KR20070030891A - 세포 배양용 액기상 노출 반응기 - Google Patents

세포 배양용 액기상 노출 반응기 Download PDF

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우웨 마르크스
마르코 리델
힉마트 부슈낙-요스팅
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프로바이오겐 아게
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Abstract

본 발명은 고 농도로 세포를 성장시키고 배양하는 방법 및 장치에 관한 것으로서, 배양용 세포는 중공 필라멘트 박막 내에 위치되고, 액체 영양분 및 기체상태 내에서 교대로 지지된다. 상기 장치는 공급 챔버를 갖는 액기상 노출 바이오 반응기이며, 내부 직경이 5mm 이하인 중공 필라멘트 박막이 위치되고, 내부 체적은 배양 챔버를 형성한다.세포를 배양 챔버 내에 집어 넣은 후, 공급 챔버의 거의 절반은 영양분 매질로 채워지고 나머지 절반은 기체 혼합물로 채워진다. 매체와 기체의 관류로 전환된 후, 중공 필라멘트 박막과 세포를 기체 또는 액체 상태에 주기적으로 노출시키는 것이 시작된다.
배양, 중공 필라멘트 박막, 공급 챔버, 반응기

Description

세포 배양용 액기상 노출 반응기{LIQUID/GAS PHASE EXPOSURE REACTOR FOR CELL CULTIVATION}
본 발명은 고밀도의 세포 성장의 개시 및 세포 배양을 위한 방법 및 장치에 관한 것으로서, 배양되는 세포가 중공-필라멘트 박막 내에 위치되고, 교대로 액체 영양분 매질 및 기체 상태에 이르게 된다.
바이오제약을 합성하기 위한 포유류 세포 배양은 주로 교반 반응기(stirred reactor)에서 작동된다. 지금까지 공기양수 반응기(airlift reactor)는 자주 사용되지 않았고, 포유류 세포에 기초하는 약을 시장에 공급하기 위한 중공 섬유 반응기는 거의 사용되지 않았다. 교반 반응기에서 체적 생성물의 생산을 개선하기 위해, 세포 밀도와 세포의 효율적인 생산 시간은 상기 방법을 최적화하고 유가식(fed-batch) 방법에서 세포 라인에 특정된 영양 양생법(regimen)을 사용함으로써 증가되어 왔다. 생산 기술은 각각 종래의 바이오 반응기보다 대략 다섯 배의 체적 용량을 갖는 세 개 내지 네 개의 교반 반응기를 포함하는 바이오 반응기 트레인으로 설계되어 있다. 현재 포유류 세포를 배양하기 위해 이용할 수 있는 가장 큰 교 반 반응기는 20,000 리터의 체적 용량을 갖고 있다. 교반 반응기 내의 유가식 공정은 튼튼하며, 인용된 체적까지 증가될 수 있고, 오래전에 약 합성에 대한 기관에 의해 허용되었다. 단점은 배양 챔버 내에 생성물이 오랫동안 머무르는 점과, 위에 뜨는 수확물로부터 세포를 분리할 필요가 있다는 점과, 여러 번 사용하는 동안 세척 및 살균에 드는 비용과, 이 기술이 적용되는 설비에 대한 높은 설치비용 및 작동비용이 있다는 점이다.
퇴화되기 쉽기 때문에 합성되는 동안 바이오 반응기에서 짧은 거주 시간(dwell time)이 부과되는 요소 VII와 같은 단백질에 대해, 배양 챔버가 채워져서 교반 반응기의 연속적인 동작이 이루어지게 하는 장치 및 시스템이 개발되었다. 이를 위해, 연속적인 매질 공급과 생성물 수확을 갖는 효율적인 세포 보유(cell retention)가 필요하다. 유체화되거나 정지된 베드 형태의 지지 물질이 생성물 세포가 표면에 부착될 수 있는 트랩 내에서 사용되는 동안, 여기에서 스핀 필터가 교반 반응기의 내부 챔버 내에 사용된다. 또한, 교반 반응기의 연속적인 모드의 작동이 세포 침전, 연속적인 세포 원심, 또는 초음파 세포 수집과 같은 외부 세포 보유 시스템에 의해 달성될 수 있다. 연속적인 작동 모드의 이점은 바이오 반응기 내에서의 짧은 거주 시간과, 합성중 일정한 생성 품질과, 체적 생산성의 증가, 한정되는 수확 시간의 함수로서 배치(batch) 체적의 더 큰 가요성이다. 단점은 잔류 세포를 갖는 수확물의 오염과, 여러 번 사용하는 동안 발생 되는 세척 및 살균 비용과, 대응하는 설비에 대한 높은 투자비용 및 작동비용이다.
바이오 제약의 합성에 대해 효과적이라고 입증된 ACUSYST® X CELL Generation이라는 중공 섬유 바이오 반응기 외에도, 세포와 접촉하게 되는 모든 요소가 처분할 수 있는 요소로 설계되는 다른 반응기 시스템이 이용가능하다. 따라서, 이들은 배치를 합성하는데 일단 사용되면 버려질 수 있다. 비싼 세척 및 살균 절차가 필요하지 않다. Cell-Pharm®, Cellmax®, Technomouse®, CELLine®, miniPERM®, OptiCell®과 같은, 이러한 형태의 상업적으로 이용가능한 시스템은 박막-기초 시스템이다. 박막-기초 방법은 몇 가지 이점을 갖고 있다. 관류(perfusion) 작업시, 이 방법은 단위 체적당 큰 박막 표면에 의해 매우 높은 세포 밀도(107-108 세포/ml)를 달성할 수 있다. 또한, 세포는 박막에 의해 전단력으로부터 보호된다. 대체로, 이 방법들은 한번 사용하도록 설계되며, 따라서 사용 후에 반드시 세척 및 살균할 필요가 없다. 쓰고 버릴 수 있는 바이오 반응기 기술에서, 또한 웨이브 바이오 반응기는 지금까지 바이오 제약의 합성용 시험 상태에서 효과적이라고 입증되었다. 이 시스템에서, 세포는 밀접하게 결합된 혼합을 향상시키기 위해 시스템적으로 교반되는 백 시스템(bag system)에서 배양된다. 이 반응기 기술의 이점 중 하나는 배양 시스템을 한 번 사용할 수 있다는 것이다. 단점은 달성할 수 있는 밀도가 낮고, 규모의 증가(scale-up) 능력이 제한되어 있다는 것이다.
인용되는 모든 방법 및 장치에서, 균일한 영양분 공급과 특히 높은 세포 밀도에서의 산소 공급이 문제가 된다. 가압과 관련된 복잡한 처리 단계에 의해 이러 한 문제를 해결하려는 시도(1989, 미국특허 4804628 A)도, 추가의 박막 시스템에 의해 세포 배양 챔버 내로 산소를 직접 도입하는 것(1986, 독일 특허 2431450 A1 및 1995, 독일특허 4230194 A1)도, 스케일이 원하는 대로 증가될 수 있고 세포가 균일하게 공급될 수 있는 배양 시스템에 이르지 못하였다. 세포가 중공 섬유와 영양분 사이에서 배양되고 영양분이 섬유의 루멘 내에서 전송되는 중공 섬유 바이오 반응기에서, 규모의 증가는 제한된다. 그러나, 중공 섬유로부터 산소를 소비함으로써 중공 섬유의 길이는 제한된다. 따라서, 규모의 증가는 평행하는 장치를 사용하는 것에 의해서만 가능하다. 그러나 실제로 이는 이익이 되지 않는 공정에 이르게 된다. 즉, 중공 섬유 반응기의 규모 증가 능력은 신선한 기체 및 액체 영양분 요소를 갖는 세포를 적절히 균질로 공급하는 것이 결여됨으로써 좌절된다.
국제특허출원 WO 03/064586 A2에서, 세포가 매우 높은 밀도로 격실에서 배양되고, 상기 격실의 크기는 그 길이가 5mm 를 넘지 않도록 제안되었다. 격실의 내부 챔버는 배양 챔버를 형성하고, 이 챔버는 반투과 요소에 의해 공급 챔버와 분리된다. 세포는 격실에 보유되고, 산소 교환은 중공 섬유 박막에 의해 발생한다. 세포에 영양분과 산소를 공급하는 것은 다양하게 조절할 수 있는 기체와 세포 배양 매질의 혼합에 의해 보장된다. 배양 장치 및 방법은 영양분과 산소의 공급 문제를 해결하고 규모 증가 능력을 보장한다 할지라도, WO 03/064586 A2에 기재된 방법은 고 밀도의 세포가 격실에 집어 넣어져야만 하는 단점을 겪고 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 국제특허출원 WO 03/102123 A2에서 생분해될 수 있는 겔(gel)이 세포 배양의 시작단계에서 접종(inoculation) 밀도를 감소시키는데 사용되는 것이 제시 되고 있다.
액기상(liquid-gas-phase) 노출 바이오 반응기는 주식회사 Zellwerk®에 의해 개발되어 왔고, 주식회사 Sartorius®에 의해 판매되고 있다. 이 바이오 반응기에서, 표면에 붙어 있는 세포는 캐리어 재료의 디스크에 고정되어 있다. 디스크는 축에 일렬로 배치되어 있고, 반은 매질로 채워지고 반은 기체로 채워진 실린더 내에서 회전된다. 이러한 장치의 이점은 세포를 양 상태에 주기적으로 노출시키는 것이다. 단점은 시스템 및 방법을 세포를 부착하는 것으로 제한하는 것과, 수확 유체 내에 분리된 세포가 존재하는 것과, 규모 증가 능력을 제한하는 것이다.
본 발명의 목적은 WO 03/064586 A2에 기재된 방법을 더욱 개선하는 것이다.
본 발명의 목적은 청구범위에 특정된 것과 같이 달성되었다. 본 발명에 의하여, 세포의 최초 성장 및 배양은 5mm 이하의 내부 직경을 갖는 중공 필라멘트 박막에 배치되어 있고 내부 체적이 배양 격실을 형성하는 공급 챔버를 포함하는 액기상 노출 바이오 반응기 내에서 착수된다. 아래와 같은 공정 단계가 발생한다:
≫ 세포를 배양 격실에 삽입하는 단계
≫ 공급 챔버의 거의 절반은 영양분 매질로 나머지 절반은 기체 혼합물로 채우는 단계
≫ 동시에 또는 별도로 매질 및 기체를 관류시키는 단계
≫ 중공 필라멘트 박막과 기체 또는 액체의 상태로 내부에 포함된 세포를 주기적으로 노출하는 단계
본 발명의 방법에 따른 다른 바람직한 실시예에 의하면, 중공 필라멘트 박막은 바이오 반응기에서 수평으로 방향이 설정된다. 반응기가 채워진 후, 박막의 절반은 영양분 매질로 덮힌다. 반응기를 한쪽 방향으로 그리고나서 반대 방향으로 360도 회전시킴으로써, 중공 필라멘트 박막과 기체 또는 액체 상태에 있는 세포를 주기적으로 노출시키는 것이 이루어진다.
한쪽 방향으로 회전시키고 난 후 반대 방향으로 회전시킴으로써 반응기에 연결된 튜브는 뒤틀리지 않게 된다.
본 발명에 의하면, 상기 회전은 기체 및 액체 상태로 동일한 노출 시간을 달성하기 위해 180도 이후 특정 시간 동안 정지된다. 고정 시간은 가변적으로 조절될 수 있다. 따라서, 세포에 액체 영양분 매질 내에서 박막의 거주 시간 동안 영양분이 충분히 공급될 수 있고, 기체 상태로 거주 시간 동안 산소가 충분히 공급될 수 있다. 고정 시간을 변형시킴으로써, 동시에 각각의 세포 라인의 신진 대사 요구사항에 적응할 수 있다.
또는, 중공 필라멘트 박막을 영양분 매질에 담그고 그 후 상기 박막을 들어올려 기체 상태에 있도록 함으로써 중공 필라멘트 박막을 주기적으로 노출시키는 것이 이루어질 수 있다. 세포의 두 가지 상태의 상이한 거주 시간은 이러한 절차에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 방법을 구현하기 위해, 저 밀도의 세포가 밀도의 세포로 성장하자마자, 저 밀도의 세포는 우선 배양 챔버 내로 집어 넣어진다. 국제특허출원 WO 03/102123 A2에 기재된 바와 같이 겔을 사용함으로써, 고율의 글루타민 함유량을 갖는 교차 결합된 폴리펩티드의 겔 및/또는 점성 유체 또는 미세한 겔 파편으로 구성된 유체의 반고체 매질과 함께, 가장 낮은 밀도의 세포를 배양 챔버 내에 집어 넣을 수 있다.
세포는 공급 챔버 외부에서 중앙 충전 시스템에 의해 격실에 넣어지고, 따라서 하나의 포트를 통해 세포를 모든 격실에 동시에 그리고 균일하게 입력하는 것이 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은 단세포 동물, 박테리아, 효모, 곰팡이 및 식물 또는 포유류 세포를 배양하는데 적합하다.
본 발명은 국제특허출원 WO 03/064586 A2에 기술된 방법과 비교할 때 신규한 것이다. 왜냐하면, 상기 국제특허출원에는 두 개의 상이한 상태로 세포를 노출시키는 것이 제공되지 않고 단지 가변적으로 조절할 수 있는 기체 및 세포 배양 매질의 혼합물 내의 세포를 노출시키기만 하기 때문이다. 또한, 반응기 또는 박막이 움직이는 것도 기술되어 있지 않다. 세포를 포함하는 박막이 특정 시간 동안 대응하는 상태로 움직일 수 있다는 것에 대한 어떠한 힌트도 국제특허출원 WO 03/064586 A2로부터 얻을 수 없다. 이는 상기 인용된 공보에서 가변적으로 조절할 수 있는 기체 및 세포 배양 매질의 혼합물을 생성하는 장치가 필요하고, 따라서 박막의 움직임 특히 회전에 의한 움직임은 연결부와 관련하여 더 복잡한 설비를 필요로 할 것이라는 사실에 기초한다.
본 발명의 장치는 실린더의 길이방향 축에 평행하게 5mm 이하의 내부 직경을 갖는 쉘-중합의 세포-보유 미세 필터링 중공 필라멘트 박막이 단부판에 고정되고, 내부 체적부가 배양 격실을 형성하고, 상기 배양 격실에 배양될 세포가 배치되는, 기체와 매질로 각각 채워질 수 있는 원통형 또는 구형 2상 공급 챔버로서, 상기 공급 챔버는 기체 혼합물이 통과할 수 있는 기체 상태와 배양 매질이 통과할 수 있는 액체 상태를 포함하고, 각각의 중공 필라멘트 박막은 실린더 길이부 전체에서 이웃하는 중공 필라멘트 박막에 대해 적어도 0.5mm의 간격을 갖고, 상기 중공 필라멘트 박막은 실린더의 길이방향 축을 따라 가상의 단면에 대해 대칭적으로 배치되어 있고, 실린더의 길이방향 축을 따라 가상의 단면에는 박막이 배치되어 있지 않은 2상 공급 챔버로 구성되어 있다.
상기 박막은 모든 물질에 대해 투과성이 있지만 모든 세포에 대해서는 그렇지 않다. 격실의 총 체적으로 구성된 배양 챔버는 공급 챔버와 박막에 의해 분할된다. 이로써 공급 물질은 배양 챔버 내로 통과될 수 있고 세포를 공급할 수 있게 된다. 또한, 이러한 분할 시스템은 생성물이 세포 격실을 나와서 공급 환경으로 들어가도록 한다.
박막은 폴리술폰, 폴리에테르 술폰, 또는 폴리카보네이트와 같은 중합체로 구성된다. 생체적합성 물질인 폴리에테르 술폰으로 구성되고 또한 300㎛ 이하의 벽두께와 6m3/m2*h*bar의 물 투과성과 0.1 내지 1.0㎛ 의 세공 직경을 갖는 중공 필라멘트 박막은 매우 적합한 것으로 입증되었다.
액체 필름이 형성되는 것을 방지하고 따라서 박막이 기체 상태로 균일하게 노출되도록, 박막은 서로에 대해 최소의 간격을 갖는다.
박막은 바람직하게 6각형 배열로 배치된다. 이것은 외주부에 위치된 것을 제외한 모든 박막이 중앙 박막에 대해 동일한 간격을 갖는 6개의 박막으로 둘러싸이는 것을 의미한다. 따라서 공급 챔버 내에서 가장 균일한 패킹 농도가 보장된다. 또한 간격을 줄이는 장치가 필요 없다.
중공 필라멘트 박막은 실제로는 상태의 경계를 나타내는 실린더의 회전축을 따라 가상의 단면에 대해 대칭적으로 배열되어 있다. 어떠한 박막도 실린더의 회전축을 따라 가상의 단면에 위치되어 있지 않다. 이런식으로, 유지 시간 동안, 모든 박막은 완전히 기체 상태에 있거나 완전히 액체 상태에 있는 것이 보장된다.
WO 03/064586 A2에는 2상 작동이 제공되지 않기 때문에, 본 발명의 장치는 WO 03/064586 A2에 기재된 장치와 비교할 때 새로운 것이다. 또한, 기체 및 매질의 혼합물을 생성하기 위한 또는 기체 및 매질의 소비된 혼합물로부터 액체를 수집하기 위한 어떤 특별한 장치가 필요하지 않다.
기체를 투입하고 제거하기 위해, 실린더의 모든 단부판은 각각 가상의 단면 상하부에 배치된 적어도 두 개의 포트를 포함하고, 따라서 심지어 회전축을 중심으로 실린더가 회전되는 동안에도 기체를 연속적으로 공급되는 것이 보장된다.
또한, 매질의 관류를 위한 적어도 하나의 튜브 포트와 살포 세포를 배양 챔버 내에 넣기 위한 적어도 하나의 입구가 헤드 표면에 배치되어 있다.
또한, 장치가 장착되고 회전되도록 장치는 구동 모터와 프레임 뿐만 아니라 튜브, 기체 가습기, 기체 라인 내의 매질 트랩, 생성물 수확 라인 내의 초여과 장치, 하드웨어 장치, 펌프, 측정 및 제어 장치를 포함한다.
생성물 수확 라인 내의 초여과 장치의 목적은 각각의 생성물을 농축하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명의 장치에 의해 WO 03/064586 A2 보다 더 높은 세포의 농도와 더 높은 세포 생성물의 산출이 이루어질 수 있다는 것이 발견되었다. 이것은 한편으로는 간격을 최적으로 이용한 것에 기인하고 다른 한편으로는 두 개의 상태로 중공 필라멘트 박막을 주기적으로 노출시킴으로써 세포의 공급을 개선한 것에 기인한다.
또는, 기체 공급용 포트는 가상의 단면 상하부에서 헤드 표면이 아니라 실린더 쉘에 장착된다.
본 발명의 장치는, 고 농도로 세포를 배양하고, 세포 생성물, 세포 구성물질, 바이러스, 단백질 또는 진단 및 탐색 시약 뿐만 아니라 약과 같은 저 분자량 물질을 회복하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 특징은 청구범위 및 상세한 설명으로부터 나오며, 각각의 특징 및 결합한 형태의 다수의 특징 모두는 본 명세서와 함께 보호되는 바람직한 실시예를 나타낸다.
본 발명의 내용은 공지의 요소(박막으로 배양 챔버와 공급 챔버를 분할)를 조합한 것을 포함하고, 또한 새로운 요소(공급 챔버 내에 박막을 배치하고, 각각 기체 상태와 액체 상태로 세포를 교대로 노출시키는 것)도 포함하며, 새로운 요소는 서로에 대해 상호적으로 영향을 미치고 전반적인 효과로서 사용시 유리하게 되고 원하는 결과를 얻게 되고, 이는 고 농도로 세포를 연속적으로 효과적으로 배양할 수 있는 능력과 세포를 동시에 보유함으로써 세포로부터 생성물을 회복할 수 있는 능력이 이루어지는 사실로부터 존재하는 것이다.
본 발명 및 그 기능은 이하 도면을 참고하여 설명될 것이다. 도면은 단지 이해를 돕기 위한 것이지, 청구범위가 구현되는 유일한 구성으로 이해되어서는 안 된다.
도 1은 바이오 반응기 시스템의 개략도.
도 2는 원통형 두 상태 공급 챔버의 길이방향 단면도.
도 3은 공급 챔버의 단부판의 평면도.
[주요 도면부호]
1 공급 단부판 11 세포 분배 챔버
2 배출 단부판 12 원통형 공급 챔버
3, 4 기체 공급 및 제거용 포트 13 기체 혼합 스테이션
5 기체 상태 14 기체 가습기
6 액체 상태 15 매질 트랩
7 상태 경계부 16 오염 트랩
8 매질용 입구(중앙 포트) 17, 19, 21 펌프
9 생성물 배출용 중앙 포트 22 초여과 모듈
10 배양 챔버용 포트 23 회전 장치
도 1은 바이오 반응기 시스템의 개략도이다.
도 1은 원통형 공급 챔버(12)에 기초하는 바이오 반응기의 한 예를 나타낸다. 실제 치수는 아니지만 실제 숫자로 된 공급 챔버 내에 배치된 중공 필라멘트 배양 격실의 장치가 공급 챔버 내에 검은색 라인으로 표현되어 있다. 운동방향이 적절한 리듬으로 주기적으로 번갈아 일어나도록 원통형 관(vessel)은 회전 장치(23)에 의해 구동된다. 공급 챔버를 통과하는 기체 상태의 흐름은 기체 라인에 의해 보장되고, 이 기체 라인은 실린더 내로 기체를 공급하는 기체 가습기(14)와 기체-혼합 스테이션(13) 및 실린더 밖으로 기체를 배출하기 위한 불순물 트랩(16)과 매질 트랩(15)으로 구성되어 있다. 실린더를 통과하는 액체 상태의 흐름은 매질 라인에 의해 보장되며, 이 매질 라인은 매질 공급용 펌프(17)와 매질 저장실 및 실린더로부터 배출시키기 위한 생성물-수집관(20) 및 펌프(19)로 구성되어 있다. 또한, 산소와 pH(수소이온농도) 및 온도를 측정하는 측정-센서 트레인(18)이 상기 배출 라인에 결합된다. 펌프(21)와 초여과(ultrafiltration) 모듈(22)을 포함하는 순환부는 생성물 수집관(20) 내에 생성물을 농축시키는 생성물 수집관에 연결된다. 생성물이 없는 여과액은 이러한 초여과 모듈의 바닥부에서 배출되고, 농축된 생성물이 수집관으로 재순환되는 동안 버려진다. 바람직하게, 기체 혼합 스테이션의 포 트로 시작하는, 바이오 반응기 시스템의 모든 요소는 간단히 처분될 수 있는 물질이다.
도 2는 원통형 2상 공급 챔버의 길이방향 단면도이다.
반응기가 작동되는 동안, 원통형 공급 챔버(12)는 상부에 기체 상태(5)를 그리고 하부에 액체 상태(6)를 포함하고 있고, 이 두 상태는 상태 경계부(7)를 형성한다. 좌측에서, 공급 챔버는 기체 및 매질을 공급하는 단부판(1)에 의해 종결되고, 우측에서, 배출용 단부판(2)에 의해 종결된다. 기체는 단부판 내의 포트(3, 4)를 통과한다. 매질의 전송은 각 단부판에서 실린더의 회전축에 위치된 중앙 포트(8, 9)를 통해 일어난다. 세포에 대한 각각의 배양 격실은 동일한 중공 필라멘트 박막으로서 설계되고, 평행하는 검은 라인에 의해 공급 챔버 내에 표현되어 있다. 세포 현탁액(suspension)의 투입은 단부판에서 검은 실선으로 도시된 포트(10)에 의해 기체 및 매질 공급과 별개로 발생한다. 중공 필라멘트 박막 내에 세포를 균일하게 뿌리기 위해, 포트는 세포 배분 챔버(11)로 종결되며, 이 챔버는 각각의 모든 중공 필라멘트 박막의 내부 공간과 연통한다.
도 3은 공급 챔버의 단부판의 평면도이다.
공급 단부판(1)의 평면도에는, 작은 원으로 도시된 기체에 대한 그리고 매질을 공급 챔버 내로 집어넣는 입구(8)로 사용되는 장치 중 하나가 도시되어 있다. 배출 단부판(2)의 평면도는 생성물을 배출하는 중앙 포트(9)와 기체 배출 포트로 사용되는 장치를 도시하고 있고, 상기 기체 배출 포트는 작은 원으로 도시되어 있다. 이 실시예에서, 세포 현탁액을 뿌리기 위한 검은색 점으로 표시된 네 개의 포 트는 두 단부판의 각각에 결합 되어있고, 이 단부판은 결합된 튜브의 연결에 의해 채워질 수 있다.
본 발명은 실제 실시예에 의해 설명될 것이며, 이 실시예에 제한되지는 않는다.
실제 실시예:
실시예 1: 고 농도의 세포
두 바이오 반응기 시스템은 도 1에 도시된 도면에 따라 구성된다. 원통형 공급 챔버는 14 리터의 총 체적 용량을 갖고 있었다. 이 공정이 진행되는 동안, 액체 상태는 7 리터를 포함하였다. 양 경우에, 각각 길이가 500mm인 144개의 중공 필라멘트 박막은 공급 챔버 내에서 축방향으로 대칭인 배열로 배치되었다. 단부판 내의 살포 포트를 통해 0.002%의 부가된 인간 혈청 알부민을 포함하는 PBG1.0 염기성 매질 내의 고농도 세포와 함께, 중공 필라멘트 박막의 내부 공간에 세포를 뿌리는 것이 발생된다. 세포 라인은 인간 단백질을 생성하고, 이 단백질은 일단계 색층분석법에 의해 위에 뜨는 배양조직과 격리될 수 있고 그 내용물에 대하여 정확히 분석된다. 배양기간은 10일 내지 23일 이었다. 이 기간에 대해서, 공기와 5%의 CO2의 혼합물이 공급 챔버의 기체 상태를 통해 연속적으로 통과되었다. 전부, 작동중에 세포를 공급하도록 10일 동안 11리터 그리고 23일 동안 24리터에 해당하는 양이 사용되었다. 실험이 진행되는 동안, 액체 상태 및 기체 상태 노출 사이클은 상이 바뀌는 사이에서 각각 30초이었다. 배양이 종결된 후에, 세포는 살포 포트를 통해 중공 필라멘트 박막으로부터 수확되었고, 세포의 농도와 생존 능력이 측정되었다. 단백질은 세포가 없는 생성물의 수확물의 분별물(aliquot)로부터 격리되었고 그 내용물이 분석되었다.
다음 테이블은 중공 필라멘트 배양 격실에서 얻은 세포 농도와 생존 가능성을 보여준다.
바이오 반응기 작동 1(10일) 바이오 반응기 작동 2(23일)
접종물 내의 총 세포수 [배양 챔버의 ml 당 세포] 1.5E7 1.8E7
접종물의 생존 가능성 67 80
수확물의 총 세포수 2.4E7 2.25E7
수확물의 생존 가능성 54 29
단백질의 총량(mg) 48 168
높은 세포 농도가 이 시스템에서 성공적으로 달성되었다. 또한, 이 공정 중에 48mg 및 168mg의 단백질 형성되었고, 위에 뜨는 세포가 없는 배양물로부터 대응하는 생성물 수집관 내로 수집되었다.
실시예 2: 저 농도의 세포
200mm의 길이로 깍인 각각 12개의 중공 필라멘트 박막을 포함하는 두 개의 2상 노출 반응기 내에서 접종을 위해 배양 챔버당 1.3E5 개의 살아있는 세포 농도를 갖는 세포가 사용되었고, 양 플라스틱 반응기가 회전되는 동안 4일 동안 배양되었다. 접종 전에, 세포는 HSA의 미세한 겔 파편과 혼합되었다. 매질 교환은 불연속적으로 실행되었다. 글루코오스 소비를 통해 신진대사 활동상태가 측정되었다. 작업이 완료된 후, 내부에 포함된 세포와 함께 겔을 수확함으로써 그리고 트리판 블루(Trypan Blue)를 통해 계산함으로써 세포 농도가 측정되었다. 짧은 배양기간 내에, 세포를 배양 챔버의 밀리미터 당 6E5 개의 살아있는 세포까지(4.6배) 그리고 배양 챔버의 밀리미터당 5E5 개의 살아있는 세포까지(3.8배) 늘리는 것이 성공적으로 이루어졌다.
실시예 3: 바이오 반응기 시스템의 작용 원리
바이오 반응기의 공급 원리는 세포를 매질 내에서 그리고 기체 혼합물 내에서 노출시켜서 종래의 시스템과 비교하여 세포에 산소를 공급하는 것을 개선할 수 있게 하는 것에 기초하고 있다.
실시예 4: 시스템의 구성
바이오 반응기의 핵심 부품은 수평으로 장착된 원통형 플라스틱 반응기이다. 이 관 내에, 도 2에 도시된 것처럼 중공 필라멘트 박막이 회전축에 평행하게 길이부에 걸쳐 고정된다. 이로써, 박막에 의해 서로 분리된 두 개의 챔버가 실린더 내에 생성된다. 하나는 중공 필라멘트 박막을 둘러싸는 공급 챔버이며, 액체 상태 및 기체 상태로 구성된다. 이 두 상태 사이의 경계부가 도 2 및 도 3에 도시되어 있다. 다른 하나는 각각의 중공 필라멘트 박막 내부에 있는 공간이다. 중공 필라멘트 내부 공간을 모두 합한 것은 세포에 대한 배양 챔버를 나타낸다. 회전축을 중심으로 대칭으로 배치된 중공 필라멘트 박막의 수에 의해, 시스템은 배양 챔버의 조건에 따라 어떤 요구되는 크기로 규모가 증가될 수 있다. 두 개의 챔버는 별개의 입구를 갖고 있고, 서로 분리되어 있다. 공급 챔버와 배양 챔버 사이의 유일한 연결통로가 박막의 세공에 의해 표현되어 있다. 바람직하게 밀리리터당 0.1 내지 1.0 ㎍으로 된 세공의 직경으로, 이러한 세공은 작은 분자 및 단백질에 대해 투과성이 있지만, 세포에 대해서는 그렇지 않다. 도 1에 도시되고 인용된 전반적인 장치는 기체 및 액체가 시스템을 통해 연속적으로 통과될 수 있게 한다.
또한 바이오 반응기 시스템은 측정 장치 및 제어 장치 뿐만 아니라 이동식 하드웨어 장치와 펌프 및 압축기를 포함한다. 또한, 이 장치는 플라스틱 반응기가 장착되고 회전되도록 하는 회전 장치와 구동 모터를 포함한다.
실시예 5: 작동 원리
회전 장치에 의해, 플라스틱 반응기는 각각의 세포 라인에 적용될 수 있는 회전 주기로 회전 축을 중심으로 회전된다. 이러한 회전 주기는 바람직하게 바이오 반응기의 전체 작동 시간에 대해서 방해를 받지 않고 반복된다. 회전 주기의 8개의 상태가 아래에 예를 들어 열거되어 있다.
상태: 우측으로 180도 회전
상태: 고정기간
상태: 우측으로 180도 회전
상태: 고정기간
상태: 좌측으로 180도 회전
상태: 고정기간
상태: 좌측으로 180도 회전
상태: 고정기간
회전 주기에 의해서, 반응기는 한쪽 방향으로 한 번의 완전한 회전을 수행하고 반대방향으로 한 번의 완전한 회전을 수행하여, 다시 최초의 시작 지점에 배치되게 된다. 회전 방향을 교대로 일어나게 함으로써 매질과 기체가 포트를 통과하게 되고, 이 포트는 반응기 내에 통합되어 고정되고 이 포트에 플라스틱 튜브가 고정된다. 대다수의 포유류 세포 바이오 반응기와 비교하여, 시스템은 임펠러 축 또는 매질 및 기체 공급 튜브와 같은 살균 공급 또는 배양 영역 내로 투입되는 이동식 구성요소 없이 효율적으로 작동한다. 따라서 관련된 오염의 위험은 존재하지 않고, 예를 들어 이중 회전 기계적 밀봉에 의해 대응하는 연마 표면을 보호하기 위한 비용이 초래되지 않는다.
작동의 각각의 시스템의 구성 및 모드는 동시에, 모든 중공 필라멘트 박막이 시스템 내의 박막의 수에 상관없이 바이오 반응기의 전체 작동 시간 동안 양 상태에서 동일한 노출 조건에 지배되도록 보장한다. 기체 상태에서의 노출은 주로 산소의 공급을 성취하는 반면, 액체 상태의 노출은 주로 용해된 영양분의 섭취와 신진대사 생성물의 배출을 달성한다. 영양분 매질과 기체 혼합물 모두는 연속적으로 공급될 수 있다.
장점과 새로운 특징:
쓰고 버릴 수 있는 물품으로서 통합된 세포 보유 시스템을 갖는 반응기
박막은 단백질에 대해 투과되어, 세포가 없는 수확을 허용한다.
시스템 내의 모든 중공 필라멘트 박막에 대해 동일한 노출 조건
기체 상태로 노출되는 동안 산소용의 짧은 확산 경로
반응기의 길이부 전체에 대해 기울기가 없는 노출 반응기의 기체 상태의 형성
단부 캡에 분포되어 있고 심지어 회전하는 동안에도 연속적으로 기체가 통과 할 수 있게 하는 다수의 기체 포트
정의:
고 농도의 세포: 높은 세포 농도를 갖는 배양과정은 배양 챔버의 밀리미터당 1E7개의 세포 보다 큰 세포 밀도에서 달성된다.
저 농도의 세포: 배양 챔버 내의 세포 밀도가 배양 챔버의 밀리미터당 1E4 내지 1E7개 사이에 있을 때 달성된다.
최저 농도의 세포: 최저 세포 농도를 갖는 배양과정은 배양 챔버의 밀리미터당 1E4개의 세포 보다 더 낮은 밀도에서 달성된다.
영양분 매질: 영양분 매질은 글루코오스, 아미노산, 및 트레이스 요소와 같은 세포의 필수적인 영양분을 포함하는 수성 용액이다.
기체 혼합물: 여기에서 사용되는 의미의 범위 내에서, 기체 혼합물은 바람직하게 가변적인 혼합비를 갖는 공기와 이산화탄소의 혼합물을 나타낸다. 또한, 기체 혼합물의 의미는 질소, 산소, 및 CO2의 가변적인 혼합비율을 포함한다.

Claims (18)

  1. 5 밀리미터 이하의 내부 직경을 갖고 내부 체적이 배양 격실을 형성하는 중공 필라멘트 박막이 배치되는 공급 챔버를 포함하는 액기상 노출 바이오 반응기 내에서 세포의 성장 및 배양을 개시하는 방법에 있어서,
    - 배양 격실 내로 세포를 집어넣는 단계와;
    - 공급 챔버의 절반은 영양분 매질로 채우고 나머지 절반은 기체 혼합물로 채우는 단계와;
    - 매질과 기체를 동시에 또는 별도로 관류시키는 단계와;
    - 기체 또는 액체 상태로 내부에 담겨 있는 세포와 중공 필라멘트 박막을 주기적으로 노출시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 중공 필라멘트 박막은 수평으로 배향되고, 상기 반응기가 채워진 후 박막의 절반은 영양분 매질로 덮히고, 한쪽 방향으로 그리고 나서 반대 방향으로 반응기를 360˚회전시킴으로써 상기 중공 필라멘트 박막의 주기적인 노출이 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    각각의 중공 필라멘트 박막이 기체 상태와 동일한 시간을 액체 상태에서 소 비하도록, 상기 회전은 가변적으로 조절가능한 대기 시간에 의해 서로 구별되는 두 개의 180˚ 스텝으로 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 주기적인 노출은 중공 필라멘트 박막을 영양분 매질에 담그고 그 후 중공 필라멘트 박막을 들어올려 기체 상태에 있게 함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    저 농도의 세포가 배양 챔버 내에 넣어지고 고 농도의 세포로 성장하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    가장 낮은 세포 농도를 갖는 세포가, 높은 글루타민 함유량을 갖는 교차 결합된 폴리펩티드의 겔 및/또는 점성 유체 내지 미세한 겔 파편으로 구성된 유체의 반고체 매질과 함께, 배양 챔버 내에 넣어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 단세포 동물, 박테리아, 효모, 곰팡이 및 식물 또는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 공급 챔버의 외부에서 중앙 충전 시스템에 의해 격실 내로 넣어지고, 모든 격실 내에 세포를 동시에 투입하는 것은 하나의 포트를 통해 이루어질 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 실린더의 길이방향 축에 평행하게 5mm 이하의 내부 직경을 갖는 쉘-중합의 세포-보유 미세 필터링 중공 필라멘트 박막이 단부판에 고정되고, 내부 체적부가 배양 격실을 형성하고, 상기 배양 격실에 배양될 세포가 배치되는, 기체와 매질로 각각 채워질 수 있는 원통형 또는 구형의 2상 공급 챔버 내에서 세포의 성장 및 배양을 개시하는 장치에 있어서,
    - 상기 공급 챔버는 기체 혼합물이 통과할 수 있는 기체 상태와 배양 매질이 통과할 수 있는 액체 상태를 포함하고;
    - 각각의 중공 필라멘트 박막은 실린더 길이부에서 이웃하는 중공 필라멘트 박막에 대해 적어도 0.5mm의 간격을 갖고;
    - 상기 중공 필라멘트 박막은 실린더의 길이방향 축을 따라 가상의 단면에 대해 대칭적으로 배치되어 있고;
    - 실린더의 길이방향 축을 따라 가상의 단면에는 박막이 배치되어 있지 않는; 것을 특징으로 하는 장치.
  10. 제9항에 있어서,
    기체를 투입하고 제거하기 위해, 실린더의 모든 단부판은 적어도 두 개의 포트를 포함하고, 상기 포트는 각각 가상의 단면 상하부에 배치되어 있어, 상기 중공 필라멘트 박막을 포함하는 공급 챔버가 매질과 기체를 공급하는 동안 길이방향 축을 중심으로 회전될 수 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    기체를 공급하는 상기 포트는 가상의 단면 상하부에서 헤드 표면이 아닌 실린더 쉘에 장착되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 중공 필라멘트 박막은 300㎛ 이하의 벽두께와, 6m3/m2*h*bar 이상의 물 투과성과, 0.1 내지 1㎛의 세공 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 장치.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 박막은 공급 챔버 내에 6각형 배열로 배치되는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제9항에 있어서,
    매질의 관류를 위한 적어도 하나의 튜브 포트와 배양 챔버에 대한 적어도 하나의 입구가 헤드 표면에 배치되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 장치가 장착되고 회전되도록, 구동 모터와 프레임 뿐만 아니라 튜브와, 기체 가습기와, 기체 라인 내의 매질 트랩과, 생성물 수확 라인 내의 초여과 장치와, 하드웨어 장치와, 펌프와, 압축기와, 측정 및 제어 장치를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 장치를, 고 농도로 세포를 배양하고, 세포 생성물, 세포 구성물질, 바이러스, 단백질 또는 낮은 분자량 물질을 회복하는데 사용하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    약을 회복하는데 사용하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    진단 시약의 합성에 사용하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115093943A (zh) * 2022-06-09 2022-09-23 辽宁工程技术大学 一种离心撞击法生物气溶胶富集装置及其细胞暴露与应用

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