CN101304766A - 藻红基抗微生物光动力治疗化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了联合使用藻红B与电磁辐照破坏体内微生物特别是细菌的方法和组合物。在优选方法中，向治疗区域引入包括藻红B的组合物。在足够的时间段后，对所述区域施加具有适当波长的辐照，以活化藻红B并通过光动力反应破坏细菌。优选的辐照波长为约530nm。藻红B被引入到凝胶中，凝胶用于限制光动力学作用在最接近生物膜的位置发生，从而确保只有不需要的细菌受到影响，而天然的微生物区系不受伤害。该方法有效用于至少破坏革兰氏阳性菌，并且在其中复合介质如唾液也存在的区域中特别有效。
Description
发明背景
1.技术领域
本发明涉及光动力治疗领域，特别是光动力治疗在选择性破坏人和动物的细菌中的应用。
2.信息公开陈述
光动力治疗(PDT)是广泛公知的并且已经被用来对抗许多通常与过度增生组织有关的疾病，如癌症和各种皮肤疾患。PDT还用作抗微生物治疗。然而，存在许多与抗微生物PDT有关的主要问题。第一个问题在于很难找到这样的光敏物质，所述光敏物质可以有效地用于对抗格兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌主要由于其双层的外膜结构而呈现坚固得多的障碍。
图1和图2说明了格兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁之间的主要差别。如图1所示，格兰氏阳性细胞具有较厚的肽聚糖细胞壁101，其包括许多围绕细胞膜105的单独的肽聚糖层103(例如，20-40个层)。相比之下，如图2所示，革兰氏阴性细胞只具有较薄的围绕细胞膜203的肽聚糖层201，其进一步被另外的外膜205围绕。该附加层使得可使用革兰氏染菌法将革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌区分开来。因为革兰氏阴性菌的外膜，结晶紫-碘染色剂在革兰氏染菌法后不能像在革兰氏阳性菌中那样到达细胞壁的肽聚糖层并保持在革兰氏阴性菌中。外膜主要负责抑制许多物质渗透进革兰氏阴性菌中，并且是很难发现有效对抗两种类型的细菌的光敏剂的原因。
另一个问题由于很难发现适当的光敏化合物，所述光敏化合物在复合介质(complex media)如血清、血液或者唾液的存在下至少保持一些活性。大多数在贫介质如磷酸盐缓冲盐水中表现出良好对抗细胞悬浮液的光敏化合物(光敏剂)在血清、血液或者唾液的存在下几乎无效。这种情况是因为这些复合介质(如蛋白质、血细胞)中的组分与细菌竞争对PDT化合物的亲合力。另一个问题涉及破坏天然存在的并对某些体功能有益或者必需的微生物的风险。抗微生物PDT的应用存在破坏有益的微生物区系以及被设法淘汰的有害细菌的风险。
藻红B是吸收450-600nm蓝绿色光的红色染料，其在各种方法如显微照相术中用作生物染色剂。例如，藻红B在植物和动物组织中被广泛用作复染剂以与与核染剂区分开来，或者用作细菌细胞的对比染色剂。
藻红和藻红B可用作与牙齿处理联合使用的染料，从而在视觉上表明牙齿上斑块的存在和位置。藻红已经用于除去生物学表面的细菌，并且用在抗菌处理中。
美国专利4,581,227还公开了藻红或其他物质除去附着于生物学表面如胃和肠表面、牙齿表面和创伤表面，猪、家畜和家禽表面的微生物的应用。该方法不足以破坏细菌，而是除去生物学表面的细菌或者防止细菌与生物学表面附着。
藻红和有关染料已经用在牙周治疗中，其检测并处理牙齿和齿龈上及其周围的微生物和孔洞。美国专利6,337,357公开了抗微生物龋齿检测用组合物，其包括水、与水可混溶的溶剂或其组合，能染色牙齿的感染有龋齿部分的染料，和抗微生物剂。其属于孔洞探测系统和杀菌系统。在适当的染料中，可使用染料如藻红，其可溶于溶剂或者多种溶剂中并能在视觉上表明孔洞的存在和位置。对于本发明，藻红完全地用作着色剂并且不考虑其作为抗微生物剂。
藻红B是已知的光敏剂，在医疗和非医疗处理中都有应用。非医疗处理包括杀虫剂处理和工业表面处理，医疗处理包括牙齿及其他生物学表面的抗微生物PDT治疗，以及癌性组织及其他患病组织的PDT。
美国专利申请2002/0173832 A1描述了用于眼中由于年龄相关性黄斑变性所致的新血管生成的PDT治疗。藻红和藻红B在许多可能的光敏剂中被列出用于这一方法。
美国专利6,609,014公开了PDT在抑制由内膜过度增生所致的血管再狭窄中的应用。在许多提出的可用于该治疗的光敏剂中，提到了藻红和藻红B。
美国专利申请2002/0022032 A1公开了光敏剂与免疫助剂结合使用以破坏转移性肿瘤细胞的方法。指出的该方法中所用光敏剂包括氧杂蒽类染料如藻红和藻红B。
美国专利4,647,578公开了某些氧杂蒽类染料游离酸如藻红B的水溶性杀虫剂组合物，用于对抗昆虫成虫和昆虫幼虫。使昆虫或者幼虫摄取含有这些组分的化合物，其引起昆虫或者幼虫在接触可见光时死亡。
美国专利5,798,112描述了光敏染料如藻红B在光毒性杀虫剂组合物中的应用。所述组合物含有经过选择的光敏染料、饵、和助剂。该组合物被所需昆虫摄取，从而助剂与光敏染料和昆虫的膜相互作用，从而改变该组合物的毒性，其在接触日光一段时间以后发挥作用杀死昆虫。美国专利6,506,791公开了治疗鱼的原生动物感染的方法。包括藻红B的光敏染料被引入到含有被感染的鱼的水性环境中，使得光敏染料的浓度足以杀死一些或全部细菌。
欧洲专利652709 B1公开了杀死生物膜上的细菌的方法，该方法对表面施用包括藻红B的某种光敏剂并且光动力学地使细菌失活。该方法用于坚固的家庭和工业表面如玻璃、塑料和陶瓷表面上。其并未公开用于生物学表面的应用。
在美国专利6,290,496中公开了光热力破坏口腔细菌的方法。将含有染料优选含有藻红B的制剂施用于牙齿上以选择性地染色口腔细菌。经过过滤除去了被血色素高度吸收的波长的辐照被施用以选择性地增加经过染色的细菌的温度并通过凝结破坏细菌。该方法并未公开选择性地只破坏有害细菌而不使天然微生物区系受到伤害的方法。
在美国专利申请2001/0022970 A1中描述了使用卤化氧杂蒽或者其衍生物的光敏剂和PDT方法，用于治疗各种体组织(包括皮肤和循环系统)的疾患。据报导，各种疾病如癌症和微生物感染可用该公开的组合物和方法进行治疗。化合物如玫瑰红和藻红B被公开用作潜在的光敏剂。该方法包括体内控制，如静脉内注射和经皮给药。该光敏剂可被引入到凝胶(第46段)中。该方法适用于口的疾病，可直接地或者间接地施用到、或者基本上为最接近组织(包括口和齿龈)，用于治疗各种疾病，如齿龈及其他牙周疾病(包括齿龈炎)(第69段)。该药剂可以被施用于人和动物的微生物感染处并递送到被感染的组织或基本上最接近被感染的组织(第97段)。示例性的细菌包括链球菌(第98段)。
该发明总地描述了光敏剂如藻红B在PDT治疗中的应用，并且描述了它们在口处理和抗菌处理中的应用，但是未描述将光敏剂限制于给定区域或者最接近生物膜的区域的方法或者组合物，如用于直接施用到牙齿、齿龈和/或舌的凝胶剂。另外，该发明未公开用于选择性地破坏有害细菌同时保持天然微生物区系不受伤害的方法或组合物。最后，该发明未公开可改善复合介质如血液、血清和唾液的有害作用的方法或组合物。
上述的PDT方法和/或组合物的不利之处在于它们可不加区别地破坏存在于体区域如口中的正常的微生物区系。这些微生物区系执行必要的功能，并且因此任何抗菌方法/组合物将避免破坏这些天然的微生物区系。本领域的现有状况未克服或解决这一问题。
需要在复合介质如唾液的存在下是有效的抗微生物PDT方法和化合物。该方法应该有效地用于对抗格兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，但是对于特定应用领域，有效杀死革兰氏阳性菌是足够的。另外，该方法和化合物应该有效对抗有害细菌并同时保持必要细菌不受伤害。本发明满足了这一需要。
发明目的和概述
本发明的目的是提供用于有效和选择性破坏人和动物主体中的有害微生物特别是细菌的方法。
本发明的另一个目的是提供可通过电磁辐照受控地和选择性地被活化的抗菌方法。
本发明的又一个目的是提供有效破坏革兰氏阳性菌的方法。
本发明的另一个目的是提供在复合介质如唾液的存在下是有效的抗菌方法和组合物。
简而言之，本发明提供了联合采用含有藻红B的组合物与电磁辐照用于破坏体内的微生物特别是细菌的方法。在优选方法中，将含有藻红B的组合物引入到治疗区域。在足够的时间段后，对该区域施用具有适当波长的辐照，以活化藻红B并通过光动力反应破坏细菌。优选的辐照波长为约530nm。藻红B被引入到凝胶中，凝胶用于限制最接近生物膜的光动力学作用，从而确保只有不需要的细菌受到影响，而天然的微生物区系不受伤害。该方法有效用于至少破坏革兰氏阳性菌，并且在其中复合介质如唾液也存在的区域中特别有效。
本发明的上述及其他目的、特征和优点从以下的描述并结合附图将变得明显。
附图说明
图1-革兰氏阳性菌细胞的胞外被膜的剖视图。
图2-革兰氏阴性菌细胞的胞外被膜的剖视图。
图3-表示变异链球菌(Streptococcus mutans)DSM6178通过含有藻红B的凝胶的光动力失活的图。
图4-表示在通过含有藻红B的凝胶进行光动力失活后链球菌(Streptococcus spec.)的存活率图。
优选实施方案的详述
因为在现有技术的方法和化合物中所发现的难题，特别是避免复合介质如血清、血液或者唾液的有害作用，并且避免破坏天然存在的微生物区系，需要找到克服上述不利的化合物。发现藻红B是对抗唾液中的革兰氏阳性菌的有效光敏化物质。这一结果对于特定应用领域如在口腔预防口腔龋齿中有效杀死链球菌特别令人感兴趣。另一个值得注意的优点是介质(如唾液)的复合组分的存在不抵消藻红B在靶向于细菌中的有效性，对抗细菌的有效性被抵消对于其他光敏剂是常见的。因此藻红B是本发明的有效抗菌处理的一部分。含有藻红B的抗菌PDT组合物也构成了本发明的一部分。在优选方案中，抗菌治疗包括三个一般步骤。第一步是向含有细菌的环境引入藻红B组合物。第二步是经过足够的时间段，使藻红B渗透进治疗区域内的细菌细胞中、或者至少结合于所述细菌细胞胞外被膜的组分上。最后一步是施加具有适当波长的辐照，以通过活化藻红B而引发光动力机制，引起破坏细菌的活性氧物质和自由基的生成。
足够使光敏剂扩散进生物膜内或者到达表面上的优选的“曝光时间”、或在施用藻红B组合物和施加辐照之间的时间段是可变的，并且将随着各种因素如待处理细菌的种类、待治疗体区、和藻红B组合物的引入方法的不同而各自不同。通常，对于局部施用，该时间段为至少5分钟。对于治疗内部细菌感染，组合物可被注入血流用于系统应用，或者，如果感染局限在特定区域时，组合物可进行局部注射。对于皮肤上或接近皮肤的感染，组合物可为局部用的溶液、膏剂、凝胶或者洗液的形式。
在优选方案中，本发明的组合物包括含在凝胶中的藻红B。藻红B凝胶的应用优点在于该组合物可被选择性地施用并附着于斑块存在的表面，使得只有位于生物膜或者龋齿内的细菌受到随后施加的辐照的影响。其显著之处在于，在体内和体表上存在许多对于生物过程具有重要性的微生物。重要的是抗菌处理避免杀死这些天然的有益微生物区系。在本发明的组合物中，藻红B被限制在并集中在接近凝胶的区域。在对生物膜施用凝胶后，藻红B从凝胶基质扩散进斑块中，直接染色目标细菌。只有斑块内的细菌被充分染色(藻红B的浓度足够高)，以用于刺激显著光动力效应的照明应用。因此，大量的藻红B不能到达远离生物膜上施用区域的区域。因此，活化区域只局限在最接近生物膜的区域，并由此局限在最接近有害细菌的区域。
本发明的示例性治疗是对牙齿和/或舌背施用藻红B凝胶以破坏有害细菌使得龋齿不得以发展的预防性应用。或者，凝胶可被施用于已经存在的龋齿或者患病组织以破坏其上的细菌。凝胶被施用于牙齿或者其他表面如齿龈上，并通过适当的辐照活化而破坏附近的生物膜内的细菌。在优选方案中，本发明针对的生物膜主要是位于牙齿和/或舌背的生物膜，其中有害细菌存在于这些生物膜上并导致龋齿。因为显著浓度的藻红B不远离凝胶组合物而存在，因此口内的其他微生物区系不受影响。
有许多物质可用于本发明中以制备凝胶剂。所有物质必须是无毒的并且经批准用于内用或口用。凝胶组分将增溶藻红B。考虑了许多纤维素基凝胶，如羟乙基纤维素。本发明凝胶的示例性方案包括藻红B、羟乙基纤维素、丙二醇、水、和选择性的香料或者芳香化合物。
在预先选定的时间段后，对治疗部位施加辐照以活化藻红B并破坏细菌。活化辐照的优选波长为500nm-580nm，优选为约530nm。辐照可为非相干辐照如来自灯的辐照，或者为相干激光辐照。对于表面或者表面下治疗，在辐照特定的被感染区域时，灯可是有效的，而在体内较深的被感染区域，优选光纤仪器用于对这些内部区域递送激光辐照，所述光纤仪器含有一个或多个光纤，并可根据需要进一步含有散射体或者其他装置，以辐照某一内部区域，优选的激光源是泵入532nm激光的二极管。
本发明通过以下例子进一步进行说明，但不限于这些例子。
实施例1：
变异链球菌的细菌细胞悬浮液通过藻红B的光动力失活：
用于该研究的有机体是变异链球菌DSM6178(ATCC 35668)。格兰氏阳性链球菌共同参与口龋齿的发展。
变异链球菌细胞在37℃在胰朊酶大豆培养基中进行过夜有氧生长(Merck KGaA Darmstadt，Germany)。细胞通过离心作用收集，并再悬浮在补充有10％无菌的经过过滤的天然唾液的无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中。600nm处的最终OD(光密度)，对于1厘米通路长度，在所有情况中为0.05。约0.5毫升的羟乙基纤维素的藻红B凝胶(1mM、2mM，、3mM和8mM藻红B)置于试管底部。凝胶用0.5毫升的细菌悬液进行铺层，并在轻微摇动条件下在室温下曝光1、3、或5分钟。曝光后，将250μl的悬浮液置于新的试管中，将该试管离心，除去上清液，并将细胞小球再悬浮在205μl的PBS+10％的天然唾液(经无菌过滤)中。将200μl等分小份的细菌悬液置于无菌的具有透明底的黑色96孔板中(
3603，Corning Inc.，USA)并曝光于得自激光器Ceralas G2(biolitec AG，Germany)的光下，波长532nm，功率设定为0.05W，从板底部通过光纤辐照的时间为30秒。该给定条件下的流量率为约0.1W/cm2(测量使用Optometer P-9710，Gigahertz-Optik GmbH，Puchheim，Germany)。对于使用的照明时间，得到的总能量流量为约3J/cm2。
用于黑暗毒性的对照样品不暴露在激光下。
在照明后，从96孔板的孔中取出样品，在胰朊酶大豆琼脂板上，通过使用螺旋式涂板装置Eddy Jet(iul Instruments，B arcelona，Spain)用胰朊酶大豆培养基进行稀释。在通过使用菌落计数器CountermatFlash(iul Instruments，Barcelona，Spain)进行充分培养后，计数集群形成单位(CFU/ml)数。
实验结果如图3所示：
观察到用含有藻红B的凝胶进行的PDT处理具有很好的杀菌效果。抗菌效果随着曝光时间和藻红B浓度的不同而不同。未观察到黑暗毒性。
实施例2：
志愿者口腔中链球菌的光动力减少
将25名志愿者分成5组，所有志愿者的牙齿通过轻缓按摩被施用约2毫升的含有藻红B的凝胶。在曝光2分钟后，口腔用水洗漱，并且牙齿通过光施加器，经由光纤用来自532nm激光器Ceralas G2(biolitec AG，Germany)的光进行照明。辐照时间为约3分钟。四组经过处理的志愿者组的照明的流量率分别为约0.05、0.1、0.3和0.5W/cm2。志愿者的对照组不进行照明。所有处理在早晨进行正常刷牙之前进行，以免从口腔除去细菌。在第一次处理前，并且在每次处理后，通过
管(Sarstedt Ag & Co.，Nümbrecht，Germany)取得唾液样品，从
管中取出样品并通过使用螺旋式涂板装置Eddy Jet(iul Instruments，Barcelona，Spain)在TYCSB琼脂(用于链球菌的选择培养基)板上进行涂板。在厌氧工作站(Don Whithley Scientific Lim.，Shipley，England)中进行充分培养后，通过使用菌落计数器countermat Flash(iul Instruments，Barcelona，Spain)计数集群形成单位(CFU/ml)的数。对于链球菌，唾液中的细菌数对应于牙齿斑块中的细菌数。
实验结果如图4所示：
通过用流量率为0.3和0.5W/cm2的照明在处理期间获得最好的杀菌效果。在用0.1和0.05W/cm2进行照明的组中也观察到减少(与对照组相比)。
虽然已经参考附图描述了本发明的优选方案，可以理解，本发明不局限于精确的实施方案，可通过本领域技术人员进行各种变化和修改而不离开由权利要求所限定的本发明的范围或者精神。
Claims (22)
1.用于破坏患者的治疗区域中的细菌的方法，该方法包括下列步骤：
a.向生物学表面上的治疗区域引入凝胶形式的包括藻红B作为光敏剂的组合物；
b.经历预置时间段，使得所述藻红B与所述治疗区域中的细菌结合；
c.对所述治疗区域施加具有预先选定的波长的辐照，以活化所述藻红B并从而刺激光动力反应以破坏所述细菌；和
其中复合介质存在于所述治疗区域内。
2.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述复合介质是唾液。
3.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述治疗区域是选自牙齿和舌背的区域上的菌斑。
4.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述治疗区域是龋齿。
5.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述预先选定的波长为约500nm-约580nm。
6.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述预先选定的波长为约530nm。
7.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述藻红B在所述组合物中的浓度大于1mM/0.5ml所述组合物。
8.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述藻红B在所述组合物中的浓度为8mM/0.5ml所述组合物。
9.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述预置时间段为至少1分钟。
10.权利要求9所述的破坏细菌的方法，其中所述预置时间段为3分钟-5分钟。
11.权利要求9所述的破坏细菌的方法，其中所述预置时间段为至少5分钟。
12.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述施加辐照的步骤通过非相干灯完成。
13.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述施加辐照的步骤通过与辐照源结合的光传输系统完成。
14.权利要求13所述的破坏细菌的方法，其中所述光传输系统为至少一个光纤。
15.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述辐照选自非相干辐照和相干激光辐照。
16.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述辐照以至少约0.05W/cm2的流量率施加。
17.权利要求16所述的破坏细菌的方法，其中所述流量率为约0.3W/cm2到约0.5W/cm2。
18.权利要求16所述的破坏细菌的方法，其中所述施加辐照的持续时间为约3分钟。
19.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述治疗区域选自牙齿和齿龈。
20.权利要求1所述的破坏细菌的方法，其中所述组合物进一步包括选自羟乙基纤维素和丙二醇的物质。
21.用于治疗生物学表面的抗微生物光动力治疗组合物，其包括藻红B和含有用于增溶所述藻红B的组分的凝胶。
22.权利要求21所述的抗微生物光动力治疗组合物，其进一步包括选自羟乙基纤维素和丙二醇的物质。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20081112 |