사하여 면역화된다. 그 후, 래빗을 불완전 프로인트 애쥬번트 (incomplete Freund's adjuvant) 내의 면역원 200㎍까지, 일반적으로 100~200㎍로 2주마다 한 번씩 피하주사한다. 각 면역화 후에 약 7~10일간 테스트 혈액을 수집하고, ELISA로 항혈청 역가를 모니터링하기 위해 사용한다.
[0496] PSCA 변이체 3 또는 4 단백질의 GST-융합체로 면역화하여 수득된 래빗 혈청과 같은 면역 혈청의 반응성 및 특이성을 테스트하기 위해, 각각의 전장 PSCA 변이체 cDNA가 pCDNA3.1 myc-his 발현 벡터 (실시예 "진핵세포계에서의 재조 합 PSCA의 발현"으로 명명된 실시예 참조)로 클로닝된다. 293T 세포로 구조체의 형질전환 후, 변성된 단백질 변이체에 대한 특이적인 활성을 확인하기 위해, 세포 용해물은 항-변이체 혈청 및 항-His 항체(Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA)이용하여 웨스턴 블랏 기술을 이용하여 탐지된다. 게다가, 면역 혈청은 천연 단백질의 특이적인 인식을 확인하기 위하여, 293T 및 다른 재조합 PSCA 변이체-발현 세포에 대하여 형광 현미경, 흐름 혈구 계산 및 면역 침전에 의해 테스트된다. 또한, 내재적으로 PSCA를 발현하는 세포를 이용한 웨스턴 블랏, 면역 침적, 형광 현미경 및 흐름 혈구 계산 기술이 반응성 및 특이성을 테스트하기 위해 사용될 수 있다.
[0497] GST 및 MBP 융합 단백질과 같은, PSCA 변이체 융합 단백질로 면역화된 래빗으로부터 얻은 항-혈청을 단독으로 또는 관계없는 융합 단백질 형태로 융합 파트너를 포함하는 융합 친화성 컬럼에 통과시킴로써, 융합 파트너 서열에 반응하는 항체의 고갈에 의하여 정제된다. 예를 들어, GST-PSCA 변이체 1 융합 단백질로부터 유래한 항혈청은 AffiGel 매트릭스 (BioRad, Hercules,Calif.)에 공유적으로 결합된 GST 단백질 컬럼을 통과하여 처음 정제된다. 그 후, 항혈청은 Affigei 매트릭스에 공유적으로 결합된 MBP-PSCA 융합 단백질로 구성된 컬럼을 통과함으로써 정제된다. 추가로, 그 후, 혈청은 IgG 분획을 분리하기 위해서 단백질 G 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 퓨전 파트너 고갈된 혈청뿐만 아니라, 다른 His-택 항원 및 펩타이드로 면역된 래빗으로부터 얻은 혈청은 원 단백질 면역원 또는 자유 펩타이드로 이루어진 컬럼 매트릭스를 통과함으로써 정제된다.
실시예 8
PSCA 모노클로날 항체(MAbs)의 생산
[0498] 하나의 실시 형태에서, PSCA 변이체에 대한 치료적 mAb는 각 변이체 단백질에 특이적인 또는 PSCA 변이체의 기능을 없애거나 조절하는 변이체들 간에 공통적인 서열에 특이적인 에피토프와 반응하는 부분을 포함하며, 예를 들어 리간드와 결합 파트너와의 상호작용을 없애는 부분이다. 이러한 mAb를 생산하기 위한 면역원은 전체 PSCA 단백질 변이체 서열을 코딩하거나 포함하는 부분, 아미노산 서열 컴퓨터 분석으로부터 항원성이 있을 것으로 예견되는 PSCA 단백질 변이체의 부분을 포함한다. 면역원은 펩타이드, GST-PSCA 융합 단백질 (도 8), 및 His 태그된 PSCA pET 벡터 단백질 (도 6) 및 포유동물에서 발현되는 정제된 His 태그된 단백질 (도 7) 및 사람과 마우스의 IgG FC 융합 단백질과 같은 재조합 박테리아 다낵질을 포함한다. 또한, RAT1-PSCA. 293T-PSCA, 3T3-PSCA 또는 300.19-PSCA 293T-PSCA와 같은 PSCA 변이체 1을 고도로 발현시키기 위해 레트로바이러스 형질도입을 통해 조작된 세포들도 마우스를 면역화하는데 사용된다 (도 5).
[0499] PSCA 변이체에 대한 mAb를 생산하기 위해서, 마우스의 풋 패드 (FP)를 우선 적절한 어쥬번트에 혼합된. 일반적으로 5-50㎍의 단백질 면역원 또는 106 내지 107 PSCA-발현 세포로 면역화시킨다. FP 면역화를 위한 적절한 어쥬번트는 예컨대 초기 FP 주사용으로 TiterMax (Sigma)이고 구 후 Immuneasy (Qiagen)사의 명반 젤이다. 초기 주사 후 마우스를 죽일 때까지 일주일에 2회씩 면역화시키고 임파 절로부터 얻은 B 세포를 융합에 이용하였다.
[0500] 면역화 프로토콜 동안, 역가와 면역 반응의 특이성을 모니터링하기 위해, 테스트 혈액을 채취한다. 대부분의 경우 적절한 반응성 및 특이성이 ELISA, 웨스턴 블랏, 면역침전, 형광 현미경 및 흐름 혈구 계산에 의해 확인되면, 그 후 융합 및 하이브리도마 생산을 전기세포 융합을 이용하여 수행하였다다 (BTX, ECM 2000)
[0501] 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120, Ha1-4.121, 및 Ha1-4.37PSCA로 명명된 모노클로날 항체를 제공한다. 이 항체들은 고정화된 PSCA 또는세포 표면과 반응 및 결합하는 것으로 나타났다.
[0502] PSCA에 대한 MAbs를 XenoMouse 기술
Figure 112006097924236-PCT00007
을 이용하여 생산하였는데, 여기서는 마우스의 중쇄와 캅파 경쇄 위치를 불활성화시켜 대부분의 인간의 중쇄 및 캅파 경쇄 면역글로불린 위치를 삽입하였다: 사람의 감마 1 생산 Xenomice를 면역화한 후 Hal-1.16을 생산하였다 (PSCA-GST의 13배); Hal-5.99는 사람의 감마 2 생산 Xenomice을 Rat1-PSCA세포로 6회 면역화시킨 후 PSCA-태그5로 2회 주사하여 생산되었다; Hal-4.117, HA1-4.37, Ha1-4.120, 및 Ha1-4.121은 사람의 감마 1 생산 Xenomice를 Rat1-PSCA 세포로 6회 면역화시킨 후 PSCA-태그5로 4회 주사하여 생산하였다. 항PSCA MAbs, Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120, 및 Ha1-4.121은 전립선암 이종이식편 세포에서 발현된 내인성 세포 표면 PSCA에 결합하였다.
[0503] Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120, Ha1-4.37, Ha1-1.16 및 Ha1-4.121로 표시된 항체들을 (Federal Express를 통해서) 2004년 5월 4일자로 American Type Culture Collection (ATCC: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108)로 보내어 각각 수탁번호 PTA-6703 및 PTA-6699 및 PTA-6700 및 PTA-6702 및 PTA-6698 및PTA-6701를 부여받았다.
[0504] 항PSCA MAbs Ha1-1.16, Ha1-5.99, Ha1-4.117, Ha1-4.120, Ha1-4.121, 및 Ha1-4.37에 대한 DNA 코딩 서열, 각각의 대응하는 하이브리도마 세포주로부터 mRNA를 Trizol 시약 (Life Technologies, Gibco BRL)을 이용하여 분리시킨 후에 결정하였다. 총 RNA를 정제 및 정량하였다. 첫번째 가닥 cDNA는 Gibco BRL Superscript Preamplification 시스템을 이용하여 올리고 (dT)12 18 프라이밍시켜 총 RNA로부터 생산하였다. 첫번째 가닥 cDNA를 사람의 면역글로불린 가변부 중쇄 프라이머, 및 사람의 면역글로불린 가변부 경쇄 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. PCR 산물을 pCRScript 벡터 (Stratagene, La Jolla) 내로 클로닝시켰다. 몇몇 클론들을 시퀀싱하여 가변부 중쇄와 경쇄 대역을 결정하였다. 가변부 중쇄 및 경쇄 대역의 핵산 및 아미노산 서열을 도 2 및 도 3에 나타내었다. 배선(germline)V-D-J 서열에 대한 PSCA 항체의 정렬 결과를 도 4A-도4M에 나타내었다.
실시예 9
PSCA 항체의 스크리닝 및 동정
[0505] "PSCA 모노클로날 항체 (MAbs)의 생산"이라는 제하의 실시예에 제시된 공정을 이용하여 제조된 항체들을 스크리닝하고 ELISA, FACS, 에피토프 그루핑 및 세포 표면에 발현된 PSCA에 대한 친화도를 포함한 복합 분석법을 이용하여 동정하였다.
A. FACS에 의한 PSCA 인간 MAb의 스크리닝.
[0506] FACS에 의해 PSCA에 대한 MAbs의 일차 하이브리도마 스크리닝을 실시하였다. 그 프로토콜은 다음과 같다: 50ul/웰 하이브리도마 상등액 (순수함) 또는 정제된 항체 (계대 희석물)을 95-웰 FACS 플레이트에 첨가하고 PSCA-발현 세포들 (내인성 또는 재조합, 50,000 세포/웰)과 혼합하였다. 이 혼합물을 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 세포들을 PSCA 완충액으로 세척하고 4℃에서 45분간 검출 항체 (항-hIgG-PE) 100 ul와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 말기에, 세포들을 FACS 완충액으로 세정하고, 포름알데히드로 고정시켜 FACScan을 이용하여 분석하였다. 데이터를 CellQuest Pro 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 색칠된 히스토그램은 음성 대조군으로부터의 데이터를, 색칠되지 않은 히스토그램은 PSCA-양성 세포로부터의 데이터를 나타낸다 (도 9).
[0507] 일차 스크린으로부터 동정된 양성 하이브리도마를 24웰 플레이트에 옮기고 확인 스크리닝을 위해 상등액을 모았다. 확인 스크리닝에는 B300.19-PSCA/300.19-neo, Rat1-PSCA/Rat1-neo, PC3-PSCA/neo, SW780 (방광암 세포주), LAPC9AI (전립선암 세포주), HPAC (췌장암 세포주)에 대한 FACs 분석 및 , Tag5-PSCA, GST-PSCA, GST-PSCA N-term, Med. C-Term, 및 pET-PSCA.ELISA 분석을 이용한 ELISA 분석이 포함된다.
B. PSCA 인간 MAb 상대적 친화도 분석
[0508] 하이브리도마 상등액의 세포 표면 PSCA에 대한 상대적 결합 친화도를 측정하는 실험을 하였다. 하이브리도마 상등액을 ㎍/ml 부터 서브-ng/ml까지 FACS 완충액 (FB) 중에서 계대희석하고; LAPC9AI 세포를 이용하여 FACS 결합 분석으로 평가하였다. 고친화도 항체는 높은 MFI 값을 나타내었다. 각 포인트에서의 MFI 값을 CellQuest Pro 소프트웨어를 이용하여 얻고, Graphpad Prism 소프트웨어를 이용하여 친화도를 계산하는데 이용하였다 (표 VII 및 표 VIII) S자형 투여량-반응 (가변 기울기) 방정식. 상대적인 친화도의 결과를 도 10에 나타내었다.
C. 에피토프 그루핑
[0509] LAPC9AI 세포에 대한 결합 패턴을 평가함으로써 PSCA 항체들을 에피토프에 따라 여러 그룹으로 나누었다. 요약하면, 각 항체 소량을 바이오티닐화시킨 다음; 각각의 바이오티닐화된 항체들을, 과량 (100X)의 바이오티닐화되지 않은 항체 존재 하에 44℃에서 1시간 동안 LAPC9AI과 함께 인큐베이션시켰다. 일반적으로, 과량의 항체들은 만일 이들이 동일한 에피토프에 결합할 경우 바이오티닐화된 항체들과 경쟁할 것이다. 인큐베이션 말기에, 세포들을 세척하고 스트렙트아비딘-PE와 함께 4℃에서 45분간 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 스트렙트아미딘-PE를 세척한 후, 세포들을 FACS를 이용하여 분석하였다. MFI 결정을 이용하여 데이터를 분석하였다 (표 VII). 표 XI에 나타난 바와 같이, 황색 표시된 세포들은 자가-경쟁하고 (100% 경쟁), 이들 세포에서의 MFI는 각각의 바이오티닐화된 항체에 대해 배 경 대조군이다. 아무 색상 표시되 되지 않은 세포들은 두개의 항체들이 서로 경쟁하고 (낮은 MFI), 높은 MFI (청색 표시)는 두개의 항체가 두개의 서로 다른 에피토프에 결합함을 나타낸다. 동일한 결합 패턴을 갖는 항체들은 항체들 중 동일한 에피토프와 결합한다. 시험된 항체들에는 6개의 에피토프 그룹이 있다. 표 XI는 PSCA 4.121이 그의 독특한 에피토프와 결합함을 보여준다.
실시예 10
PSCA 항체의 발현 및 특성화
A. 원숭이 PSCA 및 마우스 PSCA의 교차 반응성
[0510] MAb를 선별하고(screened), 마우스 및 유인원으로부터의 PSCA와의 반응성을 특성화하였다. 이 성질은 마우스 및 유인원 모델을 사용하는 경우에 세포 및 조직 상에서 PSCA의 MAb 연관성(engagement) 결과를 이해하는 데에 유용하다. Cynomolgus 원숭이 및 마우스 PSCA 유전자를 레트로바이러스 내에서 클로닝, 발현시키고, 순간적으로 293-T 세포에 감염시켰다. _____________를 아래와 같은 프로토콜을 이용하여 각 항체와 함께 배양하였다. 시험 항체를 Cynomolgus 원숭이 또는 쥐의 PSCA 중 어느 한쪽을 발현시키는 293-T 세포와 함께, 또는 음성(negative) 대조군으로서 신제3기(neo gene)의 유전자만을 발현시키는 293T 세포와 함께 배양하였다. 항-hIgG-PE 2차 검출 항체를 이용하여 특이적인 인식(recognition)을 결정하였다. 특이적(specied) 교차 반응성을 나타내는 대표적인 히스토그램을 도 11에 제시한다. 표 X에 제시된 개요는 항-인간 PSCA 항체를 제외한 모든 것이 원숭이 PSCA와 교차 반응하고, 항-인간 PSCA 항체만이 마우스 PSCA와 교차 반응하는 것을 보여 준다.
B. FACS에 의한 친화도 결정
[0511] PSCA를 고도로 발현시키는 인간 방광암 세포주인 SW780 세포 상에서 7 가지의 항-인간 PSCA 항체로 구성된 패널(panel)의 PSCA에 대한 결합 친화도를 검사하였다. 일련의(serial) 정제 항체 1:2 희석물 23개를, 최종 농도 167nM 내지 0.01pM로 하여, SW780 세포 (웰당 50,000 세포)와 함께 4℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양 종결 시에 세포를 세정하고, 항-hIgG-PE 검출 항체와 함께 4℃에서 45분 동안 배양하였다. 비결합 검출 항체를 세정한 후에, 세포를 FACS로 분석하였다. CellQuest Pro 소프트웨어를 이용하여 각 점의 MFI 값을 얻고, 이 값을 Graphpad Prism 소프트웨어: S자형(sigmoidal) 투여-응답 (가변성 기울기) 방정식을 이용하는 친화도 계산에 이용하였다 (표 VII 및 VIII). 7 가지 항체의 친화도 값을 표 IX에 제시한다.
실시예 11
PSCA 항체 내재화(internalization)
[0512] PC3-PSCA 세포를 사용하여 Ha1-4.121의 내재화를 연구하였다. 약술하면, Ha1-4.121를 세포와 함께 4℃에서 90분 동안 배양하여 항체가 세포 표면에 결합되도록 하였다. 그 다음, 세포를 2개의 군으로 나누고, 37℃에서 계속 배양하여 항체가 내재화하도록 하거나 또는 대조군(비 내재화)으로서 4℃에서 계속 배양하였다. 37℃/4℃ 배양 후에 산 세정하여 세포 표면에 결합된 PSCA 4.121을 제거하였다. 후속 침투(permeablization)는 내재화한 PSCA에 결합한 항체의 검출을 가능하 게 하였다. 2차 검출 항체와 함께 배양한 후에, 세포를 FACS를 이용하여 분석하거나 또는 형광 현미경으로 관찰하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후에 약 30%의 Ha1-4.121가 내재화하였다 (도 12).
실시예 12
항체 매개 2차 치사
[0513] PSCA에 대한 항체는 PSCA 발현 세포에서 사포린(saporin) 의존성 치사를 매개한다. 1일 째에 B300.19-SCA 발현 세포 (750 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 접종하였다. 그 다음날, 각각의 웰에, 사포린 독소 (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)와 접합된 2배 과량의 항-인간 (Hum-Zap) 또는 항-염소 (Goat-Zap) 다클론 항체와 함께, 지시된 1차 항체를 2X 농도로 함유하는, 동일한 부피의 배지를 첨가하였다. 세포를 37℃에서 5일 동안 배양하였다. 배양 기간의 종결 시점에 각각의 웰에 MTS (Promega)를 가하고, 추가로 4시간 동안 더 배양하였다. 450 nM에서 OD 값을 구하였다. 도 13(A)에 제시된 결과는 PSCA 항체 HA1-4.121 및 HA1-4.117는 B300.19-PSCA 세포에서 사포린 의존성 세포 독성을 매개하였으나, 대조군인 비특이적 인간 IgG1 항체는 영향을 미치지 않았다는 것을 보여준다. 도 13(B)의 결과는 인간 Fc를 인식하지 않았던 2차 사포린 접합 항체 첨가는 세포 독성을 매개하지 못하였다는 것을 보여준다 (도 13(A) 및도 13(B)). 이 결과는 약물 또는 세포 독성 단백질이 적당한 항-PSCA MAb를 이용하여 PSCA 발현 세포에 선택적으로 전달될 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 13
항체 면역자 매개 세포 독성
[0514] 면역 의존성 세포 독성을 매개하는 능력을 결정하기 위하여 PSCA 항체를 평가하였다. PSCA 항체 (0-50μg/ml)를 RHB 완충액 (RPMI 1640, Gibco Life Technologies, 20 mM HEPES)으로 희석하였다. B300.19-PSCA 발현 세포를 RHB 완충액으로 세정하고, 106 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 통상의 분석법에 있어서, PSCA 항체 50μl, 희석된 토끼 보충 혈청(rabbit complement serum)(Cedarlane, Ontario, Can) 50μl 및 세포 현탁액 50μl를 바닥이 평평한 조직 배양 96-웰 플레이트에 함께 가하였다. 혼합물을 5% CO2 배양기에서 37℃에서 2시간 동안 배양하여, 보충물 매개 세포 용해(complement-mediated cell lysis)를 촉진시켰다. 그 다음, Alamar Blue (Biosource Intl. Camarillo, CA) 50μl를 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 추가로 4-5시간 동안 배양을 지속하였다. 530 nm에서의 여기(excitation) 및 590 nm에서의 방출을 갖는 96-웰 형광계를 이용하여 각 웰의 형광을 관측하였다. 그 결과는 Ig1 (HA1-4.121) 또는 IgG2 이소타입(isotype) (HA1-5.99.1)를 갖는 PSCA 항체는 보충물 의존성 용해를 매개할 수 있으나, IgG4 이소 타입 (HA1-6.46)을 갖는 PSCA 항체는 그렇지 않다는 것을 보여준다 (도 14).
[0515] ADCC [항체 의존성 세포 독성(Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)]은 특이적 세포 표면 항원을 표적으로 하는 항체에 결합된 세포에 대하여 용해성 공격(lytic attack)을 매개하는 면역자(immune)이다. 이 경우, 이것은 PSCA이다. 면역 세포는 용해성 공격을 유발하는 NK 세포, 백혈구 및 단핵구의 표면 상에서 Fc 수용체에 대한 결합을 통하여 항체의 Fc 부분을 인식하고, 이는 세포의 치사를 초래한다. 생체외(in vitro )에서 종양 세포를 51크롬, 유로퓸 또는 형광 분자로 표지하고, 이들을 인간 PSCA MAb 존재하에서 말초 혈액 단핵 세포와 함께 배양함으로써, 이러한 반응을 매개하는 PSCA 항체의 능력을 평가할 수 있다. 표적 종양 세포의 용해 퍼센트를 측정함으로써 종양 세포의 특이적 용해를 결정할 수 있다. 결정되는 통상의 종말점은 적절한 검출법을 이용하여 죽은 세포로부터의 방사능, 유로퓸 또는 형광 염료 방출을 포함한다. 대안으로서, 락테에트 탈수소효소(LDH)와 같은 세포내 효소 방출을 측정할 수도 있다.
실시예 14
F(Ab')2 단편의 생성
[0516] MAb의 F(Ab')2 단편 생성은 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo) 치료 모형에 있어서 2가(bivalent)의 항원 결합 부위를 갖지만 면역 효과기(effector) Fc 도메인을 갖지 않는 MAb 분자의 효과를 연구하는 데에 유용하다. 20 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.5 중의 MAb Ha1-4.121 20 mg을 고정된(immobilized) 펩신(Pierce. Rockford IL)과 함께 또는 없이 지시된 시간 동안 배양하였다. 손상되지 않은(intact) MAb 및 소화된(digested) Fc 단편을 단백질 A 크로마토그래피로 제거하였다. 도 15에서 보여주는 것은 손상되지 않은 비소화 비환원(undigested unreduced) Mab, 지정된 시간에 채취한 소화 물질의 비환원 분액 및 최종 소화 F(Ab')2 생성물의 환원 시료의 SDS-PAGE Coomasie 염색 겔이다. 이 시약은 PSCA 발현 종양을 가지는 동물을 치료하는 데에 사용될 수 있다. 이 항체 단편으로 관찰된 항 종양 활성은 본질적인(intrinsic) 생물학적 활성을 면역 의존성 메커니즘에 의하여 매개되는 활성과 구별시킬 수 있다.
실시예 15
재조합 DNA법을 이용하는 인간 항체 발현
[0517] 형질 전환(transfected) 세포 내에서 재조합적으로 항-PSCA MAb를 발현시키기 위하여, 항-PSCA 가변성(variable) 중쇄 및 경쇄 서열을 각각 인간 중쇄 IgG1 및 경쇄 Igκ 불변(constant) 영역의 상류에서 클로닝시켰다. 완전한 항-PSCA 인간 중쇄 및 경쇄 카셋(cassettes)을 클로닝 백터 내의 CMV 촉진자/향상자(promoter/ enhancer)의 하류에서 클로닝시켰다. 다중 아데닐화(polyadenylation) 영역이 MAb 암호화(coding) 서열의 하류에 포함되었다. 재조합 항-PSCA MAb 발현 구조체(constructs)를 293T, Cos 및 CHO 세포로 형질 전환시켰다. 재조합 293-T 세포로부터 분비된 HA1-4.121 항체의 PSCA의 세포 표면에 대한 결합을 평가하고(도 Pia-3A), 이를 본래의 하이브리도마로부터 생산된 동일한 항체와 비교하였다(도 16).
실시예 16
HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 분석
[0518] 개시된 프로토콜 (예컨대, PCT 공보 WO　94/20127 및 WO　94/03205; Sidney 등, Current Protocols in Immunology 18.3.1 (1998); Sidney, 등, J.　Immunol. 154:247 (1995); Sette 등, Mol. Immunol. 31:813 (1994))에 따라, 정 제된 HLA 분자를 사용하여, HLA 클래스 I 및 클래스 II 결합 분석을 수행하였다. 약술하면, 설명된 바와 같이, 정제된 MHC 분자 (5 내지 500 nM)를 다양한 비표지 펩타이드 억제제 및 1-10 nM 125I-방사성 표지 탐색자(radiolabeled probe) 펩타이드와 함께 배양하였다. 배양에 이어서, MHC-펩타이드 복합체(complexes)를 겔 여과법으로 유리(free) 펩타이드로부터 분리하고, 결합 펩타이드의 분율(fraction)을 구하였다. 통상적으로, 예비 실험에서, 각 MHC 제제를 정해진 양의 방사성 표지 펩타이드 존재하에서 적정하여, 10-20%의 총 방사성을 결합시키는 데에 필요한 HLA 분자의 농도를 결정한다. 이어지는 모든 억제 및 직접 결합 분석을 이 HLA 농도에서 수행한다.
[0519] 이 조건 하에서 [표지]<[HLA] 및 IC50=[HLA]이므로, 측정되는 IC50 값은 진정한 KD 값의 합리적인 근사값이다. 통상적으로 펩타이드 억제제를 120　μg/ml 내지 1.2 ng/ml 범위의 농도에서 시험하고, 2 내지 4개의 완전히 독립적인 실험으로 시험한다. 서로 다른 실험에서 얻어진 결과를 비교할 수 있도록 하기 위하여, 양성 대조군(positive control)의 억제에 대한 IC50 값을 각각의 시험 펩타이드(통상적으로 방사성 표지 탐색자 펩티드의 비표지 버전)에 대한 IC50 값으로 나눔으로써, 각 펩타이드에 대한 상대적인 결합 값(figure)을 계산한다. 데이터 베이스화 및 실험간 비교를 위하여, 상대적인 결합 값을 수집한다. 이어서 양성 대조군의 억제에 대한 IC50 nM을 관심의 대상인 펩타이드의 상대적인 결합 값으로 나누어, 이 들 값을 IC50 nM 값으로 다시 전환시킬 수 있다. 이와 같은 데이터 수집법은 정확하고, 서로 다른 날에 시험하거나 또는 서로 다른 로트의 정제된 MHC로 시험한 펩타이드를 비교함에 있어서 모순이 없다.
[0520] 위와 같이 개략적으로 설명한 결합 분석법은 HLA 수퍼 모티프(supermotif) 및/또는 HLA 모티프를 갖는 펩타이드를 분석하는 데에 이용될 수 있다(표 IV 참조).
실시예 17
"미니유전자" 멀티-에피토프 DNA 플라스미드의 구축
[0521] 본 실시예는 미니유전자 발현 플라스미드의 구축을 설명한다. 물론, 미니유전자 플라스미드는 B 세포, CTL 및/또는 HTL 에피토프 또는 여기에서 기재된 에피토프 유사체의 다양한 배열을 포함한다.
[0522] 일반적으로 미니유전자 발현 플라스미드는 다수의 CTL 및 HTL 펩타이드 에피토프를 함유한다. 본 발명의 실시예에서, HLA-A2, -A3, -B7 수퍼모티프-함유 펩타이드 에피토프와 HLA-A1 -A24 모티프-함유 펩타이드 에피토프는 DR 수퍼모티프-함유 에피토프 및/또는 DR3 에피토프와 함께 사용된다. HLA 분류 I 수퍼모티프 또는 모티프-함유 펩타이드 에피토프 유래된 PSCA는 다수의 수퍼모티프/모티프가 넓은 개체 적용 범위를 확보할 수 있게 표현되도록 선택된다. 유사하게, HLA 분류 Ⅱ 에피토프는 PSCA로부터 선택되어 넓은 개체 적용 범위를 제공한다. 예를 들어, HLA DR-1-4-7 수퍼모티프-함유 에피토프 및 HLA DR-3 모티프-함유 에피토프 모두는 미니유전자 구조체 내 유입물로서 선택된다. 그 후, 선택된 CTL 및 HTL 에피 토프는 발현 벡터 내의 발현용 미니유전자로 병합된다.
[0523] 이러한 구조체는 추가로 HTL 에피토프를 세포질 세망으로 향하게 하는 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 기술분야에 기재된 것처럼 li 단백질은 하나 또는 그 이상의 HTL 에피토프에 융합되고, 이때, Ii 단백질의 CLIP 서열은 제거되고, HLA 분류Ⅱ 에피토프 서열로 대체되어, HLA 분류 Ⅱ 에피토프는 세포질 세망으로 향하고, 여기에서 에피토프는 HLA 분류 Ⅱ 분자에 결합한다.
[0524] 이 실시예는 미니유전자-산생 발현 플라스미드의 구축을 위해 사용되는 방법을 설명한다. 미니유전자 조성물을 위해 사용되는 다른 발현 벡터도 이용가능하며, 본 기술분야 당업자에게 알려져 있다.
[0525] 본 실시예의 미니유전자 DNA 플라스미드는 여기에서 기재된 방법에 따라 선택된 CTL 및/또는 HTL 에피토프에 의해 따라오는 공통 Kozak 서열과 공통 설치 동물 kappa Ig-경쇄 신호 서열을 포함한다. 이 서열은 pcDNA 3.1 Myc-His 벡터에 의해 코딩된 Myc 및 His 항체 에피토프 택에 융합된 오픈 리딩 프레임을 코딩한다.
[0526] 예를 들어, 15 누클레오타이드 중복을 갖는 평균 길이 약 70 누클레오타이드인, 중복된 올리고누클레오타이드는 합성되고, HPLC로 정제된다. 올리고누클레오타이드는 적절한 링커 누클레오타이드, Kozak 서열 및 신호 서열뿐만 아니라, 선택된 펩타이드 에피토프를 코딩한다. 최종 멀티 에피토프 미니유전자는 PCR을 사용하여 3 세트의 반응물에서 중복하는 올리고누클레오타이드를 확장함으로써 제작된다. Perkin/Eimer 9600 PCR 기계를 이용하여 총 30 사이클을 다음의 조건으 로 실시한다: 15초간 95℃, 30초간 어닐링 온도 (각 프라이머 쌍의 가장 낮게 계산된 Tm 보다 5℃ 낮음) 및 1분간 72℃.
[0527] 예를 들어, 미니유전자는 다음과 같이 제조된다. 최초 PCR 반응 동안, 5㎍의 두개의 올리고누클레오타이드 각각은 어닐링되고 확장된다: 8개의 올리고누클레오타이드, 즉, 4쌍의 프라이머를 사용하는 실시예에 있어서, 올리고누클레오타이드 1+2, 3+4, 5+6 및 7+8은 Pfu 폴리머라제 완충제(1x= 10mM KCL, 10mM (NH4)2SO4, 20mM Tris-chloride, pH 8.75, 2 mM MgSO4, 0.1% Triton X-100, 100㎍/ml BSA), 각각의 dNTP 0.25mM 및 Pfu 폴리머라제 2.5U를 함유하는 반응물 100㎕ 내에서 결합된다. 전장 다이머 산물은 겔-정제되고, 산물 1+2 및 3+4의 산물과 5+6 및 7+8의 산물을 포함하는 2개의 반응물을 혼합하고, 어닐링한 후, 확장시킨다. 이를 10회 실시한다. 그 후, 두 개의 반응물 중 반을 혼합하고, 플랭킹 프라이머가 전장 산물을 확장하기 위해 추가되기 전에, 어닐링과 확장을 5회 수행한다. 전장 산물은 겔 정제되고, pCR-blunt (Invitrogen)로 클로닝되어 각각의 클론을 시퀀싱으로 조사한다.
실시예 18
플라스미드 구조체와 면역원성을 유발시키는 정도
[0528] 플라스미드 구조체, 예를 들어 이전 실시예에 따라 제조된 플라스미드 구조체가 면역원성을 유발하는 정도는 에피토프-발현 핵산 구조체를 이용한 APC의 형질 도입 또는 형질전환 후에 APC에 의한 에피토프의 존재를 확인함으로써 시 험관 내에서 확인된다. 이러한 연구는 "항원성"을 확인하고, 인간 APC의 이용을 가능하게 한다. 이 분석은 세포 표면상의 에피토프-HLA 분류 I 복합체의 밀도를 정량함으로써, T 세포에 의해 인지되는 APC에 의해 나타나는 에피토프의 활성을 확인한다. 정량은 APC로부터 용리된 펩타이드의 양을 직접 측정함으로써 수행할 수 있다 (예, Sijts et al.,J. Immunol. 156: 683-692, 1996; Demotz et al., Nature 342:682-684, 1989); 또는 펩타이드-HLA 분류 I 복합체의 수는 병에 걸린 또는 형질감염된 표적 세포에 의해 유도된 세포 용해 또는 림포카인 방출의 양을 측정하고, 그 후, 동등한 수준의 세포 용해 또는 림포카인 방출을 얻는데 필요한 펩타이드의 농도를 확인함으로써 산출될 수 있다 (예, Kageyama et al., J. Immunol, 154:567-576, 1995 참조).
[0529] 다르게는, 면역원성은 마우스 내로 생체 내 주입하고, 이어서, 예를 들어, 알렉산더 등에 의해 기재된 방법(Alexander et al., Immunity 1:751-761, 1994)과 같이 세포 독성과 증식 분석을 각각 이용하여 분석되는 CTL 및 HTL 활성을 시험관 내에서 평가하여 확인될 수 있다.
[0530] 예를 들어, 적어도 하나의 HLA-A2 수퍼모티프 펩타이드를 함유하는 DNA 미니유전자 구조체의 생체 내에서 CTL을 유도하는 능력을 확인하기 위하여, 예를 들어, HLA-A2.1/Kb 형질전환 마우스를 100㎍의 포개진 DNA로 근육 내 주사하여 면역화한다. cDNA 면역화에 의해 유도된 CTL의 수치를 비교하는 방법으로서, 동물의 대조군도 미니유전자에 의해 코딩되는 단일 폴리펩타이드로서 합성된 다수의 에 피토프를 함유하는 실제 펩타이드 조성물로 면역화한다.
[0531] 면역화된 동물로부터 획득한 비장 세포를 각각의 조성물(미니유전자 내에서 코딩된 펩타이드 에피토프 또는 폴리에피토프 펩타이드)로 2번씩 자극한 후, 51Cr 방출 분석에서 펩타이드-특이적 세포 독성 활성을 조사한다. 결과는 A2-제한 에피토프에 대해 규제된 CTL 반응의 정도를 나타내고, 따라서, 미니유전자 백신 및 폴리에피토프 백신의 생체 내 면역원성을 나타낸다.
[0532] 따라서, 미니유전자가 폴리에피토프 펩타이드 백신이 되는 HLA-A2 수퍼모티프 펩타이드 에피토프에 대한 면역 반응을 유도하는 것이 밝혀졌다. 또한, 유사한 분석이 HLA-A3 및 HLA-B7 모티프 또는 수퍼모티프 에피토프에 의한 CTL 유도를 평가하기 위하여, 다른 HLA-A3 및 HLA-B7 형질전환 마우스 모델을 이용하여 수행되고, 여기에서, 미니유전자가 제공된 에피토프에 대한 적절한 면역 반응을 유도하는 것이 밝혀졌다.
[0533] 생체 내에서 HTL을 유도하는 분류 Ⅱ 에피토프-코딩 미니유전자의 활성을 확인하기 위하여, DR 형질전환 마우스, 또는, 적절한 마우스 MHC 분자와 상호작용하는 이들 에피토프를 위하여, 예를 들어, l-Ab-제한 마우스를 100㎍의 플라스미드 DNA로 근육 내 주사하여 면역화한다. DNA 면역화에 의해 유도된 HLT 수준을 비교하는 방법으로서, 동물의 대조군도 완전 프로인트 애쥬번트 내에 에멀전화된 실제 펩타이드 조성물로 면역화한다. CD4+ T 세포, 예, HTL를 면역화된 동물의 비장 세포로부터 정제하고, 각각의 조성물(미니 유전자에서 코딩된 펩타이드)로 자극 시킨다. HTL 반응을 3H-티미딘 병합 증식 분석을 이용하여 측정한다 (예, Alexander et al. Immunity 1:751-761, 1994). 결과는 HTL 반응의 크기를 보여주고, 따라서, 생체 내에서 미니 유전자의 면역원성은 증명된다.
[0534] 이전 실시예에서 기재된 방법으로 구축된 DNA 미니유전자는 기본 추가 접종 프로토콜을 이용한 추가 접종 시약과 혼합한 백신으로서 확인될 수 있다. 추가 접종 시약은 재조합 변이체 (e. g. , Barnett et al., Aids Res. and Human Retrviruses 14, Supplement 3:S299-S309, 1998) 또는 재조합 우두, 예를 들어, 미니유전자 또는 목적 단백질을 완전하게 코딩하는 DNA를 발현하는 우두 (예, Hanke et al., Vaccine 16: 439-445, 1998; Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95: 7648-53,1998; Hanke and McMichael, Immunol. Letters 66:177-181, 1999; and Robinson et al., Nature Med. 5: 526-34,1999 참조)로 이루어질 수 있다.
[0535] 예를 들어, 기본 추가 접종 프로토콜에 사용되는 DNA 미니유전자의 유효성은 초기에 형질전환 마우스에서 평가된다. 이 실시예에서, A2.1/Kb 형질전환 마우스는 적어도 하나의 HLA-A2 수퍼모티프-함유 펩타이드를 함유하는 면역성 펩타이드를 코딩하는 DNA 미니유전자 100㎍로 근육 내 주사로 면역화한다. 배양기간 (3~9주) 후, 마우스를 DNA 미니유전자에 의해 코딩되는 동일한 서열을 발현하는 재조합 우두 바이러스 107pfu/마우스로 복막 주사하여 추가 접종한다. 대조군 마우스를 미니유전자 서열 없이 DNA 또는 재조합 우두 100㎍으로 면역화하거나, 우두 추가 접종 없이 미니 유전자를 코딩하는 DNA 100㎍으로 면역화한다. 2주간의 추가 배 양기간 후, 마우스로부터 얻은 비장 세포에 대해 ELISPOT 분석으로 펩타이드-특이적 활성을 즉시 분석한다. 추가적으로, 비장 세포를 시험관 내에서 미니유전자 및 재조합 우두에서 코딩된 A2-제한 펩타이드 에피토프로 자극한 후, α, β 및/또는 γIFN ELISA에서 펩타이드-특이적 활성을 분석한다.
[0536] 기본 추가 접종 프로토콜에서 사용된 미니유전자가 DNA를 단독으로 사용한 것보다 HLA-A2 수퍼모티프 펩타이드에 대한 면역 반응을 더 크게 유발한다는 것 밝혀졌다. 또한, 이러한 분석은 HLA-A3 또는 HLA-B7 모티프 또는 수퍼모티프 에피토프에 의한 CTL 유도를 분석하기 위하여, HLA-A11 또는 HLA-B7 형질전환 마우스 모델을 이용하여 수행할 수 있다. 인간에서 기본 추가 접종 프로토콜의 사용은 "기본 추가 접종 프로토콜을 사용한 CTL 반응성 유도"로 명명된 아래의 실시예에 기재되어 있다.
실시예 19
다수의 항원으로부터의 폴리에피토프 백신 조성물
[0537] 본 발명의 PSCA 펩타이드 에피토프는 다른 표적 종양-관련 항원으로부터의 에피토프와 함께 사용되고, PSCA 및 이러한 다른 항원을 발현하는 암의 예방과 치료에 사용되는 백신 조성물을 생산한다. 예를 들어, 백신 조성물은 PSCA 발현과 관련된 표적 암과 함께 종종 발현되는 종양-관련 항원뿐만 아니라 PSCA로부터의 다수의 에피토프를 포함하는 단일 폴리펩타이드로서 제공될 수 있거나, 하나 또는 그 이상의 분리된 에피토프의 혼합물을 포함하는 조성물로서 투여될 수 있다. 다르게는, 백신은 미니유전자 구조체로서 또는 시험관 내에서 펩타이드 에피토프로 채워진 가지 세포로서 투여될 수 있다.
실시예 20
면역 반응을 평가하기 위한 펩타이드의 사용
[0538] 본 발명의 펩타이드는 특이적 항체, PSCA에 유래된 CTL 또는 HTL의 존재로 인한 면역 반응을 분석하는데 사용된다. 이러한 분석은 오그 등에 의한 방법에 따라 수행할 수 있다 (Ogg et al., Science 279:2103-2106, 1998). 본 실시예에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 진단 또는 예후 목적용 시약으로 사용되고, 면역원으로 사용되는 것은 아니다.
[0539] 본 실시예에서, 고 민감성 인간 백혈구 항원 4량 복합체 ("4량체")는 , 예를 들어, 질병의 다른 단계에 있는 HLA A*0201-양성 개인들로부터 유래한 PSCA HLA-A*0201-특이적 CTL 빈도의 상호-부분 분석 또는 A*0201 모티프를 함유하는 PSCA 펩타이드를 포함하는 하기의 면역화에 사용된다. 4량 복합체는 기재된 것처럼 합성된다 (Musey et al., N. Engl. J. Med. 337: 1267, 1997). 간단하게는, 정제된 HLA 중쇄 (이 실시예에서의 A*0201) 및 32-마이크로글로불린은 원핵세포 발현계의 방법으로 합성된다. 중쇄는 막-세포질 꼬리의 결실 및 BirA 효소 비오틴화 부위를 포함하는 서열의 C00H-말단 부가에 의해 수식된다. 중쇄, 32-마이크로글루불린 및 펩타이드는 희석하여 재폴딩된다. 45-kD 재폴딩된 산물을 고속 단백질 액체 크로마토그래피로 분리하고, 비오틴(Sigma, St. Louis, Missouri), 아데노신 5'트리포스페이트 및 마그네슘 존재 하에서 BirA로 비오틴화한다. 스트렙타비딘-피코에이트린 복합체를 1:4 몰 비율로 추가하고, 4량체 산물을 1mg/ml로 농축한다. 얻 어진 산물을 4량체-피코에이트린으로 명명한다.
[0540] 환자 혈액 샘플의 분석을 위하여, 약 100만 PBMC를 5분간 300g에서 원심분리하고, 50㎕의 차가운 인산 완충 식염수 내에 재현탁한다. 3색 분석을 항-CD8-3색 및 항-CD38와 함께 4량체-피코에이트린으로 수행한다. PBMC를 4량체 및 항체와 얼음 위에서 30 내지 60분간 배양하고, 2회 세척 후, 포름알데히드 고정한다. 게이트는 대조 샘플 99.98%를 초과하여 포함하도록 적용된다. 4량체를 위한 대조군은 A*0201-음성 개체 및 A*0201-양성 비-질환 제공자 모두를 포함한다. 그 후, 4량체로 염색된 세포 비율을 흐름 세포 측정으로 확인한다. 결과는 에피토프-제한 CTL을 포함하는 PBMC 샘플 내의 세포의 수를 나타내고, 이에 의하여 PSCA 에피토프에 대한 면역 반응의 범위, 즉, PSCA에 노출된 상태 또는 보호 또는 치료적 반응을 유발하는 백신에 노출된 상태를 빨리 나타낸다.
실시예 21
기본 추가 접종 프로토콜을 이용한 CTL 반응의 유도
[0541] "플라스미드 구조체 및 면역원성 유발의 정도"로 명명된 실시예에 기재된 것과 같은, 형질전환 마우스 내의 DNA 백신의 유효성을 확인하기 위해 사용된 기초 원리에 있어서 유사한 기본 추가 접종 프로토콜이 백신의 인간 투여에 사용될 수 있다. 이러한 백신 처방 계획은 예를 들어, 예를 들어, 원형 DNA의 초기 투여에 이어서, 백신을 코딩하는 재조합 바이러스, 재조합 단백질/폴리펩타이드 또는 애쥬번트 내 투여된 펩타이드 혼합물을 이용한 추가 접종을 포함한다.
[0542] 예를 들어, 초기 면역화는 실시예 ""미니유전자" 멀티-에피토프 DNA 플라스미드의 구조체"로 명명된 실시예에서 제작된 것과 같은 발현 벡터를 다수의 부위에 원형 핵산의 형태, 0.5~5mg의 용량으로 IM (or SC 또는 ID) 주사하여 수행한다. 또한, 핵산 (0.1 내지 1000㎍)도 유전자 총을 사용하여 투여될 수 있다. 접종 3~4 주 후, 추가선량이 투여된다. 추가 접종은 재조합 계두 바이러스일 수 있으며, 5~107 내지 5x109 pfu 용량으로 투여된다. MVA, 카나리팍스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스와 같은 다른 재조합 바이러스도 추가 접종을 위하여 사용될 수 있으며, 폴리에피토프 단백질 또는 펩타이드의 혼합체도 투여될 수 있다. 백신의 유효성을 평가하기 위하여, 환자의 혈액 샘플을 초기 백신 및 백신의 추가선량 투여 후 사이뿐만 아니라, 면역화 전에 채취한다. 말초 혈액 단핵 세포를 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의하여 신선한 헤파린 처리한 혈액으로부터 분리하고, 냉동 매질 내로 배분하여, 냉동 보관한다. 샘플에 대하여 CTL 및 HTL 활성을 조사한다.
[0543] 본 결과의 분석은 PSCA에 대하여 치료 또는 예방적 면역에 충분한 크기의 반응이 유발됨을 알려준다.
실시예 22
상보적 폴리뉴클레오타이드
[0544] PSCA-인코딩 서열 (도 1 또는 도 3)에 상보적인 서열 또는 그의 일부분을 자연 발생적인 PSCA의 발현을 탐지하고 감소시키거나 억제하는데 사용한다. 약 15 내지 30 염기쌍으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드의 사용을 개시하였더라 도, 본질적으로 더 작은 서열 단편 또는 더 큰 서열 단편에도 동일한 공정이 사용된다. 적절한 올리고뉴클레오타이드는 예컨대, OLIGO 4.06 소프트웨어 (National Biosciences) 및 PSCA의 코딩 서열을 이용하여 설계한다. 전사를 저지하기 위하여, 상보 올리고뉴클레오타이드는 대부분 독특한 5' 서열로부터 설계되며 코딩 서열에 프로모터가 결합하는 것을 방해하기 위하여 사용된다. 번역을 억제하기 위하여, 상보 올리고뉴클레오타이드는 PSCA-인코딩 전사에 리보좀이 결합하는 것을 방해하도록 설계한다.
실시예 23
PSCA-특이적 항체를 이용한 천연 또는 재조합 PSCA의 정제
[0545] 천연 또는 재조합 PSCA는 실질상 PSCA에 특이적인 항체를 이용하여 면역친화성(immunoaffinity) 크로마토그래피에 의하여 정제한다. 면역친화성 컬럼은 CNBr-활성화된 세파로오스 (Amersham Pharmacia Biotech)와 같은 활성화된 크로마토그래프 수지에 항PSCA 항체를 공유 결합함으로써 고정한다. 결합 후에, 제작자의 지시에 따라 상기 수지를 차단하고 세척한다.
[0546] PSCA를 함유하는 배지를 면역친화성 컬럼에 통과시키고, 상기 컬럼은 PSCA를 선택적으로 흡착할 수 있는 조건(예컨대, 세제와 같이 높은 이온 강도 버퍼류) 하에서 세척한다. 항체/PSCA 결합을 파괴하는 환경 (예컨대, pH 2 내지 pH 3의 버퍼 또는 우레아 또는 티오시아네이트 이온과 같은 고농도의 카오트로프(chaotrope)) 하에서 상기 컬럼을 녹여 분리시키고, GCR.P를 수집한다.
실시예 24
PSCA와 상호 작용하는 분자의 동정
[0547] PSCA 또는 그로부터의 생물학적으로 활성인 단편을 121 1 Bolton-Hunter 시약으로 표지한다 (예컨대, Bolton et al. (1973) Biochem. J. 133:529 참조). 멀티 웰(multi-well) 플레이트의 웰들 중에 미리 배열된 후보 분자들을 표지된 PSCA와 함께 배양하고, 세척하며, 표지된 PSCA 복합체를 갖는 모든 웰들을 분석한다. 다른 농도의 PSCA를 사용하여 얻은 데이터는 후보 분자를 갖는 PSCA의 결합, 친화력, 수량의 값을 계산하는데 이용한다.
실시예 25
PSCA 종양 성장 촉진에 대한 생체내 분석
[0548] 종양 세포의 성장에 미치는 PSCA v.4 단백질의 효과를, 생체 내에서 PSCA를 발현하거나 PSCA가 결핍된 세포의 성장 및 종양 발달을 측정함으로써 평가한다. 예를 들어 SCID 마우스의 각의 옆구리에 tkNeo 빈(empty) 벡터 또는 PSCA를 함유하는 전립선암 세포주 (예컨대 PC3 세포) 또는 3T3을 1 x 106 개 피하 주사한다. 최소 두 가지 방법이 사용될 수 있다: (1) 폴리오마 바이러스, 계두(鷄痘) 바이러스 (1989년 7월 5일에 공개된 UK 2,211,504 5), 아데노바이러스 (아데노바이러스 2 등), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 또는 예컨대 액틴 프로모터 또는 면역 글로불린 프로모터와 같은 이종의 포유류의 프로모터로부터 얻은 구조 프로모터와 같은 프로모터의 조절하에서, 구조 PSCA의 발현은 숙주 세포계와 양립 가능하고, (2) 상기 프로모터가 제공하는 엑디손, 테트라사이클린 등과 같은 유도 벡터계의 조절 하에 조절된 발현은 숙주 세포계와 양립 가능하다. 이때 종양 부피는 손으로 만질 수 있는 종양의 외관에서 캘리퍼(caliper) 측정 방법으로 관찰하고, 시간이 경과한 후 PSCA 발현 세포가 더 빠른 비율로 자라고 PSCA 발현 세포에 의하여 생성된 종양이 변화된 공격성 (예컨대 전이의 촉진, 혈관화, 화학 요법의 약물류에 대한 반응성의 감소)을 설명하는지 아닌지 결정한다.
[0549] 또한, PSCA가 췌장에서 국소적 성장에 효과가 있는지, 및 PSCA가 특이적으로 임파절 및 뼈에 전이할 수 있도록 세포의 능력에 영향을 주는지, 결정하기 위하여 마우스에 1 x 105의 동일 세포를 동소 이식할 수 있다(Miki T et al, Oncol Res. 2001;12:209; Fu X et al, Int. J Cancer. 1991, 49:938). 뼈 종양 형성 및 성장에 미치는 PSCA의 영향은 종양 세포를 주입함으로써 평가할 수 있다.
[0550] 상기 분석은 또한 예를 들어 PSCA 인트라바디(intrabody), PSCA 안티센스 분자 및 리보자임과 같은 후보 치료 조성물의 PSCA 억제 효과를 결정하는데 유용하다.
실시예 26
생체내 종양의 PSCA 모노클로날 항체 매개형 억제
[0551] 정상 조직에서는 발현이 제한되면서 암 조직 중에서는 PSCA가 현저히 발현한다는 것은 PSCA가 항체 요법에 훌륭한 표적이 되게 한다. 유사하게, PSCA 는 T 세포 기재 면역 요법을 위한 표적이다. 따라서, 사람의 전립선암 이종이식편 마우스 모델과 사람의 췌장암 이종이식편 마우스 모델에서 항PSCA MAbs의 치료적 효능을, PC3-PSCA, 및 3T3-PSCA (예컨대, Kaighn, M.E., et al., Invest Urol, 1979. 17(1): 16-23 참조) 및, LAPC 9AD와 같은 사람의 전립선 이종이식편 모델 (Saffran 외 PNAS 1999년, 10:1073-1078)과 같은 재조합 세포주를 이용하여 평가한다.
[0552] 종양 성장 및 전이 형성에 대한 항체 효능을 예컨대 마우스 중에서 동소(orthotopic) 난소 췌장, 또는 혈액 암 이종 이식 모델에서 연구하였다. 항체는 상기 실시예에서 논의한 바와 같이 결합되지 않을 수 있고, 또는 기술 분야에서 인식되는 바와 같이 치료 양식(modality)에 결합될 수 있다. 항PSCA mAbs는 마우스 이종 이식 중에서 종양의 형성을 저지한다. 또한 항PSCA mAbs는 만성의 동소 종양의 성장 및 종양 함유 마우스의 장기간 생존을 방해한다. 상기의 결과는 여러 가지의 고체 종양의 국소적인 단계 및 진전된 단계에서의 치료에서 항PSCA mAbs의 유용성을 나타낸다(예컨대, Saffran, D., et al., PNAS 10:1073-1078 또는 world wide web URL pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.051624698 참조).
[0553] 항PSCA mAbs의 투여는 확립된 동소 종양의 성장을 지체시키고 떨어져 있는 부위에 전이되는 것을 저지시켜, 종양이 있는 마우스의 생존을 현저히 연장시킨다. 이러한 연구는 PSCA가 면역 요법에서 매력적인 표적이고, 항PSCA mAbs가 국소적인 암 및 전이하는 암의 치료를 위한 잠재적인 치료 요법임을 증명한다. 이 실시예는 비결합된 PSCA 모노클로날 항체가 SCID 마우스 중에서 자라는 임파종 종양 이종 이식 및 인간 난소와 체관의 성장을 저지하는데 효과적이라는 것을 나타낸다; 따라서 상기의 효능을 가진 모노클로날 항체와 조합하는 것 또한 효과적이다.
다수의 PSCA mAbs를 사용하는 종양 억제
재료 및 방법
PSCA 모노클로날 항체:
[0554] "PSCA 모노클로날 항체 (mAbs)의 생산"이라 명칭된 실시예에 기재된 바와 같이, PSCA에 대하여 모노클로날 항체를 유도시켰다. 이들 항체들을 PSCA에 대한 결합력에 대하여 ELISA, 웨스턴 블럿, FACS 및 면역 침강에 의하여 특징화시킨다. ELISA 및 웨스턴 분석법에 의하여 측정한 결과 항PSCA mAbs를 위한 에피토프 도표화(mapping) 데이터에서 PSCA 단백질 상의 에피토프가 확인된다. 상기 항체로 암 조직 및 세포의 면역조직화학적 분석을 행한다.
[0555] 모노클로날 항체는 Protein-G 또는 Protein-A 세파로오스 크로마토그래피에 의하여 복수(腹水) 또는 융합세포 조직 배양 상청액으로부터 정제하고, 여과 살균하며, PBS를 통하여 투석시키고 -20℃에서 보관한다. 단백질 측정은 브래드포드 분석법 (Bio-Rad, Hercules, CA)에 의하여 수행한다. 치료 모노클로날 항체 또는 개개의 모노클로날 항체의 혼합물을 포함하는 칵테일을 준비하고, LAPC9 AD 및 HPAC 종양 이종이식편이 피하 또는 동소 주사된 마우스를 치료하는데 이용한다.
세포주 및 이종이식편
[0556] 전립선암 세포주 PC3 및 LNCaP 세포주와 섬유아세포주 NIH 3T3 (American Type Culture Collection)를 L-글루타민 및 10% FBS가 보강된 RPMI 및 DMEM에서 각각 배양한다.
[0557] PC3-PSCA 및 3T3-PSCA 세포 집단을 Hubert, R.S. 외, Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(25);14523에 설명된 바와 같은 레트로바이러스 유전자 전달에 의해 생산한다.
[0558] 야생형 안드로겐 수용체를 발현하고 전립선 특이적인 항원 (PSA)를 생산하는 LAPC-9 이종이식편을 6 내지 8주령 수컷 ICR-중증 복합 면역결핍 (SCID: severe combined immunodeficient) 마우스 (Taconic Farms)에서 s.c. troca 이식에 의해 계대시킨다 (Craft, N. 외, Nat Med. 1999, 5:280). LAPC-9 종양 ㅅ포의 단일 세포 현탁액을 Craft 등에 설명된 바와 같이 제조한다.
이종이식편 마우스 모델
[0559] 수컷 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리에 마트리겔(Matrigel; 공동 연구)과 1:1로 희석하여 혼합한 2 x 10 6 암 세포를 주입함으로써 피하 (s.c.) 종양을 발생시킨다. 종양 형성에 대한 항체 효능을 시험하기 위하여, 즉 항체 주입을 종양 세포 주입과 동일한 날에 시작한다. 대조군으로서, 정제된 마우스 IgG (ICN) 또는 PBS; 또는 인간 세포 중에서 발현되지 않는 무관한 항원을 인지하는 정제된 모노클로날 항체를 마우스에 주입한다. 종래의 연구에서, 종양이 성장하는 면에서 마우스 IgG 또는 PBS 사이에 아무런 차이점이 발견되지 않았다. 종양 크기는 캘리퍼 측정에 의하여 결정되고, 종양의 부피는 길이 x 너비 x 높이로 측정한다. 피하에 직경 1.5 cm보다 큰 종양이 있는 마우스는 희생시킨다.
[0560] 동소 주입은 케타민/자일라진으로 마취시킨 상태에서 수행한다. 전립 선 동소 연구에서, 전립선 노출을 위해 복근을 절개하고, 마트리겔과 혼합된 LAPC 또는 PC 종양 세포 (2 x 106)를 10 ㎕의 부피로 전립선 캡슐 내로 주사한다. 종양의 성장을 관찰하기 위하여, 마우스의 혈액을 매주 채취하여 PSA 수준을 확인한다. 항PSCA 또는 대조군 MAbs를 복강 주사한 마우스들을 적절한 치료를 위해 격리시킨다.
항PSCA MAbs는 PSCA 발현 이종이식편-암 종양의 성장을 억제한다
[0561] 종양 형성에 대한 항PSCA mAbs의 효능을 HPAC 및 LAPC9 동소 모델을이용하여 시험한다. 피하의 종양 모델과 비교한 결과, 마우스 기관에 직접 종양 세포를 주입하는 동소 모델은 국소 종양을 성장시키고, 말단 부위에서 전이를 일으키며, 마우스의 건강을 해하여 결국 죽음에 이르게 한다(Saffran, D., et al., PNAS supra). 이러한 특징은 동소 모델이 인간의 질병 진행 과정을 대표하며 임상적으로 적절한 종점(end point)에서 mAbs의 치료 효과를 이해하게 한다.
[0562] 따라서, 종양 세포를 마우스 전립선 내로 주사하고, 2일 후, 마우스를 2개의 그룹으로 분리한 다음 2 내지 5주일 동안 1주일에 3회씩 a) 250-1000 ㎍의 항PSCAAb 또는 b) 대조군 항체로 처리한다.
[0563] 동소 암 모델의 주된 이점은 전이의 발생을 연구할 수 있다는 것이다. 전립선암을 위한 항CK20과 같은 종양 특이적 세포 표면 단백질에 대한 항체를 이용하여 절단된 폐를 IHC 분석함으로써 확립 동소 종양을 함유하는 마우스 중에서 전이의 형성을 연구한다 (Lin S et al, Cancer Detect Prev. 2001 ; 25: 202).
[0564] 이종 이식 암 모델의 또 다른 이점은 신생혈관증 식(neovascularization) 및 혈관형성(angiogenesis)을 연구할 수 있다는 것이다. 종양의 성장은 부분적으로 신생 혈관 발달에 의존한다. 모세관 시스템과 발달된 혈액 네트워크가 숙주 기원의 것이라 하더라도, 신생 맥관 구조(neovasculture)의 개시 및 구조는 이종 이식 종양에 의하여 조절된다 (Davidoff AM et al, Clin Cancer Res. 2001;7:2870; Solesvik O et al,, Eur. J Cancer Clin Oncol. 1984, 20:1295). 신생혈관증식에서 항체 및 소분자의 영향은 종양 조직 및 그들을 둘러싼 미소 서식 환경의 IHC 분석과 같이 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 연구한다.
[0565] 확립된 동소 종양을 갖는 마우스에게 항PSCA mAb 또는 대조군 항체를 PBS를 4주간에 걸쳐 투여한다. 두 그룹의 마우스 모두 고종양 부담을 지우게 하여, 마우스의 폐 중에서 높은 빈도로 전이가 일어나도록 한다. 이어서, 마우스를 희생시키고 그들의 방광, 간장, 뼈 및 폐를 IHC 분석법에 의하여 종양 세포의 존재를 분석한다. 이러한 연구는 이종 이식 마우스 모델에서 전립선암의 개시 및 진행 중에 항PSCA 항체가 넓은 항종양 효과를 가진다는 것을 증명한다. 항PSCA 항체는 이미 확립 종양의 성장을 늦출 뿐만 아니라 종양의 형성을 억제하고 처리된 마우스의 생존기간을 연장시킨다. 게다가, 항PSCA mAbs는 말단 부위에 퍼진 국소 전립선 종양에, 심지어는 큰 종양 덩어리가 있는 경우에도 현저한 억제 효과가 있음을 입증한다. 따라서 항PSCA mAbs는 대다수의 임상적으로 적절한 종점 (종양 성장), 생존의 연장 및 건강에 효과적이다.
마우스에 있어서 인간 전립선 암의 성장에 미치는 PSCA MAbs의 효과
[0566] 전술한 방법론을 이용하여, LAPC-9AI 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에게 피하주사하였다. 마우스들을 무작위적으로 몇개의 그룹으로 나누고 (각 그룹 당 n=10), 제0일에 HA1-4.120 또는 이소형 MAb 대조군으로 복강 (i.p) 치료를 개시한다. 동물들을 연구일 28일까지 1주일에 2회씩 총 7회 투약 처리하였다. 3~4일 마다 칼리퍼 측정을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 그 결과 인간의 항PSCA 모노클로날 항체 Hal-4.120은 SCID 마우스에 피하이식된 인간의 전립선암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제한 것으로 나타났다 (p< 0.05) (도 18).
[0567] 또 다른 실험에서, LAPC-9AI 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에게 피하주사하였다. 종양 부피가 50 mm3에 도달 하면, 마우스를 무작위적으로 몇개의그룹으로 나누고 (각 그룹 당 n=10) HA1-5.99.1 또는 이소형 MAb 대조군으로 복강 (i.p.) 치료를 개시한다. 동물들을 연구일 14일까지 1주일에 2회씩 총 5회 투약 처리하였다. 3~4일 마다 칼리퍼 측정을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 그 결과 전적으로 인간 기원의 항PSCA 모노클로날 항체 Hal-5.99는 SCID 마우스에 피하이식된 안드로겐-비의존성 인간의 전립선암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제한 것으로 나타났다 (p< 0.05) (도 9).
[0568] 또 다른 실험에서, LAPC-9AD 종양 세포 (2.5 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 부피가 40 mm3이 되면, 마우스를 무작위적으로 몇개의 그룹으로 나누고 (각 그룹 당 n=10), HA1-4.121 또는 이소형 MAb 대조군으로 복강 (i.p.) 치료를 개시하였다. 동물들을 연구일 21일까지 1주일에 2회씩 총 7회 투약 처리하였다. 3~4일 마다 칼리퍼 측정을 이용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 그 결과 HA1-4.121은 SCID 마우스 내에 수립된 피하 인간 안드로겐-의존성 전립선 이종이식편의 성장을 억제한 것으로 나타났다 (p< 0.05) (도 9). 이 결과는 제14일, 제17일 및 제21일의 300 ug 투여량군의 경우 (p< 0.05, Kruskal-Wallis 검정, two-sided with α=0.05) 제10일, 제14일, 제17일 및 제21일의 700 ug 투여량 군의 경우 (p< 0.05, Kruskal-Wallis test, two-sided with α=0.05) 통계적으로 유의적이었음을 입증해준다 (도 20).
[0569] 또 다른 실험에서는, 환자-유도형, 안드로겐-의존형 LAPC-9AD 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스의 전립선의 등쪽 로브내로 주입하였다. 약 10일간 종양이 자라도록 한 다음 무작위적으로 마우스를 여러 그룹으로 나누었다. 종양을 이식한지 10일 후 인간의 500 mg의 HA1-4.117, HA1-4.121 또는 이소형 대조군 MAb로 처리하기 시작하였다. 항체들을 일주일에 2회 총 7회 복강 투약하였다. 최후 투약일로부터 4일 후, 동물들을 희생시켜 일차 종양을 절제하여 칭량하였다.그 결과, 인간의 항-PSCA 모노클로날 항체 Ha1-4.121 (p< 0.01) 및 Ha1-4.117 (p< 0.05)은 SCID 마우스에 동소이식된 LAPC-9AD 전립선 암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 나타났다 (도 21).
[0570] 또 다른 실험에서는, 환자-유도형, 안드로겐-의존형 LAPC-9AD 종양 세포 (2.0 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스의 전립선의 등쪽 로브내로 주입하였다. 약 9일간 종양이 자라도록 한 다음 무작위적으로 마우스를 여러 그룹으로 나누었다. 생존 그룹으로 무작위 분류된 마우스들은 이소형 MAb 대조군의 11 마리와 HA1-4.121 처리군 12마리였다. 동물들을 1000 ug HA1-4.121 또는 1000 ug 이소형 Mab 대조군으로 1주일에 2회씩 총 9회 복강 투약하였다. 그 결과 HA1-4.121은 인간의 안드로겐-의존성 전립선 종양이 있는 SCID 마우스의 생전을 유의적으로 (로그-랭크 테스트: p<0.01) 연장시켜 준 것으로 나타났다. HA1-4.121 처리 그룹의 두마리는 최종 처리 후 110일 후에도 만져지는 종양이 없는 채로 유지되었다.
마우스에 대한 PSCA MAbs와 택소티어와의 병용 효과
[0571] 또 다른 실험에서는, LAPC-9AI 종양 세포 (마리 당 2 x 106 세포)를 수컷 SCID 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 부피가 65 mm3에 달하면, 표시된 바와 같이 마우스들을 무작위적으로 4개의 그룹으로 나누었다 (각 그룹 당 n=10). 제0일에 시작해서, Ha1-4.121 또는 이소형 MAb 대조군을 500 ug의 투약량으로 1주일에 2회 총 6회 복강 투약하였다. 마지막 투약을 제17일에 실시하였다. 택소티어는 제0일, 제3일, 및 제7일에 5 mg/kg의 투약량으로 정맥 투여하였다. 종양 성장을 칼리퍼 측정에 의해 3~4일마다 모니터링하였다. 이 연구 결과, 단독 제제로서 HA1-4.121는 제28일에, 대조군 항체만으로 처리된 경우에 비해 SCID 마우스에서 안드로겐-비의존성 전립선 이종이식편의 성장을 45% 억제한 것으로 나타났다 (ANOVA/Tukey test: p<0.05). 이소형 MAb 대조군 플러스 택소티어를 투여한 경우에는 대조군 항체만으로 단독 처치된 경우에 비해 종양 성장을 28% 억제하였으며, 이 것은 통계적으로 유의적인 것이 아니었다. HA1-4.121를 택소티어와 병용하여 투여한 경우에는, 억제 효과를 증강시켜, 대조군 항체 단독의 경우에 비해 종양 성장을 69% 억제하였다 (ANOVA/Tukey test: p<0.01). HA1-4.121 플러스 택소티어 병용 그룹을 HA1-4.121 또는 이소형 MAb 대조군 플러스 택소티어 그룹과 비교한 경우에도 통계적으로 유의적인 차이가 입증되었다 (ANOVA/Tukey test: p<0.05) (도 23).
마우스에 있어서 인간의 췌장암 성장에 미치는 PSCA MAbs의 효과
[0572] 또 다른 실험에서, 인간의 HPAC 췌장암 세포 (2 x 106/마우스)를 면역결핍 ICR SCID 마우스 (Taconic Farm, Germantown, NY)에게 피하 주사하였다. 이 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (n= 10 마리/그룹), 표시된 인간 PSCA 모노클로날 항체를 이용한 치료를 같은 날 개시하였다. 항체 (500 mg/마우스)를 1주일에 2회 총 8회 복강내로 투약하였다. 그 결과 인간의 항-PSCA 모노클로날 항체 Ha1-4.121, Ha1-4.117 및 Ha1-1.16는 SCID 마우스에 피하 이식된 인간 췌장암 이종이식편의 성장을 유의적으로 억제하는 것으로 입증되었다. t 검정법 (two-sided, α=0.05)을 이용하여 통계학적 분석을 실시하였다. (도 24).
[0573] 또 다른 실험에서, HPAC 세포 (3.0 x 106 세포)를 SCID 마우스의 췌장내로 동소이식하였다. 표시된 바와 같이 마우스들을 무작위적으로 3개의 그룹으로 나누었다 (각 그룹 당 n=9). HA1-4.121 (250 ug 또는 1000 ug) 또는 이소형 MAb 대조군 (1000 ug)을 이용한 처치를 이식 당일로부터 개시하였다. 항체는 1주일에 2회씩 총 10회 복강 투약하였다. 최종 투약으로부터 13일 후에, 동물들을 희생시키 고 일차 종양을 절제하여 칭량하였다. 이 연구 결과는 HA1-4.121이 시험된 두가지 투약 수준 모두에서 SCID 마우스에서 인간 췌장암 이종이식편의 동소 성장을 유의적으로 억제하였음을 입증한다. 250 ug 및 1000 ug AGS-PSCA를 이용한 처치는 종양 성장을 각각 66% 및 70% 억제하였다 (Kruskal-Wallis/Tukey test: 각각 p<0.01 및 p<0.01) (도 25).
[0574] 부검시, 대조군 항체 처리 그룹에서 임파절과 원위 기관으로의 가시적인 전이가 관찰되었다. 2가지 모두의 HA1-4.121 처리 그룹에서는 가시적인 전이는 관찰되지 않았다. 임파절, 폐 및 간을 모든 동물로부터 제거하여 전이성 종양의 존재 여부를 조직학적으로 시험하였다. 각 동물로부터 제거된 폐와 임파절로부터의 섹션들을 인간의 사이토케라틴으로 염색하고 전이 갯수를 현미경으로 결정하였다. 이 조직학적 분석으로부터 얻은 결과는 HA1-4.121로 처리된 동물의 경우 임파절 (LN) 전이가 현저히 감소되었음을 입증해준다 (p= 0.0152: Fisher의 정확성 검정에 의해 평가). 폐 전이는 1.0 mg 투약량의 HA1-4.121로 처리된 마우스에서만 유의적으로 감소되었다 (p= 0.0498: Fisher의 정확성 검정에 의해 평가). (도 26).
마우스에 있어서 인간의 방광암 성장에 미치는 PSCA MAbs의 효과
[0575] 또 다른 실험에서, 인간의 SW780 방광암 세포 (2 x 106/마우스)를 면역결핍 ICR SCID 마우스 (Taconic Farm, Germantown, NY)에게 피하 주사하였다. 마우스들을 무작위적으로 여러 그룹으로 나누고 (n= 10 마리/그룹) 표시된 인간 PSCA MAb을 이용한 처치를 같은 날 개시하였다. 항체 (250 mg/마우스)를 1주일에 2회 총 7회 복강 투약하였다. 그 결과 HA1-4.117 (p= 0.014), HA1-4.37 (p=0.0056), HA1-1.78 (p=0.001), Ha1-5.99 (p=0.0002) 및 HA1-4.5 (p=0.0008)는 SCID 마우스에서 피하 이식된 SW780 방광 종양의 성장을 유의적으로 억제한 것으로 입증되었다. 통계학적 ㅂ부분ifㅅic서석을 t 검정법 (two-sided, α=0.05)을 이용하여 수행하였다. (도 27).
[0576] 상기 실험 결과는 표 I에 제시된 암을 치료 및 유지하기 위한 치료 및 진단 목적으로 PSCA MAbs를 이용할 수 있음을 보여준다.
실시예 27
인간에 있어서 항PSCA 항체의 치료 및 진단 용도
[0577] 항PSCA 모노클로날 항체는 안전하게 그리고 효과적으로 인간의 진단, 예방, 예후(prognostic) 및/또는 치료를 위한 목적으로 사용된다. 항PSCA mAb를 갖는 암 조직 및 암 이종이식편의 웨스턴 블럿과 면역조직화학적 (immunohistochemical) 분석은 암 중에서는 아주 광범위하게 착색되지만, 정상 조직에서는 현저하게 더 낮거나 탐지할 수 없다는 것을 보여준다. 암 및 전이성 질병 중에서 PSCA의 탐지는 진단 및/또는 예후의 지표로서 mAb를 사용하는 것이 유용하다는 것을 입증한다. 그러므로 항PSCA 항체는 암에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 암을 탐지하기 위한 신장 생체 검사 견본의 면역조직화학과 같은 진단 적용에 사용된다.
[0578] 순환 혈구(血球) 계산에 의하여 측정한 결과, 항PSCA mAb는 특이적으로 암 세포에 결합한다. 따라서, 항PSCA 항체는 PSCA를 발현시키는 국소적인 암 및 전이된 암을 탐지하기 위하여 방사방사면역신티그라피(radioimmunoscintigraphy)와 방사면역 요법 (예컨대, Potamianos S., et. al. Anticancer Res 20(2A):925-948 (2000) 참조)처럼 몸 전체를 영상 진단하기 위한 용도로 사용한다. 알칼리성 포스포디에스터라제 B10 (Meerson, N. R., Hepatology 27:563-568 (1998))에서 보여지는 바와 같이 PSCA 세포 밖의 도메인을 세포 밖 주위 환경으로 방출하거나 흘리는 것은, 의심 환자의 혈청 및/또는 소변 시료 중에서 항PSCA 항체에 의하여 PSCA를 진단할 수 있도록 한다.
[0579] PSCA에 특이적으로 결합하는 항PSCA 항체는 PSCA를 발현하는 암의 처리를 목적으로 하는 치료 요법에 사용된다. 항PSCA 항체는 전구 약물, 효소 또는 방사성 동위 원소와 같이 당업계에서 잘 공지된 다양한 치료 또는 영상 진찰법 중의 하나에 상기 항체를 첨부하여 비결합된 양상과 결합된 형태로서 사용한다. 전임상 연구에서, SCID 마우스 암 이종 이식 모델, 예컨대, 신장 암 모델 AGS-K3 및 AGS-K6, (예컨대, "생체내 종양의 PSCA 모노클로날 항체 매개 억제"라는 제하의 실시예 참조) 중에서 종양을 저지하고 성장을 방해하는 비결합된 및 결합된 항PSCA 항체의 효능을 시험한다. 결합된 또는 비결합된 항PSCA 항체는 다음의 실시예에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 다른 처리물과 혼합하여 인간의 임상 실험에서 치료 모델로 사용된다.
실시예 28
생체내 인간 항PSCA 항체의 이용을 통한 인간 암종의 치료 및 진단을
위한 인간에 대한 임상 시도
[0580] 본 발명에 따른 항체는 PSCA 상의 에피토프를 인지하는데 사용되고, 표 I에 기재된 것과 같은 종양의 치료에도 사용된다. PSCA 발현 수준을 포함하여 많은 요인에 기초할 때, 표 I에 기재된 것과 같은 종양은 곧 바람직한 표지 인자이다. 이러한 각각의 징후와 연관하여 세 가지 임상 실험이 성공적으로 수행된다.
[0581] I.) 부속 요법: 부속 요법에서, 환자들은 화학 요법 약제 또는 항종양제 및/또는 방사 요법과 조합하여 항PSCA 항체로 치료한다. 표 I에 기재된 것과 같은 제1기 암의 표적은 표준의 첫 번째 및 두 번째 라인의 치료에 항PSCA 항체를 첨가함으로써 표준 프로토콜 하에서 처리한다. 프로토콜 설계는 표준 화학 치료시 보통 복용하는 양을 감소시킬 수 있고, 종양 덩어리를 감소시키는 것으로 평가되어 효과적이다. 상기 투약량의 감소는 화학 치료제의 복용량 관련 독성을 감소시킴으로써 추가적인 치료 및/또는 연장된 치료를 가능하게 한다. 항PSCA 항체는 화학 요법 약제 또는 항종양제인 아드리아마이신 (진전된 전립선암), 시스플라틴 (진전된 머리와 목 및 폐암), 택솔 (유방암) 및 독소루비신 (잠복기의)과 조합하여 여러 부속 임상 실험에서 사용된다.
[0582] II.) 단일 요법: 종양의 단일 요법에서는 항PSCA 항체의 사용과 관련하여, 화학 요법 약제 또는 항종양제 없이 항체만 환자에게 투여한다. 일 구체예에서, 단일 요법은 임상적으로 광범위한 전이성 질병을 가진 암 말기의 환자에게 실행한다. 환자들은 다소 질병의 안정화를 나타낸다. 실험은 불치의 종양을 가진 난치의 환자들에게 효과가 있음을 입증한다.
[0583] III.) 조영제: 항PSCA 항체에 방사성 핵종(核種) (예컨대, 요오드 또 는 이트륨 (I131, Y90))을 결합함으로써, 방사 표지된 항체는 진단 제제 및/또는 조영제로서 이용된다. 그러한 역할로서 표지된 항체는 PSCA를 발현하는 세포의 전이성 장애와 고체 종양 모두에 배치한다. 조영제로서 항PSCA 항체의 사용과 관련하여, 항체는 고체 종양의 외과적 치료에서 부가적으로 사용되고, 수술 전 스크리닝 뿐만 아니라 수술 후 뒤따르는 종양의 잔류 및/또는 소생 여부를 결정하는데에도 사용된다. 일구체예에서, (111 In)-PSCA 항체는 PSCA를 발현하는 암을 가진 환자에 대한 단계 I의 인간 임상 실험에서 조영제로서 사용한다 (예컨대, Divgi et al. J. Natl. 암 Inst. 83:97-104 (1991)의 분석 참조). 환자들은 전방 및 후방의 표준 감마 카메라로 추적한다. 결과는 제1기 장애 및 전이성 장애가 확인된 것으로 나타났다.
복용량 및 투여 경로
[0584] 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 인지되는 바와 같이, 복용량의 문제는 임상적으로 유사한 제품과 비교하여 결정할 수 있다. 따라서, 항PSCA 항체는 5 내지 400 mg/m 2 의 범위를 1회 복용량으로 투여할 수 있고, 예컨대 안전한 연구와 관련하여서는 더 낮은 양을 복용할 수 있다. 표적에 대한 공지된 항체의 친화력에 비교하여 항PSCA 항체의 친화력은, 유사 복용 처방 계획을 정하는데 당업계에서 숙련된 자들이 사용하는 하나의 기준이다. 게다가, 완전하게 인간 항체인 항PSCA 항체는 키메라 항체와 비교해서 제거하는데 더 오래 걸리므로, 상기의 완전한 인간 항PSCA 항체를 가지는 환자의 복용량은 아마 50 내지 300 mg/m2의 범위보다 더 낮으면서도 여전히 효력이 있을 수 있다. 통상적인 복용량의 측정 단위인 mg/kg과는 반대로, 복용량으로 mg/m2를 사용하는 것은 표면적에 근거한 측정 방법이고 유아부터 성인까지 모든 크기의 환자를 포함하도록 설계된 편리한 복용량 측정 방법이다.
[0585] 세 가지의 독특한 전달 방법이 항PSCA 항체의 전달에 유용하다. 통상적인 정맥 내 전달은 많은 종양에 대한 표준적인 전달 기법 중의 하나다. 그러나 난소, 담관, 다른 도관 등 복막강 중의 종양과 관련하여, 내복막강 투여는 종양에서 항체의 복용량을 높이기 위하여, 또한 항체 제거를 최소화하기 위하여 유리할 수 있다. 유사한 방식으로, 어떠한 고체 종양은 국부 살포에 적절한 맥관 구조를 가진다. 국부 살포는 종양 부위에서 항체의 복용량을 높이게 되고, 항체의 단기간 제거를 최소화한다.
임상 개발 계획 (CDP)
[0586] 개요: CDP는 부속 요법, 단일 요법과 관련하여, 그리고 조영제로서 항PSCA 항체의 처리법을 개발하고 진행시킨다. 최초로 실험으로 안정성을 입증하였고 이로 인하여 반복 복용시의 효능을 확인하였다. 표준 화학 요법을 항PSCA 항체가 첨가된 표준 요법과 비교할 때 자국들(Trails)은 개방 표지(open label)이다. 인식될 수 있는 것처럼, 환자의 등록과 관련하여 사용될 수 있는 하나의 기준은 생체 검사에 의하여 측정되는 그들의 종양 중의 PSCA 발현 수준이다.
[0587] 모든 단백질 또는 항체 융합 기재 치료에서, 안전에 대한 고려는 주로 (i) 시토카인 배출증, 즉, 저혈압, 열병, 학질, 오한; (ii) 물질에 대한 면역성 반응의 발달 (즉, 항체 치료 또는 HAHA 반응하기 위한 환자의 인간 항체의 발달); 및 (iii) PSCA를 발현하는 정상적인 세포에 대한 독성에 관한 것이다. 표준 시험 및 추적은 이러한 안전성 각각을 모니터하기 위하여 사용된다. 항PSCA 항체는 인간에게 투여시 안전한 것으로 밝혀졌다.
실시예 29
인간 임상 실험: 인간 항PSCA 항체의 단일 요법
[0588] 항PSCA 항체는 상기 논의된 부속 실험과 관련하여 안전하며, II상 인간 임상 실험은 단일 요법에서의 효과적이고 최적화된 복용량을 확인해 준다. 환자들이 항PSCA 항체의 복용과 동시에 화학 요법을 받지 않는다는 점을 제외하면, 이렇게 실험한 결과 전술한 부속 실험과 동일한 안전성 및 분석 결과가 나왔다.
실시예 30
인간 임상 실험: 항PSCA 항체를 이용한 영상 진단
[0589] 다시 한번, 전술한 부속 요법은 전술한 안전 기준 내에서 안전하므로, 진단 조영제로서 항PSCA 항체를 사용하여 인간 임상 실험을 수행한다. 프로토콜은 Divgi et al. J. Natl. Cancer Inst. 83:97-104 (1991)에서 기재된 것과 실질적으로 유사한 방법으로 설계한다. 항체는 진단 모델로서 사용할 때 안전하고 효과적임이 밝혀졌다.
실시예 31
인간 항PSCA 항체 및 화학 요법, 방사능 요법 및/또는 호르몬 소거 요법을
이용한 인간 임상 실험 부속 요법
[0590] 제I상 인간 임상 실험은 고체 종양, 표 I에 기재된 조직의 암의 치료와 관련하여 인간 항PSCA 항체의 6개의 정맥 내 투약의 안전성을 평가하기 위하여 시작하였다. 연구에서, 시스플라틴, 토포테칸, 독소루비신, 아드리아마이신, 택솔, Lupron, Zoladex, Eulexin, Casodex, Anandron등과 같은 비제한적으로 정의된 항종양약 또는 화학 요법 제제에 부속 요법으로서 사용되는 항PSCA 항체의 1회분의 안전성을 평가한다. 실험 설계에는 다음의 계획에 따라 처리하여 대체로 약 25 mg/m 2 내지 약 275 mg/m 2로 양을 늘리면서 항체를 투약하면서 항PSCA 항체의 1회 분량을 6개 전달하는 것을 포함한다.
Figure 112006097924236-PCT00008
[0591] 항체와 화학요법을 각각 실시한 후 1주일 동안 환자들을 주의깊게 관찰하였다. 특히, 환자들은 전술한 (i) 시토카인 배출증, 즉, 저혈압, 열병, 학질, 오한; (ii) 물질에 대한 면역성 반응의 발달 (즉, 항체 치료 또는 HAHA 반응하기 위한 환자의 인간 항체의 발달); 및 (iii) PSCA를 발현하는 정상적이 세포에 대한 독성에 대한 안전성을 평가받았다. 표준 시험 및 추적은 이러한 각각의 안전성 고려에 이용된다. 또한 환자들은 임상 결과, 특히 MRI 또는 다른 영상에 의하여 입증되는 바와 같이 종양이 감소 된 것으로 평가받았다.
[0592] 상기 항PSCA 항체는 안전하고 효과적인 것으로 입증되었다. II상 실험 결과는 약물 효능을 확인해주고 최적 투여량을 더 세밀하게 조정해준다.
실시예 32
RNA 간섭 (RNAi)
[0593] RNA 간섭 (RNAi) 기술은 종양학과 관련된 여러가지 세포 분석에 실시된다. RNAi는 이중 가닥 RNA (dsRNA)에 의해 활성화된 전사후 유전자 침묵화 메카니즘이다. RNAi는 특이적인 mRNA 분해를 유도하여 단백질 발현의 변경과 이어서 유전자 기능의 변경을 이끌어낸다. 포유동물 세포에서, 짧은 간섭 RNA (siRNA)라고 불리우는 이러한 dsRNAs는 특히 몇몇 mRNA를 분해시키는데 표적화된 RNAi 경로를 활성화시키기위한 정확한 조성을 갖는다. Elbashir S.M., et　al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs Mediate RNA interference in Cultured Mammalian Cells, Nature 411(6836):494-8 (2001) 참조. 따라서, RNAi 기술은 포유동물 세포에서 표적화 유전자를 침묵시키는데 성공적으로 사용된다.
[0594] 세포 증식 제어 능력의 상실은 암세포의 특징이다; 따라서, 세포 생존/증식에 있어서 PSCA의 역할을 평가하는 것은 타당하다. 따라서, RNAi를 이용하여 PSCA 항원의 기능을 조사하였다. PSCA에 대한 siRNA를 만들기 위해, 필수적인 분자 변수 (G:C 함량, 융점 등)를 나타내고, 세포 내로 도입될 경우 PSCA 단백질의 발현 수준을 유의적으로 감소시키는 능력이 있는 올리고뉴클레오타이드들을 예측해주는 알고리듬을 이용하였다. 이 실시예에 따라, PSCA 단백질 또는 그의 서브서열의 핵산 ORF 서열에 대응하는 siRNA (이중 가닥, 짧은 간섭 RNA)를 함유하는 PSCA siRNA 조성물을 사용하였다. 따라서, 이러한 방식으로 사용되는 siRNA 서브서열들은 주로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,31, 32, 33, 34, 35 또는 35 이상의 인접 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 이러한 siRNA 서열들은 mRNA 코딩 서열의 적어도 일부에 상보적이고 비상보적이다. 바람직한 구체예에서, 서브서열들은 길이가 19-25 뉴클레오타이드이고, 가장 바람직한 것은 21-23 뉴클레오타이드 길이의 것이다. 바람직한 구체예에서, 이들 siRNA는 그 단백질을 발현하는 세포에서 PSCA 항원을 넉다운시키며 후술하는 바와 같은 기능 효과를 갖는다.
[0595] 선택된 siRNA (PSCA.b.올리고)를 생존/증식 MTS 분석(세포의 대사 활성을 측정)에서 수많은 세포주들에 대해 시험하였다. 테트라졸륨-기재의 비색 분석 (즉, MTS)는 살아있는 세포만을 검색하는데, 이는, 살아있는 세포가 대사적으로 활성이기 때문에, 테트라졸륨염을 유색 포르마잔 화합물로 환원시키기 때문이다; 그러나, 죽은 세포는 그렇지 않다. 또한, 이 PSCA.b 올리고는 그 단백질을 발현하는 세포에서 PSCA 항원을 넉다운 시키고 다음의 프로토콜을 이용하는 후술 내용에서와 같이 기능적 효과를 갖는다.
[0596] 포유동물의 siRNA 트랜스펙션: 생존/MTS 분석을 위해, siRNA 트랜스 펙션을 하기 전날에, 여러가지 세포주들을 80 ㎕ (96 웰 플레이트 포맷) 중 2x103 세포/웰로 배지 (10% FBS w/o 항생제가 보강된 RPMI 1640)의 비율로 도말하였다. PSCA 특이적인 siRNA 올리고와 병용하여, 다음의 서열들을 대조군으로서 다음의 모든 실험에 포함시켰다: a)　Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)과 어닐링 완충액 (siRNA 없음)으로 트랜스펙션된 세포 Mock; b)　루시페라제-4 특이적인 siRNA (표적화 서열: 5'-AAGGGACGAAGACGAACACUUCTT-3') (SEQ ID NO:77); 및 c)　Eg5 특이적인 siRNA (표적화 서열: 5'-AACTGAAGACCTGAAGACAATAA-3') (SEQ ID NO:78). SiRNAs를 10nM and 1 ㎍/ml 리포펙타민 2000 최종 농도로 사용하였다.
[0597] 다음의 공정을 이용하였다: 먼저 siRNAs를 0.1uM μM (10배 농축)의 OPTIMEM (무혈청 트랜스펙션 배지, Invitrogen)에 희석하고 실온에서 5-10분간 인큐베이션하였다. 리포펙타민 2000을 총 트랜스펙션 수에 대해 10 ㎍/ml (10배 농축)로 희석하고 실온(RT)에서 5-10분간 인큐베이션시켰다. 희석된 10배 농축 siNA와 리포펙타민 2000의 적정량을 1:1로 혼합하고 실온에서 20-30" 인큐베이션시켰다 (5배 농축된 트랜스펙션 용액). 5배 농축된 트랜스펙션 용액 20 ㎕를 각각의 샘플에 첨가하고 37℃에서 96시간 동안 분석전까지 인큐베이션시켰다.
[0598] MTS 분석: MTS 분석은 테트라졸륨 화합물 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내염 MTS(b)] 및 전기 커플링 시약 (페나진 에토설페이트; PES)에 기반한 증식, 세포독성 또는 화학민감성 분석에 있어서 살아있는 세포 수를 측정하기 위한 비색법이다. 소량의 Solution Reagent를 배양 웰에 직접 첨가하고, 1-4시간 동안 인큐베이션한 다음 490 nm에서의 흡광도를 96-웰 플레이트 판독기로 기록함으로써 분석을 행하였다. 490 nm에서의 흡광도량으로 측정된 착색된 포르마잔 생성물의 양은 배양 중의 살아있는세포들의 미토콘드리아 활성 및/또는 세포수와 정비례한다.
[0599] 세포에서의 PSCA 기능을 확인하기 위해, 내재 발현되는 PSCA 세포주를 트랜스펙션시킴으로써 PSCA를 침묵화시킨다.
[0600] 본 발명의 또 다른 구체예는 PSCA 관련 세포 증식을 억제하는 방법으로 증식의 마커로서 DNA 합성을 측정한다. 표지된 DNA전구체 (i.e. 3H-티미딘)를 이용하여 DNA에 대한 이들의 병합을 정량한다. 표지된 전구체의 DNA 내로의 병합은 배양시 발생하는 세포 분할량과 정비례한다. 세포 증식을 측정하는 또 다른 방법은 클론 분석을 수행하는 것이다. 이 분석에서는, 소정 갯수의 세포들을 적절한 매트릭스 상에 도말하고 siRNA 처리에 이은 성장 기간이 경과한 후에 형성된 집락 수를 계수한다.
[0601] PSCA 암 표적 검정에서는, 세포 생존/증식 분석을 세포자멸사 및 세포 사이클 프로파일링 연구와 연계하여 고려한다. 세포자멸사 과정의 특징은 세포를 자살시키는 비가역적인 사건인 게놈 DNA 분획화이다. 세포에서 분획화된 DNA를 관찰하는 방법은 세포자멸사 세포의 세포질에서 히스톤-복합형 DNA 단편 (모노 및 올리고 뉴클레오좀)의 부화(enrichment)를 측정하는 면역분석법 (즉, 세포 사멸 검정 ELISA)에 의해 히스톤 복합형 DNA 단편을 면역학적으로 검출하는 것이다. 이 분석법은 세포를 미리 표지시킬 필요가 없고 시험관내에서 증식하지 않는 세포들 (즉, 갓 분리된 종양 세포)에 있어서의 DNA 분해를 검출할 수 있다.
[0602] 세포자멸사를 격발시키는데 있어서 가장 중요한 이펙터 분자는 카스파제이다. 카스파제는 활성화될 경우 아스파테이트 잔기의 카르복시 말단 부위에서 수많은 기질을 절단시켜 활성화시 세포자멸사르 매우 이른 단계를 매개한다. 모든 카스파제는 전구 효소 (pro-enzyme_으로서 합성되며 그 활성화는 아스파테이트 잔기에서의 절단과 관련이 있다. 특히, 카스파제 3은 세포자멸사의 세포 사건의 개시에 있어서 중추적인 역할을 하는 것으로 보인다. 카스파제 3 활성화를 측정하는 분석법은 세포자멸사의 조기 사건을 검사한다. RNAi 처리에 이어, 활성적인 카스파제 3의 존재 여부 또는 세포자멸 세포 중에서 발견되는 생성물 (예컨대 PARP)의 단백질 분해를 웨스턴 블랏 검사하여 세포자멸사의 활성적인 유도를 더욱 지지한다. 세포자멸사를 야기시키는 세포 기작은 복잡하기 때문에, 각자는 장점과 제약이 따른다. 세포 형태학, 크로마틴 축합, 막 블레빙, 세포자멸체와 같은 다른 기준/종점을 고려하면 세포 사멸을 세포자멸사로서 더욱 지지해준다. 세포 성장을 조절하는 유전자 표적들 모두가 항세포자멸사적인 것은 아니기 때문에, 투과된 세포의 DNA 함량을 측정하여 DNA 함량 프로필 또는 세포 사이클 프로필을 얻는다. 세포자멸사된 세포의 핵들은 세포질로 핵이 새어나감으로 해서 DNA를 덜 함유한다 (서브-G1 집단). 이에 더해, DNA 염색을 이용하여 (즉, 프로피디움 요오다이드) 세포 집단 중의 세포 사이클의 여러가지 단계들을 차별화시킬 수 있는데, 이는, G0/G1, S 및 G2/M에서 DNA의 양이 서로 다르기 때문이다.
[0603] PSCA 유전자의 경우, RNAi 연구는 암 경로에 있어서 유전자 생산과 관련 된 이해를 깊게 해준다. 이러한 활성 RNAi 분자들은 활성적인 항종양 치료제인 MAb를 스크리닝하기 위한 분석법을 동정하는데 이용된다. 또한, 표 1에 열거된 것들을 비롯한 여러가지 암 종류의 악성적인 성장을 둔화시키기 위해 siRNA를 암환자에게 투여한다. PSCA가 세포 생존, 세포 증식, 종양 생성, 또는 세포자멸사에 있어서 어떤 역할을 할 경우, 이것은 진단, 예후, 예방 및/또는 치료적 목적을 위한 표적으로서 사용될 수 있다.
실시예 33
암환자 표본에 있어서 IHC에 의한 PSCA 단백질의 검색
[0604] 암환자의 종양 표본에서 PSCA 단백질이 발현하는 것을 항HA1-4.117을 이용하여 검사하였다. 포르말린 고정된 파라핀 내장 조직을 4 마이크론 섹션으로 절단하여 유리 슬라이드 위에 장착하였다. 이 섹션들로부터 밀랍을 제거하고, 재수화시킨 다음, 고온에서 항원 회수 용액 (Antigen Retrieval Citra Solution; BioGenex, 4600 Norris Canyon Road, San Ramon, CA, 94583)으로 처리하였다. 이어서 이 섹션들을 4℃에서 16시간 동안 플루오레신 접합된 인간의 모노클로날 항-PSCA 항체, Hal-4.117 중에서 인큐베이션시켰다. 슬라이드를 완충액에서 3회 세척한 다음 토끼의 항-플루오레신과 함께 1시간 인큐베이션시키고, 완충액에서 세척한 후, DAKO EnVision+ TM 퍼옥시다제-접합된 염소의 항-토끼 면역글로불린 2차 항체 (DAKO Corporation, Carpenteria, CA)에 30분간 침지시켰다. 이어서 섹션들을 완충액 중에서 세척하고, DAB 키트 (SIGMA Chemicals)를 이용하여 전개시킨 다음, 헤마 톡실린을 이용하여 대조염색시킨 후 명시야 현미경법에 의해 분석하였다. 그 결과, 전립선 선암종 (A,B), 방광 전이형 암종 (C) 및 췌장의 도관형 선암종 (D)의 종양 세포들에서 PSCA가 발현된 것으로 나타났다. 이러한 결과는 인간의 암에서 PSCA가 발현되었음과 이 항원에 지향된 항체들이 진단 시약으로서 유용함을 가리키는 것이다 (도 17).
[0605] 이 결과들은 PSCA가 암을 진단, 예후 및 치료하기 위한 표적이 될 수 있음을 가리키는 것이다.
[0606] 본 발명 전반에 걸쳐, 다양한 웹사이트 데이터 내용, 간행물, 특허 출원 및 특허문헌들이 참고되었다 (웹사이트는 월드 와이드 웹상에 주소를 가지고 Uniform Resource Locator 또는 URL에 의하여 참고된다.) 상기의 각각의 참고 문헌에서 개시된 내용은 전체적으로 참고 문헌으로서 본 출원에 병합되어 있다.
[0607] 본 발명은 본 발명의 개별적 측면의 하나의 예로서 의도된 본 명세서에 기재된 구체적인 실시예에 의하여 제한되지 않으며, 이와 기능적으로 균등하다고 생각되는 모든 것은 본 발명의 범위 내이다. 본 명세서에 기재된 것에 추가하여, 본 발명의 모델 및 방법에 대한 다양한 변형은 앞서 기술하고 교시한 것으로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 자에게는 명백할 것이고, 본 발명의 범위 내에 속하게 된다. 그러한 변형 또는 다른 구체예는 본 발명의 진정한 사상과 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있다.
Figure 112006097924236-PCT00009
표 II: 아미노산 약기
단문자 3문자 완전한 명칭
F Phe 페닐알라닌
L Leu 류신
S Ser 세린
Y Tyr 티로신
C Cys 시스테인
W Trp 트립토판
P Pro 프롤린
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
R Arg 아르기닌
I Ile 이소류신
M Met 메티오닌
T Thr 쓰레오닌
N Asn 아스파라긴
K Lys 라이신
V Val 발린
A Ala 알라닌
D Asp 아스파르트산
E Glu 글루탐산
G Gly 글라이신
Figure 112006097924236-PCT00010
Figure 112006097924236-PCT00011
Figure 112006097924236-PCT00012
Figure 112006097924236-PCT00013
Figure 112006097924236-PCT00014
Figure 112006097924236-PCT00015
Figure 112006097924236-PCT00016
Figure 112006097924236-PCT00017
Figure 112006097924236-PCT00018
Figure 112006097924236-PCT00019
Figure 112006097924236-PCT00020
표 VI: 전사 PSCA v.1의 엑손 경계
엑손 번호 개시 종결 길이
1 10 69 60
2 70 177 108
3 178 985 808
표 VII: 친화도 계산에 사용되는 각 데이터 포인트의 MFI 값
nM PSCA PSCA PDP3 T=8+4 PDP3 T=8+4
40 869.3 777.06 795.24 666.66
20 875.19 835.94 816.34 824.07
10 856.28 847.83 777.85 842.72
5 866.94 817.45 758.15 818.83
2.5 835.47 769.79 742.45 783.5
1.25 813.12 782.84 806.2 792.44
0.625 766.52 689.3 683.64 666.28
0.3125 588.3 541.25 549.03 499.22
0.15625 389.95 354.24 366.82 355.83
0.07813 234.85 230.37 225.82 211.77
0.03906 138.05 132.14 134.25 134.07
0.01953 84.35 78.49 77.62 80.14
0.00977 48.13 48.38 50.93 46.87
0.00488 33.49 30.58 30.71 30.04
0.00244 21.77 20.33 18.14 20.44
0.00122 14.45 13.59 13.82 13.11
0.00061 11.07 10.14 9.52 10.35
0.00031 8.61 8.3 8.57 9.09
0.00015 7.45 7.17 7.28 7.85
0.00008 6.91 6.73 7.32 7.86
0.00004 6.94 6.41 6.81 6.51
표 VIII: Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산된 친화도: S자형 투약-반응 (기울기 변수) 방정식
PSCA PSCA PDP3 T=8+4 PDP3 T=8+4
식 1
최적치
BMAX 896.6 843.9 816.4 820.3
KD 0.1784 0.1849 0.1678 0.1839
표준 오차
BMAX 10.83 10.92 12.63 20.12
KD 0.01152 0.01275 0.01397 0.02405
95% 신뢰도 간격
BMAX 873.9 내지 919.3 821.0 내지 866.7 790.0 내지 842.9 778.2 내지 862.4
KD 0.1543 내지 0.2025 0.1583 내지 0.2116 0.1386 내지 0.1971 0.1336 내지 0.2343
표 IX: 전적으로 인간 PSCA MAbs에 대한 FACS에 기초한 친화도
샘플 ID Kd (nM)
Ha1-4.37 0.23
Ha1-4.121 0.26
Ha1-5.99.1 0.28
Ha1-4.117 0.32
Ha1-4.120 0.41
Ha1-4.5 1.00
Ha1-1.16.1 6.91
표 X: 원숭이 PSCA 및/또는 마우스 PSCA와 교차 반응하는 항체
하이브리도마 ID 원숭이 PSCA와 교차 반응 마우스 PSCA와 교차 반응
H1-1.10 - -
Ha1-1.16 + -
Ha1-1.78 + -
Ha1-1.41 + -
Ha1-4.5 + -
Ha1-4.37 + -
Ha1-4.117 + +
Ha1-4.120 + -
Ha1-4.121 + -
Ha1-5.99 + -
Figure 112006097924236-PCT00021
표 XI: SCA: FACS 분석에 의한 에피토프 그룹화
<110> AGENSYS,INC. <120> ANTIBODIES AND RELATED MOLECULES THAT BIND TO PSCA PROTEINS <130> KP-CH-067162 <150> US10/857,484 <151> 2004-05-28 <150> PCT/US2004/017231 <151> 2004-05-28 <150> US60/616,381 <151> 2004-10-05 <150> US60/617,881 <151> 2004-10-12 <150> US60/621,310 <151> 2004-10-21 <150> US60/633,077 <151> 2004-12-02 <150> US60/672,000 <151> 2005-04-14 <160> 78 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 990 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (18)..(386) <220> <221> misc_feature <222> (543) <223> n=a, t, c or g <400> 1 agggagaggc agtgacc atg aag gct gtg ctg ctt gcc ctg ttg atg gca 50 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala 1 5 10 ggc ttg gcc ctg cag cca ggc act gcc ctg ctg tgc tac tcc tgc aaa 98 Gly Leu Ala Leu Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys 15 20 25 gcc cag gtg agc aac gag gac tgc ctg cag gtg gag aac tgc acc cag 146 Ala Gln Val Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln 30 35 40 ctg ggg gag cag tgc tgg acc gcg cgc atc cgc gca gtt ggc ctc ctg 194 Leu Gly Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu 45 50 55 acc gtc atc agc aaa ggc tgc agc ttg aac tgc gtg gat gac tca cag 242 Thr Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln 60 65 70 75 gac tac tac gtg ggc aag aag aac atc acg tgc tgt gac acc gac ttg 290 Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu 80 85 90 tgc aac gcc agc ggg gcc cat gcc ctg cag ccg gct gcc gcc atc ctt 338 Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu 95 100 105 gcg ctg ctc cct gca ctc ggc ctg ctg ctc tgg gga ccc ggc cag cta 386 Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu 110 115 120 tagg ctctgggggg ccccgctgca gcccacactg ggtgtggtgc cccaggcctt 440 tgtgccactc ctcacagaac ctggcccagt gggagcctgt cctggttcct gaggcacatc 500 ctaacgcaag tttgaccatg tatgtttgca ccccttttcc ccnaaccctg accttcccat 560 gggccttttc caggattccc acccggcaga tcagttttag tgacacagat ccgcctgcag 620 atggcccctc caaccctttc tgttgctgtt tccatggccc agcattttcc acccttaacc 680 ctgtgttcag gcacttcttc ccccaggaag ccttccctgc ccaccccatt tatgaattga 740 gccaggtttg gtccgtggtg tcccccgcac ccagcagggg acaggcaatc aggagggccc 800 agtaaaggct gagatgaagt ggactgagta gaactggagg acaagagttg acgtgagttc 860 ctgggagttt ccagagatgg ggcctggagg cctggaggaa ggggccaggc ctcacatttg 920 tggggctccc gaatggcagc ctgagcacag cgtaggccct taataaacac ctgttggata 980 agccaaaaaa 990 <210> 2 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln 1 5 10 15 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn 20 25 30 Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys 35 40 45 Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 50 55 60 Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly 65 70 75 80 Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly 85 90 95 Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu 115 120 <210> 3 <211> 1020 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (56)..(424) <400> 3 tttgaggcca tataaagtca cctgaggccc tctccaccac agcccaccag tgacc 55 atg aag gct gtg ctg ctt gcc ctg ttg atg gca ggc ttg gcc ctg cag 103 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln 1 5 10 15 cca ggc act gcc ctg ctg tgc tac tcc tgc aaa gcc cag gtg agc aac 151 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn 20 25 30 gag gac tgc ctg cag gtg gag aac tgc acc cag ctg ggg gag cag tgc 199 Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys 35 40 45 tgg acc gcg cgc atc cgc gca gtt ggc ctc ctg acc gtc atc agc aaa 247 Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 50 55 60 ggc tgc agc ttg aac tgc gtg gat gac tca cag gac tac tac gtg ggc 295 Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly 65 70 75 80 aag aag aac atc acg tgc tgt gac acc gac ttg tgc aac gcc agc ggg 343 Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly 85 90 95 gcc cat gcc ctg cag ccg gct gcc gcc atc ctt gcg ctg ctc cct gca 391 Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala 100 105 110 ctc ggc ctg ctg ctc tgg gga ccc ggc cag cta taggct ctggggggcc 440 Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu 115 120 ccgctgcagc ccacactggg tgtggtgccc caggcctctg tgccactcct cacacacccg 500 gcccagtggg agcctgtcct ggttcctgag gcacatccta acgcaagtct gaccatgtat 560 gtctgcgccc ctgtccccca ccctgaccct cccatggccc tctccaggac tcccacccgg 620 cagatcggct ctattgacac agatccgcct gcagatggcc cctccaaccc tctctgctgc 680 tgtttccatg gcccagcatt ctccaccctt aaccctgtgc tcaggcacct cttcccccag 740 gaagccttcc ctgcccaccc catctatgac ttgagccagg tctggtccgt ggtgtccccc 800 gcacccagca ggggacaggc actcaggagg gcccggtaaa ggctgagatg aagtggactg 860 agtagaactg gaggacagga gtcgacgtga gttcctggga gtctccagag atggggcctg 920 gaggcctgga ggaaggggcc aggcctcaca ttcgtggggc tccctgaatg gcagcctcag 980 cacagcgtag gcccttaata aacacctgtt ggataagcca 1020 <210> 4 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Lys Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln 1 5 10 15 Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn 20 25 30 Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys 35 40 45 Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys 50 55 60 Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly 65 70 75 80 Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly 85 90 95 Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala 100 105 110 Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu 115 120 <210> 5 <211> 888 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (423)..(704) <400> 5 tttgaggcca tataaagtca cctgaggccc tctccaccac agcccaccag tgaccatgaa 60 ggctgtgctg cttgccctgt tgatggcagg cttggccctg cagccaggca ctgccctgct 120 gtgctactcc tgcaaagccc aggcgcagtt ggcctcctga ccgtcatcag caaaggctgc 180 agcttgaact gcgtggatga ctcacaggac tactacgtgg gcaagaagaa catcacgtgc 240 tgtgacaccg acttgtgcac tcggcctgct gctctgggga cccggccagc tataggctct 300 ggggggcccc gctgcagccc acactgggtg tggtgcccca ggcctctgtg ccactcctca 360 cacacccggc ccagtgggag cctgtcctgg ttcctgaggc acatcctaac gcaagtctga 420 cc atg tat gtc tgc gcc cct gtc ccc cac cct gac cct ccc atg 464 Met Tyr Val Cys Ala Pro Val Pro His Pro Asp Pro Pro Met 1 5 10 gcc ctc tcc agg act ccc acc cgg cag atc ggc tct att gac aca gat 512 Ala Leu Ser Arg Thr Pro Thr Arg Gln Ile Gly Ser Ile Asp Thr Asp 15 20 25 30 ccg cct gca gat ggc ccc tcc aac cct ctc tgc tgc tgt ttc cat ggc 560 Pro Pro Ala Asp Gly Pro Ser Asn Pro Leu Cys Cys Cys Phe His Gly 35 40 45 cca gca ttc tcc acc ctt aac cct gtg ctc agg cac ctc ttc ccc cag 608 Pro Ala Phe Ser Thr Leu Asn Pro Val Leu Arg His Leu Phe Pro Gln 50 55 60 gaa gcc ttc cct gcc cac ccc atc tat gac ttg agc cag gtc tgg tcc 656 Glu Ala Phe Pro Ala His Pro Ile Tyr Asp Leu Ser Gln Val Trp Ser 65 70 75 gtg gtg tcc ccc gca ccc agc agg gga cag gca ctc agg agg gcc cgg 704 Val Val Ser Pro Ala Pro Ser Arg Gly Gln Ala Leu Arg Arg Ala Arg 80 85 90 taaagg ctgagatgaa gtggactgag tagaactgga ggacaggagt cgacgtgagt 760 tcctgggagt ctccagagat ggggcctgga ggcctggagg aaggggccag gcctcacatt 820 cgtggggctc cctgaatggc agcctcagca cagcgtaggc ccttaataaa cacctgttgg 880 ataagcca 888 <210> 6 <211> 94 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Tyr Val Cys Ala Pro Val Pro His Pro Asp Pro Pro Met Ala Leu 1 5 10 15 Ser Arg Thr Pro Thr Arg Gln Ile Gly Ser Ile Asp Thr Asp Pro Pro 20 25 30 Ala Asp Gly Pro Ser Asn Pro Leu Cys Cys Cys Phe His Gly Pro Ala 35 40 45 Phe Ser Thr Leu Asn Pro Val Leu Arg His Leu Phe Pro Gln Glu Ala 50 55 60 Phe Pro Ala His Pro Ile Tyr Asp Leu Ser Gln Val Trp Ser Val Val 65 70 75 80 Ser Pro Ala Pro Ser Arg Gly Gln Ala Leu Arg Arg Ala Arg 85 90 <210> 7 <211> 1174 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (424)..(990) <400> 7 gacagtgaac cctgcgctga aggcgttggg gctcctgcag ttctggggca gccacaggcg 60 cccagggttt cgtgccgatc agcccaggac ggtcttcccg gtgcagtttc tgatgcgggg 120 agggcagtgc tgccttccgg tcaccaggac cagtgctcag cccgcctgct tgaccccctt 180 acttagctgg ggtccaatcc atacccaatt tagatgattc agacgatggg atttgaaact 240 tttgaactgg gtgcgactta agcactgccc tgctgtgcta ctcctgcaaa gcccaggtga 300 gcaacgagga ctgcctgcag gtggagaact gcacccagct gggggagcag tgctggaccg 360 cgcgcatccg cgcagttggc ctcctgaccg tcatcagcaa aggctgcagc ttgaactgcg 420 tgg atg act cac agg act act acg tgg gca aga aga aca tca cgt 465 Met Thr His Arg Thr Thr Thr Trp Ala Arg Arg Thr Ser Arg 1 5 10 gct gtg aca ccg act tgt gca acg cca gcg ggg ccc atg ccc tgc agc 513 Ala Val Thr Pro Thr Cys Ala Thr Pro Ala Gly Pro Met Pro Cys Ser 15 20 25 30 cgg ctg ccg cca tcc ttg cgc tgc tcc ctg cac tcg gcc tgc tgc tct 561 Arg Leu Pro Pro Ser Leu Arg Cys Ser Leu His Ser Ala Cys Cys Ser 35 40 45 ggg gac ccg gcc agc tat agg ctc tgg ggg gcc ccg ctg cag ccc aca 609 Gly Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Leu Trp Gly Ala Pro Leu Gln Pro Thr 50 55 60 ctg ggt gtg gtg ccc cag gcc tct gtg cca ctc ctc aca cac ccg gcc 657 Leu Gly Val Val Pro Gln Ala Ser Val Pro Leu Leu Thr His Pro Ala 65 70 75 cag tgg gag cct gtc ctg gtt cct gag gca cat cct aac gca agt ctg 705 Gln Trp Glu Pro Val Leu Val Pro Glu Ala His Pro Asn Ala Ser Leu 80 85 90 acc atg tat gtc tgc gcc cct gtc ccc cac cct gac cct ccc atg gcc 753 Thr Met Tyr Val Cys Ala Pro Val Pro His Pro Asp Pro Pro Met Ala 95 100 105 110 ctc tcc agg act ccc acc cgg cag atc ggc tct att gac aca gat ccg 801 Leu Ser Arg Thr Pro Thr Arg Gln Ile Gly Ser Ile Asp Thr Asp Pro 115 120 125 cct gca gat ggc ccc tcc aac cct ctc tgc tgc tgt ttc cat ggc cca 849 Pro Ala Asp Gly Pro Ser Asn Pro Leu Cys Cys Cys Phe His Gly Pro 130 135 140 gca ttc tcc acc ctt aac cct gtg ctc agg cac ctc ttc ccc cag gaa 897 Ala Phe Ser Thr Leu Asn Pro Val Leu Arg His Leu Phe Pro Gln Glu 145 150 155 gcc ttc cct gcc cac ccc atc tat gac ttg agc cag gtc tgg tcc gtg 945 Ala Phe Pro Ala His Pro Ile Tyr Asp Leu Ser Gln Val Trp Ser Val 160 165 170 gtg tcc ccc gca ccc agc agg gga cag gca ctc agg agg gcc cgg 990 Val Ser Pro Ala Pro Ser Arg Gly Gln Ala Leu Arg Arg Ala Arg 175 180 185 taaaggctga gatgaagtgg actgagtaga actggaggac aggagtcgac gtgagttcct 1050 gggagtctcc agagatgggg cctggaggcc tggaggaagg ggccaggcct cacattcgtg 1110 gggctccctg aatggcagcc tcagcacagc gtaggccctt aataaacacc tgttggataa 1170 gcca 1174 <210> 8 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Thr His Arg Thr Thr Thr Trp Ala Arg Arg Thr Ser Arg Ala Val 1 5 10 15 Thr Pro Thr Cys Ala Thr Pro Ala Gly Pro Met Pro Cys Ser Arg Leu 20 25 30 Pro Pro Ser Leu Arg Cys Ser Leu His Ser Ala Cys Cys Ser Gly Asp 35 40 45 Pro Ala Ser Tyr Arg Leu Trp Gly Ala Pro Leu Gln Pro Thr Leu Gly 50 55 60 Val Val Pro Gln Ala Ser Val Pro Leu Leu Thr His Pro Ala Gln Trp 65 70 75 80 Glu Pro Val Leu Val Pro Glu Ala His Pro Asn Ala Ser Leu Thr Met 85 90 95 Tyr Val Cys Ala Pro Val Pro His Pro Asp Pro Pro Met Ala Leu Ser 100 105 110 Arg Thr Pro Thr Arg Gln Ile Gly Ser Ile Asp Thr Asp Pro Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Ser Asn Pro Leu Cys Cys Cys Phe His Gly Pro Ala Phe 130 135 140 Ser Thr Leu Asn Pro Val Leu Arg His Leu Phe Pro Gln Glu Ala Phe 145 150 155 160 Pro Ala His Pro Ile Tyr Asp Leu Ser Gln Val Trp Ser Val Val Ser 165 170 175 Pro Ala Pro Ser Arg Gly Gln Ala Leu Arg Arg Ala Arg 180 185 <210> 9 <211> 1660 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (910)..(1476) <400> 9 gacagtgaac cctgcgctga aggcgttggg gctcctgcag ttctggggca gccacaggcg 60 cccagggttt cgtgccgatc agcccaggac ggtcttcccg gtgcagtttc tgatgcgggg 120 agggcagtgc tgccttccgg tcaccaggac cagtgctcag cccgcctgct tgaccccctt 180 acttagctgg ggtccaatcc atacccaatt tagatgattc agacgatggg atttgaaact 240 tttgaactgg gtgcgactta agcactgccc tgctgtgcta ctcctgcaaa gcccaggtga 300 gcaacgagga ctgcctgcag gtggagaact gcacccagct gggggagcag tgctggaccg 360 cgcgcatccg tgagtggggg gacgacagcc gccaggccta ggtctctgcc actgaactat 420 taatctttct ggccatctgt ccgcatctgt gtgctgtttt ccttccacct gtccccgacc 480 cgtcccgcac ctgcaccccc aacaatcacc cagcatctgt ccctccagcc atcctcctcc 540 atctgccact cctccactca tctgtccctc cccatcctcc atcttccact cctccaccca 600 tctgtccctc cccatccctg agctcactta ctcactcacc ccatttctga cgctcagcgg 660 gtggtccatc tgcctcggac atctggatag ggctgagacc agggccgaga ccaggccctc 720 gcactgcttg caatcctgag gccagcccag ggggactcta gagcattagg cagggtggga 780 caggaggagg cctggggcag gtcaggcagg tgagcacaca gggcagcccc atccccggat 840 cccgctgctc cccaggcgca gttggcctcc tgaccgtcat cagcaaaggc tgcagcttga 900 actgcgtgg atg act cac agg act act acg tgg gca aga aga aca tca cgt 951 Met Thr His Arg Thr Thr Thr Trp Ala Arg Arg Thr Ser Arg 1 5 10 gct gtg aca ccg act tgt gca acg cca gcg ggg ccc atg ccc tgc agc 999 Ala Val Thr Pro Thr Cys Ala Thr Pro Ala Gly Pro Met Pro Cys Ser 15 20 25 30 cgg ctg ccg cca tcc ttg cgc tgc tcc ctg cac tcg gcc tgc tgc tct 1047 Arg Leu Pro Pro Ser Leu Arg Cys Ser Leu His Ser Ala Cys Cys Ser 35 40 45 ggg gac ccg gcc agc tat agg ctc tgg ggg gcc ccg ctg cag ccc aca 1095 Gly Asp Pro Ala Ser Tyr Arg Leu Trp Gly Ala Pro Leu Gln Pro Thr 50 55 60 ctg ggt gtg gtg ccc cag gcc tct gtg cca ctc ctc aca cac ccg gcc 1143 Leu Gly Val Val Pro Gln Ala Ser Val Pro Leu Leu Thr His Pro Ala 65 70 75 cag tgg gag cct gtc ctg gtt cct gag gca cat cct aac gca agt ctg 1191 Gln Trp Glu Pro Val Leu Val Pro Glu Ala His Pro Asn Ala Ser Leu 80 85 90 acc atg tat gtc tgc gcc cct gtc ccc cac cct gac cct ccc atg gcc 1239 Thr Met Tyr Val Cys Ala Pro Val Pro His Pro Asp Pro Pro Met Ala 95 100 105 110 ctc tcc agg act ccc acc cgg cag atc ggc tct att gac aca gat ccg 1287 Leu Ser Arg Thr Pro Thr Arg Gln Ile Gly Ser Ile Asp Thr Asp Pro 115 120 125 cct gca gat ggc ccc tcc aac cct ctc tgc tgc tgt ttc cat ggc cca 1335 Pro Ala Asp Gly Pro Ser Asn Pro Leu Cys Cys Cys Phe His Gly Pro 130 135 140 gca ttc tcc acc ctt aac cct gtg ctc agg cac ctc ttc ccc cag gaa 1383 Ala Phe Ser Thr Leu Asn Pro Val Leu Arg His Leu Phe Pro Gln Glu 145 150 155 gcc ttc cct gcc cac ccc atc tat gac ttg agc cag gtc tgg tcc gtg 1431 Ala Phe Pro Ala His Pro Ile Tyr Asp Leu Ser Gln Val Trp Ser Val 160 165 170 gtg tcc ccc gca ccc agc agg gga cag gca ctc agg agg gcc cgg taaa 1480 Val Ser Pro Ala Pro Ser Arg Gly Gln Ala Leu Arg Arg Ala Arg 175 180 185 ggctgagatg aagtggactg agtagaactg gaggacagga gtcgacgtga gttcctggga 1540 gtctccagag atggggcctg gaggcctgga ggaaggggcc aggcctcaca ttcgtggggc 1600 tccctgaatg gcagcctcag cacagcgtag gcccttaata aacacctgtt ggataagcca 1660 1660 <210> 10 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr His Arg Thr Thr Thr Trp Ala Arg Arg Thr Ser Arg Ala Val 1 5 10 15 Thr Pro Thr Cys Ala Thr Pro Ala Gly Pro Met Pro Cys Ser Arg Leu 20 25 30 Pro Pro Ser Leu Arg Cys Ser Leu His Ser Ala Cys Cys Ser Gly Asp 35 40 45 Pro Ala Ser Tyr Arg Leu Trp Gly Ala Pro Leu Gln Pro Thr Leu Gly 50 55 60 Val Val Pro Gln Ala Ser Val Pro Leu Leu Thr His Pro Ala Gln Trp 65 70 75 80 Glu Pro Val Leu Val Pro Glu Ala His Pro Asn Ala Ser Leu Thr Met 85 90 95 Tyr Val Cys Ala Pro Val Pro His Pro Asp Pro Pro Met Ala Leu Ser 100 105 110 Arg Thr Pro Thr Arg Gln Ile Gly Ser Ile Asp Thr Asp Pro Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Ser Asn Pro Leu Cys Cys Cys Phe His Gly Pro Ala Phe 130 135 140 Ser Thr Leu Asn Pro Val Leu Arg His Leu Phe Pro Gln Glu Ala Phe 145 150 155 160 Pro Ala His Pro Ile Tyr Asp Leu Ser Gln Val Trp Ser Val Val Ser 165 170 175 Pro Ala Pro Ser Arg Gly Gln Ala Leu Arg Arg Ala Arg 180 185 <210> 11 <211> 1020 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (83)..(424) <400> 11 tttgaggcca tataaagtca cctgaggccc tctccaccac agcccaccag tgaccatgaa 60 ggctgtgctg cttgccctgt tg atg gca ggc ttg gcc ctg cag cca 106 Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln Pro 1 5 ggc act gcc ctg ctg tgc tac tcc tgc aaa gcc cag gtg agc aac gag 154 Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn Glu 10 15 20 gac tgc ctg cag gtg gag aac tgc acc cag ctg ggg gag cag tgc tgg 202 Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys Trp 25 30 35 40 acc gcg cgc atc cgc gca gtt ggc ctc ctg acc gtc atc agc aaa ggc 250 Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys Gly 45 50 55 tgc agc ttg aac tgc gtg gat gac tca cag gac tac tac gtg ggc aag 298 Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly Lys 60 65 70 aag aac atc acg tgc tgt gac acc gac ttg tgc aac gcc agc ggg gcc 346 Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala 75 80 85 cat gcc ctg cag ccg gct gcc gcc atc ctt gcg ctg ctc cct gca ctc 394 His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu 90 95 100 ggc ctg ctg ctc tgg gga ccc ggc cag cta taggct ctggggggcc 440 Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly Gln Leu 105 110 ccgctgcagc ccacactggg tgtggtgccc caggcctctg tgccactcct cacacacccg 500 gcccagtggg agcctgtcct ggttcctgag gcacatccta acgcaagtct gaccatgtat 560 gtctgcgccc ctgtccccca ccctgaccct cccatggccc tctccaggac tcccacccgg 620 cagatcggct ctattgacac agatccgcct gcagatggcc cctccaaccc tctctgctgc 680 tgtttccatg gcccagcatt ctccaccctt aaccctgtgc tcaggcacct cttcccccag 740 gaagccttcc ctgcccaccc catctatgac ttgagccagg tctggtccgt ggtgtccccc 800 gcacccagca ggggacaggc actcaggagg gcccggtaaa ggctgagatg aagtggactg 860 agtagaactg gaggacagga gtcgacgtga gttcctggga gtctccagag atggggcctg 920 gaggcctgga ggaaggggcc aggcctcaca ttcgtggggc tccctgaatg gcagcctcag 980 cacagcgtag gcccttaata aacacctgtt ggataagcca 1020 <210> 12 <211> 114 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Ala Gly Leu Ala Leu Gln Pro Gly Thr Ala Leu Leu Cys Tyr Ser 1 5 10 15 Cys Lys Ala Gln Val Ser Asn Glu Asp Cys Leu Gln Val Glu Asn Cys 20 25 30 Thr Gln Leu Gly Glu Gln Cys Trp Thr Ala Arg Ile Arg Ala Val Gly 35 40 45 Leu Leu Thr Val Ile Ser Lys Gly Cys Ser Leu Asn Cys Val Asp Asp 50 55 60 Ser Gln Asp Tyr Tyr Val Gly Lys Lys Asn Ile Thr Cys Cys Asp Thr 65 70 75 80 Asp Leu Cys Asn Ala Ser Gly Ala His Ala Leu Gln Pro Ala Ala Ala 85 90 95 Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gly Leu Leu Leu Trp Gly Pro Gly 100 105 110 Gln Leu <210> 13 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 1 5 10 15 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 20 25 30 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ile Trp Ile 35 40 45 Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 50 55 60 Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met 65 70 75 80 Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val 85 90 95 Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Thr 100 105 110 Met Ile Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe 145 <210> 14 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr 35 40 45 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Phe Pro Arg Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 <210> 15 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Cys Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln 1 5 10 15 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 35 40 45 Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile 50 55 60 Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 65 70 75 80 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 85 90 95 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg 100 105 110 Ile Thr Met Val Arg Gly Gly Ile Pro Ser Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 130 135 <210> 16 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Pro Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 15 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Val 20 25 30 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 50 55 60 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Ile Pro Arg Thr Phe 65 70 75 80 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 85 90 95 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 100 105 110 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 115 120 125 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 130 135 <210> 17 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Gln Val His Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Lys Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 <210> 18 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 1 5 10 15 Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 20 25 30 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Glu 35 40 45 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 50 55 60 Gly Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Cys Gly 65 70 75 80 Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 85 90 95 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 100 105 110 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 130 135 140 <210> 19 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Gly Leu Gln Cys Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln 1 5 10 15 Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asn Tyr Trp Ser 35 40 45 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 50 55 60 Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 65 70 75 80 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 85 90 95 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly 100 105 110 Ser Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Lys 130 135 <210> 20 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Phe Leu Ile Ser Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Cys Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asp Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 21 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Pro Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 22 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Gly Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Met Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Leu Gly Glu Leu Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 <210> 23 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg 1 5 10 15 Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Ile Leu Tyr Arg Ser Ser 20 25 30 Lys Lys Asn His Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Thr Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly <210> 24 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (3)..(4) <223> Xaa= Any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10) <223> Xaa= Any amino acid <400> 24 Gly Pro Gly Xaa Xaa Lys Pro Ser Gln Xaa Leu Ser Leu Thr Gly Thr 1 5 10 15 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile 20 25 30 Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr 35 40 45 Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile 50 55 60 Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ala Val 65 70 75 80 Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Ile Thr 85 90 95 Met Val Arg Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Tyr 130 135 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 20 25 30 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Leu Pro Arg 35 40 45 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 50 55 60 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Lys Ala 85 90 95 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Thr Leu Gln 100 105 <210> 26 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Ile Ala Val Arg Pro Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 <210> 27 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Met Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 <210> 28 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Cys Pro Gly Ala Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Tyr Tyr Trp Ile Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 50 55 60 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Ile Ser Gly 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 <210> 29 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ile Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 20 25 30 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 35 40 45 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser 50 55 60 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr Arg 85 90 95 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 100 105 110 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 130 135 140 Gly 145 <210> 30 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala 20 25 30 Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala Val Ser 50 55 60 Val Lys Ser Arg Met Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Arg Leu Gly Glu Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 <210> 31 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Gln Val Gln Pro Glu Cys Leu Tyr Thr Val Ser Asp Lys Asn Asn 1 5 10 15 Phe Leu Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 20 25 30 Met Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro 65 70 75 80 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 85 90 95 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 100 105 110 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 115 120 125 <210> 32 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Trp Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Met Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Leu Gly Glu Leu Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 <210> 33 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Met Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu 1 5 10 15 Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Arg Ser 20 25 30 Asn Lys Lys Asn Phe Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly <210> 34 <211> 445 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 gtggcagcac ccagatgggt cctgtcccag gtgcagctgc aggagtcggg cccaggactg 60 gtgaagcctt cacagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggctc catcagcagt 120 ggtggttact actggatctg gatccgccag cacccaggga agggcctgga gtggattggg 180 tacatctatt acaatgggaa cacctactac aacccgtccc tcaagagtcg agttaccatg 240 tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc ctgaagctga gctctgtgac tgccgcggac 300 acggccgtgt attactgtgc gagagatggt attactatga tacgcggcta ctactacggt 360 atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca 420 tcggtcaagg gcccatcggt cttca 445 <210> 35 <211> 148 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 1 5 10 15 Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 20 25 30 Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ile Trp Ile 35 40 45 Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr 50 55 60 Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met 65 70 75 80 Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val 85 90 95 Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Thr 100 105 110 Met Ile Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe 145 <210> 36 <211> 466 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n= a, t, c, or g <400> 36 cagctgacnc agtctccatc ttccgtgtct gcatctgtag gagacagagt caccatcact 60 tgtcgggcga gtcggggtat tagcagctgg ttagcctggt atcagcagaa accagggaaa 120 gcccctaagc tcctgatcta tactgcatcc agtttgcaaa gtggagtccc atcaaggttc 180 agcggcagtg gttctgggac agatttcact ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagat 240 tttgcaactt actattgtca acaggcttac agtttccctc ggacgttcgg ccaagggacc 300 aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 360 gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 420 gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggta 466 <210> 37 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 1 5 10 15 Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 20 25 30 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr 35 40 45 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Ser Phe Pro Arg Thr Phe 85 90 95 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 <210> 38 <211> 409 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 cagtgtgtgg cagcacccag atgggtcctg tcccaggtgc agctgcagga gtcgggccca 60 ggactggtga agccttcaca gaccctgtcc ctcacctgca ctgtctctgg tggctccatc 120 agcagtggtg gttactactg gagctggatc cgccagcacc cagggaaggg cctggagtgg 180 attgggtaca tatattacag tgggagcacc tactacaacc cgtccctcaa gagtcgagtt 240 accatatcag tagacacgtc caagaaccag ttctccctga agctgagctc tgtgactgcc 300 gcggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga gatcgaatta ctatggttcg gggaggtatt 360 cccagtggta tggacgtctg gggccaaggg accacggtca ccgtctcct 409 <210> 39 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Gln Cys Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln 1 5 10 15 Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser 35 40 45 Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile 50 55 60 Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 65 70 75 80 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 85 90 95 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg 100 105 110 Ile Thr Met Val Arg Gly Gly Ile Pro Ser Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 130 135 <210> 40 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 tcaccattca cttgccgggc aagtcagagc attaccaact atttaaattg gtatcagcag 60 aaaccagggg aagcccctaa gctcctgatc catgttgcat ccagtttgca aagtggggtc 120 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg agagatttca ctctcaccat cagcagtctg 180 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtc acagtatccc tcggacgttc 240 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 300 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 360 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggt 417 <210> 41 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Ser Pro Phe Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 15 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Val 20 25 30 Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 35 40 45 Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 50 55 60 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Ile Pro Arg Thr Phe 65 70 75 80 Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 85 90 95 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 100 105 110 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 115 120 125 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 130 135 <210> 42 <211> 416 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 caggtgcatc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccggggaagg gactggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac cagctacaag 180 ccgtccctca agagtcgagt caccgtatca gtggacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct atgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agataggggt 300 gactacggtg acttcctctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag caccta 416 <210> 43 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Gln Val His Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Lys Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Val Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Tyr Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Arg Gly Asp Tyr Gly Asp Phe Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 <210> 44 <211> 425 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 tctccagggg aaagagccac cctctcctgc agggccagtc agagtattgg cagcacctac 60 ttagcctggt accagcagaa acctggccag gctcccaggc tcctcatcta tggtgcatcc 120 agcagggcca ctggcatccc agaaaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcact 180 ctcaccatca gcggactgga gcctgaagat tttgcagtgt tttactgtca acagtgtggt 240 agctcacctc cgacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca 300 ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 360 gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 420 gccct 425 <210> 45 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile 1 5 10 15 Gly Ser Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 20 25 30 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Glu 35 40 45 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 50 55 60 Gly Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Cys Gly 65 70 75 80 Ser Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 85 90 95 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 100 105 110 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 130 135 140 <210> 46 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 46 ggtctgcagt gtgtggcagc acccagatgg gtcctgtccc aggtgcagct acagcagtgg 60 ggcgcaggac tgttgaagcc ttcggagacc ctgtccctca cctgcgctgt ctatggtggg 120 tccttcagtg gtaactactg gagctggatc cgccagcccc cagggaaggg gctggagtgg 180 attggggaaa tcaatcatag tggaagcacc aactacaacc cgtccctcaa gagtcgagtc 240 accatatcag tagacacgtc caagaaccag ttctccctga agctgagctc tgtgaccgcc 300 gcggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga ggggggagct acaactactt tgactactgg 360 ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca gcctccacca agggcccatc ggtcaag 417 <210> 47 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gly Leu Gln Cys Val Ala Ala Pro Arg Trp Val Leu Ser Gln Val Gln 1 5 10 15 Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Asn Tyr Trp Ser 35 40 45 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile 50 55 60 Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val 65 70 75 80 Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser 85 90 95 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly 100 105 110 Ser Tyr Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Lys 130 135 <210> 48 <211> 933 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 aaaaaagtca gtcccaacca ggacacagca tggacatgag ggtccctgct cagctcctgg 60 ggctcctgct gctctggctc tcaggtgcca gatgtgacat ccagatgact cagtctccat 120 cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcg agtcaggaca 180 ttagcaacta tttgaattgg tatcagcaga gtcccgggaa agcccctaag ttcctgatct 240 ccgatgcatc caatttaaaa acaggggtcc catcaaggtt cagtggaagt ggatctggga 300 cagatttttc tttcaccatc agcagcctac agcctgaaga tattgcgacc tattgctgtc 360 aacagtatga tagtctccca ttcactttcg gccctgggac caaagtggat atcaaacgaa 420 ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 480 ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 540 aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 600 aggacagcac ctacagcctc agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 660 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct 720 tcaacagggg agagtgttag agggagaagt gcccccacct gctcctcagt tccagcctga 780 ccccctccca tcctttggcc tctgaccctt tttccacagg ggacctaccc ctattgcggt 840 cctccagctc atctttcacc tcacccccct cctcctcctt ggctttaatt atgctaatgt 900 tggaggagaa tgaataaata aagtgaatct ttg 933 <210> 49 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ser Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Phe Leu Ile Ser Asp Ala Ser Asn Leu Lys Thr Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Phe Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Cys Cys Gln Gln 100 105 110 Tyr Asp Ser Leu Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile 115 120 125 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 130 135 140 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 145 150 155 160 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 165 170 175 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 180 185 190 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 195 200 205 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 50 <211> 968 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 aaagatcagg actcctcagt tcaccttctc acaatgaggc tccctgctca gctcctgggg 60 ctgctaatgc tctgggtctc tggatccagt ggggatattg tgatgactca gtctccactc 120 tccctgcccg tcacccctgg agagccggcc tccatctcct gcaggtctag tcagagcctc 180 ctacatagta atggatacaa ctatttggtt tggtacctgc agaagccagg acagtctcca 240 cagctcctga tctatttggg ttctattcgg gcctccgggg tccctgacag gttcagtggc 300 agtggatcag gcacagattt tacactgaaa atcagcagag tggaggctga ggatgttggg 360 gtttattact gcatgcaacc tctacaaact ccgatcacct tcggccaagg gacacgactg 420 gagattaaac gaactgtggc tgcaccatct gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag 480 ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc 540 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca 600 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca 660 gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc 720 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt tagagggaga agtgccccca cctgctcctc 780 agttccagcc tgaccccctc ccatcctttg gcctctgacc ctttttccac aggggaccta 840 cccctattgc ggtcctccag ctcatctttc acctcacccc cctcctcctc cttggcttta 900 attatgctaa tgttggagga gaatgaataa ataaagtgaa tctttgcaaa aaaaaaaaaa 960 aaaaaaaa 968 <210> 51 <211> 239 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Met Arg Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu His Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Val Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Ile Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gln Pro Leu Gln Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 180 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 52 <211> 425 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 52 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat cgagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatggttatg cagtatctgt gaaaagtcga atgaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagagaggt taggggagtt atacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 accta 425 <210> 53 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Gly Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Met Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Leu Gly Glu Leu Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 <210> 54 <211> 484 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 54 cagctgacgc agtctccaga ctccctggct gtgtctctgg gcgagagggc caccatcaac 60 tgcaagtcca gccagaatat tttatacagg tccagcaaga agaaccactt agtttggtac 120 cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcatttact gggcatctac ccgggaatcc 180 ggggtccctg cccgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 240 accctgcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgtcagc aatattatag tactcctccc 300 accttcggcc aagggacacg actggagatt aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480 ggta 484 <210> 55 <211> 161 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg 1 5 10 15 Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Ile Leu Tyr Arg Ser Ser 20 25 30 Lys Lys Asn His Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Thr Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 85 90 95 Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly <210> 56 <211> 409 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n= a, t, c, or g <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> n= a, t, c, or g <400> 56 ggcccaggac nggngaagcc ttcacagacc tgtccctcac cggcactgtc tctggtggcc 60 catcagcagt ggtggttatt actggagctg gatccgccag cacccaggga agggcctgga 120 gtggattggg aacatctatt acagtgggag cacctactac aacccgtccc tcaagagtcg 180 agttaccata tcagtagaca cgtctaagaa ccagttctcc ctgaagctga gcgctgtgac 240 tgccgcggac acggccgtgt attactgtgc gagagataat attactatgg ttcggggagt 300 ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc accgtctcct cagcctccac 360 caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctat 409 <210> 57 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIANT <222> (4)..(5) <223> Xaa= Any amino acid <400> 57 Ala Gln Asp Xaa Xaa Ser Leu His Arg Pro Val Pro His Arg His Cys 1 5 10 15 Leu Trp Trp Pro Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg 20 25 30 Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser 35 40 45 Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser 50 55 60 Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ala Val Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Ile Thr Met 85 90 95 Val Arg Gly Val Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Tyr 130 135 <210> 58 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 tatgcagcat ccagtttgca aagtggggtc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctgga 60 acagacttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgaag attttgcaac ttactattgt 120 caacaggctc acagtctccc tcggacgttc ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacga 180 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 240 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gaaaggccaa agtacagtgg 300 aaggtggata acaccctcca a 321 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 1 5 10 15 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 20 25 30 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Leu Pro Arg 35 40 45 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 50 55 60 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 65 70 75 80 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Lys Ala 85 90 95 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Thr Leu Gln 100 105 <210> 60 <211> 433 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cgtccggatt caccttcagt cgccatggcg tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggaggc 300 cttatagcag ttcgtccggg gtactactac tacggtatgg acgtctgggg ccaagggacc 360 acggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 420 tccaagagca cct 433 <210> 61 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Leu Ile Ala Val Arg Pro Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 <210> 62 <211> 471 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 gaaatgcagc tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg t 471 <210> 63 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Met Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 <210> 64 <211> 424 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 64 tgtccaggtg cactgcagga gtcgggccca ggactggtga ggccttcaca gaccctgtcc 60 ctcacctgca ctgtctctgg tggctccatc agcagtggtg gtacttacta ctggatctgg 120 atccgccagc acccagggaa gggcctggag tggattgggt acatctatta cagtgggagc 180 acctactaca acccgtccct caagagtcga gttaccatat cagtagacac gtctaagaac 240 cagttctccc tgaagctgag ctctgtgact gccgcggaca cggccgtgta ttactgtgcg 300 agagatggaa ttactatggt tcggggaatt agcgggggca tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc agcctccacc aagggcccat cggtcaaggg cccatcggtc 420 ttca 424 <210> 65 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Cys Pro Gly Ala Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser 1 5 10 15 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Tyr Tyr Trp Ile Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 50 55 60 Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ile Thr Met Val Arg Gly Ile Ser Gly 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 <210> 66 <211> 436 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 gcatctgtag gagacagagt caccatcact tgccgggcaa gtcagagcat tagtagtcat 60 ttaaattggt atcagcagaa accagggaaa gcccctaagc tcctgatcta tgctgcttcc 120 agtttgcaaa gtggggtccc atcaaggttc agtggcagtg gatctgggac agatttcact 180 ctctccatca gcagtctgca acctgaagat tttgcaactt acttctgtca acagagttac 240 agtatccctc ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcacacgaac tgtggctgca 300 ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 360 gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 420 gccctccaat cgggta 436 <210> 67 <211> 145 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser 1 5 10 15 Ile Ser Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 20 25 30 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 35 40 45 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser 50 55 60 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr Arg 85 90 95 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 100 105 110 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 115 120 125 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 130 135 140 Gly 145 <210> 68 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 cagctgcagc agtcaggtcc aggactggtg aagccctcgc agaccctctc actcacctgt 60 gccatctccg gggacagtgt ctctagcaac agtgctgctt ggaactggat caggcagtcc 120 ccatcgagag gccttgagtg gctgggaagg acatactaca ggtccaagtg gtataatgaa 180 tatgcagtat ctgtgaaaag tcgaatgacc atcaacccag acacatccaa gaaccagttc 240 tccctgcagc tgaactctgt gactcccgag gacacggctg tgtattactg tgcaagagag 300 aggttagggg agttatacgg tatggacgtc tggggccaag ggaccatggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacc 417 <210> 69 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala 20 25 30 Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala Val Ser 50 55 60 Val Lys Ser Arg Met Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Arg Leu Gly Glu Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 <210> 70 <211> 384 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 70 ctgcaagtcc agccagagtg tctttataca gtgtccgaca agaacaactt cttatgttgg 60 taccagcaga aaccaggaca gcctcctaaa ctgctcatgt actgggcatc tatccgggaa 120 tccggggtcc ctgaccgatt cagtggcagc gggtctggga cagatttcac tctcaccatc 180 agcagcctgc aggctgaaga tgtggcagtt tattactgtc agcaatatta tagtactcct 240 cccaccttcg gccaagggac acgactggag attaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 300 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 360 ctgaataact tctatcccag agag 384 <210> 71 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Leu Gln Val Gln Pro Glu Cys Leu Tyr Thr Val Ser Asp Lys Asn Asn 1 5 10 15 Phe Leu Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 20 25 30 Met Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 35 40 45 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 50 55 60 Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro 65 70 75 80 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 85 90 95 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 100 105 110 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 115 120 125 <210> 72 <211> 425 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 72 caggtacagc tgcagcagtc aggtccagga ctggtgaagc cctcgcagac cctctcactc 60 acctgtgcca tctccgggga cagtgtctct agcaacagtg ctgcttggaa ctggatcagg 120 cagtccccat ggagaggcct tgagtggctg ggaaggacat actacaggtc caagtggtat 180 aatgaatatg cagtatctgt gaaaagtcga atgaccatca acccagacac atccaagaac 240 cagttctccc tgcagctgaa ctctgtgact cccgaggaca cggctgtgta ttactgtgca 300 agagagaggt taggggagtt atacggtatg gacgtctggg gccaagggac cacggtcacc 360 gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 accta 425 <210> 73 <211> 141 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Trp Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Glu Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Met Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Leu Gly Glu Leu Tyr Gly Met Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 <210> 74 <211> 487 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n= a, t, c, or g <400> 74 atgcagctga cncagtctcc agactccctg gctgtgtctc tgggcgagag ggccaccatc 60 aactgcaagt ccagccagaa tgttttatac aggtccaaca agaagaactt cttagtttgg 120 taccagcaga aaccaggaca gcctcctaag ctgctcattt actgggcatc tatccgggaa 180 tccggggtcc ctgaccgatt cagtggcagc gggtctggga cagatttcac tctcaccatc 240 agcagcctgc agactgaaga tgtggcagtt tattactgtc agcaatatta tagtactcct 300 cccaccttcg gccaagggac acgactggag attaaacgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggta 487 <210> 75 <211> 162 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Met Gln Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu 1 5 10 15 Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Asn Val Leu Tyr Arg Ser 20 25 30 Asn Lys Lys Asn Phe Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag Tag <400> 76 gattacaagg atgacgacga taag 24 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Control sequence <400> 77 aagggacgaa gacgaacact tctt 24 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control sequence <400> 78 aactgaagac ctgaagacaa taa 23

Claims (46)

  1. PSCA 단백질 (SEQ ID NO: )에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체 또는 그의 단편 (SEQ ID NO: ).
  2. 제1항에 있어서, 항체는 모노클로날 항체인 항체 또는 단편.
  3. 제2항에 있어서, 항체는 ATCC 수탁번호: ______인 항체 또는 단편.
  4. 제2항에 있어서, 항체는 ATCC 수탁번호: ______인 항체 또는 단편.
  5. 제2항에 있어서, 모노클로날 항체는 인간화된 항체인 항체 또는 단편.
  6. 제1항에 있어서, 단편은 Fab, F(ab')2, Fv 또는 Sfv 단편인 항체 또는 단편.
  7. 제1항에 있어서, 항체는 전적으로 인간 항체인 항체 또는 단편.
  8. 제1항에 있어서, 항원 결합 부위는 마우스의 항원 결합 도메인인 항체 또는 단편.
  9. 제1항에 있어서, 재조합적으로 생산된 항체 또는 단편.
  10. 제9항에 있어서, 재조합 단백질은 항원 결합 부위인 항체 또는 단편.
  11. 제1항에 있어서, 항체는 검출가능한 마커, 독소, 치료제 또는 화학요법제와 커플링되는 것인 항체 또는 단편.
  12. 제11항에 있어서, 검출가능한 마커는 방사능 동위원소, 금속 킬레이터, 효소, 형광 화합물, 생체발광 화합물 또는 화학발광 화합물인 것인 항체 또는 단편.
  13. 제12항에 있어서, 방사능 동위원소는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, 또는 Lu를 포함하는 것인 항체 또는 단편.
  14. 제11항에 있어서, 독소는 리신, 리신 A쇄, 독소루비신, 다우노루비신, 메이탄시노이드, 택솔, 에티디움 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파 사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 쿠리 신, 크로틴, 칼리케아마이신, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 글루코코르티코이드, 오리스타틴, 오로마이신, 이트리움, 비스무쓰, 콤브레스타틴, 듀오카르마이신, 돌로스타틴, cc1065 또는 시스플라틴인 것인 항체 또는 단편.
  15. 제1항에 있어서, 항원 결합 부위는 특이적으로 도 2의 단백질의 아미노산 (SEQ ID NO: ) 중의 에피토프인 것인 항체 또는 단편.
  16. 제2항의 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물.
  17. 제2항의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  18. 제2항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드르 포함하는 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 벡터는 중쇄와 경쇄의 가변부를 포함하는 단쇄인 것인 벡터.
  20. 제1항의 항체 또는 단편을 포함하는 인간을 위한 단위 투약 제형으로 된 약학적 조성물.
  21. 생물학적 샘플을 제1항의 항체와 접촉시키고, 샘플 중의 PSCA 단백질 (SEQ ID NO: )의 결합을 검색하는 단계를 포함하여 이루어지는, 생물학적 샘플 중에서 PSCA 단백질의 존재 여부를 검사하는 분석법.
  22. 개체에게 PSCA 단백질 (SEQ ID NO: )와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변부를 함유하는 단쇄 모노클로날 항체를 코딩하는 벡터를 투여함으로써, 그 벡터가 암세포에게 단쇄 모노클로날 항체를 코딩하는 서열을 전달하고 상기 코딩된 단쇄 항체가 세포내에서 발현되도록 하는 것을 포함하여 이루어지는, 개체에 있어서 PSCA (SEQ ID NO: )를 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법.
  23. 제1항의 항체 또는 단편과 컨쥬게이트된 세포독성 제제 또는 진단제를 제공하여 항체 제제 또는 그의 단편 제제 컨쥬게이트를 제공하는 공정; 및
    상기 세포를 항체 제제 또는 그의 단편 제제 컨쥬게이트에 대해 노출시키는 공정
    을 포함하여 이루어지는 PSCA 단백질 (SEQ ID NO: )를 발현하는 세포독성 제제 또는 진단제의 전달 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포독성 제제 또는 진단제는 검출가능한 마커, 독소 및 치료제로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 검출가능한 마커는 방사능 동위원소, 금속 킬레이터, 효소, 형광 화합물, 생체발광 화합물 또는 화학발광 화합물인 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 방사능 동위원소는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 186Re, 211At, 125I, 188Re, 153Sm, 213Bi, 32P, 또는 Lu인 것인 방법.
  27. 제24항에 있어서, 독소는 리신, 리신 A쇄, 독소루비신, 다우노루비신, 메이탄시노이드, 택솔, 에티디움 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 엑소톡신 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A쇄, 모데신 A쇄, 알파 사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레트스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 쿠리신, 크로틴, 칼리케아마이신, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 글루코코르티코이드, 오리스타틴, 오로마이신, 이트리움, 비스무쓰, 콤브레스타틴, 듀오카르마이신, 돌로스타틴, cc1065 또는 시스플라틴인 것인 방법.
  28. 생물학적 샘플에서 PSCA 단백질 (SEQ ID NO: )를 검출하는 방법으로서:
    생물학적 샘플과 대조군 샘플을 제공하는 공정;
    생물학적 샘플과 대조군 샘플을 PSCA 단백질에 특이적으로 결합하는 제1항의 항체와 접촉시키는 공정; 및
    생물학적 샘플과 대조군 샘플 중에 존재하는 기질과 PSCA 단백질 및 항체와의 복합체의 양을 측정하는 공정
    을 포함하여 이루어지는, PSCA 단백질 (SEQ ID NO: )를 검출하는 방법.
  29. 제28항에 있어서:
    표 1에 열거된 암에 걸렸거나 걸린 것으로 추정되는 환자로부터의 대조군 샘플과 생물학적 샘플을 채취하는 공정을 추가로 포함하는 방법.
  30. 도 2에 도시된 단백질을 코딩하는 핵산 또는 그의 서브서열에 대응하는 PSCA siRNA (이중 가닥 RNA)를 함유하는 조성물로서, 상기 서브서열은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 RNA 뉴클레오타이드 길이이고 mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보 및 비상보적인 것인 조성물.
  31. 세포 증식을 조절하는 분자들을 동정하는 방법으로서:
    (a) (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 서열;
    (ii) 도 3에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
    (iii) 도 3에 도시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (iv) (i), (ii), 또는 (iii)의 뉴클레오타이드 서열의 단편
    으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 계에 분자를 도입하거나; 또는 상기 (i), (ii), (iii), 또는 (iv)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 계에게 테스트 분자를 도입하는 공정; 및
    (b) 상기 분자와 상기 핵산 서열 또는 단백질 간의 상호반응의 존재 여부를 측정하는 공정
    을 포함하여 이루어지며, 여기서, 상기 분자 및 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질 간에 상호반응이 존재할 경우 그 분자가 세포 증식을 조절하는 분자인 것으로 동정되는 것인, 세포 증식을 조절하는 분자들을 동정하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 계는 생체내 (in vivo) 계인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 계는 시험관내 (in vitro) 계인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 분자는 (i), (ii), (iii), 또는 (iv)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 분자는 도 2에 도시된 단백질을 코딩하는 핵산에 대응하는 PSCA siRNA (이중 가닥 RNA) 또는 그의 서브서열을 포함하는 조성물이고, 여기서 상기 서브서열은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 RNA 뉴클레오타이드 길이이고 mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보 및 비상보적인 것인 조성물.
  36. 제31항의 방법에 의해 동정된 분자를 암에 걸린 것으로 진단된 개체에게 투여함으로써, 상기 분자로 하여금 상기 개체 내에서 암을 억제 또는 지연시키는 것을 특징으로 하는, 개체에 있어서 암을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 암은 표 1에 제시된 암인 것인 방법.
  38. 표 1에 제시된 암을 치료하기 위한 치료제를 동정하는 방법으로서:
    (a) (i) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오타이드 서열;
    (ii) 도 3에 도시된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
    (iii) 도 3에 도시된 아미노산 서열과 90% 이상 동일한 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    (iv) (i), (ii), 또는 (iii)의 뉴클레오타이드 서열의 단편
    으로 이루어진 군 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는 계에 분자를 도입하거나; 또는 상기 (i), (ii), (iii), 또는 (iv)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질을 포함하는 계에게 테스트 분자를 도입하는 공정; 및
    (b) 상기 분자와 상기 핵산 서열 또는 단백질 간의 상호반응의 존재 여부를 측정하는 공정
    을 포함하여 이루어지며, 여기서, 상기 분자 및 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질 간에 상호반응이 존재할 경우 그 분자는 표 1에 제시된 조직의 암을 치료하는 치료제인 것으로 동정되는 것인, 표 1에 제시된 암을 치료하기 위한 치료제를 동정하는 방법
  39. 제38항에 있어서, 상기 계는 시험관내 (in vitro) 계인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 계는 생체내 (in vivo) 계인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 상기 분자는 (i), (ii), (iii), 또는 (iv)의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 상기 분자는 도 2에 도시된 단백질을 코딩하는 핵산에 대응하는 PSCA siRNA (이중 가닥 RNA) 또는 그의 서브서열을 포함하는 조성물이고, 여기서 상기 서브서열은 길이가 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 인접 RNA 뉴클레오타이드 길이이고 mRNA 코딩 서열의 적어도 일부와 상보 및 비상보적인 것인 조성물.
  43. 제38항의 방법에 의해 동정된 분자를 암에 걸린 것으로 진단된 개체에게 투여함으로써, 상기 분자로 하여금 상기 개체 내에서 암을 억제 또는 지연시키는 것을 특징으로 하는, 개체에 있어서 암을 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 암은 표 1에 제시된 암인 것인 방법.
  45. PSCA (SEQ ID NO: )에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (SEQ ID NO: )의 치료적 유효량과 치료적 유효한 선량의 방사선을 병용하여 치료하는 것을 특징으로 하는 포유동물에 있어서 종양 크기를 감소시키는 방법.
  46. PSCA (SEQ ID NO: )에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 (SEQ ID NO: )와 화학치료제와의 치료적 유효량으로 포유동물을 치료하는 것을 특징으로 하느, 포유동물에 있어서 종양 크기를 감소시키는 방법.
KR1020067027763A 2004-05-28 2006-12-28 Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 항체 및 관련 분자 KR101215611B1 (ko)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/857,484 2004-05-28
USPCT/US2004/017231 2004-05-28
PCT/US2004/017231 WO2005014780A2 (en) 2003-05-30 2004-05-28 Prostate stem cell antigen (psca) variants and subsequences thereof
US10/857,484 US7622564B2 (en) 2003-05-30 2004-05-28 Prostate stem cell antigen (PSCA) variants and subsequences thereof
US61638104P 2004-10-05 2004-10-05
US60/616,381 2004-10-05
US61788104P 2004-10-12 2004-10-12
US60/617,881 2004-10-12
US62131004P 2004-10-21 2004-10-21
US60/621,310 2004-10-21
US63307704P 2004-12-02 2004-12-02
US60/633,077 2004-12-02
US67200005P 2005-04-14 2005-04-14
US60/672,000 2005-04-14
PCT/US2005/017412 WO2005118864A2 (en) 2004-05-28 2005-05-17 Antibodies and related molecules that bind to psca proteins

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117010832A Division KR101282396B1 (ko) 2004-05-28 2005-05-17 Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 암 진단용 항체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070047251A true KR20070047251A (ko) 2007-05-04
KR101215611B1 KR101215611B1 (ko) 2012-12-28

Family

ID=44210117

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117010832A KR101282396B1 (ko) 2004-05-28 2005-05-17 Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 암 진단용 항체
KR1020067027763A KR101215611B1 (ko) 2004-05-28 2006-12-28 Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 항체 및 관련 분자

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117010832A KR101282396B1 (ko) 2004-05-28 2005-05-17 Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 암 진단용 항체

Country Status (6)

Country Link
KR (2) KR101282396B1 (ko)
CN (1) CN102344493B (ko)
BR (3) BRPI0511624B1 (ko)
IL (1) IL214210A (ko)
NO (1) NO341404B1 (ko)
SI (1) SI1753871T1 (ko)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101680896A (zh) 2007-03-27 2010-03-24 伊缪诺维亚公司 检测腺癌的蛋白标志/标记
EP3494996A1 (en) * 2012-08-23 2019-06-12 Agensys, Inc. Antibody drug conjugates (adc) that bind to 158p1d7 proteins
KR20150093834A (ko) * 2012-12-13 2015-08-18 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Ｄｎａ 항체 작제물 및 그 이용 방법
GB201319878D0 (en) * 2013-11-11 2013-12-25 Immunovia Ab Method, Array and use thereof
SG11201604719WA (en) 2013-12-13 2016-07-28 Univ Pennsylvania Dna antibody constructs and method of using same
AU2015355126B9 (en) 2014-12-01 2020-03-26 Inovio Pharmaceuticals, Inc. DNA antibody constructs and method of using same
GB202010970D0 (en) 2020-07-16 2020-09-02 Immunovia Ab Methods, arrays and uses thereof

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2343085B1 (en) * 1997-03-10 2014-12-10 The Regents of The University of California Antibody against prostate stem cell antigen (PSCA)
US6258939B1 (en) * 1997-03-10 2001-07-10 The Regents Of The University Of California PSCA antibodies and hybridomas producing them
US6541212B2 (en) * 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
IL149116A0 (en) * 1999-10-29 2002-11-10 Genentech Inc Anti-prostate stem cell antigen (psca) antibody compositions and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
CN102344493A (zh) 2012-02-08
BRPI0511624A (pt) 2008-01-02
KR101282396B1 (ko) 2013-07-04
NO341404B1 (no) 2017-10-30
IL214210A0 (en) 2011-08-31
BRPI0511624B1 (pt) 2022-02-08
BRPI0520902A2 (pt) 2011-10-25
KR101215611B1 (ko) 2012-12-28
BR122018073034B8 (ko) 2022-10-11
NO20110647L (no) 2006-12-19
BR122018073034B1 (pt) 2021-10-13
CN102344493B (zh) 2014-09-03
BRPI0520902B1 (pt) 2021-11-30
SI1753871T1 (sl) 2016-01-29
KR20110056564A (ko) 2011-05-30
IL214210A (en) 2013-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8013128B2 (en) Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
US8278424B2 (en) Antibodies that bind to PSCA proteins for diagnosis of cancer
US7541442B2 (en) Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
KR101215179B1 (ko) Ｓｔｅａｐ-１ 단백질과 결합하는 항체 및 그로부터 유래된분자
AU2005250370B2 (en) Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
KR101215611B1 (ko) Ｐｓｃａ 단백질에 결합하는 항체 및 관련 분자
AU2006237616B2 (en) Antibodies and related molecules that bind to PSCA proteins
CN1997751B (zh) 结合于psca蛋白的抗体以及相关分子
DK1753871T3 (en) Antibodies and related molecules that bind to psca proteins
NO345322B1 (no) Antistoffer og beslektede molekyler som bindes til PSCA Proteiner

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
A107 Divisional application of patent
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151204

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161207

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171208

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191211

Year of fee payment: 8