KR20070024649A - 신규한 배열을 가진 ｈｃｖ ｒｎａ - Google Patents

Abstract

C형 간염 바이러스의 코어 단백으로부터 NS2 단백을 코드하는 유전자의 일부의 영역을 번역틀을 유지하면서 결실된 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자.

특히, 상기 유전자의 일부의 영역이 적어도 E1 단백 및 E2 단백을 코드하는 영역에 존재하는 유전자.

C형 간염 바이러스 유전자

Description

신규한 배열을 가진 ＨＣＶ ＲＮＡ{HCV RNA HAVING NOVEL SEQUENCE}

본 발명은 C형 만성 간염 바이러스 (이하,「HCV」라고 약기한다)의 게놈에 관한 것이다.

HCV는 C형 만성 간염의 원인 인자로서, WHO의 통계에 의하면 세계에서 1.7억명의 감염자가 있는 것으로 추정되고 있다. HCV는 다른 바이러스성 간염과 달리, 감염 초기에는 비교적 경미한 증상을 일으킬 뿐이지만, 감염자는 높은 빈도로 만성화되고, 일정 기간의 무증후기를 거친 후, 만성 간염이 발병한다. 또한, 감염이 장기화함에 따라, 간경변으로 병상이 점차 악화되고, 높은 빈도로 간암에 이른다. 간암의 95%는 간염 바이러스와 관여되어 있고, 그 대부분 (80%)이 HCV의 감염에 의한 것으로 여겨지고 있다.

HCV는 혈액, 혈액 성분이나, 저빈도이지만 체액 성분을 매개하여 감염된다. HCV의 검사법이 헌혈시의 스크리닝에 도입됨으로써, 선진국에서는 신규한 수혈성 C형 간염의 발증은 거의 없어졌다. 또한, 의료 기술의 진보에 따라서, 의료 과실에 의한 전파도 억제되어 있고, 일본에서는 신규 환자의 발생은 거의 억제되어 있다. 그러나, 역학 조사에서 일본에 있어서의 HCV 캐리어는 170만명 이상으로 추정되고 있는데, 그 대부분은 40대 이상으로, 감염이 장기화하고 있는 것으로 나타나고 있 다. 따라서 향후 간암의 증례 수의 증가가 크게 염려된다.

간암의 위험은 간 섬유화 상태와 크게 관련이 있으며, 섬유화가 진행될수록 간암의 발생율이 높아진다. 간 섬유화 상태는 Type IV 콜라겐, 히알론산의 혈중 농도의 측정, 혈중 혈소판수, 화상 진단 (복부 초음파 검사) 등을 조합함으로써 일반적으로 실시되고 있으나, 확정 진단을 위하여는 간생검(肝生檢)을 한다. 그러나, 간생검은 환자에게 다대한 부담을 강요하는 것이 큰 문제이어서, 보다 환자 본위의 진단 방법이 요구되고 있다.

HCV는 약 9,600 염기의 플러스 사슬 RNA를 게놈으로 하는 프라비바이러스과, 프라비바이러스속으로 분류되는 바이러스이며, 혈액이나 혈액 성분을 매개하여 감염되고, 간장에서 증식하는 것으로 생각되고 있다. 유전자 배열의 해석 결과, 적어도 6 종류의 유전자형이 존재하고 있는 것으로 추정되고 있다. 약 9,600 염기의 게놈은 감염 후, 숙주 세포 내에서 mRNA로서 기능하여, 약 3,000 아미노산 길이의 하나의 폴리프로테인이 합성되고, 숙주인 시그널 펩티다제, 시그널 펩티딜펩티다제 및 HCV 게놈이 코드하는 프로테아제에 의하여 절단된다. 그 결과, 코어 (core), E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B , NS5A, NS5B의 10 종류의 단백질이 산생된다. 이 번역틀 (오픈 리딩 프레임) 이외에, 5' 말단, 3' 말단에 비번역 영역 (UTR)이 존재하여, 번역 조절, 게놈의 복제 조절 기능을 담당하고 있다.

이 중에서, 코어, E1 및 E2는 바이러스를 구성하는 구조 단백질로서, 바이러스 게놈은 코어 단백질에 의하여 패키지되어 캡시드를 형성하고, 지질 이중막에 앵커된 E1, E2 단백질에 의하여 둘러싸여 바이러스 입자 (빌리언)를 형성하는 것으로 생각되고 있다. p7에 대하여는 그 기능은 분명하지 않지만, 바이러스의 증식에 필수인 것이 보고되어 있다. NS2는 메탈프로테아제이며, 그 자신의 절단에 필요하지만, 그 이외의 기능에 대하여는 알려져 있지 않다. NS3 내지 NS5B는 복합체를 형성하고, 숙주 단백질과 함께, RNA 복제 장치를 형성하고, 게놈 RNA의 복제를 실시하는 것으로 생각되고 있다.

HCV의 감염을 진단하는 방법으로는 환자 생체 성분 (혈액, 혈청, 혈전 등)에 포함되는 HCV가 만들어 내는 단백질에 대한 항체를 검출하는 방법이 널리 이용되고 있으나, 항체의 유무만으로는 HCV가 활동하고 있는지 여부를 판별할 수 없기 때문에, 혈중 바이러스량을 측정하는 것이 진단에는 중요하다. 혈중 바이러스의 검출 또는 측정에는 HCV의 바이러스 게놈을 검출 또는 측정하는 방법, 또는 HCV가 산생하는 코어 단백질을 측정 또는 검출하는 방법이 이용된다.

C형 만성 간염의 치료에는 인터페론이 널리 사용되고 있다. 최근 약제의 개량이나, 리바비린과의 병용 요법 등 투여 방법의 개선 등에 의하여, HCV가 체내로부터 구제되어 완치하는 비율도 서서히 늘고 있다. 그러나, 아직도 완치율은 5할 정도이다. 또한, 인터페론 투여는 중대한 부작용을 일으키는 경우가 있고, 고령자 등에게는 사용할 수할 수 없는 증례가 많이 있어서, 더 효과적인 치료법, 약제의 개발이 요구되고 있다.

인터페론 치료와 HCV와의 관련성에 관하여는, 혈중 바이러스량이 많을수록 인터페론 치료에 대한 저항성이 높은 경향이 인정되고 있다. 또한, 유전자형에 따라서 인터페론에의 감수성이 다른 경우가 있고, 특히 유전자형 2는 비교적 치료에 높은 감수성을 나타낸다. 그러나, 혈중 바이러스량과 간염의 악화도와의 사이, 그리고 유전자형과 간염의 경중(severity) 사이에 명확한 관련은 없다. 즉, 간 질환의 경중을 나타내는 바이러스 마커는 없다.

HCV는 사람에게는 혈액 또는 혈액 성분을 매개하여 감염된다. 사람 이외의 생물에서는 유인원 (침팬지)에 감염되고, 감염에 의하여 간염을 발병시키고, 만성 간염에 이르는 경우도 있다. 다른 것보다 사육이 용이한 실험동물에서, HCV에 높은 비율로 감염되는 것은 알려져 있지 않다.

한편, HCV는 생체 외(in vitro)에서 사람이나 원숭이 유래의 세포에 감염시키고, 증식시키는 것이 보고되어 있다. 그러나, 감염 효율, 증식 효율은 모두 낮다. 그 때문에 시험관 내에서 HCV를 감염, 증식시키는 것은 매우 곤란하다.

최근, 생체 외에서 합성한 HCV 게놈의 일부 (서브게노믹 RNA)와 약제 내성 마커를 가지는 RNA를, 사람 간암 유래의 수립 세포에 도입하고, 약제 내성을 지표로 세포를 선택함으로써, 매우 저빈도이지만, 세포 내에서 자율적으로 RNA가 복제ㅎ하고 있는 세포를 단리할 수 있다는 것을 알게 되었다. 많은 연구실에서 재현하고, 비교적 용이하게 유지를 할 수 있기 때문에, 연구에 널리 이용되게 되었다. 자주 이용되는 레프리콘은 HCV의 구조 단백질 부분을 인공적으로 결실시킨 것으로, 비구조 영역이 만들어 내는 단백질로 이루어지는 복제 장치가 HCV 본래의 플러스 사슬 RNA의 세포 내에서의 복제에 필요 충분한 정보를 가지는 것을 시사하고 있다.

HCV가 간장에서 증식하고 있는 것은, 간장에 포함되는 HCV가 산생하는 단백질을 검출하는 것이나, 간장에 포함되는 RNA를 검출함으로써 나타나고 있다. 또한, 인터페론 치료에 의하여 HCV를 일시적, 또는 항구적으로 구제하면, 그 후의 간염의 증상이 완화되는 것으로부터도, 간장에서의 병태의 발현에 HCV가 관여하고 있는 것은 분명하다. 그러나, HCV가 간장 중에서 어떠한 양태를 취하고 있는 지에 대하여는 해명되어 있지 않은 점이 많다.

그 때문에 HCV의 감염에 의하여 간염이 발병하고, 장기 만성화에 의하여 병상이 점차 악화되어, 최종적으로 간암에 이르는 HCV의 병태 발현 및 진전의 메카니즘에 대하여 해명되어 있지 않다. HCV의 각 단백질을 유전자 재조합에 의하여 배양 세포 중에서 발현시키고, 발현 세포 상태를 해석함으로써, 병태 발현·악화의 메카니즘에 대하여 가설을 세우는 연구는 활발하게 진행되고 있으나, 그것을 증명하기 위한 적절한 HCV 감염·증식 모델이 존재하지 않기 때문에, 가설을 검증되어 있지 않다.

특허 문헌 1: 일본 공개 특허 공보 2001-17187

비특허 문헌 1: Science 제277권, p570-, 1997

비특허 문헌 2: Journal of Virology, 제76권, p4008-4021, 2002

비특허 문헌 3: Science 제285권, p110-, 1999

비특허 문헌 4: Science 제290권, p1972-, 2000

비특허 문헌 5: Hepatology, 제29권, p223-229, 1999

비특허 문헌 6: Journal of Viro1ogy, 제77권, p2134-2146, 2003

비특허 문헌 7: Res. Virol., 제144권, p275-279, 1993

비특허 문헌 8: Journal of Virology, 제75권, p4614-4624, 2001

비특허 문헌 9: PNAS, 제29권, 14416-14421, 2002

비특허 문헌 10: Current Opinion in Infectious Disease, 제14권,

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비특허 문헌 11: Jounal of Vira1 Hepatitis, 제6권, p35-47, 1999

비특허 문헌 12: Clinica1 Chemistry, 제43권, p1507-1522, 1 997

비특허 문헌 13: Journal of General Virology, 제81권, p1631-1648, 2000

HCV는 간장 중에서 복제하고, 증식하는 것으로 생각되고 있지만, 간장 중에서의 양태에 대한 해석이 이루어지지 않았다. 그 때문에 간장 중에서 어떻게 HCV가 복제하고 있는 지에 대한 정보는 거의 없고, HCV에 대한 치료약의 표적으로서 어느 분자가 적절한 것인 지에 대한 정보도 없다. 따라서, HCV의 치료법은 시행착오를 ㄱ겪지 않을 수 없다. 치료약을 효율적으로 개발하려면 환자 간장에서 활발하게 복제되고 있는 HCV 게놈 RNA를 특정할 필요가 있다. 이에, 본 발명은 간장에서 복제, 증식되고 있는 HCV 게놈 RNA 관한 것으로, 치료약의 적절한 표적이 되는 HCV 게놈 RNA를 제공하는 것을 목적으로 한다.

HCV의 증식에 의하여 간염이 중증화하고 있는 데도 불구하고, 간염 상태를 나타내는 바이러스 마커가 존재하지 않는다. 간염 상태를 나타내는 적절한 바이러스 마커가 요구되고 있다. 본 발명은 간염의 증상, 상태를 나타내는 바이러스 마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.

HCV는 취급이 용이한 감염 동물 및 높은 비율로 감염되고, 고효율로 복제되는 생체 외 배양계가 존재하지 않기 때문에, 효율적인 약제의 스크리닝을 실시하는 것이 곤란하다. 이들은 HCV 특이적인 치료약의 개발을 곤란하게 만드는 원인의 하나이다.

예를 들면, 널리 이용되고 있는 인터페론 치료는 환자를 피검체로 하여 직접 치료법이 개발, 개량되어 오고 있어서 환자에게 큰 부담을 강요해왔다. 그 때문에, 환자의 입장을 고려한 의약품의 개발 방법이 필요하다. 이 문제를 해결하기 위하여 유효한 치료약과 치료법의 개발에 널리 이용할 수 있는 HCV 감염, 증식 모델이 필요하다. 본 발명의 목적의 하나는 치료약, 치료법의 개발, 스크리닝 등에 이용하는 HCV 감염, 증식 모델을 제공하는 것이다.

이와 같은 증식 모델로서 서브게노믹 레프리콘을 사용한 계(系)가 제공되었다. 즉, HCV의 서브 게놈과 적당한 약제 내성 마커를 코드하는 적절한 구조를 가지는 RNA를 사람 간암 유래 세포에 도입하고, 약제 내성으로 선택함으로써, 세포 내에서 자율적으로 증식하는 HCV 서브게노믹 RNA 레프리콘을 얻을 수 있다. 이 레프리콘과, 레프리콘을 유지하고 있는 세포를 사용함으로써, HCV에 대한 약제의 스크리닝이 시작되었다. 그러나, 이 방법에는 큰 문제가 있다.

그 하나는 사용하고 있는 HCV의 게놈은 본래의 HCV 게놈 RNA와는 다른 구조로 이루어져 있다는 점이다. 즉, 서브 게놈은 HCV 게놈의 비구조 단백질로 이루어지는 정보를 가질 뿐이다. 이 점을 개량하기 위하여, HCV 단백질의 모든 번역 영역과 약제 내성 마커로 이루어지는 레프리콘이 수립되었다. 이 레프리콘을 유지하고 있는 세포에서는 HCV 게놈에 코드되어 있는 모든 단백질이 산생될 것이고, HCV 입자가 세포 외로 방출되는 것이 기대되었다. 그러나 세포 외로 HCV 입자는 방출되지 않았다. 즉, 이와 같은 개량이 이루어졌다고 하여도 HCV의 증식계로서는 불완전한 것이었다.

또한, 상기 비구조 영역으로 이루어지는 서브 게놈의 레프리콘은 HCV의 5' 비번역 영역의 IRES (intenal ribosome entry site)와 코어의 일부 유전자의 하류에 네오마이신 내성 유전자를 가지고, 그 하류에 뇌김근염 바이러스(encephalomyocarditis virus (EMCV))의 IRES (intenal ribosome entry site)와 HCV의 비구조 단백을 코드하는 영역과 3' 비번역 영역을 가지는 구조이다. 또한, 개량된 HCV의 모든 번역 영역을 가지는 레프리콘도 서브 게놈의 레프리콘의 비구조 단백을 코드하는 유전자 영역을 HCV의 모든 번역 영역을 코드하는 영역과 교체한 것으로 것으로, 기본적인 구조는 같다.

이들 레프리콘은 본래의 HCV의 구조와 달리, HCV의 IRES와 EMCV의 IRES의 2개의 IRES를 가지고 있는데, 생체 내에 있어서의 HCV의 게놈의 구조와는 다른 것이다. 이 구조의 차이가, 세포외로의 HCV의 입자의 방출이 없는 원인의 하나일 가능성도 생각할 수 있다. 또한, 이와 같은 구조의 레프리콘은 생체 내에서는 복제되고 있는 바이러스 게놈과 다른 기구로 복제되고 있는 것도 생각할 수 있다.

이들로부터, HCV의 레프리콘 시스템은 본래의 생체 내의 HCV 게놈 구조를 가지는 RNA를 이용한 레프리콘 시스템인 것이 좋다. 본 발명은 간장에서 실제로 복제하고 있는 배열 및 구조로 이루어지는 레프리콘을 제공하는 것을 목적으로 한다.

더 큰 문제는 적응 변이라고 불리는 서브게노믹 레프리콘의 실험계 특유의 변이의 존재이다. 생체 외에서 기능하는 HCV 레프리콘을 회수하여 해석하면, NS3, NS5A 등에 본래 존재하지 않았던 복수의 변이가 발생하고 있다. 이 변이는 높은 효율로 복제하는 데 있어서 중요하고, 복제의 효율을 좌우한다. 그러나, 복제에 적절한 변이는 HCV의 증식에 있어서 발생하여서는 아니되는 변이인 것이 알려져 있다. 생체 외에서 합성한 HCV 게놈을 직접 침팬지의 간장에 접종함으로써 HCV에 감염시킨다.

이 생체 외에서 합성한 HCV RNA에, 서브게노믹 레프리콘으로 중요한 변이를 도입하면, 원래의 배열이 가지고 있던 침팬지에의 감염성이 소실되었다. 또한, 침팬지에 감염성을 나타내는 배열을 가지는 시험관 내의 세포에서 복제, 증폭하는 배열도 없다. 따라서, 생체 외에서 복제하게 된 배열은 생체 내에서 복제, 증식하는 기능을 잃었기 때문에, 본래의 HCV가 가지는 RNA 복제, 증식능을 유지하고 있지 않다. 생체에서도, 생체 외에서도 복제, 증식하는 배열일 필요가 있다. 즉, 본 발명의 제공하는 HCV 게놈 RNA 배열을 가지는 레프리콘은 생체 외에서도 시험관 내에서도 복제하는 것이다.

본 발명자들은 환자 간장 중의 HCV 게놈 RNA에 대한 cDNA를 단리하여, 그 전체 구조를 결정하였다. 결정한 배열을 해석하였더니, 단리된 cDNA는 지금까지 보고된 HCV 게놈 RNA의 구조와는 완전히 다른 배열을 가지는 것이 판명되었다.

이 새로운 구조의 게놈 RNA는 이미 보고되고 있는 HCV 게놈 RNA의 구조 단백질 영역이 일부, 또는 전부 결실되어 있는 것이 특징이며, 또한 결실된 부분의 전후의 배열은 원래의 HCV 게놈의 번역틀 (reading frame)을 유지한 채로 결합하고 있고, 이 HCV 게놈은 신규한 하나의 폴리펩티드를 코드하고 있는 것으로 판명되었다. 하나의 폴리펩티드는 HCV 본래의 구조 단백질의 일부와 비구조 단백질의 전부를 발현할 수 있다.

이 게놈에 코드되어 있는 HCV 폴리프로테인은 세포내 시그널 펩티다제에 의한 절단 부위, 자신의 프로테아제에 의한 절단 배열을 유지하고 있어, 프로세싱을 받는 것으로 추정된다. 사실, 배열 번호 1에 나타내는 신규한 HCV 게놈 cDNA를 포유류 세포에서 발현시켜, 산물(産物)을 해석하였더니, 코어 단백질은 정상적으로 프로세스되고, E1와 NS2 단백질은 융합 단백질로서 발현하고, NS3와는 프로세스되며, NS3는 본래의 크기의 분자로 프로세스되었다.

이 HCV 게놈 RNA를 트런케이트 폼 (TF)이라고 부른다. 이에 대하여, 이미 보고되어 있는 구조 유전자를 모두 포함하는 HCV RNA를 풀 렝쓰 폼(full length form) (FLF)이라고 부른다. 복수의 만성 C형 간염 환자의 간생검, 혈청을 해석하였다. 복수의 환자로부터 공통되는 특징을 가진 TF HCV 게놈이 검출되었다. 그 특징은 구조 단백질의 배열의 일부 또는 전부가 결실되어 있지만, NS2의 후반 이후의 배열을 유지하고 있고, 남아 있는 배열은 FLF로 추정되는 번역틀을 유지하는 형태로 발현할 수 있는 형태로 결실되어 있다.

즉, 본원 발명은

(1) C형 간염 바이러스 유전자에 있어서, 구조 단백 코드 영역의 일부분을 유지하고, 1개의 번역틀을 유지하면서, 코어 단백으로부터 NS2 단백을 코드하는 영역의 일부분이 결실되어 있는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자,

(2) C형 간염 바이러스 유전자에 있어서, 구조 단백 코드 영역의 일부분을 유지하고, 1개의 번역틀을 유지하면서, 적어도 E1 단백과 E2 단백의 이음부의 아미노산 배열을 코드하는 영역이 결실되어 있는 (1)의 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자,

(3) C형 간염 바이러스 유전자에 있어서, E1 단백 코드 영역의 일부분, E2 단백 코드 영역, P7 단백 코드 영역 및 NS2 단백 코드 영역의 일부분이 번역틀을 유지하면서 결실되어 있는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자,

(4) 5'UTR 및 3'UTR를 가진, 상기 (1) 내지 (3)의 어느 하나에 기재된 유전자,

(5) 5'UTR, NS3로부터 하류의 단백질 코드 영역 및 3'UTR를 가지는 상기 (1) 내지 (3)의 어느 하나에 기재된 유전자를 제공한다.

C형 간염 바이러스 게놈은 RNA이지만, 본원 발명의 C형 간염 바이러스 유전자는 RNA도, DNA도 모두 이용 가능하다.

바꾸어 말하면, 본 발명은 (a) C형 간염 바이러스 유전자에 있어서, E1 단백 코드 영역의 일부분, E2 단백 코드 영역, P7단백 코드 영역 및 NS2 단백 코드 영역의 일부분이 번역틀을 유지하면서 결실되어 있는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자를 제공한다.

또한, 5' 비번역 영역으로부터 구조 단백인 코어 단백을 코드하는 영역의 전부 또는 일부 및 비구조 단백인 NS2의 후반 두 부분의 막 관통 영역을 코드하는 영역으로부터 3' 비번역 영역의 전부 또는 일부를 가진 상기 (a)에 기재된 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자를 제공한다.

또한, C형 간염 바이러스 유전자의 핵산 배열의 1번에서 914번의 전부 또는 일부의 배열 및 3001번 이후의 전부 또는 일부의 배열을 가진 상기 (a)에 기재된 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자를 제공한다.

한편, 서브게노믹 레프리콘의 해석으로부터 RNA 복제에 필요한 정보는 NS3 이후의 비구조 단백질의 영역에 코드되어 있는 것으로 나타나고 있다. 따라서, TF 게놈은 RNA 복제에 필요한 비구조 단백질의 정보를 모두 유지하고 있다. 또한, 일부의 간생검 샘플에서는 TF 게놈이 우선적으로 검출되므로, TF 게놈은 간장에서 자율적으로 복제하고 있는 것을 알 수 있다. 추가로, 생체 외에서 TF를 포함하는 RNA를 세포에 도입하면, 세포 내에서 복제한다. 즉, TF HCV 게놈 RNA는 레프리콘으로서 기능한다. 이들 결과로부터, 본 발명에 의하여 제공되는 HCV 게놈 RNA는 간장에서 복제하고, 또한 생체 외에서도 복제하는 것을 알게 되었다.

따라서, 본원 발명은 또한,

(6) 세포 중에서 자율적으로 복제하는 C형 간염 바이러스의 코어 단백으로부터 NS2 단백을 코드하는 유전자의 일부의 영역을 번역틀을 유지한 채로, 결실된 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자 또는 결실된 영역이 적어도 E1 단백 및 E2 단백을 코드하는 영역에 존재하는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자의 레프리콘 유전자를 제공한다.

본 발명은, 또한,

(7) 상기 (3)의 레프리콘 유전자에 선택 마커 유전자가 결합된 레프리콘 유전자를 제공한다.

또는

(8) 상기 레프리콘 유전자가 복제하는 세포를 제공한다.

TF는 간장에서 FLF보다 유리하게 증식하고, 해당 환자가 중증의 간염 증상을 발현하고 있다. TF의 출현은 간염 증상에 강하게 관계되어 있고, TF의 증식을 억제 또는 저해하고, 구제하는 것은 유효한 치료 방법이 된다. 즉, 효과적으로 C형 만성 간염의 증상을 억제, 완화하는 약제는 TF를 표적으로 하여 개발하는 것이 좋다. 따라서, TF를 이용한 레프리콘을 이용한 의약품의 스크리닝은 간염의 중증화를 억제, 완화 또는 구제하기 위한 의약품 개발에 적절한 것은 분명하다.

따라서, 본원 발명은 또한,

(9) 트런케이트 폼 유전자가 복제하는 세포를 이용한 약제의 스크리닝 방법, 약효 평가 방법 및 약효를 평가함으로써 약제를 제조하는 방법을 제공한다.

(10) 트런케이트 폼 유전자를 넣은 벡터를 유지하여, 그 단백질을 발현하고 있는 세포를 제공한다.

(11) 트런케이트 폼 유전자를 포함하는 레프리콘이 복제하고 있는 세포, 또는 세포가 산생하는 단백질을 이용한 HCV의 진단 방법도 제공한다.

이 TF 게놈은 혈액 중에도 검출할 수 있다. 즉, 이 HCV 게놈 RNA는 간장 중에서 복제되어 혈액 중에 VLP로서 존재한다. 그러므로, TF 게놈의 검출에는 혈액, 또는 혈액 성분을 샘플로서 사용할 수 있다.

TF가 검출되는 환자에게 있어서, TF가 간장 RNA 중에서 우선형인 예가 관찰된다. 이것은 TF가 FLF보다 간장 내에서의 RNA 복제에 적절한 배열인 것을 나타내고 있다. 또한, 다수의 환자의 간생검, 혈청을 분석하여, TF가 간장에서 우선형인 환자는 증증의 간염을 발병하고 있는 예가 많고, 많게는 인터페론 치료의 예후도 불량한 것으로 판명되었다. 이것으로부터 TF형이 간장에서 우선인 경우는 간염이 중증화하고 있고, 또 인터페론 치료 효과도 한정적이다. 즉, TF를 검출, 또는 정량하는 것은 간염 상태를 나타내는 지표가 된다. 이것으로부터 TF를 검출, 정량하는 방법은 간염 상태를 진단하는 방법으로서 적용할 수 있고, 신규한 바이러스 마커로서 이용할 수 있다.

따라서, 본원 발명은, 또한,

(12) 검체 중의 트런케이트 폼 유전자를 검출하는 방법을 제공한다. 또한, 이 방법은 모든 유전자의 결실을 검출하는 방법을 사용하여, C형 간염 바이러스의 트런케이트 폼 유전자를 검출하는 방법을 포함한다.

또한 일례로서 C형 간염 바이러스 유전자의 핵산 배열의 1번에서 914번 및 3001번 이후의 배열로부터 설계한 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고, 트런케이트 폼 유전자를 증폭함으로써 트런케이트 폼 유전자를 검출 또는 정량하는 방법을 제공한다.

(13) 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자 및 풀 렝쓰 폼 C형 간염 바이러스 유전자를 혼합한 검체에 있어서, 그 존재비를 정량하는 방법도 제공한다.

(14) 트런케이트 폼 유전자 및 풀 렝쓰 폼 유전자의 공통 영역의 유전자의 정량과 트런케이트 폼 유전자의 결실된 영역의 유전자의 정량에 의하여 존재비를 정량하는 방법도 제공한다.

또한, 혈중의 TF 게놈은 C형 간염 바이러스 입자 또는 C형 간염 바이러스 유사 입자로서 존재하고 있는 것으로 생각된다. 어떠한 구조체를 형성하고 있지 않으면, TF 게놈은 RNA이기 때문에, 신속하게 혈액 중의 RNase에 의하여 분해되어 검출할 수 없기 때문이다.

따라서, 본원 발명은,

(15) 트런케이트 폼 유전자를 유지하는 C형 간염 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자를 제공한다.

TF 게놈은 구조 단백을 코드하는 영역이 결실되어 있다. 그 때문에, 결실된 영역에 코드되어 있던 펩티드를 결여한 신규한 HCV 폴리프로테인을 산생할 수 있다. 전술한 바와 같이 배열 번호 1의 HCV 게놈 cDNA를 포유류 세포에서 발현시켰을 경우, E1과 NS2의 융합 단백이 산생되었다.

그 때문에, 본원 발명은, 또한

(16) 트런케이트 폼 유전자로부터 산생되는 C형 간염 바이러스의 폴리프로테인 및 폴리프로테인으로부터 프로세스된 단백을 제공한다. 또한,

(17) 이 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다.

신규한 HCV 게놈 RNA (TF)를 사용함으로써, 생체 내에서 복제하고 있는 RNA 레프리콘을 생체 외에서 복제하는 것이 가능하게 된다. 이 레프리콘을 사용함으로써, 환자 간장 내에서 우선적으로 복제하고, 간염을 중증화시키는 감염 세포 모델을 구축할 수 있다. 이 모델을 이용함으로써, 간염의 중증화를 억제, 저해하는 의약품의 개발, 스크리닝을 실시할 수 있다.

TF를 검출 또는 정량하는 것은 간염 상태를 파악하는 데 효과적이며, 간염 상태를 나타내는 바이러스 마커로서 유효하다. 또한, 이 마커를 이용한 진단법에 의하여, 환자의 간염 상태, 약제의 효과에 대한 모니터링, 약제에 대한 저항성을 진단할 수 있다.

도 1은 간장 조직의 HCV 게놈 RNA로부터 RT-PCR에 의하여 검출된 TF 게놈의 대표적인 자기 영동상을 나타낸다. 프라이머 세트(1)는 cDNA 합성 프라이머가 3481R, 1st PCR 프라이머가 HClongAl과 3481R, 2nd PCR 프라이머가 85F와 3297R, 프라이머 세트 2는 cDNA 합성 프라이머가 3945R, 1st PCR 프라이머가 831S와 3945R, 2nd PCR 프라이머가 841S와 3759R, 프라이머 세트 3은 cDNA 합성 프라이머가 3945R, 1st PCR 프라이머가 813S와 3174AS, 2nd PCR 프라이머가 841S와 3111AS를 나타낸다. 화살표는 TF 게놈의 PCR 산물을 나타내고 있다.

도 2는 TF 게놈만이 검출된 검체의 TF 게놈과 D89815의 게놈과의 구조의 차이를 나타낸다. D89815의 각 단백을 코드하고 있는 핵산 배열은 코어가 341-914, E1이 915-1454, E2가 1455-2079, P7가 2580-2778, NS2가 2779-3419에 존재한다. 각 검체로부터 취득한 TF 게놈을 5'UTR은 실선으로, 단백을 코드하고 있는 부분은 회색의 막대로 나타내고 있다. 결실 부분은 각각의 막대를 선으로 묶어 나타낸다. 각 검체의 번호는 D89815에 대응하는 핵산의 위치를 나타낸다.

도 3은 TF 게놈과 FLF 게놈의 양쪽 모두가 검출된 검체의, TF 게놈과 D89815 의 게놈과의 구조의 차이를 나타낸다. 도 2와 마찬가지로, 각 검체로부터 취득한 TF 게놈을 5 ' UTR은 실선으로, 단백을 코드하고 있는 부분은 회색의 막대로 나타내고 있다. 결실 부분은 각각의 막대를 선으로 묶어 나타낸다. 각 검체의 번호는 D89815에 대응하는 핵산 배열의 위치를 나타내고 있다.

도 4는 실시예 6에 있어서의, 항원량의 경시적 변화를 나타내는 그래프이다.

도 5는 실시예 7에 대해 얻은 결실을 가진 유전자의 결실 전후의 배열을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 상태

이하에 본원 발명의 최선의 상태를 설명하지만, 본원 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 C형 간염 바이러스의 신규한 구조의 유전자에 관한 것이다. 정상적인 FLF의 C형 간염 바이러스의 유전자는 5'UTR와 그것에 이어서, 바이러스의 구조 단백질인 코어 단백, E1 단백, E2 단백 및 P7 단백 및 비구조 단백질 NS2 단백, NS3 단백, NS4A 단백, NS4B 단백, NS5A 단백, NS5B 단백을 코드하는 영역 및 3'UTR로 이루어져 있다.

본원 발명의 C형 간염 바이러스 유전자는 구조 단백질인 코어 단백, E1 단백, E2 단백 또는 P7 단백 각각의 전부 또는 일부 및/또는 비구조 단백질인 NS2의 일부를 코드하고 있는 유전자가 결실되어 있는 TF 게놈이다. 이 TF 게놈은 FLF 게놈의 번역틀을 유지한 채로, 인플레임으로 결실이 일어나고 있고, 결실 부분 이외의 영역에서는 정상적인 HCV의 폴리프로테인을 산생할 수 있다. 즉, 본원 발명은 C 형 간염 바이러스의 폴리프로테인을 코드하는 유전자의 일부 영역이 인플레임으로 결실된 C형 간염 바이러스 유전자에 관한 것이며, 그 TF 게놈의 구조에 특징이 있다.

이 HCV의 TF 게놈은 5'UTR를 유지하고 있고, 적어도 HCV의 FLF 게놈의 3001번째 이후의 유전자를 유지하고 있는 것이 많은 것으로 생각된다. 3001번째 이후의 유전자에게는 NS2 영역의 C말측의 두 부분의 막 관통 영역이 존재하고 있고, NS3 이후의 HCV의 단백질을 이 TF 게놈으로부터 정상적으로 세포 중에서 산생할 수 있다. (이하의 핵산 배열의 위치를 나타내는 번호는 전장형(全長型)의 배열인 GeneBank ACCession No. D89815의 HCV의 배열에 상당하는 위치의 번호를 기재한다.)

또한, 이 TF 게놈은 코어 단백, E1 단백, E2 단백의 일부 또는 전부를 코드하는 영역이 결실되어 있는 것에 특징이 있다. 특히 모든 TF 게놈은 도 2와 도 3에 나타낸 바와 같이, E1 및 E2 영역을 코드하는 유전자를 완전한 형태로 유지하지 않는 것에 특징이 있다. 바꾸어 말하면, E1 단백 및 E2 단백의 일부 또는 전부를 코드하는 유전자가 결실되어 있는 것에 특징이 있는 유전자이다. 현재 취득되어 있는 TF 게놈에서는 E1를 코드하는 1200위로부터 E2를 코드하는 1998위를 유지하고 있는 TF 게놈은 확인되어 있지 않다. 각 TF 유전자의 연속되는 결실은 적어도 63 염기이고, 최대 2043 염기이다. 또한, 1개의 TF 유전자의 결실의 합계는 1449 내지 2067 염기이다.

가장 전형적인 TF 게놈의 구조는 E1 단백으로부터 NS2 단백을 코드하는 약 2 kb의 유전자가 결실되어 있는 구조이다 (도 2).

또한, 상기 결실을 가지고, 또한 5'UTR, NS3로부터 하류의 단백질을 코드하는 유전자 및 3'UTR를 유지하고 있는 유전자가 좋다.

이 TF 유전자는 그 결실 부분의 구조에 특징이 있다. 그 때문에 핵산 배열은 HCV의 유전자 배열이면 모든 것을 포함한다. 본원 발명에서는 유전자형 1 이외에, 유전자형 2의 TF 유전자도 확인하고 있으나, 그 이외의 유전자형 3에서 6의 배열의 TF유전자도 포함된다.

이 TF 게놈은 C형 만성 활동성 간염 환자의 간장 중에서 자율적으로 복제하고 있다. 또한, 환자 조직 중에서 TF 게놈만이 PCR로 증폭되는 검체가 있다. 이것으로부터, TF 게놈은 FLF 게놈보다 간 조직 중에서 우선적으로 복제하고 있는 것으로 생각된다.

그 때문에, 이 TF 게놈을 간장 세포 또는 간장 유래 세포에서 복제 가능한 레프리콘으로서 이용할 수 있다. TF 게놈 그 자체가 자율 복제 능력이 있기 때문에, 그 구조 자체로 레프리콘으로서 기능한다. 또한, 레프리콘을 선택하기 위하여, 약제 내성 유전자를 결합시켜, 약제에 의하여 선택하는 것도 가능하다. 약제 내성 유전자로서는 네오마이신 등을 사용할 수 있다. 레프리콘으로서 이용 가능한 TF 게놈은 전술한 구조 영역을 결실힌 TF 게놈의 모든 것이 포함된다. 또한, 그 이외에도 간장에서 복제하고 있는 HCV 유전자의 인프레임의 결실체인 TF 게놈이라면, 어떠한 구조라도 이용 가능하다.

본원 발명의 가장 바람직한 레프리콘은 HCV의 5' 비번역 영역의 IRES, 코어 영역, E1 영역의 일부 및 NS2의 일부로부터 하류의 비구조 단백을 코드하는 영역과 3' UTR를 가지는 레프리콘이며, 생체 내에서 복제하고 있는 TF 게놈과 같은 구조의 레프리콘이다. 또한, 나아가 레프리콘의 일부, 예를 들면 코어 영역에 네오마이신 내성 유전자를 넣은 것도 레프리콘으로서 유용하다.

또한, 본원 발명은 이 레프리콘이 복제하는 세포를 제공한다. TF 게놈의 구조를 가지는 HCV-RNA는 실제로 간장 세포 중에서 복제되고 있고, 이 구조를 이용한 TF 게놈 레프리콘의 복제계는 간장에서의 바이러스 복제계를 반영하고 있는 것으로 생각된다. 레프리콘이 복제하는 세포는 간장 유래의 계대 세포라도 좋고, 초대 간세포이어도 좋다. 또한, 본원 발명의 레프리콘이 복제하는 세포이면, 간장 유래가 아닌 세포라도 이용 가능하다. 레프리콘이 복제하는 세포는 항상적으로 레프리콘이 복제하는 세포도 포함된다. 또한, 일과성으로 레프리콘이 복제하는 세포도 포함된다.

TF 게놈의 레프리콘의 복제계는 HCV의 감염에 대한 약제의 스크리닝에 유용하다. 이것은 이 TF 게놈이 실제로 간장 조직 중에서 복제되고 있기 때문이다. 이 레프리콘이 복제하고 있는 세포의 레프리콘 복제계를 사용하여, HCV의 증식을 억제하는 약제의 스크리닝할 수 있다. 레프리콘 복제 세포를 이용하여 약제의 약효를 평가하는 방법도 포함된다. 이 스크리닝계 등은 실제로 간장에서 복제되고 있는 TF 게놈의 레프리콘을 타겟으로 하고 있기 때문에, 더 효과적인 약제를 스크리닝할 수 있을 것으로 기대된다. 스크리닝된 약제의 효과를 평가하는 방법으로서도 유효하다. 이 경우, 약제의 평가를 이 방법으로 실시하는 것이 중요하고, 약제의 관리에 필수라면, 약제를 제조하는 방법으로도 이용할 수 있다.

또한, 본원 발명은 TF 게놈을 검출하는 방법을 제공한다. TF 게놈은 결실 부분을 가지고 있다. 이 결실 부분이 있는 유전자를 검출하는 방법이면, 어떠한 방법으로도 이용할 수 있다. 예를 들면, 결실 영역으로부터 3'측의 외측에 프라이머를 설정하고, RNA보다 cDNA를 합성한다. 그 cDNA로부터 결실 영역을 삽입하도록 5'와 3'의 외측에 프라이머를 설정하고 PCR을 실시함으로써, 결실이 있는 FLF 게놈보다 짧은 유전자를 검출할 수 있다. PCR을 실시한 후에, 노던 블로팅에 의하여 짧은 TF 게놈을 검출하는 것도 가능하다.

이 TF 게놈을 검출하는 방법은 상기에 기재한 방법 이외에 유전자의 결실을 검출하는 모든 방법이 포함된다.

또 전장(全長)의 FLF 게놈 및 TF 게놈의 양을 정량하고, 그 후 FLF 게놈을 정량한 값을 뺌으로써, TF 게놈의 양을 구하는 것도 가능하다.

FLF 게놈 및 TF 게놈의 결실이 없는 공통 영역에 PCR의 프라이머를 설정하고 RT-PCR에 의하여 양쪽 모두의 유전자의 양을 측정한다. 다음에, TF 게놈의 결실 영역에 PCR의 프라이머를 설정하고, 유전자의 양을 측정함으로써 FLF 게놈의 양만을 측정할 수 있다. 또한, FLF 게놈 및 TF 게놈의 양과 FLF 게놈의 양을 비교함으로써, TF 게놈의 양을 측정할 수 있다.

FLF 게놈 및 TF 게놈의 양을 측정하는 프라이머는 FLF 게놈과 TF 게놈이 중복되는 영역이면 어떠한 영역에 프라이머를 설정하여도 된다. 예를 들면 5'UTR나 NS3 이후의 비구조 단백을 코드하는 영역 또는 3'UTR에 프라이머를 설정할 수 있 다. 또한, FLF 게놈의 양만을 측정하는 프라이머는 TF 게놈이 결실되어 있는 영역이면 어떠한 영역이어도 좋지만, 예를 들면 구조 단백을 코드하고 있는 영역인, 코어, E1, E2의 유전자 영역이나, P7 또는 NS2 결실 영역에 설정할 수 있다. 전형적인 TF 게놈은 핵산의 배열 번호 1189에서 2922의 유전자가 결실되어 있기 때문에, 이 영역에 프라이머를 설정함으로써, FLF 게놈만을 검출할 수 있다. 더 좋기로는, 본원 발명의 실시예에서 얻은 모든 TF 게놈은 1200에서 1998이 결실되어 있기 때문에, 이 영역에 프라이머를 설정함으로써, FLF 게놈만을 검출하는 것이 가능하다.

HCV-RNA 유전자의 정량은 RT-PCR법에 의하여 실시할 수 있다. 예를 들면, Competitive-RT-PCR이나 리얼타임 PCR법 등을 사용할 수 있다.

본원 발명은 TF 게놈으로부터 산생되는 폴리프로테인에 관한 발명을 제공한다. TF 게놈은 인플레임으로 결실이 발생하고, 폴리프로테인을 코드하고 있다. 이 폴리프로테인은 C형 간염의 폴리프로테인과 비교하면 결실 영역에 코드된 펩티드를 가지지 않는 폴리프로테인이다. 또한, 결실 부분의 상류의 N말측의 단백과 하류의 C말측의 단백이 융합된 FLF 게놈으로부터 산생되는 정상적인 폴리프로테인과는 다른 신규한 단백질이다.

본원 발명은, 또한 상기 폴리프로테인으로부터 프로세스된 단백질을 제공한다. 상기 폴리프로테인은 펩티다제로 절단되지만, 프로세스에 의하여 E1와 NS2의 융합 단백, E1와 E2의 융합 단백, 코어와 E2의 융합 단백 등의 신규한 단백이 산생된다. 상기 폴리프로테인 또는 프로세스된 단백질은 FLF 게놈에서는 산생되지 않기 때문에, 이 단백을 검출함으로써, TF 게놈의 검출과 동등한 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 TF 게놈, 또는 TF 게놈으로부터 산생된 폴리프로테인을 검출 또는 정량함으로써, 간염의 증상을 진단하는 진단법을 제공한다.

본원 발명은 또한 TF 게놈으로부터 산생된 폴리프로테인 또는 융합 단백에 대한 특이적인 항체를 제공한다. 이들 항체는 폴리프로테인 또는 융합 단백의 검출에 유용하다.

또한, 본원발명은 TF 게놈을 포함하는 바이러스와 유사한 구조를 가지는 입자를 제공한다. TF 게놈은 간세포 이외의 혈액으로부터 검출된다. 혈액 중에서 TF 게놈은 코어의 단백질과 관련하여 존재하고 있다. 이 바이러스 입자 또는 바이러스와 유사한 입자는 진단, 치료 등에 이용할 수 있다.

실시예 1. 단축형 배열의 단리와 해석

환자 간장 절편 BP207 (0.5 mm × 1 mm)을 100 ㎕의 RIPA 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.1% deoxycholate, complete protease inhibitor cocktail [Roche diagnostics corporation] 중에서 파쇄하고, 10 krpm, 5분간의 원심 후 상청을 회수하였다. 이 추출액으로부터 High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche diagnostics corporation)를 사용하여 제조업체가 권장하는 방법에 따라 핵산을 정제하였다. 정제한 핵산에 HC9405R-1b 프라이머를 가하고 MMLV reverse transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 제조업체가 권장하는 조건으로, 42℃, 1 시간 역전사 반응을 실시하게 하고 cDNA를 얻었다.

이 반응액에 RNaseH (Invitrogen)를 가하고, 37℃에서, 30 분간 반응시켜, RNA를 분해시켰다. 이 반응액의 일부를 이용하여 HC-LongAl 프라이머와 T7-HC9313R 프라이머의 존재하에서, KlenTaq LA DNA polymerase (Clontech, BD bioscience)를 사용하여 94℃, 20초, 68℃, 9분간으로 이루어지는 30회의 서멀 사이클 반응에 의한 포리메라제 체인 리액션 (PCR)을 실시함으로써, HCV 게놈 RNA의 cDNA (HCV cDNA)의 증폭을 실시하였다. 이 반응액의 일부를 사용하고, 또한 HC85F와 HC9302R 프라이머의 존재 하에서 PCR을 실시하고, HCV cDNA를 증폭하였다.

증폭된 단편은 0.7% 아가로스 겔 전기 영동에 의하여 분리하고, 아가로스 겔로부터 QIAquick 9eI purification kit (QIAGEN)를 사용하여 제조업체가 권장하는 방법으로 DNA 단편을 회수하였다. 회수한 HCV cDNA 단편은 제조업체가 권장하는 방법에 따라서 pGEM-T easy 벡터 (Promega)와 연결 반응시키고, DH5α주를 형질 전환시켰다. 암피실린 내성으로, IPTG와 X-gal을 가한 한천 배지 상에서의 평판 배양으로 백색 콜로니를 형성하는 형질 전환체를 선택하고, 암피실린을 10O ㎍/㎖가 되도록 가한 2YT 배지에서 배양하였다. 배양한 균체로부터 Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System를 사용하여 plasmid를 정제하였다.

정제한 플라스미드에 넣은 HCV cDNA의 배열은 벡터 및 HCV cDNA에 적합하는 적절하게 준비한 프라이머를 이용하여 CEQ DTCS Quick Start Kit (벡터맨 코르타ㅅ사)에 의하여, 제조업체가 권장하는 방법에 따라 반응을 실시하고, CEQ2000 XL DNA analysis svstem (Software version 4.0.0, 벡터맨 코르타사)에 의하여 해석하였다. 얻은 데이터를 기초로, Sequencher (Version 4.1.2, Gene Codes Corporation)를 사용하여 배열 데이터의 통합, 해석을 실시하고, HCV cDNA의 염기 배열을 결정 하였다. 클론 LV207-0193-1, LV207-0193-6, LV207-0193-15의 3 종류의 HCV cDNA의 배열을 결정하였다.

단리된 배열을, 공표되어 있는 HCV cDNA의 배열 (D89851)과 비교하면, PCR에 사용한 프라이머의 영역인 제85위로부터 제9302위까지의 배열을 포함하지만, 어느 클론에서나 제1189로부터 제3000위에 상당하는 배열이 결여되어 있었다. 예상되는 아미노산 배열을 구하면, LV207-0193-1의 배열은 아미노산 길이의 하나의 아미노산을 코드하지만, E1의 도중부터 NS2의 도중까지가 번역틀이 어긋나지 않고 (in frame) 연결되는 형태로 결실되어 있었다. 구한 배열을 기초로, 공통되는 배열, 컨센서스 배열을 MacVector (version 7)를 사용하여 결정하고, 얻은 HCV cDNA 클론의 적절한 단편을 조합함으로써, 컨센서스 배열을 가지는 HCV cDNA 단편을 작성하였다.

구체적으로는 먼저 클론(1)의 단편에, Cla_s, Cla_as 프라이머를 이용하여, Quick Mutagenesis Kit (Staratagene)를 사용하여 제조업체가 권장하는 방법에 따라, 배열 번호 1의 제709위에 위치하는 ClaI 사이트를 변이 도입하였다. LV207-0193-1에서 제709위의 ClaI 사이트로부터, 제1063위의 AfeI까지의 단편, 제4169위의 HpaI 사이트로부터 제5569위의 SacI 사이트까지 및 제6687위의 SfiI 사이트로부터 제7123위의 BglII 사이트까지 있는 단편을 단리하여 구축에 사용하였다. 또한, LV207-0193-6에서는 제1063위의 AfeI 사이트로부터 제1265위의 BsiWI 사이트까지 있는 단편을 단리하여 사용하였다.

LV207-0193-15에서는 제1265위의 BsiWI 사이트로부터 제4169위의 HpaI 사이 트까지의 단편, 제5569위의 SaCl 사이트로부터 제6687위의 SfiI 사이트까지 있는 단편 및 제7123위의 BglII 사이트로부터 제7386위의 HindIII 사이트까지 있는 단편을 단리하여, 구축에 사용하였다. 이들 단편을 조합하고, 또한 아래와 같이 환자 조직으로부터 단리된 3'UTR을 포함하는 제7383위의 HindIII와 제7786위의 XbaI의 단편을 조합하여 크로닝 벡터 pBIuescriptSKII(-) (Stratagene)의 ClaI 사이트로부터 XbaI 사이트에 넣음으로써, 배열 번호 1의 제709위로부터 제7786위까지의 배열을 가지는 pLVC_ClaXba 7.2K를 구축하였다. 또한, 제한 효소, T4 DNA ligase는 뉴 잉글랜드 바이오랩사, 타카라슈조사, 도요보사, 니폰 진사로부터 구입한 것을 사용하였다.

한편 HCV cDNA의 말단은 아래와 같이 단리하였다. 전술한 RNaseH로 처리한 cDNA 반응액의 일부를, HCLongH1 및 HC705R와 JumpStart RedTaq DNA polymerase (Sigma)를 사용하여 94℃, 20초, 55℃, 30 초, 72℃, 1분으로 이루어지는 서멀 사이클을 35회 반복하는 PCR에 의하여, 이미 보고되어 있는 HCV cDNA의 제1위에서 709위에 상당하는 단편을 증폭시켰다. 단편의 클로닝, 해석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 그 결과, 배열 번호 1의 제1위로부터 제709위까지를 포함하는 HCV cDNA, pLV207-0007을 얻었다. 이것을 주형에 T7-H1V2 프라이머와 CoreCla_as프라이머를 이용한 PCR에 의하여 약 0.7 kb의 단편을 증폭하고, pGEM-T Easy에 클로닝함으로써, pT7_LV207_0007을 얻었다.

pcDNA3.1(+) (Invitrogen사)의 NotI와 XbaI 사이트 간에 pT7_LV207_0007을 NotI와 ClaI에 의하여 절단함으로써 얻을 수 있는 약 0.7 kb의 단편과 pLVC_ClaXba 7.2K를 ClaI와 XbaI로 절단함으로써 얻을 수 있는 약 7.2 kb의 단편을, 연결 삽입함으로써, 배열 번호 1의 제1위로부터 제7786위까지의 배열을 가지는 HCV cDNA의 삽입된 플라스미드 pcD-LV207TF를 얻었다.

환자 조직으로부터의 3' UTR 유전자의 분리

만성 간염 환자의 조직으로부터 상기와 동일한 방법으로 RNA를 회수하였다. RNA 2.5 ㎕에 프라이머 8913F를 5 pmole (0.5 ㎕) 가하고 70℃에서 3분간 유지하고, 얼음 중에서 급냉하였다. 이것에 5xFirst-Strand Buffer 2 ㎕, 0.1 M DTT 1 ㎕, 20 mM dNTP 0.5 ㎕, RNase Inhibitor (TAKARA) 20 units, MMLV 리버스 트랜스클립타제 0.5 ㎕를 가하고 전체 양으로 10 ㎕가 되도록 디에틸피로카보네이트 처리한 멸균수를 가하였다. 이 혼합액을 42℃에서, 60분간 반응시켰다. RNA를 파괴하기 위하여, RNaseH (TAKARA, 60U/ ㎕)을 12 U 가하고 37℃에서 30분간 유지하고, 그 후 72℃에서, 3분 실활시켜, cDNA로서 사용하였다.

이 cDNA, 2 ㎕를 프라이머 8913 F 및 RP2를 사용하여 상기와 같은 방법으로 PCR을 실시하였다. 이 PCR의 산물의 일부를 사용하여 8939F와 R1의 프라이머로 두번째의 PCR을 실시하고, 약 600 base의 PCR 산물을 얻었다. 이 PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터로 클로닝하고, 핵산 배열을 상기와 같은 방법으로 결정하였다. 이하에 클로닝 및 유전자의 구축에 사용한 프라이머 배열의 일부를 나타낸다.

1b160Bam: 5'-cgcggatcct tagtcctcca gaacccggac ac-3' (배열 번호:49)

chiba-as: 5'-tgcacggtct acgagacct-3' (배열 번호: 50)

chiba-s: 5'-tagtggtctg cggaaccggt-3' (배열 번호: 51)

core_cla_as: 5'-gccgcatgta agggtatcga tgacc-3' (배열 번호: 52)

core_cla_s: 5'-ggtcatcgat acccttacat gcggc-3' (배열 번호 53)

eco_npt_as: 5'-gcgaattctt atcagaagaa ctcgtcaaga ag-3' (배열 번호: 54)

HClb9405R: 5'-gcctattggc ctggagtgtt tagctc-3' (배열 번호 55)

HC85F: 5'-atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct-3' (배열 번호 56)

HC705R: 5'-agccgcatgtaagggtatcgatgac-3' (배열 번호: 57)

HCl986S: 5'-tggttcggct gyacatggat gaa-3' (배열 번호: 58)

HC2199AS: 5'-ggrtagtgcc aragcctgta tgggta-3 (배열 번호: 59)

HC9302R: 5'-tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t-3' (배열 번호: 60)

HClongAl: 5'-atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat-3' (배열 번호: 61)

HClongH1: 5'-gccagccccc tgatgggggc gacactccac c-3' (배열 번호: 62)

Nde_core9_as: 5'-aatcatatgt ctttgaggtt taggatttgt-3' (배열 번호: 63)

Nde_npt_s: 5'-gacatatgat tgaacaagat ggattgcac-3' (배열 번호: 64)

SbfHl: 5'-gtcctgcagg ccagccccct gatgggggcg aca-3' (배열 번호: 65)

SbfNpt-R: 5'-gacctgcagg ttatcagaag aactcgtcaa gaag-3' (배열 번호: 66)

T7_HlV2 : 5'-gccttaatta atacgactca ctataggcca gccccctgat gggggcgaca-3' (배열 번호: 67)

T7_HClongH1:5'-tctagtcgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcggccag ccccctgatgggggcgacac tccacc-3' (배열 번호: 68)

T7_HC9313b: 5'-tctagtcgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactcta gggcggcggg gtcgggcwcg ngacabgctg tga-3' (배열 번호: 83)

실시예 2.

환자로부터의 TF HCV 게놈 RNA에 대한 cDNA의 단리와 해석

다음에, 만성 활동성 간염의 간장의 간생검의 23 검체 및 간암 환자의 수술시의 조직 검체인 BP1, BP2, BP3의 3 검체로부터 TF의 HCV-RNA의 검출을 시도하였다.

RNA의 추출

RNA용 추출 시약 ISOGEN (니폰 진사)의「미량 시료로부터의 RNA의 단리」의 프로토콜에 준하여, RNA를 추출하였다. 약 0.5 mm×1 mm의 크기의 환자 간장 절편에 0.8 ㎖의 ISOGEN를 가하고 1 ㎖의 칩의 끝으로 조직편을 풀어헤쳐, 피펫팅에 의하여 분쇄하였다. 5 분간 실온에서 방치하고, 0.2 ㎖의 클로로포름을 첨가한 후, 30초 심하게 교반하고, 4℃에서 5 분간 두었다. 냉각 미량 원심기 12000 g으로 4℃, 15분 원심하고, 수상(水相)을 회수하였다.

약 5 ㎍의 효모 tRNA를 첨가하고, 0.8 ㎖의 이소프로판올을 첨가하고 4℃에서 30분 또는 하루 낮밤 방치하였다. 12000 g으로 4℃, 15분간 원심하고, 상청을 버리고 펠렛이 된 RNA를 회수하였다. 그 펠렛에 1 ㎖의 70% 에탄올을 가하고 심하게 교반하여 12000 g으로 4℃에서 15 분간 원심하였다. 상청을 버리고, 동일한 조작을 2회 반복하고, 펠렛의 세정을 실시하였다. 마지막 세정 후에 펠렛를 10분간 풍건하고, 디에틸피로카보네이트 처리한 멸균수 50 ㎕에 용해하고, RNA 샘플로 하였다. 샘플은 사용할 때까지 -80℃로 보존하였다.

cDNA 합성

간생검 조직으로부터 추출한 RNA 샘플로부터 cDNA의 합성을 실시한 BP207의 조직으로부터 취득한 TF 게놈의 결실 영역이 HCV의 유전자의 핵산 번호의 1189에서 3000이므로 3000으로부터 3' 비번역 영역측에 cDNA 합성의 프라이머를 수 개 설정하고, cDNA 합성을 실시하였다. 리버스 트랜스크립타제는 GIBCO-BRL사의 MMLV 리버스 트랜스크립타제를 사용하고, 첨부한 프로토콜에 따라서 합성하였다.

RNA 2.5 ㎕에 프라이머를 5 pmole (0.5 ㎕) 가하고, 70℃에서 3 분간 유지한 후, 얼음 중에서 급냉하였다. 이것에 5xFirst-Strand Buffer 2 ㎕, O.1 M DTT 1 ㎕, 20 mM dNTP 0.5 ㎕, RNase Inhibitor (TAKARA) 20 units, MMLV 리버스 트랜스크립타제 0.5 ㎕을 가하고, 전체 양이 10 ㎕이 되도록 디에틸피로카보네이트 처리한 멸균수를 가하였다. 이 혼합액을 42℃에서 60분간 반응시켰다. RNA를 파괴하기 위하여, RNaseH (TAKARA, 60 U/㎕)를 12 U 가하고, 37℃에서 30분간 유지하고, 그 후 72℃에서 3분간 실활시켜, cDNA로서 사용하였다.

또한, cDNA 합성용의 프라이머는,

5035R: 5'-AGGCCTGTGA AGACGCTCTC CCAGAACT-3' (배열 번호: 69)

HC3297R: 5'-GGTGATGAC CTTGGTCTCC AT-3' (배열 번호: 70)

HC3481R : 5'-GCTTAGAGGC TAGTGATGAT GCAACCAAGT AC-3' (배열 번호: 71)

HC3945R: 5'-GGCGACCGCA TAGTAGTTTC CATA-3' (배열 번호: 72)

의 어느 하나를 사용하였다. 어느 프라이머를 사용하였는지는 표 1에 기재한다.

포리메라제 체인 리액션 ( PCR )에 의한 증폭

cDNA를 사용하여 5' UTR으로부터 NS3 코드하는 영역에 걸쳐서 몇개의 프라이마의 조합으로 PCR을 실시하였다. PCR는 TaKaRa LA Taq (TAKAR A)를 사용하여 첨부한 프로토콜에 준하여 반응시켰다. cDNA 2 ㎕, 10xLA PCR buffer II (Mg^{2 +} free) 2.5 ㎕, 25 mM MgCl₂ 2.5 ㎕, 2.5 mM dNTP 2.5 mM, 센스 프라이머 10 pmole, 안티센스 프라이머 10 pmole, TaKaRa LA Taq 0.25 ㎕ (5 unit/㎕)를 가하고 이것에 멸균수를 가하고 25 ㎕으로 하여 PCR을 실시하였다. 반응은 마스터 사이클러 그레디언트(에펜도르프 야트론사)을 사용하였다. 반응 프로파일은 94℃에서 2분간 가열한 후, 변성 94℃ 20초, 어닐링 62℃ 30초, 연장 68℃ 3분으로 10 사이클, 그 후 변성 94℃ 20초, 어닐링 58℃ 30초, 연장 68℃ 3분으로 25 사이클로 실시하였다.

이 1회째의 PCR (1st PCR) 산물 2.5 ㎕을 사용하여 두번째의 PCR (2nd PCR)을 실시하였다. 제1 PCR 산물 2.5 ㎕, 10xLA PCR buffer II (Mg^{2 +} free) 2.5 ㎕, 25 mM MgCl₂ 2.5 ㎕, 2.5 mM dNTP 2.5 mM, 센스 프라이머 10 pmole, 안티센스 프라이머 10 pmole, TaKaRa LA Taq 0.25 ㎕ (5 unit/㎕)를 가하고 이것에 멸균수를 가하여 25 ㎕으로 하고, 제1 PCR과 동일한 반응 프로파일로 PCR을 실시하였다.

프라이머는,

HC85F : 5'-ATGGCGTTAG TATGAGTGTC GTGCAGCCT-3' (배열 번호: 56)

HC813S: 5'-CTGGAGGACG GCGTGAACTA TGCAACAGGG AA-3' (배열 번호: 73)

HC841S: 5'-GGAACTTGCC CGGTTGCTCT TTCTCTATCT TC-3' (배열 번호: 74)

HC3206R : 5'-TGGGGCAAGA TGGTTATAAA C-3' (배열 번호: 75)

HC3174AS: 5'-GGGGTAAGAT GGTTATAAAC GTACGTACCT G-3' (배열번호: 76)

HC3111AS : 5'-ATAATGACCC CCGGCGACTT TCCGCACTAA C-3' (배열 번호: 77)

HC3297R : 5'-GGTGATGAC CTTGGTCTCC AT-3' (배열 번호: 70)

HC3481R : 5'-GCTTAGAGGC TAGTGATGAT GCAACCAAGT AC-3' (배열번호: 71)

HC3759R : 5'-TGACATCAGC ATGTCTCGTG ACCA-3' (배열 번호: 78)

HCLONGAl : 5'-ATCGTCTTCA CGCAGAAAGC GTCTAGCCAT-3' (배열 번호: 61)

HC3945R: 5'-GGCGACCGCA TAGTAGTTTC CATA-3' (배열 번호: 72)

의 어느 프라이머를 조합하여 사용하였다. 사용한 1st 및 2nd PCR의 프라이머의 조합은 표 1에 기재하였다.

PCR 산물의 해석

반응 종료 후의 PCR 산물을 전기 영동으로 해석하였다. 1% 아가로스 겔을 사용하여 1xTAE 버퍼 (Tris-HCl 40 mM, 빙초산 40 mM, EDTA 1mM)으로 서브마린형 전기 영동조로 영동하였다. PCR 산물에 겔 로딩 버퍼를 가하고 전기 영동 후, 에티듐브로마이드로 염색하여, 자외선 하에서 PCR 산물을 관찰하였다.

4 검체의 RNA로부터 3조(組)의 프라이머로 HCV의 유전자를 증폭시킨 전기 영동의 결과를 도 1에 나타낸다. 2nd PCR의 프라이머가 HC85F와 HC3297R의 조합에서는 약 3.1 kb, 841S와 3759R의 조합에서는 약 2.9 kb, 841S와 3111AS의 조합에서는 2.2 kb의 FLF의 HCV-RNA가 검출될 것이다. 번호 1의 검체 (BP274)는 어느 프라이머 의 조합에서도 FLF의 길이의 PCR 산물만이 검출되었다. 번호 2의 검체 (BP295) 는 HC85F와 HC3297R의 조합에서는 약 3.1 kb의 FLF와 2 kb의 TF, 841S와 3759R의 조합에서는 약 2.9 kb의 FLF, 841S와 3111AS의 조합에서는 2.2 kb의 FLF가 검출되었다.

번호 3의 검체 (BP325)는 HC85F와 HC3297R의 조합에서는 약 3.1 kb의 FLF, 841S와 3759R의 조합에서는 약 2.9 kb의 FLF, 841S와 311lAS의 조합에서는 2.2 kb의 FLF와 30O bp의 TF가 검출되었다. 번호 4의 검체 (BP373)는 HC85F와 HC3297R의 조합에서는 약 1.2 kb의 TF, 841S와 3759R의 조합에서는 약 1 kb의 TF, 841S와 3111 AS의 조합에서는 PCR 산물은 검출되지 않았다. 검체와 프라이머의 조합으로 달라지는데, FLF만이 검출되는 검체, FLF와 TF가 검출되는 검체, TF만이 검출되는 검체가 있었다. 26 검체에 대하여, 각각의 cDNA 합성 프라이머, 1st PCR, 2nd PCR의 프라이머의 조합에서 얻은 PCR 산물을 표 1에 나타낸다.

배열의 결정

얻은 FLF 및 TF이라고 생각되는 PCR 산물을 플라스미드에 넣어, 배열을 결정하였다.

PCR 산물을, 전기 영동한 아가로스 겔로부터 잘라내어, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN)에 의하여 정제하고 40 ㎕의 멸균수에 추출하였다. DNA 5 ㎕으로 pGEM-T Easy Vector (Promega사) 0.5 ㎕에 10 x T4 ligase buffer 1 ㎕, T4 DNA Ligase 1 ㎕, 멸균수 2.5 ㎕을 가하고, 16℃에서 1 시간 반응시키고, DNA와 벡터를 결합시켰다. 이노우에 등의 방법 (Gene, vol 96, 1990, pp 23-28)그리고 작성한 대장균 DH5α의 컴피턴트 셀에 DNA를 가하고 정법에 따라서 형질 전환시킨다.

출현한 콜로니를 2xYT 배지에서 하루 낮밤 배양하고, Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega사)로 미니프리하고, 플라스미드 DNA를 회수하였다. PCR 산물이 들어간 플라스미드 DNA를 BECKMAN COULTER사의 CEQ 2000XL DNA analysis system으로 해석하고 배열을 결정하였다. CEQ2000 Dye Terminator Cycle Sequencing with Quick Start Kit를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라 반응시키고 해석하였다. 시퀀스 프라이머는 pGEM-T Easy의 프라이머 및 HCV의 배열에 적합한 것을 적절하게 선택하였다. 배열의 해석은 MacVector (Accelrys사) 및 Sequencher (Gene Codes사로 해석하였다.

검출된 TF 게놈의 핵산 배열 및 그로부터 추정되는 아미노산 배열을 배열표에 나타낸다. 검체 BP 203은 배열 번호 9 내지 12에, BP204는 배열 번호 13과 14에, BP208는 배열 번호 15와 16에, BP295는 배열 번호 17과 18에, BP325는 배열 번호 19와 20에, BP368는 배열 번호 21과 22에, BP373는 배열 번호 23 내지 28에, BP1는 배열 번호 29 내지 34에, BP2는 배열 번호 35 내지 38에 각각 기재하였다. 배열의 결정에 의하여, 어느 하나의 프라이머의 조합으로 FLF가 검출된 것, TF가 검출된 것을 정리하여 표 2에 나타내었다.

TF만이 검출된 검체가 6 검체, FLF와 TF가 검출된 검체가 5 검체, FLF만이 검출된 검체가 6 검체, 나머지의 검체는 어느 것도 검출되지 않았다. 두 가지 모두 검출된 검체는 대부분이 유전자형 2이며, 사용한 cDNA 합성 프라이머, 1st PCR, 2nd PCR 의 프라이머는 유전자형 1의 배열을 기초로 합성하였기 때문에, 유전자형 2의 HCV-RNA의 배열과는 일치하지 않는 부분이 있고, PCR 산물을 얻을 수 없는 검체가 많았던 것으로 생각된다.

TF 게놈의 해석

얻은 HCV-RNA의 TF의 배열을 No.D89815의 HCV의 배열의 구조와 비교 검토하였다. 도 2는 TF만이 검출된 BP207, BP368, BP373, BP1, BP2 및 BP203의 구조를 나타내고 있다. 결실 부분은 약 2 kb이지만, BP207와 완전히 동일한 영역이 결실되어 있는 것은 없고, 각각의 환자에게서 결실 영역이 차이가 났다. BP203는 유전자형 2의 검체에서 유일하게 TF가 검출된 검체이지만, 동일한 결실이 발견되었고, 결실 부분은 핵산 번호의 988에서 2988위에 존재하고 있었다.

이들 HCV--RNA에 공통되어 있는 것은 BP207와 같이 인프레임으로 결실이 일어나고 있고, 결실 부분을 제외하고는 HCV의 폴리프로테인을 합성하고 있는 것으로 생각된다. 특히 코어 단백을 코드하는 유전자를 정상적인 형태로 유지하고 있고, 코어 단백도 정상적으로 합성될 수 있는 것, NS2의 C말단측의 두 부분의 막 관통 영역이 결실된 것은 없고, NS3 이후의 단백질도 정상적으로 발현할 수 있는 것이 시사된다. 또한 E1와 NS2의 단백을 코드하는 영역이 인프레임으로 결합하고 있기 때문에, E1와 NS2의 융합 단백이 산생되고 있는 것으로 생각된다.

다음에, TF와 FLF의 양쪽 모두가 검출된 검체에 대하여 TF의 배열의 구조를 비교하였다 (도 3). BP204, BP325, BP295, BP288의 배열을 확인하였다. TF만이 검출된 검체와 달리, 코어 단백을 코드하는 영역에 해당하는 유전자가 취득되어 있는 BP204, BP295에서는 코어 영역의 일부 또는 전부가 결실되어 있었다. 또한, 결실 영역의 후반 부분도 NS2를 유지하고, E2영역의 일부를 결실되어 있는 것이 있었다.

다만, 검체의 HCV-RNA도 BP207와 마찬가지로 인프레임으로 결실이 일어나고 있어서, 결실 부분을 제외하고는 HCV의 폴리프로테인을 합성하고 있는 것으로 생각된다.

TF 와 FLF 의 HCV -RNA의 배열의 검토

만성 활동성 간염 환자에게서 TF와 FLF의 HCV-RNA가 취득된 검체에 대하여, 그 중복 부분의 핵산 배열로 추정되는 아미노산 배열을 비교하였다. TF 길이의 PCR 산물을 동일한 방법으로 벡터에 클로닝하고, 핵산 배열을 결정하였다. BP204, BP325, BP208의 FLF의 배열은 각각 배열 번호 39와 40, 41과 42, 43과 44에 나타낸다. 핵산, 아미노산의 배열을 비교하면 BP325는 핵산에서 96.7%, 아미노산에서 97.5%, BP288는 핵산에서 97.3%, 아미노산에서 97.7%인 것으로 보아 동일한 유사종(quasispecies)에 속하는 바이러스라고 생각되었다. 한편, BP204는 핵산에서 82.6%, 아미노산에서 83.6%로 TF 와 FLF의 배열은 괴리되어 있었다.

혈청중으로부터의 TF - HCV - RNA 의 분리

간조직으로부터 TF-HCV-RNA가 검출된 검체에 대하여, 혈청으로부터 TF-HCV-RNA의 분리를 시도하였다. 간생검과 동시에 채혈된 혈청으로부터 High Pure Viral RNA Kit (Roche사)를 이용하여 추출하였다. 혈청 200 ㎕으로부터 첨부한 프로토콜에 따라서, 용출 완충액 50 ㎕에 추출하였다. 여기서 간생검의 검체인 BP368에 대응하는 혈청은 이하 S368라고 기재한다.

RNA 2.5 ㎕를 사용하여, 간생검의 RNA로부터 cDNA를 합성하고, PCR을 실시한 방법과 같은 방법으로, PCR 산물을 취득하였다. S368에 대하여 cDNA 합성을 3297R 프라이머, 제1 PCR을 HCLONGAl과 3297R, 2ndPCR을 85F와 3174AS로 실시하였을 경우에 1.2 kb의 TF의 PCR 산물이라고 생각되는 것을 취득할 수 있었다 (표 4).

다음에, 5'UTR 영역에서의 HCV-RNA의 정량으로 비교적 RNA량이 많았던 S20 4, S207, S368에 대하여, 그 밖의 프라이머의 조합으로 cDNA 합성으로부터 PCR을 실시하였다. 그 결과, S207와 S368는 TF의 길이의 PCR 산물이, S204에서는 FLF의 길이의 PCR 산물이 취득되었다 (표 5). 이 PCR 산물을 마찬가지로 pGEM-T Easy vector에 넣고, 배열을 결정하였다. S207, S368가 결정된 배열은 각각 배열 번호 45과 46, 배열 번호 47과 48에 나타낸다. BP207와 S207 및 BP368와 S368의 중복 부분에 대하여 핵산 및 아미노산의 배열 상동성을 비교하면, BP207와 S207에서 각각 99.4%과 99.3%, P368와 S368에서 98.8%과 97.3%이어서, 동일한 유사종에 속하는 바이러스라고 생각된다 (표 6). 이것은 간장 중에서 복제된 TF-HCV-RNA가 어떤 시스템으로 혈청 중에 방출되고 있는 것이다.

실시예 3. HCV RNA 레프리콘의 작성

pBluescriptIISK(+)의 XhoI와 XbaI 사이트 간에, XhoX-Xba-s 올리고머와 XhoX-Xba-as 올리고머를 어닐링시켜 얻는 링커 단편을 삽입함으로써, pBSIISK (+)△XX를 구축하였다. 또한, pLV207-0007을 Sbf-H1 프라이머와 Cla_as 프라이머를 사용한 PCR에 제공함으로써, 약 0.7 kb의 단편을 증폭시키고, 이것을 pGEM-T Easy에 클로닝함으로써, pLVC-0007 Sbf를 얻었다. pBSIISK(+) △XX의 NotI와 XbaI의 사이트 간에, pLVC-0007Sbf를 NotI와 ClaI로 절단함으로써 얻을 수 있는 약 0.7 kb의 단편과 pLVC_ClaXba 7.2 K를 ClaI와 XbaI로 절단함으로써 얻는 약 7.2 kb의 단편을 연결 삽입함으로써 pSbf-LV207TF를 얻었다.

한편, HCV 항체 양성의 혈청, G14로부터 정제한 RNA에, T7-HC9313b 프라이머를 가하고 SuperscriptII reverse transcriptase (Invitrogen)에 의하여, 제조업체가 권장하는 방법으로 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA 반응액의 일부를 이용하여 T7-HClongH1 프라이머와 1b160Bam 프라이머의 존재하의 EX-Taq DNA polymerase (타카라슈조사)를 사용한 PCR (1 사이클이 95℃, 30초, 55℃, 1분, 74℃, 1분으로 이루어지는 반응을 35 사이클)에 의하여, HCV cDNA를 증폭하였다. 아가로스 겔 전기 영동으로 증폭된 단편을 분리하고, QIAquick gel kit를 사용하여 아가로스 겔로부터 DNA를 정제하였다. 정제한 단편은 pT7-blue T (Novagen)에 클로닝하고, Applied Biosystems DNA sequencer 377A를 사용하여 제조업체가 권장하는 시약, 조건으로 배열을 결정하였다.

다음에, HCV cDNA를 T7-H1V2 프라이머와 nde_core9_as 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 한편 pcDNA 3.1 (+)을 템플릿에 nde_npt_S와 EcoNpt_as 프라이머로 PCR을 실시하고, 네오마이신 내성 유전자 단편을 증폭하였다. 단편을 NdeI의 제한 효소 부위에서 연결시킨 것을 pBluescriptIISK(-)에 클로닝함으로써, HCV cDNA의 5'UTR와 core의 최초의 9 아미노산과 네오마이신 내성 유전자 (네오마이신 인산 전이 효소, NPT-II)와의 융합 단편을 구축하였다. 이 단편을 가지는 플라스미드를 또한 T7-H1V2 프라이머와 Sbf_Npt_R 프라이머를 사용한 PCR을 실시하고, 5'말단에 PacI의 3'말단에 SbfI의 사이트를 가지는 단편을 조제하였다. 이것을 pGEM-T Easy로 클로닝함으로써 pG14UTRcNE0를 얻었다.

pG14UTRcNE0로부터 NotI와 SbfI로 절단함으로써 얻을 수 있는 약 1.2 kb의 단편을, pSbf-LV207TF의 NotI와 SbfI 사이트 사이에 삽입함으로써, pLV207TFRepG14를 얻었다. 이 플라스미드 DNA를 XbaI 와 NotI로 절단한 것을 주형으로, Megascript T7 kit (Ambion)를 사용하여 RNA를 합성하였다. 제조업체가 권장하는 방법으로 RNA를 정제하였다.

사람 간암세포 (Huh7, JCRB0403)는 Dulbecco's modified Eagle medium (D-MEM, IWAKI)에 10% 소 태아 혈청 (FBS), 페니실린과 스트렙토마이신을 각각 50 U/㎖, 50 ug/㎖이 되도록 가한 것을 배양액으로 하여 5% 이산화탄소를 부가하고, 37℃에서 배양을 실시하였다. 컨플루언트가 되기 전의 세포를 트립신, EDTA 처리에 의하여 배양접시로부터 박리시키고, 혈청 첨가 배지에 재현탁함으로써 트립신을 비활성화한다. PBS로 2회 세정 후, 1.25% DMSO를 첨가한 Cytomix (120 mM Potassium chloride, 10 mM Potassium phosphate, 5 mM Magnesium chloride, 25 mM HEPES, 0.15 mM Calcium chloride, 2 mM EGTA, pH 7.6)에 재현탁하고, 갭 0.4 cm의 일렉트로포레이션 큐벳에 옮긴다.

적당량의 RNA를 세포에 가한 후, 5분간 얼음 위에서 충분히 냉각한다. 일렉트로포레이터 (Bio-Rad사)로, 960 uF, 270 V로 펄스를 가한다. 곧 바로 8 ㎖의 배지에 재현탁하여 일부를 플레이트에 뿌린다. 일정 시간 배양한 후, 세포를 0.1 % EDTA, PBS로 박리시키고, 원심 분리에 의하여 침전시켜, 회수하였다. 회수한 세포로부터, Isogen (니폰 진사)을 사용하고, 제조업체가 권장하는 조건에 따라 RNA를 회수하였다. 회수한 RNA에 포함되는 HCV RNA량은 정량적 RT-PCR법으로 해석하였다.

마이너스 사슬의 정량 방법

HCV RNA의 복제가 일어나고 있는 지는 세포 중에 HCV RNA의 5' UTR 영역의 마이너스 사슬을 검출할 수 있는지 아닌지로 조사하였다. 마이너스 사슬의 특이적인 정량법은 일본 공개 특허 공보 평08-187097호에 기재된 마이너스 사슬 RNA의 특이적 검출법과 동일한 방법으로 실시하였다.

pLV207TFRepG14를 주형으로 생체 외에서 합성한 RNA를 일렉트로포레이션으로 도입한 세포로부터 유의한 양의 마이너스 사슬을 검출할 수 있고, HCV RNA를 복제할 수 있는 것이 확인되었다.

실시예 4. 전체 RNA 중의 단축형 RNA 량비와 HCV 관련 질환과의 상관

환자 검체로부터 회수한 RNA에 포함되는 HCV RNA의 정량은 이하와 같이 실시하였다. 5' UTR를 표적으로 한 RNA의 정량을 실시하는 경우에는 Chiba-S , Chiba-AS 프라이머를 사용하였다. QauntiTect SYBR Green RT-PCR Kit (QIAGEN)를 사용하여 제조업체가 권장하는 조건으로 반응액을 조제하고, LightCycler Capillary (Roche diagnostics사)로 옮기고, LightCycler (Roche diagnostics사)에 세트하고, 반응시켜 PCR 산물을 경시적으로 모니터하였다. 적절하게 희석한 생체 외에서 합성한 HCV 5' UTR를 포함하는 기지(旣知)의 농도의 RNA를 표준 물질로서 사용하였다. LightCycler software (V3.5.3)를 이용하고 해석을 실시하였다.

RNA의 정량을 E2의 영역을 표적으로 실시하는 경우에는 HCl986S 프라이머와 HC2199-as 프라이머를 사용하였다. 0neStep RT-PCR kit (QIAGEN)를 사용하여, 제조업체가 권장하는 반응 조건으로 역전사 반응이 일어나게 하였다. 이 반응액을, 등량의 동일한 프라이머를 포함하는 LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche diagnostics사)로 조제한 반응액을 가하고, LightCycler Capillary (Roche diagnostics사)로 옮기고, LightCycler (Roche diagnostics사)에 세트하였다. PCR 반응이 일어나게 하여 산물을 경시적으로 모니터하였다. 적절하게 희석한 생체 외에서 합성한 HCV 5'UTR를 포함하는 기존 농도의 RNA를 표준 물질로서 사용하여 Light Cycler software를 이용하여 정량치를 구하였다.

실시예 5. 단축형 배열을 코드하는 cDNA의 포유류 세포에서의 발현과 HCV 단백질의 해석

pcDNA 3.1의 NotI, XbaI에 pLV207TFRepG14를 NotI, XbaI로 절단하여 얻는 약 8.5 kb의 단편을 삽입함으로써, pcD-LVTRG를 얻었다. 이 플라스미드 DNA를 사람 신장 유래 배양 세포, 293 TRex에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen사)를 사용하여 트랜스펙트하였다. DNA 트랜스펙트 후 4 시간째에 배지를 교환하고, 또한 세포를 18 시간 배양하였다. 세포를 플레이트로부터 회수하고, 원심 분리에 의하여 침전, 회수하였다. 세포를 RIPA 완충액 중에서 피펫팅함으로써 파쇄하고, 원심 분리법으로 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 1/3 양의 3 x SDS sample buffer (187.5 mM Tris-HCl [pH 6.8], 6 % SDS, 125 mM DTT, 30% 글리세롤)를 가하고, 95℃, 5분간 열처리하였다.

폴리아크릴아미드 겔 (다이이치가가쿠야쿠힌사)에 적용하여, 제조업체가 권장하는 방법으로 전기 영동을 실시하였다. 영동 종료후, PVDF막 (Millipore사)에 Semi-Dry blotter (잘트리우스사)를 사용하여 통상적인 방법에 따라 전사하였다. 전사한 막은 TTBS (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20)에서 세정한 후, 10배 희석한 블로킹제 (Milk Diluent / Blocking Solution, Kirkegaad & Perry Laboratories사)중에서 실온, 2 시간 반응시켰다. 여기에 최종농도 0.3 ug/ ㎖가 되도록 희석한 일차 항체를 가하고 실온, 1.5 시간, 진탕하면서 반응시켰다. 반응액을 버리고 TTBS로 3회 세정 후, 40,000배로 희석한 HRP 표지 항체를 가하고, 실온, 1 시간, 진탕하면서 반응시켰다.

반응액을 버리고 TTBS에서 3회 세정 후, SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce사)를 사용하여 실온, 5분간 반응시켰다. 발생한 화학 발광은 LAS1000 (Fuji Film사)을 사용하여 검출하거나, 시그널이 불충분한 경우에는 BioMax Film (Kodak사)를 노광시킴으로써 검출하였다. pLV207TRG의 HCV cDNA에 의하여, 성숙형의 코어 항원 일치하는 위치에, NS3 항원이 성숙형 NS3 항원의 분자량에 일치하는 위치에, 각각 항코어 모노클로날 항체, 항NS3 토끼 항혈청에 의하여 검출되었다.

또한, 항E1 모노클로날 항체와 반응시키면, 분자량 약 35 kd의 정상적인 것에 가까운 분자량의 것이 검출되지만, EndoH 처리 후에 분석하여 반응시킨 경우에는 분자량 24 kd로 변화하였다. 이 분자량은 LV 207의 HCV cDNA가 예상되는 아미노산 배열의 E1와 NS2의 융합 단백질의 아미노산 배열로부터 산출되는 분자량과 거의 일치한다. 이것으로부터 E1와 NS2는 융합 단백질로서 존재하고, 당사슬 수식을 받는 것을 알게 되었다. 이들로부터 LV207의 HCV cDNA에 의하여 코드되는 HCV 폴리프로테인은 FLF형의 폴리프로테인과 동일한 절단 부위에서 절단되고 있는 것을 알게 되었다.

실시예 6. HCV RNA 레프리콘의 작성과 세포에서의 복제

약제 내성 마커인 네오마이신 내성 유전자를 가지지 않는 TF 타입의 레프리콘을 작성하였다. 실시예 3에서 구축한 pSbf-LV207TF의 플라스미드를 NotI와 ClaI로 절단하여 약 0.7 kb의 단편을 얻었다. 이 단편을 실시예 3에서 구축한 플라스미드 pLV207TFRepG14의 NotI와 ClaI 사이트 사이에 삽입함으로써, 플라스미드 pLV207TF를 구축하였다.

이 플라스미드 DNA를 NotI와 XbaI로 절단한 것을 주형으로 하고, Megascript T7 Kit (Ambion사)을 사용하여 RNA를 합성하였다. 이 RNA를 제조업체가 권장하는 방법으로 정제하고, 세포에의 트랜스펙션에 사용하였다.

2일간 배양을 실시한, 사람 간암 세포 Huh7에, 정제한 RNA를 일렉트로포레이션에 의하여 트랜스펙트하였다. 세포를 트립신, EDTA 처리하여 박리시키고, 혈청 첨가 배지에 재현탁하여, 트립신을 비활성화한다. PBS로 2회 세정 후, 1.25 % DMSO를 첨가한 Cytomix (120 mM Potassium chloride, 10 mM Potassium phosphate, 5 mM Magnesium chloride, 25 mM HEPES, 0.15 mM Calcium chloride, 2 mM EGTA, pH 7.6)에 재현탁하고, 약 4×10⁶의 세포를 갭 0.4 cm의 일렉트로포레이션 큐벳에 옮겼다.

10 ㎍의 RNA를 큐벳에 가하고 5 분간 얼음 위에서 충분히 냉각한다. 일렉트로포레이터 (Bio-Rad)로 960 uF, 270 V로 펄스를 가한다. 즉시 8 ㎖의 배지에 재현탁하여, 12 웰의 플레이트 (직경 22.1 mm)에 뿌렸다. 4 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간 및 96 시간 세포를 0.1 % EDTA-PBS로 박리하여 원심 분리로 회수하였다. 세포 펠렛를 50 ㎕ RIPA 완충액 (20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0.1 % Deoxycholate, 0.1 % SDS, complete protease inhibitor cocktail (Roche diagnostics사)에 용해하고, 10 krpm으로 5분간 원심에 의하여 상청을 회수하였다. 상청 10 ㎕를 HCV 코어 항원의 킷 (후지 레비오, 루미펄스사)을 사용하여 측정하였다.

도 4에 나타내는 바와 같이, 코어 항원의 측정값은 24 시간까지는 검출 한계 이하이지만, 48 시간부터 상승하고, 96 시간 후에도 증가하고 있었다. 이것은 본원 발명의 TF 타입의 레프리콘이 세포 중에서 복제되어, 코어 단백질을 복제하고 있는 것을 나타내고 있다. 간장에서 복제하고 있는 구조와 같은 TF 게놈이 생체 외에서 복제 가능한 것을 나타낸 것이다.

실시예 7. 유전자형 2의 HCV 검체로부터의 트런케이트 폼 유전자의 취득

실시예 2에서 만성 간염 환자의 생검법 검체로부터 RT-PCR법에 의하여, 트런케이트 폼 유전자를 검출하였지만, 유전자형 2의 검체로부터는 BP203의 검체를 제외하고, 트런케이트 폼 유전자는 검출할 수 없었다. 이 원인은 검출에 사용한 프라이머의 배열이 유전자형 1의 배열에 기초하여 디자인되었기 때문이라고 생각된다.

그 때문에, 유전자형 2의 배열에 기초하여 프라이머를 디자인하고, 그 프라이머에 의하여, 유전자형 2의 만성 간염 환자의 생검 검체로부터, 트런케이트 폼 유전자의 검출을 시도하였다.

사용하는 프라이머 이외에는 실시예 2의 방법에 따라, 표 1에 나타낸 유전자형 2에 대하여, cDNA 합성, PCR, PCR 프래그먼트의 클로닝, 염기 배열의 결정을 실시하였다. cDNA 합성 및 PCR의 프라이머의 조합은 다음에 나타내는 2조(組)의 조합으로 실시하였다. 프라이머 세트 A 는 cDNA 합성이 2a_HC3293R, 1st PCR이 2a_807S 및 2 a_3216R, 2nd PCR이 2a_HC835S 및 2a_HC3203R로, 프라이머 세트 B는 cDNA 합성이 2a_HC3156R, 1st PCR가 2a_807S 및 2a_3144R, 2nd PCR가 2a_HC835S 및 2a_HC3108R이다. 각각의 프라이머의 배열을 아래와 같이 나타낸다.

2a_HC3293R: TCTCCATTGGGCTGAACACCACAGGCTCCAC (배열 번호 84)

2a_HC3216R: GGGGAGAGGTGGTCATAGATGTAAGTGCCGG (배열 번호 85)

2a_HC3203R: CATAGATGTAAGTGccGGTCCACCTGCCTA (배열 번호 86)

2a_HC3144R: CTCCTGCGAGGTGTCTCACCAGGGTACACA (배열 번호 87)

2a_HC3108R: AGCAGAGCGTGAGCTCTGACGAAGTATGG (배열 번호 88)

2a_HC835S: GGAATCTACCCGGTTGCTCTTTTTCTATCTTC (배열 번호 89)

2a_HC807S: CTGGAAGACGGGATAAATTATGCAACAGGGAA (배열 번호 90)

표 6에 나타내는 바와 같이, 프라이머 세트 A에서 9 검체 중 6 검체에 있어서, 프라이머 세트 B에서 9 검체 중 2 검체에 있어서, 결실을 가지는 유전자가 검출되었다. 유전자의 배열을 결정하였더니, BP203는 987-2999nt, BP235는 1060-2945, BP297는 1024-2966에 약 2 kb의 결실을 가지고, 인프레임으로 결합하고 있는 전형적인 트런케이트 폼 유전자이었다. 결실 부분의 배열을 도 5에 나타낸다.

실시예 8. 만성 활동성 간염 환자 및 간암 환자의 간장 조직으로부터의 트런케이트 폼 유전자의 검출율에 대하여

실시예 2 및 실시예 7의 결과를 정리하면, BP207를 포함하는 24 검체의 만성 활동성 간염 환자의 간장 조직 중 BP207, BP203, BP325, BP297, BP368, BP373의 6검체로부터, E1로부터 NS2에 걸친 약 2 kb의 유전자가 인프레임으로 결실되어 있는 전형적인 트런케이트 폼 유전자가 검출되었다. 한편, 3 검체의 간암 조직에서는 BP1와 BP2로부터 동일한 전형적인 트런케이트 폼 유전자가 검출되었다. 각각의 검출율은 만성 간염 환자에서 25% (6/24), 간암 환자에서 66.6% (2/3)이고, 만성 간염으로부터 간암으로 진행됨에 따라, 검출율이 높아졌다.

또한, 무증후성 캐리어의 혈장으로부터의 20 검체로부터, 트런케이트 폼 유전자의 검출을 시도하였지만, 전형적인 트런케이트 폼 유전자는 검출할 수 없었다. 이 결과는 만성 간염, 간경변, 간암과 C형 간염 바이러스의 감염에 의한 병상의 진행과 트런케이트 폼 유전자의 존재가 어떠한 관련이 있는 것을 나타낸다. 즉, 트런케이트 폼 유전자의 검출은 병상의 진행의 예측 인자로서 유용한 것으로 생각된다.

실시예 9. 극증 간염 환자로 부터의 트런케이트 폼 유전자의 취득

극증 간염 환자의 혈청으로부터 트런케이트 폼 유전자의 취득을 시도하였다. 환자 혈청으로부터 RNA의 추출 시약인 ISOGEN-LS (니폰 진사)를 사용하여 첨부한 지시서에 따라서, RNA를 추출하였다.

이 RNA로부터 실시예 1에서 BP207로부터 유전자를 취득한 것과 동일한 순서로, 제85위에서 9302위까지의, HCV유전자를 취득하였다. pGEM-T easy 벡터에 클로닝한 11 클론의 배열을 결정하였더니, 10 클론은 922위에서 1062위, 1096위에서 1131위 및 1209위에서 2997위까지가 결실된 전형적인 트런케이트 폼 유전자이었다. 또한, 나머지 1 클론은 1096위 내지 1131위의 결실은 없었지만, 922위 내지 1062위 및 1209위 내지 2997위가 결실된 전형적인 트런케이트 폼 유전자이었다.

또한, 이 환자의 RNA로부터 실시예 1에 기재되어 있는 방법으로 5' 비번역 영역과 3' 비번역 영역의 cDNA의 취득을 실시하였다.

다음에, 5' 비번역 영역의 말단의 배열을 결정하기 위하여, 5' RACE법에 의하여 말단 배열의 취득을 시도하였다. 환자 RNA로부터 5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Version 2.0 (Invitrogen사)의 킷을 사용하여 첨부한 지시서에 따라서, HCV의 5' 비번역 영역의 말단을 취득하였다. cDNA 합성을 위한 안티센스 프라이머는 Chiba-as를 사용하였다. SuperScript II Reverse Transcriptase로 cDNA를 합성하고, S.N.A.P. column으로 정제후, cDNA에 TdT-tailing 반응을 실시하여 dCTP를 부가하였다. 이 cDNA를 킷에 첨부한 5' RACE Abridged Anchor 프라이머 및 KY78 프라이머: 5'-CTCGCAAGCACCCTATCAGCCAGT-3' (배열 번호: 91)로, LA Taq (TAKARA사)를 사용하여, 1st PCR을 실시하였다. 이 PCR 산물의 일부를 주형으로, 킷에 첨부한 UAP 프라이머와 KM2 프라이머: 5'-AGGCATTGAGCGGGTTTATC-3' (배열 번호: 92)로, LA Taq (TAKARA)를 사용하여 2nd PCR을 실시하고, PCR 산물을 얻었다. 이 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터로 클로닝하고, 배열을 결정하였다. 그 결과, 이 트런케이트 폼 유전자는 통상의 풀 렝쓰의 HCV의 유전자와 같이, 제1위의 배열로부터 5' 비번역 영역을 가지고 있었다.

또는 3' 비번역 영역의 말단의 배열을 결정하기 위하여, 3' RACE법에 의하여 말단의 배열의 취득을 시도하였다. 우선 환자의 RNA에 Poly(A)Tailing Kit (Ambion, Inc)을 사용하여, 첨부한 지시서에 따라서, Poly(A)를 부가하였다. 이 Poly(A)의 부가된 RNA로부터, dT-Adp 프라이머 5' -CTAGACTCGAGTCGACATCGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (배열 번호: 93)를 사용하여 실시예 1에 기재된 cDNA 합성 순서와 같이 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로서 3 UTR-lF프라이머: 5'-ATCTTAGCCCTAGTCACGGC-3' (배열 번호: 94) 및 Adp 프라이머: 5' -CTAGACTCGAGTCGACATCG-3' (배열 번호: 95)로 1st PCR을, XR58F : 5'-CT AGCTGTGAAAGGTCCGTGAGccGCATGA-3' (배열 번호: 96) 및 Adp 프라이머 (배열 번호: 95)로 2nd PCR을 LA Taq (TAKARA)를 사용하여 실시하였다. 이 PCR 산물을 pGEM-T easy 벡터로 클로닝하고, 배열을 결정하였다. 그 결과, 이 트런케이트 폼 유전자의 3' 말단은 통상의 전장(full-length) HCV의 유전자와 동일한 3'말단을 가지고 있었다.

본 발명의 활용예로서 레프리콘 복제계는 C형 간염 바이러스의 치료약의 개발을 위한 약제 스크리닝에 이용할 수 있다. 이 계는 치료약의 약효 평가, 제조에도 이용 가능하다. 또한 TF 게놈의 검출계는 C형 간염의 병태 마커로서도 이용 가능하고, 진단약으로서 유용하다.

<110> Advanced Life Science Institute, Inc. <120> HCV RNA HAVING NOVEL SEQUENCE <130> CH-067087 <150> JP 2004-188543 <151> 2004-06-25 <150> JP 2004-190144 <151> 2004-06-28 <150> JP 2004-277677 <151> 2004-09-24 <160> 96 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 7785 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> 5'UTR <222> (1)..(341) <220> <221> gene <222> (342)..(7559) <220> <221> CDS <222> (342)..(950) <223> core protein <220> <221> CDS <222> (951)..(1607) <223> truncated E1-NS2 fusion protein <220> <221> CDS <222> (1608)..(3500) <223> NS3 protein <220> <221> CDS <222> (3501)..(3662) <223> NS4A protein <220> <221> CDS <222> (3663)..(4442) <223> NS4B protein <220> <221> CDS <222> (4443)..(5786) <223> NS5A protein <220> <221> CDS <222> (5787)..(7559) <223> NS5B protein <220> <221> 3'UTR <222> (7560)..(7775) <400> 1 gccagccccc tgatgggggc gacactccac catagatcac tcccctgtga ggaactactg 60 tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac 120 cccccctccc gggagagcca tagtggtctg 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gca gga tgg ctc ctg tca 638 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggc tct cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc cgg cgt agg 686 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgt aac ttg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca tgc ggc ttc gcc 734 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tac att ccg ctc gtc ggt gcc ccc cta ggg ggc gct 782 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc cta gca cat ggt gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac 830 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tac gca aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 878 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct ctg ctg tcc tgt ctg acc atc cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc 926 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg 180 185 190 195 aac gtg tcc gga ata tac cat 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ggg tat aag gta ctc gtc ctg aac ccg tcc gtt gcc gcc acc 2312 Ala Gln Gly Tyr Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr 220 225 230 235 ctg agt ttt ggg gcg tat atg tcc aag gca cat ggt gtc gac cct aac 2360 Leu Ser Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn 240 245 250 atc aga act ggg atg agg acc atc acc aca ggc gct ccc atc acg tac 2408 Ile Arg Thr Gly Met Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr 255 260 265 tcc acc tat ggc aag ttc ctt gcc gac ggt ggt tgt tcc ggg ggc gcc 2456 Ser Thr Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala 270 275 280 tat gac atc ata tta tgt gat gag tgc cac tca act gac tca act act 2504 Tyr Asp Ile Ile Leu Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr 285 290 295 gtt tta ggc atc ggc aca gtt ctg gac caa gcg gag acg gct gga gcg 2552 Val Leu Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala 300 305 310 315 cga ctc gtc gtg ctc gcc acc gct acg cct cca gga tcg gtc acc gtg 2600 Arg Leu Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr 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Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Trp Cys Leu 565 570 575 Leu Leu Leu Ser Val Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 580 585 590 <210> 9 <211> 1060 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (229)..(1059) <400> 9 ccaggccccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa 60 ttaccggaaa gactgggtcc tttcttggat aaacccactc tatgtccggt catttgggcg 120 tgcccccgca agactgctag ccgagtagcg ttggggtgcg aagggccttg tggtactgcc 180 tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac cgtgcatc atg agc aca 237 Met Ser Thr 1 aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa aga agc aca aac cgc cgc cca 285 Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg Pro 5 10 15 cag gac gtc aag ttc ccg ggt ggc ggt cag atc gtt ggc gga gtt tac 333 Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr 20 25 30 35 ttg ctg ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg aca agg aag 381 Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys 40 45 50 act tcc gag cga tcc cag ccg cgt ggg aga cgc cag ccc atc ccg aaa 429 Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys 55 60 65 gat cgg cgc tcc acc ggc aag tcc tgg gga aag cca gga tat cct tgg 477 Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr Pro Trp 70 75 80 ccc ctg tat gga aac gag ggt tgc ggc tgg gca ggt tgg ctc ctg tcc 525 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggg tct cgt cct act tgg ggc ccc acc gac ccc cgg cac aga 573 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Thr Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg 100 105 110 115 tca cgc aat tgg ggt aaa gtc atc gat acc ctt acg tgt ggt ttt gcc 621 Ser Arg Asn Trp Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tac atc cct gtc att ggc gcc ccg gtc gga ggc gtt 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Val Ile Gly Ala Pro Val Gly Gly Val 135 140 145 gcc aga gcc cta gcg cac ggt gtt agg gtc ctg gaa gac ggg gtg aat 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tac gca aca ggg aat cta ccc ggt tgc tct ttt tct atc ttc ttg ctt 765 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gcc ctt ctg tcg tgc gtc aca gtg cca gtg tct gca gtg gag gtc agg 813 Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Val Pro Val Ser Ala Val Glu Val Arg 180 185 190 195 aac att agt tct agc tac tat gcc act aac gat tgc tcg gac aac agc 861 Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Asn Asp Cys Ser Asp Asn Ser 200 205 210 atc acc tgg cag cgc ctt gtg ttt gaa gtc aca aaa tgg ttg tta gca 909 Ile Thr Trp Gln Arg Leu Val Phe Glu Val Thr Lys Trp Leu Leu Ala 215 220 225 atc ctg ggg tct gcc cac ctc ctt aaa gcg tcc ctg cta cgg gtg cca 957 Ile Leu Gly Ser Ala His Leu Leu Lys Ala Ser Leu Leu Arg Val Pro 230 235 240 tac ttt gtg agg gct cac gct ctg cta cgg gtg tgt acc ctg gtg agg 1005 Tyr Phe Val Arg Ala His Ala Leu Leu Arg Val Cys Thr Leu Val Arg 245 250 255 cac ctt gca gga gct aag tac atc cag atg ctg ttg atc act gtg ggc 1053 His Leu Ala Gly Ala Lys Tyr Ile Gln Met Leu Leu Ile Thr Val Gly 260 265 270 275 agg cgg a 1060 Arg Arg <210> 10 <211> 277 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 10 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Thr Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg His Arg Ser Arg Asn Trp Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Val Ile Gly Ala Pro Val 130 135 140 Gly Gly Val Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Val Pro Val Ser Ala Val 180 185 190 Glu Val Arg Asn Ile Ser Ser Ser Tyr 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Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr 20 25 30 35 ttg ctg ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg aca agg aag 381 Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys 40 45 50 act tcc gag cga tcc cag ccg cgt ggg aga cgc cag ccc atc ccg aaa 429 Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys 55 60 65 gat cgg cgc tcc acc ggc aag tcc tgg gga aag cca gga tat cct tgg 477 Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly Tyr Pro Trp 70 75 80 ccc ctg tac gga aac gag ggt tgc ggc tgg gca ggt tgg ctc ctg tcc 525 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggg tct cgt cct act tgg ggc ccc acc gac ccc cgg cac aga 573 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Thr Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg His Arg 100 105 110 115 tca cgc aat ttg ggt aaa gtc atc gat acc ctt acg tgt ggt ttt gcc 621 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tac atc cct gtc att ggc gcc ccg gtc gga ggc gtt 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Val Ile Gly Ala Pro Val Gly Gly Val 135 140 145 gcc aga gcc cta gcg cac ggt gtt agg gtc ctg gaa gac ggg gtg aat 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tac gca aca ggg aat cta ccc ggt tgc tct ttt tct atc ttc ttg ctt 765 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gcc ctt ctg tcg tgc gtc aca gtg cca gtg tct gca gtg gag gtc agg 813 Ala Leu Leu Ser Cys Val Thr Val Pro Val Ser Ala Val Glu Val Arg 180 185 190 195 aac att agt tct agc tac tat gcc act gac gat tgc tcg aac aac agc 861 Asn Ile Ser Ser Ser Tyr Tyr Ala Thr Asp Asp Cys Ser Asn Asn Ser 200 205 210 atc acc tgg cag cgc ctt gtg ttt gaa gtc aca aaa tgg ctg tta gca 909 Ile Thr Trp Gln Arg Leu Val Phe Glu Val Thr Lys Trp Leu Leu Ala 215 220 225 atc ctg ggg tct gcc cac ctc ctt aaa gcg tcc ctg cta cgg gtg cca 957 Ile Leu Gly Ser Ala His Leu Leu Lys Ala Ser Leu Leu Arg Val Pro 230 235 240 tac ttt gtg agg gct cac gct ctg cta cgg gtg tgt acc ctg gtg agg 1005 Tyr Phe Val Arg Ala His Ala Leu Leu Arg Val Cys Thr Leu Val Arg 245 250 255 cac ctt gca gga gct aag tac atc cag atg ctg ttg atc act gta ggc 1053 His Leu Ala Gly Ala Lys Tyr Ile Gln Met Leu Leu Ile Thr Val Gly 260 265 270 275 agg tgg acc ggc act tac atc tat gtc cac ctc tcc ccc tta tca act 1101 Arg Trp Thr Gly Thr Tyr Ile Tyr Val His Leu Ser Pro Leu Ser Thr 280 285 290 tgg gca gct cag ggt ttg cgg gac ctg gcg gtc gcc gtg gag cct gtg 1149 Trp Ala Ala Gln Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val 295 300 305 gtg ttc agc cca 1161 Val Phe Ser Pro 310 <210> 12 <211> 311 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 12 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly 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Val Glu Pro Val Val Phe Ser Asp 280 285 <210> 14 <211> 289 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 14 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg 85 90 95 Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 100 105 110 Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 115 120 125 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala 130 135 140 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu 145 150 155 160 Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Val Pro Pro Leu Asn 165 170 175 Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala Val His 180 185 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gtc cgg gag aac aac cgc tct cgc tgc tgg gta gcg 192 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Arg Ser Arg Cys Trp Val Ala 50 55 60 ctc acc cct acg ctc gcg gcc aga aac agc agc atc ccc act gcg aca 240 Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Ile Pro Thr Ala Thr 65 70 75 80 ata cga cgc cat gtc gat ttg ctc gtt ggg gca gcc gct ctc tgc tcc 288 Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ser 85 90 95 gcc atg tat gtg ggg gat ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtg ttc ttc 336 Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Phe Phe 100 105 110 tgt gct gcc tgg tat atc aag ggt aag ctg gtc ccc ggg gcg gca tat 384 Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Lys Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr 115 120 125 gct ttt tat agc gta tgg ccg ctg ctc ctg ctc ttg ctg gcg cta cca 432 Ala Phe Tyr Ser Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro 130 135 140 cca cga gcg tac gct atg gac cgg gag atg gct gca tca tgt gga ggc 480 Pro Arg Ala Tyr Ala Met Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser Cys Gly Gly 145 150 155 160 ggg gtc ttc ata ggt cta ata atc ttg act ttg tca ccg cac tat aaa 528 Gly Val Phe Ile Gly Leu Ile Ile Leu Thr Leu Ser Pro His Tyr Lys 165 170 175 gca ttc ctc gct agg ctt ata tgg tgg tta caa tat ttt atc acc agg 576 Ala Phe Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Ile Thr Arg 180 185 190 acc gag gcg cac ttg caa gtg tgg atc ccc cct ctc aac gtt cgg ggg 624 Thr Glu Ala His Leu Gln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn Val Arg Gly 195 200 205 ggc cgt gat gcc atc atc ctc ctc atg tgc gtg gtc cat cca gag cta 672 Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Met Cys Val Val His Pro Glu Leu 210 215 220 att ttt gaa atc acc aag atc ttg ctc gcc ata ctg ggt ccg ccc atg 720 Ile Phe Glu Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Pro Met 225 230 235 240 gtg ctc cag gcc ggc ctg att agg gtg ccg tac ttc gtg cgc gct caa 768 Val Leu Gln Ala Gly Leu Ile Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln 245 250 255 ggg ctc att cgt gca tgc at 788 Gly Leu Ile Arg Ala Cys 260 <210> 16 <211> 262 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 16 Leu Leu Ala Leu Leu 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Val Val His Pro Glu Leu 210 215 220 Ile Phe Glu Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Pro Met 225 230 235 240 Val Leu Gln Ala Gly Leu Ile Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln 245 250 255 Gly Leu Ile Arg Ala Cys 260 <210> 17 <211> 1504 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (233)..(1504) <400> 17 ccaggtcccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa 60 ttgccaggac gaccgggtcc tttcttggat taacccgctc aatgcctgga gatttgggcg 120 tgcccccgcg agactgctag ccgagtagtg ttgggtcgcg aaaggccttg tggtactgcc 180 tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac cgtgcaccat gg 232 atg aat acc acc ggg ttc acc aag acg tgc ggg ggc ccc ccg tgt aac 280 Met Asn Thr Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn 1 5 10 15 atc ggg ggg gtc ggc aat aac acc ctg acc tgt ccc acg gac tgc ttc 328 Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe 20 25 30 cgg aag cac ccc gag gct acg tac acg cga tgc ggt tcg ggg cct tgg 376 Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Arg Cys Gly Ser Gly Pro 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Ala Val Phe Ile Gly Leu 260 265 270 gca ctc ttg acc ttg tca cca tac tac aaa gtg ttc ctc gct agg ctc 1096 Ala Leu Leu Thr Leu Ser Pro Tyr Tyr Lys Val Phe Leu Ala Arg Leu 275 280 285 ata tgg tgg tta caa tac ttt atc act aga gcc gag gcg cac ttg caa 1144 Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe Ile Thr Arg Ala Glu Ala His Leu Gln 290 295 300 gtg tgg gtc ccc ccc ctt aac gct cgg gga ggc cgc gat gcc atc atc 1192 Val Trp Val Pro Pro Leu Asn Ala Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile 305 310 315 320 ctt ctc aca tgt gca gtc cat cca gag cta atc ttt gac atc acc aaa 1240 Leu Leu Thr Cys Ala Val His Pro Glu Leu Ile Phe Asp Ile Thr Lys 325 330 335 atc ctg ctc gcc ata ttt ggt cca ctc atg gtc ctc cag gct agt ata 1288 Ile Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Ser Ile 340 345 350 act gca gtg ccg tac ttt gtg cgc gct caa ggg ctc att cgt gca tgc 1336 Thr Ala Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys 355 360 365 atg ttg gtg cgg aaa gtt gct ggg ggc cat tat gtc caa atg gcc ttc 1384 Met Leu Val Arg Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Phe 370 375 380 atg aag ctg gca gca ctg aca ggt acg tac gtt tac gac cat ctt act 1432 Met Lys Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr 385 390 395 400 ccg ctg cgg gac tgg gcc cac gcg ggc cta cgg gac ctt gcg gtg gca 1480 Pro Leu Arg Asp Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala 405 410 415 gta gag ccc gtt gtc ttc tct gac 1504 Val Glu Pro Val Val Phe Ser Asp 420 <210> 18 <211> 424 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 18 Met Asn Thr Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn 1 5 10 15 Ile Gly Gly Val Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe 20 25 30 Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Thr Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp 35 40 45 Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr 50 55 60 Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly 65 70 75 80 Gly Val Glu His Arg Leu Ser Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu 85 90 95 Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu 100 105 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ggc tac cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc cgg cgt agg 573 Pro Arg Gly Tyr Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgt aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca tgc ggc ttc gcc 621 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tat att ccg ctt gtc ggc gcc cct tta gga ggc gct 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc ctg gca cat ggt gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aat 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tat gca aca ggg aat ttg cct ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 765 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct ctg ctg tcc tgt ttt acc acc cca gct tcc gct tat gga gtg cgc 813 Ala Leu Leu Ser Cys Phe Thr Thr Pro Ala Ser Ala Tyr Gly Val Arg 180 185 190 195 acg tgc gcg gtc cat cca gag cca atc ttt gac atc acc aac ctc ctg 861 Thr Cys Ala Val His Pro Glu Pro Ile Phe Asp Ile Thr Asn Leu Leu 200 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Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Val Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Tyr Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Phe Thr Thr Pro Ala Ser Ala Tyr 180 185 190 Gly Val Arg Thr Cys Ala Val His Pro Glu Pro Ile Phe Asp Ile Thr 195 200 205 Asn Leu Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly 210 215 220 Ile Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala 225 230 235 240 Cys Met Leu Val Arg Lys Ala Pro Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala 245 250 255 Leu Met Arg Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu 260 265 270 Ala Pro Leu Gln His Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val 275 280 285 Ala Val Glu Pro Val Ile Phe Ser Asp 290 295 <210> 23 <211> 1143 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (229)..(1143) <400> 23 ccaggtcccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa 60 ttgccaggac gaccgggtcc tttcttggat caacccgctc aatgcctgga gatttgggcg 120 tgcccccgcg agactactag ccgagtagtg ttgggtcgcg aaaggccttg tggtactgcc 180 tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac cgtgcatc atg agc aca 237 Met Ser Thr 1 aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac cgc cgc cca 285 Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro 5 10 15 cag gac gtc aag ttc ccg ggc ggt ggc cag atc gtt ggt gga gtt tac 333 Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr 20 25 30 35 ctg ttg ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg act agg aag 381 Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys 40 45 50 act tcc gag cgg tcg caa cct cgt gga agg cga caa cct atc ccc aag 429 Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys 55 60 65 gct cgc cga ccc gag ggc agg gcc tgg gca cag ccc ggg tac cct tgg 477 Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp 70 75 80 cct ctc tat ggc aat gag ggc ctg ggg tgg gct gga tgg ctc ctg tca 525 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggc tcc cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc cgg cgt agg 573 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgc aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctc act tgc ggc ttc gcc 621 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta gga ggt gct 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac ggc gtg aac 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tac gca aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 765 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct tta ctg tcc tgt ttg acc atc cca gct tcc gct cat caa gtg cgc 813 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Gln Val Arg 180 185 190 195 aac gtg tcc ggg gtg tac cat gtc acg aac aac tgc tcc aac tca aga 861 Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asn Cys Ser Asn Ser Arg 200 205 210 att gtg gac atc acc aag att ttg ctc gcc ata ttt ggc ccg ctc atg 909 Ile Val Asp Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro Leu Met 215 220 225 gcg ctc cag gct ggt tta act aga gtg ccg tac ttt gta cgc gct cat 957 Ala Leu Gln Ala Gly Leu Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala His 230 235 240 ggg ctc atc cgt gtg tgc atg ttg gtg cgg aaa gtc tct ggg ggt cat 1005 Gly Leu Ile Arg Val Cys Met Leu Val Arg Lys Val Ser Gly Gly His 245 250 255 tac gtc cag atg gct ctc atg agg ctg gcc gca ctg acg ggc acg tac 1053 Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Arg Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr 260 265 270 275 gtc tat aac cat ctt act ccg ctg cgg gac tgg gcc cac gtg ggc ctg 1101 Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Ala His Val Gly Leu 280 285 290 cga gac ctt gca gtg gca gtt gag cct gtc atc ttc tct gac 1143 Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Ile Phe Ser Asp 295 300 305 <210> 24 <211> 305 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 24 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp 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tgt ttg acc atc cca gct tcc gct cat caa 48 Leu Leu Thr Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Gln 1 5 10 15 gtg cgc aac gtg tcc ggg gtg tac cat gtc atg aac aac tgc tcc aac 96 Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Met Asn Asn Cys Ser Asn 20 25 30 tca agt att gtg gac atc acc aag att ttg ctc gcc ata ttt ggc ccg 144 Ser Ser Ile Val Asp Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro 35 40 45 ctc atg gtg ctc cag gct ggt tta act aga gtg ccg tac ttc gta cgc 192 Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg 50 55 60 gct cat ggg ctc atc cgt gtg tgc atg ttg gtg cgg aaa gtc tct ggg 240 Ala His Gly Leu Ile Arg Val Cys Met Leu Val Arg Lys Val Ser Gly 65 70 75 80 ggt cat tac gtc cag atg gct ctc atg agg ctg gcc gca ctg acg ggt 288 Gly His Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Arg Leu Ala Ala Leu Thr Gly 85 90 95 acg tac gtc tat aac cat ctt act ccg ctg cgg gac tgg ggc cac gcg 336 Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp Gly His Ala 100 105 110 ggc ctg cga gac ctt gca gtg gca gtt gag cct gtc atc ttc tct gac 384 Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Ile Phe Ser Asp 115 120 125 atg gag acc aag atc atc acc tgg ggg gcg gac acc gcg gcg tgc ggg 432 Met Glu Thr Lys Ile Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly 130 135 140 gac atc atc tca ggt cta ccc gtc tcc gcc cga agg ggg agg gag ata 480 Asp Ile Ile Ser Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly Arg Glu Ile 145 150 155 160 tta ctg gga ccg gcc gac agt ttt gga gag cga ggg tgg cga ctc ctt 528 Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser Phe Gly Glu Arg Gly Trp Arg Leu Leu 165 170 175 gcg cct att acg gcc tac tcc caa caa acc cgg ggc ctg ctt ggc tgc 576 Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys 180 185 190 atc atc act agc ctt aca ggt cgg gac aag aac cag gtt gag ggg gag 624 Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu 195 200 205 gtt cag gtg gtt tcc acc gca acg caa tct ttc ccg gcg acc tgc gtc 672 Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Pro Ala Thr Cys Val 210 215 220 aac ggc gta cgt tgg act gtc tac cat ggt gcc ggc tca aag acc cta 720 Asn Gly Val Arg Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser Lys Thr Leu 225 230 235 240 gcc ggc cca aag ggc cca gtc acc cag atg tac acc aat gta gac cgg 768 Ala Gly Pro Lys Gly Pro Val Thr Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp Arg 245 250 255 gac ctc gtt ggt tgg ccg gcg ccc tct ggg gcg cgc tcc ttg aca cca 816 Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Ser Gly Ala Arg Ser Leu Thr Pro 260 265 270 tgc acc tgt ggc agc tca gac ctc tac c 844 Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr 275 280 <210> 26 <211> 281 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 26 Leu Leu Thr Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Gln 1 5 10 15 Val Arg Asn Val Ser Gly Val Tyr His Val Met Asn Asn Cys Ser Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Val Asp Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile Phe Gly Pro 35 40 45 Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg 50 55 60 Ala His Gly Leu Ile Arg Val Cys Met Leu Val Arg Lys Val Ser Gly 65 70 75 80 Gly His Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Arg Leu Ala Ala Leu Thr Gly 85 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cct ctc tat ggc aat gag ggc ctg ggg tgg gca gga tgg ttc ctg tca 525 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Phe Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggc tcc cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc cgg cgt agg 573 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgc aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctc act tgc ggc ttc gcc 621 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc tta gga ggt gct 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac ggc gtg gac 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asp 150 155 160 tac gca aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 765 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct tta ctg tcc tgt ttg acc atc cca gct tcc gct cat caa gtg cgc 813 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Gln Val Arg 180 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Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys 40 45 50 act tcc gag cgg tcg caa cct cgt gga agg cga caa cct atc ccc aag 428 Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys 55 60 65 gct cgc cag ccc gag ggt agg gcc tgg gct cag ccc ggg tac cct tgg 476 Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp 70 75 80 ccc ctc tac ggc aat gag ggc ctg ggg tgg gca gga tgg ctc ctg tca 524 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggc tct cgg cct agt tgg ggc ccc aca gac ccc cgg cgt agg 572 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgt aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc 620 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc acg ggg tac atc ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct 668 Asp Leu Thr Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc ttg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac 716 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tat gca aca ggg aac ctt ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 764 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct ttg ctg tcc tgt ttg acc att cca gcc tcc gcc cat gtc ccc cct 812 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Val Pro Pro 180 185 190 195 ctc aac gtc cgg gga ggc cgc gac gcc atc atc ctt ctc aca tgt gcg 860 Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala 200 205 210 gtc cac tca gag cta gtt ttt aaa atc acc aaa atc ttg ctt gca ata 908 Val His Ser Glu Leu Val Phe Lys Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile 215 220 225 ctt ggt ccg ctc atg gtg ctc cag gct ggt ctc gtt agg gtg ccg tac 956 Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu Val Arg Val Pro Tyr 230 235 240 ttc gtg cgc gcc caa ggg ctt atc cgt gca tgc atg ttg gtg cgg aag 1004 Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys 245 250 255 atc gct ggg ggt cat tat gtc caa atg gct ttc gtg aag ctg gcc gca 1052 Ile Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Phe Val Lys Leu Ala Ala 260 265 270 275 ctg acg ggc acg tac gtc tat gac cat ctt act cca ctg cgg gac tgg 1100 Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp 280 285 290 gcc cac acg ggc ctg cga gac ctc gcg gtg gcg gtc gag ccc gtc gtc 1148 Ala His Thr Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Val 295 300 305 ttc tct gac atg ggg acc aag atc atc acc tgg ggg gcg gac acc gcg 1196 Phe Ser Asp Met Gly Thr Lys Ile Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala 310 315 320 gcg tgc ggg gac atc atc tcg ggt ctg ccc gtc tcc gct cgg agg ggg 1244 Ala Cys Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly 325 330 335 agg gag ata ctc ctg gga ctg gcc gat agt ttc gga gag cag gga tgg 1292 Arg Glu Ile Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ser Phe Gly Glu Gln Gly Trp 340 345 350 355 cga ctc ctt gcg cct atc acg gcc tac tcc caa cag acg cgg ggt tta 1340 Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln Thr Arg Gly Leu 360 365 370 ctt ggc tgc atc atc act agc ctc aca ggc cgg gac aag aac cag gtc 1388 Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val 375 380 385 gag ggg gaa gtc cag gtg gtt tcc acc gca acg cag tct ttc ctc gcg 1436 Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala 390 395 400 aca tgt gta aat ggt gtg tgt tgg act gtc tac cat ggt gcc ggc tca 1484 Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser 405 410 415 aag acc tta gcc ggc cct aag ggt ccg atc act caa atg tac acc aat 1532 Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln Met Tyr Thr Asn 420 425 430 435 gtg gac cag gac ctc gtt ggc tgg cag gcg ccc cct ggg gcg cgt tcc 1580 Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser 440 445 450 atg aca cca tgc acc tgc ggc agc tcg gac ctc tac ctg gtc acg aga 1628 Met Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg 455 460 465 cat gcc gat gtc att ccg gtg cgt cgg cgg ggc gac agc aga ggg agc 1676 His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser 470 475 480 cta ctc tcc ccc agg cct gtg tcc tat ttg aag ggc tcc tcg ggt ggt 1724 Leu Leu Ser Pro Arg Pro Val Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly 485 490 495 cca ctg ctc tgc ccc ttg ggg cac gtc gtg ggc atc ttc cgg gct gct 1772 Pro Leu Leu Cys Pro Leu Gly His Val Val Gly Ile Phe Arg Ala Ala 500 505 510 515 gtg tgc acc cgg ggg gtt gcg aag gcg gtg gac ttt gta ccc gtt gag 1820 Val Cys Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Val Pro Val Glu 520 525 530 tct 1823 Ser <210> 32 <211> 532 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 32 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 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gag ggt agg gcc tgg gct cag ccc ggg tac cct tgg 477 Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp 70 75 80 ccc ctc tac ggc aat gag ggc ctg ggg tgg aca gga tgg ctc ctg tca 525 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Thr Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgc ggc tct cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc cgg cgt agg 573 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgt aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc 621 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tac atc ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc ttg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tat gca aca ggg aac ctt ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 765 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct ttg ctg tcc tgt ttg acc att cca gcc tcc gcc cat gtc ccc cct 813 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala His Val Pro Pro 180 185 190 195 ctc aac gtc cgg gga ggc cgc gac gcc atc atc ctt ctc aca tgt gcg 861 Leu Asn Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala 200 205 210 gtc cac tca gag cta gtt ttt aaa atc acc aaa atc ttg ctt gca ata 909 Val His Ser Glu Leu Val Phe Lys Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Ile 215 220 225 ctt ggt ccg ctc atg gtg ctc cag gct ggt ctc att agg gtg ccg tac 957 Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Leu Ile Arg Val Pro Tyr 230 235 240 ttc gtg cgc gcc caa ggg ctt atc cgt gca tgc atg ttg gtg cgg aag 1005 Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys 245 250 255 atc gct ggg ggt cat tat gtc caa atg gct ttc gtg aag ctg gcc gca 1053 Ile Ala Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Phe Val Lys Leu Ala Ala 260 265 270 275 ctg acg ggc acg tac gtc tat gac cat ctt act cca ctg cgg gac tgg 1101 Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp 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cat tat gtc caa atg gct ctt gtg 240 Leu Val Arg Lys Val Ser Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Leu Val 65 70 75 80 agg cta gct gcg cta acg ggc acg tac gtt tat gac cat ctt act ccg 288 Arg Leu Ala Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asp His Leu Thr Pro 85 90 95 ctg cgg gac tgg gcc cac gcg ggc ctg cga gat ctc gcg gtg gca gtt 336 Leu Arg Asp Trp Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val 100 105 110 gag ccc gtc atc ttc tct gac atg gag acc aag atc atc acc tgg gag 384 Glu Pro Val Ile Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Ile Ile Thr Trp Glu 115 120 125 gca gac acc gcg gcg tgc ggg gac atc atc tcg ggc cta ccc gtc tcc 432 Ala Asp Thr Ala Ala Cys Gly Asp Ile Ile Ser Gly Leu Pro Val Ser 130 135 140 gcc cga agg ggg agg gag ata ctt ttg ggg ccg gcc gat agt ttt aga 480 Ala Arg Arg Gly Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser Phe Arg 145 150 155 160 gat cag ggg tgg caa ctc ctt gcg ccc atc acg gcc tac tcc caa cag 528 Asp Gln Gly Trp Gln Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Gln Gln 165 170 175 acg cgg ggc cta ctt ggc tgc atc atc act agc ctc aca ggc cgg gac 576 Thr Arg Gly Leu Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp 180 185 190 aag aac cag gtc gag gga gag gct cag gtg gtt tcc acc gca aca caa 624 Lys Asn Gln Val Glu Gly Glu Ala Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln 195 200 205 tcc ttc ctg gcg acc tgt gtt aat ggc gtg tgt tgg acc gcc tac cgt 672 Ser Phe Leu Ala Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Ala Tyr Arg 210 215 220 ggc gcc ggt gca aag acc cta gcc ggc cca aag ggt cca atc acc caa 720 Gly Ala Gly Ala Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Thr Gln 225 230 235 240 atg tat acc aat gta gac cag gac ctc gtc ggt tgg cag gcg ccc tcc 768 Met Tyr Thr Asn Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Gln Ala Pro Ser 245 250 255 ggg tcg cgt tcc tta acg cca tgc acc tgc ggt agc tcg gac ctt tac 816 Gly Ser Arg Ser Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr 260 265 270 t 817 <210> 38 <211> 272 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 38 Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Cys Glu 1 5 10 15 Thr Pro Thr 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Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Ile 515 520 525 ggg tcg gtg gtt gtc tcc tct gca atc aag tgg gag tat gtc gtg ttg 1632 Gly Ser Val Val Val Ser Ser Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 530 535 540 ctc ttc ctt ctc ctg gcg gac gca cgc gtc tgt gcc tgc ttg tgg atg 1680 Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp Met 545 550 555 560 atg cta ctg gta gcc cag gcc gag gct gct tta gag aac cta gtg gtt 1728 Met Leu Leu Val Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val Val 565 570 575 ctc aac gcg gca tcc gtg gct ggg acg cac ggc att atc ccc ttc ctt 1776 Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Thr His Gly Ile Ile Pro Phe Leu 580 585 590 gtg ttc ttc tgt gcc gcc tgg tac atc aaa ggc agg ctc gtc cct gca 1824 Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro Ala 595 600 605 gcg gca tat gct ttc tat ggc gta tgg ccg ctg ctc ctg ctc ctg ctg 1872 Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu 610 615 620 gcg tta cca cca cga gct tac gcc atg gac cgg gag atg gct gca tcg 1920 Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser 625 630 635 640 tgt gga ggc ggg gtt ttt gta ggt ctg gca ttc ttg acc ttg tca cca 1968 Cys Gly Gly Gly Val Phe Val Gly Leu Ala Phe Leu Thr Leu Ser Pro 645 650 655 tac tac aag gtg ttc ctc gct aag ctc ata tgg tgg tta caa tat ttt 2016 Tyr Tyr Lys Val Phe Leu Ala Lys Leu Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe 660 665 670 atc acc aga gcc gag gcg cac ttg caa gtg tgg atc ccc ccc ctc aac 2064 Ile Thr Arg Ala Glu Ala His Leu Gln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn 675 680 685 gtt cgg gga ggc cgt gat gcc atc atc ctc ctc gca tgc gca gtc cac 2112 Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Ala Cys Ala Val His 690 695 700 ccg gag cta atc ttt gac atc acc aaa ctt ctg ctc gcc ata ctc ggc 2160 Pro Glu Leu Ile Phe Asp Ile Thr Lys Leu Leu Leu Ala Ile Leu Gly 705 710 715 720 ccg ctc atg gtg ttc cag gcc agc ata acc cga gtg ccg tac ttt gtg 2208 Pro Leu Met Val Phe Gln Ala Ser Ile Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val 725 730 735 cgc gct caa ggg ctc att cgt gca tgc atg tta gtg cgg aaa gcc gct 2256 Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys Met Leu Val Arg Lys Ala Ala 740 745 750 ggg ggt cat tat atc caa atg gcc ctc gtg aaa ctg gcc gcg ctg 2301 Gly Gly His Tyr Ile Gln Met Ala Leu Val Lys Leu Ala Ala Leu 755 760 765 a 2302 <210> 40 <211> 767 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 40 Pro Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu 1 5 10 15 Val Arg Asn Phe Ser Gly Ile Tyr Arg Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly 35 40 45 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala 50 55 60 Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ile Ser Val Pro Thr Thr Thr 65 70 75 80 Ile Arg Arg Asn Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser 85 90 95 Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln 100 105 110 Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn 115 120 125 Cys Ser Ile Tyr Ser Gly His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp 130 135 140 Met Met Met 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Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln 100 105 110 ctg ttc acc ttc tcg cct cgc cgg tat gag acg gta caa gac tgc aat 384 Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn 115 120 125 tgc tca ctc tat cct ggc cac gta aca ggt cac cgc atg gcc tgg gat 432 Cys Ser Leu Tyr Pro Gly His Val Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp 130 135 140 atg atg atg aac tgg tcg cct aca aca gcc cta gtg gta tcg cag ata 480 Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Ile 145 150 155 160 ctg cgg atc cca caa gcc gtc atg gac atg gtg acg ggg gcc cac tgg 528 Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Thr Gly Ala His Trp 165 170 175 gga gtc ctg gcg ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg gga aac tgg gct 576 Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala 180 185 190 aag gtc ctg att gtg ttg tta ctc ttt gcc ggc gtt gat ggg acc acc 624 Lys Val Leu Ile Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr Thr 195 200 205 cac ata acg ggg ggg act gca ggc caa act gcc ttt agc ctc aca agt 672 His Ile Thr Gly Gly Thr Ala Gly Gln Thr Ala Phe Ser Leu Thr Ser 210 215 220 ctc ctc gca tct ggg ccg act cag aag atc caa att ata aac act aac 720 Leu Leu Ala Ser Gly Pro Thr Gln Lys Ile Gln Ile Ile Asn Thr Asn 225 230 235 240 ggc agc tgg cac atc aac aga act gcc ttg agt tgt aac gac tcc ctt 768 Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Ser Cys Asn Asp Ser Leu 245 250 255 cag act ggg ttc att gcc gcg ctg ttc tac aag cac agg ttc aac tcg 816 Gln Thr Gly Phe Ile Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Arg Phe Asn Ser 260 265 270 tcc gga tgc cca gag cgc atg gcc agc tgc cgc ccc atc gac agg ttt 864 Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Arg Phe 275 280 285 aat cag ggg tgg ggt ccc att act tat gat gat aag ctt ccc gtc tca 912 Asn Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Asp Asp Lys Leu Pro Val Ser 290 295 300 gac cag agg cct tac tgc agg cac tac gcg cct cgg ccg tgc ggt atc 960 Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Arg His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile 305 310 315 320 gtg ccc gcg tcg gag gtg tgt ggt ccg gtg tat tgc ttc acc cca agc 1008 Val Pro Ala Ser Glu Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser 325 330 335 cct gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgc ttc ggc gct ccc acg tat aac 1056 Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr Asn 340 345 350 tgg ggg gag aat gag acg gac gtg cta atc ctc aac aac acg cgg ccg 1104 Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro 355 360 365 ccg caa ggc aac tgg ttt ggc tgt aca tgg atg aat aac acc ggg ttc 1152 Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Asn Thr Gly Phe 370 375 380 acc aag acg tgc gga ggc cct ccg tgt aac atc ggg ggg gtc ggc aat 1200 Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly Asn 385 390 395 400 gag acc ttg acc tgc cct acg gat tgc ttc cgg aag cac ccc gaa gcc 1248 Glu Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala 405 410 415 acg tac acc aaa tgc ggc tcg ggg cct tgg ttg aca cct agg tgt atg 1296 Thr Tyr Thr Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met 420 425 430 gtt gat tac cca tac aga ctt tgg cac tac ccc tgc act gta aac ttt 1344 Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe 435 440 445 act atc ttc aag atc agg atg tac gtg ggg ggt gta gag cac agg ttc 1392 Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe 450 455 460 aca gcc gcg tgc aat tgg gcc cga gga gag cgc tgt gac gta gag gac 1440 Thr Ala Ala Cys Asn Trp Ala Arg Gly Glu Arg Cys Asp Val Glu Asp 465 470 475 480 agg gat aga gca gag ctc agc ccg cta cta ctg tct aca act gag tgg 1488 Arg Asp Arg Ala Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp 485 490 495 cag ata ctg ccc tgt tcc ttt acc acc cta cca gct ctg tcc acc gga 1536 Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly 500 505 510 tcg atc cac ctc cat cag aac acc gtg gac gtg caa tac ctg tac ggt 1584 Ser Ile His Leu His Gln Asn Thr Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly 515 520 525 gta ggg tca gcg gtt gtt tcc atc gcg atc aaa tgg gag tat gtc ctg 1632 Val Gly Ser Ala Val Val Ser Ile Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu 530 535 540 ctg ctt ttc ctt ctc ttg gcg gac gca cgc gtc tgc gcc tgt ttg tgg 1680 Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu Trp 545 550 555 560 atg atg ctg ctg ata gcc cag gct gag gcc gct ttg gag aac ctg gtg 1728 Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val 565 570 575 atc ctc aat gcg gcg tcc gta gct gga gcg cac ggc att ctt tcc ttc 1776 Ile Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala His Gly Ile Leu Ser Phe 580 585 590 ctc atg ttc ttc tgt gct gcc tgg tat atc aag ggt aag ctg gtc ccc 1824 Leu Met Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Lys Leu Val Pro 595 600 605 ggg gcg gca tat gct ttc tat agc gta tgg ccg ctg ctc ctg ctc ctg 1872 Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Ser Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu 610 615 620 ctg gcg cta cca cca cga gcg tac gct atg gac cgg gag atg gct gca 1920 Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met Asp Arg Glu Met Ala Ala 625 630 635 640 tca tgt ggg ggt ggg gtc ttc ata ggt ttg gta gtc ttg act ttg tca 1968 Ser Cys Gly Gly Gly Val Phe Ile Gly Leu Val Val Leu Thr Leu 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Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln 485 490 495 ata ctg ccc tgt tcc ttc acc acc cta ccg gct ttg tcc act ggt ttg 1536 Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu 500 505 510 att cat ctc cat cag aac att gtg gac gta caa tac ctg tac ggt gta 1584 Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val 515 520 525 ggg tca gcg gtt gtc tcc att gcg atc aaa tgg gag tac gtc gtg ctg 1632 Gly Ser Ala Val Val Ser Ile Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 530 535 540 ctc ttt ctc ctc ctg gcg gac gca cgc ttc tgc gcc tgc ttg tgg atg 1680 Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Phe Cys Ala Cys Leu Trp Met 545 550 555 560 atg ctg ctg ata gcc cag gct gag gcc gcc tta gag aac ctg gtg atc 1728 Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val Ile 565 570 575 ctc aat gca gcg tcc gtg gcc gga gcc cgt ggc att ctc tcc ttc ctt 1776 Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala Arg Gly Ile Leu Ser Phe Leu 580 585 590 gtg ttc ttc tgt gct gcc tgg tac atc aag ggc aaa ctg gtc cct ggg 1824 Val Phe Phe 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Ala Pro Thr Tyr Thr Trp 340 345 350 Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro 355 360 365 Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr 370 375 380 Lys Thr Cys Gly Ala Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ser Gly Asn Asn 385 390 395 400 Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr 405 410 415 Tyr Ile Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Leu Val 420 425 430 Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr 435 440 445 Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Thr 450 455 460 Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg 465 470 475 480 Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln 485 490 495 Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu 500 505 510 Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val 515 520 525 Gly Ser Ala Val Val Ser Ile Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val Val Leu 530 535 540 Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Phe Cys Ala Cys Leu Trp Met 545 550 555 560 Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val Ile 565 570 575 Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala Arg Gly Ile Leu Ser Phe Leu 580 585 590 Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Lys Leu Val Pro Gly 595 600 605 Ala Ala Tyr Ala Leu Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu 610 615 620 Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Phe Asp Arg Glu Met Ala Ala Ser 625 630 635 640 Cys Gly Gly Ala Val Phe Ile Gly Leu Met Leu Leu Thr Leu Ser Pro 645 650 655 His Tyr Lys Ala Leu Leu Ala Arg Leu Ile Trp Trp Leu Gln Tyr Phe 660 665 670 Ile Thr Arg Ala Glu Ala His Leu Gln Val Trp Ile Pro Pro Leu Asn 675 680 685 Val Arg Gly Gly Arg Asp Ala Ile Ile Leu Leu Thr Cys Ala Val His 690 695 700 Ser Glu Leu Ile Phe Glu Ile Thr Lys Ile Leu Leu Ala Met Leu Gly 705 710 715 720 Pro Leu Met Met Leu Gln Ala Gly Leu Ile Arg Val Pro Tyr Phe Val 725 730 735 Arg Ala Gln Gly Leu Ile 740 <210> 45 <211> 490 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (1)..(489) <400> 45 ctc ttg gct ctg ctg tcc tgt ctg acc atc cca gct tcc gct tat gaa 48 Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu 1 5 10 15 gtg cgc aac gtg tcc gga ata tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac 96 Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn 20 25 30 tca agc att gtg tat gag gca gcg gac gtg atc atg cat acc ccc ggg 144 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His Thr Pro Gly 35 40 45 tgc gtg ccc tgt gtt cgg gag ggt aac gcc tcc cgt tgt tgg gca gcg 192 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Ala Ala 50 55 60 ctc act ccc acg ctc gcg gtc ggg aat gcc agc gtc ccc act aag gca 240 Leu Thr Pro Thr Leu Ala Val Gly Asn Ala Ser Val Pro Thr Lys Ala 65 70 75 80 ata cgg cgc cac gtc gat ctg ctt gtt ggg acg gct gct ttc tgc tcc 288 Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Thr Ala Ala Phe Cys Ser 85 90 95 gcc atg tac gtg ggg gat ctc tgc gga tac atc gcc aaa ctc ctg ctc 336 Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Tyr Ile Ala Lys Leu Leu Leu 100 105 110 gcc aca ctc ggt ctg ctc atg gtg ctc cag gct gcc ata gct aga gtg 384 Ala Thr Leu Gly Leu Leu Met Val Leu Gln Ala Ala Ile Ala Arg Val 115 120 125 ccg tac ttc gta cgc act cag ggg ctc att cgt gtg tgt atg tta gtg 432 Pro Tyr Phe Val Arg Thr Gln Gly Leu Ile Arg Val Cys Met Leu Val 130 135 140 cgg aaa gtc gcc ggg ggt cac tat gcc cag atg gcc ttc atc aag ctg 480 Arg Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Ala Gln Met Ala Phe Ile Lys Leu 145 150 155 160 gcc gca ctg a 490 Ala Ala Leu <210> 46 <211> 163 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 46 Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu 1 5 10 15 Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn 20 25 30 Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His Thr Pro Gly 35 40 45 Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ala Ser Arg Cys Trp Ala Ala 50 55 60 Leu Thr Pro Thr Leu Ala Val Gly Asn Ala Ser Val Pro Thr Lys Ala 65 70 75 80 Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Thr Ala Ala Phe Cys Ser 85 90 95 Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Tyr Ile Ala Lys Leu Leu Leu 100 105 110 Ala Thr Leu Gly Leu Leu Met Val Leu Gln Ala Ala Ile Ala Arg Val 115 120 125 Pro Tyr Phe Val Arg Thr Gln Gly Leu Ile Arg Val Cys Met Leu Val 130 135 140 Arg Lys Val Ala Gly Gly His Tyr Ala Gln Met Ala Phe Ile Lys Leu 145 150 155 160 Ala Ala Leu <210> 47 <211> 1018 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (229)..(1017) <400> 47 ccaggacccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa 60 ttgccaggac gaccgggtcc tttcttggat taacccgctc aatgcctgga gatttgggcg 120 tgcccccgcg agactgctag ccgagtagtg ttgggtcgcg aaaggccttg tggtactgcc 180 tgatagggtg cttgcgagtg ccccgggagg tctcgtagac cgtgcacc atg agc acg 237 Met Ser Thr 1 aat cct aaa ccc caa aga aaa acc aac cga aac acc aac cgc cgt cca 285 Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Asn Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro 5 10 15 cag gac gtt aag ttc ccg ggc ggt ggt cag atc gtc ggt gga gtt tac 333 Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr 20 25 30 35 ctg ttg ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg act agg cag 381 Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Gln 40 45 50 act tcc gag cgg tcg cag cct cgt gga agg cga caa cct atc ccc aag 429 Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys 55 60 65 gtt cgc cgg ccc gag ggc aga acc tgg gct cag ccc ggg tat cct tgg 477 Val Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp 70 75 80 ccc ctc tat ggc aat gag ggc ttg ggg tgg gca gga tgg ctc ctg tca 525 Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser 85 90 95 ccc cgt ggc tcc cgg cct agt tgg ggc ccc acg gac ccc cgg cgt agg 573 Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg 100 105 110 115 tcg cgt aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctc aca tgc ggc ttc gcc 621 Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 120 125 130 gac ctc atg ggg tat att ccg ctt gtc ggc gcc cct tta gga ggc gct 669 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 135 140 145 gcc agg gcc ctg gca cat ggt gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aat 717 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 150 155 160 tct gca aca ggg aat ttg cct ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg 765 Ser Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 165 170 175 gct ctg ctg tcc tgt ttg acc atc cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc 813 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg 180 185 190 195 acg tgc gcg gtc cat cca gag cca atc ttt gac atc acc aac ctc ctg 861 Thr Cys Ala Val His Pro Glu Pro Ile Phe Asp Ile Thr Asn Leu Leu 200 205 210 ctc gcc ata ctc ggc ccg ctc atg gtg ctc cag gct ggc ata act aga 909 Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly Ile Thr Arg 215 220 225 gtg ccg tac ttc gta cgc gct caa ggg ctc att cgt gca tgc atg tta 957 Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala Cys Met Leu 230 235 240 gtg cgg aaa acg cct ggg ggt cat tat gtc caa atg gcc ctc atg agg 1005 Val Arg Lys Thr Pro Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala Leu Met Arg 245 250 255 ctg gcc gca ctg a 1018 Leu Ala Ala Leu 260 <210> 48 <211> 263 <212> PRT <213> Hepatitis C virus <400> 48 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Asn Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 Thr Arg Gln Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro 50 55 60 Ile Pro Lys Val Arg Arg Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75 80 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 Gly Val Asn Ser Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile 165 170 175 Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr 180 185 190 Glu Val Arg Thr Cys Ala Val His Pro Glu Pro Ile Phe Asp Ile Thr 195 200 205 Asn Leu Leu Leu Ala Ile Leu Gly Pro Leu Met Val Leu Gln Ala Gly 210 215 220 Ile Thr Arg Val Pro Tyr Phe Val Arg Ala Gln Gly Leu Ile Arg Ala 225 230 235 240 Cys Met Leu Val Arg Lys Thr Pro Gly Gly His Tyr Val Gln Met Ala 245 250 255 Leu Met Arg Leu Ala Ala Leu 260 <210> 49 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic <400> 49 cgcggatcct tagtcctcca gaacccggac ac 32 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> synthetic <400> 50 tgcacggtct acgagacct 19 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic <400> 51 tagtggtctg cggaaccggt 20 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic <400> 52 gccgcatgta agggtatcga tgacc 25 <210> 53 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic <400> 53 ggtcatcgat acccttacat gcggc 25 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic <400> 54 gcgaattctt atcagaagaa ctcgtcaaga ag 32 <210> 55 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic <400> 55 gcctattggc ctggagtgtt tagctc 26 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> synthetic <400> 56 atggcgttag tatgagtgtc gtgcagcct 29 <210> 57 <211> 25 <212> DNA <213> synthetic <400> 57 agccgcatgt aagggtatcg atgac 25 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic <400> 58 tggttcggct gyacatggat gaa 23 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic <400> 59 ggrtagtgcc aragcctgta tgggta 26 <210> 60 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic <400> 60 tcgggcacga gacaggctgt gatatatgtc t 31 <210> 61 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic <400> 61 atcgtcttca cgcagaaagc gtctagccat 30 <210> 62 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic <400> 62 gccagccccc tgatgggggc gacactccac c 31 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic <400> 63 aatcatatgt ctttgaggtt taggatttgt 30 <210> 64 <211> 29 <212> DNA <213> synthetic <400> 64 gacatatgat tgaacaagat ggattgcac 29 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic <400> 65 gtcctgcagg ccagccccct gatgggggcg aca 33 <210> 66 <211> 34 <212> DNA <213> synthetic <400> 66 gacctgcagg ttatcagaag aactcgtcaa gaag 34 <210> 67 <211> 50 <212> DNA <213> synthetic <400> 67 gccttaatta atacgactca ctataggcca gccccctgat gggggcgaca 50 <210> 68 <211> 76 <212> DNA <213> Synthetic <400> 68 tctagtcgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcggccag ccccctgatg 60 ggggcgacac tccacc 76 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 69 aggcctgtga agacgctctc ccagaact 28 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 70 ggtgatgacc ttggtctcca t 21 <210> 71 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 71 gcttagaggc tagtgatgat gcaaccaagt ac 32 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 72 ggcgaccgca tagtagtttc cata 24 <210> 73 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 73 ctggaggacg gcgtgaacta tgcaacaggg aa 32 <210> 74 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 74 ggaacttgcc cggttgctct ttctctatct tc 32 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 75 tggggcaaga tggttataaa c 21 <210> 76 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 76 ggggtaagat ggttataaac gtacgtacct g 31 <210> 77 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 77 ataatgaccc ccggcgactt tccgcactaa c 31 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 78 tgacatcagc atgtctcgtg acca 24 <210> 79 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 79 cttgaaaaag ccctggattg tcagat 26 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 80 acatgatctg cagagaggcc 20 <210> 81 <211> 26 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 81 ctacggggcc tgttactcca ttgaac 26 <210> 82 <211> 35 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 82 acatgatctg cagagaggcc agtatcagca ctctc 35 <210> 83 <211> 73 <212> DNA <213> synthetic <400> 83 tctagtcgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactcta gggcggcggg gtcgggcwcg 60 ngacabgctg tga 73 <210> 84 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 84 tctccattgg gctgaacacc acaggctcca c 31 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 85 ggggagaggt ggtcatagat gtaagtgccg g 31 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 86 catagatgta agtgccggtc cacctgccta 30 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 87 ctcctgcgag gtgtctcacc agggtacaca 30 <210> 88 <211> 29 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 88 agcagagcgt gagctctgac gaagtatgg 29 <210> 89 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 89 ggaatctacc cggttgctct ttttctatct tc 32 <210> 90 <211> 32 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 90 ctggaagacg ggataaatta tgcaacaggg aa 32 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 91 ctcgcaagca ccctatcagc cagt 24 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 92 aggcattgag cgggtttatc 20 <210> 93 <211> 38 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 93 ctagactcga gtcgacatcg tttttttttt tttttttt 38 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 94 atcttagccc tagtcacggc 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 95 ctagactcga gtcgacatcg 20 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> synthetic DNA <400> 96 ctagctgtga aaggtccgtg agccgcatga 30

Claims (15)

1. C형 간염 바이러스 유전자에 있어서, E1 단백 코드 영역의 일부분, E2 단백 코드 영역, P7 단백 코드 영역 및 NS2 단백 코드 영역의 일부분이 번역틀을 유지하면서 결실되어 있는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자.
2. 제1항에 있어서, 5' 비번역 영역으로부터 구조 단백인 코어 단백을 코드하는 영역의 전부 또는 일부 및 비구조 단백인 NS2의 후반 2부분의 막 관통 영역을 코드하는 영역으로부터 3' 비번역 영역의 전부 또는 일부를 가지는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자.
3. 제1항에 있어서, C형 간염 바이러스 유전자의 핵산 배열의 1번에서 914번의 전부 또는 일부의 배열 및 3001번 이후의 전부 또는 일부의 배열이 있는 트런케이트 폼 C형 간염 바이러스 유전자.
4. 세포 중에서 자율적으로 복제하는 제1항 내지 제3항의 어느 하나의 항에 기재된 레프리콘 유전자.
5. 제4항에 있어서, 선택 마커 유전자가 결합되어 있는 레프리콘 유전자.
6. 제4항 또는 제5항에 기재된 레프리콘이 복제하는 세포.
7. 제6항에 기재된 세포를 사용한 약제의 스크리닝 방법 또는 약효 평가 방법.
8. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 기재된 유전자를 넣은 벡터를 유지하고, 단백질을 발현하고 있는 세포.
9. 제6항 또는 제8항에 기재된 레프리콘이 복제하고 있는 세포, 또는 세포가 산생하는 단백질을 사용하는 HCV의 진단 방법.
10. 유전자의 결실을 검출하는 방법을 사용하여, C형 간염 바이러스의 트런케이트 폼 유전자를 검출하는 방법.
11. C형 간염 바이러스 유전자의 핵산 배열의 1번 내지 914번 및 3001번 이후의 배열로부터 설계한 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고, 트런케이트 폼 유전자를 증폭함으로써 트런케이트 폼 유전자를 검출 또는 정량하는 방법.
12. 트런케이트 폼 유전자 및 풀 렝쓰 폼 유전자의 공통 영역의 유전자의 측정과 트런케이트 폼 유전자의 결실된 영역의 유전자의 측정에 의하여 존재비를 정량하는 방법.
13. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 기재된 유전자를 유지하는 C형 간염 바이러스 입자 또는 바이러스 유사 입자.
14. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 기재된 유전자로부터 산생되는 C형 간염 바이러스의 폴리프로테인 및 폴리프로테인으로부터 프로세스된 단백.
15. 제14항에 기재된 단백질을 특이적으로 인식하는 항체.

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