KR20070017947A - 항미생물성 광역학 치료용 화합물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

전자기적 방사선과 함께 사프라닌 O를 이용하여 체내의 미생물, 특히 세균을 파괴시키는 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 바람직한 일 구체예에서, 사프라닌 O를 포함하는 조성물이 치료 영역으로 도입된다. 충분한 시간이 경과한 후에, 적합한 파장의 방사선이 상기 영역으로 인가되어 사프라닌 O를 활성화시키고, 광역학 반응에 의해 세균을 파괴시킨다. 바람직한 방사선의 파장은 약 530 nm이다. 본 발명의 방법은 그램-양성 및 그램-음성 세균 모두를 파괴시키는데 효과적이며, 혈청, 혈액 또는 타액과 같은 복합 매질이 존재하는 영역에서 특히 효과적이다.

Description

항미생물성 광역학 치료용 화합물 및 이의 사용 방법 {ANTIMICROBIAL PHOTODYNAMIC THERAPY COMPOUND AND METHOD OF USE}

본 발명은 광역학 치료 분야에 관한 것이고, 특히 사람 및 동물 환자에서 세균을 선택적으로 파괴시키는 광역학 치료의 사용에 관한 것이다.

광역학 치료(PDT)는 널리 공지되어 있고, 암 및 다양한 피부 질환과 같은, 일반적으로 고증식 조직과 관련된 수많은 질환을 치료하는 데 사용되고 있다. 또한 PDT는 항미생물 치료에 사용되고 있다. 그러나, 항미생물 PDT와 관련하여 두 가지 주요 문제점이 존재한다. 첫번째 문제는 그램-양성 및 그램-음성 세균 둘 모두에 대해 유효하게 사용될 수 있는 광활성 물질을 찾아내는 것이 어렵다는 것에 기인한다. 그램-음성 세균은 주로 이들의 이중층 외막 구조로 인해 훨씬 강한 장애물을 제공한다.

그램-양성 및 그램-음성 세균의 근본적인 차이는 도 1 및 도 2에 도시된 대로 세포벽에 있다. 도 1에 도시된 대로, 그램-양성 세포는 세포막(105)을 둘러싼 개개의 많은 펩티도글리칸 층(103)(예를 들어, 20 내지 40개 층)으로 구성된 두꺼운 펩티도글리칸 세포벽(101)을 지닌다. 대조적으로, 도 2에 도시된 대로, 그램-음성 세포는 세포막(203)을 둘러싼 펩티도글리칸의 얇은 층(201)만을 지니며, 이것 은 추가의 외막(205)에 의해 추가로 둘러싸인다. 이 추가 층이 그램-음성 및 그램-양성 세균이 그램 방법에 의해 구별될 수 있게 한다. 그램-음성 세균의 외막으로 인해, 크리스탈 바이올렛-요오드 염색이, 그램 방법 이후 그램-양성 세균에서와 같이, 세포벽의 펩티도글리칸 층에 도달할 수 없어 그램-음성 세균내에 보유된다. 외막은 많은 물질이 그램-음성 세균으로 침투하는 것을 억제하는 역할을 근본적으로 담당할 뿐만 아니라, 둘 모두의 세균 유형에 대해 유효한 감광제를 찾아내는 것을 곤란하게 만드는 원인이 된다.

두 번째 문제점은 혈청, 혈액 또는 타액과 같은 복합 매질의 존재하에서는 어느 정도 이상의 활성을 보유하는 적합한 감광성 화합물을 발견하기 어렵다는 데에 기인한다. 인산염 완충 식염수와 같은 불량한 매질 중의 세포 현탁액에 대해서는 양호한 활성을 나타내는 대부분의 감광성 화합물 (감광제)은 혈청, 혈액 또는 타액의 존재하에서는 실질적으로 효과를 나타내지 않는다. 이는 이들 복합 매질 중의 성분 (예를 들어, 단백질, 혈액 세포)이 PDT 화합물의 친화성에 대해 세균과 경쟁하기 때문이다.

사프라닌 O(Safranin O)는 450 내지 600nm의 청록색 범위에서 흡수되는 적색 염료이다. 이는 광학현미경법과 같은 공정에서 생물학적 염색제로서 사용된다. 예를 들어, 사프라닌 O는 핵, 염색체, 리그닌화되거나 큐틴화된 세포벽을 적색으로 염색시킨다. 또한, 이는 세균을 판별하기 위해 그램 요오드 (Gram's iodine)와 함께 사용되고, 전자 현미경법에서 사용된다. 또한, 사프라닌 생성물은 멸균 기술에서 시간, 압력, 에너지 또는 특정 화학물질의 존재/부재를 포함하는 상태를 나타내 는 데 사용되는 잉크 조성물에서 사용되어 왔다 (미국 특허 제 5,990,199호).

사프라닌 O, 사프라닌 및 관련 염료는 치아와 잇몸 및 그 주변에 존재하는 미생물 및 충치를 검출하고 치료하는 치주 치료법에 사용되어 왔다. 미국 특허 제 6,337,357호에는 물, 수혼화성 용매 또는 배합물, 치아의 우식-감염된 부분을 염색시킬 수 있는 염료, 및 항미생물제를 포함하는 항미생물성 우식 검출 조성물이 기재되어 있다. 이는 충치 검출 및 멸균 둘 모두를 수행하는 시스템이다. 용매(들)에 가용성이고 충치의 존재 및 위치를 시각적으로 나타낼 수 있는 적합한 염료에 속하는 사프라닌 O와 같은 염료가 사용될 수 있다. 상기 발명의 경우, 사프라닌은 순수하게 염색제로서 사용되고, 항미생물제로서는 고려되지 않는다.

또한, 사프라닌은 항미생물성 PDT 적용시 감광제로서 사용되어 왔다. 미국 특허 제 6,558,653호 (및 미국 특허 출원 제 2003/0059379호)에는 치아상의 괴사 조직 및 세균을 파괴하기 위해 PDT 및 감광성 화합물을 사용하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법은 450 내지 600nm 사이 파장의 광 에너지를 흡수하는 사프라닌과 같은 염료 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 이러한 염료는 괴사 조직, 세균 및 주위 조직과 접촉하여 조직을 선택적으로 염색시킨다. 이렇게 염색된 감염된 조직은 인가된 방사선을 용이하게 흡수하여, 질병에 걸린 조직 및 세균을 열에 의해 파괴시킨다.

본 발명은 광열 효과를 이용한 치주낭에서의 표면 세균의 처리에 관한 것이다.

사프라닌 O의 광활성 특성은 그 밖의 적용, 예컨대, 살충 및 비-사람 항균 치료 및 조성물에서 이용되고 있다. 미국특허 제5,798,112호는 광독성 살충 조성물에서의 광활성 염료, 예컨대, 사프라닌 O의 사용을 기재하고 있다. 그러한 조성물은 소정의 광활성 염료, 베이트(bait) 및 보조제를 함유한다. 화합물은 요구되는 곤충에 의해 소화되고, 그로 인해 보조제가 광활성 염료와 곤충의 막과 상호작용하여 조성물의 독성을 변화시키고, 일정 시간 동안 태양광에 노출된 후에 곤충을 치사시키는 작용을 한다. 미국 특허 제 6,506,791호는 어류에서의 원생동물 감염증을 치료하는 방법을 개시하고 있다. 사프라닌 O을 포함하는 광활성 염료는 감염된 어류가 함유되어 있는 수성 환경에 도입되는데, 광활성 염료의 농도가 일부 또는 모든 세균을 치사시키기에 충분하도록 도입된다.

복합 매질, 예컨대, 혈청, 혈액 또는 타액의 존재하에 효과적인 항균 PDT 방법 및 화합물이 요구되고 있다. 이러한 방법은 그램 양성 및 그램 음성 세균 둘 모두에 대해서 효과적으로 사용될 수 있어야 한다. 본 발명은 이러한 요구를 다루고 있다.

발명의 목적 및 간단한 요약

본 발명의 목적은 사람 또는 동물 대상에 존재하는 유해한 미생물, 특히 세균을 효율적으로 그리고 선택적으로 파괴시키기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 전자기선에 의해서 조절 가능하게 그리고 선택적으로 활성화될 수 있는 항균 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 그램 양성 및 그램 음성 세균 둘 모두의 파괴에 효과적인 방법을 제공하는 것이다.

간단하게 요약하면, 본 발명은 사프라닌 O를 전자기선과 함께 사용함으로써 체내에 존재하는 미생물, 특히 세균을 파괴하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 바람직한 방법에서, 사프라닌 O를 포함하는 조성물이 치료 부위에 도입된다. 충분한 시간이 경과한 후에, 적합한 파장의 방사선이 그 부위에 인가되어 사프라닌 O를 활성화시키고 광역학 반응에 의해 세균을 파괴한다. 본 방법은 그램-양성 및 그램-음성 세균 둘 모두를 파괴하는 데 효과적이며, 혈청, 혈액 또는 타액과 같은 복합 매질이 존재하는 영역에 특히 효과적이다.

본 발명의 상기 목적 및 기타 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면과 하기 설명으로부터 자명해질 것이다.

도 1은 그램-양성 세균 세포의 세포 싸개(envelope)의 단면도이다.

도 2는 그램-음성 세균 세포의 세포 싸개의 단면도이다.

도 3은 사프라닌 O에 의한 스타필로코커스 아우레우스 DSM1104의 광역학적 불활성화를 나타내는 그래프이다.

도 4는 사프라닌 O에 의한 슈도모나스 아에루기노사 DSM1117의 광역학적 불활성화를 나타내는 그래프이다.

도 5는 사프라닌 O에 의한 에스케리키아 콜리 DSM8698의 광역학적 불활성화를 나타내는 그래프이다.

특히, 그램-양성 및 그램-음성 세균 둘 모두를 파괴하고, 복합 매질 예컨대, 혈청, 혈액 또는 타액의 해로운 영향을 피하는 방법을 제공하는 데 있어 종래의 방법 및 화합물에서 관찰된 어려움으로 인해, 이러한 단점이 극복된 화합물을 발견하는 것이 바람직하다. 놀랍게도, 사프라닌 O는 전자기파와 함께 그램-양성 및 그램-음성 병원균 둘 모두를 파괴하는 데 효과적으로 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 주목된 또 다른 이점은, 복합 성분의 매질 (예를 들어, 혈청, 혈액 또는 타액)이 종종 기타 광감제의 경우에서와 같이 세균을 표적화하는 데 있어서 사프라닌 O의 효과를 중화시키지 못한다는 점이다. 따라서, 사프라닌 O는 본 발명에 따른 효과적인 항균 치료제의 일부이다. 사프라닌 O를 포함하는 항균 PDT 조성물은 또한 본 발명의 일부이다.

바람직한 구체예에서, 항균 치료는 세가지 일반적인 단계를 포함한다. 첫번째 단계는 사프라닌 O 조성물을 세균 함유 환경에 도입시키는 것이다. 두번째 단계는 사프라닌 O가 치료 영역 내의 세균 세포로 침투되거나, 최소한 세균 세포 외피의 성분에 결합되도록 충분한 시간을 경과시키는 것이다. 최종 단계는, 적절한 파장의 방사선을 인가시켜, 세균의 파괴를 일으키는 활성 산소종 및 자유 라디칼을 생성시키는 사프라닌 O의 활성화에 의해 광역학적 메커니즘을 개시하는 것이다.

사프라닌 O 조성물 및 방사선 조사의 인가 사이의 바람직한 시간은 다양하며, 치료할 세균의 유형, 치료할 신체 영역, 및 사프라닌 O 조성물을 도입시키는 방법과 같은 요인에 의해 달라질 것이다. 보통, 상기 기간은 15분 이상이다. 내부세균 감염을 치료하기 위해, 상기 조성물은 전신 적용을 의해 혈류로 주사되거나, 감염이 특정 영역에 제한되는 경우 국소적으로 주사될 수 있다. 피부상 또는 피부 근처의 감염에 대해, 상기 조성물은 국소 적용을 위한 용액, 크림, 겔 또는 로션 형태일 수 있다.

소정 기간 후, 방사선은 사프라닌 O를 활성화시키고 세균을 파괴하기 위해 치료 영역으로 인가된다. 활성화 방사선의 바람직한 파장은 500 ㎚ 내지 580 ㎚이고, 더욱 바람직하게는 약 530 ㎚이다. 방사선은, 예를 들어 램프와 같은 비간섭성 방사선, 또는 간섭성 레이저 방사선일 수 있다. 표면 또는 표면하 치료를 위해 램프는 방사선 조사되는 특정 감염 영역에 효과적일 수 있는 반면, 신체 내의 보다 깊은 감염된 영역에 대해서는 특정 내부 영역을 방사선 조사하는 데 필요한 산광기 또는 기타 장치를 추가로 함유할 수 있는 하나 이상의 광학 섬유를 포함하는 광학 섬유 장치가 상기 내부 영역에 레이저 방사선을 전달하는 데 바람직할 수 있다. 바람직한 레이저선 공급원은 다이오드 펌핑된(diode-pumped) 532 ㎚ 레이저이다.

본 발명은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되나, 이에 제한되지는 않는다.

실시예 1:

사프라닌 O에 의한 세균 세포 현탁액의 광역학적 불활성화:

여러 개의 연구들은, 그램-양성 세균 (예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스)이 구체적으로 광역학적 불활성이 되기 쉬운 반면, 그램-음성 세균 (예를 들어, 에스케리키아 콜리, 슈도모나스 아에루기노사)이 통상적으로 많이 사용되는 감광제에 대해 더욱더 내성인 것을 나타내고 있다. 더욱이, 본 발명자들은, 더욱 복합적인 매질 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 타액) 중의 그램-양성 및 그램-음성 세균 세포 둘 모두가 광역학적 작용으로부터 더욱 보호된다는 것을 밝혀내었다.

본 연구에서 사용된 유기물은 하기한, 상처 부위의 미생물 무리의 세 개 성분이다: 스타필로코커스 아우레우스 DSM 1104 (ATCC 25923), 그램-양성; 에스케리키아 콜리 DSM 8698, 그램-음성; 슈도모나스 아에루기노사 DSM 1117 (ATCC 27853), 그램-음성. 모든 균주를 트립신 대두 액체 배지(Tryptic Soy Broth, Merck KGaA Darmstadt, Germany)에서 하룻밤 동안 호기적으로 성장시켰다. 세포를 원심분리하여 수집하였으며, 이를 멸균 인산염-완충 식염수 (PBS), 또는 10% 멸균 말 혈청 (Oxoid), 10% 사람 혈장 또는 10% 사람 혈액 (둘 모두 공여자로부터 새로이 얻어짐)이 각각 보충된 멸균 PBS 중에 재현탁시켰다. 모든 경우에, 600 nm, 1 cm에서 최종 OD (광학적 밀도)가 0.03이었다.

분취량 (190 ㎕)의 세균 현탁액을 깨끗한 바닥을 갖는 멸균 블랙 96 웰 플레이트 (Costar® 3603, Corning Inc., USA)에 넣었다. 10 ㎕의, 세 개의 상이한 사프라닌 O 원액을 첨가하여 각각 10 μM, 100 μM 및 1 mM의 최종 감광제 농도를 얻었다. 플레이트를 실온의 암소에서 30분 동안 인큐베이션시켰다.

인큐베이션 후에, 샘플을 플레이트 바닥으로부터의 광섬유에 의해 레이저 세랄라스(Ceralas) G2 (biolitec AG, Germany), 532 nm, 전력 조정 0.5 W, 조사시간 85 초의 광에 노출시켰다. 이러한 셋팅에 대한 에너지 밀도는 약 1.2 W/㎠ [옵토미터 P-9710 (Optometer P-9710, Gigahertz-Optik GembH, Puchheim, Germany]로 측정됨)이었다. 상기 조사 시간으로, 얻어진 에너지 밀도는 약 100 J/㎠이었다.

대조군 웰은 사프라닌 O를 함유하지 않으며, 레이저 광에 노출시키지 않았 다. 암 독성에 대한 대조군 샘플을 임의의 조명 없이 단지 사프라닌 O (1 mM의 말단 농도)에 노출시켰다.

조명 이후에, 샘플을 플레이트의 웰로부터 제거하고, 트립신 대두 액체 배지로 희석시키고, 트립신 대두 아가 플레이트 상에서 스피랄 플레이터 에디 제트 (spiral plater Eddy Jet: iul Instruments, Barcelona, Spain)를 이용하여 플레이팅시켰다. 콜로니-형성 유닛 (CFU/ml)의 수를, 적당한 인큐베이션 후에 콜로니 계수기 카운터매트 플래시(Countermat Flash)(iul Instruments, Barcelona, Spain)를 사용하여 계수하였다.

이러한 실험 결과는 도 3, 4 및 5에 도시되어 있다:

본 발명자들은 PBS 중 그램-양성 스타필로코커스 아우레우스 세포의 현탁액의 경우 및 더욱 복합적인 매질 (PBS + 10% 말 혈청, PBS + 10% 사람 혈장)에서 사프라닌 O를 이용한 PDT 처리에 의해 매우 양호한 사멸 효과가 얻어짐을 밝혀내었다 (참조, 도 4). 더욱이, 또한 처리 현탁액 중 혈청 또는 플라스마의 존재하에서 그램-음성 슈도모나스 아에루기노사 및 에스케리키아 콜리 세포의 세포 현탁액의 충분한 사멸이 존재하였다 (참조, 도 4 및 5).

첨부된 도면과 관련하여 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하였지만, 본 발명은 구체적인 구체예에 한정되는 것은 아니며, 다양한 변화 및 개질이, 첨부된 청구범위에 규정된 바와 같이 본 발명의 범위 또는 정신으로부터 벗어나지 않으면서, 당업자에 의해 본원에 이루어질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (12)

1. 환자의 치료 영역에서 세균을 파괴시키는 방법으로서,

   a. 감광제로서, 사프라닌(Safranin) O를 포함하는 조성물을 환자의 치료 영역 내로 도입시키는 단계;

   b. 사프라닌 O가 치료 영역 내의 세균과 결합하도록 소정 기간을 경과시키는 단계; 및

   c. 소정 파장의 방사선을 치료 영역에 인가하여 사프라닌 O를 활성화시켜, 광역학 반응을 촉진시켜 세균을 파괴시키는 단계를 포함하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 소정 파장이 약 500 nm 내지 약 580 nm인 세균 파괴 방법.
3. 제 2항에 있어서, 소정 파장이 약 530 nm인 세균 파괴 방법.
4. 제 1항에 있어서, 치료 영역이, 혈청, 혈액 및 타액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 복합 매질(complex media)을 함유하는 세균 파괴 방법.
5. 제 1항에 있어서, 도입 단계가 전신 적용, 국부(local) 적용 및 국소(topical) 적용으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세균 파괴 방법.
6. 제 5항에 있어서, 전신 적용이 정맥내 주사인 세균 파괴 방법.
7. 제 5항에 있어서, 국부 적용이 비혈관 조직으로의 국부 주사인 세균 파괴 방법.
8. 제 5항에 있어서, 국소 적용을 위한 조성물이 용액, 크림, 겔 및 로션으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세균 파괴 방법.
9. 제 1항에 있어서, 소정 시간이 약 15분 이상인 세균 파괴 방법.
10. 제 1항에 있어서, 방사선이, 비간섭성(non-coherent) 램프 및 간섭성 레이저로 이루어지는 군으로부터 선택된 방사선 공급원에 의해 제공되는 세균 파괴 방법.
11. 제 1항에 있어서, 방사선 인가 단계가, 방사선 공급원에 연결된 하나 이상의 광섬유에 의해 수행되는 세균 파괴 방법.
12. 광역학 치료를 위한 활성 감광제 성분으로서, 사프라닌 O를 포함하는 항미생물성 광역학 치료용 조성물.

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