KR20070012315A - 배큘로바이러스의 제조방법 - Google Patents

배큘로바이러스의 제조방법 Download PDF

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KR20070012315A
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Abstract

본 발명은 모충 유충에서 감염성 배큘로바이러스로 폐색체들을 생성하고, 세포 배양물 중에서의 일련의 통과로 다수의 바이러스 입자들을 제조하는 단계들을 포함하는 방법들의 조합을 사용하여 상업적인 양의 배큘로바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 2단계의 방법은 처음에 모충 유충에서 감염성 바이러스를 생성하고, 그 후에 생성된 감염성 바이러스를 세포 배양물 중에서의 제한된 횟수의 일련의 통과를 위한 접종원으로서 사용하여, 다량의 감염성 배큘로바이러스를 생성하므로써 개발되었다.

Description

배큘로바이러스의 제조방법{METHOD OF PRODUCING BACULOVIRUS}
본 발명은 배큘로바이러스들의 제조에 관한 것으로서, 특히 상업적인 양의 배큘로바이러스들의 제조방법에 관한 것이다.
배큘로바이러스들은 재조합 단백질들의 제조와 천연살충제의 사용을 포함하는 여러가지 응용을 위해 사용되어 왔다. 상업적으로 사용되는 배큘로바이러스들의 문제는 많은 양의 감염성 배큘로바이러스를 제조할 수 없다는 것이었다.
배큘로바이러스들의 경제적인 상업적 제조는 세포당 150 OB(폐색체들:occlusion bodies) 이상의 바이러스 수율을 갖는 적어도 10,000리터의 배지의 제조가 필요하다(Greenfield, P. F., Reid, S., Weiss, S. & Scholz, B. (1999). "생물학적인 조절제로서의 배큘로바이러스들: 연구, 생산 및 상업적인 쟁점" In The 5 th Asia - Pacific Biochemical Engineering Conference Proceedings. Phuket, Thailand). 대규모 배큘로바이러스 제조를 위한 표준적인 스케일-업 공정은 동결 배큘로바이러스 작업 저장물(working stock)을 위한 충분한 바이러스를 얻기 위해서 세포 배양물 중에 배큐로바이러스를 최대 5회까지 통과시키는 것이 필요하다. 경제적인 제조를 달성하기 위해서 10,000리터 규모까지 제조공정을 스케일-업하기 위해서 6회 더 통과시키는 것이 필요하다(Rhodes, D. J. (1996)). "배큘로바이러스-곤충 세포 제조 시스템들의 경제학" Cytotechnology 20, 291~297). 이러한 표준 스케일-업 공정에 따르면, 바이러스가 일련의 통과과정 동안 안정하고, 세포당 150 OB 이상을 생성한다고 가정한다면, 10,000리터 규모로 최종 바이러스 생성물을 얻기 위해서 11회 통과가 실행될 것이다.
그러나, 배큘로바이러스들은 자연적으로 돌연변이되어 FP(약간의 다면체:few polyhedra) 변종 또는 DIP(결함 있는 간섭 입자들:defective interfering particles) 변종을 형성하므로, 세포 배양물 내에서의 일련의 통과 동안 안정하지 않다. 바이러스 게놈의 25K FP 유전자에서의 자연발생적인 돌연변이 때문에, FP 변종은 세포 배양물 내에 빠르게 축적된다. HaSNPV의 경우, FP 돌연변이는 6회 통과에 의해서 상당히 빠르게 일어나서, 전체 바이러스 개체군은 FP 변종으로 구성된다. 수율은 세포당 10 OB 이하이고, 생성된 OB는 생물학적으로 활성이 아니다(Lua, L. H. L., Pedrini, M., Reid, S., Robertson, A. & Tribe, D. E. (2002). "세포 배양물내에 연속적으로 통과시킨 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera ) 핵다각체병 바이러스의 표현형 및 유전자형 분석" Journal of General Virology 83, 947~957). 유사하게, DIP들 또한 높은 MOS를 갖는 배큘로바이러스들의 세포 배양물 내에서의 일련의 통과 동안 축적될 수 있다. 세포당 10PFU 의 MOI가 사용되었을 때, 4회 통과만에 AcMNPV 감염 DIP가 검출되었다. DIP는 바이러스 게놈에서의 상당한 결손의 결과이다. DIP들은 복제를 위해서 '헬퍼 바이러스'(야생형 바이러스)를 필요로 한다(Pijilman, G. P., van den Born, E., Martens, D. E. & Vlak, J. M. (2001). "상당한 게놈 결손을 갖는 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 배큘로바이러스들은 감염된 곤충 세포들에서 빠르게 생성된다" Virology 283, 132~138). 이들 돌연변이체의 발생은 바이러스 접종원으로부터 대규모 생산까지의 스케일-업 하는 동안 문제를 야기한다.
HaSNPV의 일련의 통과 동안에, FP 돌연변이는 DIP의 출현으로 인한 것보다도 생성 공정의 스케일-업을 더 심각하게 위협한다. FP 돌연변이는 MOI에도 불구하고 DIPs보다 훨씬 빠르게 더 일찍 발생한다.
세포 배양에 있어서, 감염성 OB에 대한 어떠한 선택 압력이 있는 것처럼 생각되지는 않는다. FP 돌연변이체 감염 세포들은 MP(많은 다면체:many polyhedra) 감염세포 보다 배큘로바이러스를 더 생성시키며, 이로써 FP 돌연변이체에 대한 선택적인 이점들을 제공한다. 세포 배양물에서와는 달리, 유충에서 감염성 OB는 다른 유충으로 전이된 배큘로바이러스의 형태라는 점에서 선택적 이점을 갖는다(Potter, K. N., Jaques, R. P. & Faulkner, P. (1978). 생체내에서 통과된 Trichoplusia ni 핵다각체병 바이러스의 변형" Intervirology 9, 76~85).
일련의 통과는 다량의 배큘로바이러스를 생성할 수 있지만, 이 경우의 바이러스는 감염성이 아니다. 모충(caterpillar) 유충(larvae)으로부터의 다량의 바이러스의 제조는 실행 불가능한데, 그 이유는 다수의 유충이 필요하고, 바이러스를 분리하기 위해서 필요한 연속적인 대규모의 정제가 어렵기 때문이다. 다량의 생산 동안에 각각의 통과 후에 폐색체들로부터 폐색 유도된 바이러스를 추출하는 방법들은 또한 기술적으로 상당히 어렵고, 실행 불가능하다. 각각의 통과 후에 폐색체들을 세포들로부터 추출시키고, 농축시키는 것이 필요하고, 또한 전체 공정 동안에 무균상태를 유지하는 것이 필요하다.
현재, 대규모의 상업적인 양의 감염성 배큘로바이러스를 경제적으로 생산하는 방법들은 없다.
본 발명을 보다 쉽게 이해시키고, 실제적인 효과를 나타내기 위해서, 여기에 첨부된 도면들이 언급될 것이다:
도 1은 다량의 배큘로바이러스의 제조방법의 개략도이고;
도 2는 바람직한 구체예의 추출 안정화 배지인 VPM3의 조성을 나타내고;
도 3은 추출에 사용된 OB의 수와 4회 통과시에 세포당 생성된 OB의 수를 비교하고; 그리고
도 4는 2개의 샘플들(플라스크 A 및 B)을 사용하여 얻은 4회 통과까지의 OB 수율을 나타낸다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 다량의 배큘로바이러스를 제조하는 선택적인 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
본 발명은 상업적인 양의 감염성 배큘로바이러스 OB를 생산하기 위한 필요에 의해서 착상되고 연구되었다. 본 발명은 모충 유충에서 감염성 배큘로바이러스를 갖는 폐색체들을 생성하고, 세포 배양물 중에서의 일련의 통과로 다수의 바이러스 입자들을 생성하는 것의 이점을 확인하므로써 착상되었다. 그 후, 먼저 모충 유충에서 감염성 바이러스를 생성한 후에, 생성된 감염성 바이러스를 세포 배양물 중에서의 제한된 횟수의 일련의 통과를 위한 접종원으로서 사용하여, 다량의 감염성 배큘로바이러스를 생산하는 2단계의 방법이 개발되었다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 다음의 단계들을 포함하는 다량의 배큘로바이러스를 제조하는 방법이다:
배큘로바이러스 접종원으로 모충 유충을 접종하는 단계;
접종된 모충 유충을 배양하는 단계;
감염된 모충 유충으로부터 배큘로바이러스 폐색체들을 수확하는 단계;
상기 폐색체들로부터 폐색 유도된 바이러스를 추출하는 단계;
폐색 유도된 바이러스의 접종원으로 숙주 곤충 세포들의 배양물을 접종하는 단계;
바이러스/세포 배양물을 배양하는 단계; 및
배양된 바이러스/세포 배양물로부터 배큘로바이러스를 수확하는 단계.
바이러스/세포 배양물의 배양은 배큘로바이러스의 4회 또는 5회의 통과를 가능하게 하는 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 일반적인 용어로 사용된 배큘로바이러스는 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera ) SNPV, 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea ) SNPV, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda ) MNPV, 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis ) MNPV, 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica ) MNPV, 아나그라파 팔시페라(Anagrapha falcifera ) MNPV, 림만트리아 디스파(Lymantria dispar ) MNPV, 밤빅스 모리(Bombyx mori ) MNPV, 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua ) MNPV, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni ) MNPV, 오르가이이아 슈도트수가타(Orgyia pseudotsugata ) MNPV 및 부주라 수프레사리아(Buzura suppressaria ) SNPV를 포함하는 다른 배큘로바이러스종들을 포함한다. 바람직한 배큘로바이러스는 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera) 분리종이다. 바람직한 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera ) 분리종은 H25EA1 균주이다.
최초의 배큘로바이러스 접종원은 유충 또는 세포 배양물로부터의 폐색체들을 포함하는 어떤 적당한 원(source)으로부터 유도될 수 있다.
적당량의 폐색체 작업 저장물을 생성하기 위해서 유충으로부터 배큘로바이러스를 생산하는 1단계 이상의 생산 단계들이 있을 수 있다. 하나의 바람직한 형태에 있어서, 폐색체 마스터 저장물(master stock)을 형성하기 위한 초기 단계에서 배큘로바이러스는 유충으로부터 생성될 수 있다. 그 후에 폐색체 마스터 저장물은 폐색체 작업 저장물의 생성을 위한 접종원을 제공하기 위해서 사용될 수 있다. 바람직한 형태에 있어서, 폐색체 작업 저장물은 대략 2 x 1012 폐색체들을 갖는데 반해서, 폐색체 마스터 저장물은 대략 109 폐색체들을 갖는다. 마스터 저장물과 작업 저장물 모두 4℃ 또는 동결상태에서 저장될 수 있다.
바람직하게는, 폐색 유도된 바이러스(ODV:occlusion derived virus)는 상대적으로 높은 MOI로 세포 배양물 중에서 배양된다. 바람직한 구체예에서, 폐색 유도된 바이러스의 접종원은 2.5 x 1010만큼 적은 폐색체들로부터 얻어지고, ml당 5 x 105 세포들을 포함하는 10리터의 생물반응기(bioreactor)로 도입된다. 배양물은 10리터 부피(P1)로부터 100리터 부피 (P2)로, 그 후에는 1,000리터 부피(P3)로, 그리고 최종적으로 10,000리터 부피(P4)까지 점점 스케일-업된다. 10리터 배양물은 ml당 대략 107 PFU (배큘로바이러스)를 생성한다. 10,000리터 배양물은, 바람직하게는 대략 리터당 1.5~2.0 x 109 세포들 내지 리터당 2.5 x 1011 OB(세포당 대략 150 OB) 사이의 세포 밀도를 갖는다. OB는 헬리오씨스(heliothis) 모충들에 대한mm2 당 0.2~1.0 OB의 LC50을 갖는다.
작업 저장물로부터의 폐색 유도된 바이러스의 추출은 적당한 방법에 의해 수행될 수 있다. 폐색 유도된 바이러스는 알칼리를 사용하여 추출하여 폐색체들을 용해시키고, 생성된 바이러스 입자들은 적당한 완충 배지에서 안정화되는 것이 바람직하다. 바람직한 추출방법은 알칼리 용액을 OB 현탁액과 혼합하고, 바이러스 입자들을 분리시키는 시간 및 온도에서 혼합물을 배양하는 것을 포함한다. 그 후에 ODV는 안정화 배지, 바람직하게는 VPM3(도 2에 나타나 있음)에 현탁되는 것이 바람직하다. 산 중화단계를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 ODV 추출 방법은 하기에 나타낸 VPM3 추출 방법이다. VPM3 추출 방법은 트립신 처리를 사용하지 않고, VPM3 배지는 혈청을 포함하지 않으므로, 종래의 방법보다 더 경제적인 방법으로 될 수 있고, 그 결과 대규모 상업적 제조에 적합하게 되는 이점을 갖는다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 언급된 방법으로부터 생산된 배큘로바이러스 생성물을 포함한다. 배큘로바이러스 생성물은 헬리코베르파 종(Helicoverpa spp) 모충에 대한 mm2당 0.2~1.0 OB의 LC50과 함께 대략 2.5 x 1015 OB의 감염성 배큘로바이러스 양으로 특징지워진다. 이러한 양의 감염성 배큘로바이러스는 이전에 시험관내에서의 단일 생성 방법으로부터는 획득될 수 없었다. 다른 이점은 이러한 양의 감염성 배큘로바이러스가 경제적으로 생산가능하다는 것이다.
생성된 배큘로바이러스는 생물살충제로서의 용도를 포함하는 다양한 목적을 위해서 사용될 수 있다. 예컨대, 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera ) OB는 헥타르당 5 x 1011 ~ 5 x 1012 OB로 농작물에 적용되어, 헬리코베르파 아미게라(H. armigera ) 모충 해충을 확실하게 억제할 수 있다.
대량의 배큘로바이러스를 생산하는 방법의 바람직한 구체예는 처음에 모충 유충에서 바이러스를 제조하고, 그 후에 모충 유충으로부터 폐색 유도된 바이러스를 사용하여 세포 배양물을 접종하고, 세포 배양물에서의 제한된 횟수의 일련의 통과를 행하는 2단계의 공정을 포함한다(도 1 참고).
상기 방법은 처음에 모충 유충 폐색체들의 마스터 저장물과 작업 저장물의 제조를 포함한다. 모충 OB의 마스터 저장물과 작업 저장물은 각각 대략 1,000 OB의 상당량의 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera ) 유충을 공급하므로써 제조된다. 그들이 사멸됨에 따라(감염 후 6~10일), 그들은 수집되어, 4℃에서 저장된다. 공정당 2.5 x 1010 OB를 필요로 하고, 유충당 대략 1.7 x 1010 OB가 생성되므로, 10리터(통과 1회) 접종원을 위해 대략 1.5~2의 유충이 필요하게 된다. 충분한 수의 죽은 모충들을 모은 후에, 그들은 SDS(30분, 0.5% 최종 농도)로 추출되고, 균질화되고(혼합 공정), 여과되고(치즈클로드(cheesecloth)), 회전 강하되고, 물에 현탁(1010OB/ml)된다. 여분의 파편들을 제거하기 위해서 수회의 물세척이 수행될 수 있다. OB현탁액은 냉동 보존 또는 동결 보존될 수 있다.
OB는 VPM3 추출 방법을 사용하여 추출되고, 이는 각각 0.7ml의 OB 현탁액(1010OB/ml)에 대해서 40μl의 알칼리 용액(0.5M Na2CO3, 1M NaCl)을 첨가하는 단계들을 포함하고, 혼합물을 잘 혼합하고 30분 동안 28℃에서 배양한다. 그리고 나서 배양된 OB 혼합물은 각각 0.74ml의 추출된 OB에 대해서 10ml의 VPM3 배지로 희석된다(VPM3의 조성에 대해서는 도 2 참고). 희석된 ODV 현탁액은 그 후에 0.22μm 필터를 통해서 여과 살균된다. 생성된 ODV 현탁액은 그 후에 접종원으로서 사용된다.
도 3은 추출에 사용된 세포당 OB의 수율들의 예를 나타내고, 4회 통과시에 얻어진 세포당 OB의 수율을 나타낸다.
10리터 배양물(5 x 105 세포들/ml)을 감염시키기 위한 접종원으로서의 사용을 위해 충분한 ODV를 생산하기 위해서 대략 2.5 x 1010 OB가 필요하다.
배큘로바이러스가 접종된 10리터 배양물은 대략 3일 동안 28℃에서 생물반응기 중에서 호기성으로 배양되었다. 배양은 1회 통과이다. 발효는 점차로 스케일 업되어, 통과 2회, 3회 및 4회는 각각 100리터, 1,000리터 및 10,000리터이었다. 10~15일 동안의 최종 배양을 제외하고, 모든 배양물들에는 대략 2일 동안 28℃에서 공기가 공급되었다.
10,000리터 배양물은 대략 리터당 1.5~2.0 x 109 세포들 내지 리터당 2.5 x 1011 OB(세포당 대략 150 OB) 사이의 세포 밀도를 갖는다. OB는 mm2당 0.2~1.0 OB의 헬리코베르파 종(Helicoverpa spp) 모충에 대한 LC50을 갖는다.
도 4에 나타나 있는 다른 예들에 있어서, 1011 OB는 성공적으로 추출되고 여과되었다. 여과된 살균 추출물이 샘플로 되어, 2개의 100ml 배양물들(플라스크 A 및 B)을 감염시켰다. 4회 통과(10,000리터 배양물) 후의 OB 수율은 비교적 높았고, 플라스크 A 및 B로부터 세포당 263 OB 및 239 OB가 각각 얻어졌다.
물론 상기한 것은 본 발명의 예시를 위해서 제공되었지만, 당업자들에게 명백한 것으로 보이는 다른 변형들과 다양성들은 여기에 나타나 있는 본 발명의 넓은 범위와 영역내에 포함되는 것으로 간주된다.
본 명세서의 상세한 설명과 청구범위에 있는 용어 "포함한다(단수형)" 및 이용어의 다른 변형 형태인 "포함한다(복수형)" 및 "포함하는"과 같은 용어는 다른 첨가제들, 성분들, 정수들(integers) 또는 단계들을 배제하는 것을 의도하는 것은 아니다.

Claims (12)

  1. 다음의 단계들을 포함하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법:
    배큘로바이러스 접종원으로 모충 유충을 접종하는 단계;
    접종된 모충 유충을 배양하는 단계;
    감염된 모충 유충들로부터 배큘로바이러스 폐색체들을 수확하는 단계;
    상기 폐색체들로부터 폐색 유도된 바이러스를 추출하는 단계;
    폐색 유도된 바이러스의 접종원으로 숙주 곤충 세포들의 배양물을 접종하는 단계;
    바이러스/세포 배양물을 배양하는 단계; 그리고
    배양된 바이러스/세포 배양물로부터 배큘로바이러스를 수확하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스/세포 배양물의 배양은 배큘로바이러스의 4회 또는 5회 통과를 가능하게 하는 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 다음의 군의 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법:
    헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera ) SNPV, 헬리코베르파 지아(Helicoverpa zea ) SNPV, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda ) MNPV, 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis) MNPV, 아우토그라파 칼리포니카(Autographa californica ) MNPV, 아나그라파 팔시페라(Anagrapha falcifera ) MNPV, 림만트리아 디스파(Lymantria dispar ) MNPV, 밤빅스 모리(Bombyx mori ) MNPV, 스포돕테라 엑시구아(Spodoptera exigua ) MNPV, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni ) MNPV, 오르가이이아 슈도트수가타(Orgyia pseudotsugata ) MNPV 및 부주라 수프레사리아(Buzura suppressaria ) SNPV.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 헬리코베르파 아미게라(Helicoverpa armigera) 분리종인 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 적당량의 폐색체 작업 저장물을 생성하기 위하여 유충으로부터 배큘로바이러스를 제조하는 하나 이상의 단계가 포함되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배큘로바이러스는 처음 단계에서 유충으로부터 생성되어 폐색체 마스터 저장물을 형성하고, 그 후에 상기 폐색체 마스터 저장물은 폐색체 작업 저장물의 생성을 위한 접종원을 제공하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색체 마스터 저장물은 대략 109 폐색체들을 갖고, 폐색체 작업 저장물은 대략 2 x 1012 폐색체들을 갖는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색 유도된 바이러스(ODV)는 상대적으로 높은 MOI로 세포 배양물 내에 접종되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색 유도된 바이러스의 접종원은 2.5 x 1010 폐색체만큼 낮은 수준으로부터 얻어지고, ml당 5 x 105 세포들을 포함하는 10리터 생물반응기 내로 도입되고, 그 후에 배양물은 10리터 부피(P1)로부터 100리터 부피(P2)로, 그 후에 1,000리터 부피(P3)로, 그리고 최종적으로 10,000리터 부피(P4)까지 점차적으로 스케일 업되고; 10리터 배양물은 ml당 대략 107 PFU(배큘로바이러스)를 생성하고, 10,000리터 배양물은 대략 리터당 1.5~2.0 x 109 세포들 내지 리터당 2.5 x 1011 OB(세포당 대략 150 OB) 사이의 세포 밀도를 갖고, OB는 mm2당 0.2~1.0 OB의 헬리오씨스 모충에 대한 LC50을 갖는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 폐색 유도된 바이러스는 알칼리를 사용하여 추출하여 폐색체들을 용해시키고, 생성된 바이러스 입자들은 적당한 완충 배지에서 안정화되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출방법은 알칼리 용액을 OB 현탁액과 혼합하고, 바이러스 입자들을 분리시키는 시간 및 온도에서 혼합물을 배양하고, 그 후에 ODV는 안정화 배지에 현탁되고, ODV는 트립신 처리 없이 VPM3 배지에 혈청을 사용하지 않고 추출되는 것을 특징으로 하는 대량의 배큘로바이러스의 제조방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 생성된 배큘로바이러스 생성물.
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