KR20070000291A - 나노포어 및 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용한고감도 핵산 검출 방법 - Google Patents

나노포어 및 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용한고감도 핵산 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산 시료와 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 전도성 유체 매질 중에서 접촉시키는 단계; 얻어진 상기 물질이 결합된 핵산을 포함하는 시료를 나노포어(nanopore)와 접촉시키는 단계; 및 상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하여, 상기 나노포어를 통한 전류 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는, 시료 중의 핵산을 고감도로 검출하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 인터컬레이터를 이용하지 않은 경우에 비해 나노포어를 통한 전류 진폭의 변화가 증가하므로 핵산을 더욱 고감도로 검출할 수 있다.

Description

나노포어 및 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용한 고감도 핵산 검출 방법{Method for the high sensitive nucleic acid detection using nanopore and non-specifically nucleic acid-binding agent}
본 발명은 나노포어 및 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용한 고감도 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
시료 내에서 표적 생분자를 검출하기 위해 다양한 방법이 개발되었는데, 그 중에서 나노포어(nanopore)를 이용한 방법은 바이오포어(bio-pore) 모방 시스템으로서 고감도 DNA 검출 시스템으로 각광을 받고 있으며, 이론적으로 염기서열의 시퀀성이 가능하다고 알려졌다.
미국특허 제6362002호는 "Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions"에 관한 것으로, 두 개의 풀(pool) 사이의 계면에 단일가닥 핵산은 통과할 수 있으나 이중가닥 핵산은 통과할 수 없는 채널(channel)을 만들어 이중가닥 핵산을 검출하는 방법을 개시하고 있다.
미국 특허 제6428959호는 "Methods of Determining the presence of double stranded nucleic acids in a sample"에 관한 것으로, 유체 시료내 핵산을 나노포어를 통과시키면서 나노포어를 통해 흐르는 전류 진폭(current amplitude)을 측정하여 전류의 차단(blockade)에 의해 이중가닥 핵산을 검출하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허는 단일가닥 핵산과 이중가닥 핵산을 포함하는 시료에서 이중가닥 핵산을 검출하는 것으로, 전류 진폭을 증가시키기 위해 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용하여 핵산을 검출하는 본 발명과는 상이하다.
미국 특허 공개번호 제2003/0104428호는 "Method for characterization of nucleic acid molecules"에 관한 것으로, 염기 서열 특이적인 단백질을 이용하여 특이적인 국부(local area) 변형을 통해, 더 큰 신호 변화를 달성한 것이다. 그러나, 상기 특허는 특정 서열을 가진 DNA를 나노포어를 이용하여 검출하는 것으로, 특정 서열에 관계 없이 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용하여 핵산을 검출하는 본 발명과는 상이하다.
본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 핵산의 검출 방법을 연구하던 중, 특정 서열에 관계 없이 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용하여 나노포어를 통한 전류 진폭의 변화를 증가시킴으로써 핵산을 고감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 핵산 시료와 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 전도성 유체 매질 중에서 접촉시키는 단계; 얻어진 상기 물질이 결합된 핵산을 포함하는 시료를 나노포어(nanopore)와 접촉시키는 단계; 및 상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하여, 상기 나노포어를 통한 전류 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는, 시료 중의 핵산을 고감도로 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 나노포어; 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질; 상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하는 수단; 및 상기 나노포어를 통한 전류 변화를 측정하는 검출기를 포함하는, 핵산 검출용 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
핵산 시료와 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 전도성 유체 매질 중에서 접촉시키는 단계;
얻어진 상기 물질이 결합된 핵산을 포함하는 시료를 나노포어(nanopore)와 접촉시키는 단계; 및
상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하여, 상기 나노포어를 통한 전류 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는, 시료 중의 핵산을 고감도로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명은 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용하여 핵산이 나노포어를 통과할 때 발생하는 전류 진폭을 증가시켜 핵산을 고감도로 검출하는 것이다. 구체적으로, 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질이 결합되지 않은 핵산에 비해 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질이 결합된 핵산은 그 부피가 증가하게 되어 전류 진폭이 커지는 것이다.
본 발명의 방법은 핵산 시료와 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 전도성 유체 매질 중에서 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 나노포어를 통한 핵산의 이동시 전류 진폭을 증가시켜, 핵산을 고감도로 검출하기 위해서 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 이용한다. 핵산에 비특이적으로 결합되는 물질과 핵산 시료는 전도성 유체 매질 중에서 접촉된다. 검출하고자 하는 핵산은 유체 시료, 특히 액체 시료에 존재한다. 시료는 전기적으로 전도성의 시료이어야 하므로, 전기적으로 전도성인 용매에 용해되어야 하는 것이다. 임의의 편리한 전기적으로 전도성인 용매가 이용될 수 있다. 상기 용매는 수성 용매이며, 순수한 물 또는 하나 이상의 부가적인 물질, 예를 들면, 완충제, 염(예를 들면, 염화칼륨)이 존재하는 물일 수 있다. 유체 시료의 pH는 전형적으로 약 6.0 내지 9.0, 더욱 바람직하게는 약 7.0 내지 8.5이다.
본 발명의 방법은 얻어진 상기 물질이 결합된 핵산을 포함하는 시료를 나노포어(nanopore)와 접촉시키는 단계를 포함한다. 나노포어는 "나노" 크기의 직경을 갖는 채널 또는 포어를 갖는 구조를 의미한다. 본원에 사용된, 용어 "나노포어" 및 "채널"은 핵산이 통과할 수 있는 나노스케일 통로를 갖는 구조를 언급하기 위해 상호교환하여 이용된다.
본 발명의 방법은 상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하여, 상기 나노포어를 통한 전류 변화를 모니터링하는 단계를 포함한다. 유체 시료 중의 핵산은 유체 시료에 전기장의 인가에 의해 나노포어를 통해 이동하게 된다. 나노포어를 통한 전류 진폭은 이동 과정 동안 모니터링되며, 진폭의 변화는 나노포어를 통한 핵산의 통과와 관련되므로, 측정된 전류 진폭 값으로부터 핵산을 효율적으로 검출할 수 있는 것이다.
나노포어를 통한 시료 중의 핵산의 이동은 임의의 편리한 수단에 의해 달성될 수 있으며, 일반적으로 이동은 시료에 전기장을 인가함으로써 달성된다. 인가된 전기장은 나노포어를 통해 핵산을 이동시킬 수 있을 정도로 충분히 강할 것이다.
전기장이 나노포어를 통해 유체 시료에 인가되는 시간은 시료 중의 핵산의 일부 또는 실질적으로 모두가 이동되는가에 의존한다. 일반적으로, 전기장은 약 1ms 이상, 바람직하게는 약 1s 이상, 더욱 바람직하게는 약 10s 이상, 더더욱 바람직하게는 1분 이상일 수 있다. 그러나, 일반적으로 약 10분 이상, 통상 약 1 시간 이상은 인가되지 않을 것이다.
본 발명의 방법에서, 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질은 인터컬레이터(intercalator), 대홈(major groove) 결합물질, 소홈(minor groove) 결합물질 등을 포함할 수 있다. 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질은 가능하면 핵산에 결합되어 핵산의 부피 변화를 크게 하여 전류의 진폭을 증가시킬 수 있는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법에서, 상기 인터컬레이터는 YOYO(1,1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤족사졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드), TOTO(1-1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드), EtBr(에티디움 브로마이드) 등을 포함할 수 있다. 상기 인터컬레이터는 핵산에 삽입될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으나, 가능하면 핵산에 삽입되어 핵산의 부피 변화를 크게 하여 전류의 진폭을 증가시킬 수 있는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명에 이용된 YOYO의 구조는 하기와 같다.
본 발명의 방법에서, 상기 나노포어의 직경은 1.5nm ∼120nm 일 수 있다. 나노포어의 직경이 1.5nm 미만이면 핵산이 통과하지 못하는 문제가 생기며, 120nm을 초과하면 전류 진폭이 작아서 핵산의 검출이 불가능하기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 인가된 전기장은 100mV ∼1000mV 일 수 있다. 인가된 전기장이 100mV 미만이면 나노포어를 통한 핵산의 통과 효율이 감소되는 문제가 생기며, 1000mV를 초과이면 노이즈가 심해지는 문제가 발생하기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 전도성 유체 매질은 서열이 서로 상이한 복수의 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 시료 중에 존재하는 한 종류의 핵산을 검출하는 것도 가능하지만, 한 종류에 국한되지 않고 길이 또는 서열이 서로 상이한 복수의 핵산을 검출하는 것도 가능할 수 있다. 즉, 핵산의 종류에 따라 모니터링되는 전류의 진폭의 변화가 달라질 수 있으므로 서로 길이 또는 서열이 상이한 핵산을 검출할 수 있는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
나노포어;
핵산에 비특이적으로 결합하는 물질;
상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하는 수단; 및
상기 나노포어를 통한 전류 변화를 측정하는 검출기를 포함하는, 핵산 검출용 장치를 제공한다.
본 발명의 핵산 검출용 장치는 핵산을 포함하는 시료와 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 전도성 유체 매질에서 접촉시킨 후, 상기 장치에 도입하고, 나노포어를 통하여 전기장을 인가하면, 나노포어를 통한 전류 변화를 측정하는 검출기에 의해 전류 변화를 측정함으로써 핵산을 고감도로 검출하는 것이다.
나노포어는 "나노" 크기의 직경을 갖는 채널 또는 포어를 갖는 구조를 의미하며, 천연 유래 또는 합성 유래일 수 있다. 천연 유래 나노포어는 올리고머성 단백질 채널, 예를 들면, 포린, 그라미시딘, 및 합성 펩티드 등을 포함하며, 특히 바람직한 단백질 채널은 α-헤모라이신의 자가 조립된 헵타머성 채널이다. 합성 나노포어는 고체 물질을 통해 구멍이 뚫린 통로를 포함한다.
상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하는 수단은 전형적으로 약 10mV 이상, 통상 약 50mV 이상, 더욱 통상적으로 약 100mV 이상의 전압을 생성할 수 있다. 전형적으로, 전기장 인가 수단은 전압 공급원에 연결된 염화은 전극으로 구성된다.
상기 나노포어를 통한 전류 변화를 측정하는 검출기는 매우 낮은 노이즈 증폭기 및 전류 인젝터(injector), 아날로그를 디지탈로 변환시키는 A/D 변환기를 포함한다. 상기 장치는 또한 데이타 획득 소프트웨어, 전자 저장 매체 등을 포함하는 출력(output) 생성 시스템의 기타 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 장치에서, 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질은 인터컬레이터(intercalator), 대홈(major groove) 결합물질, 소홈(minor groove) 결합물질 등을 포함할 수 있다. 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질은 가능하면 핵산에 결합되어 핵산의 부피 변화를 크게 하여 전류의 진폭을 증가시킬 수 있는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 장치에서, 상기 인터컬레이터는 YOYO(1,1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤족사졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드), TOTO(1-1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드), EtBr(에티디움 브로마이드) 등을 포함할 수 있다. 상기 인터컬레이터는 핵산에 삽입될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으나, 가능하면 핵산에 삽입되어 핵산의 부피 변화를 크게 하여 전류의 진폭을 증가시킬 수 있는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 장치에서, 상기 나노포어의 직경은 1.5nm ∼120nm 일 수 있다. 나노포어의 직경이 1.5nm 미만이면 핵산이 통과하지 못하는 문제가 생기며, 120nm을 초과하면 전류 진폭이 작아서 핵산의 검출이 불가능하기 때문이다.
본 발명의 장치에서, 상기 인가된 전기장은 100mV ∼1000mV 일 수 있다. 인가된 전기장이 100mV 미만이면 나노포어를 통한 핵산의 통과 효율이 감소되는 문제가 생기며, 1000mV를 초과이면 노이즈가 심해지는 문제가 발생하기 때문이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 본 발명의 나노포어의 제조
본 발명에 이용된 나노포어는 하기와 같이 제조하였다. 먼저, 실리콘 웨이퍼 상면에 LPCVD 장치를 이용하여 고응력 니트리드층(high stress nitride layer)을 250-300nm정도 생성시킨 후, 하면에 포토레지스트를 코팅한 후, 600㎛ × 600㎛ 크기의 패턴을 제작하였다.
그 후, KOH 용액을 이용하여, 웨이퍼를 에칭하면, 하면에 있는 600㎛ × 600㎛ 크기의 패턴이 에칭되고, 상면에 있는 니트리드면까지 식각된다. 완성된 니트리드 멤브레인 윈도우(membrane window)는 30 × 30㎛ 이다.
유기 용매로 세정한 후, 니트리드만 있는 니트리드 멤브레인 윈도우에 FIB (Focused Ion Beam)을 이용하여 100nm정도의 홀(hole)을 제작한다. 그 후, ALD (Atomic layer deposition)　공정으로 표면한다.
실시예 2: 핵산 부재하의 전류 변화 측정
람다(Lambda) DNA 없이 인터컬레이터만을 이용하여 나노포어를 통한 전류를 측정하였다. 인터컬레이터로는 0.1μM의 YOYO-1을 이용하고, 전도성 유체 매질로는 1M KCl, 10mM Tris-EDTA, pH8.0 을 이용하고, 상기 실시예 1에서 제조된 나노포어(직경 100nm)에 300mV의 전기장을 인가하였다. 도 1은 람다 DNA 없이 인터컬레이터만을 이용하여 나노포어를 통한 전류를 측정한 것이다. 도 1에서 A 및 B는 상기 실시예 1에서 제조된 나노포어의 duplicate을 나타낸 것이다. 도 1에서 보여주는 바와 같이, DNA 없이 인터컬레이터만 있는 경우에는 전류의 변화가 거의 없음을 알 수 있다.
실시예 3: 람다 DNA 존재하의 전류 변화 측정
람다 DNA 존재하에 인터컬레이터를 이용하여 나노포어를 통한 전류를 측정하였다. 인터컬레이터로는 0.1μM의 YOYO-1을 이용하고, 람다 DNA는 0.1nM을 이용하고, 전도성 유체 매질로는 1M KCl, 10mM Tris-EDTA, pH8.0 을 이용하고, 상기 실시예 1에서 제조된 나노포어(직경 100nm)에 300mV의 전기장을 인가하였다. 도 2는 람다 DNA 존재하에 인터컬레이터를 이용하여 실시예 2의 나노포어 A를 통한 전류를 측정한 것이다. 도 2에서 보여주는 바와 같이, 천연 람다 DNA 의 경우에는 나노포어를 통한 전류의 진폭이 약 200pA(피코암페아)인데 반해, YOYO-DNA 복합체의 경우에는 나노포어를 통한 전류의 진폭이 약 800pA 이었다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 천연 람다 DNA에 비해 인터컬레이터로서 YOYO-1을 첨가한 YOYO-DNA 복합체의 경우에는 전류의 진폭이 4배 정도 증가한 것을 알 수 있다.
도 3은 람다 DNA 존재하에 인터컬레이터를 이용하여 실시예 2의 나노포어 B를 통한 전류를 측정한 것이다. 도 3에서 보여주는 바와 같이, 천연 람다 DNA 의 경우에는 나노포어를 통한 전류의 진폭이 거의 검출되지 않는 반면, YOYO-DNA 복합체의 경우에는 나노포어를 통한 전류의 진폭이 약 880pA 이었다. 상기에서 알 수 있는 바와 같이, 천연 람다 DNA에 비해 인터컬레이터로서 YOYO-1을 첨가한 YOYO-DNA 복합체의 경우에는 전류의 진폭이 현저하게 증가한 것을 알 수 있다.
따라서, 인터컬레이터를 첨가하지 않은 경우에 비해 인터컬레이터를 첨가한 경우에 전류의 진폭이 현저하게 증가하므로 더욱 고감도로 핵산을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 4: 인가된 전기장의 세기에 따른 전류 변화 측정
인가된 전기장의 세기에 따라 나노포어를 통한 전류를 측정하였다. 인터컬레이터로는 0.1μM의 YOYO-1을 이용하고, 람다 DNA는 0.1nM을 이용하고, 전도성 유체 매질로는 1M KCl, 10mM Tris-EDTA, pH8.0 을 이용하고, 상기 실시예 1에서 제조된 나노포어(직경 100nm)에 300mV의 전기장을 인가하였다. 도 4는 인가된 전기장의 세기에 따른 실시예 2의 나노포어 A를 통한 전류를 측정한 것이다. 도 4에서 보여주는 바와 같이, 천연 람다 DNA 의 경우에, 전압이 300mV인 경우에는 나노포어를 통한 전류의 진폭이 약 350pA인데 반해, 전압이 600mV의 경우에는 나노포어를 통한 전류의 진폭이 약 600pA 이었다. 또한, YOYO-DNA 복합체의 경우에는 전압이 300mV의 경우에 나노포어를 통한 전류의 진폭이 약 800pA 이었다. 이로부터, 전압을 600mV까지 증가시켜 얻은 600pA의 전류 진폭보다 YOYO-DNA 복합체의 경우에는 300mV에서 800pA의 전류 진폭을 나타내는 결과로 인해, 전류 진폭 방법으로 전압 증가보다 인터컬레이터를 이용한 방법이 더욱 효과적인 것을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 인터컬레이터를 이용하지 않은 경우에 비해 나노포어를 통한 전류 진폭의 변화가 증가하므로 핵산을 더욱 고감도로 검출할 수 있다.
도 1은 람다 DNA 없이 인터컬레이터만을 이용하여 나노포어를 통한 전류를 측정한 것이다.
도 2는 람다 DNA 존재하에 인터컬레이터를 이용하여 실시예 2의 나노포어 A를 통한 전류를 측정한 것이다.
도 3은 람다 DNA 존재하에 인터컬레이터를 이용하여 실시예 2의 나노포어 B를 통한 전류를 측정한 것이다.
도 4는 인가된 전기장의 세기에 따른 실시예 2의 나노포어 A를 통한 전류를 측정한 것이다.

Claims (11)

  1. 핵산 시료와 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질을 전도성 유체 매질 중에서 접촉시키는 단계;
    얻어진 상기 물질이 결합된 핵산을 포함하는 시료를 나노포어(nanopore)와 접촉시키는 단계; 및
    상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하여, 상기 나노포어를 통한 전류 변화를 모니터링하는 단계를 포함하는, 시료 중의 핵산을 고감도로 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질은 인터컬레이터(intercalator), 대홈(major groove) 결합물질 및 소홈(minor groove) 결합물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 YOYO(1,1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤족사졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드), TOTO(1-1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드) 및 EtBr(에티디움 브로마이드)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 나노포어의 직경은 1.5nm ∼120nm 인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 인가된 전기장은 100mV ∼1000mV 인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 전도성 유체 매질은 서열이 서로 상이한 복수의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 나노포어;
    핵산에 비특이적으로 결합하는 물질;
    상기 나노포어를 통하여 전기장을 인가하는 수단; 및
    상기 나노포어를 통한 전류 변화를 측정하는 검출기를 포함하는, 핵산 검출용 장치.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 핵산에 비특이적으로 결합하는 물질은 인터컬레이터(intercalator), 대홈(major groove) 결합물질 및 소홈(minor groove) 결합물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 인터컬레이터는 YOYO(1,1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤족사졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드), TOTO(1-1'-[1,3-프로판디일비스[(디메틸이미니오)-3,1-프로판디일]]비스[4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]]-,테트라요오디드) 및 EtBr(에티디움 브로마이드)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 나노포어의 직경은 1.5nm ∼120nm 인 것을 특징으로 하는 장치.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 인가된 전기장은 100mV ∼1000mV 인 것을 특징으로 하는 장치.
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