KR20070004159A - Process for preparing crosslinked hyaluronic acid - Google Patents
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Abstract
Description
도 1은 본 발명의 실시예 4에서 제조된 실 형태의 히알루론산 가교물의 사진이다;1 is a photograph of a hyaluronic acid crosslinked product in the yarn form prepared in Example 4 of the present invention;
도 2는 본 발명의 실시예 4에서 제조된 마이크로비드 형태의 히알루론산 가교물의 사진이다.2 is a photograph of a hyaluronic acid crosslinked microbeads prepared in Example 4 of the present invention.
본 발명은 히알루론산 가교물의 신규한 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 에폭시 반응기를 둘 또는 그 이상 가지고 있는 가교제와 히알루론산의 혼합물을 유기용매 중에서 고상(solid phase)으로 가교반응을 유도하여 히알루론산 가교물을 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel method for preparing a hyaluronic acid crosslinked product, and more particularly, to a crosslinking reaction of a crosslinking agent having two or more epoxy reactors with a hyaluronic acid in a solid phase in an organic solvent to induce a crosslinking reaction. A method for producing a hyaluronic acid crosslinked product.
히알루론산은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 있고 상기 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절 의 활액 및 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 의료 및 의료 용구나, 화장품 용도 등으로 널리 사용되고 있다. 그러나, 그 자체만으로는 생체내(in vivo) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다. 따라서, 구조적으로 안정한 히알루론산 유도체를 개발하기 위한 노력이 널리 진행되고 있다(Laurent, T.C. "The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives" Portland Press Ltd., London, 1998).Hyaluronic acid is a biopolymer made up of N-acetyl-D-glucosamine and D-glucuronic acid, and the repeating units are linearly connected, and are present in eyeglasses, synovial fluid of joints, and chicken chives. Hyaluronic acid has been widely used in medical and medical applications such as ophthalmic surgical aids, joint function improvers, drug delivery materials and eye drops, etc., due to its excellent biocompatibility and viscoelasticity. However, by itself, it is easily decomposed under conditions such as in vivo or acid, alkali, etc., thereby limiting its use. Therefore, efforts to develop structurally stable hyaluronic acid derivatives have been widely progressed (Laurent, TC "The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives"). Portland Press Ltd., London, 1998).
히알루론산 유도체는 수술 후의 유착 방지제, 주름살 개선제, 성형 보조물, 관절기능 개선제, 약물 전달체 및 세포배양 지지체(Scaffold) 등 다양한 용도로 개발되고 있으며, 특히 주름살 개선제와 성형 보조제 등은 상업적 용도로 활발한 연구가 행해지고 있다(F. Manna, M. Dentini, P. Desider, O. De Pita, E. Mortilla, B. Maras, Journal of European Academy of Dermatology and Venereology, 13(1999) 183-192). Hyaluronic acid derivatives are being developed for various purposes such as anti-adhesion agents after surgery, wrinkle improvers, molding aids, joint function improvers, drug carriers, and cell culture scaffolds. (F. Manna, M. Dentini, P. Desider, O. De Pita, E. Mortilla, B. Maras, Journal of European Academy of Dermatology and Venereology, 13 (1999) 183-192).
히알루론산 유도체의 하나로서, 가교제를 사용하여 히알루론산들을 상호 공유결합시킨 히알루론산 가교물은 우수한 생체적합성, 물리적 안정성 및 생분해성을 가지고 있으며, 미국특허 제4,716,224호, 제4,963,666호, 제5,017,229호, 제5,356,883호 등에는 그것의 제조방법들이 개시되어 있다. As one of the hyaluronic acid derivatives, hyaluronic acid crosslinked products which covalently bond hyaluronic acids with a crosslinking agent have excellent biocompatibility, physical stability and biodegradation, and are described in US Pat. Nos. 4,716,224, 4,963,666, 5,017,229, 5,356, 883 and the like disclose methods for their preparation.
그러나, 이들 특허에서의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물(히알루론산 유도체)은 히알루론산 분해효소 및 열에 대한 안정성이 상대적으로 낮으며 미반응 화 학물질의 제거가 어려워 고순도의 생체적합성 물질로 활용하기에는 한계가 있다. 특히, 가교제로 다관능성 에폭시계 가교제(polyfunctional epoxide-based crosslinking agent)를 사용하는 미국특허 제4,716,224호, 제4,963,666호 및 미국특허출원 공개 제US2003/0094719A1호의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물은, 물리적 점탄성이 낮고, 첨가된 가교제의 농도가 높아 활성상태로 반응물에 남아 있을 수 있거나, 또는 반응 후 남아 있는 미반응물의 잔류량이 높아 반응효율이 낮고 정제공정이 어렵다는 문제점이 있다. 즉, 이들 방법은 알칼리 수용액에서 가교제와 히알루론산을 혼합하여 이를 용액상(liquid phase)에서 가교반응을 유도하고 있지만, 일반적으로 반응성이 매우 낮아 물성을 향상시키기 위해서는 반응농도를 증가시키거나 가교제를 많이 첨가해야 하는데, 이 경우 고농도로 제조하기 용이하지 않으며 다량으로 첨가된 가교제를 정제과정에서 완벽하게 제거하기 어렵다는 문제점을 가지고 있다.However, the hyaluronic acid crosslinked products (hyaluronic acid derivatives) prepared by the methods of these patents have relatively low stability against hyaluronic acid degrading enzymes and heat and are difficult to remove unreacted chemicals, and thus are limited to be used as high purity biocompatible materials. There is. In particular, hyaluronic acid cross-linked product prepared by the methods of US Patent Nos. 4,716,224, 4,963,666 and US Patent Application Publication No. US2003 / 0094719A1 using a polyfunctional epoxide-based crosslinking agent as a crosslinking agent, Low viscoelasticity, high concentration of the added crosslinking agent may remain in the reactant in the active state, or there is a problem that the reaction efficiency is low and the purification process is difficult due to the high residual amount of unreacted material remaining after the reaction. That is, these methods induce a crosslinking reaction in a liquid phase by mixing a crosslinking agent and hyaluronic acid in an aqueous alkali solution, but in general, it is very low in reactivity to increase the reaction concentration or increase the crosslinking agent in order to improve physical properties. In this case, there is a problem in that it is not easy to prepare a high concentration and it is difficult to completely remove the crosslinking agent added in a large amount during the purification process.
따라서, 본 발명의 목적은 이러한 종래기술의 문제점을 해결할 수 있는 히알루론산 가교물의 제조방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing a hyaluronic acid crosslinked product which can solve the problems of the prior art.
즉, 본 발명의 목적은 생체적합성, 물리적 특성, 및 열과 분해효소에 대한 안정성을 향상시킴으로써 체내의 다양한 환경에서도 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 불순물을 최소화하고, 고효율의 결합반응을 유도하며, 정제가 용이한 히알루론산 가교물의 제조방법을 제공하는 것이다. That is, the object of the present invention is not only can be useful in various environments in the body by improving biocompatibility, physical properties, and stability against heat and degrading enzymes, but also minimizes impurities, induces high-efficiency binding reactions, and purification. It is to provide a method for easily preparing a hyaluronic acid crosslinked product.
이러한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 히알루론산 가교물의 제조방법은, 에폭시 반응기를 둘 또는 그 이상 가지고 있는 가교제와 히알루론산의 혼합물을 유기용매 중에서 고체상(solid phase)으로 가교제에 의한 히알루론산의 가교반응을 유도하여 히알루론산 가교물을 제조하는 과정을 포함한다.A method for preparing a hyaluronic acid crosslinked product according to the present invention for achieving this object is to crosslink a hyaluronic acid with a crosslinking agent having a epoxy reactor or two or more and a mixture of hyaluronic acid in a solid phase in an organic solvent. Inducing a reaction to produce a hyaluronic acid crosslinked product.
즉, 본 발명의 제조방법은 가교제에 의한 히알루론산의 가교반응을 액체상(liquid phase)이 아닌 유기용매 중에서 고체상(solid phase)으로 진행시킨다는 점에서 종래기술의 제조방법과 큰 차이가 있다.That is, the manufacturing method of the present invention has a great difference from the manufacturing method of the prior art in that the crosslinking reaction of hyaluronic acid by the crosslinking agent proceeds to the solid phase in the organic solvent rather than the liquid phase.
액체상의 가교반응으로 진행되는 종래기술에서는 가교반응의 효율이 낮으므로, 히알루론산과 결합한 가교제의 여러 에폭시 작용기 중 미반응 에폭시 작용기가 히알루론산에 남아 있게 되며, 이는 생체내 물질과 반응할 위험이 있으므로 최소화하거나 가수 분해하여 비활성 작용기로 변환시켜야 한다. 따라서, 이를 위한 추가 반응 또는 공정이 필요하다. 또한, 과량의 가교제를 첨가하는 경우에는 미반응 가교제가 히알루론산 가교물 사이에 남아 있을 위험성이 매우 크다. 따라서, 이러한 가능성을 최소화하기 위하여 반응율에 규합되는 정확한 양의 가교제를 첨가하여 고효율의 반응을 유도하는 것이 공정의 효율 및 생체적합성의 관점에서 매우 중요하지만, 이러한 작업은 반응의 특성상 용이하지 않다. In the prior art, which proceeds with a liquid crosslinking reaction, the efficiency of the crosslinking reaction is low. Among the various epoxy functional groups of the crosslinking agent combined with the hyaluronic acid, the unreacted epoxy functional group remains in the hyaluronic acid, which is a risk of reacting with the material in vivo. It should be minimized or hydrolyzed and converted to inactive functional groups. Thus, further reactions or processes are required for this. In addition, when an excess amount of the crosslinking agent is added, there is a great risk that an unreacted crosslinking agent remains between the hyaluronic acid crosslinked materials. Thus, in order to minimize this possibility, it is very important from the viewpoint of the efficiency and biocompatibility of the process to induce a high efficiency reaction by adding the correct amount of crosslinking agent that is incorporated in the reaction rate, but this operation is not easy due to the nature of the reaction.
반면에, 본 발명에서와 같이 유기용매 중에서 고체상으로 가교반응을 행하면, 소망하는 고상 형태에서 반응을 진행시킬 수 있다는 점 이외에도, 높은 반응율 과 그로 인한 불순물의 최소화, 고순도 물질의 제조, 용이한 정제과정 등 종래기술의 대부분의 문제점들을 해소할 수 있다. 또한, 최종적으로 얻어진 히알루론산 가교물(유도체)은 크게 향상된 생체적합성, 물리적 강도, 및 열과 효소에 대한 안전성 등 우수한 물성을 갖는 것으로 확인되었다. On the other hand, if the cross-linking reaction in the solid phase in the organic solvent as in the present invention, in addition to being able to proceed the reaction in the desired solid form, high reaction rate and resulting minimization of impurities, production of high purity material, easy purification process Most of the problems of the related art can be solved. In addition, the finally obtained hyaluronic acid crosslinked product (derivative) has been confirmed to have excellent physical properties such as greatly improved biocompatibility, physical strength, and heat and enzyme safety.
본 명세서에서 사용된 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체와 히알루론산 염을 모두 포함하는 의미로 사용되고 있다. 따라서, 이하에서 사용된 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산 과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함하는 개념이다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함된다. 경우에 따라서는, 그들의 둘 또는 그 이상이 조합되어 사용될 수도 있다.The term "hyaluronic acid" as used herein is used to mean both hyaluronic acid itself and hyaluronic acid salt. Accordingly, the term "aqueous solution of hyaluronic acid" used below is a concept including both an aqueous solution of hyaluronic acid, an aqueous solution of hyaluronic acid salt, and a mixed aqueous solution of hyaluronic acid and hyaluronic acid salt. The hyaluronic acid salt includes both inorganic salts such as sodium hyaluronate, potassium hyaluronate, calcium hyaluronate, magnesium hyaluronate, zinc hyaluronate and cobalt hyaluronic acid, and organic salts such as tetrabutylammonium hyaluronic acid. In some cases, two or more of them may be used in combination.
히알루론산의 분자량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 다양한 물성과 생체적합성을 구현하기 위해 100,000 내지 5,000,000 이 바람직하다.The molecular weight of hyaluronic acid is not particularly limited, but 100,000 to 5,000,000 is preferable in order to implement various physical properties and biocompatibility.
상기 가교제는 둘 또는 그 이상의 에폭시 작용기를 포함하는 화합물로서 다양할 수 있으며, 바람직한 예로 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리 테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르(neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르(polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르(glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르(tri-methylpropane polyglycidyl ether), 비스에폭시프로폭시에틸렌(1,2-(bis(2,3-epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르(pentaerythritol polyglycidyl ether) 및 소르비톨폴리글리시딜에테르(sorbitol polyglycidyl ether) 등을 들 수 있고, 그 중에서도 부탄디올글리시딜에테르가 특히 바람직하다.The crosslinking agent may be varied as a compound including two or more epoxy functional groups, and preferred examples thereof include butanediol diglycidyl ether (BDDE) and ethylene glycol diglycidyl (ethylene glycol diglycidyl). ether: EGDGE), hexanediol diglycidyl ether (1,6-hexanediol diglycidyl ether), propylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether , Polytetramethylene glycol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether Diglycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, trimethylpropanepolyglycidyl Tri (methylpropane polyglycidyl ether), bisepoxypropoxyethylene (1,2- (bis (2,3-epoxypropoxy) ethylene), pentaerythritol polyglycidyl ether and sorbitol polyglycidyl Sorbitol polyglycidyl ether and the like, and butanediol glycidyl ether is particularly preferred.
본 발명에 따른 히알루론산 가교물은 상기 가교제의 에폭시 작용기가 히알루론산의 알코올기와 반응함으로써 형성된다. 상기 에폭시 작용기와 히알루론산 알코올기는 반응시 에테르 결합을 형성하는데, 에폭시 작용기는 고효율의 반응에 의해 거의 모두가 히알루론산에 붙어 있게 되므로 부산물이 발생하지 않는다. The hyaluronic acid crosslinked product according to the present invention is formed by reacting the epoxy functional group of the crosslinker with an alcohol group of hyaluronic acid. When the epoxy functional group and the hyaluronic acid alcohol group react with each other to form an ether bond, almost all of the epoxy functional groups are attached to the hyaluronic acid by high-efficiency reaction, and thus no by-products are generated.
본 발명에 따른 히알루론산 가교물은 생체적합성 소재로 주름살 개선제, 성형 보조제, 관절기능 개선제, 유착 방지제 등 체내에 도입된 상태에서 어떠한 부작용 없이 일정한 형태를 유지하는 용도로 사용할 수 있으며, 약물 전달계(drug delivery system)에서 특정한 약물을 전달하는 매개체(vehicle), 세포배양 지지체 등에 유용하게 사용할 수 있다. 또한 실, 마이크로비드, 필름, 하이드로겔 및 스폰지 등 용도에 맞게 다양한 형태로 제조될 수 있다.Hyaluronic acid crosslinked product according to the present invention can be used as a biocompatible material to maintain a certain form without any side effects in the state introduced into the body, such as wrinkle improver, molding aid, joint function improver, anti-adhesion agent, drug delivery system (drug It can be usefully used in vehicles (vehicle), cell culture support for delivering a specific drug in the delivery system). In addition, it can be prepared in various forms to suit the purpose, such as yarn, microbeads, film, hydrogel and sponge.
본 발명의 하나의 바람직한 제조방법은,One preferred manufacturing method of the present invention,
(a) 히알루론산을 알칼리 수용액에 넣어 녹이고, 상기 히알루론산 알칼리 수용액에 가교제를 첨가하여 균질하게 혼합하는 단계;(a) dissolving hyaluronic acid in an aqueous alkali solution, adding a crosslinking agent to the aqueous alkali solution of hyaluronic acid, and mixing the mixture homogeneously;
(b) 상기 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 유기용매에 떨어뜨려 고체상으로 히알루론산과 가교제의 반응을 유도하는 단계;(b) dropping an aqueous alkali solution of hyaluronic acid containing the crosslinking agent in an organic solvent to induce a reaction of the hyaluronic acid with the crosslinking agent in a solid phase;
(c) 상기 가교반응을 통해 얻어진 히알루론산 가교물에서 수산화 이온 및 미반응 가교제를 제거하는 단계; 및(c) removing hydroxide ions and unreacted crosslinkers from the hyaluronic acid crosslinked product obtained through the crosslinking reaction; And
(d) 상기 히알루론산 가교물을 분리 및 건조하여 회수하는 단계;(d) separating and drying the hyaluronic acid crosslinked product;
를 포함한다.It includes.
상기 단계(a)에서, 히알루론산의 농도는 히알루론산 알칼리 수용액에서의 고체 성분의 중량을 기준으로 1% 내지 50%이며, 바람직하게는 5% 내지 15%이다.In the step (a), the concentration of hyaluronic acid is 1% to 50%, preferably 5% to 15% by weight of the solid component in the aqueous alkali solution of hyaluronic acid.
알칼리 수용액에 사용되는 알칼리 시약은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아수 등과 같은 염기성 화합물이 바람직하며, 그 중에서 수산화나트륨이 특히 바람직하다. 알칼리 수용액의 농도는 0.1M 내지 10M인 것이 히알루론산의 용해 및 가교반응에 바람직하다. The alkali reagent used in the aqueous alkali solution is not particularly limited, but basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, aqueous ammonia and the like are preferred, and sodium hydroxide is particularly preferred. It is preferable for dissolution and crosslinking reaction of hyaluronic acid that concentration of aqueous alkali solution is 0.1M-10M.
추후 단계(b)에서 유기용매에 대한 히알루론산의 용해성을 떨어뜨려 고체상으로의 변환을 더욱 용이하게 하기 위하여, 히알루론산 알칼리 수용액에 염화나트륨 등의 염을 더 첨가할 수 있으며, 이 경우에 염의 바람직한 농도는 1 내지 1000 mg/ml이다. 상기 염화나트륨은 단계(b)에서 혼합용액이 유기용매에 떨어질 때 순간적으로 고체상태로 변환되는 것을 원활하게 해준다.In order to further reduce the solubility of hyaluronic acid in the organic solvent in the step (b) to facilitate the conversion into a solid phase, a salt such as sodium chloride may be further added to the aqueous alkali solution of hyaluronic acid, in which case the preferred concentration of the salt Is 1 to 1000 mg / ml. The sodium chloride facilitates the instantaneous conversion to the solid state when the mixed solution falls into the organic solvent in step (b).
가교제의 첨가량은 히알루론산 반복 단위(repeating unit)당 0.01 당량% 내 지 50 당량%가 바람직하며, 0.1 당량% 내지 10 당량%가 더욱 바람직하다.The amount of the crosslinking agent added is preferably 0.01 to 50 equivalent%, more preferably 0.1 to 10 equivalent%, per hyaluronic acid repeating unit.
상기 단계(b)에서, 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 유기용매에 떨어뜨려 고체상으로 만들 때 소망하는 형태에 따라 구형의 입자, 실 등으로 고화시킬 수 있다. 가교반응은 이러한 고체상에서 진행되며, 고체상에서의 반응농도는 액체상에서의 반응농도와 비교하여 상당히 높아지기 때문에 반응의 효율성을 극대화시킬 수 있어 우수한 물성을 지닌 히알루론산 유도체를 제조할 수 있다.In the step (b), when the aqueous alkali solution of hyaluronic acid containing a crosslinking agent is dropped into an organic solvent to form a solid phase, it may be solidified into spherical particles, yarns, etc. according to a desired form. The crosslinking reaction proceeds in such a solid phase, and the reaction concentration in the solid phase is considerably higher than the reaction concentration in the liquid phase, thereby maximizing the efficiency of the reaction, thereby preparing a hyaluronic acid derivative having excellent physical properties.
상기 유기용매로는 아세톤, 아세톤 수용액, 에탄올 등의 C2 내지 C6 알코올 또는 알코올 수용액 등을 사용할 수 있다.As the organic solvent, acetone, acetone aqueous solution, C 2 to C 6 alcohol such as ethanol or an aqueous alcohol solution may be used.
가교반응의 온도는 15℃ 내지 60℃가 바람직하고, 25℃ 내지 50℃가 더욱 바람직하다. 이때, 가교반응의 시간은 특별히 제한되지 않으나, 반응 시간이 길어질수록 히알루론산이 분해되어 물리적 점탄성이 낮아지는 문제점이 있으므로 1 시간 내지 48 시간이 바람직하다.15 to 60 degreeC is preferable and, as for the temperature of a crosslinking reaction, 25 to 50 degreeC is more preferable. At this time, the time of the crosslinking reaction is not particularly limited, but as the reaction time increases, the hyaluronic acid is decomposed to lower the physical viscoelasticity, so 1 hour to 48 hours are preferable.
상기 단계(c)에서, 히알루론산 가교물을 증류수나 산성용액 또는 염이 첨가된 수용액으로 수회 세척하여 미반응 가교제 및 수산화 이온을 제거할 수 있다. 상기 산성용액으로는 염산, 황산, 질산, 인산, 아세트산 등의 수용액을 사용할 수 있고, 상기 염이 첨가된 수용액으로는 염화나트륨 수용액, 인산 수용액, 인산염이 포함된 염화 나트륨 수용액 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 세척효율이 뛰어난 염이 첨가된 수용액을 사용하는 것이 특히 바람직하다.In step (c), the hyaluronic acid crosslinked product may be washed several times with distilled water, an acidic solution or an aqueous solution to which salt is added to remove the unreacted crosslinking agent and the hydroxide ion. The acidic solution may be an aqueous solution of hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, acetic acid, and the like, and the aqueous solution to which the salt is added may be an aqueous sodium chloride solution, an aqueous phosphoric acid solution, or an aqueous sodium chloride solution containing phosphate. Especially, it is especially preferable to use the aqueous solution to which the salt excellent in the washing | cleaning efficiency was added.
상기 단계(d)에서, 정제된 히알루론산 가교물을 유기용매 또는 유기용매 수 용액에 침전시켜 회수하거나 세척 용매상에서 회수할 수 있다. 또는, 상기 히알루론산 가교물을 증류수 또는 염이 첨가된 수용액에서 분쇄기를 이용하여 미세한 입자로 만든 다음 유기용매 또는 유기용매 수용액에 침전시켜 회수하거나 증류수상에서 회수할 수 있다. 상기 유기용매는 가교제가 포함된 히알루론산 알칼리 수용액을 고체상으로 만들 때 사용했던 유기용매와 그 종류가 동일할 수 있다. In step (d), the purified hyaluronic acid crosslinked product may be recovered by precipitation in an organic solvent or an aqueous organic solvent solution or recovered in a washing solvent. Alternatively, the hyaluronic acid crosslinked product may be made into fine particles in a distilled water or an aqueous solution to which salt is added, and then precipitated in an organic solvent or an aqueous organic solvent solution, or recovered in distilled water. The organic solvent may be the same kind as the organic solvent used when the aqueous alkali solution of hyaluronic acid containing a crosslinking agent is made into a solid phase.
회수된 히알루론산 가교물은 열, 질소, 공기 감압, 동결건조 등을 이용하여 건조하고, 적용목적에 따라 형태나 크기에 따라 분리 회수할 수 있다.The recovered hyaluronic acid crosslinked product may be dried using heat, nitrogen, air pressure reduction, lyophilization, and the like, and may be separated and recovered depending on the shape and size according to the application purpose.
본 발명에 따른 제조 방법들의 각 반응단계에서의 생성물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의하여 반응계로부터 분리 및/또는 정제될 수 있다. 분리 및 정제방법의 예로는, 증류(대기압 하에서의 증류 및 감압증류를 포함), 재결정, 칼럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석, 세척 등을 들 수 있다. 정제는 각 반응단계마다 또는 일련의 반응 단계들 이후에 수행할 수 있다.The product in each reaction step of the preparation methods according to the invention can be separated and / or purified from the reaction system by conventional methods known in the art. Examples of separation and purification methods include distillation (including distillation under atmospheric pressure and distillation under reduced pressure), recrystallization, column chromatography, ion exchange chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, thin layer chromatography, phase separation, solvent extraction, Dialysis, washing and the like. Purification can be carried out for each reaction step or after a series of reaction steps.
상기에서 제조된 히알루론산 가교물은 건조방법, 성형방법 등에 의해 마이크로비드, 실, 하이드로겔, 필름, 스폰지 등 다양한 형상으로 제조될 수 있다.The hyaluronic acid crosslinked product prepared above may be prepared in various shapes such as microbeads, yarns, hydrogels, films, sponges, etc. by a drying method, a molding method, and the like.
본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서, 공정의 효율성 및 수율의 향상을 위하여, 상기 공정들의 일부가 변형되거나 기타 제조 공정들이 포함될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.To the extent that the effects of the present invention are not impaired, in order to improve the efficiency and yield of the process, some of the above processes may be modified or other manufacturing processes may be included, all of which should be construed as being included in the present invention.
본 발명에 따른 히알루론산 가교물의 합성에 필요한 원료물질 및 시약은 문헌의 방법에 의해 또는 전술한 방법에 의해 용이하게 제조 가능하거나, 상업적으로 구입 가능하다. 참고로, 별도의 설명이 없는 한, 본 발명에서 정의하는 각종 범위, 예를 들어, 농도 범위, 온도 범위, 시간 범위 등은 본 발명을 보다 효율적으로 실행하기 위한 조건들로서 이해한다.Raw materials and reagents necessary for the synthesis of the hyaluronic acid crosslinked product according to the present invention can be easily prepared by the methods of the literature or by the aforementioned methods, or can be commercially purchased. For reference, unless stated otherwise, various ranges defined in the present invention, for example, concentration ranges, temperature ranges, time ranges, and the like, are understood as conditions for more effectively carrying out the present invention.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명의 내용을 상세히 설명하지만, 본 발명의 범주가 그것에 의해 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the content of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예Example 1: 고체상 반응으로 히알루론산 1: hyaluronic acid by solid phase reaction 가교물의Crosslinked 마이크로비드Microbeads 제조 Produce
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 5N NaOH 용액에 녹여 2 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 2.4 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 5%). 상기 용액을 에탄올에 구형의 입자 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 비드는 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켰다. Sodium hyaluronate (molecular weight: 3,000,000, manufacturer: LG Life Sciences Ltd.) at 50 mg / ml was dissolved in 5N NaOH solution to prepare 2 ml, and 2.4 μl of BDDE was added to the sodium hyaluronate solution (hyaluronic acid). Equivalent ratio of BDDE to repeat units: 5%). The solution was dropped into ethanol in the form of spherical particles, reacted at room temperature for 24 hours, and then washed several times with distilled water. The washed beads were precipitated and recovered in ethanol and dried over nitrogen gas.
실시예Example 2: 고체상 반응으로 히알루론산 2: hyaluronic acid by solid phase reaction 가교물의Crosslinked 마이크로비드Microbeads 제조 Produce
50 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 NaCl이 200 mg/ml이 되도록 첨가된 1N NaOH 용액에 녹여 2 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 2.4 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 5%). 상기 용액을 에탄올에 구형의 입자 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 비드는 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켰다.Sodium hyaluronate (molecular weight: 3,000,000, manufacturer: LG Life Sciences Ltd.) at a concentration of 50 mg / ml was prepared by dissolving 2 ml of 1N NaOH solution added with NaCl to 200 mg / ml, followed by sodium hyaluronate solution. 2.4 μl of BDDE was added (equivalent ratio of BDDE to hyaluronic acid repeat unit: 5%). The solution was dropped into ethanol in the form of spherical particles, reacted at room temperature for 24 hours, and then washed several times with distilled water. The washed beads were precipitated and recovered in ethanol and dried over nitrogen gas.
실시예Example 3: 고체상 반응으로 히알루론산 3: hyaluronic acid by solid phase reaction 가교물의Crosslinked 실 제조 Thread manufacturing
150 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 1 N NaOH 용액에 녹여 1.33 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 0.096 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 0.1%). 상기 용액을 에탄올에 일정한 속도로 분사하여 실의 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 실은 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켰다. Sodium hyaluronate (molecular weight: 3,000,000, manufacturer: LG Life Sciences Ltd.) at 150 mg / ml was dissolved in 1 N NaOH solution to prepare 1.33 ml, and then 0.096 μl of BDDE was added to the sodium hyaluronate solution (hyaluronic acid). Equivalent ratio of BDDE to repeating units of lonic acid: 0.1%). The solution was sprayed onto ethanol at a constant rate, dropped into a thread form, reacted at room temperature for 24 hours, and then washed several times with distilled water. The washed yarn was recovered by precipitation in ethanol and dried with nitrogen gas.
실시예Example 4: 고체상 반응으로 히알루론산 4: hyaluronic acid by solid phase reaction 가교물의Crosslinked 실과 Fruit 마이크로비드Microbeads 제조 Produce
150 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 1 N NaOH 용액에 녹여 2.67 ml 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 9.6 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 5%). 상기 용액을 에탄올에 일정한 속도로 분사하여 실의 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척하였다. 세척된 실은 에탄올에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조하여 실의 형태로 제조하였다. Sodium hyaluronate (molecular weight: 3,000,000, manufacturer: LG Life Sciences Ltd.) at 150 mg / ml was dissolved in 1 N NaOH solution to prepare 2.67 ml of sodium hyaluronate, and 9.6 μl of BDDE was added to the sodium hyaluronate solution (hyaluronic acid). Equivalent ratio of BDDE to Ronson repeat unit: 5%). The solution was sprayed onto ethanol at a constant rate, dropped into a thread form, reacted at room temperature for 24 hours, and then washed several times with distilled water. The washed yarn was recovered by precipitation in ethanol and dried with nitrogen gas to prepare a yarn.
일부의 세척된 실은 분쇄기를 이용하여 증류수 상에서 분쇄한 다음, 에탄올 에 침전하여 회수한 뒤, 질소가스로 건조시켜 마이크로 크기의 입자 형태로 제조하였다.Some of the washed yarn was ground in distilled water using a grinder, precipitated and recovered in ethanol, dried with nitrogen gas, and prepared in the form of micro-sized particles.
실험예 1: 실시예 4에서 제조된 히알루론산 가교물의 실과 마이크로비드의 형태와 물성 비교Experimental Example 1: Comparison of the form and physical properties of the yarn and microbeads of the hyaluronic acid crosslinked product prepared in Example 4
실시예 4에서 제조된 히알루론산 가교물 실을 생리 식염수를 사용하여 76.6 mg/ml 농도로 만들었고, 형태를 확인하기 위해 촬영한 사진이 도 1에 개시되어 있다. 또한, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 71,661,079 cP를 나타내었다.The hyaluronic acid crosslinked yarn prepared in Example 4 was made at 76.6 mg / ml concentration using physiological saline, and photographs taken to confirm the form are shown in FIG. 1. In addition, the complex viscosity was measured after sterilization at a frequency of 0.02 to 1 Hz using a rheometer to check the rheological properties. The composite viscosity measured at a frequency of 0.02 Hz of the prepared sample was 71,661,079 cP.
실시예 4에서 제조된 히알루론산 가교물 마이크로비드를 생리 식염수를 사용하여 70 mg/ml 농도로 만들었고, 형태를 확인하기 위해 촬영한 사진이 도 2에 개시되어 있다. 또한, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 9,590,261 cP를 나타내었다. The hyaluronic acid crosslinked microbead prepared in Example 4 was made at 70 mg / ml concentration using physiological saline, and photographs taken to confirm the form are shown in FIG. 2. In addition, the complex viscosity was measured after sterilization at a frequency of 0.02 to 1 Hz using a rheometer to check the rheological properties. The composite viscosity measured at a frequency of 0.02 Hz of the prepared sample was 9,590,261 cP.
비교예Comparative example 1: One: 액체상Liquid phase 반응으로 히알루론산 Reaction hyaluronic acid 가교물의Crosslinked 마이크로비드Microbeads 제조 Produce
150 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 1N NaOH 용액에 녹여 2.67 ml를 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 1.92 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 1%). 상기 용액을 둘로 나눠 그 중 한 용액은 액체상으로 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수에서 분쇄 및 세척을 하여 에탄올에 침전한 뒤 회수하였다. Sodium hyaluronate (molecular weight: 3,000,000, manufacturer: LG Life Sciences Ltd.) at 150 mg / ml was dissolved in 1N NaOH solution to prepare 2.67 ml, and then 1.92 μl of BDDE was added to the sodium hyaluronate solution (hyaluronic acid). Equivalent ratio of BDDE to repeating units of lon acid: 1%) The solution was divided into two, one of which was reacted in a liquid state at room temperature for 24 hours, and then pulverized and washed in distilled water to precipitate in ethanol and recovered.
실시예Example 5: 고체상 반응으로 히알루론산 5: hyaluronic acid by solid phase reaction 가교물의Crosslinked 마이크로비드Microbeads 제조 Produce
비교예 1에서 나머지 다른 용액은 에탄올에 일정한 속도로 분사하여 실의 형태로 떨어뜨려, 실온에서 24 시간 동안 고체상으로 반응을 행한 후, 증류수로 여러 번 세척한 다음, 상기 증류수 상에서 분쇄기를 이용하여 분쇄한 뒤 에탄올에 침전하여 회수하고 질소가스로 건조시켜 마이크로 크기의 입자형태로 제조하였다. In Comparative Example 1, the remaining solution was sprayed onto ethanol at a constant rate, dropped into a yarn, reacted in a solid phase at room temperature for 24 hours, washed several times with distilled water, and then pulverized using a grinder on the distilled water. Then, precipitated and recovered in ethanol and dried with nitrogen gas to prepare a micro-sized particle form.
비교예 2: 액체상 반응으로 히알루론산 가교물의 마이크로비드 제조Comparative Example 2: Preparation of microbeads of hyaluronic acid crosslinked product by liquid phase reaction
300 mg/ml의 농도로 히알루론산 나트륨(분자량: 3,000,000, 제조사: LG Life Sciences Ltd.)을 0.75N NaOH 용액에 녹여 1 ml를 제조한 다음, 상기 히알루론산 나트륨 용액에 BDDE를 1.44 ㎕ 첨가하였다(히알루론산 반복단위에 대한 BDDE의 당량비: 1%). 상기 용액은 액체상으로 실온에서 24 시간 동안 반응을 행한 후, 증류수에서 분쇄 및 세척한 다음, 에탄올에 침전하여 회수하였다. Sodium hyaluronate (molecular weight: 3,000,000, manufacturer: LG Life Sciences Ltd.) at 300 mg / ml was dissolved in 0.75N NaOH solution to prepare 1 ml, and then 1.44 μl of BDDE was added to the sodium hyaluronate solution ( Equivalent ratio of BDDE to hyaluronic acid repeat units: 1%). The solution was reacted in a liquid phase at room temperature for 24 hours, then triturated and washed in distilled water, and then recovered by precipitation in ethanol.
실험예 2: 실시예 5와 비교예 1 및 2에서 제조된 히알루론산 가교물의 마이크로비 드의 물성 비교Experimental Example 2: Comparison of physical properties of the microbeads of the hyaluronic acid crosslinked product prepared in Example 5 and Comparative Examples 1 and 2
실시예 5에서 제조된 마이크로비드를 생리 식염수를 사용해 50 mg/ml 농도로 만든 후, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 6,466,432 cP를 나타내었다. After preparing the microbead prepared in Example 5 to 50 mg / ml concentration using physiological saline, and after sterilization at a frequency of 0.02 to 1 Hz using a rheometer (rheometer) to confirm the rheological properties complex viscosity (complex) viscosity) was measured. The composite viscosity measured at a frequency of 0.02 Hz of the prepared sample was 6,466,432 cP.
비교예 1에서 제조된 마이크로비드는 반응성이 매우 낮아 정제시 대부분 용해되어 회수가 되지 않았으며, 회수된 일부는 생리 식염수로 제조하였을 때 유변학적 특성을 확인할 수 없을 정도로 매우 낮은 점도를 보였다. The microbead prepared in Comparative Example 1 was very low in reactivity, so that most of the microbeads were not dissolved and recovered, and the recovered part showed a very low viscosity so that rheological properties could not be confirmed when manufactured with physiological saline.
비교예 2에서 제조된 마이크로비드를 생리 식염수를 사용해 20 mg/ml 농도로 만든 후, 유변학적 특성을 확인하기 위하여 레오미터(rheometer)를 사용하여 0.02 내지 1 Hz의 진동수에서 멸균 후 복합점도(complex viscosity)를 측정하였다. 제조된 시료의 0.02 Hz의 진동수에서 측정한 복합점도는 6,138,680 cP를 나타내었다. After making the microbead prepared in Comparative Example 2 to 20 mg / ml concentration using physiological saline, and after sterilization at a frequency of 0.02 to 1 Hz using a rheometer (rheometer) to check the rheological properties complex viscosity (complex) viscosity) was measured. The composite viscosity measured at a frequency of 0.02 Hz of the prepared sample was 6,138,680 cP.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 액체상의 가교반응으로 제조된 히알루론산 가교물(비교예 1)은, 고체상의 가교반응으로 제조된 히알루론산 가교물(실시예 5)과 동일한 농도의 히알루론산 및 동일한 가교제를 사용하여 제조하였음에도 불구하고, 실시예 5의 가교물에 비해 반응성이 매우 낮아 수율 및 물성이 많이 감소됨을 알 수 있다. 또한, 비교예 2의 가교물은 실시예 5의 가교물과 유사한 물성을 갖게 하기 위하여 두 배의 농도에서 반응시켜 제조하였지만, 이 경우에도 팽윤도가 약 2.5 배 높았기 때문에 가교도가 낮은 것으로 확인되었다.As can be seen from the above results, the hyaluronic acid crosslinked product prepared by the liquid phase crosslinking reaction (Comparative Example 1) is the same concentration as the hyaluronic acid crosslinked product prepared by the solid phase crosslinking reaction (Example 5) and the same crosslinking agent. In spite of the fact that it was prepared using, it was found that the reactivity is very low compared to the crosslinked material of Example 5, and the yield and physical properties are greatly reduced. In addition, the crosslinked product of Comparative Example 2 was prepared by reacting at twice the concentration in order to have similar physical properties as the crosslinked product of Example 5, but in this case, it was confirmed that the crosslinking degree was low because the swelling degree was about 2.5 times higher.
따라서, 액체상의 가교반응에 비해 유기용매에서 고체상으로 가교반응을 하 는 경우가 반응의 효율성이 높아 상대적으로 낮은 반응농도와 가교제의 적은 양에서도 우수한 물성의 히알루론산 가교물이 제조될 수 있음을 알 수 있다.Therefore, when the crosslinking reaction from the organic solvent to the solid phase is higher than the liquid phase crosslinking reaction, the hyaluronic acid crosslinked material having excellent physical properties can be produced even at a relatively low reaction concentration and a small amount of the crosslinking agent. Can be.
상기에서 본 발명을 구체적인 예들을 중심으로 상세히 설명하였지만, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백할 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속한다.Although the present invention has been described in detail with reference to specific examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made within the scope and spirit of the present invention, and such modifications and modifications belong to the appended claims. .
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따르면, 소망하는 고체상의 형태에서 반응을 진행시킬 수 있고, 높은 반응율과 그로 인한 불순물의 최소화, 고순도 물질의 제조, 용이한 정제과정 등 종래기술의 대부분의 문제점들을 해소할 수 있다. As described above, according to the manufacturing method of the present invention, the reaction can proceed in the form of a desired solid phase, and the high reaction rate and the resulting minimization of impurities, the production of high purity materials, easy purification process, such as most of the prior art Problems can be solved.
이러한 히알루론산 가교물은 마이크로비드, 실, 하이드로겔, 필름 및 스폰지와 같은 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 우수한 생체적합성, 물리적 특성 및 열과 분해효소에 대한 안정성을 가지므로 체내의 다양한 환경에서도 주름살 개선제, 성형 보조물, 약물 전달체, 세포 지지체, 유착 방지제, 관절기능 개선제 등 다양한 용도로 사용될 수 있다.These hyaluronic acid crosslinked products can be prepared in various forms such as microbeads, yarns, hydrogels, films, and sponges, and have excellent biocompatibility, physical properties, and stability against heat and degrading enzymes, thereby improving wrinkles in various environments in the body. It can be used in various applications, such as molding aids, drug carriers, cell supports, anti-adhesion agents, joint function improving agents.
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