KR20060130577A - 미생물용 냉동 보호제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는, 미생물용 동결건조 배지에 관한 것이다. 동결건조 배지는 코리네박테리움 디프테리아와 같은 세균 균주의 냉동 보호를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 동결건조 배지를 사용하여 미생물의 동결건조된 배양물을 제조하는 방법 및 미생물의 동결건조물에 관한 것이다.
코리네박테리움 디프테리아, 동결건조물, 동결건조 배지, 냉동 보호

Description

미생물용 냉동 보호제{Cryo-protective agents for microorganisms}
본 발명은 미생물용 냉동 보호제에 관한 것이다.
백신은 흔히 배양 배지에서 병원체를 증식시키고 병원체 또는 이의 일부 또는 병원체의 생성물을 분리하고 당해 물질을 면역원으로서 사용하여 백신으로 제형화함으로써 제조된다. 전체 병원체를 함유하는 백신은 전체 세포 백일해 백신 및 홍역 백신을 포함한다. 병원체의 일부를 함유하는 백신은 비세포성 백일해 백신을 포함한다. 병원체의 생성물을 함유하는 백신은 디프테리아 및 파상풍 백신을 포함한다. 병원체, 이의 일부 또는 생성물은 이를 백신으로 사용하기 전에, 예를 들어, 화학적 처리로 탈독화시킬 필요가 있다.
백신의 제조에 생성물이 사용되는 병원체의 예는 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)이고 생성물은 디프테리아 독소이다. 디프테리아는 그람 양성이고 호기성이며 간균 형태인 씨. 디프테리아의 감염에 의해 유발되는 치명적인 질환이다. 당해 질환은 씨. 디프테리아의 독소 생산 균주가 비인두 조직을 국부적으로 침입하여 유발된다. 당해 유기체는 편도선 또는 비인두 영역내에 위치 할 수 있는 통증성, 출혈성 및 괴사성 병변 위에 위치한 단단한 섬유성 막에서 증식한다. 과거의 전형적인 유행병 발생 동안에, 질환은 소적(droplet) 감염에 의해 전염되었다. 디프테리아로부터 회복한 환자는, 항생제로 집중적으로 치료받지 못한다면, 환자의 인후 및 비인두에서 수주 또는 수개월동안 독성 세균을 보유할 수 있다.
디프테리아의 임상적 증상 대부분은 tox 유전자를 갖고 있는 코리네박테리오프로파아지(corynebacterioprophage)로부터 생성된 강력한 디프테리아 독소 때문이다. 프로파아지가 씨. 디프테리아 균주를 감염시키고 용원화가 유발된 후 당해 균주는 독성이 된다. 디프테리아 독소의 비독성 형태(톡소이드(toxoid))를 사용한 활성 면역화에 의해 유도된 독소 중화 항체(항독소)는 디프테리아를 예방할 수 있다. 현재 면역화 전략은 디프테리아 독소를 포름알데하이드 처리에 의해 비독성이지만 항원성인 톡소이드로 전환시켜 제조되는 디프테리아 백신을 사용하는 것이다. 디프테리아 톡소이드는 전세계적으로 대량 면역화를 위해 기타 백신 성분과 다양하게 배합하여 사용된다. 세계 보건 기구(WHO)는 최근에 전세계적으로 연간 100,000건의 사례가 발생하고 있고 8,000명 가량이 사망하는데 그 이유는 어린이의 면역화 감소, 성인에서의 디프테리아에 대한 면역력의 쇠퇴 및 백신의 불충분한 공급으로 인한 것으로 추정하고 있다.
흔히, 코리네박테리움 디프테리아의 파르케 윌리엄스(Parke Williams) 8 (PW8) 균주의 변이체는 외독소를 제조하기 위해 사용되고 있고 이로부터 화학적 변형에 의해 톡소이드가 제조된다. 일반적으로, 아미노산, 미량 비타민, 무기염 및 말토스와 같은 탄수화물 공급원을 함유한 배지 제형이 당해 세균의 우수한 증식을 촉진한다. 카제인의 산 분해물 및 소 근육의 효소(트립신 또는 파파인)적 분해물과 같은 또 다른 배지가 독소 생산을 위해 적합한 배지이다. 통상적인 방법에서, 당해 세균은 동물 기원의 단백질성 물질을 함유하는 배지에서 배양된다. 디프테리아 제조에서 일반적으로 사용되는 배지는 NZ-아민 A형 배지이고 이는 카제인 분해물을 함유한다. 최적의 조건하에서, NZ-아민 A형 배지를 사용하여 제조되는 독소의 양은 라임스(Limes)의 침전 방법으로 측정했을때 180Lf/ml이다.
예시된 디프테리아 백신과 같은 백신의 제조에서 동물 기원의 단백질성 물질의 사용은 당해 배지를 사용하여 제조되는 디프테리아 독소로 바람직하지 못한 오염물을 도입시킬 수 있다.
대부분의 연구자들은 씨. 디프테리아와 같은 병원체를 배양하기 위해 동물-성분이 실질적으로 부재이거나 제거된 증식 배지 제조에 노력을 기울여 왔다. 또한, 씨. 디프테리아와 같은 병원체를 포함하는 미생물에 대해, 실질적으로 동물 성분이 없거나 제거된 씨드 배양물 및 특히 냉동 보호제를 제공할 필요가 있다.
발명의 요약
본 발명은 미생물용 냉동 보호제에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는, 미생물용 동결건조 배지가 제공된다.
동결건조 배지는 약 1 내지 10%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 1 내지 10%(w/v)의 효모 추출물, 예를 들어, 약 5%(w/v) 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v) 효모 추출물을 함유할 수 있다. 당해 미생물은 코리네박테리움 디프테리아를 포함하는 세균 균주일 수 있다.
본 발명의 제2 측면에서, 특정 양의 미생물을 제공하는 단계, 당해 특정 양을, 동물 기원의 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는 동결건조 배지와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계 및 당해 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는,미생물의 동결건조된 배양물을 제조하는 방법이 제공된다. 동결건조 배지는 약 5%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v)의 효모 추출물, 예를 들어, 약 5%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유할 수 있다. 당해 혼합물의 동결건조는 당해 혼합물에 대해 약 -30℃의 제1 온도를 성취하여 냉각된 혼합물을 제공하는 단계 및 당해 냉각된 혼합물을, 이것이 실질적으로 건조되어 건조된 혼합물을 제공할 때까지 특정 시간동안 진공하에 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 진공은 약 120mT이고 적합한 시간은 약 10 내지 약 12시간이다. 냉각된 혼합물이 실질적으로 건조되어 건조된 혼합물을 제공할때까지 특정 시간동안 진공하에 냉각된 혼합물을 유지하는 단계는 당해 냉각된 혼합물을 약 10 내지 약 12시간동안 진공하에 유지시키고 약 -30℃의 온도를 약 +20℃의 제2 온도로 증가시킴을 포함한다. 적합한 진공은 약 120mT이다. 미생물은 코리네박테리움 디프테리아를 포함하는 세균 균주일 수 있다.
또한 미생물 세포, 및 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는 동결건조 배지를 포함하는 동결 건조된 동결 건조물이 제공된다. 동결건조 배지는 약 1 내지 10%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 1 내지 10%(w/v)의 효모 추출물, 예를 들어, 약 5%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v)의 효모 추출물을 포함할 수 있다. 미생물은 코리네박테리움 디프테리아를 포함하는 세균 균주일 수 있다.
본 발명은 도면을 참조로 하기의 기재로부터 추가로 이해될 것이다.
도 1은 씨. 디프테리아 배양물의 제조 및 동결건조를 요약한 흐름도이다.
씨. 디프테리아의 제조 및 동결건조를 요약한 흐름도는 도 1에 나타낸다. 씨 디프테리아 균주 1M1514N3S의 동결건조물을 피톤(Phyptone)TM 한천을 함유하는 한천 플레이트상에 접종하고 43 내지 48시간동안 36℃에서 배양하였다. 피톤TM 펩톤 배지의 조성은 하기 표 1 및 2에 기재되어 있다.
15g/l의 피톤TM 함유 피톤TM 펩톤 배지의 조성
성분 리터당 양
피톤TM 펩톤 15g
아세트산 7.2ml
말토스 25g
성장 인자 8ml
10% L-시스틴 2ml
60% 나트륨 락테이트 1.7ml
pH 7.5
증식 인자 용액의 조성
성분
황산마그네슘 225g
베타 알라닌 2.30g
피멜산 0.15g
황산아연 0.80g
황산구리 0.50g
염화마그네슘 0.24g
니코틴산 4.6g
진한 염산 30ml
주입용수 1000ml
[표 3]
제조원[Difco Laboratories]에 의해 제공된 바와 같은 피톤TM 펩톤의 전형적 분석을 하기에 나타낸다
질소 함량/물성
총 질소(TN)(%) 9.0
아미노 니트로겐(AN)(%) 2.4
AN/TN 0.27
재(%) 12.4
건조시 손실(%) 1.5
NaCl(%) 4.0
pH(2% 용액) 7.1
원소 분석
칼슘(㎍/g) 1001
마그네슘(㎍/g) 2435
칼륨(㎍/g) 31547
나트륨(㎍/g) 34037
클로라이드(%) 0.76
설페이트(%) 0.67
포스페이트(%) 0.64
아미노산 분석
유리된 것 전체
알라닌(%) 0.3 2.6
아스파르트산(%) 0.3 3.9
글루탐산(%) 0.3 5.9
히스티딘(%) 0.2 0.8
류신(%) 0.8 2.3
메티오닌(%) 0.2 0.2
프롤린(%) 0.1 1.8
트레오닌(%) 0.1 0.5
티로신(%) 0.2 0.8
아르기닌(%) 0.6 2.1
시스틴(%) 0.4 가수분해에 의해 파괴됨
글라이신(%) 0.2 1.5
이소류신(%) 0.2 1.3
라이신(%) 1.2 2.4
페닐알라닌(%) 0.2 1.4
세린(%) 0.4 0.5
트립토판(%) 검출 수준 미만 가수분해에 의해 파괴됨
발린(%) 0.1 1.5
배양물을 5ml의 피톤TM 펩톤 배지에 재현탁시키고 1.5ml의 배양물을 1:10 희석된 포스페이트 용액(32%(w/v)) 0.9ml 및 1:2 희석된 염화칼슘 용액(53%(w/v)) 0.45ml을 함유하는 피톤TM 펩톤 배지 90ml를 포함하는 1차 진탕 플라스크로 옮겼다. 당해 배양물을 36℃에서 24시간동안 200rpm에서 배양하였다. 5ml의 배양물을 1:10 희석된 포스페이트 용액(32%(w/v)) 2.5ml 및 1:2의 염화칼슘 용액(53%(w/v)) 1.25ml을 함유하는 피톤TM 펩톤 배지 250ml를 포함하는 2차 진탕 플라스크 배양물로 옮겼다. 당해 배양물을 추가로 24 내지 28시간동안 36℃에서 배양하였다. 10ml의 상기 2차 진탕 플라스크 배양물을 5개의 50ml 멸균 스크류 캡 원심분리 튜브로 분배하고 4℃에서 10분동안 6000 x g에서 원심분리하였다.
상등액을 버리고 각 튜브의 펠렛을 하기의 동결건조 배지중 하나의 배지 5ml중에 재현탁시켰다:
a) 10%(w/v)의 탈지유(동물 대조군)
b) 10%(w/v)의 효모 추출물
c) 10%(w/v)의 피톤TM 펩톤
d) 5%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 + 10%(w/v) 효모 추출물
e) 10%(w/v)의 피톤TM 펩톤 + 10%(w/v) 효모 추출물 + 0.25% (w/v) 한천
상기 동결건조 배지중의 배양물은 0.25ml의 양으로 1ml의 유리 바이엘에 분배하고 하기와 같이 동결건조시켰다.
동결-건조 주기
생성물 온도가 -30℃에 도달하도록 하고 120mT의 진공하에 약 10 내지 12시간동안 당해 온도를 유지시켰다. 10 내지 12시간 후에, 생성물 온도를 증가시키고 120mT 진공하에 20℃에서 유지하였다. 바이엘을 진공하에 밀봉하고 4℃에서 저장하였다. 동결 건조된 배양물을, 콜롬비아 혈액 한천 플레이트상에서 콜로니 형성 유니트를 측정하여 생존성에 대해 분석하였다.
씨. 디프테리아 균주에 대한 동결 건조 전후에 수득된 CFU의 결과는 표 4, 5, 6 및 7에 나타낸다.
탈지유 존재 및 동물 성분 부재 동결건조 배지에서 씨. 디프테리아의 동결 건조된 배양물의 CFU 수의 비교. 씨. 디프테리아의 동결 건조전의 CFU 수는 6.0 x 109 CFU/ml
동결건조 배지 CFU/ml % 생존성
탈지유(동물 성분 대조군) 1.24 x 109 21
MSG + 효모 추출물 1.08 x 109 18
시간의 함수로서 탈지유 존재 및 동물 성분 부재 동결건조 배지에서 씨. 디프테리아의 동결 건조된 배양물(씨. 디프테리아 균주)의 CFU 수의 비교
동결건조 배지 0일째 7일째 16일째 45일째 86일째 120일째
탈지유 1.24 x 109 5.6 x 107 7 x 106 3 x 106 3 x 106 3 x 108
MSG + 효모 추출물 1.08 x 109 9.5 x 108 3.2 x 108 7.9 x 108 3.5 x 108 3.4 x 108
동물 성분 부재 동결건조 배지의 스크리닝 및 동결 건조 후 동물 성분 동결건조 배지와 비교한 이의 각각의 CFU 수
동결 혼합물 CFU/ml
탈지유(동물 성분) 1.2 x 107
10% 효모 추출물 1.9 x 107
10% 피톤TM 펩톤 1.36 x 108
MSG + 효모 추출물 6.0 x 108
효모 추출물 + 피톤TM 펩톤 + 한천 1.76 x 108
동물 성분 존재 및 동물 성분 부재 동결건조 배지에서 씨. 디프테리아의 동결 건조된 배양물의 CFU 수의 비교
CFU/ml
시간(일수) 10% 탈지유 5% MSG + 10% YE
0 2.04 x 109 1.0 x 109
1 2.0 x 107 1.22 x 109
16 5 x 106 2.96 x 108
45 2.0 x 106 1.02 x 109
86 2.0 x 106 3.2 x 108
동결건조를 위해 가장 안정한 혼합물은 표 4 내지 7에 나타낸 바와 같이 일나트륨 글루타메이트(5% w/v)과 효모 추출물(10% w/v)의 혼합물이다.

Claims (20)

  1. 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는 미생물용 동결건조 배지.
  2. 제1항에 있어서, 약 1 내지 10%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 1 내지 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유하는 동결건조 배지.
  3. 제2항에 있어서, 약 5%(w/v) 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유하는 동결건조 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 세균 균주인 동결건조 배지.
  5. 제4항에 있어서, 세균 균주가 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae)인 동결건조 배지.
  6. 특정 양의 미생물을 제공하는 단계,
    당해 특정 양을, 동물 기원의 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는 동결건조 배지와 혼합하여 혼합물을 수득하는 단계 및
    당해 혼합물을 동결건조시키는 단계를 포함하는, 미생물의 동결건조된 배양물을 제조하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 동결건조 배지가 약 5%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 동결건조 배지가 약 1 내지 10%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 1 내지 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유하는 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물의 동결 건조가,
    (a) 당해 혼합물에 대해 약 -30℃의 제1 온도를 성취하여 냉각된 혼합물을 제공하는 단계 및
    (b) 당해 냉각된 혼합물을, 이것이 실질적으로 건조되어 건조된 혼합물이 수득될때까지 특정 시간동안 진공하에 유지시키는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 진공이 약 120mT인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 시간이 약 10 내지 약 12시간인 방법.
  12. 제7항에 있어서, 냉각된 혼합물을 이것이 실질적으로 건조되어 건조된 혼합물이 수득될때까지 특정 시간동안 진공하에 유지시키는 단계가,
    (a) 당해 냉각된 혼합물을 약 10 내지 약 12시간의 특정 시간동안 진공하에 유지시키는 단계 및
    (b) 약 -30℃의 온도를 약 +20℃의 제2 온도로 증가시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 진공이 약 120mT인 방법.
  14. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 세균 균주인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 세균 균주가 코리네박테리움 디프테리아 균주인 방법.
  16. 동물 기원 생성물이 실질적으로 부재이고 효모 추출물 및 일나트륨 글루타메이트를 함유하는 동결건조 배지 및 미생물 세포를 포함하는 동결건조된 동결건조물.
  17. 제12항에 있어서, 배지가 약 1 내지 10%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 1 내지 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유하는 동결건조된 동결건조물.
  18. 제13항에 있어서, 배지가 약 5%(w/v)의 일나트륨 글루타메이트 및 약 10%(w/v)의 효모 추출물을 함유하는 동결건조된 동결건조물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 세균 균주인 동결건조된 동결건조물.
  20. 제19항에 있어서, 세균 균주가 코리네박테리움 디프테리아 균주인 동결건조된 동결건조물.
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