KR20060098657A - 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생물 시스템의 신호 전달 경로에 포함되는 단백질 농도 등의 생물학적 데이터를 변수로 한 수학적인 동력학 모델을 개발하고 이를 이용하여 시뮬레이션 함으로써 다양한 환경에서 단백질의 기능과 활성화 상태, 단백질 사이의 상호작용 및 신호 전달 경로 등을 예상할 수 있어 신호 전달 네트워크의 정량적 및 정성적 이해가 가능한, 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시뮬레이션 모델을 이용하면 약제 설계 등 특정 목적을 위한 신물질 발굴에 있어 실험의 횟수를 최소화할 수 있고 그 적용을 쉽게 예측함으로써 품질을 높일 수 있다.

동력학 모델, 신경 전달 경로, 시뮬레이션, 단백질 농도, 반응속도식, 효소반응

Description

생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템{Methods and systems for modeling and simulating the biochemical pathways}

도 1은 생화학 경로의 모델링 및 시뮬레이션 과정을 설명하는 블록도.

도 2는 EGFR 신호 전달 경로를 구성하는 단백질과 이들의 인산화 및 탈인산화 과정에 관한 개념도.

도 3은 EGF에 의해 매개된 EGFR 신호 전달 경로의 회로도.

도 4a 내지 4c는 컴퓨터 시뮬레이션에 의한 Raf, MEK, 및 ERK의 활성화 수준을 나타내는 그래프.

도 4d 및 도 4e는 PC12 세포에서 MEK 및 ERK 인산화의 웨스턴 블럿 분석.

도 5a 내지 도 5c는 컴퓨터에 의해 생성된 Raf, MEK 및 ERK의 인산화 및 탈인산화 반응들의 반응속도 그래프.

도 6a 내지 6g는 상이한 EGF 농도에서 EGF 매개된 EGFR 신호 전달 연쇄 증폭의 컴퓨터 시뮬레이션. 도 6a는 EGFR의 활성화, 도 6b는 Shc의 활성화, 도 6c는 Ras-GTP 형성, 도 6d는 Ras의 활성화, 도 6e는 Raf의 활성화, 도 6f는 MEK의 활성화 및 도 6g는 ERK의 활성화를 나타낸다.

도 7a 내지 7g는 다양한 EGFR 수에 대한 EGFR 신호 전달의 시뮬레이션 그래 프. 도 7a는 EGFR의 활성화, 도 7b는 Shc의 활성화, 도 7c는 Ras-GTP 형성, 도 7d는 Ras의 활성화, 도 7e는 Raf의 활성화, 도 7f는 MEK의 활성화 및 도 7g는 ERK의 활성화를 나타낸다.

도 8a는 ERK 활성화 수준에 대한 MEK 인산화 전환의 효과에 대한 컴퓨터 분석 그래프.

도 8b 및 8c는 MEK 및 ERK 활성화에서 PD98059 및 U0126의 효과에 대한 웨스턴 블럿 분석.

본 발명은 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생물 시스템의 신호 전달 경로에 포함되는 단백질 농도 등의 생물학적 데이터를 변수로 한 수학적인 동력학 모델을 개발하고 이를 이용하여 시뮬레이션 함으로써 다양한 환경에서 단백질의 기능과 활성화 상태, 단백질 사이의 상호작용 및 신호 전달 경로 등을 예상할 수 있어 신호 전달 네트워크의 정량적 및 정성적 이해가 가능한, 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시뮬레이션 모델을 이용하면 약제 설계 등 특정 목적을 위한 신물질 발굴에 있어 실험의 횟수를 최소화할 수 있고 그 적용을 쉽게 예측함으로써 품질을 높일 수 있다.

최근에, 여러 분야의 공학에서 사용하는 도구와 방법들을 생물 시스템에 도입하려는 시스템 생물학(Systems biology)이 시도되고 있다. 시스템 생물학은 생물 시스템의 체계적인 이해를 바탕으로 생물학적 복잡성을 해명하는 것을 목표로 한다. 생물학적 복잡성을 해명하기 위해서는 신호 전달에 관한 연구가 필수적이며, 각 경로의 특이성은 특정 세포 내의 표준적인 신호 전달 카세트들의 독특한 조합들을 통합함으로써 생성된다.

어떤 생물 시스템의 생화학 경로를 모델링하고 가설의 확인을 위한 시뮬레이션을 하는 일반적인 방법의 예는 도 1과 같다. 도 1에 나타난 일반적인 모델링 및 시뮬레이션 방법을 간단히 설명하면 다음과 같다.

먼저, 생물 시스템으로부터 이용 가능한 정성적인 데이터베이스 정보를 수집하고 특정 하위 시스템을 교란시킬 수 있는 모델을 설계한다. 이어서, 감도 분석(sensitivity analysis)을 근거로 단백질 수준의 변화를 측정하기 위한 실험 세트를 디자인한다. 실험을 수행하고 실험 데이터를 발생시킨다. 동력학 변수 값(kinetic parameter value)을 사용하여 모델을 시뮬레이션하고 신호 전달 경로의 역학(dynamics)을 연구한다. 시뮬레이션 결과와 실험 데이터를 비교하여 실험 데이터가 컴퓨터 상(in silico)에서의 예상에 부합하면 유용한 모델을 확인할 수 있게 된다. 만약, 단지 부분적으로만 일치하면 상기 모델을 수정하거나 또는 상기 모델 내의 수치 변수를 수정하여 다시 시뮬레이션 결과와 실험 데이터를 비교한다. 이러한 피드백 조절 전략을 통하여 모델의 예견치를 천연 생물 시스템의 측정 변수에 점차적으로 수렴되게 할 수 있다.

신호 전달 경로에 대한 연구는 전통적으로 직접적인 상부 및 하부 상호작용을 묘사하고, 이어서 이들 상호작용을 세포 표면 수용체로부터 세포 효과기, 예를 들어 대사 효소, 채널 또는 전사 인자들로의 정보에 의존하고 이를 조절하는 1 차적인 연쇄 증폭으로 조직화하는데 초점을 두어왔다[Weng et al., 284 Science 92-96, 1999].

종래 연구된 세포 신호 전달 경로 중 대표적인 하나는 수용체 티로신 키나제(RTK)의 신호 전달 경로이다[Schlessinger, 103 Cell 211-225, 2000]. RTK의 작용 기전 및 상기가 조절하는 신호 전달 경로는 특정한 생물학적 반응이 어떻게 발생될 수 있는가에 대한 통찰력을 제공하였다. RTK의 활성화 시, 인산화된 티로신 부위는 상이한 도킹 단백질들을 모집하여 신호를 전달할 수 있으며, 신호 전달 특이성은 별개의 기능들을 조절하는 상이한 하부 작용체를 통해 이루어질 수 있음이 확인되었다.

상피세포성장인자(EGF)는 아미노산 53 개가 하나의 긴 사슬로 이루어진 펩타이드 성장인자로서, 인간의 몸 조직의 외곽에 위치한 세포들의 성장조절을 담당한다. 이는 상처 및 위벽 손상을 치료하는 치료제 등으로 사용될 수 있으며[대한민국 특허출원 제 2000-0008116 호], 당뇨병 환자들에게 발생하기 쉬운 족부궤양의 치료제로 각광을 받고 있다.

한편, 상피세포성장인자 수용체(EGFR)는 다양한 단백질의 인산화와 탈인산화 및 차별적인 유전자 발현 유도를 통해 표적 세포의 증식, 이동, 생존 및 분화에 중요한 역할을 하는 티로신 키나제 수용체이다. EGFR은 많은 수의 성장 인자들을 통해 신호 전달을 매개하는 ErbB 수용체 군에 포함된다. 최근에는 EGFR의 과 발현이 종양에 미치는 영향에 기초하여 인간 EGFR에 대한 억제제가 개발되었다.

EGF는 PC12 세포의 증식을 조절하는데, EGF는 EGFR의 빠른 인산화를 유도하고 결과적으로 그의 신호 전달 물질들의 인산화와 활성화를 유도한다. 이들 신호 전달 분자들의 활성화는 즉시 초기 및 말기 유전자들(immediate early and late genes)의 발현 유도를 포함하여 하부 신호 전달에 이를 때 최고조에 달한다. 리간드는 상기 세포 수용체들과 상호작용하며 생화학 신호들의 전달을 조장하여 생물 반응을 이끌어낸다.

최근 들어, 중요한 신호 전달 시스템이 EGFR의 하부 미토젠-활성화 단백질 키나제(MAPK) 경로를 포함함을 암시하는 증거가 점점 많아지고 있다[Egan SE and Weinberg RA 365 Nature 781-783, 1993]. 이러한 신호 전달 과정을 도 2와 같이 나타낼 수 있다. EGF에 의해서 활성화된 EGFR과 성장인자-수용체-결합 단백질 2(Grb2)의 Src homology 2(SH2) 도메인과의 상호작용은 Ras 및 MAPK를 통한 신호 전달을 개시시킨다. Grb2는 EGFR과 직접적으로 결합하거나, 또 다른 SH2-도메인을 포함하고 있는 단백질인 Shc를 통해서 결합할 수 있다. 연결 단백질 Grb2는 EGFR 키나제로부터의 신호를 Ras에 전달하는 데 중요한 역할을 한다.

Grb2의 SH3 도메인은 구아닌 뉴클레오티드-방출 인자인 7이 없는 자손(Son-of-sevenless, Sos)(GDP를 Ras 상에서 GTP로 전환시켜 Ras가 활성화되는 것을 촉진시킨다)과 결합한다. 상기 과정의 하부로, 활성화된 Raf는 인산화하여 미토젠-활성화된 단백질 키나제 1 및 2(MEK1 및 MEK2)를 활성화시키며, 이때 상기 키나제 들은 세포 외 신호-조절 키나제 1 및 2(ERK1 및 ERK 2)의 티로신과 트레오닌 잔기에 인산화 시킴으로 활성화시킬 수 있다. MAP 키나제의 활성화 시, 세포질과 핵 중에 존재하는 전사 인자(ERK1/2에 대한 기질)는 인산화되고 활성화되어 특정 표적 유전자의 발현을 유도하여 생물학적 반응을 야기시킨다.

상기의 EGFR 신호 전달에 관한 분자 수준의 많은 연구들이 있어 왔지만, 세포 반응의 조절에 기초를 이루는 기전은 충분히 설명되지 못하고 있다. 이는 EGFR 신호 발생 네트워크에 대한 정량적인 설명이 없기 때문이다. 시스템의 역학을 설명하기 위해서 주로 운동 법칙을 모델에 대입시키는 방법을 사용하는 여러 모델링 도구들이 시도되었다[Weng et al., 284 Science 92-96, 1999; Hatakeyama et al., 373 Biochem. J., 451-463, 2003; Schoeberl et al., 20 Nature Biotechnol. 370-375, 2002]. 생화학적 구조는 모든 세포 화학 신호 전달(즉, 신호 전달 네트워크를 형성함), 반응 운동식의 효과 및 공급, 및 각 사건의 상수를 명시하는 운동 법칙과 네트워크 루트를 통하여 수학적으로 표현되었다. 이러한 동력학 시뮬레이션 컴퓨터 모델은 세포외에서 세포 내로의 정보 전달을 분석하고 신호 전달 상태의 체계적인 측정을 통하여 신호 전달 네트워크의 작동에 대해 자세히 알 수 있다.

최근 수년간 신호 전달 경로의 역학에 대한 모델링이 두드러진 연구 분야로서 나타났으며, 여기에서 1 차적인 신호 전달 경로의 조사에 의해 관찰할 수 없는 성질들을 확인하기 위해서 시스템에 대해 데이터 분석을 수행하였다(Bhalla U and Iyengar R, 28 Science 381-387, 1999). 컴퓨터 분석을 위한 EGFR 신호 전달 모델의 개발을 목적으로 하는 다수의 상이한 접근법들이 제안되었다(Weng et al., 284 Science 92-96, 1999; Hatakeyama et al., 373 Biochem. J., 451-463, 2003; Schoeberl et al., 20 Nature Biotechnol. 370-375, 2002; Yunchen G and Xin Z, 554 FEBS Lett. 467-472, 2003; Sasaoka et al., 269 J. Biol. Chem. 32621-32625, 1994; Dario et al., 270 J. Biol. Chem. 27489-27494, 1995; Favata et al., 273 J. Biol. Chem., 18623-18632, 1998). 많은 이러한 연구들은 미분 방정식 및 수치 경로 시뮬레이션에 초점을 두었다. 동력학 시뮬레이션을 사용함으로써 신호 흐름 및 복잡한 신호 전달 경로에 대한 연구가 진일보하였다. 그러나 최종 모델을 고려할 때 상기 보고서들은 EGFR 신호 전달의 초기 사건들의 역학에 대한 정량적인 연구를 제공하는 것에 그쳤다.

US 2002/0068269 A1은 TNF-α 수용체 신호전달경로 시스템을 이용하여 신호전달기전을 검토하기 위한 소프트웨어 플랫폼을 제안하였다. 그러나 본 발명은 EGF 수용체 신호전달기전 시스템에 초점을 맞추어 정량적인 지식을 포함한 컴퓨터 모델을 발전시키고, 더 나아가 각기 다른 조건하에 단백질의 농도 변화에 따른 변화를 살펴봄으로 단백질의 활성을 분석할 수 있다는 점에서 상기 미국 특허와 다르다.

이에 본 발명자는 이러한 종래 문제점을 해결하기 위하여 연구, 노력한 결과, 생물 시스템의 신호 전달 경로에 포함되는 단백질의 농도 등을 동력학 변수로 하고 반응속도 방정식과 효소반응 관련 방정식(미켈스-멘튼 방정식)을 기초로 한 미분방정식을 이용하여 수학적인 동력학 모델을 개발하여 이를 시뮬레이션하면 생물 시스템의 전체 신호 전달 네트워크의 정량적 및 정성적인 해석과 예상이 가능하다는 사실을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 신호 전달 경로의 단백질들의 동력학 정보를 이용하여 생물학적 시스템을 정량적 및 정성적으로 모델링 하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 생화학 경로의 세포 환경 정보를 수집하는 단계, 및 반응속도식 및 미켈스-멘텐 공식에 기초한 미분방정식과 상기 세포 환경 정보를 이용하여 모델링 하는 단계를 포함하는 생화학 경로의 모델링 방법과; 생화학 경로의 세포 환경 정보 및 입력 정보를 제공하는 단계, 반응속도식 및 미켈스-멘텐 공식에 기초한 미분방정식과 상기 세포 환경 정보를 이용하여 모델링 하는 단계, 상기 입력 정보에 기초하여 시뮬레이션하는 단계, 및 시뮬레이션 결과를 디스플레이하는 단계를 포함하는 생화학 경로를 시뮬레이션하는 방법;을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 생물 시스템의 신호 전달 경로에 포함되는 단백질 농도 등의 생물학적 데이터를 변수로 한 수학적인 동력학 모델을 개발하고 이를 이용하여 시뮬레이션 함으로써 다양한 환경에서 단백질의 기능과 활성화 상태, 단백질 사이의 상호 작용 및 신호 전달 경로 등을 예상할 수 있어 신호 전달 네트워크의 정량적 및 정성적 이해가 가능한, 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시뮬레이션 모델을 이용하면 약제 설계 등 특정 목적을 위한 신물질 발굴에 있어 실험의 횟수를 최소화할 수 있고 그 적용을 쉽게 예측함으로써 품질을 높일 수 있다.

본 발명의 모델링 및 시뮬레이션 방법은 어떠한 자극이 생화학 경로에 미치는 영향을 평가하고 예상하기 위하여 생화학 경로에 대한 광범위한 정보를 통합한다. 상기 정보에는 세포 환경 정보(cellular environment information) 및 입력 정보(input information)에 관한 정보를 포함한다.

상기 "세포 환경 정보"는 세포의 물질, 과정, 유형 및 성분; 단백질 유형, 구조, 조성 및 기능; 하위 세포 위치; 활성, 억제 등의 변이 효과 등을 포함하는 시뮬레이션에 영향을 주는 모든 환경적 요소를 의미한다.

상기 "입력 정보"는 단백질 상황(context), 자극(stimuli), 녹아웃(knockout), 및 종말점(endpoint) 등을 포함하는 개념이다. 입력 정보를 기초로 시뮬레이션하여 목적하는 결과를 얻을 수 있다.

단백질의 유형(type), 구조(structure), 조성(composition) 및 기능(function)에 관한 정보는 www.ncbi.nlm.nih.gov 등을 비롯하여 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가지는 자가 접근할 수 있는 다양한 웹 기반 플렛폼을 이용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 모델링을 위하여 단백질의 농도, 속도 상수 등의 동력학 변수가 포함된 수학식을 이용한다. 상기 수학식에는 반응속도식, 미켈스-멘텐 공식 등이 포함된다.

본 발명의 시스템(100)은 데이터 입력 모듈(10), 시뮬레이션 모듈(20), 데이터베이스(30) 및 디스플레이 모듈(40)을 포함한다(도 9a 참고).

모델링 및 시뮬레이션에 필요한 상기 세포 환경 정보 및 입력 정보는 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 방법으로 데이터 입력 모듈(10)에 제공될 수 있는데, 키보드를 통해 직접 손으로 입력되거나, 또는 자동화된 데이터 입력 장치에 의해 입력될 수 있다. 상기 데이터 입력 모듈(10)에 제공된 세포 환경 및 입력 정보에 기초하여 시뮬레이션 모듈(20)은 정의된 세포 환경에서 발생하는 사건의 순서를 결정함으로써 생화학 경로에 관한 시뮬레이션을 행한다. 또한, 시뮬레이션 모듈(20)은 시뮬레이션된 경로를 디스플레이 모듈(40)을 통하여 문서적으로 또는 그래프적으로 디스플레이한다.

상기 시뮬레이션 모듈(20)은 1 이상의 유저(200), 데이터베이스(30) 및 디스플레이 모듈(40)과 연결되어 있으며 시스템을 위한 모든 프로세싱 로직을 포함한다. 상기 시뮬레이션 모듈(20)은 그래픽 유저 인터페이스(21)와 추론 엔진(22)을 포함하며, 선택적으로 편집기 또는 컴파일러(23)를 포함할 수 있다(도 9b 참고).

그래픽 유저 인터페이스(21)는 유저로부터의 입력 정보를 수집한다. 유저는 다양한 입력 유형들을 본 발명이 속하는 분야의 여러 데이터 입력 방법을 사용하여 시뮬레이션 모듈에 제공한다. 또한, 새로운 데이터는 그래픽 유저 인터 페이스를 통해 데이터베이스에 보내질 수 있다. 시뮬레이션 모듈은 데이터베이스를 통해 입력 정보를 받을 수도 있다.

추론 엔진(22)은 데이터베이스와 함께 작동하며, 세포 환경에 기초하여 어떤 세포 사건이 촉발되는지를 결정하는 논리 문장(logic statements)의 순서를 평가한다. 상기 추론 엔진은 공지된 세포 구성 성분 및 반응에 관한 데이터베이스와 관련하여 신호 전달 과정을 설명할 수 있다.

편집기 또는 컴파일러(23)는 유저가 특성, 개념 및 사건의 새로운 정의를 입력하거나, 존재하는 정의를 편집하거나, 및/또는 데이터베이스에 대한 모든 변화를 편집하는데 사용된다.

데이터베이스(30)는 생화학 경로를 분석하기 위하여 필요한 모든 정보를 저장할 수 있다. 바람직하게는 시뮬레이션에 필요한 세포 환경 정보와 입력 정보를 저장할 수 있다.

본 발명의 시스템은 Microsoft Windows, NT, Windows 2000, UNIX, LINUX, XENIX 등이 가동되는 워크 스테이션을 포함하는 서버 상에서 구현되는 것이 바람직하다. 그러나 또한 프로그램된 일반 목적의 컴퓨터, 특정 목적의 컴퓨터, 프로그램된 마이크로프로세서, 또는 마이크로컨트롤러 드를 비롯한 본 발명의 프로그램을 가동할 수 있는 어떤 장치를 사용하여도 무방하다.

상기 시스템의 데이터 입력 모듈(10) 및 디스플레이 모듈(40)은 시뮬레이션에 있어서 통상적으로 사용하는 것들을 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 시스템 및 방법을 확인하기 위하여 성장 인자에 의 해 야기되는 세포 내 신호 전달에 초점을 맞춘 모델링 및 시뮬레이션을 수행한다.

성장 인자는 국소적인 신호전달물질로, 세포들 간의 정보를 전달하고 세포 반응에 큰 영향을 미친다. 세포 내 신호 전달 경로의 개시에서 주요한 것은 성장 인자와 수용체의 결합 및 수용체 올리고머화이다. 활성화된 수용체는 작동체 분자들의 결합을 유도하고, 이어서 신호 전달 기전을 통한 신호의 증폭에 의해 유전자를 발현시킨다. 각각의 성장 인자는 종종 동일한 분자들을 이용한 신호전달 경로를 거치게 되지만 다양한 세포 반응들을 일으키는 다수의 다양한 신호 전달 경로를 활성화시킨다. 상이한 경로들에 대한 분석은 신호 전달 과정에서 상이한 수준의 다양한 신호 전달 화합물의 상호작용을 밝혀낸다. 따라서 성장 인자에 대한 반응은 다른 신호전달물질과의 상호작용 정도에 따라 변한다.

신호전달물질로 작용하는 단백질의 주요 기능은 대사 중간체들의 화학적 전환보다는 정보의 전달과 프로세싱이다. 이들 단백질은 정보를 세포막에서 유전자로 전달한다. 신호 전달 네트워크에서 이들 단백질은 신호를 증폭시켜 통합하거나 또는 정보 저장소로서 작용하는 회로에 결합된다. 실제로, 신호 전달은 작은 분자들의 화학적 반응과 유사하여, 분자 상호작용을 동력학 및 열역학 언어를 사용하여 묘사할 수 있게 한다.

지금까지는 이러한 고도로 상호 연결된 신호 전달 시스템에 대한 전체적인 이해가 매우 제한되었었다. 최근 10 년 간 세포 생물학, 생화학 및 분자 생물학 분야에서의 폭발적인 진보는 생리학적 및 병리학적 기전을 탐구하여 그에 대한 지식을 얻기 위한 새로운 기술들을 제공하였다. 그러나 주어진 생화학 사건에 대해 많은 상이한 영향들이 적합한 세포 반응들을 최고조에 달하게 하기 위해서 어떻게 통합되는지에 대한 보다 나은 이해는 이러한 정보의 통합을 요한다.

본 발명은 생물 시스템으로부터 단백질의 농도 등의 생물학적 데이터를 수입하여 이를 바탕으로 수학적인 동력학 모델을 설계한다. 모델을 바탕으로 시뮬레이션하여 모델의 확인 과정을 거치는데, 본 발명에서는 생물학적 데이터 중에서 동력학 변수로 단백질의 활성과 관련이 있는 농도를 이용하는 것이 좋다. 수학적 모델링은 신호 전달 화합물의 농도를 정량화하고, 특정 화합물의 녹-아웃 생성, 신호전달 분자의 세포 내 이동을 연구할 수 있게 한다.

다수의 다양한 유형의 분자들을 함유하는 생물 유기 조직의 결정적 수준으로 기능성 모듈을 규정함으로써, 신호 전달 또는 단백질 합성과 같은 세포 내 반응들을 모듈 구조로 분리시킬 수 있다. 이러한 모듈은 서로 격리되거나 연결될 수 있다. 서로 연결시키는 경우 주어진 모듈의 기능은 다른 것에 영향을 미칠 수 있다. 따라서 다수의 출처로부터의 정보를 통합하여 특정 반응들을 전달하는 세포의 능력은 그의 기능성 모듈들 사이의 관계에서 얻어질 수 있을 것이다. 동일한 모듈 개념을 적용하여 수학적 모델을 구상함으로써, 여러 생물 현상을 평가할 수 있으며 신호 간의 연결망(cross-talk) 및 양 또는 음의 피드백과 같은 사건들을 또한 통합시킬 수 있다.

본 발명이 제시하는 방법은 유전자 조절 네트워크에서 세포 간 및 세포 내 신호 전달에 이르는 범위의 다양한 역학적인 세포 내 과정들을 다룰 수 있으며, 효소 작용이 일어나는 신호 전달 경로의 전체 단백질들을 고려하여 모델링 할 수 있 다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 : EGFR의 신호 전달 경로에의 적용

1. 모델링 및 시뮬레이션

본 발명의 수학적 동력학 모델을 확인하기 위하여 EGF에 의해 유도된 MAPK 신호전달과정에 포함되는 요소와 그의 활성화에 필요한 동력학 정보를 포함하는 EGFR 신호 전달 동력학 모델을 개발하였다.

본 발명자들은 컴퓨터 모델을 개발하기 위한 생물 시스템으로 PC12 세포를 선택하였다. PC12 세포 상에서 약 20,000 개의 수용체들이 발현됨이 알려져 있다.

본 발명자는 EGFR 경로 구조, 속도 방정식 및 각 사건의 동력학 변수들뿐만 아니라 그들의 농도를 생화학적 시뮬레이터에 통합시켰다. 컴퓨터 시뮬레이션을 인텔^® 펜티엄 PC를 사용하여 수행하였다. 시뮬레이터는 상기 생화학적 데이터들을 근거로 각 신호 전달 물질의 농도 변화를 계산하였고 우리는 이를 신호로 간주하였다.

도 3은 EGF에 의해 유도된 EGFR 하부 단백질 활성화 회로도를 나타내고, R1 내지 R28에 대한 설명은 표 1에 정리하였다.

도 3의 R1 내지 R8은 신경 전달 경로 중 EGFR의 이량체화 및 고유 EGFR 티로신 키나제 도메인의 활성화에 이은 EGF-EGFR 복합체 형성 및 세포내 내재화에 대해 완비된 시뮬레이션을 형성한다. Shc의 인산화를 통해서 활성화된 EGFR을 기점으로 세포 내 신호 전달 기전을 활성화 하여 구아닌뉴클레오티드 결합 단백질 Ras 및 Raf, MEK(MAPK 또는 ERK 키나제) 및 ERK(세포 외 신호 조절 키나제) 단백질 키나제를 포함하는 세포 내 미토젠-활성화 단백질 키나제 신호전달기전을 활성화시킨다. 상기 모델에서 Raf-1과 같이 B-Raf의 활성은 Ras-GTP와의 결합 및 인산화 모두를 통해 조절된다.

상기 모델의 모든 시뮬레이션들은 제파시(Gepasi) 소프트웨어 버전 3.21에 의해 수행되었다. 이러한 시뮬레이션은 반응 체계를 이루는 신호 전달 물질과 각 반응 단계들에 의해 형성되며 이를 위해 적합한 반응속도식 및 역학 상수를 지정하였다. 이러한 데이터로부터 상기 소프트웨어는 시간에 따른 신호 전달 매개체의 농도 변화를 기술하는 미분 방정식 세트를 유도한다.

본 모델링은 생화학 방정식을 상기 소프트웨어에 입력하고 각 방정식에 대한 역학 법칙과 그에 상응하는 역학 상수를 대입하여 시뮬레이션을 생성시켰다. 역학 방정식과 매개변수는 표 1에 요약하였고, 세포 신호 전달 분자의 초기 농도는 표 2에 나타내었다. EGFR 생화학적 신호전달기전은 하기 반응들을 근거로 시뮬레이션하였다.

먼저, EGF와 EGFR 사이의 반응속도식을 이용하였다.

상기 식에서 X는 EGF를, Y는 EGFR을, 그리고 Z는 EGF-EGFR 복합체를 나타내고, k₁은 정방향 속도상수를, k_-1은 역방향 속도상수를 의미한다.

상기 반응식 1을 다음의 수학식 1에 적용하여 모델링하였다.

각 단백질들의 인산화 및 탈인산화 반응은 일종의 효소반응이므로 다음 반응식 2의 미켈스-멘텐 공식을 이용하였다.

상기 식에서, E는 효소를, S는 기질을, ES는 효소-기질 복합체를, 그리고 P는 생성물을 나타내고, k₁, k₂ 및 k₃은 속도 상수를 의미한다.

상기 반응식 2를 다음의 수학식 2에 적용하여 모델링하였다.

이에 리간드의 초기 농도 변화 및 수용체 수에 관하여 감도 분석을 수행하였다.

상기 모델에 포함되지 않은 수용체-리간드 복합체(EGF-EGFR)의 세포 내 내재화 과정에 상응하는 단계들을 시뮬레이션에 포함시키기 수용체 내재화 속도를 다음의 수학식 3을 이용하여 구하였다.

d(t) = ε + (1-ε)[1-e^-(t/ΔT)3]

상기 식에서 ΔT는 시간 지연을 의미하고, 상기 식과 관련하여 εk는 리간드 첨가 전 속도 상수이고, k는 리간드 첨가 후 정상 상태의 속도 상수이다.

이에 따라 내재화 속도 상수는 k(t) = kd(t)의 시간의 함수가 된다. 상기 내재화 속도를 인자 f(세포 표면에 위치하는 수용체들이 내재되는 분획을 나타낸다)에 의해 추가로 변경시킨다. 피막 홈의 연결기 단백질의 수는 시뮬레이션된 기간에 걸쳐 유효하게 일정하게 남아있는 것으로 추정되며, 따라서 이는 피막 홈과 활성화된 수용체의 결합에 대한 속도 상수에 기여한다.

2. 실험과 시뮬레이션의 비교

실제적 실험 및 다른 모델링 연구에서와 같이, 첫 번째 시뮬레이션 시리즈에서 본 발명자들은 EGF = 100 nM에서 모델을 시뮬레이션함으로써 MARK 신호전달 분자들의 활성화 수준을 확인하였다.

도 4a 내지 도 4c는 Raf, MEK 및 ERK의 활성화 상태를 예시한다. Raf 활성화는 약 1.4 분 내에 최대(17 %)에 도달하고 이어서 시간이 지남에 따라 감소한다. 이러한 Raf의 일시적인 활성화는 상기 신호를 다음의 MEK로 전달하여 인산화 되게 한다. MEK의 활성화는 3.4 분에 최대에(26 %) 도달하는데, 이는 Raf 활성화와 유사한 패턴을 따랐다. 또한, 유사하게 상기 신호는 MEK에서 ERK로 전파되며 이에 의해 ERK는 활성화되었다. 상기 예견된 ERK 변화는 시간에 따라 전체적으로 느리게 감소하는 일시적인 ERK 활성(4.3 분에서 94.7%의 최대 활성화)을 나타내었다.

이러한 시뮬레이션을 확인하기 위해서, EGF(100 ng/㎖)를 처리한 PC12 세포에서 MEK 및 ERK 활성화 수준에 관한 시간 추이 데이터를 측정하였다. 예상된 대로 항인산화-MEK 및 항이중인산화-ERK 항체들에 대한 웨스턴 블럿 분석은 MEK 및 ERK 각각의 일시적인 활성화를 나타내었다(도 4d 및 4e). 웨스턴 블럿 분석은 다음의 방법으로 하였다. PC12 세포를 100 ng/㎖의 EGF로 0 내지 120 분간 처리하였다. 용해물 단백질 샘플을 항인산화-MEK 및 항이중인산화-ERK 항체로 블럿팅한 다음, Anti-HRP(horse radish peroxidase)-접합된 2 차 항체로 블럿팅하고, 상기 블럿을 ECL 화학발광에 의해 밴드를 확인하였다.

MAPK 신호전달기전의 활성화에 의해 생성된 효과는 매우 복잡하며 그의 활성 화 지속기간에 따라 상이한 반응들이 관찰되었다. 상기 연구에서 수득된 시뮬레이션 및 실험 데이터는 이미 보고된 데이터와 일치하였다[Hunter, T. Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., New York, 1991].

3. 단백질 초기 농도의 영향 평가

교란의 결과를 평가하기 위해서 각 세포 기능에 대한 각 신호 전달 성분의 관계를 밝히는 것이 중요하다. ERK 신호의 강도 및 지속기간은 최종 생물 반응결과에 중요하다. 이를 다루기 위해서, 상기 단백질의 초기 농도에 대한 체계적인 스캐닝을 수행한 다음, ERK 신호의 강도에 대해 상기 신호 전달 시스템을 분석하였다. 표 3은 단백질 농도 값의 변화 및 최대 ERK 활성화 상태의 측정을 요약한다.

수용체 과 발현은 다수 개의 신호 전달 경로에서 세포 반응에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있었다. 상기 EGFR 수의 효과에 대한 상세한 내용은 이하에 논의되어 있다. 간략히 말해서, 초기 EGFR 수가 증가함에 따라 매우 민감한 ERK 활성화 수준이 관찰되었고 ERK 인산화는 지속적인 패턴을 보이며 이는 보고된 데이터와 일치하였다[Schlessinger, J. and Ullrich, A. 9 Neuron 383-391, 1992].

Ras의 상부 활성화제인 Shc는 EGF에 반응하여 티로신 잔기에 인산화되어 상기 인산화된 EGFR에 결합한다. 다양한 초기 Shc 농도에서의 시뮬레이션은 94 % ERK 활성화를 보였으며 이는 MAPK 활성화가 보다 효율적일 수 있는 상기 Shc-의존성 경로를 통해 일어남을 암시한다. EGFR의 활성화는 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자(GEF; Sos) 활성의 증가를 도출시킨다. EGFR의 ERK에의 연결은 Grb2.Sos 복합체의 결합에 의해서 또는 다량체성 복합체를 통한 연결 단백질에 의해 일어날 수 있다. 상이한 Sos 분자들의 시간 추이 데이터는 보다 높은 Sos 농도에서 지속적인 패턴을 갖는 87 ∼ 96 % ERK 활성화를 제시하며, 이는 추후에 기초 수준으로 복귀된다.

Ras는 MAPK 신호 전달을 온 앤드 오프로 변화시키는 스위치로서 작용하며 다수 개의 신호 전달 경로의 활성화를 결집시킨다. 표 3에 나타낸 바와 같이, Ras 과발현은 그의 농도를 80000 분자/세포로 고정시키는 경우 최대 97.5 %의 활성을 생성시킨다. 흥미롭게도 ERK는 이 상태에서 50 분 후에 그의 활성을 유지하였다(전체 활성화에 대해 >50 %). Raf 및 MEK 단백질은 그의 초기 단계 농도를 증가시킴으로써 ERK 활성화 수준의 증가를 야기시켰으며, 이는 보다 높은 농도에서도 거의 동일하게 유지되었다. 이는 Raf 또는 MEK의 증가가 높은 수준의 ERK 활성화를 이루는데 필요하지 않음을 의미한다. 스캐닝된 다양한 단백질 분자들 중에서 Raf가 40000 분자/세포로 고정 시 99 %의 ERK 활성화를 나타내고 50 분 후에 상기 ERK 활성의 37 %가 유지된 유일한 단백질이었다. 이는 상기 Raf의 양이 상기 경로가 ERK 활성화를 지배하게 할 수 있게 함을 가리킨다. 대조적으로, 상이한 ERK 농도들에서의 시뮬레이션은 Raf 및 MEK의 반대 패턴을 보이며 여기에서 ERK 활성화는 ERK 분자 수의 증가에 따라 감소되는 것이 관찰되었다. 더욱 또한, ERK를 375000 분자/세포로 고정시킨 보다 긴 기간에서 30 % 활성이 보존되었다.

주어진 신호전달체계의 분자적인 세부사항을 이해하기 위해서 세포 반응에 따른 각 신호전달 단백질을 과다하게 발현시킴으로 일어나는 그 영향을 아는 것은 중요하다. 이런 점에서 실제적으로 실험을 수행하는 실험자는 개별적인 세포주에서 다양한 단백질을 과다 발현시키므로 목적 단백질에 주로 의존하는 다양한 세포반응을 관찰하게 된다. 그러므로 각기 다른 단백질의 초기 농도를 다양하게 함으로 단백질의 과다발현 패턴을 예증하여 결과적으로 ERK 활성정도를 살펴봄으로 인해 세포내 시스템의 결과를 평가하게 된다. 과다 발현된 단백질과 목적단백질 사이의 관계에 관한 지식을 얻는 과정을 통해 단백질의 기능이 밝혀지는 것이다.

4. 인산화 및 탈인산화 속도의 영향 검토

인산화 및 탈인산화는 세포 신호 전달에 필수적인 요소이며, 이로 인해 많은 중요한 세포 사건들이 활성화 또는 종결된다. 키나제 및 포스파타제에 의한 인산화/탈인산화는 세포가 많은 다양한 과정들을 온 또는 오프로 개폐하는 기전을 제공한다. 신호 전달에서 단백질 인산화/탈인산화 조절 과정은 그의 정상상태 인산화/탈인산화 속도에 비하여 약간의 제한이 있다. 인산화된 단백질에 의해 조절되는 기전 및 과정들을 연구하기 위해서는 인산화 및 탈인산화 속도를 검사하는 것이 중요하다.

따라서 상기 시뮬레이션의 다음 단계에서 신호 증폭에 관한 키나제 및 포스파타제의 생화학 반응을 이해하기 위해 인산화 및 탈인산화 반응의 반응 속도를 모니터하였다. 도 5a, 5b 및 5c는 Raf, MEK, 및 ERK의 인산화 및 탈인산화 반응의 반응 속도를 나타낸다. 처음에, 시작인 인산화 반응은 탈인산화 반응보다 더 높은 반응 속도를 나타내며 이는 신호들이 증폭됨을 암시한다. 이러한 곡선은 키나제/포스파타제에 대한 신호 결합이 상기 키나제/포스파타제의 촉매 성질의 변화를 야기하거나 또는 이용할 수 있는 키나제/포스파타제의 분획을 불활성화시켜 한결같거나 또는 일시적인 상태 농도에 영향을 미침을 의미한다. 농도 변화는 세포 내에서 한정된 생화학 반응들을 도출시키는 신호의 증폭을 나타낸다. 신호 전달 네트워크의 출현 성질들을 인산화/탈인산화 연쇄 증폭의 반응속도를 평가함으로써 측정할 수 있다. 또한, 인산화/탈인산화 반응 속도의 시간 추이에 대한 분석은 신호 전달에서 키나제/포스파타제 반응의 동력학을 조사하는데 적합한 실험 조건들에 대해 일부 실마리를 제공할 것이다.

단백질의 인산화는 신호전달체계에서 중요한 역할을 하게 된다. 신호를 증폭하는 데 있어 상위 단계의 단백질이 하부 단계의 목적 단백질을 인산화 시킴으로써 인산화와 탈인산화 과정이 정보를 전달하는데 있어 필수적인 것이다. 또한 단백질의 인산화와 탈인산화 과정의 조절은 평상시의 그 비율을 간주해 볼 때 얼마간의 차이를 보인다. 그래서 발명의 컴퓨터 모델이 민감하게 신호의 증폭을 보여줄 수 있는지를 알아보기 위해, 그리고 인산화된 단백질에 의해 조절되는 메커니즘과 과정을 연구하기 위해 인산화와 탈인산화 반응의 반응속도를 세밀하게 관찰해야 한다.

5. EGF 및 EGRR의 친화력 평가

생물학적 결과들을 신호 전달 과정에서 각 신호 전달 성분의 활성화 강도 및 지속 기간에 의해 측정하였다. 변수 변화 효과를 검사하기 위해 감도 분석을 수행하여 EGF 농도를 측정하였으며, 환경에 반응하여 신호 전달 성분의 활성화에 가장 큰 영향을 미치는 EGFR 수용체 수를 측정하는 것이 중요하였다. 신호 전달 분자 EGF는 그 뒤에 일어나는 일련의 세포 반응에 있어 첫 번째 구성원이므로, 상기 연구는 상이한 EGF 농도(1, 10, 100 및 1000 nM)에 반응하는, 도 3에 개시된 하부 신호 전달 사건들의 시간 추이 활성화를 조사하였다(도 6a 내지 6g).

EGFR은 EGF에 대한 2 가지 별개의 결합 친화성(높고, 낮은)을 갖는다. 고-친화성 결합 상호작용은 <1 nM의 해리 상수(Kd)를 갖는 반면, 저-친화성은 6 내지 12 nM의 범위를 갖는다. 이 연구에서 EGF 농도는 EGFR의 Kd 값 이상이었다(Schoeberl et al., 20 Nature Biotech. 370-375, 2002).

이러한 시뮬레이션 결과는 모든 신호 전달 분자의 활성화가 지연되었으며 상기 활성화 수준은 EGF = 10 ∼ 1000 nM에 비해 EGF = 1 nM에서 낮았음을 보였다. 예견된 활성화 수준은 보다 높은 리간드 농도(>10 nM)에서 거의 같았다. 따라서 EGF를 상기 언급한 분석 및 후속 실험을 위해 EGF = 100 nM에서 유지시켰다.

도 6a는 높은 EGF 농도에서 거의 150 배의 빠른 활성화를 보인다. EGF = 100 nM에서, 상기 모델은 50 %의 EGFR 활성화 수준을 예견한다. EGFR 활성화 플롯은 EGFR이, 해리가 빠른 저 친화성(Kd ≥ 10 nM)의 경우 관찰된 것보다 더 긴 시간이 해리에 필요했기 때문에 고 친화성(Kd = 1 nM)을 가짐을 나타낸다. 비록 본 발명자들은 본 연구에서 수용체 내재화를 강조하지 않았지만, 우리의 시뮬레이션 데이터는 수용체의 내재화는 수용체 의존적이라고 보고한 와일리 연구(Wiley, HS. et al., 266 J. Biol. Chem. 11083-11094 1991; Wiley, HS. 107 J. Cell Biol. 801-810, 1998)와 일치하였다. 더욱이 EGFR 모델의 동력학 분석은 EGF 내재화의 특정 내재화 속도 상수가, 높은 EGF 농도에서보다 낮은 농도에서 수 배 더 큼을 밝혔다. EGF-수용체 복합체는 내재화 후 빠르게 재 순환하며, EGF와 복합체를 이루는 수용체의 재순환 속도는 EGF와 복합체를 이루고 있지 않은 수용체의 재순환 속도보다 더 느리다.

Shc, Ras-GTP 및 Ras의 활성화 신호는 2 분에서 일시적인 활성화를 갖고 이어서 시간이 지남에 따라 서서히 감소하는 농도-의존성 방식의 유사한 패턴에 따랐다(도 6b 내지 도 6d). 다른 한편으로, MAPK 신호전달기전물질들에 대한 조사는 상기 Raf, MEK 및 ERK 활성화 수준이 리간드 농도와 상관없이 변하지 않음을 밝혀냈다. ERK 활성화가 EGF = 1 nM에서 34%이지만, 예견된 ERK 활성화는 이러한 조건 하에서 >90%였으며, 이는 신호 전파의 높은 효율을 가리킨다. 상이한 리간드 농도들에 대한 보다 높은 ERK 활성화 수준은 여기 제시된 모델과 유사한 패턴을 보인다(Schoeberl et al., 20 Nature Biotech. 370-375, 2002). 이들 플롯은 MAPK 신호전달의 최대 활성화가 궁극적인 목표인 경우 EGF 농도는 보다 높은 ERK 활성화 수준에 도달하는데 의미 있는 인자가 아님을 입증한다. EGFR 매개된 신호 전달 분자들의 이러한 시뮬레이션된 활성화 정도는 다른 시뮬레이션 결과들과 일치한다(Schoeberl et al., 20 Nature Biotech. 370-375, 2002; Kholodenko, BN. et al., 274 J. Biol. Chem. 30169-30181, 1999).

6. EGFR 과 발현 효과의 평가

수용체의 활성으로 인한 하부 표적으로의 신호 전달은 일련의 신호전달기전의 기존 견해를 고도로 서로 얽혀있는 복합체 간의 네트워크로 바꾼 모델이 된다. 과잉의 수용체의 존재는 추가적인 신호 전달 분자들을 모집하여, 신호 증폭을 증가시킬 수 있다. 수용체의 EGF 군의 다른 분자들에 대한 평가뿐 아니라 EGFR 발현의 평가 또한 EGFR 과 발현에 기여하는 기전을 이해하는데 도움이 된다. 따라서, 시뮬레이션의 다음 과정은 EGFR의 수용체 과 발현 효과를 평가하기 위해 수행되었다.

EGFR 신호 전달 분자들의 활성화 수준에 따라 다수의 가능한 기전들이 다양한 효과들에 기초를 이루게 된다. 선행 보고서들은 세포 당 대략 20000 개의 EGFR 수용체가 존재함을 보였다(Traverse, S. et al., 4 Current Biology, 694-701, 1994). 따라서, 본 연구는 5550 내지 200000 개 범위 수의 EGFR 모델을 시뮬레이션하였다.

도 7a 내지 7g는 시간 및 EGFR 수의 함수로서 각 단백질의 활성화를 나타낸다. EGFR은 EGF에 대한 EGFR 친화성을 조절하는데 기여할 수도 있다. 수용체 밀도의 증가가 EGF 회합의 결합 동력학 및 상기 수용체 와의 해리를 조절할 수 있음이 보고되었다[Wiley, HS. 107 J. Cell Biol., 801-810, 1998]. 상기 모델 시뮬레이션은 수용체 수의 증가에 의해 활성화된 EGFR 수준이 향상됨을 보여준다. 이러한 상이 수용체 발현 프로파일은 MAPK 신호 전달 활성화 수준에 영향을 미치지 않는다. 연구된 모든 EGFR 수에 대해서, Raf 및 MEK는 그들의 활성화 수준에 무시할만한 변화를 나타낸 반면, ERK 활성화는 완전히 변하지 않고 남아있었다. 또 다른 성분인 Ras는 불활성 GDP와 결합된 상태에서 활성 GTP와 결합된 상태가 번갈아 일어나는 분자 스위치로서 작용할 수 있다. 흥미롭게도, 상기 모델은 Shc 및 Ras-GTP의 경우 상이한 활성화 패턴을 나타낸다(도 7b 및 7c).

11100 정도의 수용체 수의 경우, Shc 및 Ras-GTP 활성화 수준은 5550의 수용체 수에 대한 상황에 비해 낮았다. 그러나 ≥11100의 수용체 수의 경우 Shc 및 Ras-GTP 활성화는 다른 성분들에 대해 관찰된 패턴과 유사한 패턴을 따랐다.

7. 억제 효과 시뮬레이션

상피 성장 인자는 세포 증식에서 중요한 역할을 한다. 그의 부재는 세포 주기 진행을 억제 또는 정지시키거나 또는 세포가 세포사멸을 겪게 할 수 있다[Aaronson, 254 Science, 1146-1153, 1991]. 종양 세포 성장을 위한 성장 인자의 중요성은 광범위하게 입증되었다. 임상 연구는 인간 종양에서 흔히 발생하는 성장 인자 수용체의 과 발현이 종종 1 기 유방암에서, 보다 불량한 예후와 상관이 있음을 지적한다[Veale, et al., 55 Br. J. Cancer, 513-516, 1987]. 이러한 사실에 기인하여, 인간 EGF 수용체에 대한 억제제가 개발되었다[Fan, et al., 269 J. Bio. Chem. 27595-27602, 1994]. MAPK 신호전달기전의 지속적인 활성화는 많은 인간 암의 악성 진행에 기여할 수도 있다[Maemura, et al., 57 Oncology 37-42, 1999]. 지속적으로 활성화된 ERK는 핵으로 이동되는 반면, 일시적으로 활성화된 ERK는 핵으로의 대규모 이동이 보이지 않는다[Kholododenko, 276 Eur. J. Biochem 1583-1588, 2000].

MAPK 신호전달기전에 대한 억제 약물의 개발은 중요한 연구 분야이다. 이를 기반으로 하여, 모델링 분석을 사용하여, EGF에 의해 유도된 ERK 활성화의 시뮬레이션에 대한 MEK 억제제의 효과를 조사하였다. PD09859 및 U0126은 이중 특이성 키나제의 비길항적 억제제이며, ERK의 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있다. 상기 두 억제제가 모두 유사한 억제 기전을 나타내지만, U0126이 MAPK 경로의 억제에 보다 효능이 있고 특이적이다(Traverse, et al. 288 Biochem. J. 351-355, 1922). 이들 억제제는 MEK의 촉매 활성을 억제시킴으로써 MEK가 ERK를 인산화시키는 것을 방지한다. 따라서 억제 효과를 시뮬레이션하기 위해서, MEK 반응의 촉매 속도 상수 값을 변화시켰다.

도 8a는 MEK 인산화를 나타내는 50 내지 0.5 분^-1 범위의 전환 수에 대해 시뮬레이션된 ERK 활성 수준을 나타낸다. 결과는 ERK 활성화 수준이 MEK 인산화의 동력학 변수가 변함에 따라 점차 감소하여 Kcat가 0.5 분^-1으로 고정되었을 때 0으로 떨어짐을 나타낸다. 상기 모델 시뮬레이션은 ERK 억제를 유도하는 완전한 MEK 억제를 예견하였으며 이는 실험적 관찰과 연관이 있다. 상기 유형의 동력학 언어의 이용은 키나제의 억제 기전을 평가하는데 유용하다.

EGF 또는 신경 성장 인자(NGF) 처리된 PC12 세포를 MEK 및 ERK 활성화 수준에 대한 PD09859(10 μM) 및 U0126(0.01 ∼ 10 μM)의 효과를 평가하기 위해서 검사하였다(도 8b 및 8c). 웨스턴 블럿은 다음의 방법으로 하였다. PC12 세포를 PD98059 또는 U0126에 이어서 100 ng/㎖의 EGF 또는 NGF로 5 분간 처리하였다. 이에 얻어진 단백질 샘플을 SDS/PAGE에 의해 분리시키고 항인산화-MEK 및 항이중인산화-ERK 항체로 블럿팅한 다음, 항-HRP(horse radish peroxidase) 접합된 2 차 항체로 블럿팅하고, 상기 블럿을 ECL 화학발광에 의해 밴드를 확인하였다.

이들 세포에 EGF를 처리했을 경우 MEK의 활성화 수준이 현저하게 높다. 반면 MAPK 경로를 단지 약화시키는 PD98059의 경우, EGF나 NGF가 함께 주어졌을 때에도 ERK의 활성화를 억제하지 않았다. 대조적으로, U0126은 용량 의존적으로 MEK 의 활성에 의한 세포 내 ERK 인산화를 억제하였다. 그러나 MEK 인산화를 억제하는 효과는 없었다. 이러한 시뮬레이션 및 실험 결과가 또한 서로 잘 일치하지만 상기 모델은 상기 두 억제제들 간의 정량적인 차이를 예견하지는 못했다.

상술한 바와 같이 본 발명의 생화학 경로의 모델링과 시뮬레이션 방법 및 시스템은 생물 시스템의 신호 전달 경로에 포함되는 단백질 농도 등의 생물학적 데이터를 변수로 한 수학적인 동력학 모델을 개발하고 이를 이용하여 시뮬레이션 함으로써 다양한 환경에서 단백질의 기능과 활성화 상태, 단백질 사이의 상호작용 및 신호 전달 경로 등을 예상할 수 있어 신호 전달 네트워크의 정량적 및 정성적 이해가 가능하다. 본 발명의 시뮬레이션 모델을 이용하면 약제 설계(drug design) 등 특정 목적을 위한 신물질 발굴에 있어 실험의 횟수를 최소화할 수 있고 그 적용을 쉽게 예측함으로써 품질을 높일 수 있다.

Claims (8)

1. 생화학 경로의 세포 환경 정보를 수집하는 단계; 및

   반응속도식 및 미켈스-멘텐 공식에 기초한 미분방정식과 상기 세포 환경 정보를 이용하여 모델링 하는 단계;

   를 포함하는 생화학 경로의 모델링 방법.
2. 생화학 경로의 세포 환경 정보 및 입력 정보를 제공하는 단계;

   반응속도식 및 미켈스-멘텐 공식에 기초한 미분방정식과 상기 세포 환경 정보를 이용하여 모델링 하는 단계;

   상기 입력 정보에 기초하여 시뮬레이션하는 단계; 및

   시뮬레이션 결과를 디스플레이하는 단계;

   를 포함하는 생화학 경로를 시뮬레이션하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포 환경 정보는 세포의 물질, 과정, 유형 및 성분; 단백질 유형, 구조, 조성 및 기능; 하위 세포 위치; 활성 또는 억제 효과임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 입력 정보는 단백질 상황(context), 자극(stimuli), 녹아웃(knockout) 및 종말점(endpoint)임을 특징으로 하는 방법.
5. 세포 환경 정보 및 입력 정보를 수용하는 데이터 입력 모듈(10);

   반응속도식 및 미켈스-멘텐 공식에 기초한 미분방정식에 상기 정보들을 대입하여 시뮬레이션을 수행하는 시뮬레이션 모듈(20);

   상기 정보들을 저장하는 데이터베이스(30); 및

   상기 시뮬레이션의 결과를 출력하는 디스플레이 모듈(40)

   포함하는 생화학 경로를 시뮬레이션하는 시스템.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 시뮬레이션 모듈은 그래픽 유저 인터페이스(21)와 추론 엔진(22)을 포함하는 것을 특징으로 하는 생화학 경로를 시뮬레이션하는 시스템.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 세포 환경 정보는 세포의 물질, 과정, 유형 및 성분; 단백질 유형, 구조, 조성 및 기능; 하위 세포 위치; 활성 또는 억제 효과임을 특징으로 하는 시스템.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 입력 정보는 단백질 상황(context), 자극(stimuli), 녹아웃(knockout) 및 종말점(endpoint)임을 특징으로 하는 시스템.

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