JP2012509667A - 分子を特徴付けるための方法 - Google Patents

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Abstract

創薬は、多くの挑戦に直面している複雑な仕事であり、多くの有望な候補が、病気の乏しい理解のためクリニックで効力がないかまたは毒性であると判明するように、少なからず、高い加害率を有する。従って、それらは生物学システムをターゲットにする。それ故、創薬の生産性を上昇させるために、薬剤ターゲットの完全な生物学的コンテキストおよび個々の遺伝子とタンパク質を越えた動きを考慮して、病気の分子機構のはるかにより深い理解を必要とすることについて、概して同意する。本方法は、活動のモード、毒性、あらゆる分子のターゲットおよび経路を体系的に示すためにラベルフリー細胞分析、特にＤＭＲインデックスの使用に頼る。

Description

Ｉ．背景
２．本開示は、共鳴導波グレーティング（RWG： resonant waveguide grating）バイオセンサまたは表面プラズモン共鳴（SPR : surface plasmon resonance）バイオセンサまたは電気バイオセンサの如きバイオセンサに関し、特に分子を特徴付ける上記のバイオセンサの使用に関する。また、本開示は、分子に関するインデックスの生成方法および創薬の方法に関する。
II．概要
３．本開示は、ラベルフリーバイオセンサ細胞分析を用いる分子を特徴付けるための方法、組成、製品および機械を提供し、リガンドを含む分子のシステム生物学およびシステム薬理学分析および創薬の実施を提供する。また、本開示は、特定の分子に関するインデックスを生成するための方法、組成、製品および装置を提供し、あらゆる分子の活動のモードを判定するために異なる分子のインデックスの比較分析を使用する方法を提供する。
III．図面の簡単な説明
図１は、本開示の実施例における、創薬のための細胞プロファイル薬理学アプローチの図を示す。 図２は、本開示の実施例における、創薬のための細胞プロファイル薬理学アプローチの例を示す。 図３Ａは、開示の実施例における、１６の異なるリガンドの１次プロファイルを示す。各リガンドは１０μＭであり、Ａ５４９細胞に作用している。 図３Ｂは、開示の実施例における、１６の異なるリガンドの１次プロファイルを示す。各リガンドは１０μＭであり、Ａ５４９細胞に作用している。 図４は、本開示の実施例における、Ａ４３１細胞に作用しているビヒクル溶液の１次プロファイル（ネガティブコントロール）と比較した静止状態のＡ４３１細胞に作用している３２ｎＭの上皮増殖因子（ＥＧＦ）の１次プロファイルを示す。 図５は、本開示の実施例における、静止状態のＡ４３１細胞に作用している３２ｎＭのＥＧＦの１次プロファイル（コントロール）および４つの異なるリガンドの２次プロファイルを示す。２次プロファイルの各々は、各リガンド（ＢＬＭ−２６５、ＡＧ１４７８、Ｕ０１２６、ロットレリン）による細胞の約１時間の前処理の後、３２ｎＭのＥＧＦに対するＡ４３１細胞の光学反応を測定することにより得られた。 図６Ａは、リガンドのパネルによって３２ｎＭのＥＧＦ誘導された静止状態のＡ４３１細胞の光シグナルの変調プロファイルの例を示す。リガンドの不存在下および存在下におけるＡ４３１細胞のＥＧＦ ＤＭＲシグナルの３つの光学反応パラメータは、リガンドの関数として分析されプロットされた。３つのパラメータは、Ａ４３１細胞のＥＧＦ ＤＭＲシグナルの（Ａ）Ｐ−ＤＭＲ（ポジティブＤＭＲ）、（Ｂ）Ｎ−ＤＭＲ（ネガティブＤＭＲ）、（Ｃ）ＲＰ−ＤＭＲ（リカバリポジティブＤＭＲ）の振幅である。あらゆる分子による前処理なしの分子のＤＭＲシグナルは、ポジティブコントロール（ポジティブ）として使用され、一方、ビヒクルのみ（すなわち分析緩衝液）で処理された細胞のＤＭＲシグナルはネガティブコントロールとして使用された。 図６Ｂは、リガンドのパネルによって３２ｎＭのＥＧＦ誘導された静止状態のＡ４３１細胞の光シグナルの変調プロファイルの例を示す。リガンドの不存在下および存在下におけるＡ４３１細胞のＥＧＦ ＤＭＲシグナルの３つの光学反応パラメータは、リガンドの関数として分析されプロットされた。３つのパラメータは、Ａ４３１細胞のＥＧＦ ＤＭＲシグナルの（Ａ）Ｐ−ＤＭＲ（ポジティブＤＭＲ）、（Ｂ）Ｎ−ＤＭＲ（ネガティブＤＭＲ）、（Ｃ）ＲＰ−ＤＭＲ（リカバリポジティブＤＭＲ）の振幅である。あらゆる分子による前処理なしの分子のＤＭＲシグナルは、ポジティブコントロール（ポジティブ）として使用され、一方、ビヒクルのみ（すなわち分析緩衝液）で処理された細胞のＤＭＲシグナルはネガティブコントロールとして使用された。 図６Ｃは、リガンドのパネルによって３２ｎＭのＥＧＦ誘導された静止状態のＡ４３１細胞の光シグナルの変調プロファイルの例を示す。リガンドの不存在下および存在下におけるＡ４３１細胞のＥＧＦ ＤＭＲシグナルの３つの光学反応パラメータは、リガンドの関数として分析されプロットされた。３つのパラメータは、Ａ４３１細胞のＥＧＦ ＤＭＲシグナルの（Ａ）Ｐ−ＤＭＲ（ポジティブＤＭＲ）、（Ｂ）Ｎ−ＤＭＲ（ネガティブＤＭＲ）、（Ｃ）ＲＰ−ＤＭＲ（リカバリポジティブＤＭＲ）の振幅である。あらゆる分子による前処理なしの分子のＤＭＲシグナルは、ポジティブコントロール（ポジティブ）として使用され、一方、ビヒクルのみ（すなわち分析緩衝液）で処理された細胞のＤＭＲシグナルはネガティブコントロールとして使用された。 図７は、静止状態のＡ４３１細胞に作用している（Ａ）３２ｎＭ ＥＧＦ、（Ｂ）５μＭ ヒスタミン、（Ｃ）１μＭ ニコチン酸）、（Ｄ）２ｎＭ エピネフリンの１次プロファイルを示す。 図８は、Ａ５４９細胞に作用している（Ａ）４０ｎＭ ピナシジル、（Ｂ）８μＭ ＳＬＩＧＫＶアミド、（Ｃ）２５０μｇ／ｍｌ ポリ（Ｉ：Ｃ）、（Ｄ）８μＭ ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、（Ｅ）１０μＭ ヒスタミン、（Ｆ）１６μＭ フォスコリンの１次プロファイルを示す。 図９は、本開示の実施例における、（Ａ）静止状態のＡ４３１細胞に作用している分子ＨＡ−１０７７の１次プロファイル、（Ｂ）Ａ５４９細胞に作用しているＨＡ−１０７７の１次プロファイル、（Ｃ）ＨＡ１０７７の変調インデックスを示す。変調インデックスは、ＨＡ１０７７の非存在下および存在下における細胞におけるマーカ誘導された反応の特定のパラメータを比較することによって生成された。正の値は、ＨＡ−１０７７が細胞におけるマーカ光シグナルの特定のパラメータを増強していることを示し、一方、負の値は、ＨＡ−１０７７が細胞におけるマーカ誘導されたシグナルの特定のパラメータを抑制または減衰させていることを示す。 図１０は、本開示の実施例における、（Ａ）静止状態のＡ４３１細胞に作用している分子Ｈ−８の１次プロファイル、（Ｂ）Ａ５４９細胞に作用しているＨ−８の１次プロファイル、（Ｃ）Ｈ−８の変調インデックスを示す。 図１１は、本開示の実施例における、（Ａ）静止状態のＡ４３１細胞に作用している分子ＬＹ２９４００２の１次プロファイル、（Ｂ）Ａ５４９細胞に作用しているＬＹ２９４００２の１次プロファイル、（Ｃ）ＬＹ２９４００２の変調インデックスを示す。 図１２は、本開示の実施例における、（Ａ）静止状態のＡ４３１細胞に作用している分子ケルセチンの１次プロファイル、（Ｂ）Ａ５４９細胞に作用しているケルセチンの１次プロファイル、（Ｃ）ケルセチンの変調インデックスを示す。
ＩＶ．詳細な説明
１６．本開示の様々な実施例が図面を参照しつつ詳細に説明されている。様々な実施例に対する言及は、本開示の範囲を制限しない。本開示は、添付の請求の範囲によってのみ制限される。さらに、本明細書に記載された例は、限定となることを意図しておらず、単に請求の範囲に記載された発明の多くの可能な実施例のうちのいくつかを記載しているにすぎない。
Ａ． 定義
１． 材料（Material）
１７．材料（material）は対象物の構成に進入する(化学的、生物化学的、生物学的または混合された)何かの具体的な部分である。
２． 物質 （Substance）
１８．物質などの用語は、あらゆる対象物である。材料は、物質である。分子、リガンド、マーカ、細胞、タンパク質およびＤＮＡは、物質とみなすことができる。機械または製品は、物質それ自体というよりもむしろ物質で造られているものとみなされるであろう。
３． 分子（Molecule）
１９．ここで使用される場合、分子などの用語は、化学分子または一定の分子量を有する分子の形式で存在する生物学上または生物化学上または化学上の実在物（エンティティ）をいう。分子などの用語は、そのサイズにかかわらず、化学上または生物化学上のまたは生物学上の分子である。
２０．いくつかの分子は、炭素を含んでいないが（酸素分子などの単純な分子ガスおよびいくらかの硫黄ベースポリマーなどのより複雑な分子を含む）、多くの分子は、有機分子と呼ばれるタイプのものがある（とりわけ、共有結合によって接続された炭素原子を含む分子）。「分子」という一般的な用語は、タンパク質、核酸、炭水化物、ステロイド、有機薬剤、小分子、受容体、抗体、脂質などの多くの記述的な分子のクラスまたはグループを含んでいる。適切であるとき、１つ以上のこれらのより記述的な用語（タンパク質のようにそれらの多くは、それ自身が分子のオーバーラップしているグループを記述している）は、そのような分子が一般的なクラス「分子」とタンパク質などの固有名のあるサブクラスの両方の代表であるとする意図を損なうことなく分子のサブグループの本発明の方法の適用のためにここに使用される。明確に示されない限り、「分子」という用語は、特定の分子およびその塩（薬理学的に許容できる塩など）を含む。
４．リガンド（Ligand）
２１．リガンドなどの用語は、生物学的目的を果たすために生体分子を有する合成物と結合およびこれを形成できる物質、組成または分子である。リガンドとそのターゲット分子との事実上不可逆の共有結合は、生体系においては稀である。受容体に結合しているリガンドは、化学構造、すなわち、受容体タンパク質の三次元形状を変化させる。受容体タンパク質の立体配置的な状態は、受容体の機能的状態を決定する。結合の性向または強度は、親和性と呼ばれている。リガンドは、基質、ブロッカー、抑制剤、活性剤および神経伝達物質を含む。放射性リガンドは、ラジオアイソトープラベル化リガンドであり、蛍光リガンドは、蛍光性にタグ付けされたリガンドである。リガンドが受容体生物学および生物化学の研究のためのトレーサーとしてしばしば使用される故、両者を考慮することができる。リガンドおよびモジュレータは、相互交換可能に使用される。
５．マーカ（Marker）
２２．マーカなどの用語は、バイオセンサ細胞分析においてシグナルを生成するリガンドである。シグナルは、少なくとも１つの特定の細胞シグナリング経路の特性、および/または、少なくとも１つの特定のターゲットを通して媒介された少なくとも１つの特定の細胞のプロセスである。シグナルは、正または負または正負のどのような組み合わせであってもよい（例えば発振）。
６．混合分子（Molecule mixture）
２３．混合分子などの用語は、少なくとも２つの分子を含む混合物である。２つの分子は、限定されないが、構造的に異なっていてもよいし（すなわち、鏡像異性体）、組成的に異なっていてもよいし（例えばタンパク質アイソフォーム、グリコーゲン、または異なるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の改変を有する抗体）、構造的および組成的に異なっていてもよい（浄化されていない天然抽出物、または浄化されていない合成化合物）。
７．未知の分子（Unknown molecule）
２４．未知の分子などの用語は、生物学上／薬理学上／生理学上／病態生理学上の活動が知られていない分子である。
８．既知の分子（Known molecule）
２５．既知の分子などの用語は、薬理学上／生物学上／生理学上／病態生理学上の活動が知れられており、その正確な活動のモードが既知または未知である分子である。
９．テスト分子（Test molecule）
２６．テスト分子などの用語は、テスト分子に関するなんらかの情報を獲得する方法において使用される分子である。テスト分子は、既知または未知の分子であり得る。
１０．薬剤候補分子（Drug candidate molecule）
２７．薬剤候補分子などの用語は、その薬剤またはファルマコフォアとして機能する能力についてテストされるテスト分子である。この分子はリード分子（lead molecule）としてみなすことこができる。
１１．変調する（Modulate）
２８．変調すること、またはそれの形式は、細胞ターゲット通して媒介された細胞活動を増加させるまたは減少させるまたは維持させることを意味する。これらの用語の１つが使用されているところはどこでも、それがコントロールから例えば１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％、５００％、１０００％増加された、または、コントロールから１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％減少されたことが開示されたと理解される。
１２．モジュレータ（Modulator）
２９．モジュレータなどの用語は、細胞ターゲットの活動をコントロールするリガンドである。それは、ターゲットタンパク質などの細胞ターゲットに結合するシグナル変調分子である。
１３．既知のモジュレータ（Known modulator）
３０．既知のモジュレータなどの用語は、ターゲットの少なくとも１つが既知の親和性で知られているモジュレータである。例えば、既知のモジュレータは、ＰＩ３Ｋ抑制剤、ＰＫＡ抑制剤、ＧＰＣＲアンタゴニスト、ＧＰＣＲアゴニスト、ＲＴＫ抑制剤、上皮増殖因子受容体中和抗体、ホスホジエステラーゼ抑制剤、ＰＫＣ抑制剤、活性剤などであり得る。
１４．細胞（Cell）
３１．細胞などの用語は、半透性の膜によって外面的に隔てられた原形質の小さい通常微細な密集体をいう。状況に応じて、１以上の核およびさまざまな他の細胞器官が含まれ、単独でまたは密集体のような他のものとの相互作用で生物のすべての基本的な機能を実行する能力があり、合成細胞構造、細胞モデルシステム、および人工の細胞システムを含む独立に機能する能力がある生命体の最も小さい構造ユニットを形成している。
３２．細胞は、異なる細胞タイプを含み得る。例えば、特定の疾病に関連する細胞、特定の起源からの細胞のタイプ、特定のターゲットに付随する細胞のタイプ、または特定の生物学上の機能に関連する細胞のタイプなどである。細胞は、体内に生じた細胞、操作された細胞、変形された細胞、不死化された細胞、初代細胞、胚幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞、幹細胞由来細胞であり得る。
３３．人間は、約２１０の異なる既知の細胞からなる。どのようにして細胞が生成され（例えば、操作され、変形され、不死化され、または人体から新鮮に分離されて）、そして、細胞がどこで取得されるか（例えば、異なる年齢の人体または異なる病期）を考慮すれば、細胞のタイプの数はほとんど無限である。
１５．マトリックス（Matrix）
３４．マトリックスなどの用語は、ある規則に従って他の何かが生じ、具体化し、または進展するポイントを構成する何かである。マトリックスは、分析が行われる過程およびもたらされる結果の質において重大な影響を持つ。例えば、本開示の実施例において、分子を特徴付けるために細胞のパネルを選択するためのマトリックスは、限定されないが、例えば、特定の病気（例えば、アレルギー反応または炎症性の病気、病原菌感染、乳がん、皮膚がん、大腸がん、肝疾患、膵臓がん、心臓疾患などに関与する細胞のパネル）、または特定の起源（例えば、神経細胞、肺細胞、皮膚細胞、筋肉細胞、肝細胞などのパネル）、または特定の細胞ターゲット（例えば、受容体、酵素、キナーゼ、発癌遺伝子、構造タンパク質、DNA、RNA）、または人間生理学および病態生理学を代表する細胞のタイプの広いスペクトル（例えば角質化する上皮細胞からなる細胞のパネル、ウェット重層上皮細胞、外分泌上皮細胞、ホルモン分泌細胞、代謝および貯蔵細胞、バリア機能細胞（肺、腸、外分泌腺、および泌尿生殖路）、近接した体内の体腔と並ぶ上皮細胞、推進機能を持つ繊毛細胞、細胞外のマトリックス分泌細胞、収縮性細胞、血液および免疫システム細胞、感覚変換器細胞、自律神経細胞、感覚器および抹消神経支持細胞、中枢神経系ニューロンおよびグリア細胞、レンズ細胞、色素細胞、生殖細胞、ナース細胞、および間質細胞）を含む。他の実施例において、少なくとも２つの細胞のタイプの混合群が、細胞システムとして使用され得る。
１６． 細胞培養（Cell culture）
３５．「細胞培養」は、原核細胞または真核細胞がコントロールされた状況下で育成されている過程をいう。「細胞培養」は、多細胞の真核生物から得られた細胞、特に動物細胞の培養のみならず、複合組織および器官の培養をも含む。
１７． バイオセンサ（Biosensor）
３６．バイオセンサなどの用語は、生物学的構成要素と生理学的検出器構成要素とを結合した検体の検出のためのデバイスをいう。バイオセンサは通常３つのパーツ、すなわち、生物学的な構成要素またはエレメント（例えば組織、微生物、病原体、細胞、またはこれらの組み合わせ）と、検出部エレメント（例えば、光学的、圧電的、電気化学的、測熱法的、磁気的などの物理学的な方法で動作する）と、これらの両構成要素と協働するトランスデューサと、により構成されている。生物学的な構成要素またはエレメントは、例えば、生体細胞、病原対またはこれらの組み合わせであってもよい。実施例において、光学バイオセンサは、生体細胞、病原体またはこれらの結合における分子識別または分子刺激現象を定量化可能なシグナルに変換する光学トランスデューサを含み得る。
１８．アッセイ（Assaying）
３７．「アッセイ」、「分析する」などの用語は、分子または細胞などの物質の特性、例えば、リガンドまたはマーカのような１つ以上の外因刺激による刺激時における存在、非存在、量、範囲、キネティクス、ダイナミクスまたは細胞の光学的あるいはバイオインピーダンス反応（bioimpedance response）のタイプを判定するための分析をいう。刺激に対する細胞の反応のバイオセンサシグナルを生成することは分析であり得る。
１９．長期間分析（Long term assay）
３８．長期間分析などの用語は、生体細胞における所定の分子の長期間の影響を調査するために使用される。長期間分析の特定のタイプは、「長期間バイオセンサ細胞分析」である。１つの実施例において、各細胞のタイプは、長時間（例えば、８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４８時間、７２時間）分子にさらされるのみである。この長期間分析は、健全な状態の細胞における分子の影響（例えば、生存力、アポトーシス、細胞サイクル規則、細胞粘着規則、増殖）を判定するのに使用される。また、この長期間分析は、早期の細胞シグナリング反応（例えば、分子刺激後３０分、６０分、１２０分、１８０分）を含んでおり、分子誘導された細胞シグナリングイベントまたは経路を調べるために直接的に使用され得る。
３９．他の実施例において、マーカの存在下における長期間バイオセンサ細胞分析は、分子とマーカとの間の細胞生物学および生理学の長期影響の相互制御（cross regulation）を調べるために使用される。マーカは、分子の前、同時または後に加えられる。例えば、マーカ（例えばＨ２Ｏ２）が細胞パネルにおける少なくとも１つの細胞のタイプのアポトーシスを誘発するとき、その分子が保護性であるか否かを判定するために上記の長期間分析を使用することができる。逆もまた真であり、そのような長期間分析は、分子誘導された細胞イベント（例えばアポトーシスまたはネクローシス）に対するマーカの保護性のまたは相乗的な役割を判定するために使用することができる。
２０．短期間分析（Short term assay）
４０．短期間分析などの用語は、生体細胞における所定の分子の短期間の影響を調査するために使用される。短期間分析の特定のタイプは、「短期間バイオセンサ細胞分析」である。１つの実施例において、各細胞のタイプは、短時間（例えば、５分、１０分、３０分、４５分、６０分、９０分、１８０分、２４０分）分子にさらされるのみである。この短期間分析は、早期の細胞シグナリング反応を検出するためにしばしば使用され、分子誘導された細胞シグナリングイベントまたは経路を調べるために、またはマーカ誘導された細胞反応を変調する分子の能力を調べるために直接的に使用され得る。
２１．２ステップ分析（Two step assay）
４１．２ステップ分析などの用語は、細胞パネルにおける各細胞のタイプが分子誘導されたバイオセンサシグナルを調べるためにはじめに分子にさらされ、マーカ誘導されたバイオセンサシグナルを変調する分子の能力を調査するために特定のマーカまたはマーカのパネルがその後に続く。この分析は、２モード分析と呼ぶことができる。すなわち、はじめのアゴニズムモードとそれに続くアンタゴニズムモードである。分子の活動のモード（例えばターゲット、アゴニズムまたはアンタゴニズムおよび潜在力または効能）
２２．アゴニストおよびアタゴニストモード（Agonist and antagonist mode）
４２．アゴニズムモードなどの用語は、ＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルを誘発する分子の能力を判定するために細胞が分子にさらされる分析であり、一方、アンタゴニズムモードは、マーカに反応する細胞のバイオセンサシグナルを変調する分子の能力を判定するために分子の存在下において細胞がマーカにさらされる分析である。
２３． パルス刺激分析（A pulse stimulation assay）
４３．パルス刺激分析などの用語は、細胞が非常に短い時間（例えば、数秒または数分）分子にさらされる場合に使用される。このパルス刺激分析は、細胞またはターゲットに作用する分子のキネティクスおよびマーカ誘導されたバイオセンサシグナルへの影響を調べるために使用され得る。パルス刺激分析は、単に分子を加えた直後の一定の時間において液体処理装置によって分子溶液を細胞分析緩衝液に置き換えることにより実施することができる。
２４． 処理（Treating）
４４．処理またはトリートメントなどの用語は、少なくとも２つの態様で使用され得る。第１に、処理またはトリートメントまたはこれらと同類の用語は、対象に対してなされる管理または行為をいう。第２に、処理またはトリートメントなどの用語は、あらゆる２つのもの、例えば分子と細胞などあらゆる２つ以上の物質を一緒に混合することをいう。この混合は、少なくとも２つの物質の間で接触が生じ得るように、これらをまとめる。
４５．処理またはトリートメントなどの用語が病気を持つ対象という状況において使用されているとき、それは例えば治療または症状の軽減さえも意味しない。「治療の」などの用語が処理またはトリートメントなどの用語と併せて使用されているとき、それは、内在的な病気の症状が軽減され、および／または症状を引き起こしている１つ以上の内在的な細胞の、生理学上の、または生物化学上の原因またはメカニズムが低減されることを意味する。低減は、この文脈において使用される場合、病気の状態に関係していることを意味し、病気の分子状態を含み、単なる病気の生物化学上の状態ではないことが理解される。
２５． 接触（Contacting）
４６．接触などの用語は、もし、分子相互作用が少なくとも２つの物体（例えば分子、細胞、マーカ、少なくとも１つの合成物または組成、または少なくとも２つの組成、または製品または機械を有するこれらのどれも）の間で可能である場合、分子相互作用が起こり得るように近接させることを意味する。例えば、接触は、少なくとも２つの組成、分子、製品または物体を接触させること（すなわち、それらが混ざるまたは触れるまで近接するように）をいう。例えば、組成Ａの溶液と培養細胞Ｂを用意し、培養細胞Ｂに組成Ａの溶液を注ぐと、組成Ａの溶液は細胞培養Ｂに接触する。細胞をリガンドと接触させることは、細胞にリガンドをもたらし、細胞がリガンドにアクセスすることを確実にするであろう。
４７．ここに開示されているあらゆるものは、他のあらゆるものと接触され得ることが理解される。例えば、細胞は、マーカまたは分子、バイオセンサなどと接触され得る。
２６．誘発（Trigger）
４８．誘発などの用語は、反応などのイベントを開始または機動する活動をいう。
２７．検出（Detect）
４９．検出などの用語は、本開示の装置または方法における分子誘導またはマーカ誘導された細胞反応を発見または感知する能力および識別された分子に関する感知された反応を識別する能力をいう。
２８．反応（Response）
５０．反応などの用語はあらゆる刺激に対するあらゆる反応である。
２９.細胞反応（Cellular Response）
５１．細胞反応などの用語は、細胞による刺激に対するあらゆる反応である。
３０．バイオセンサ反応（Biosensor Response）
５２．バイオセンサ反応、バイオセンサ出力シグナル、バイオセンサシグナルなどの用語は、細胞反応に対する細胞を有するセンサシステムのあらゆる反応である。バイオセンサは、細胞反応を定量化できるセンサ反応に変換する。バイオセンサ反応は、ＲＷＧまたはＳＰＲなどの光学バイオセンサによって測定されたとき刺激に対して光学的な反応となり、電気バイオセンサによって測定されたとき刺激に対してバイオインピーダンス反応（bioimpedance response）となる。バイオセンサ反応は、刺激に対する細胞反応と直接的に関係している故、バイオセンサ反応と細胞反応は、本開示の実施例において相互交換可能に使用され得る。
３１．ＤＭＲ反応（DMR response）
５３．ＤＭＲなどの用語は、光学バイオセンサを使用しているバイオセンサ反応である。ＤＭＲは動的密集体再配分（dynamic mass redistribution）または動的細胞物質再配分（dynamic cellular matter redistribution）をいう。Ｐ−ＤＭＲはセンシングゾーン内に位置する増加する密集体を示すポジティブなＤＭＲ反応である。Ｎ−ＤＭＲはセンシングゾーン内に位置する減少する密集体を示すネガティブなＤＭＲ反応である。ＲＰ−ＤＭＲは、刺激性のイベント後に規定レベルに戻る密集体配分を示すリカバリＰ−ＤＭＲ反応である。
３２．反応の分析（Assaying the response）
５４．「反応の分析」は、反応を特徴付ける手段を使用することを意味する。例えば、もし、分子が細胞と接触した場合、バイオセンサは分子への露出における細胞の反応を分析するために使用され得る。
３３．プロファイル（A profile）
５５．プロファイルなどの用語は、細胞などの組成に関して集められたデータをいう。プロファイルは、ここに記載されているように、ラベルフリーバイオセンサから集められ得る。
３４．１次プロファイル（Primary profile）
５６．１次プロファイルなどの用語は、分子が細胞と接触したときに生成されるバイオセンサ反応、バイオセンサ出力シグナルまたはプロファイルをいう。典型的には、１次プロファイルは、正味ゼロのバイオセンサシグナル（すなわちベースライン）に対する初期細胞反応の規格化のあとに得られる。
３５．２次プロファイル（Secondary profile）
５７．２次プロファイルなどの用語は、分子の存在下においてマーカに反応する細胞のバイオセンサ反応またはバイオセンサ出力シグナルである。２次プロファイルは、マーカ誘導された細胞反応またはバイオセンサ反応を変調する分子の能力のインジケータとして使用され得る。
３６．変調プロファイル（Modulation profile）
５８．変調プロファイルなどの用語は分子の存在下におけるマーカの２次プロファイルとあらゆる分子の不存在下におけるマーカの１次プロファイルとの間の比較である。比較は、例えば、２次プロファイルから１次プロファイルを差し引く、または１次プロファイルから２次プロファイルを差し引く、または２次プロファイルを１次プロファイルに対して規格化することによりなされる。
３７．ライブラリ（Library）
５９．ライブラリなどの用語はコレクションである。ライブラリはここに開示されたあらゆるもののコレクションであり得る。例えばインデックスのコレクション、インデックスライブラリであり得る。すなわち、それは、プロファイルのコレクション、プロファイルライブラリであり得る。または、それは、ＤＭＲインデックスのコレクション、ＤＭＲインデックスライブラリであり得る。また、それは、分子のコレクション、分子ライブラリであり得る。それは細胞のコレクション、細胞ライブラリであり得る。それはマーカのコレクション、マーカライブラリであり得る。ライブラリは、例えば、ランダムまたは非ランダムであり、確定または不確定であり得る。例えば、ＤＲＭインデックスまたは既知のモジュレータのバイオセンサインデックスが開示されている。
３８．パネル（Panel）
６０．パネルなどの用語は、あらかじめ定められた標本（例えば、マーカ、細胞、経路）のセットである。パネルは、ライブラリから標本を選定することにより生成され得る。
３９．マーカパネル（Marker panel）
６１．マーカパネルなどの用語は、少なくとも２つのマーカからなるパネルである。マーカは、異なる経路、同じ経路、異なるターゲット、同じターゲットに関するものであってもよい。
４０．細胞パネル（Cell panel）
６２．細胞パネルなどの用語は、少なくとも２つの細胞のタイプからなるパネルである。細胞は、ここに開示されるどんなタイプまたは組合せであってもよい。
４１．分子の存在下（In the presence of the molecule）
６３．「分子の存在下」などの用語は、培養された細胞の分子への接触または露出をいう。接触または露出は、刺激物が細胞と接触する前またはそのときに実施され得る。
４２．バイオセンサシグナル（Biosensor Signal）
６４．バイオセンサシグナルなどの用語は、刺激による細胞の反応によって生成されたバイオセンサで測定された細胞のシグナルをいう。
４３．ＤＭＲシグナル（DMR signal）
６５．ＤＭＲシグナルなどの用語は、刺激による細胞の反応によって生成された光学バイオセンサで測定された細胞のシグナルをいう。
４４．規格化（Normalizing）
６６．規格化などの用語は、例えば、少なくとも１つの共通変数を除去するために、データ、プロファイル、反応を調整することを意味する。例えば、もし２つの反応が生じた場合（１つは細胞に作用するマーカに関するもの、１つは細胞に作用するマーカおよび分子に関するもの）、規格化は分子の不存在下におけるマーカ誘導された反応と、分子存在下における反応との比較の行為をいい、規格化された反応が、マーカに対する分子の変調に起因する反応を表すように、マーカのみに起因する反応を除去することをいう。変調比較は、分子存在下において、マーカの１次プロファイルおよびマーカの２次プロファイルを規格化することにより生成される（変調プロファイル）。
４５．コントロール（Control）
６７．コントロール、コントロールレベル、コントロール細胞などの用語は、変化が測定された標準として定義され、たとえば、コントロールは実験に左右されず、その代わりに定義済みのパラメータのセットに従う。または、コントロールは前処理レベルまたは後処理レベルに基づく。それらは、テストランと平行またはその前または後に実施され得る。または、それらは、あらかじめ定められた標準であり得る。例えば、コントロールは、実験からの結果をいい、被検体または対象物または試薬などがテスト中において、手順またはエージェントまたは可変的なその他の省略を除いて、平行した実験の場合のように扱われ、それは実験結果判定における比較の標準として使用される。従って、コントロールは、手順、エージェント、または可変的なその他のものに関係する効果を判定するために使用され得る。例えば、細胞上のテスト分子の効果が疑わしい場合、ａ）分子の存在下における細胞の特徴を単に記録し、ｂ）ａを行い、その後既知の活動または活動の欠如、またはコントロール組成（例えば分析緩衝液（ビヒクル））にコントロール分子を加えることの影響も記録し、コントロールに対するテスト分子の影響を比較することができるかもしれない。ある状況において、いったんコントロールが実行されると、コントロールは標準として使用され得る。この場合、コントロール実験を再度実施する必要はない。他の状況においては、コントロール実験は比較がなされる度に平行に実施されるべきである。
４６．ポジティブコントロール（Positive control）
６８．ポジティブコントロールなどの用語は、データコレクションに関する状態がデータコレクションをもたらし得ることを示すコントロールである。
４７．変調比較（Modulation comparison）
６９．変調比較などの用語は、１次プロファイルおよび２次プロファイルを規格化した結果である。
４８．インデックス（Index）
７０．インデックスなどの用語は、データのコレクションである。例えば、インデックスは、１つ以上の変調プロファイルを含むリスト、表、ファイル、またはカタログであり得る。インデックスはどんなデータの組み合わせからでも生成することができることが理解される。例えば、ＤＭＲプロファイルは、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、ＲＰ−ＤＭＲを有し得る。インデックスは、プロファイルの完成データ、Ｐ−ＤＭＲデータ、Ｎ−ＤＭＲデータ、ＲＰ−ＤＭＲデータ、またはこれらの中のあらゆるポイント、またはこれらまたは他のデータの組み合わせを用いて生成され得る。インデックスは、そのようなあらゆる情報のコレクションである。典型的には、インデックスを比較するとき、インデックスは同種のデータであり、すなわち、Ｐ−ＤＭＲに対してＰ−ＤＭＲデータである。
４９．バイオセンサインデックス（Biosensor Index）
７１．バイオセンサインデックスなどの用語は、バイオセンサデータのコレクションで構成されるインデックスである。バイオセンサインデックスは、１次プロファイルまたは２次プロファイルなどのバイオセンサプロファイルのコレクションであり得る。インデックスはあらゆるデータのタイプによって構成され得る。例えば、プロファイルのインデックスは、Ｎ−ＤＭＲデータポイントにより構成され得、それは、Ｐ−ＤＭＲデータポイントであってもよく、またはその両方または、インピーダンスデータポイントであってもよい。それは、プロファイルカーブ（プロファイル曲線）に関連するすべてのデータポイントであってもよい。
５０．ＤＭＲインデックス（DMR index）
７２．ＤＭＲインデックスなどの用語は、ＤＭＲデータのコレクションにより構成されるバイオセンサインデックスである。
５１．分子バイオセンサインデックス（Molecule biosensor index）
７３．分子バイオセンサなどの用語は、分子に関して収集されたデータによって生成されるバイオセンサインデックスである。例えば、分子バイオセンサインデックスは、細胞のパネルに作用している分子のプロファイルにより構成され、マーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対する分子の変調プロファイルにより構成され得る。
５２．分子ＤＭＲインデックス（Molecule DMR index）
７４．分子ＤＭＲインデックスなどの用語は、分子に関して収集されたデータによって生成されるＤＭＲインデックスである。例えば、分子バイオセンサインデックスは、細胞のパネルに作用している分子のプロファイルおよびマーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対する分子の変調プロファイルにより構成され得る。
５３．分子インデックス（Molecule index）
７５．分子インデックスなどの用語は、分子に関連するインデックスである。
５４．モジュレータバイオセンサインデックス（Modulator biosensor index）
７６．モジュレータバイオセンサインデックスなどの用語は、分子に関して収集されたデータによって生成されるバイオセンサインデックスである。例えば、モジュレータバイオセンサインデックスは、細胞のパネルに作用しているモジュレータのプロファイルおよびマーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対するモジュレータの変調プロファイルにより構成され得る。
５５．モジュレータＤＭＲインデックス（Modulator DMR index）
７７．モジュレータＤＭＲインデックスなどの用語は、分子に関して収集されたデータによって生成されるＤＭＲインデックスである。例えば、モジュレータＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用しているモジュレータのプロファイルおよびマーカのパネル、（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対するモジュレータの変調プロファイルにより構成され得る。
５６．分子変調インデックス（Molecule modulation index）
７８．分子変調インデックスなどの用語は、細胞のパネルに作用するマーカのパネルのバイオセンサ出力シグナルを変調する分子の能力を表示するインデックスである。変調インデックスは、分子の存在下におけるマーカでの刺激に対する細胞の反応の特定のバイオセンサ出力シグナルパラメータを、あらゆる分子の不存在下におけるそれに対して規格化することにより生成される。
５７．既知のモジュレータバイオセンサインデックス（Known modulator biosensor index）
７９．既知のモジュレータバイオセンサインデックスなどの用語は、既知のモジュレータに関して収集されたデータによって生成されたモジュレータバイオセンサインデックスである。例えば、既知のモジュレータバイオセンサインデックスは、細胞のパネルに作用している既知のモジュレータのプロファイルおよびマーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対する既知のモジュレータの変調プロファイルにより構成され得る。
５８．既知のモジュレータＤＭＲインデックス（Known modulator DMR index）
８０．既知のモジュレータＤＭＲインデックスなどの用語は、既知のモジュレータに関して収集されたデータによって生成されるモジュレータＤＭＲインデックスである。例えば、既知のモジュレータＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用している既知のモジュレータのプロファイルおよびマーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のため各マーカのパネル）に対する既知のモジュレータの変調プロファイルにより構成され得る。
５９．マーカバイオセンサインデックス（Marker biosensor index）
８１．マーカバイオセンサインデックスなどの用語は、マーカに関して収集されたデータによって生成されるバイオセンサインデックスである。例えば、マーカバイオセンサインデックスは、細胞のパネルに作用しているマーカのプロファイルおよびマーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対するマーカの変調プロファイルにより構成され得る。
６０．マーカＤＭＲインデックス（Marker DMR index）
８２．マーカＤＭＲインデックスなどの用語は、マーカに関して収集されたデータによって生成されるＤＭＲインデックスである。例えば、マーカＤＭＲインデックスは、細胞のパネルに作用しているマーカのプロファイルおよびマーカのパネル（細胞のパネルにおける１つの細胞のための各マーカのパネル）に対するマーカの変調プロファイルにより構成され得る。
６１．インデックスの類似性（Similarity of indexes）
８３．インデックスの類似性などの用語は、インデックスのパターンおよび／またはスコアのマトリックスに基づいて、２つのインデックス間、または少なくとも３つのインデックス間（１つは分子に関するもの）における類似性を表す用語である。スコアのマトリックスは、対応する細胞における異なる分子の１次プロファイルのサイン、および各マーカに対する異なる分子の変調プロファイルの性質およびパーセンテージのように、それらのカウンターパートに強く関係している。例えば、より高いスコアは、より類似している特徴に対して与えられる。より低いまたは負のスコアは非類似の特徴に対して与えられる。分子変調インデックスにおいて見いだせる変調のタイプは、ポジティブ、ネガティブ、ニュートラルの３つしかない故、類似性マトリックスは比較的単純である。例えば、単純なマトリックスは、同一の変調（例えばポジティブな変調）にスコア＋１を割り当て、非同一の変調にスコア−１を割り当てる。
８４．あるいは、異なるスコアが変調のタイプに関連して与えられ得るが、異なるスケールで与えられ得る。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、１００％、２００％というポジティブな変調は、これらに相応して、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋１０、＋２０というスコアが与えられ得る。逆に、ネガティブな変調に対しては、同様にしかし逆のスコアが与えられ得る。このアプローチに従えば、マーカのパネルに対するＨＡ−１０７７の変調インデックスは、図９Ｃに示されるように、ＰＫＡ／ＰＫＧ抑制剤ＨＡ１０７７は、異なるマーカによって誘導されたバイオセンサ反応を異なるように変調することを示している。すなわち、Ａ５４９細胞において、ピナシジル（−８６％）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（＋１８％）、ＰＭＡ（＋３６％）、ＳＬＩＧＫＶ-アミド（＋２２％）、フォルスコリン（＋１８％）、ヒスタミン（初期のＰ−ＤＭＲ、＋２６％）、ヒスタミン（末期のＰ−ＤＭＲ、＋５５％）、および静止状態のＡ４３１細胞において、エピネフリン（−３８％）、ニコチン酸（＋８％）、ＥＧＦ（Ｐ−ＤＭＲ（＋１９％））、ＥＧＦ（Ｎ−ＤＭＲ（−２０％））、ヒスタミン（−５０％）。従って、同格関係におけるＨＡ１０７７変調インデックスのスコアは、(−８．６、 １．８、 ３．６、 ２．２、 １．８、 ２．６、 ５．５、 −３．８、 ０．８、 １．９、 −２、 −５)として割り当てられる。一方、Ｈ８に関しては、同格関係におけるそのスコアは、（−７．２、 １．８、 ２．２、 ３．２、 ２、 ３．８、 ６．５、 −１．６、 １、 ０．３、 −２、 １．６）である。
８５．ＨＡ１０７７およびＨ８のインデックスは、（１）単純なスコアマトリックスに基づいて比較され得る。これにおいて、Ａ５４９およびＡ４３１の双方におけるそれらの主要なインデックスは、類似しており（スコア＋１、＋１）、変調インデックスは類似している（スコア＋１、 +１、 +１、 +１、 +１、 +１、 +１、 +１、 +１、 +１、 +１、 -１）。（２）スケールに基づくスコアマトリックスに基づいて比較され得る。これにおいて、両スコア同格（スコアコーディネーション）は類似しており、しかし同一ではない。おそらく、細胞ターゲットに作用するそれらの潜在力差による。両方のインデックスが同じ投与量（10μＭ）を使って生成される点は注目に値する。そして（３）顕著な変調プロファイル（例えば、ピナシジル反応）を使用した分類に基づいて比較され得る。これにおいて、両分子は類似した変調をもたらす。上記の点を全て考慮すると、ＨＡ１０７７とＨ８が試験される２つの細胞株において類似した主要な活動のモードを示すと結論付けることができる。同様に、ＬＹ２９４００２およびケルセチンの両方もまた試験される２つの細胞株において類似した主要な活動のモードを示す。しかしながら、ＨＡ１０７７／Ｈ８およびＬＹ２９４００２／ケルセチンは異なる活動のモードを示す。
６２．特性づける（Characterizing）
８６．特製づけるなどの用語は、リガンド、分子、マーカまたは細胞に関するプロファイルの獲得など、物質（リガンド、分子、マーカ、または細胞など）に関するあらゆる情報を集めることをいう。
６３．増強する（Potentiate）
８７．増強する、増強されたなどの用語は、分子によって引き起こされた細胞におけるマーカのバイオセンサ反応の特定のパラメータの増加をいう。分子の存在下におけるマーカの１次プロファイルと同じ細胞における同じマーカの２次プロファイルとの比較により、分子による細胞のマーカ誘導されたバイオセンサ反応の変調を計算することができる。ポジティブな変調は分子がマーカによって誘導されたバイオセンサシグナルの増加を引き起こすことを意味する。
６４．より高いおよび抑制するなどの用語
８８．より高い、増加する、高めるまたは上昇などの用語またはこれらの用語の変形は、例えばコントロールを比較したときに、規定レベルを超えて増加することをいう。低い、より低い、減少する、低下するまたは低下などの用語またはこれらの用語の変形は、例えばコントロールを比較したときに、規定レベルを下回って減少することをいう。例えば、規定レベルは、アゴニストまたはアンタゴニストなどの分子を細胞に加える前、分子の不存在下において、分子を加えたときに生体内レベルにおいて標準的である。抑制するなどの用語は減じることまたは食い止めることをいう。
６５．分子薬理学（Molecule pharmacology）
８９．分子薬理学などの用語は、システム細胞生物学またはシステム細胞薬理学または細胞に作用する分子の活動のモードをいう。分子薬理学は、限定されないが、毒性、特定の細胞のプロセス（例えば、増殖、分化、反応性酸素種シグナリング）に影響を与える能力または、特定の細胞ターゲット（例えば、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＡ、 ＰＫＣ、ＰＫＧ、ＪＡＫ２、ＭＡＰＫ、ＭＥＫ２またはアクチン）を変調する能力によって特徴付けられる。
６６．受容体（Receptor）
９０．受容体などの用語は、移動性シグナリング（またはシグナル）分子が付着し得る細胞の原形質膜または細胞質に埋められるタンパク質分子である。受容体が結合している分子は、リガンドと呼ばれ、ペプチド（神経伝達物質など）、ホルモン、製薬または毒素である場合があり、そのような結合が生じたとき、受容体は通常、細胞反応を開始する構造的な変化を起こす。しかしながら、いくつかのリガンドはどんな反応も誘導することなく（例えばアンタゴニスト）、単に受容体をブロックする。受容体におけるリガンド誘導された変化は、リガンドの生物学的活動を構成する生理学的変化をもたらす。
６７．細胞ターゲット（Cellular target）
９１．細胞ターゲットなどの用語は、その活動が外部刺激によって変更され得るタンパク質または核酸などのバイオポリマーである。細胞ターゲットは、最も一般的には酵素、キナーゼ、イオンチャネルおよび受容体などのタンパク質である。
６８．シグナリング経路（Signaling pathway(s)）
９２．定義された経路などの用語は、シグナル（例えば外因性のリガンド）の受信から細胞反応（例えば細胞ターゲットの発現増加）までの細胞の経路（パス）である。いくつかのケースにおいて、受容体に結合しているリガンドによって引き起こされた受容体活性化は、リガンドに対する細胞の反応と直接的に結びつく。例えば、神経伝達物質ＧＡＢＡは、イオンチャネルの一部である細胞表面受容体を活性化することができる。ニューロン上のＧＡＢＡＡ受容体と結合しているＧＡＢＡは、受容体の一部である塩素選択性イオンチャネルを開く。ＧＡＢＡＡ受容体活性化は、負に荷電する塩化物イオンを、活動ポテンシャルを生じるニューロンの能力を抑制するニューロンへ移動させる。しかしながら、多くの細胞表面受容体に関して、リガンド受容体相互作用は、細胞の反応に直接的に結びつかない。リガンドの細胞のふるまいに対する最終的な生理学上の効果が生じる前に、活性化された受容体は、細胞の中の他のタンパク質と最初に相互作用しなければならない。しばしば、いくつかの相互作用している細胞タンパク質の連鎖のふるまいは、受容体活性化の後、変更される。受容体活性化によって誘発される細胞変化のセット全体は、シグナル伝達機構または経路と呼ばれている。シグナリング経路は比較的単純であるか極めて複雑であり得る。
６９．分子処理された細胞（Molecule-treated cell）
９３．分子処理された細胞などの用語は分子にさらされた細胞である。
７０．細胞プロセス（Cellular process）
９４．細胞プロセスなどの用語は、細胞によってまたは細胞内で起こるプロセスである。細胞プロセスの例には、限定されないが、増殖、アポトーシス、ネクローシス、分化、細胞シグナル伝達、極性変化、マイグレーションまたは変形などが挙げられる。
７１.期間（Period of time）
９５．期間は、時間経過を表すあらゆる期間をいう。例えば１秒、１分、１時間、１日および１年はすべて期間である。
７２．短期間（Short period of time）
９６．短期間などの用語は１分から３００分の間の期間である。
７３．別の期間（another period of time）
９７．別の期間などの用語は、ある期間に連続して生じている期間である。
７４．細胞のパネルに亘りおよびマーカのパネルに対して（across the panel of cells and against the panels of markers）
９８．「細胞のパネルに亘りおよびマーカのパネルに対して」というフレーズは、細胞のパネルにおける各細胞に作用している分子の１次プロファイルおよびマーカのパネルを変調する分子の変調プロファイルを調べるための体系的なプロセスをいう。マーカ／細胞ペアに関し、細胞の各タイプに独立に作用する分子の１次プロファイルをはじめに調べることでプロセスは開始され、これに続いて、同じ細胞において、分子の存在下においてマーカの２次プロファイルを調べる。「対し」という用語は、マーカ誘導されたバイオセンサ反応を変調する分子の能力を明示するために特異的に使用される。
７５．分子の活動のモードに関するインジケータ（indicator for the mode of action of the molecule）
９９．インジケータなどの用語は、表示するものである。特に、「分子の活動のモードのためのインジケータ」は、よく知られているモジュレータのバイオセンサインデックスと比較した分子のバイオセンサインデックスの類似性などのものを意味する。それは、分子とよく知られたモジュレータとが類似した活動のモードを共有していると解釈できる。
７６．特定の人間生理学と病態生理学の代表（representative of a particular human physiology and pathophysiolgy）
１００．代表などの用語は、標本またはあるクラスのタイプまたはものの種類となることである。例えば、ヒト肺がん細胞株Ａ５４９の細胞特性がヒト肺がんの生理学を代表すると考えられる。 したがって、Ａ５４９は、ヒト肺がんの細胞生物学および生理学を研究するためのモデル細胞株として使用される。
７７．長期間バイオセンサシグナル（long-term biosensor signal）
１０１．長期間バイオセンサシグナルは、長期の分析から生成されるバイオセンサシグナルである。
７８．長期間ＤＭＲシグナル
１０２．長期間ＤＭＲシグナルなどの用語は、長期の光学バイオセンサ細胞分析から生成される光学バイオセンサシグナルである。
７９．パニング（Panning）
１０３．パニングなどの用語は、１つ以上の受容体または細胞ターゲットの存在に関し、細胞をスクリーニングすることをいう。
８０．強いバイオセンサシグナル（Robust biosensor signal）
１０４．強いバイオセンサシグナルは、その振幅がノイズレベルまたはネガティブコントロール反応上で顕著である（例えば３ｘ、１０ｘ、２０ｘ、１００ｘ、１０００ｘ）バイオセンサシグナルをいう。ネガティブコントロール反応は、しばしば、分析緩衝液（すなわちビヒクル）を加えた後の細胞のバイオセンサ反応である。ノイズレベルは、あらゆる溶液を更に加えることをしない細胞のバイオセンサシグナルである。細胞は、あらゆる溶液の添加の前に常に溶液で覆われていることは、留意に値する。
８１．強いＤＭＲシグナル
１０５．強いＤＭＲシグナルなどの用語は、強いバイオセンサシグナルのＤＭＲ形式である。
８２．潜在力（Potency）
１０６．潜在力などの用語は、所定の強さの影響を生じることを要求される量の面から表される分子活動の大きさである。例えば、非常に強力な薬は、低い濃度でより大きな反応を引き起こす。潜在力は、親和性および効能に比例する。親和性は、薬剤分子が受容体に結合する能力である。
８３．効能（Efficacy）
１０７．効能などの用語は、理想的または最適な状況の下で望ましい規模の影響を生じる能力である。効能と効果という関連した概念を区別するのはこれらの状況であり、それは現実の状況の下での変化に関するものである。効能は、受容体占有と分子、細胞、組織またはシステムレベルで反応を開始する能力との関係である。
８４．定義された経路（Defined pathway(s）)
１０８．定義された経路などの用語は、Ｇｐ経路、Ｇｓ経路、Ｇｉ経路、ＥＧＦＲ経路またはＰＫＣ経路などの特定の経路である。
８５．ネットワーク相互作用（Network interaction）
１０９．ネットワーク相互作用などの用語は、少なくとも２つの特定のシグナリングカスケードまたは経路間の相互作用である。例えば、Ａ４３１細胞のブラジキニンＢ２受容体の活性化は少なくとも２重のシグナリング経路をもたらす（すなわちＧｑおよびＧｓ経路）。これにおいて２つの経路は、互いに相互規制（cross-regulated）することができる。そのような相互規制は、ネットワーク相互作用の１つのタイプである。他の例は、Ａ４３１細胞におけるＥＧＦＲシグナリングである。それは、複合の多成分性の信号伝達経路に関連する。これらの経路は、主にネットワーク相互作用を介した、フィードバック、シグナル増幅、および多重シグナルとシグナリング経路との間の１つの細胞内における相互作用の機会を提供する。
８６．生物化学アプローチ（Chemical biology approach）
１１０．「生物化学アプローチ」などの用語は、化学技術およびツール（しばしば合成化学を通じて生産される合成物）の使用を生物学系の研究と操作に取り入れる化学的なアプローチである。いくつかの生物化学の形式は、化学レベルで生物学系を直接精査することによって生物学的問題に答えようとする。生物化学、遺伝学または分子生物学を使っている研究と対照的に、突然変異生成が新しいバージョンの生物または興味深い細胞を提供することができる所で、特定の目的のために設計されたか、生物化学または細胞ベースのスクリーンングに基づいて特定された小分子を用いて、生物化学は、試験管内で、そして、生体内でかつての精査システムを研究している。
８７．細胞生物学アプローチ（Cell biology approaches）
１１１．細胞生物学アプローチなどの用語は、細胞研究（それらの生理学上の特性、それらの構造、それらが含む細胞小器官、それらの環境に対する相互作用、それらのライフサイクル、分割と死）を含む科学的なアプローチある。これは、微視的および分子レベルの双方でなされる。細胞の構成要素および細胞がいかに働くかを知ることは、すべての生物科学の基本となる。
８８．バイオセンサ細胞分析を中心とした細胞プロファイル薬理学（Biosensor cellular assay-centered cell profile pharmacology）
１１２．バイオセンサ細胞分析を中心とした細胞プロファイル薬理学などの用語は、ラベルフリーバイオセンサ細胞分析を使用している分子の薬理学を判定する方法である。
８９．システム生物学（Systems biology）
１１３．システム生物学などの用語は、混合物内およびそれらが機能する生理学的環境における生物学的プロセスの体系的なインターロゲーションである。
９０．システム薬理学（Systems pharmacology）
１１４．システム薬理学などの用語は、薬理学ゴールの追求において、システム生物学を使用することである。
９１．マーカのバイオセンサシグナルを変調する（Modulate the biosensor signal of a marker）
１１５．「バイオセンサシグナルを変調する」などの用語は、バイオセンサシグナルまたはマーカによる刺激に反応する細胞のプロファイルの変化を引き起こすことである。
９２．ＤＭＲシグナルを変調する（Modulate the DMR signal）
１１６．「ＤＭＲシグナルを変調する」などの用語は、ＤＭＲシグナルまたはマーカによる刺激に反応する細胞のプロファイルの変化を引き起こすことである。
９３．（薬剤候補分子の）直接作用（Direct action (of a drug candidate molecule)）
１１７．直接作用などの用語は、細胞に独立に作用している（薬剤候補分子の）結果である。
９４．細胞プロファイル薬理学
１１８．細胞プロファイル薬理学などの用語は、分子による個々または全体的な刺激に反応する細胞の１次プロファイル、および分子の不存在下にけるマーカ分子のパネルによる個々または全体的な刺激に反応する細胞の２次プロファイルを生成するために、ラベルフリーバイオセンサ、特に光学バイオセンサを使用している。、１次プロファイルおよび２次プロファイルの双方のコレクションおよびそれらの結果として生じる変調プロファイルが、個々にまたは全体的に使用され、分子の薬理を判定する。
９５．分子の不存在および存在下における細胞／マーカのキネティック反応（Kinetic response of the cells/markers in the absence and presence of a molecule）
１１９．「分子の不存在および存在下における細胞／マーカのキネティック反応」などのフレーズは、分子の不存在下および存在下におけるマーカによって誘導された細胞反応の全体分析または部分分析時系列をいい、それは例えば、パターン認識分析を用いた薬理学または分子の活動のモードを調べるために直接に使用され得る。
９６．付着する（Attach）
１２０．「付着する」、「付着」、「接着する」、「接着した」、「接着性の」「不動化した」などの用語は、例えば、本開示の表面修飾物質、適合化剤、細胞、リガンド候補分子および同様の主体を、物理吸着、化学的結合および同様のプロセスまたはこれらの組み合せによって表面に固定化するまたは不動化することを一般的にいう。特に、「細胞付着」、「細胞吸着」などの用語は、表面への細胞の結合または相互作用を言い、例えば、培養による、または、アンカー物質、適合化剤（例えばフィブロネクチン、コラーゲン、ラミン、ゼラチン、ポリリジン、その他）での相互作用による、または、実体によるものである。「付着細胞」、「固定化された細胞」などの用語は、原核または真核細胞などの気質の外面に付随し、固定化され、接触してとどまっている細胞または細胞核または細胞システムをいう。培養した後のそのようなタイプの細胞は、付着したまま洗浄および培地交換に耐え、生存することができる。プロセスは多くの細胞ベースの分析に不可欠である。
９７．弱い付着細胞（Weakly adherent cells）
１２１．弱い付着細胞は、細胞培養の間、基質の表面と弱く相互作用するまたは付随するまたは接触する、原核または真核細胞などの細胞または細胞株または細胞システムをいう。しかしながら、これらのタイプの細胞、例えばヒト胎児由来肝臓（ＨＥＫ）細胞などは洗浄または培地交換などの物理的に阻害する方法によって基質の表面から容易に分離される。
９８．浮遊細胞（Suspension cells）
１２２．浮遊細胞は、培地内で好ましく培養されている細胞または細胞株をいい、細胞は、培養の間、基質の表面に付着または接着しない。しかしながら、浮遊細胞は、一般に、化学的手段（例えば共有結合または抗体-細胞表面受容体相互作用）または物理的手段（例えば、定着、重力により、バイオセンサが埋められるウェルの底）によってバイオセンサ表面と接触する。
９９．対象（Subject）
１２３．至るところに使用されるように、対象などの用語は個体を意味する。従って、「対象」は、例えば猫、犬、などの飼いならされた動物、家畜（例えば、牛、馬、豚、羊、山羊など）、実験動物（例えば、マウス、うさぎ、ラット、モルモットなど）および哺乳類、人間以外の哺乳類、霊長類、人間以外の霊長類、齧歯動物、鳥、爬虫類、両生類、魚および他のどの動物も含み得る。ある態様において、対象は、例えば霊長類または人間などの哺乳類である。対象は人間でなくてもよい。
１００．随意的な（Optional）
１２４．「随意的な」、「必要に応じて」などの用語は、後に記述されるイベントまたは状況が起こるまたは起こらないことを意味し、および、記述がイベントまたは状況が起こる場合または、それが起こらない場合を含んでいることを意味する。例えば、「必要に応じて、組成は組み合わせからなることができる」というフレーズは、記述が組み合わせおよび組み合わせの不存在（すなわち、組合せの個々の要素）の双方を含むように、組成が異なる分子の組合せから成り得るまたは組合せを含まないかもしれないことを意味する。
１０１．A
１２５．明細書および添付された請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの用語は、文脈が別の方法で明確に指示しない限り、複数の指示物を含む。従って、たとえば、「製薬キャリア」という言及は、そのような２以上のキャリアの混合物を含む。
１０２．省略（Abbreviations）
１２６．技術の通常の知識を有する者によく知られている省略が、使用されている。（例えば時間に「ｈｒ」、グラムに「ｇ」または「ｇｍ」、ミリリットルに「ｍＬ」および室温に「ｒｔ」、ナノメートルに「ｎｍ」、モルに「Ｍ」などの省略）
１０３．範囲（Range）
１２７．範囲は、「およそ」１つの特定の値からおよび／または「およそ」他の特定の値までとしてここに示される。そのような範囲が示されたとき、他の実施例は、当該１つの特定の値からおよび／または当該他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として示されたとき、前例の「およそ」の使用により、特定の値は、他の実施例を形成すると理解されるであろう。範囲の各々の終点が、他の終点との関係においておよび他の終点と独立して、有意であるとさらに理解されるであろう。また、ここに明らかにされた多くの値があり、そして、各値がその値自体に加えて特定の値である「およそ」としてここに開示されていることも理解されるであろう。例えば、もし値１０が開示されているとき、約１０もまた同時に開示されている。熟練した職人によって適切に理解されるように、ある値が「その値よりも小さいまたは等しい」と開示されているとき、その値は、「その値より大きいまたは等しい」および値の間のとりえる範囲も開示されていると理解される。例えばもし、値「１０」が開示されている場合、「１０未満または１０に等しい」および「１０より大きいまたは１０に等しい」も開示される。この出願のいたるところに、データはいくつかの異なるフォーマットで提供されており、このデータは、終点および始点およびデータポイントのあらゆる組み合わせに関する範囲を示していることも理解される。例えば、もし、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示されている場合、より大きい、より大きいまたは等しい、より少ない、より少ないまたは等しい、１０および１５に等しい値が１０と１５の間の値と同様に開示されているものと考えられると理解される。２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されていると理解される。例えば、もし、１０および１５が開示されているとき、１１、１２、１３および１４も開示される。
１０４．からなる（Comprise）
１２８．記述および本明細書の請求の範囲を通して、語「からなる」およびその語の変形は、「含むがこれに限定されるものではない」を意味し、例えば、他の追加的な、構成要素、整数またはステップを排除することを意図していない。
１０５．本質的に〜からなる（Consisting essentially of）
１２９．実施例における「本質的に〜からなる（Consisting essentially of）」とは、例えば、表面組成、表面組成を形成もしくは使用する方法、構築、またはバイオセンサの表面組成、および本開示の製品、デバイスまたは装置をいい、特許請求の範囲に記載された構成要素またはステップを含み得る。さらに、特定の反応物、特定の添加物もしくは成分、特定の薬剤、特定の細胞もしくは株化細胞、特定の表面変更因子または表面状態、特定のリガンド候補等、の変更可能な構造、材料またはプロセスなどのように、組成、物品、装置および本開示の作製および使用の方法の基本的且つ新規な性質に物質的に作用しない他の構成またはステップを含み得る。本開示の構成またはステップの基本的な性質に物質的に作用し得るかまたは本開示に望ましくない特徴を与え得る要素は、例えば、バイオセンサ表面に対する細胞の親和性の減少、細胞表面受容体または細胞内受容体に対する刺激の異常親和性、リガンド候補等の刺激物に反応する異常または反対の細胞活動、及びこれらと同様の特徴を含む。
１０６．安定な（Stable）
１３０．医薬品組成物に関して使われるとき、「安定な」などの用語は、定まった期間の特定の貯蔵条件下における有効成分の特定の損失量（通常１０％）未満の意味として技術的に理解される。組成が安定であると思われることを要求される時間は各々の製品の使用に関連し、製品を生産することの商業的実用性によって決定される。品質管理と点検のためにそれを保持し、最終的な使用の前に再びそれが貯蔵庫に保持されたところで、卸売業者に、または、直接顧客に出荷される。２、３ヵ月の時間の安全係数を含んで、医薬のための最小限の製品寿命は、通常１年、望ましくは１８ヵ月以上である。ここに使われる場合、「安定な」という語は、これらの市場現実性および、すぐに達成できる環境状況（例えば２℃〜８℃の冷蔵状態）で製品を格納および輸送する能力に及ぶ。
１０７．構成要素（Components）
１３１．開示された組成を準備するのに使用される構成要素およびここに開示された方法の中で使用される構成要素自体が開示されている。これらおよび他の材料がここに開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されているとき、様々な個々のおよび全体的な組合せの各々の特定の言及と、これらの分子の順列とがはっきりと開示されない場合であっても、各々はここにおいて熟慮され、記載されていることが理解される。従って、もし、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスと、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスと、組み合わせ分子の例Ａ−Ｄとが開示され、各々が個々に列挙されていない場合でさえ、各々が個々におよび全体的に考慮された意味のある組み合わせ、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されているものと考えられる。従って、例えばＡ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループは開示されているものと考えられる。この概念は、開示された組成の作製および使用する方法におけるステップを含む本出願のすべてのアスペクトに適用されるが、これに限定されるものではない。従って、もし、実施され得る追加のステップの多様性がある場合、これらの追加のステップの各々は、あらゆる特定の実施例または開示された方法の実施例の組み合わせで実施され得ることが理解される。
１０８．模倣する（Mimic）
１３２．ここに使用されているように、「模倣する」などの用語は、参照物体の１以上の機能を実行することをいう。例えば、分子模倣は、分子の１以上の機能を実行する。
１０９．または（Ｏｒ）
１３３．語「または」などはここで使用されているように、特定のリストのあらゆる１のメンバーを意味し、そのリストのメンバーのあらゆる組み合わせをも含む。
１１０．刊行物（Publications）
１３４．本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示の全体は、これが関係する到達技術水準について、より完全に説明するために参照によってこの出願に組み入れられる。開示された引用例は、その引用例に含まれる信頼されている文章中で論じられている材料に関し、個々におよび具体的に参照によってここに組み入れられる。
１１１．サンプル（Sample）
１３５．サンプルなどの用語は、動物、植物、菌類などを意味する。すなわち、天産物、天産物抽出物など; 動物からの組織または器官; 細胞（対象内、対象から直接とられる、または培養内に維持されたまたは培養された細胞株からの細胞のどちらでも）; 細胞可溶化物（または溶解物フラクション）または細胞抽出物; または細胞または細胞材料（例えばポリペプチドまたは核酸）に由来する一つ以上の分子を含んでいる溶液。サンプルは、ここに記載されるように分析される。また、サンプルは、細胞または細胞成分を含むどんな体液や排出物（例えば、限定されないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）であってもよい。
１１２．約（About）
１３６．例えば、構成要素の中の成分の数、濃度、体積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流速、圧力などの値およびそれらの範囲を修飾している本開示の実施例の記述において使用されている「約」は、起こることがありえる数の量における変化に言及している。（たとえば、合成物、組成、濃縮物または使用製剤を作るために使用される典型的な測定および処理手順；これらの手順における不注意によるエラー; 方法を実行するのに用いられる製品、ソース、出発材料または成分の純度における違い；などの考慮点を通して）。用語「約」は、特定の初期濃度または混合物を含む組成または製剤の老化によって異なっている量、特定の初期濃度または混合物を含む組成または製剤を混合するまたは処理することによって異なっている量を包含する。「約」という用語によって修飾されたかどうかにかかわらず、ここに添付された請求の範囲は、これらの量と等価なものを含む。
１１３．値（Values）
１３７．組成、要素、添加物、細胞タイプ、マーカなどのアスペクトおよびそれらの範囲のために開示された特定且つ好ましい値は、説明のためにのみ用いられる。それらは、定義された他の値または定義された範囲の中の他の値を除外しない。組成、装置および開示の方法は、それらが有するどんな値または値のどんな組み合わせ、特定の値、さらなる特定の値およびここに開示された好ましい値も含む。
１３８．従って、開示された方法、組成、製品および機械は、ここに論じられるように様々な構成要素、ステップ、分子、および組成などから成り、またこれらにより構成され、または本質的にこれらからなるような態様で、結合され得る。それらは、例えば、ここに定義されたようなリガンドを含む分子を特徴づけるための方法、ここに定義されたようなインデックスを生成する方法、ここに定義されたような創薬の方法においてそれらは使用され得る。
１１４．合成物および組成
１３９．合成物および組成は、この技術において標準的な意味を有する。特定の指定物（分子、物質、マーカ、細胞または試薬組成など）からなる、またこれらの指定物により構成される、また本質的にこれらの指定物からなる組成が開示されることが理解される。従って、特定の指定マーカが使用されている場合、そのマーカからなり、そのマーカにより構成され、または本質的にそのマーカからなる組成が開示されることが理解される。適正な特定の指定がなされた場合は常に、その指定物の合成物も開示されるものと理解される。例えば、もし、ＥＧＦなどの特定の生物学的材料が開示された場合、その合成物形式におけるＥＧＦも開示される。
Ｂ．組成、方法、製品および装置
１４０．製薬およびバイオテクノロジー産業は、一見対立するゴールによる課題を抱えている。（１）新薬のために低消耗を達成すること、（２）市場への新薬の導入時間を減らすこと。創薬は、ほとんど無制限の数の化学物質から望ましい薬理学上および生理学上の性質を有する捉えどころのない分子を選ぶことを必要とする。残念なことに、薬の選択は、とても費用が高く、本質的に低効率プロセスであり得る。 先進技術への相当な投資にもかかわらず、新薬承認の数は、近年低いままであった。現在の研究開発生産性のギャップは −１年につき採用される新薬候補の数に対する製薬研究開発費の増加額 − 広範囲にわたる懸念、およびその問題とその潜在的解決に関するいくつかの異なる意見を生みだした。
１４１．状況を激化させるために、ジェノミクスとプロテオミクスの最近の進歩は、新薬の潜在的目標数をかなり増やした。目的指向型の創薬技術は、既知の目的に対する前の成功にもかかわらず、新たな目的（すなわち、前の薬剤の目的ではない分子）に対して薬剤を供給することがしばしばできなかった。注目すべきは、過去１０年の間、そのような「革新的な」目標に対して、全産業で平均して１年につき２〜３つの小分子薬だけであった。その結果、多くの企業は、創薬および開発において使われるツール、技術および実践を再検査している。この内省は、特に創薬において、システム生物学およびシステム薬理学ベースの評価および薬剤作用の検証、およびさらなる生理学関連技術の必要性をハイライトした。
１．分子を特徴付ける方法
１４２．創薬のためのラベルフリーバイオセンサ細胞分析を使用する方法が開示されている。とくに、創薬のためのラベルフリーバイオセンサ細胞分析を中心とする細胞プロファイル薬理学に関する方法が開示されている。本方法は、人間生理学および人間病態生理学を代表する異なるタイプの細胞のパネルへの作用を直接モニタすることにより、およびマーカ分子のパネルを用いて、個々にまた全体的に、刺激に反応する各細胞のバイオセンサシグナルを変調する薬剤候補分子の能力を判定することにより、薬剤候補分子のシステム細胞薬理学を判定するラベルフリーバイオセンサの使用を含む。細胞に対する分子の直接作用は１次プロファイルをもたらす一方、マーカ誘導されたバイオセンサシグナルに対する分子の変調は、２次プロファイルという結果をもたらす。両タイプのプロファイルは、通常、リアルタイム動的細胞反応として記録される。分子の不存在下における１次プロファイルとマーカのパネルが作用している複数の細胞に亘る分子の存在下における２次プロファイルを結合することにより、これらのマーカに対する分子の変調プロファイルのパネルがもたらされる。変調プロファイルの全体または一部のパネルは、ＤＭＲインデックスの如きバイオセンサインデックスなどの変調インデックスを生成するために結合され得る。分子インデックスと薬理学的に知られた分子のパネルの確立されたインデックスとを比較することにより、細胞受容体、ターゲット、分子が介在する経路を割り出すことが可能となる。この細胞プロファイル薬理学アプローチは、あらゆる分子の活動（例えば、ターゲット、経路、アゴニズムまたはアンタゴニズム、または毒性）のモードに関する情報を提供するだけでなく、それらの潜在力、選択性およびシステム細胞薬理学の割り出しを可能とする。
１４３．本創薬のアプローチおよび本方法は、限定されるものではないが、物質、分子、リガンド、マーカ、分子、組成、未知の分子、既知の分子、テスト分子、薬剤候補分子、分子混合物、モジュレータ、既知のモジュレータ、細胞、アゴニスト、アンタゴニスト、ライブラリ、パネル、マーカパネル、細胞パネル、受容体、細胞ターゲット、定義された経路、分子処理された細胞、シグナル経路、付着細胞、弱い付着細胞、浮遊細胞、バイオセンサ、および対象物さえも含む、ここに開示されているあらゆる物理的構成要素を使用することができる。
１４４．本創薬のアプローチおよび本方法は、限定されるものではないが、反応、細胞反応、ＤＭＲ反応、プロファイル、１次プロファイル、２次プロファイル、変調プロファイル、バイオセンサシグナル、ＤＲＭシグナル、コントロール、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、モジュレータ比較、インデックス、バイオセンサインデックス、分子バイオセンサインデックス、分子ＤＭＲインデックス、分子インデックス、モジュレータバイオセンサインデックス、モジュレータＤＭＲインデックス、分子モジュールインデックス、既知のモジュレータバイオセンサインデックス、既知のモジュレータＤＭＲインデックス、マーカバイオセンサインデックス、マーカＤＭＲインデックス、マーカバイオセンサインデックス、マーカインデックス、インデックスの類似性、マトリックス、分子薬理学、細胞プロセス、期間、短期間、他の期間、インジケータ、人間生理学、人間病態生理学、長期バイオセンサシグナル、長期ＤＭＲシグナル、強いバイオセンサシグナル、強いＤＭＲシグナル、効率、ネットワーク相互作用、生物化学、細胞分析を中心とする細胞プロファイル薬理学、システム細胞薬理学および細胞プロファイル薬理学を含む、ここに開示されたあらゆる物理的／而上学的構成要素または情報関連構成要素を使用することができる。
１４５．本創薬のアプローチおよび本方法は、限定されるものではないが、変調、細胞培養、分析、長期間分析、短期間分析、２ステップ分析、パルス刺激分析、処理、接触、誘発、検出、反応分析、規格化、特徴づけ、増強、パニング、バイオセンサシグナル変調、ＤＭＲシグナル変調、および付着を含む、ここに開示されたあらゆる方法要素を使用することができる。
１４６．構成要素のどれもが、少なくとも上記の構成要素リスト上において列挙された構成要素に関し、あらゆる組み合わせにおいて使用され得、各順列は具体的にここに列挙されていることが理解される。
１４７．細胞プロファイル薬理学ベース創薬のために、異なるタイプの細胞のパネルを判定するマトリックスが開示される。
１４８．ある実施例においてヒト細胞は、薬剤候補分子などの分子の薬理学を割り出すために使用される。候補薬の薬理学を割り出すためのヒト細胞の全てのタイプを使用することは実際ほとんど不可能である。薬剤候補分子の可能性およびドラッガビリティをアンサンブルするために、異なる細胞のパネルが、特定の目的のために選択され、使用され得る。例えば、広いスペクトラムタイプの細胞のパネルが潜在的副作用を評価するために使用される一方、特定疾患を治療する分子の潜在力および効能を判定するために特定疾患関連細胞のパネルが使用される。一方で、特定の器官からの細胞のパネルが分子の特異性を調べるために使用され、特定のターゲットのための細胞のパネルが同一のターゲット介して作用している分子の広いかかわり合いを判定するために使用される。各細胞の特定の細胞バックグラウンドに起因して、特定の細胞ターゲットの活動の変調が、異なる細胞反応（しばしば細胞状況依存的な「表現型」反応と呼ばれる。）をもたらすことが知られている。薬剤候補分子は同一の細胞ターゲットの活動を変調する機能的選択性を示すことができる。従って、同じターゲットを発現する異なるタイプの細胞に亘って異なる細胞反応をもたらす。
ａ）シグナリング経路および細胞ターゲット
１４９．細胞の各タイプに関し、マーカ／細胞ターゲット／経路のパネルの使用が開示されている。マーカ／細胞ターゲット／経路の選択は、各細胞のタイプにおけるＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルを誘発するそれらの能力に関してリガンドのパネルの先決を開始し、各リガンドのシステム細胞生物学（例えば、経路、ターゲットのリガンド誘導された変調から下流を含むネットワーク相互作用）およびシステム細胞薬理学（例えば、ターゲット特異性および潜在力および効能）を割り出すための生物化学変調プロファイルリングがこれに続く。リガンドは、（１）そのリガンドが、バイオセンサ細胞分析を使用している細胞内において強いバイオセンサシグナルを生成しているとき、（２）リガンドバイオセンサシグナルが少なくとも１つの特定の細胞シグナリング経路および／または少なくとも１つの特定のターゲットを媒介する少なくとも１つの特定の細胞プロセスの特徴であるときマーカとしての資格を得ることができる。
１５０．マーカは、細胞パネルにおける細胞の各タイプに関して異なる場合がある。例えば、細胞１に関してマーカＡおよびＢおよびＣが使用され得る。一方、細胞２に関してマーカＤおよびＥおよびＦが使用され得る。他の実施例において、少なくとも１つのマーカは、パネルにおける細胞の少なくとも２つのタイプにおいて共通である。例えば、ヒスタミンはパネルにおけるＡ５４９およびＡ４３１の双方においてマーカとして使用され得る。他の実施例において、パネルにおける各細胞のためのマーカの数は異なる場合がある（例えば細胞１に対して１つのマーカ、細胞２に対して２つのマーカ、細胞３に対して２つのマーカ、細胞４に対して４つのマーカ）。他の実施例において、パネルにおける各細胞のためのマーカの数は同一であり得る（例えば、各細胞に対して１つのマーカ、または各細胞に対して２つのマーカ、または各細胞に対して３つのマーカ）。
１５１．実施例において、マーカのパネルが、細胞シグナリング経路の多数を包括的にカバーするために選択される場合がある（例えば、Ｇｑ経路に対して１つのマーカ、Ｇｉ経路に対して１つのマーカ、Ｇｓ経路に対して１つのマーカ、ＥＧＦＲ経路に関して１つのマーカ、トール様受容体経路に関して１つのマーカなど）。ある実施例においては、マーカのパネルは、興味深い特定の病気に応じて（炎症性疾患、伝染病、ガン、糖尿病、肥満、ニューロン疾患、自己免疫疾患、喘息の気道炎症、ＣＯＰＤの気道病理学、アルツハイマー病、白斑症、結腸直腸がん、膵性腺癌またはウイルス誘導された気道炎症など）シグナリング経路の特定のセット（例えば、ＰＩ３Ｋ経路、Ａｋｔ経路、ＰＫＡ経路、ＭＡＰＫ経路、ＪＮＫ経路、トール様受容体経路、Ｇｐ経路、Ｇｓ経路、Ｇｉ経路、Ｇ１２／１３経路、ＥＧＦＲ経路、ｍＴＯＲ経路、またはＩＫＫ経路など）をカバーするために選択される場合がある。
１５２．主要な細胞シグナリング経路は、限定されるものではないが、１４−３−３誘導された細胞内シグナリング（例えば、細胞周期制御、アポトーシス）、アクチンベース運動性ＲｈｏファミリーＧＴＰアーゼ、ｃＡＭＰ−ＰＫＡ 経路、ＧＰＣＲｓ媒介Ｇｓ経路, ＧＰＣＲｓ媒介Ｇｑ 経路、ＧＰＣＲｓ媒介Ｇｉ経路, ＧＰＣＲｓ媒介Ｇ１２/１３ 経路 , ＡＩＦ 経路, Ａｋｔ シグナリング, 上皮細胞内のアルドステンシグナリング, ＡＭＰＫエンザイム混合経路, ＭＨＣｓによる抗原プロセッシングおよび プレゼンテーション, 細胞死受容体を介したまたはＨＩＶ１によるアポトーシス, 苦味シグナリング, ｃＡＭＰ 経路, ヘルパーＴ細胞内のＣＤ２８ シグナリング, 細胞アポトーシス経路,セラミド経路, ケモカインシグナリング, ＣＲＥＢ 経路, サイクリンおよび 細胞周期制御, ｅＮＯＳシグナリング, ＥＲＫシグナリング, エストロゲン経路, ＦＡＫシグナリング, ＦＧＦ経路, G-・γ シグナリング, ＧＰＣＲ経路, 成長ホルモンシグナリング, ＧＳＫ３シグナリング, インターロイキン（例えば ＩＬ−１, ＩＬ−２, ＩＬ−２２, ＩＬ−３, ＩＬ−２３, ＩＬ−９） 経路, ｉＮＯＳシグナリング, インスリン受容体経路, インテグリン経路, インターフェロン経路, 細胞内カルシウムシグナリング, ＩＰ３経路, ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路, ＪＮＫ経路, ＭＡＰＫシグナリング, ミトコンドリアのアポトーシス, ｍＴＯＲ経路, ＮＦ−・Ｂ経路, ＮＧＦ経路, ノッチシグナリング, ｐ３８シグナリング, アポトーシス媒介ｐ５３, ＰＤＧＦ経路, ホスホリパーゼＣ経路, ＰＩ３Ｋシグナリング, ＰＫＡシグナリング,ＰＫＣ経路, ＰＴＥＮ経路, Ｒａｃ１経路, ＲＡＮＫ経路, Ｒａｐ１経路, Ｒａｓ経路, ＲｈｏＡ経路, ＲＮＡｉ経路, ｓｉＲＮＡ経路, ＳＭＡＤシグナリング, ＳＴＡＴ３経路, ＳＵＭＯ経路, Ｔ細胞受容体シグナリング, ＴＧＦ−β経路, トロンビンシグナリング, ＴＮＦシグナリング, トール様受容体経路, ＶＥＧＦ経路,ＷＮＴシグナリングを含む。これらの多くの経路およびシグナリングイベントが多くの収束点（インテグレータポイントまたはジョイントと称される）を共有し、および互いに相互作用しているので、ここに開示されるバイオセンサ細胞分析はシグナリングおよびネットワーク相互作用に関する情報を提供することができる。ここに提供されるように細胞プロファイル薬理学創薬のために、マーカ／ターゲット／経路のパネルに含まれるこれらの全ての経路を持つ必要はない。
１５３．バイオセンサ細胞プロファイル薬理学ベースの発見のための複数のタイプの分析の使用が開示されている。１つの実施例において、長期間バイオセンサ細胞分析が細胞のパネルにおける分子の長期間の影響を調べるために使用される。ここで、各細胞のタイプは長期間（例えば８時間、１６時間、２４時間、３２時間、４８時間、７２時間）分子にさらされるのみである。この長時間分析は、健全な細胞状態に対する分子の影響を判定するために使用される（例えば、生存度、アポトーシス、細胞周期制御、細胞接着度、増殖）。また、この長期間分析は、初期細胞反応（例えば分子刺激の後１０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分）を含み、分子誘導された細胞シグナリングイベントまたは経路を調べるために直接的に使用され得る。
１５４．他の実施例において、マーカの存在下における長期間のバイオセンサ細胞分析は、分子とマーカ間の細胞生物学および生理学上の長期間影響の相互規制を調べるために使用される。マーカは、分子の前または同時または後に添加され得る。例えば、マーカ（例えばＨ２Ｏ２）が細胞パネルにおける少なくとも１つのタイプの細胞のアポトーシスを誘発するとき、分子が保護性であるか否かを判定するためにそのような長期分析を使用することができる。
１５５．他の実施例において、ＤＭＲシグナルなどの分子誘導されたバイオセンサシグナルを調べるためにはじめに細胞パネルにおける細胞の各タイプが分子にさらされ、これに続いて特定のマーカまたはマーカのパネルが独立に処理される一方、少なくとも２ステップ分析が使用される。この分析はしばしば２モード分析と称される（はじめのアゴニズムモードおよびこれに続くアンタゴニズムモード）。アゴニズムモードは、ＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルを誘発する分子の能力を判定することを企図している。一方、アンタゴニズムモードは、マーカのパネル（細胞パネルにおける１つの細胞タイプのための各マーカのパネル）のＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルを変調する分子の能力を判定することを企図している。
１５６．他の実施例において、パルス刺激分析が使用され得る。これにおいて、細胞は非常に短い時間（例えば数秒または数分）分子にさらされるのみである。このパルス刺激分析は、細胞／ターゲットに作用する分子のキネティクスおよびマーカ誘導されたＤＭＲシグナルに対するその影響を調べるために使用され得る。パルス刺激分析は、分子添加直後の所定時間に、液体処理装置によって単に分子溶液を細胞分析緩衝液と置き換えることで実施することができる。
２．インデックスの生成方法
１５７．薬剤候補分子などの分子のシステム細胞薬理学を調べる方法が開示されている。その方法は、分子のシステム細胞薬理学の直接分析、または分子−およびよく知られたモジュレータ（例えばＰＩ３Ｋ抑制剤、ＰＫＡ抑制剤、ＧＰＣＲアンタゴニスト、ＧＰＣＲアンタゴニスト、ＲＴＫ抑制剤、ＥＧＦＲ中和抗体またはホスホジアステラーゼ抑制剤、ＰＫＣ抑制剤または活性化因子）誘導されたＤＭＲインデックスなどのバイオセンサシグナル間のパターン認識に基づく間接分析のためのＤＭＲインデックスなどのバイオセンサシグナルインデックスの生成を含む。
１５８．１つの実施例において、方法は、（１）アゴニストモードにおける分子のＤＭＲ反応などのバイオセンサ反応を収集するステップ、（２）分子の不存在下および存在下において細胞パネルにおけるマーカのパネルのＤＭＲ反応などのバイオセンサ反応を収集するステップ、（３）ＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルの各々からＤＭＲパラメータなどのバイオセンサ反応パラメータの特定のセットを抽出するステップ、（４）ポジティブコントロール（すなわち、あらゆる分子の不存在下におけるマーカで処理された細胞）に対して各パラメータを規格化し、変調（増強または抑制または無変調を示すことができる）のパーセンテージを生成するステップ、（５）マーカ／細胞の関数として各パラメータの変調のパーセンテージをプロットし、分子のバイオセンサシグナルを生成するステップ、（６）分子誘導されたバイオセンサシグナルインデックスと、既知のモジュレータバイオセンサシグナルインデックスのライブラリ、またはあらゆる分子誘導されたバイオセンサシグナルインデックスのライブラリを、細胞／マーカのパネルに対して比較するステップ、を含む。
１５９．１つの実施例において、方法は、（１）アゴニストモードにおける分子のＤＭＲ反応を収集するステップ、（２）分子の不存在下および存在下において細胞パネルにおけるマーカのパネルのＤＭＲ反応を収集するステップ（３）ＤＭＲシグナルの各々からＤＭＲパラメータの特定のセットを抽出するステップ（４）ポジティブコントロール（すなわち、あらゆる分子の不存在下におけるマーカで処理された細胞）に対して各ＤＭＲパラメータを規格化し、変調（増強または抑制または無変調を示すことができる）のパーセンテージを生成するステップ、（５）マーカ／細胞の関数として各ＤＭＲパラメータの変調のパーセンテージをプロットし、分子のＤＭＲインデックスを生成するステップ、（６）分子誘導されたＤＭＲインデックスと既知のモジュレータＤＭＲインデックスのライブラリ、またはあらゆる分子誘導されたＤＭＲインデックスのライブラリとを、細胞／マーカのパネルに対して比較するステップ、を含む。
１６０．ＤＭＲインデックスなどの分子バイオセンサシグナルインデックスとＤＭＲインデックスなどのモジュレータバイオセンサシグナルインデックスとの間の類似性が分子の活動のモード（例えばターゲット、アゴニスズムまたはアンタゴニズムおよび潜在力または効能）のインジケータとして使用され得る。ＤＭＲインデックスなどの分子バイオセンサシグナルインデックスがＤＭＲインデックスなどのモジュレータバイオセンサシグナルインデックスに近づくほど、モジュレータが作用する同じターゲットを分子が変調する可能性が高くなる。アゴニストモードにおけるＤＭＲシグナルなどの分子バイオセンサシグナルは、ＤＭＲインデックスなどのバイオセンサシグナルインデックス内に含まれ得る。
１６１．ある実施例において、分子は、１つのインデックスと他のインデックス（例えば既知のマーカインデックスに対する分子インデックス）との間で少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％の類似性を有していると特定される。しかしインデックスが作り出される多くの点（例えばプロファイルからのＰ−ＤＭＲデータ）で、類似性が判定されることがある。この例では、類似性は２つ方法のうちの１つにおいて判定され得る。すなわち、１）各インデックスに関してすべてのＰ−ＤＭＲデータポイントのうちの少なくとも例えば８０％、または２）各インデックスに関して各データポイントで少なくとも８０％の類似性。
１６２．ある実施例において、分子の活動のモードは、マーカインデックスのライブラル、モジュレータインデックスまたはあらゆる分子インデックスとの比較による従来の分子インデックスのパターン認識分析を用いて特性される。
１６３．ある実施例において、分子の活動のモードはスコアのマトリックスを用いて特定される。対応する細胞における異なる分子の１次プロファイルのサイン、および各マーカに対する異なる分子の変調プロファイルの性質やパーセンテージのように、スコアのマトリックスは、それらのカウンターパートに強く関係している。例えば、より高いスコアは、より類似している特徴に与えられ、より低いスコアまたは負のスコアは非類似の特徴に与えられる。分子変調インデックスにおいて見いだせる変調のタイプは、ポジティブ、ネガティブ、ニュートラルの３つしかない故、類似性マトリックスは比較的単純である。例えば、単純なマトリックスは、＋１のスコアの同一の変調（例えポジティブな変調）および−１のスコアの非同一の変調を割り当てる。代替の実施例において、異なるスコアが１つのタイプの変調ではあるが異なるスケールをもつ変調に対して与えられる。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、１００％、２００％などのポジティブな変調は、相応して、スコア＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、＋６、＋１０、＋２０が与えられる。一方、ネガティブな変調に関しては、同様に、しかし逆のスコアが与えられ得る。このアプローチに従えば、マーカのパネルに対するＨＡ−１０７７の変調インデックスは、図９Ｃに示されるように、ＰＫＡ／ＰＫＧ抑制剤ＨＡ１０７７が異なるマーカによって誘導されたバイオセンサ反応を異なるように変調することを示す。すなわち、Ａ５４９細胞において、ピナシジル（−９５％）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（＋１８％）、ＰＭＡ（＋３６％）、ＳＬＩＧＫＶ-アミド（＋２２％）、フォルスコリン（＋１８％）、ヒスタミン（＋２６％）、および静止状態のＡ４３１細胞においてエピネフリン（−３８％）、ニコチン酸（＋８％）、ＥＧＦ（Ｐ−ＤＭＲ（＋１９％））、ＥＧＦ（Ｎ−ＤＭＲ（−２０％））、ヒスタミン（−５０％）。従って、同格関係におけるＨＡ１０７７変調インデックスのスコアは、（−９．５、１．８、 ３．６、 ２．２、 １．８、 ２．６、 −３．８、 ０．８、 １．９、 −２、−５）のように割り当てられる。同様に、Ｈ８に関しては、同格関係におけるそのスコアは、（−７．２、 １．８、 ２．２、 ３．２、 ２、 ３．８、 ６．５、 −１．６、 １、 ０．３、 −２、 １．６）である。ＨＡ１０７７とＨ８との間でスコアを比較することにより、両分子は、試験される２つの細胞株において類似の活動のモードを示すと結論付けることができる。
３．創薬の方法
１６４．薬剤候補分子を含むあらゆる分子のシステム薬理学およびシステム細胞薬理学評価のための方法が開示されている。方法は、ＤＭＲインデックスなどの、分子のバイオセンサインデックスを作成するために細胞/ターゲット/マーカ/経路の選択に頼る。分子のＤＭＲシグナルなどのバイオセンサシグナルを誘発する能力およびＤＭＲシグナルなどのマーカ誘導されたバイオセンサシグナルを変調する能力の分析は、異なる分析のタイプと併せて、分子の統合的薬理学を体系的な評価をもたらす。
１６５．開示された創薬のための細胞プロファイル薬理学アプローチの原理を示す図１を参照する。この例において、２つの細胞のタイプ、細胞１および細胞２が使用されている。この２つの細胞のタイプは、関連があってもなくてもよい。各細胞のタイプのための２つの分析のタイプ、すなわち、分子のみによる長期間分析、および２ステップ（または２モード）分析などの短期間分析である。長期間分析は、健全な細胞状態に対する分子の影響（例えば、増殖率、細胞周期制御、毒性、細胞接着の変更など）を判定するために使用される。この２モード評価は、両タイプの細胞における、ＤＭＲシグナルなどの分子誘導されたバイオセンサシグナルを判定する、はじめのアゴニストモード、およびこれに続くＤＭＲシグナルなどの、各細胞のためのマーカのパネルによって誘導された、バイオセンサシグナルに対する分子の変調を判定するアンタゴニストモードを含む。ここでは、細胞１に対してマーカＡ、ＢおよびＣまたは細胞２に対してマーカＤ、ＥおよびＦのように、各細胞は自己のマーカのパネルを有している。細胞１に対応する経路ａ、ｂおよびｃまたは細胞２に対応する経路ｄ、ｅおよびｆのように、各マーカは、異なる経路を介したシグナリングをもたらす。あるいは、これらの経路は互いに相互作用し、または、それらの少なくとも２つは、類似または同一であり得る。変調プロファイルの集合は、変調インデックスを作成するために使用され得る。分子の１次プロファイルとともに、２つの細胞のタイプおよび６つのマーカに対する分子に関するＤＭＲインデックスなどのバイオセンサインデックスが作成され得る。ＤＭＲインデックスなどのバイオセンサインデックスは、既知のモジュレータのライブラリに関するＤＭＲインデックスなどのバイオセンサインデックスのライブラリに対するパターン認識を通じて、分子薬理学を判定するためにさらに使用される。
１６６．分子薬理学判定のために、どのようにバイオセンサ細胞プロファイル薬理学ベースアプローチが使用されているかを示す図２を参照する。このアプローチは、細胞から始めて、特定の経路を介した細胞シグナリング（例えば、Ｃｑ結合ヒスタミン１受容体媒介シグナリング）を誘発するマーカのパネルに対する分子をテストし、最後に、ＤＭＲインデックスなどの既知のモジュレータ誘導されたバイオセンサシグナルインデックスのライブラリとの比較を通じたパターン認識（または特定のデータポイント）を用い、分子が作用する特定のターゲットを判定する。結果として、分子の統合的薬理学が割り出される。
１６７．開示された細胞プロファイル薬理学は、マーカ分子のパネルによる個々のまたは全体的な刺激に反応する細胞の１次プロファイルを生成するために、ラベルフリーバイオセンサ、特に光学バイオセンサを使用する。各マーカ分子は、受容体または細胞ターゲットを活性化して細胞にバイオセンサシグナルをもたらす。バイオセンサ中心測定を使用して分子薬理学を判定およびスクリーニングするための方法が開示されている。当該方法は、以下のステップを含む。
１６８．１）細胞のパネルを選択するステップ。これにおいて、細胞はマトリックスに基づいて選択される。
１６９．２）各細胞のタイプにおける細胞ターゲットおよびマーカのパネルを決定するステップ。これにおいて、マーカ分子による細胞ターゲットの変調は、定義された経路を介した細胞シグナリングをもたらすだけでなく、ラベルフリーバイオセンサによって検出されたバイオセンサシグナルをもたらす。
１７０．３）分子で各細胞を処理するステップ。
１７１．３ａ）マーカのパネルで各細胞を処理してパネルから各マーカの１次プロファイルを生成するステップ。
１７２．４）短時間の細胞反応をモニタリングして分子の１次プロファイルを生成するステップ。
１７３．５）分子処理された細胞にマーカのパネルを個別に添加するステップ。これにおいて、各マーカは特定の投与量で与えられ（例えばＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、ＥＣ１００）、各マーカのシグナルに影響を与えている分子の２次プロファイルを生成する。
１７４．６）別の期間に細胞反応をモニタリングするステップ。
１７５．６ａ）分子の存在下における各マーカの２次プロファイルと、マーカのパネルからの各マーカの１次プロファイルの各々とを比較するステップ
１７６．７）細胞のパネルに亘るおよびマーカのパネルに対する分子のバイオセンサインデックスを生成するステップ。
１７７．８）分子のバイオセンサインデックスと既知の薬理学を持つモジュレータのバイオセンサインデックスとを比較するステップ。これにおいて、分子バイオセンサインデックスとモジュレータバイオセンサインデックスとの間の類似性は、分子の活動のモードに関するインジケータである。
１７８．９）必要に応じて、細胞におけるマーカの不存在下または存在下における分子の長期間バイオセンサシグナルを生成するステップを含む。
１７９．開示された細胞プロファイル薬理学は、マーカ分子のパネルによる個々または全体的な刺激に反応する細胞の１次ＤＭＲプロファイルを生成するために、ラベルフリー光学バイオセンサを使用する。各マーカ分子は、受容体または細胞ターゲットを活性化し、細胞にＤＭＲシグナルをもたらす。バイオセンサ中心測定を使用した分子薬理学を判定およびスクリーニングする方法が開示されている。当該方法は、以下のステップを含む。
１８０．１）細胞のパネルを選択するステップ。これにおいて、細胞はマトリックスに基づいて選択される。
１８１．２）各細胞のタイプにおける細胞ターゲットおよびマーカのパネルを決定するステップ。これにおいて、マーカ分子による細胞ターゲットの変調は、定義された経路を介した細胞シグナリングをもたらすだけでなく、ラベルフリーバイオセンサによって検出されたＤＭＲシグナルをもたらす。
１８２．３）分子で各細胞を処理するステップ。
１８３．４）短時間の細胞ＤＭＲ反応をモニタリングして分子の１次ＤＭＲプロファイルを生成するステップ。
１８４．５）分子処理された細胞にマーカのパネルを個別に添加するステップ。これにおいて、各マーカは特定の投与量で与えられ（例えばＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、ＥＣ１００）、各マーカのシグナルに影響を与えている分子の２次ＤＭＲプロファイルを生成する。
１８５．６）別の期間に細胞ＤＭＲ反応をモニタリングするステップ。
１８６．７）細胞パネル全体でおよびマーカのパネルに対して、分子のＤＭＲインデックスを生成するステップ。
１８７．８）分子のＤＭＲインデックスと既知の薬理学を持つモジュレータのＤＭＲインデックスを比較するステップ。これにおいて、分子ＤＭＲインデックスとモジュレータＤＭＲインデックスとの間の類似性は、分子の活動のモードに関するインジケータである。
１８８．必要に応じて、細胞におけるマーカの不存在下または存在下における分子の長期間ＤＭＲシグナルを生成するステップを含む。
１８９．細胞システムの使用および接点測定（point-of-contact measures：例えば、細胞成長率、特定のサイトカイン放出）に大きく依存した従来のシステム生物学およびシステム薬理学ベースの創薬と異なり、開示された方法は、分子薬理学および病態生理学を調べるために、ラベルフリーバイオセンサベースのキネティック測定と併せて、異なるタイプの体内に生じた細胞または操作された細胞のパネルを使用するものである。従来のシステム生物学アプローチは、特徴づけのために大規模分析ツール（例えばタンパク質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイまたは質量分光法）を使用する。
１９０．細胞プロファイル薬理学のための体内に生じたまたは操作された細胞システムを使用する方法もまた開示されている。病気に関連する複雑性は、異なる細胞のタイプと一緒に組み合わせることにより、およびネットワーク規制および突発的な特性を引き出すために同時に複数の経路を活性化させることにより、細胞システム内に操作され得る。例えば、炎症性疾患に対する細胞システムアプローチは、内皮細胞、血中単核細胞、および複雑なサイトカインまたは免疫刺激環境の組み合わせを含み得る。
１９１．システム生物学、および特に細胞シグナリング経路の解明およびダイナミック分析は、創薬の新しい枠組みを提供する。これらの多くの、多様な、相互作用している構成要素の結合した振る舞いに対する洞察は、反復的なアプローチにおける実験的、数学的、計算科学の統合を通して成し遂げられる。病気の分子機構のこの文脈上の理解を通して、システムアプローチは、治療的な変調の規制のおよび代謝性のネットワークの特定と検証を更に容易にする可能性を有し、従って、ターゲットおよびバイオマーカ、薬剤候補の「オフターゲット」および副作用の特定を助ける。開示された方法は、例えば、分子または物質を調べるためのシステム生物学の使用を可能とする。
１９２．開示された方法は、従来のシステム生物学ベースのアプローチの利益をも有する。例えば、細胞の組み合わせ、各システムにおける刺激および読み取り、および一緒に分析されるシステムの組み合わせは、できるだけ多くの既知の疾病変調エージェントおよび薬剤を、最小限の測定のセットで検出し、区別するために使用され得る。開示された創薬アプローチは、再び最初に生物学を置いて、発見プロセスを通して生物学的洞察を適用する。それは衝突を特定し、複雑な細胞システムまたは様々な活動的な細胞、興味のある疾病状態にある経路およびネットワークのモデルとなる細胞のパネルにおいて、それらの引き出された生物学に基づいてリードを最適化する。このアプローチにおいて、薬剤候補それ自身は、ターゲット遺伝子またはタンパク質ではなく、検証に使用される。
４．バイオセンサおよびバイオセンサ分析
１９３．ラベルフリー細胞ベース分析は、通常、生体細胞における分子誘導された反応をモニタするためにバイオセンサを使用する。分子は自然に生じたもの、人工的なものであってもよく、浄化されたまたは浄化されていない混合物であってもよい。バイオセンサは、典型的には、光学的、電気的、熱量計的、音響的、磁気的などのトランスデューサを利用し、バイオセンサと接触する細胞における分子認識イベントまたは分子変調された変化を定量化可能な信号に変換する。これらのラベルフリーバイオセンサは、分子相互作用分析のために使用され、分子複合体が時間経過とともにどのように形成され、分離するかを特徴付けることを伴い、細胞が刺激に対してどのように反応するかを特徴付けることを伴う。本方法において適用することができるバイオセンサは、例えば、表面プラズモン共鳴（SPR : surface plasmon resonance）および共鳴導波グレーティング（RWG： resonant waveguide grating）バイオセンサ、共鳴ミラー、偏光解析器などの光学バイオセンサシステム、バイオインピーダンスシステムなどの電気バイオセンサシステムを含み得る。
ａ） ＳＰＲバイオセンサおよびシステム
１９４．ＳＰＲは、プリズムを使用して、表面のプラズモンを励起する導電性金属膜（例えば、金）を有する平面ガラス基板に、入射角の範囲をカバーしている偏光のウェッジを方向付ける。結果として生じるエバネッセント波は、電子電荷密度波（すなわち、表面のプラズモン）を起こし、反射光の強度低減をひきおこしながら、金の層で自由電子雲と相互作用し、および自由電子雲によって吸収される。この強度最小限が起こる共鳴角度は、センサ表面の反対の面の金層の近くの溶液の屈折率の関数である。
ｂ）ＲＷＧバイオセンサおよびシステム
１９５．ＲＷＧバイオセンサは、たとえば、基板（例えば、ガラス）、組込形格子または周期的構造による導波管薄膜および細胞層を含み得る。ＲＷＧバイオセンサは、回折格子を用いて導波管内での光の共鳴結合を利用し、解曲面の界面で全反射をもたらし、界面で次々と電磁場を生成する。この電磁場は事実上薄れていく。それは、センサ表面から指数的に減衰することを意味する。それが初期値の１／ｅにまで減衰する距離は、侵入深さとして知られており、特定のＲＷＧバイオセンサのデザインの関数であるが、一般的には２００ｎｍのオーダである。このタイプのバイオセンサは、センサ表面で、又はその近くで、細胞層のリガンド誘導された変化を特徴づけるために、そのようなエバネッセント波を利用する。
１９６．ＲＷＧ機器は、角度シフトまたは波長シフト測定に基づくシステムに細分化される。波長シフト測定において、入射波長の範囲を一定の角度でおおっている偏光は、導波管を照らすのに用いられる。特定の波長の光は、導波管に接続されて導波管に沿って伝搬する。一方、角度シフト機器では、センサはモノクロの明りで照らされ、そして、光が反響して結合される角度が測定される。
１９７．反響状況はバイオセンサの表面と直接接触している細胞層によって影響される（例えば、細胞集密度、粘着性および状態）。リガンドまたは分析体が生体細胞内の細胞ターゲット（例えば、ＧＰＣＲ、キナーゼ）と相互作用するとき、細胞層内の局所屈折率のどんな変化も、反響角度（または波長）のシフトとして検出され得る。
１９８．コーニング（登録商標）エピック（登録商標）システムは、ラベルフリー生物化学または細胞ベースの分析のために（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）、ＲＷＧバイオセンサを使用する。エピック（登録商標）システムはＲＷＧプレートリーダと、ＳＢＳ（Society for Biomolecular Screening）標準マイクロタイタープレートと、により構成されている。細胞のリガンド誘導された変化の結果、プレートリーダ内の探知器システムは、入射光線の波長の変動を測るために、統合光ファイバを利用する。一連のイルミネーション検出ヘッドが直線的な態様で配列され、反射スペクトルが３４８ウェルマイクロプレートのコラムの中の各ウェルから同時に集められる。各センサが複数回アドレスされ得るように、全プレートがスキャンされ、各コラムは順番にアドレスされる。入射光の波長が収集され、分析に使用される。温度変動による入射波長の変動を最小にするために温度コントロールユニットを機器に含めることができる。測定された反応は細胞の集団の平均化された反応を表す。システムの様々な特徴は、サンプルローディングのように自動化することができ、また、９６または３８６ウェルマイクロプレートを用いたときのように多重化することがきる。液体の取扱いは、オンボード液体ハンドラーまたは外部液体ハンドリングアクセサリーにより行われる。具体的には、分子溶液は、直接加えられるか、各ウェルの底で培養されている細胞を有する細胞分析プレートのウェルの中へピペットで移されます。細胞分析プレートは、細胞を覆っているある量の分析緩衝液を含んでいる。上下に数回ピペット操作することによる単純なミキシングステップが分子添加ステップに組み込まれる場合がある。
ｃ）電気バイオセンサおよびシステム
１９９．電気バイオセンサは、基板（例えば、プラスチック）、電極および細胞層により構成される。この電気的検出見方法では、細胞は、基板上に配列される小さな金電極の上で培養され、システムの電気インピーダンスが時間とともに追跡される。インピーダンスは、細胞層の導電性の変化の指標となる。通常、固定周波数または様々な周波数のわずかな定電圧が電極または電極アレイに印加され、回路を通した電流は時間とともにモニタされる。リガンド誘導された電流変化は細胞分析の指標を提供する。全体細胞センシングのためのインピーダンス測定は、１９８４年に最初に実現された。それ以来、インピーダンスベースの測定は、細胞接着および細胞伸展、細胞微細動作、細胞形態変化、および細胞死などを含む細胞イベントの広い範囲を研究するために適用されてきた。古典的なインピーダンスシステムは、小さな検出電極と大きなリファレンス電極の使用に起因して、分析ばらつきが大きいことに苦慮している。このばらつきを克服するために、最新世代のシステム、例えばＣｅｌｌＫｅｙシステム（ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）およびＲＴ−ＣＥＳ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）は、微小電極アレイを有する集積回路を利用している。
ｄ）高空間解像度バイオセンサイメージシステム
２００．ＳＰＲイメージシステム、偏光解析法イメージシステムおよびＲＷＧイメージシステムを含む光学バイオセンサイメージシステムは、高い空間解像度を提供し、本開示の実施例において使用され得る。例えば、ＳＰＲイメージャー（登録商標）ＩＩ（ＧＷＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）はプリズム結合されたＳＰＲを使用し、固定された入射角度でＳＰＲ測定を行い、ＣＣＤカメラで反射光を収集する。表面の変化は反射率の変化として記録される。従って、ＳＰＲイメージングは、配列のすべての要素の測定を同時に収集する。
２０１．イメージングベースのアプリケーションのためのＲＷＧバイオセンサに基づく掃引波長光学インターロゲーションシステム（swept wavelength optical interrogation system）が使用され得る。このシステムでは、高速調整可能なレーザ源が、センサまたはマイクロプレートフォーマットにおけるＲＷＧバイオセンサのアレイを照らすのに用いられる。センサスペクトルは、センサから反射された光出力をレーザ波長がスキャンしたときの時間関数として検出することによって構築され得る。電子化された共鳴波インターロゲーションモデルリングを持つ測定データの分析は、固定化された受容体または細胞層を有するバイオセンサの空間的に解像されたイメージの構築をもたらす。イメージセンサの使用は必然的にイメージングベースのインターロゲーションスキームをもたらす。２次元ラベルフリーイメージは、可動部分なしで得ることができる。
２０２．あるいは、垂直偏波またはｐ分極されたＴＭ０モードを用いる角度インターロゲーションシステムを使用することができる。このシステムは、各々がおよそ２００μｍ×３０００μｍまたは２００μｍ×２０００μｍの寸法で、ＲＷＧセンサを照らすように光ビームのアレイを生成するための照射システムと、これらのセンサから反射された光ビームの角度の変化を記録するためのＣＣＤカメラベースの受信システムと、からなる。光ビームのアレイは、回析光学レンズと組み合わせたビームスプリッターによって得ることができる。このシステムは、３秒ごとに同時に最大４９個のセンサ（７×７ウェルセンサアレイ）をサンプリングまたは、１０秒ごとに最大３４８ウェルマイクロプレートの全部をサンプリングすることができる。
２０３．あるいは、スキャニング波長インターロゲーションシステムを使用することができる。このシステムにおいて、一定の角度を持つ入射波長の範囲をカバーしている偏光が導波グレーティングバイオセンサの全体を照射およびスキャンするために使用され、各位置での反射光が同時に記録される。スキャニングを通して、バイオセンサ全体の高解像度イメージが得られる。
５．生体細胞における動的密集体再配分（ＤＭＲ：Dynamic Mass Redistribution）シグナル
２０４．細胞ターゲットを介した刺激に対する細胞反応は、下流のシグナリングネットワークの時空間ダイナミクスによってコード化され得る。この理由から、リアルタイムの細胞シグナリングの統合のモニタリングは、細胞生物学および生理学を理解するのに役立つ生理学的に関連した情報を提供することができる。
２０５．共鳴導波グレーティング（ＲＷＧ）バイオセンサを含む光学バイオセンサは、細胞物質の動的再配分に関する統合された細胞反応を検出することができ、従って、細胞シグナリングを研究するための非侵襲的な手段を提供する。全ての光学バイオセンサは、それらがセンサ表面でまたはその直近で局所屈折率における変化を測定し得る点で共通である。原則として、ほとんどすべての光学バイオセンサは、細胞センシングに適用でき、細胞におけるリガンド誘導された変化を特徴づけるエバネッセント波を使用することができる。エバネッセント波は電磁界であり、溶液表面の界面における光の全反射によって生成される。エバネッセント波は、通常、侵入深さまたはセンシングボリュームとして知られている特有の深さで溶液内に短い距離（数百ナノメートル）で広がる。
２０６．近年、リガンドによる刺激に反応して生体細胞で測定される光信号のパラメータおよび性質を記述する、理論的、数学的モデルが開発された。既知の細胞生物物理学と組み合わせた３層導波システムに基づくこれらのモデルは、受容体を介して媒介された特定の細胞プロセスをリガンド誘導された光信号にリンクさせる。
２０７．バイオセンサは入射光線による照射領域に位置する細胞の平均的な反応を測定する故、細胞の高密集層が最適分析結果を達成するめに使用され得る。バイオセンサの短い侵入深さと比較した細胞の大きな寸法のために、センサ構成は、従来にない３層システムであるとみなされる。すなわち、基板、格子構造を有する導波フィルム、細胞層。従って、実効屈折率（すなわち、検出信号）におけるリガンド誘導された変化は、最初のオーダに対して、細胞層の底部の屈折率の変化に正比例していることがありえる。：
Figure 2012509667
２０８．ここでＳ（Ｃ）は細胞層に対する感度である。Δｎｃはバイオセンサによって検知されたリガンド誘導された細胞層の局所屈折率における変化である。細胞内の所定の量の屈折率が、タンパク質などの生体分子の集中によって広く検出されるので、Δｎｃは、検知量内におけるリガンド誘導された細胞ターゲットまたは分子集合体の局所集中における変化に正比例するものとみなされ得る。センサ面から離れて広がっているエバネッセント波の指数的に減衰している性質を考慮して、リガンド誘導された光信号は、
Figure 2012509667
により支配される。
２０９．ここでΔＺｃは、細胞層への侵入深さであり、αは、特定の屈折増加（タンパク質に関し約０．１８／ｍｇ／ｇ）であり、Ｚｉは密集体再配分が生じる距離であり、ｄは細胞層の１枚の想像上の厚さである。ここでは、細胞層は垂直方向で同等の間隔をあけた薄片に分けられる。上記の式は、リガンド誘導された光信号がセンサ面から離れた異なった距離で起こっている密集体再配分の合計（全体的な反応に対する不揃いの寄与で）であることを示す。さらに、検出された信号は、波長または角度シフトに関してセンサ面に対して直角に生じている密集体再配分に主に敏感である。その動的な性質のために、それは動的密集体再配分（ＤＭＲ）シグナルとも称される。
６．細胞およびバイオセンサ
２１０．細胞は、それらが受ける情報を処理し、コード化して、統合するために、複数の細胞経路または機械に頼る。分析物のタンパク質ターゲットへの結合を特に測定する光学バイオセンサを用いた親和性分析と異なり、生体細胞はより複雑かつダイナミックである。
２１１．細胞シグナリングを調べるために、細胞はバイオセンサの表面と接触され、それは細胞培養を通して達成される。これらの培養された細胞は、３つの接触のタイプを通して、バイオセンサ表面に付着され得る。すなわち、焦点接着、近接接触、および細胞外マトリックス接触であり、それぞれ、表面からのそれら自身の特有の離間距離を有する。結果として、基底細胞膜は、通常、表面から１０−１００ｎｍ離れて位置する。浮遊細胞に関しては、細胞は、細胞表面受容体の共有結合、または細胞表面受容体の特定の結合、または単に重力による定着を通してバイオセンサ表面と接触され得る。この理由により、バイオセンサは、細胞の底部を検知することができる。
２１２．細胞は、多くの場合、表面依存的な粘着力と増殖を示す。強力な細胞分析法を達成するために、バイオセンサ表面は、細胞接着と増殖を強化するコーティングを必要とする。しかしながら、表面特性は、細胞生物学に直接的な影響を持つ。たとえば、基板材料の機械整合性がそうすることができるように、表面に結び付いたリガンドは、細胞の反応に影響することができ、細胞によって印加された力の下でそれがどのように変形するかを指示する。異なった培養状態(時間、血清濃度、密集度など)に起因して、得られた細胞状態は、１つの表面と別の表面および１つの状態と他の状態とで異なる場合がある。従って、細胞状態をコントロールする特別な取り組みが、バイオセンサベースの細胞分析を発展させるのに必要である。
２１３．細胞は比較的大きい寸法（通常数十ミクロンの範囲）の動的な物体である。細胞は、刺激がなくても絶えず微小運動を起こす。（動的な運動および細胞構造の改造（亜細胞の溶液で経時的顕微鏡検査法による組織培養においておよびナノメータレベルのバイオインピーダンス測定により観察される。）
２１４．非刺激状況下において、ＲＷＧバイオセンサで試験されるように、細胞は、一般的にほとんど正味ゼロのＤＭＲ反応を生成する。これは、大きなサイズのレーザスポットと連結光の長い伝搬長によって測定されたときの、光学バイオセンサの部分的に低い空間解像度のためである。レーザスポットのサイズは、調査領域のサイズを決定する。 通常、１つの分析点のみが、一度に追跡され得る。従って、バイオセンサは、通常、光入射領域に位置する大きい細胞集団の平均化された反応を測定する。細胞は単一細胞レベルで微小運動を起こすにもかかわらず、大きい細胞集団は、平均正味ゼロのＤＭＲ反応を引き起こす。さらに、細胞内巨大分子は高度に組織されて、哺乳類の細胞の適切なサイトに空間的に制限される。局在化は細胞がそれらの適当なパートナーと相互作用しているタンパク質の特異性および効能を制御し、タンパク質活性化および非活性化メカニズムを空間的に切り離すことを可能とするので、細胞上のおよび細胞内の厳しくコントロールされたタンパク質の局在化は、特定の細胞機能および反応を割り出す。このコントロールにより、非刺激状況の下で、検出範囲内における細胞の局所密集密度は均衡状態に達し、従って、正味ゼロの光学反応をもたらす。一貫した光学反応を達成するために、調べられる細胞は、大部分の細胞が分割の１サイクルを完了するような期間、従来の培養状況の下で培養され得る。
２１５．生体細胞は、外因性信号を感知し、反応する優れた能力を有する。細胞シグナリングは、環境要因が反応の直線連鎖を誘発し、一つの明確な反応をもたらす直線ルートを介して機能するものと以前考えられた。しかし、研究は、外的刺激に対する細胞反応はさらに複雑であることを示した。細胞が受信した情報は、複合テンポラル（complex temporal）、リン酸の空間パターン、シグナリングタンパク質のトポロージの再配分で処理され、コード化され得ることが明らかになった。適当なサイトに対するタンパク質の空間的および時間的ターゲッティングは、タンパク質―タンパク質相互作用の特異性および効能を規制するのに重要となり、従って細胞シグナリングおよび反応のタイミングを指示するのに重要となる。中枢の細胞決定（例えば細胞骨格再編成、細胞周期チェックポイントおよびアポトーシス）は、活性化されたシグナルトランスデューサの正確な時間的制御と相対的な空間分布に依存する。従って、一般的にＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣ）のような細胞ターゲットを通して媒介される細胞シグナリングは、一般的に整然として管理された態様で進行し、一連の空間的、時間的イベントにより構成され、そして、その多くは局所密集体密度における変化または細胞の局所細胞物質における再配分をもたらす。これらの変化または再分配は、検知量範囲内で起こるとき、光学バイオセンサを使ってリアルタイムに直接追従することができる。
７．生体細胞の生理学的反応としてのＤＭＲシグナル
２１６．受容体生物学を研究するための従来の薬理学的アプローチとの比較を通じて、リガンドが細胞システムにおいて発現された受容体に対して特有であるとき、リガンド誘導されたＤＭＲシグナルは、受容体特有で、投与量依存的で、飽和可能であることが示された。かなりの数のＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）リガンドに関しては、効能（ＥＣ５０で測定される）は、従来の方法を使用することで測定されたものとほとんど同じであることがわかっている。さらに、脱感作および再感作がすべてのＧＰＣＲで共通であるため、ＤＭＲシグナルは期待される脱感作パターンを示す。さらに、ＤＭＲシグナルもＧＰＣＲリガンドの忠実度を維持し、従来のテクノロジーを使用して得られるものと類似している。さらに、バイオセンサは完全アゴニスト、部分アゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニストおよびアロステリックモジュレーターを識別することができる。合わせて考えると、これらの調査結果は、ＤＭＲが生体細胞の生理学的反応をモニタすることができることを示す。
８．生再体細胞内のリガンド-受容体ペアのシステム細胞生物学情報を含むＤＭＲシグナル
２１７．リガンドを用いた細胞の刺激は、一連の空間的時間的イベントをもたらし、その限定されない例は、リガンド結合、受容体活性化、タンパク質補充、受容体内部移行およびリサイクリング、第２メッセンジャーオルタネーション、細胞骨格改造、遺伝子発現および細胞接着変化である。各々の細胞イベントは、それ自身の特徴（例えば、キネティクス、期間、振幅、密集体移動）があり且つバイオセンサは、検知量範囲内で密集体再配分に関わる細胞イベントに主に敏感であるので、これらの細胞イベントは、別々にＤＭＲシグナルの全体に寄与することができる。生物化学、細胞生物学および生物物理学的なアプローチは、リガンド誘導されたＤＭＲシグナルに関し、細胞メカニズムを説明するのに用いられる。近年では、生物化学（それは特定の細胞シグナリング構成要素への干渉のために化学を直接使用する）は生物学的問題に対処するのに用いられてきた。これは、多くの異なるタイプの細胞ターゲットの活動を具体的にコントロールする多数のモジュレータの識別の結果、可能となる。このアプローチは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体、ＧｑおよびＧｓ結合受容体を含む受容体を通して媒介されるシグナリングおよびそのネットワーク相互作用をマッピングするために採用されてきた。
２１８．ＥＧＦＲは、受容体型チロシンキナーゼのファミリーに属する。ＥＧＦはＥＧＦＲの固有のタンパク質-チロシンキナーゼ活動と結合して刺激し、そして、シグナル伝達カスケードを開始し、主にＭＡＰＫ、ＡｋｔおよびＪＮＫ経路と関わる。ＥＧＦ刺激による、Ａ４３１細胞における密集体再配分をもたらす多くのイベントがある −内因的にＥＧＦＲを過剰発現させている細胞株。ＥＧＦＲシグナリングは、細胞状態に依存していることが知られている。その結果、ＥＧＦ誘導されたＤＭＲシグナルもまた細胞状態に依存している。０．１％の胎児ウシ血清での２０時間の培養で得られた静止細胞においては、ＥＧＦ刺激は３つの異なった連続したフェーズを有するＤＭＲシグナルをもたらす。すなわち、（ｉ）信号増加を伴うポジティブフェーズ（Ｐ−ＤＭＲ）、（ii）移行フェーズ、（iii）減衰フェーズ（Ｎ−ＤＭＲ）である。生物化学と細胞生物学調査はＥＧＦ誘導されたＤＭＲシグナルが主にＲａｓ／ＭＡＰＫ経路にリンクされ、ＭＥＫを通して進行して細胞分離をもたらすことを示している。第１に、ダイナミンまたはクラスリン活動のどちらの障害物も、Ｐ−ＤＭＲイベントの大きさに、ほとんど影響を及ぼさない。ダイナミンとクラスリン（ＥＧＦＲ活性化の２つの下流の構成要素）は、ＥＧＦＲ内部移行およびシグナリングを実行する重要な役割を担う。第２に、ＭＥＫ活動の障害物は、Ｐ−ＤＭＲイベントを部分的に弱める。ＭＥＫは、ＭＡＰＫ経路の重要な構成要素であり、ＥＧＦ刺激の後、最初に細胞質から細胞膜まで転位し、受容体での内部移行がこれに続く。
２１９．一方、Ｎ−ＤＭＲイベントは、細胞分離および受容体内部移行に起因している。蛍光画像は、ＥＧＦ刺激がかなりの数の受容体内部移行および細胞分離をもたらすことを示している。受容体内部移行またはＭＥＫ活動の障害物は細胞分離を妨げ、受容体内部移行はダイナミンとクラスリンの両方を必要とすることが知られている。これは、ダイナミンまたはクラスリン活動の障害物が受容体内部移行および細胞分離のどちらも妨げなければならない一方、ＭＥＫ活動の妨害物が受容体内部移行でなく細胞分離のみを妨げなければならないことを示唆している。予想されるように、ダイナミンまたはクラスリン抑制剤はＥＧＦ誘導されたＮ−ＤＭＲを完全に妨げる（〜１００％）。一方、ＭＥＫ抑制剤は、Ｎ−ＤＭＲを部分的に弱める（〜８０％）。蛍光画像も、ＭＥＫではなく、ダイナミンの活動の妨害が受容体内部移行を弱めることを確認する。
９．生体細胞に作用するリガンドのシステム細胞薬理学情報を含むＤＭＲシグナル
２２０．ＤＭＲシグナルは細胞の底部での細胞物質の動的再配分を含む多くの細胞イベントの寄与からなる統合された細胞反応であるので、ＤＭＲシグナルなどのリガンド誘導されたバイオセンサシグナルは、システム細胞薬理学情報を含む。ＧＰＣＲはしばしば細胞内で豊かな振る舞いを示し、多くのリガンドは、細胞機構の特定の部分に働く有効なバイアスを誘導し、経路バイアスされた効能を示すことが知られている。従って、受容体の下流の細胞イベントがどのように測定され、リガンド薬理学に関する読み出した情報がどのように使用されるかに依存して、リガンドが複数の効能を有する可能性が高い。大部分が経路バイアスされ、１つのシグナリングイベントだけを分析する従来の細胞分析では、ＧＰＣＲリガンドのシグナリングポテンシャルを体系的に表すことは、実際には困難である。しかしながら、ラベルフリーバイオセンサ細胞分析は、細胞シグナリングの事前知識を必要とせず、経路バイアスなしおよび経路感度良好であるので、これらのバイオセンサ細胞分析は、リガンド選択シグナリング研究およびあらゆるリガンドのシステム細胞薬理学に受け入れられる。
１０．バイオセンサパラメータ
２２１．ＲＷＧバイオセンサまたはバイオインピーダンスバイオセンサなどのラベルフリーバイオセンサは、リガンド誘導されたリアルタイム細胞反応に追従することができる。非侵襲性で操作のないバイオセンサ細胞分析は、細胞シグナリングの事前知識を必要としない。結果として生じるバイオセンサシグナルは、受容体シグナリングおよびリガンド薬理学に関する高度な情報を含んでいる。マルチパラメータは、刺激による細胞の動的バイオセンサ反応から得ることができる。これらのパラメータは、限定されるものではないが、全体的なダイナミクス、フェーズ、信号振幅を含み、動的パラメータは、あるフェーズから他のフェーズへの遷移時間、各フェーズのキネティクスを含む（Fang, Y., および Ferrie, A.M. (2008)「生体細胞におけるβ２アドレナリン受容体に作用するリガンド案内された機能的選択性のためのラベルフリーバイオセンサ」. FEBS Lett. 582, 558-564；Fang, Y.ほか(2005)）「ラベルフリー光学バイオセンサで測定された生体細胞におけるＥＧＦ受容体シグナリングの動的密集体再配分の特性」Anal. Chem., 77, 5720-5725；Fang, Y.ほか(2006)）「生体細胞検知のための共鳴導波グレーティングバイオセンサ」Biophys. J., 91, 1925-1940参照）
１１．ＤＭＲパラメータ
ａ）バイオセンサ出力パラメータ
２２２．多くの異なるバイオセンサ出力パラメータが、ここで議論される。刺激誘導された細胞中での指向性の密集体再配分のキネティクスを定めている６つのパラメータは、全体的なダイナミクス（すなわち形状）、反応のフェーズ（静止状態のＡ４３１細胞におけるＥＧＦ誘導されたＤＭＲシグナルの特定の例において、細胞反応に関して３つの主な段階がある。すなわち、ポジティブ動的密集体再配分（Positive-Dynamic Mass Redistribution (P-DMR)）、 ネガティブ動的密集体再配分（Negative-Dynamic Mass Redistribution (N-DMR)）、および回復ポジティブ動的密集体再配分（Recovery Positive-Dynamic Mass Redistribution (RP-DMR)）、キネティクス、各フェーズの全体の期間、各々のＤＭＲイベントの総規模、およびＰ-ＤＭＲからＮ−ＤＭＲフェーズまでまたはＮ−ＤＭＲからＲＰ−ＤＭＲまでの遷移時間であり得る。動的密集体再配分は、しばしば動的細胞物質再配分または指向性密集体再配分と称される。他のバイオセンサ出力パラメータは、共鳴ピークから得られる。たとえば、最大半減（ＰＷＨＭ）でのピークの位置、強さ、ピーク形状、ピーク幅が、使用され得る。バイオセンサ出力パラメータは、バイオセンサの共鳴バンドイメージからも得ることができる。５つの更なる特徴、すなわちバンド形状、位置、強さ、配置および幅。ここに明らかにされるように、バイオセンサを使用するあらゆる細胞分析のあらゆる所定の応用のために、これらのパラメータの全てが独立して、または、一緒に使用され得る。どんなパラメータのサブセットまたは組み合わせによる使用でも、細胞受容体分析に関するサイン、およびＥＧＦ受容体ベースの分析に関する特定のサインなどのように、所定の分析または特定の分析における所定のバリエーションに関してサインを生じることができる。
（１）刺激誘導された指向性密集体再配分のキネティクスに関するパラメータ
２２３．刺激誘導されたＤＭＲのキネティクスに関する多くのバイオセンサ出力パラメータがある。これらのパラメータは、細胞への刺激性イベントが起こったときにバイオセンサデータ出力に生じる変化率を見ている。刺激性イベントは、例えば培養液への細胞の添加、温度変化またはｐＨ変化、細胞への放射線の導入などの細胞の状態が変化し得るあらゆるイベントである。刺激性イベントは、刺激性イベントによって生成される細胞に対して指向性密集体再配分などのあらゆる刺激性の効果をもたらし得る。刺激性イベントは、分子、化学的、生物化学的、生物学的、ポリマーであり得る。生物化学のまたは生物学のものは、ペプチド、synthicペプチド、自然発生ペプチドであり得る。例えば、炎症誘発性ペプチドブラジキニン、プロテアーゼ酵素トロンビン、および血圧規制ペプチドアンジオテンシンを含む多くの異なるペプチドがシグナリング分子として活動する。これらの３つのタンパク質は、それらのシーケンスおよび生理学において識別でき、異なる細胞表面受容体を通して活動する一方、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）と呼ばれている細胞表面受容体の共通クラスに割り当てられている。ＧＰＣＲの他のポリペプチドリガンドは、バソプレシン、オキシトシン、ソマトスタチン、ニューロペプチドＹ、ＧｎＲＨ、leutinizingホルモン、卵胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、オレキシン、ウロテンシンII、エンドルフィン、エンケファリンおよび他の多くを含む。ＧＰＣＲは、ペプチドリガンドだけでなく小分子神経伝達物質（アセチルコリン、ドーパミン、セロトニンとアドレナリン）、光、臭気物質、味覚、脂質、ヌクレオチドおよびイオンにも反応する、広くて多様な遺伝子ファミリーである。ＧＰＣＲによって用いられる主要なシグナリングメカニズムは、細胞内カルシウム放出とｃＡＭＰ生成を含む下流の第２のメッセンジャーシステムに結合するＧタンパク質ＧＴＰａｓｅタンパク質と相互作用することである。ペプチドＧＰＣＲにより用いられる細胞内シグナリングシステムは、すべてのＧＰＣＲに用いられるそれらと類似しており、典型的には、それらが相互作用するＧタンパク質および活性化される第２のメッセンジャーシステムに応じて分類される。Ｇｓ結合ＧＰＣＲに関し、受容体によるＧタンパク質Ｇｓの活性化は、アデニル酸シクラーゼの下流の活性化およびサイクリックＡＭＰの生成を刺激する一方、Ｇｉ結合受容体はｃＡＭＰ生成を抑制する。ｃＡＭＰ生成の鍵となる結果の一つは、プロテインキナーゼＡの活性化である。Ｇｑ結合受容体はホスホリパーゼＣを刺激し、ＩＰ３およびジアシルグリセロールを放出する。細胞内カルシウムの放出およびこれに続くプロテインキナーゼＣ、カルモジュリン依存的な経路の起動を引き起こすために、ＩＰ３はＥＲで受容体と結合する。ＧＰＣＲのためのこれらの第２のメッセンジャーシグナリングシステムに加えて、ＧＰＣＲ経路は、チロシンキナーゼ成長因子受容体とｍａｐキナーゼ経路を含む他のシグナリング経路とクロストークを示す。ＥＧＦ受容体または焦点粘着性複合体のようなどちらの受容体型チロシンキナーゼのトランス活性化でも、アダプタータンパク質Ｓｈｅ、Ｇｒｂ２およびＳｏｓおよびＥｒｋｌおよびＥｒｋ２を活性化している下流のｍapキナーゼを介してｒａｓ活性化を刺激することができる。Ｓｒｃキナーゼは、ＧＰＣＲによってｒａｓおよびｍａｐキナーゼ経路の活性化において重要な仲介役を担うことができる。
２２４．若干の刺激性のイベントが起こることがあり得るが、データ出力の変化は生じない。指向性密集体再配分または細胞または細胞培養の変化を引き起こしたいくつかの方法において細胞の状態が変化したので、この状況はやはり刺激性イベントである。
２２５．ここに明らかにされるように、特定のサインがあらゆる分析またはあらゆる細胞状態に関して判定され得るものと理解される。多くの異なる分析に関し、ここに明らかにされる多数の「サイン」があり、しかし、ここで実施されるあらゆる分析に関し、その分析の「サイン」は判定され得る。ここに記載されるように、あらゆる所定の分析に関する１つ以上の「サイン」があり得、判定され得る。バイオセンサ出力データを収集し、１つ以上のパラメータを見た後、所定の分析のためのサインが取得され得る。最適サインを特定するために複数の実験を実行することが必要である場合があり、そして、異なる状況の下で最適サインを見つけるために実験を実行することが必要である場合があり、しかし、これは可能である。ここに明らかにされる方法のどれもが、例えば、それらの上に加えられたサインを「特定する」または「判定する」または「提供する」ステップを有することができるものと理解される。
（ａ）全体的なダイナミクス
２２６．見ることができるパラメータの１つは、データ出力の全体的なダイナミクスである。全体的なダイナミクスパラメータは、データコレクションの完全な運動実態を観察する。観察される全体的なダイナミクスの１つの態様は、時間とともにデータ出力によって生成されるカーブの形状における時間ごとの変化である。従って、データ出力によって生成されるカーブの形状は、刺激イベントの発生に応じて変わることができるか、安定したままでいることができる。変化の方向は、全体的な密集体再配分を示す。例えば、ポジティブＤＭＲ（Ｐ−ＤＭＲ）フェーズは、センサのエバネッセントテイル内での密集体の増加を示す。正味ゼロのＤＭＲは、センサのエバネッセントテイル内での密集体のほとんど正味ゼロの変化があることを示唆する。ネガティブＤＭＲは、センサのエバネッセントテイル内での密集体の正味の減少を示す。
２２７．光学バイオセンサを用いて得られる刺激誘導された細胞反応の全体的なダイナミクスは、単一のフェーズ（Ｐ−ＤＭＲまたはＮ−ＤＭＲまた正味ゼロのＤＭＲ）または２つのフェーズ（例えば２つのフェーズは、これら３つのフェーズのどんな組み合わせであってもよい）、または多数のフェーズ（さらに１つのＰ−ＤＭＲが時間経過の間に生じ得る。）からなる。
（ｂ）反応のフェーズ
２２８．時間の関数として観察され得るもう１つのパラメータはデータ出力において生じるフェーズ変化である。ラベルフリーバイオセンサはカーブを作るグラフ化し得るデータ出力を生成する。このカーブは移行ポイントを有し、例えば、増加状態から減少状態にまたは反対にデータが変化する。これらの変化はフェーズ移行と呼ぶことができ、そして、それらが起こる時間およびそれらがなす形がたとえば、バイオセンサ出力パラメータとして使用され得る。例えば、Ｐ−ＤＭＲ、正味のゼロのＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲまたはＲＰ−ＤＭＲがある。Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲおよびＲＰ−ＤＭＲの振幅は、別々のバイオセンサ出力パラメータとして測定することができる。
（ｃ）キネティクス
２２９．もう１つのバイオセンサ出力パラメータは、データ出力のあらゆる側面のキネティクスであり得る。例えば、フェーズ移行の完了の割合である。例えば、どれだけ速くフェーズ移行が完了するかまたはデータ出力が完了するのにどれぐらいの時間がかかるかなど。多の測定できるキネティックスの他の例は、データ出力の全てのフェーズに要する時間の長さである。もう１つの例は、Ｐ−ＤＭＲおよびＮ−ＤＭＲフェーズの一方または両方のトータル所要時間である。もう１つの例は、Ｐ−ＤＭＲおよびＮ−ＤＭＲフェーズの一方または両方のトータル振幅を得る時間または率である。もう１つの例は、Ｐ−ＤＭＲからＮ−ＤＭＲフェーズへの移行時間τであり得る。Ｐ−ＤＭＲおよびＮ−ＤＭＲ双方のイベントまたはフェーズのキネティクスは測定することが可能である。
（２）共鳴ピークに関するパラメータ
２３０．所定の導かれたモードの共鳴ピークは、たとえば、光の強さ対バイオセンサへの光のカップリングの角度または光の強さ対バイオセンサへのカップリング光の波長を見ることによって起こるデータ出力のタイプである。光導波ライトモードスペクトルは、バイオセンサに照射する光の角度の広い範囲を使用し、角度の関数としてインカップルされた強度の強さをモニタする方法で光の強度対バイオセンサへの光のカップリングの角度を見ることによって現れるデータ出力のタイプである。このスペクトルにおいて、多数の導かれたモードの多数の共鳴ピークは共に生じる。共鳴ピークとＯＷＬＳスペクトルの背後の主役が同じであるので、所定の導かれたモードの共鳴ピークまたは多数の導かれたモードのＯＷＬＳスペクトルを相互交換可能に使用することができ、光の特定の波長が生じるとき、特定の角度でバイオセンサに照射するように光が生成されたとき、光源から放射された光は、バイオセンサに結合し、このカップリングがバイオセンサから生じる信号を増加させる。このカップリング光の角度または波長の関数としての強度変化は共鳴ピークと呼ばれる。センサの異なる所定モードは、異なる特徴を有する類似した共鳴ピークを引き起こすことができる。ＤＭＲまたは細胞影響を評価するためにこのピークに関係する、使用され得る所定モードの共鳴ピークまたは共鳴スペクトルを定める多くの異なるパラメータがある。これらのサブセットは以下において議論される。
（ａ）ピーク位置
２３１． データ出力がグラフで示されるとき、共鳴ピークのピークは、たとえば、光の特定の波長でも、またはバイオセンサへの光カップリングの特定の入射角でも生じる。これが生じる角度または波長、位置は、刺激性イベントに対する反応における密集体再配分または細胞イベントにより変化する。たとえば、ＥＧＦ受容体などの特定の受容体のための潜在的成長因子の存在下において、培養細胞に関する共鳴ピークの位置は、共鳴ピークの中心位置の変化をもたらすカップリングの角度またはカップリングの波長を増加させあるいは減少させることができる。ピーク強度の位置は測定可能であり、且つ測定するのに良好なポイントであり、共鳴ピークに沿ったあらゆるポイントの位置も測定し得ることが理解できる。例えばピーク強度の７５％の位置、ピーク強度の５０％の位置、ピーク強度の２５％の位置、ピーク強度の６６％の位置、ピーク強度の４５％の位置（ピーク強度の１〜１００％の全てのレベルが開示されているものと考えられる。）しかし、ピーク強度以外の点を使うとき、ピーク強度の前および後には常にポジションがあり、それはたとえば、ピーク強度の４５％である。従って、ピーク強度以外のどんな強度に関しても、２つの位置が、常にその強度が起こるピークの中にある。これらの非ピーク強度の位置はバイオセンサ出力パラメータとして使用することができる。しかし、その強度の位置はピーク前の強度なのかピーク後の強度なのかを単純に知る必要がある。
（ｂ）強度
２３２．共鳴ピークの特定の強度の位置が正にバイオセンサ出力パラメータとして使用し得るとき、強度それ自体の大きさもバイオセンサパラメータとして使用することができる。特に関連した強度の１つは、所定のモードの共鳴ピークの最大強度である。細胞または細胞培養に特定の影響を及ぼす刺激性のイベントの存在に基づいて、最大強度は、その位置と同様、最大強度の大きさは、変化し、この変化は測定され、サインとして使用され得る。ちょうど共鳴ピーク位置のように、共鳴ピーク強度はピーク内のあらゆる強度または位置で測定され得る。例えば、バイオセンサ出力パラメータとして最大強度の５０％である強度、最大強度の３０％、最大強度の７０％、または最大強度の１％から１００％の間のあらゆるパーセントである強度を使用することができる。同様に、強度の位置のように、最大強度以外の強度が使用される場合（例えば最大強度の４５％）、この強度を有する共鳴ピーク内に常に２つの位置がある。ちょうど強度位置パラメータのように、非最大強度が使用されるとき、その強度は最大強度前なのか最大強度後なのかを考慮しなければならない。
２３３．例えば、最初の細胞密集度がおよそ５０％（密集度５０％で、バイオセンサ表面上の細胞は、最大ＰＷＨＭ値に至る傾向がある）であるとき、抑制剤と活性剤の双方の存在は、培養後、最大半減（ＰＷＨＭ）におけるピーク幅の減少という結果をもたらす。しかしながら、トータル角度シフト（すなわち、共鳴ピークの中央位置）などの他のバイオセンサ出力パラメータが、全く影響を受けない分子から抑制剤と促進剤とを識別するのに使用することができる。ＰＷＭＨ長は、図６Ｂで例示されるように、ピークの最大強度（高さ）の半分であるピーク上の点の間で描かれる線の長さである。すべてのセンサ上の細胞密度が実質的に同一または殆ど同じであるとき、どんな処理もされていない細胞を有するセンサと比較して、例えば細胞増殖の抑制剤は、全く処理されていない細胞に関するシフトより小さな角度シフトを引き起こす傾向があり、その一方、活性剤はより大きな角度シフトを引き起こす。細胞増殖を（抑制剤として）抑制するまたは（活性剤として）刺激する分子の潜在能力または能力は、すべての分子の濃度が同じであることを前提として、ＰＷＨＭ値に対するそれらの影響によって判定することができる。共鳴ピークの中心位置の変化との組み合わせにおいて、規定のＰＷＨＭ値の変化は、抑制剤または活性剤を取り除くのに用いることができる。所定のモードの共鳴ピークを検出するために使用されるインターロゲーションシステムに依存して、ＰＷＨＭの単位または値は変化し得る。たとえば、角度インターロゲーションシステムについては、単位は度であり得る。ＰＷＨＭにおける度の変化は例えば１０００分の１、１０００分の２、１０００分の３、１０００分の５、１０００分の７または１００００分の１であり得る。
（ｃ）ピーク形状
２３４．使用することができる他のバイオセンサ出力パラメータは、全体的なピーク形状またはある強度間またはある強度におけるピークの形状である。例えば、最大半減ピーク強度でのピークの形状またはあらゆる他の強度（例えば３０％、４０％、７０％、８８％または２０と１００％の間のあらゆるパーセント）がバイオセンサ出力パラメータとして使用できる。形状は、特定の強度よりも下または上のピークの領域によって特徴付けられる。例えば、最大半減ピーク強度においてピーク前の強度の点およびピーク後の点がある。線は、これらの２つの点の間で引くことができ、共鳴ピーク内のこの線の上の領域または共鳴ピーク内のこの線の下の領域が決定され、バイオセンサ出力パラメータとなる。所定ピークの統合された領域もまた細胞に作用している分子の影響を分析するために使用することができると理解される。
２３５．バイオセンサ出力パラメータに関する他の形状は、特定ピーク強度における共鳴ピークの幅であり得る。例えば、最大半減ピーク強度（ＨＭＰＷ）での共鳴ピークの幅は、ピーク強度の５０％である共鳴ピーク上のピーク強度前の点と、ピーク強度の５０％であるピーク後である線上の点との間の線のサイズを測定することによって決定され得る。この測定はその後、バイオセンサ出力パラメータとして使用される。共鳴ピークの幅はピーク強度の２０％と１００％の間のあらゆる強度に関して、このように測定され得る。（この例は、図（例えば図６Ｂ）を通して見ることができる。）
（３）バイオセンサの共鳴バンドイメージに関するパラメータ
２３６．これまで、ほとんどの光学バイオセンサは、センサ表面に固定された調査分子へのターゲット分子の結合または、センサ表面上の細胞付着または細胞生存度をひとつずつモニタしている。複数のバイオセンサ上の結合イベントまたは細胞付着または細胞生存度に関し、研究者は一般に時間連続した方法でこれらのイベントをモニタしている。したがって、異なるセンサ間の直接比較は、挑戦であり得る。さらに、これらの検出システムがそれが波長または角度インターロゲーションであるか否かにかかわらず、センサを照らすために小スポット（直径〜１００−５００μｍ）のレーザ光を使用している。反応または共鳴ピークは、照射領域からの細胞反応の平均を表している。９６ウェルバイオセンサマイクロプレート（例えばコーニングのエピックマイクロプレート）では、各ＲＷＧセンサは、およそ３×３ｍｍ２であり、各ウェルの底に位置する。一方、３８４マイクロプレート形式では、センサは一般的に１×１ｍｍ２の寸法を有する。したがって、現在のセンサテクノロジーを使用して得られる反応は、センサ表面の小部分を表すのみである。理想的には、検出システムによって複数のバイオセンサに付着した生体細胞の反応を同時にモニタすることを可能とするのみならず、各センサの比較的大きい面積または複数の領域からのシグナルインターロゲーションを可能にしなければならない。
２３７．イメージング光学インターロゲーションシステム（例えばＣＣＤカメラ）を介した共鳴バンドは、例えば、単一のセンサを横断する定義された位置での反射光（すなわちアウトカップル光）の強度と対比して物理的位置を見ることによって生じるデータ出力のタイプである。反射光は、インカップル光に直接的に関係する。あるいは、共鳴バンドは、センサに照射する小さいレーザスポットを使用して、１次元または２次元でセンサ全体をスキャンし、所定の導かれたモードの共鳴ピークを収集する方法で、スキャニングインターロゲーションシステムを介して収集される。センサ内の位置の関数としての共鳴ピークまたは光強度はセンサの共鳴バンドを形成するために最終的に再構成され得る。バイオセンサでは、特定の波長の光が生じたとき、または特定の角度でバイオセンサに照射するように光が生成されたとき、アウトカップル光は、センサ表面またはその近傍における屈折率変化の関数として変化し、この変化はイメージングシステムによって収集された各センサの共鳴バンドの特徴のシフトをもたらす。さらに、培養後のセンサ全体に亘る細胞の不均一な付着は、共鳴バンドを使用して直接に可視化することができる（例えば、図１における円で囲まれた共鳴バンドを参照）。理想的なマルチウェルバイオセンサマイクロプレートにおいて、各センサの位置は、他のバイオセンサに対して規格化することに関連している。すなわち、センサは、各ウェルの中央を通ってマイクロプレートにおける行または列を横断して整列される。したがって、得られる共鳴バンドイメージは、刺激に反応する細胞付着または細胞変化に関する内部参照として使用され得る。したがって、所定のモードの各センサのそのような共鳴バンドは、ＤＭＲまたは細胞の影響を評価するためにこのバンドに関連して使用され得る追加のパラメータを提供する。これらのサブセットは以下において議論される。
（ａ）バンド形状
２３８．使用され得る他のバイオセンサ出力パラメータは、所定モードの各バイオセンサの共鳴バンドの形状である。形状は各センサの広い領域を横断する強度分布によって定められる。形状は、広い領域を横断する刺激に反応する細胞付着または細胞変化の均一性のインジケータとして使用され得る（例えば、図１に示すように、各共鳴バンドは〜２００ｍｍ×３０００ｍｍの寸法を有するセンサ全体に亘る反応を表している。）
（ｂ）位置
２３９．所定モードの各センサの共鳴ピークの位置と同様、各共鳴バンドの位置は、バイオセンサ出力パラメータとして使用され得る。強度は、各バンドの最大強度を有する中央位置を生成するためにイメージングソフトウェアを使用して定量化される。そのような位置は、刺激または分子処理に反応する細胞変化を試験するために使用され得る。
（ｃ）強度
２４０．まさに共鳴バンドの位置のように、イメージングシステムを使用して収集されたアウトカップル光の強度は、バイオセンサ出力パラメータとして使用され得る。全バンドの平均強度またはイメージングバンドにおける各ピクセルの絶対強度は、細胞付着の質を試験し、細胞反応を評価するために使用され得る。
（ｄ）分布
２４１．イメージングシステムを用いて収集され、定められた角度または波長を有するアウトカップル光の分布は、バイオセンサ出力パラメータとして使用され得る。このパラメータは、細胞または調査分子が固定されていないセンサそれ自身の表面特性を評価するために、およびセンサ表面の照射領域を横断する細胞付着の質を試験するために使用され得る。さらに、このパラメータは、全体領域にわたる細胞密度が同一であるときに、細胞への分子の影響の均一性を試験するために使用され、または、照射領域に亘るある領域と他の領域で細胞密度が異なるとき、分子誘導された細胞反応における細胞密度の影響を試験するために使用され得る。
（ｅ）幅
２４２．まさに所定モードの共鳴ピークのＰＷＨＭのように、イメージングシステムを使用して得られる共鳴バンドの幅は、バイオセンサ出力パラメータとして使用され得る。共鳴ピークのために使用することができる唯一のＰＷＨＭの代わりにセンサの照射領域の複数の領域における複数のバンド幅を得ることができることを除き、このパラメータは、共鳴ピークのＰＷＨＭ値のそれらとほとんど同一の特徴、すなわち、有用な情報内容を共有している。共鳴バンドイメージによって得られる他のパラメータと同様、幅は上述したアプリケーションに使用することができる。
２４３．これらの全てのパラメータは、ここに開示されたようなバイオセンサを用いたあらゆる細胞分析の与えられるあらゆるアプリケーションのために独立にまたは一緒に使用することができる。パラメータのあらゆるサブセットまたは組み合わせの使用は、例えば細胞受容体に関するサイン、およびＥＧＦ受容体ベース分析に関する特定のサインのように、所定の分析または特定の分析における所定のバリエーションに関するサインを生成する。
１２．方法
２４４．分子を特徴付けるための方法が開示されている。当該方法は、１次プロファイルを生成している分子のバイオセンサ反応を収集するステップと、２次プロファイルを生成している分子の存在下において、細胞パネルにおけるマーカパネルのバイオセンサ反応を収集するステップと、バイオセンサシグナルの各々からバイオセンサパラメータの特定のセットを抽出するステップと、ポジティブコントロールに対して各バイオセンサパラメータを規格化して変調比較を生成するステップと、マーカパネルまたは細胞パネルの関数として少なくとも１つのバイオセンサパラメータの変調比較をプロットして分子変調インデックスを生成するステップと、必要に応じて、分子の１次プロファイルと分子変調インデックスを組み合わせて分子バイオセンサインデックスを生成するステップと、必要に応じて、分子バイオセンサインデックスとモジュレータバイオセンサインデックスのライブラリを比較するステップとを含む。
２４５．バイオセンサ細胞分析を使用して分子をスクリーニングする方法が開示されている。当該方法は、細胞のパネルを選択するステップと、それぞれが細胞パネルにおける各細胞に対応するように複数のマーカのパネルを選択するステップと、分子処理された細胞のパネルを生成している分子でパネルにおける各細胞を処理するステップと、バイオセンサ反応をモニタリングして分子の１次プロファイルのパネルを各細胞に関して生成するステップと、マーカパネルの各マーカを、分子処理された細胞のパネルの各細胞に個別に特定の投与量で加えるステップと、バイオセンサ反応をモニタリングして、マーカのバイオセンサシグナルに影響を与えている分子の２次プロファイルのパネルを各マーカに関して生成するステップと、細胞のパネルに亘るおよびマーカのパネルに対する分子バイオセンサインデックスを生成するステップと、必要に応じて、分子バイオセンサインデックスと既知のモジュレータバイオセンサインデックスとを比較するステップと、を含み、分子バイオセンサインデックスとモジュレータバイオセンサインデックスとの間の類似性が分子の活動のモードに関するインジケータであることを特徴とする。
２４６．分子を特徴付ける方法が開示されている。当該方法は、既知のリガンドのパネルで細胞のパネルをパニングして既知のリガンドが所定の細胞タイプにおいて強いバイオセンサシグナルを誘発できるかどうかを判定するステップと、マーカとして強いバイオセンサシグナルを誘発し得る既知のリガンドを選択し、所定の細胞タイプのためのマーカのライブラリを生成するステップと、特定の細胞タイプにおいてバイオセンサシグナルを誘発する能力に関する各マーカの潜在力および効能を判定するステップと、特定の細胞タイプにおいて各マーカによって誘発されたシグナリング経路およびネットワーク相互作用を割り出すステップと、各細胞タイプに関してマーカのパネルをダウンセレクトするステップと、分子の１次プロファイルのパネルを生成するために、細胞のパネルにおいてバイオセンサシグナルを誘発する分子の能力を調べ、およびマーカパネルに対する分子の２次プロファイルまたは変調プロファイルのパネルを生成するために細胞のパネルにおいてマーカ誘導されたバイオセンサシグナルを変調する分子の能力を調べる分析を実施するステップと、分子バイオセンサインデックスを生成するステップと、必要に応じて、分子バイオセンサインデックスと既知のモジュレータバイオセンサインデックスのライブラリを比較するステップと、を含む。
２４７．分子を特徴づける方法が開示されている。当該方法は、１次プロファイルを生成している分子のＤＭＲ反応を収集するステップと、２次プロファイルを生成している分子の存在下において、細胞パネルにおけるマーカパネルのＤＭＲ反応を収集するステップと、バイオセンサシグナルの各々からＤＭＲパラメータの特定のセットを抽出するステップと、ポジティブコントロールに対して各ＤＭＲパラメータを規格化して変調比較を生成するステップと、マーカパネルまたは細胞パネルの関数として少なくとも１つのバイオセンサパラメータの変調比較をプロットして分子変調インデックスを生成するステップと、必要に応じて、分子の１次プロファイルと分子変調インデックスを組み合わせて分子ＤＭＲインデックスを生成するステップと、必要に応じて分子ＤＭＲインデックスとモジュレータＤＭＲインデックスのライブラリを比較するステップとを含む。
２４８．バイオセンサがＤＭＲを検出する方法が開示されている。当該方法は、分子バイオセンサインデックスにおける１以上の分子変調プロファイルと類似しているモジュレータバイオセンサインデックスにおける１以上のマーカ変調プロファイルを特定するステップをさらに含み、分子は、分子バイオセンサインデックスがモジュレータバイオセンサインデックスに類似しているとき、類似した活動のモードをモジュレータと共有し、アゴニストモードにおいてステップａ）が実行され、ステップｄ）におけるポジティブコントロールは、細胞のサンプルがマーカのみで処理されているときに生成されたマーカの１次プロファイルを含み、変調比較は増強作用を含み、変調比較は抑制作用を含み、変調比較は非変調を含み、モジュレータバイオセンサインデックスのライブラリは分子バイオセンサインデックスを含み、モジュレータバイオセンサインデックスのライブラリは同一の細胞パネルに関する同一のマーカパネルに対して異なる分子からなり、分子バイオセンサインデックスとモジュレータバイオセンサインデックスとの間の類似性は、活動のモードのインジケータとして使用され、類似性は分子バイオセンサインデックス間のパターン認識分析に基づいており、類似性は分子変調インデックス間のパターン認識分析に基づいており、類似性は分子変調インデックスに関するスコアのマトリックスに基づいており、細胞のパネルは特定の病気、特定の細胞ターゲット、特定の起源、特定の人間生理学および病態生理学の代表と関連し、少なくとも１つの細胞システムは細胞のパネルに含まれ、細胞システムは２つの細胞のタイプを含み、マーカのパネルは、リガンドのライブラリから選択され、リガンドの各々は細胞における特定の細胞シグナリング経路を示すバイオセンサシグナルを生成し、ステップｅ）におけるマーカの特定の投与量は、細胞においてバイオセンサシグナルを誘発するために、少なくともＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、ＥＣ１００の濃度からなり、細胞におけるマーカの不存在下または存在下において分子の長期間バイオセンサシグナルを生成するステップをさらに含み、マーカは分子が細胞に添加される前、またはそのとき、または後に添加され、細胞パネルは、特定の病気に関連する細胞のタイプ、特定の起源からの細胞のタイプ、特定のターゲットに関連する細胞のタイプ、特定の生理学的機能と関連する細胞のタイプ、を含み、細胞パネルは、体内に生じた細胞、操作された細胞、変形された細胞、不死化された細胞、主要な細胞、胚幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞、幹細胞由来細胞を含み、ステップ（ａ）は細胞を特定の投与量の分子と接触させるステップを含み、ステップ（ｂ）は細胞をマーカパネルにおける特定の投与量のマーカと接触させるステップを含み、ステップ（ｂ）は細胞を特定の投与量の分子と接触させるステップを含み、特定の投与量は１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭから選択される所定の分子濃度であり、特定の投与量は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、 １００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、 １０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌから選択される所定の分子濃度であり、特定の投与量は、細胞におけるバイオセンサシグナルを誘発するために、マーカのＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、ＥＣ１００であり、ステップ（ｂ）は細胞をある期間リガンドに接触させ、その後細胞をマーカに接触させるステップを含み、ステップ（ｂ）は細胞をマーカおよび細胞に同時に接触させるステップを含み、ステップ（ｄ）は（１）マーカの１次プロファイルのＰ−ＤＭＲの振幅と、マーカに対する分子の２次プロファイルのＰ−ＤＭＲの振幅、（２）マーカの１次プロファイルのＮ−ＤＭＲの振幅と、マーカに対する分子の２次プロファイルのＮ−ＤＭＲの振幅、（３）マーカの１次プロファイルのＲＰ−ＤＭＲの振幅と、マーカに対する分子の２次プロファイルのＲＰ−ＤＭＲの振幅、またはこれらの組み合わせを比較するステップを含み、変調比較は変調差、変調割合、またはこれらの組み合わせを含む。
２４９．インデックスを生成する方法が開示されている。当該方法は、１より多いマーカに対する分子の変調プロファイルを収集するステップと、インデックスにおける分子の変調比較をリストアップするステップとを含む。
２５０．開示されている方法において、変調インデックスは１つの細胞タイプにおいておよび複数のマーカに関して得られ、変調インデックスは複数の細胞タイプにおいておよび単一のマーカに関して得られ、変調インデックスは複数の細胞のタイプにおいておよび複数のマーカに関して得られ、変調インデックスは複数のマーカに関して得られる。
２５１．創薬の方法が開示されている。当該方法は、未知の分子インデックスと既知のモジュレータインデックスとを比較するステップと、未知の分子リガンドインデックスが既知のモジュレータインデックスと類似しているかどうか判定するステップと、を含む。
２５２．分子を特徴付ける方法が開示されている。当該方法は、細胞をマーカに接触させるステップと、マーカに対する細胞の反応を分析して１次プロファイルを得るステップと、細胞をマーカおよび分子に接触させるステップと、マーカおよび分子に対する細胞の反応を分析して変調プロファイルを得るステップと、を含む。
２５３．分子を特徴付ける方法が開示されている。当該方法は、細胞をマーカおよび分子に接触させるステップと、細胞のマーカおよび分子に対する反応を分析するステップと、を含む。
２５４．開示されている方法は、さらに、先行するステップの後に分子を合成するステップを含み、さらに分子の派生物のライブラリを制作するステップを含み、１以上のステップは機械で実施され、機械は汎用コンピュータであり、機械はバイオセンサである。
２５５．組成を作成する方法が開示されている。当該方法は、分子を合成するステップを含み、分子は分子として特徴付けられ、分子インデックスはモジュレータインデックスに対して類似性を有し、ここに記載の方法を使用してそのように特定される。
２５６．ここに開示された方法のプロセスによって製造された製造物が開示されている。
Ｖ．実施例
Ａ．実験の手順
１．材料
２５７．ＡＤＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、アデノシン、スペルミン、ヒスタミン、エピネフリン、エライジン酸、リポキシンＡ４、ニコチン酸、ピナシジルは、ポリ（Ｉ：Ｃ）、フォルスコリン、および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）はシグマケミカル社（セントルイス、ミーズーリ州）から購入された。ホルボール１２-ミリスチン酸塩１３-アセテート（ＰＭＡ）、ＨＡ１０７７、Ｈ−８、ＬＹ２９４００２、ケルセチン、Ｕ０１２６、ＡＧ１４７８、ＢＭＬ−２６５、ロットレリン、および８０のキナーゼ抑制剤からなるバイオモル・キナーゼライブラリは、バイオモルインターナショナルＩｎｃ（プリマスミーティング、ペンシルベニア州）から得られた。ブラジキニン、アドレノメデュリン、ＳＦＬＬＲ-アミド、アンギオテンシン、ニューロペプチドＹおよびＳＬＩＧＫＶ-アミドは、バッヘムアメリカス社（トランス、カリフォルニア州）から得られた。エピック（登録商標）３８４バイオセンサマイクロプレート細胞培養コンパチブルはコーニング社（コーニング、ニューヨーク州）から得られた。
２．細胞培養
２５８．すべての細胞株は、アメリカンタイプセルカルチャー（マナッサス、バージニア州）から得られた。細胞培養培地は以下のとおりである。すなわち、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、４．５ｇ／リットルのブドウ糖、２ｍＭのグルタミン、人間の類表皮癌Ａ４３１および人間の肺がんＡ５４９のための抗生物質で補われたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。
２５９．細胞は、典型的には、バイオセンサマイクロプレートで、３〜１５の経代で、調和する５０μｌの培地内で懸濁している１ウェルあたり１〜２×１０４の細胞を使用して成長され、細胞は、１日あたり大気／５％ＣＯ２下において３７℃で培養された。無血清ＤＭＥＭでの連続培養を通して〜２０時間の飢餓にさらされたＡ４３１を除いて、他の細胞のタイプは、飢餓なしで直接分析された。分析時点のすべての細胞の密集度は、９５％〜１００％であった。
３．光学バイオセンサシステムおよび細胞分析
２６０．エピック（登録商標）波長インターロゲーションシステム（コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）がすべての細胞検知に使用された。このシステムは温度コントロールユニット、光学検出ユニット、およびロボット工学を用いたオンボード液体ハンドリングユニットにより構成されている。検出ユニットは、統合された光ファイバを軸とし、１５秒の時間間隔での細胞反応の運動計測を可能にする。
２６１．ＲＷＧバイオセンサは、センサ表面の近傍で局所屈折率の微細な変化を検出することができる。細胞の中の局所屈折率は、生物量（例えば、タンパク質、分子複合体）の密度およびその配置の関数であるので、体内に生じた細胞においてリガンド誘導された動的密集体再配分を非侵襲的に検出するために、バイオセンサはそのエバネッセント波を利用する。エバネッセント波は、細胞内に広がって、距離に応じて指数関数的に減衰し、受容体活性化を通して媒介されたどんな光学反応もエバネッセント波がサンプリングしている細胞の部分における平均を表しているのみであるということを暗示しながら、１５０ｎｍの量の特徴検知をもたらす。受容体活性化の下流における多くの細胞イベントの寄せ集めは、リガンド誘導されたＤＭＲのキネティクスおよび振幅を判定する。
２６２．バイオセンサ細胞分析のために、ＨＢＳＳ（１×ハンクスでバランスされた食塩水プラス２０ｍＭのヘペス、ｐＨ 7.1）を用いて貯蔵された濃厚溶液を薄めることによって、分子溶液は作製された。分子溶液は、３８４ポリプロピレン分子貯蔵プレートに移され、分子ソースプレートを用意した。２ステップ分析が実施されたとき、分子およびマーカソースプレートの双方は、別々に作製された。並行して細胞は、ＨＢＳＳで２回洗浄され、３０μｌのＨＢＳＳ内に維持され、細胞分析プレートを用意した。細胞分析プレートおよび分子およびマーカソースプレートの双方は、その後リーダシステムのホテル内で保温された。１時間の保温の後、細胞分析マイクロプレートにおけるすべてのバイオセンサのベースライン波長が記録され、ゼロに規格化された。その後、２〜１０分の連続記録が実施され、ベースラインが確立され、細胞が定常状態に至ることが確保された。その後、細胞反応は、オンボード液体ハンドラーを使用して細胞分析プレートに１０μｌのマーカ溶液をピペットで移すことによって誘発された。
２６３．マーカ誘導された反応における分子の影響を調べるために、一定用量（一般的にＥＣ８０またはＥＣ１００）のマーカによる第２の刺激が加えられた。第２の刺激の直前に、マイクロプレートのすべてのバイオセンサの共鳴波長は、第２のベースラインを確立するために再び規格化された。２つの刺激は、通常１時間の間隔をおいて切り離されている。すべての調査は、コントロールされた温度（２８℃）において実施された。それぞれ少なくとも３回の反復を有する独立した少なくとも２セットの実験が実施された。分析変動係数は、１０％よりも小さいことがわかった。
Ｂ．実施例１：細胞プロファイル薬理学ベースの創薬のアウトライン
２６４．第１に、２つの上皮ガン細胞株が、創薬に対する細胞プロファイル薬理学アプローチを例示するために選ばれた。上皮層は、感染に対する最初の障壁であり、生来の免疫のキープレーヤーの１つである。感染の間、すべての病原体は、気道、消化管、泌尿生殖器または皮膚の切れ目（または火傷）を通して上皮を通過する経路を見つけなければならない。２つの細胞株は、人間の気道上皮細胞Ａ５４９および人間の皮膚上皮細胞Ａ４３１であった。
２６５．第２に、既知のリガンドが、選択された細胞のタイプにおいて強いＤＭＲシグナルを誘発することができたかどうかを判定するために、既知のリガンド（例えば、ＧＰＣＲアゴニスト、受容体チロシンキナーゼアゴニスト、トール様受容体（ＴＬＲｓ）アゴニスト、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性剤、アデニリルシクラーゼ活性剤、ホスホジエステラーゼ抑制剤、イオンチャネルオープナーまたは活性剤、アクチン崩壊エージェントまたは細胞アポトーシスエージェント、その他）を使って、ターゲットパニング調査が実施された。
２６６．第３に、各リガンドの潜在力および効能が、各細胞タイプにおけるＤＭＲシグナルを誘発するリガンドの能力の面から判定された。
２６７．第４に、特定の細胞タイプの各々において各リガンドによって誘発されたシグナリング経路およびネットワーク相互作用が生物化学および細胞生物学アプローチを組み合わせることによって割り出された。
２６８．第５に、これらのマーカが誘発するシグナリング経路および他の要因（例えば疾患特有のターゲットまたは経路）に応じて、マーカのパネルが細胞タイプごとにこれらのリガンドのコレクションから選ばれた。通常、特定の経路情報を含んでいるＤＭＲシグナルなどの強いバイオセンサシグナルをもたらすことができるリガンドは、マーカとなる。マーカのライブラリは、所定の細胞のタイプに関して特定され得る。１以上のマーカが特定の細胞ターゲットまたは受容体のために使用され得る点に注意する必要がある。たとえば、Ａ４３１におけるビート２-アドレナリン受容体に関して、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、サルメテロール、ＣＧＰ１２１７７およびピンドロールをマーカとして選択することができる。
２６９．第６に、細胞のパネルにおいてＤＭＲシグナル（すなわち分子の１次プロファイル）を誘発する分子の能力や細胞のパネルにおいてマーカ誘導されたＤＭＲシグナル（すなわち、分子の２次プロファイル）を変更する分子の能力を調べるために、一連の分析が実施された。
２７０．第７に、ＤＭＲインデックスが、細胞／マーカのパネルに対する分子に関して生成された。
２７１．第８に、分子ＤＭＲインデックスは、細胞／マーカの同じパネルに対する既知のモジュレータのＤＭＲインデックスのライブラリと比較された。
Ｃ．実施例２：ターゲットパニングで特定されたＡ５４９細胞におけるマーカ／ターゲット
２７２．（１）Ａ５４９細胞が選択されたリガンドのパネルに対して受容体を内因的に発現するかどうか、（２）リガンドのパネルを用いたこれらの受容体のターゲッティングが強いＤＭＲシグナルをもたらすかどうかの判定を精査するためにターゲットパニング調査が実施された。
２７３．第１に、各々１０μＭの濃度であるリガンドターゲッティングＧＰＣＲのパネルが選択され、エピック（登録商標）システムを用いたＤＭＲ測定を使用してＡ５４９細胞上でのそれらの活動が調査された。リガンドパネルは４つのＰ２ＹアゴニストＡＤＰ、ＡＴ、ＵＴＰ、ＵＤＰ、アデノシン受容体アゴニストアデノシン、カルシウム感知受容体アゴニストスペルミン、ヒスタミン受容体アゴニストヒスタミン、アドレナリン受容体アゴニストエピネフリン、遊離脂肪酸受容体アゴニストエライジン酸、リポキシン受容体アゴニストリポキシンＡ４、ブラジキニン受容体アゴニストブラジキニン、アドレナリン受容体アゴニストアドレナリン、ＰＡＲ１アゴニストＳＦＬＬＲ-アミド、アンギオテンシン受容体アゴニストアンギオテンシン、ニューロペプチドＹ受容体アゴニストニューロペプチドＹおよびＰＡＲ２アゴニストＳＬＩＧＫＶ−アミドを含んでいた。図３Ａおよび図３Ｂに示されるように、これらのすべてのリガンドはＡ５４９細胞において強いＤＭＲシグナルをもたらした。
２７４．次に、第２のリガンドパネルが選択され、エピック（登録商標）システムを用いたＤＭＲ測定を使用してＡ５４９細胞上でのそれらの活動が調査された。パネルは、プロテインキナーゼＣ活性剤ＰＭＡ、内在性ＫＡＴＰイオンチャネル活性剤ピナシジル、アデニリルシクラーゼ活性剤フォルスコリン、内在性トール様受容体（ＴＬＲ）活性剤ポリ（Ｉ：Ｃ）を含んでいた。図８に示されるように、このリガンドのパネルはＡ５４９細胞において強いＤＭＲシグナルをもたらした。
２７５．これらのリガンドがＡ５４９細胞において強いＤＭＲシグナルを誘発したという判定の後、エピック（登録商標）システムを使用してマーカに対するＡ５４９細胞の投与依存的な反応を得ることで、各々のマーカの潜在力と効能が判定された。
２７６．次に、各リガンドのＤＭＲシグナルの原因になっている細胞シグナリング経路が生物化学および細胞生物学アプローチを用いてさらに調査された。全てのこれらのリガンド誘導されたＤＭＲシグナルが特定であるが異なるシグナリング経路情報を含むという結果が示された。したがって、これらの全てのリガンドをＡ５４９細胞のためのマーカに選択することができる。これらのマーカの全てまたは部分的なコレクションは、Ａ５４９細胞のためのマーカのパネルとして結集され得る。
Ｄ．実施例３：Ａ４３１細胞における上皮細胞増殖因子受容体のシステム細胞生物学分析
２７７．培地を含む血清で１日間の培養し、これに続く０．１％の胎児のウシ血清を含む培地での２０時間の飢餓培養を通じて得られた部分的静止状態の細胞においてエピック（登録商標）細胞分析が実施された。分析は、Ａ４３１細胞のＥＧＦ刺激が２つの異なった連続するフェーズのＤＭＲシグナルをもたらすことを示した。すなわち（ｉ）信号増加（Ｐ−ＤＭＲ）を伴うポジティブフェーズ、および（ｉｉ）減衰フェーズ（Ｎ−ＤＭＲ）である。生物化学および細胞生物学調査は、このＥＧＦ誘導されたＤＭＲシグナルが、主にＲａｓ／ＭＡＰＫ経路にリンクされ、ＭＥＫを通して進行して、細胞分離をもたらすことを示した。（Ｆａｎｇ，Ｙ．ほか（２００５）「ラベルフリー光学バイオセンサで測定された生体細胞におけるＥＧＦ受容体シグナリングの動的密集体再配分の特徴」Ａｎａｌ.Ｃｈｅｍ、７７、５７２０−５７２５）
２７８．ここで、完全な静止状態にあるＡ４３１細胞におけるＥＧＦＲのシステム細胞生物学が波長インターロゲーションシステムを使用してその後再調査された。ＥＧＦは、プロテアーゼおよび脂肪酸を含まない０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１×ＨＢＳＳ内に懸濁された。最適な状態の下で、ＥＧＦは、静止状態のＡ４３１細胞において投与依存的反応を誘発した（データを示さず）。図４に示されるように、ＥＣ８０（〜３２ｎＭ）のＥＧＦは、完全に静止状態の細胞において顕著かつ強いＤＭＲシグナルをもたらした。ＥＤＦ ＤＭＲシグナルは、３つのフェーズにより構成された。すなわち、最初のＰ−ＤＭＲイベント、これに続くＮ−ＤＭＲイベントおよび回復したＰ−ＤＭＲ（ＲＰ−ＤＭＲ）イベントである。その一方、図４のネガティブコントロールにおいて示されるように、分析バッファ単独（すなわち、ビヒクル）では、少しの明らかなＤＭＲシグナルも誘発しなかった。図４において、各ＤＭＲシグナルは３２回の反復の平均化された反応を示している。
２７９．ターゲット特異性およびＥＧＦのシグナリング経路が第２の分析のセットを用いて精査された。図５に示すように、ＢＭＬ−２６５またはＡＧ１４７８による静止状態のＡ４３１細胞の前処理は、３２ｎＭのＥＧＦによって誘導されたＤＭＲシグナルをほとんど完全に遮断した。これは、ＢＭＬ−２６５およびＡＧ１４７８の双方がＥＧＦＲチロシンキナーゼ抑制剤である故、ＥＧＦ ＤＭＲシグナルがＥＧＦＲの活性化に起因することを示唆する。図５に示すように、Ｕ０１２６による静止状態のＡ４３１細胞の前処理は、Ｎ−ＤＭＲとＲＰ−ＤＭＲシグナルを顕著かつ選択的に減らした。これは、Ｕ０１２６がＭＥＫキナーゼ抑制剤である故、おそらくＭＥＫ−ＦＡＫ媒介される細胞分離に起因して、Ｎ−ＤＭＲイベントがＭＡＰＫ経路を通じて少なくとも部分的に進行することを示唆する。また、図５に示されるように、ロットレリンによる細胞の前処理は、特に早期のＰ−ＤＭＲイベントおよび早期のＮ−ＤＭＲイベントの一部の打ち切りを引き起こした。これはロットレリンがＰＫＣ抑制剤である故、ＥＧＦ ＤＭＲシグナルの早期のＤＭＲ反応が、ＥＧＦＲの下流のＰＫＣ経路の活性化に起因することを示唆する。
２８０．最後に、ＥＧＦ ＤＭＲシグナルが、８０のマーカのバイオモルキナーゼ抑制剤ライブラリを使って、体系的に精査された。１０マイクロモルの濃度の各キナーゼマーカが約１時間、完全に静止状態のＡ４３１細胞を処理するために使用された。分子前処理の後、ＥＧＦ誘導されたＤＭＲシグナルが測定された。３つのＤＭＲパラメータ、すなわち、Ｐ−ＤＭＲ、Ｎ−ＤＭＲ、ＲＰ−ＤＭＲの振幅が各反応から抽出され、キナーゼモジュレータの関数としてプロットされた。図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示すように、これらの様々なキナーゼ抑制剤は別個のＥＧＦ ＤＭＲパラメータを別々に変調した。これは、ＥＧＦ ＤＭＲシグナルが、ＥＧＦＲによって調停された静止状態のＡ４３１細胞のシグナリングに関するシステム細胞生物学情報を実際に含むことを示唆する。
Ｅ．実施例４：Ａ４３１およびＡ５４９細胞に関する異なったマーカのパネルによって誘導されたＤＭＲシグナル。
２８１．マーカの第１のパネルが各マーカの濃度ＥＣ８０またはＥＣ１００に近い濃度の静止状態のＡ４３１細胞に接触され、エピック（登録商標）システムによりＤＭＲ測定結果が得られた。このマーカのパネルは、エピック（登録商標）細胞分析を用いて、Ａ４３１細胞において特定されたマーカのライブラリから選択された。このパネルは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、エピネフリン、ニコチン酸およびヒスタミンを含んでいた。これらのマーカの各々は、細胞シグナリングの広い配列をもたらす。上述したＥＧＦＲ ＤＭＲと同様、生物化学および細胞生物学アプローチを併用したエピック（登録商標）細胞分析を使用して、我々はＡ４３１細胞におけるマーカ誘導されたＤＭＲシグナルの各々の原因となる経路およびネットワーク相互作用を割り出した。主な観測が以下にまとめられている。上皮細胞増殖因子は、ＰＬＣ−ＰＩ３Ｋ経路、ＭＡＰＫ経路、ＳＴＡＴ経路およびＰＫＣ経路を含む異なる多数の細胞シグナリングをもたらすＡ４３１における内在性ＥＧＦ受容体のための天然のアゴニストである。エピネフリンは、Ａ４３１細胞における内在性ビート２-アドレナリン受容体のための天然のアゴニストであり、その活性化がｃＡＭＰＰＫＡ経路をもたらす。ニコチン酸は、Ａ４３１における内在性ＧＰＲ１０９Ａ受容体のための天然のアゴニストであり、その活性化はＧｉ媒介シグナリングおよびＭＡＰＫ経路をもたらす。ヒスタミンは、Ａ４３１における内在性ヒスタミンタイプ１受容体（Ｈ１Ｒ）のための天然のアゴニストであり、その活性化はＧｑ媒介シグナリングおよびＰＫＣ経路をもたらす。図７は、エピック（登録商標）細胞分析によって測定されたマーカの第１のパネルによる刺激に反応する完全静止状態のＡ４３１細胞のＤＭＲシグナルを示している。各ＤＭＲシグナルは、４回の反復の平均化された反応を示している。
２８２．マーカの第２のパネルが各マーカの濃度ＥＣ８０またはＥＣ１００に近い濃度のＡ５４９細胞に接触され、エピック（登録商標）システムによりＤＭＲ測定結果が得られた。上述したＥＧＦＲ ＤＭＲと同様、生物化学および細胞生物学アプローチを併用したエピック（登録商標）細胞分析を使用して、我々はＡ５４９細胞におけるマーカ誘導されたＤＭＲシグナルの各々の原因となる経路およびネットワーク相互作用を割り出した。主な観測が以下にまとめられている。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、Ａ５４９における内在性トール様受容体のためのアゴニストであり、その活性化はＩＫＫ経路およびＡＫＴ経路をもたらす。ＳＬＩＧＫＶ−アミドは、Ａ５４９における内因性プロテアーゼ活性化受容体サブタイプ２（ＰＡＲ２）のためのアゴニストであり、その活性化はＧｑ、ＧｉおよびＧ１２／１３媒介シグナリングをもたらす。ピナシジルは、Ａ５４９における内在性ＡＴＰ感受性カリウム（ＫＡＴＰ）イオンチャネルのためのオープナーであり、その活性化はＲｈｏおよびＪＡＫ媒介シグナリングをもたらす。ＰＭＡはタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）のための活性剤であり、その活性化はＰＫＣ経路および脱顆粒をもたらす。ヒスタミンは、内因性ヒスタミン受容体（支配的にＨ１ＲおよびおそらくＨ３Ｒ）のための天然のアゴニストであり、その活性化はＡ５４９におそらくＧｑおよびＧｉ媒介シグナリングを介した２重のシグナリングをもたらす。フォルスコリンは、アデニリルシクラーゼのための活性剤であり、その活性化は、Ａ５４９にｃＡＭＰＰＫＡ経路をもたらす。図８は、エピック（登録商標）細胞分析によって測定されたマーカの第２のパネルによる刺激に反応するＡ５４９細胞のＤＭＲシグナルを示している。各ＤＭＲシグナルは、４回の反復の平均化された反応を示している。
Ｆ．実施例５：リガンドのＤＭＲインデックス
２８３．ＤＭＲインデックスは、４つのリガンド分子に対して生成された。静止状態のＡ４３１および増殖性のＡ５４９細胞は、それらの１次プロファイルを生成するために約１時間リガンド分子に別々にさらされ、これに続いて一定の濃度の各マーカで更に１時間刺激され（図７および図８に示すように）、双方のタイプの細胞におけるマーカのパネルに対して分子の２次プロファイルが生成された。次に、分子のＤＭＲインデックスをプロットするための読み出しとして１以上のＤＭＲパラメータが選択された。Ａ５４９におけるピナシジルＤＭＲ反応に関し、Ｎ−ＤＭＲの振幅（すなわち、刺激後３０分の振幅）が選択された。Ａ５４９におけるポリ（Ｉ：Ｃ）ＤＭＲ反応に関し、末期のＤＭＲの振幅（すなわち、刺激後５０分の振幅）が選択された。Ａ５４９におけるＰＭＡ反応に関し、末期のＤＭＲの振幅（すなわち、刺激後５０分の振幅）が選択された。Ａ５４９におけるＳＬＩＧＫＶ−アミド反応に関し、Ｐ−ＤＭＲ振幅（すなわち、刺激後２０分の振幅）が選択された。Ａ５４９におけるフォルスコリン反応に関し、Ｐ−ＤＭＲの振幅（すなわち、刺激後５０分の振幅）が選択された。Ａ５４９におけるヒスタミン反応に関し、初期のＤＭＲ振幅（すなわち、刺激後１０分の振幅）および末期の反応（すなわち刺激後３０分の振幅）の双方が選択された。Ａ４３１におけるエピネフリン反応に関し、Ｐ−ＤＭＲ振幅（すなわち、刺激後５０分の振幅）が選択された。Ａ４３１におけるニコチン酸ＤＭＲに関し、Ｐ−ＤＭＲ振幅（すなわち、刺激後３分の振幅）が選択された。Ａ４３１におけるＥＧＦ ＤＭＲに関し、Ｐ−ＤＭＲ振幅（すなわち、刺激後４分の振幅）およびＮ−ＤＭＲ振幅（すなわち刺激後４分−４０分の間の減衰している振幅）の双方が選択された。Ａ４３１におけるヒスタミン反応に関し、Ｐ−ＤＭＲ振幅（すなわち、刺激後３分の振幅）が選択された。各マーカに対するマーカの変調の割合は、細胞におけるマーカに対する分子の２次プロファイルを、同一の細胞に作用している同一のマーカの１次プロファイルに対して規格化することにより算出される。
２８４．図９、１０、１１、１２に示されるように、リガンド分子のＤＭＲインデックスは、２つの反応のタイプを含み得る。すなわち、双方の細胞株におけるアゴニストモード反応（すなわち、リガンド誘発された１次プロファイル）と、アンタゴニストＤＭＲインデックス（すなわち、マーカの２つのパネルに対するリガンドの細胞株ごとの２次プロファイル）である。
２８５．図９は、既知のリガンド、ＰＫＡ／ＰＫＧ抑制剤ＨＡ１０７７に関するＤＭＲインデックスを示している。ＨＡ１００７は、Ａ５４９およびＡ４３１細胞の双方において類似のＮ−ＤＭＲシグナルを誘発した。ＨＡ１０７７は、Ａ５４９においてほとんど完全にピナシジル反応を弱め、Ａ４３１において部分的にエピネフリン反応を弱め、Ａ４３１において部分的にヒスタミン反応を弱めた。しかしながら、ＨＡ１０７７は、Ａ５４９においてＰＭＡ反応およびヒスタミン反応を顕著に強めた。
２８６．図１０は、他の既知のリガンドのＤＭＲインデックス、ＰＫＡ／ＰＫＧ抑制剤Ｈ−８のＤＭＲインデックスを示している。Ｈ−８は、ＨＡ−１０７７と比較して類似のＤＭＲインデックスをもたらす。しかしながら、Ａ４３１細胞においてヒスタミン反応およびエピネフリン反応を弱めることに関して、Ｈ−８はより効果的ではなかった。これらの結果は、双方の抑制剤は、同一のターゲットＰＫＡを変調することを示唆している。
２８７．図１１は、既知のリガンド、ＰＩ３Ｋ抑制剤ＬＹ２９４００２のＤＭＲインデックスを示している。ＬＹ２９４００２は、Ａ４３１におけるＥＧＦ反応を選択的且つ部分的に弱めるが、Ａ４３１におけるヒスタミン反応を強める。図１２に示すように、他のＰＩ３Ｋ抑制剤ケルセチンは、類似のＤＭＲインデックスを生成した。これらの結果は、双方の抑制剤は同一のターゲットＰＩ３Ｋを変調することを示唆している。
２８８．図９、１０、１１および１２に示すように、ＨＡ１０７７またはＨ−８のＤＭＲインデックスは、ＬＹ２９４００２またはケルセチンのＤＭＲインデックスと劇的に異なり、ＨＡ１０７７およびＨ−８はＬＹ２９００４２またはケルセチンよりも異なる細胞ターゲットをターゲットにしていることを示唆している。
Ｇ．実施例６：エピック（登録商標）システムによる分析のためのＡ４３１およびＡ５４９細胞の準備
１．目的
ａ）このプロトコルは、エピック（登録商標）システムを用いた分子の細胞プロファイル薬理学分析のための解凍方法、継代（passage）、シードおよび２つの異なる付着細胞株（Ａ４３１およびＡ５４９）の準備におけるガイダンスを提供する。
２．方法の原理および推奨
ａ）原理：
（１）細胞がある分子にさらされているとき、それらはエピック（登録商標）システムを介して検出されモニタされる態様で反応することができる。それがエンドサイトーシス、アポトーシス、細胞輸送または細胞再編成によるかどうかにかかわらず、これらの動作はＲＷＧバイオセンサの検知量で見ることができ、追跡することができる。
（２）現在、これらの効果を調査するのに用いられる２つの細胞株がある。Ａ５４９は、付着細胞株であり、染色体の数が１２の様式の低三倍体人間細胞株であり、細胞の２４％で生じ、上皮性の形態を有する。Ａ４３１は人間の類表皮がんに由来する付着細胞で、上皮性の形態を示す。
ｂ）推奨
（１）Ａ５４９およびＡ４３１細胞の双方は、２−１５の継代が使用されるべきである。より高い継代は、不定なバイオセンサ反応をもたらす。
３．設備およびセットアップ
ａ）Ａ４３１細胞株（＃ＣＲＬ−１５５５、ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）
ｂ）Ａ５４９細胞株（＃ＣＣＬ−１８５、ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）
ｃ）ＤＭＥＭ（＃１０５６６−０１６、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｄ）保証され、熱不活性化された胎児のウシ血清（＃１００８２−１３９、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｅ）ペニシリン−ストレプトマイシン液（１００×）（＃１５１４０−１２２、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｆ）ジェネテシン（１００×）（＃１０１３１−０２７、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｇ）トリプシン−ＥＤＴＡ（ＥＤＴＡ ４Ｎａ含有０．２５％トリプシン）１×（＃２５２００−０５６、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｈ）１Ｍヘペス緩衝液（＃１５６３０−０８０、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｉ）カルシウムおよびマグネシウムを含むが、フェノールレッドを含まない１×ハンクス平衡塩類溶液（１×ＨＢＳＳ）（＃１４０２５−０９２、インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）
ｊ）Ｚシリーズ、Ｚ−ｐａｋ（＃８３２０３１２、ベックマンコールター、フラートン、カリフォルニア州）
ｋ）Dilu-Vial（＃３−３４１−１３、フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルベニア州）
ｌ）ベントキャップを有するコーニング２５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｔ−２５）（＃４３０６３９、コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）
ｍ）ベントキャップを有するコーニング７５ｃｍ２細胞培養フラスコ（Ｔ−７５）（＃４３０６４１、コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）
ｎ）コールターカウンターＺ１（モデルＺ１ Ｄ、ベックマンコールター、フラートン、カリフォルニア州）
ｏ）コーニングエピック（登録商標）３８４ウェルバイオセンサマイクロプレート細胞培養コンパチブル（＃５０４０、コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）
ｐ）コーニング３８４ウェルポリプロピレン分子貯蔵プレート（＃３６５３、コーニング社、コーニング、ニューヨーク州）
４．溶液および試薬
ａ）コンプリートＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ）
（１）ＤＭＥＭ
（２）１０％胎児ウシ血清
（３）１００μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマシン（１×）
ｂ）細胞分析緩衝液
（１）ＨＢＳＳ（１０ｍＭヘペスを含む１×ＨＢＳＳ、ｐＨ７．１）
５．手順
ａ）最初の細胞増殖（Ｔ−２５フラスコからの細胞の分配／パッセージング（Passaging））
（１）コンプリートＤＭＥＭ培地を３７℃のウォータバスに入れ、それを３７℃で暖める。
（２）トリプシン／ＥＤＴＡ０．２５％を室温下に置く。
（３）使用した培地を吸引する。
（４）２ｍｌ（Ｔ−２５）の０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡをフラスコに加え、前後にゆっくりフラスコをゆらすことによりフラスコ内の細胞を洗浄する。
（５）トリプシン／ＥＤＴＡを吸引する。
（６）２ｍｌ（Ｔ−２５）の０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡをフラスコに加える。
（７）ＣＯ２（５％）のインキュベータで３−５分間（Ａ５４９）または８−１２分間（Ａ４３１）または細胞が表面から剥離するまで３７℃で保温する。フラスコは前後に揺らさない。それは細胞凝縮を引き起こす場合がある。
（８）３ｍｌのコンプリート培地をＴ−２５フラスコに加え、フラスコ内で数回上下にピペット動作することにより細胞を分散させる。
（９）新たなフラスコに分配する準備をする。
（ａ）１：１０の希釈度（Ａ４３１）−新しいＴ−７５フラスコの中の１５ｍｌのｃＤＭＥＭに１．５ｍｌの新たに分散した細胞を加える−分配した細胞の間で５日間
（ｂ）１：１５の希釈度（Ａ５４９）−新しいＴ−７５フラスコの中の１４ｍｌのｃＤＭＥＭに１ｍｌの新たに分散した細胞を加える−分配した細胞の間で４日間
（１０）細胞が顕微鏡の下で視覚の点検によって９０％より高い密集度に至るまで湿度９５％、３７℃にセットされたＣＯ２（５％）インキュベータに、Ｔ−７５フラスコを入れる。− 再び、増殖させる（分配する）準備をする。
ｂ）細胞増殖（Ｔ−７５フラスコからの細胞の分配／パッセージング（Passaging））
（１）コンプリートＤＭＥＭ培地を３７℃のウォータバスに入れ、それを３７℃で暖める。
（２）トリプシン／ＥＤＴＡ０．２５％を室温下に置く。
（３）使用した培地を吸引する。
（４）３ｍｌ（Ｔ−７５）の０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡをフラスコに加え、前後にゆっくりフラスコをゆらすことによりフラスコ内の細胞を洗浄する。
（５）トリプシン／ＥＤＴＡを吸引する。
（６）３ｍｌ（Ｔ−７５）の０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡをフラスコに加える。
（７）ＣＯ２（５％）のインキュベータで３−５分間（Ａ５４９）または８−１２分間（Ａ４３１）または細胞が表面から剥離するまで３７℃で保温する。フラスコは前後に揺らさない。それは細胞凝縮を引き起こす場合がある。
（８）ほとんど全ての細胞がフラスコ表面から剥離した後、１２ｍｌ（Ｔ−７５）のコンプリート培地を細胞に加える。フラスコ内で数回上下にピペット動作することにより細胞を分散させる。
（９）新たなフラスコに分配する準備をする。
（ａ）１：１０の希釈度（Ａ４３１）−新しいＴ−７５フラスコの中の１４ｍｌのｃＤＭＥＭに１．５ｍｌの新たに分散した細胞を加える−分配した細胞の間で５日間
（ｂ）１：１５の希釈度（Ａ５４９）−新しいＴ−７５フラスコの中の１４ｍｌのｃＤＭＥＭに１ｍｌの新たに分散した細胞を加える−分配した細胞の間で４日間
（１０）細胞が顕微鏡の下で視覚の点検によって９０％より高い密集度に至るまで湿度９５％、３７℃にセットされたＣＯ２（５％）インキュベータに、Ｔ−７５フラスコを入れる。− 再び、増殖させる（分配する）準備をする。
ｃ）細胞カウント
（１）ベックマンコールターのパーティクルカウンターをオンにする。
（２）カウンティング容器を１０ｍｌの希釈剤で満たす。
（３）１０ｍｌに対して５０μｌの細胞を加える。
（４）スタートボタンを押してカウントを開始する。
（５）カウンタは、カウントが終了すると結果を表示させる。
（６）カウントを繰り返す−カウントの変動が５％以上である場合はより多く。
（７）最初のストックにおける細胞／ｍｌの濃度を判定する。すなわち、
[(#の細胞)(10ml)]/[(サンプル中の0.05ml)(0.5ml コールターサンプリング量)] または (#の細胞)(400)
（８）トータル細胞＝細胞／ｍｌの濃度×細胞のトータル量
ｄ）細胞シーディング
（１）収穫後、Ｔ−７５フラスコから細胞を収集する。
（２）細胞の数量をカウントする。
（３）室温下、２０００ｒｐｍで５分間、細胞を回転させる。
（４）培地を吸引する。
（５）５０ｍｌの遠心分離チューブの中のｃＤＭＥＭ培地を用いて細胞を最終シーディング濃度（Ａ４３１では４０００００細胞／ｍｌ、Ａ５４９では３２００００細胞／ｍｌ）で再懸濁させる。
（６）自動ピペッターを使用して５０μｌの細胞を３８４ウェルバイオセンサプレートの各ウェルに加える。
（７）ウェルの底で捕捉された気泡がないことを確認する。
（８）気泡をピペットで外部に取り出し、ウェルに戻すことにより気泡を除去する必要がある。
（９）プレートを少なくとも１５−３０分間層流フード内で保温する。
（１０）望ましい密集度に達するまで（通常一晩中）、５％のＣＯ２インキュベータ内で３７℃、湿度９５％にて細胞を保温する。
ｅ）Ａ４３１細胞を飢餓にする
（１）分析が実施される前日に細胞を少なくとも１６時間飢えさせる必要がある。
（２）血清フリー培地（１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ）を３７℃下に置く。
（３）適切な容器内でプレートをはじくか、プレート洗浄機を使用することによって、血清培地の全てを除去する。
（４）５０μｌの血清フリー培地を各ウェルに加える。
（５）ステップ（３）および（４）を１回繰り返す
（６）次の日まで、５％ＣＯ２のインキュベータ内で３７℃、湿度９５％にて細胞を保温する。
６．エピック（登録商標）ベータシステムによる実験の準備
ａ）バイオテックのＥＬｘ４０５ＵＣＷプレート洗浄機を使用して、細胞を洗浄する。
（１）ＣＯ２インキュベータから、細胞を有する細胞分析プレートを除去する。
（２）蓋を取り外す。
（３）５０μｌのＨＢＳＳを使用して細胞をプレート洗浄機で２回洗浄する。
（４）１ウェルあたり５０μｌのＨＢＳＳを加える。
（５）４０μｌ残すのに余分なバッファを吸引する。
ｂ）蓋を元に戻す。
ｃ）プレートを少なくとも１時間エピック（登録商標）機器のホテル内にカバーした状態で入れる。
７．パラメータのセットアップおよびエピック（登録商標）ベータシステムによる実験の実行
ａ）データ収集率（一般的に１５秒／読み出し）、ベースライン（〜２分）および分析（〜６０または９０分）のための時間を含む適切な分析パラメータを選択する。
ｂ）複合物リソースプレートのタイプ、蓋の除去、複合物添加および混合、蓋を元に戻すことを含む適切なロボットパラメータを選択する。
ｃ）チップを変更する（ＣｙＢｉｏ Ｃａｔ ＃ ＯＬ２００１−２５−２５０）
ｄ）ソースプレート（分子プレート）およびテストプレート（細胞分析プレート）を装着する。
ｅ）「プレートＩＤ」にプレートネームをタイプする
ｆ）標準プロトコルを使用する「分析プロトコル」で実行する。各スキャンは、分析プレートの底を横切る２回のスイープの平均である。
（ａ）ベースラインのために１２０秒間のプレスキャンを行う。
（ｂ）５×濃度で１０μｌの分子を加える。
（ｃ）さらに２４００秒間（〜１時間）スキャンする。
ｇ）ソースプレートおよびテストプレートを取り外す。
先にされた米国特許出願の利益の要求
１．本出願は、２００８年１１月２４日に出願された先の米国特許出願Ｎｏ．６１／１１７４５０の利益を要求する。本書面の内容およびここで言及された刊行物、特許、および特許文書の全ての開示が参照によって組み入れられる。
ＶＩ．参考文献
２８９．Fang, .Y., Ferrie, A.M., and Li, G.著 (2005)文献名「Probing cytoskeleton modulation by optical biosensors」 FEBS Lett., 579, 4175-4180
２９０． Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.H., Yuen, P.K.著 (2005)文献名「Characteristics of dynamic mass redistribution of EGF receptor signaling in living cells measured with label free optical biosensors」Anal. Chem., 77, 5720-5725
２９１． Fang, Y., Li, G., Peng, J. 著(2005)文献名「Optical biosensor provides insights for bradykinin B2 receptor signaling in A431 cells.」FEBS Lett. 579, 6365-6374」
２９２．Fang, Y., Ferrie, A.M., Fontaine, N.H., Mauro, J., Balakrishnan, J.著(2006)文献名「Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing」Biophys. J., 91, 1925-1940
２９３．Fang, Y. 著(2006)文献名「Label-free cell-based assays with optical biosensors in drug discovery」Assays and Drug development Technologies. 4(5), 583-595
２９４．Fang, Y., Li, G. and Ferrie, A.M.著 (2007)文献名「Non-invasive optical biosensor for assaying endogenous G protein-coupled receptors in adherent cells」J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 55, 314-322
２９５． Fang, Y. and Ferrie, A.M. 著(2007)文献名「Optical biosensor differentiates signaling of endogenous PAR1 and PAR2 in A431 cells」BMC Cell Biol., 8, 24(1-12)
２９６．Fang, Y. 著(2007)文献名「Non-invasive optical biosensor for probing cell signaling」Sensors, 7, 2316-2329
２９７． Fang, Y., and Ferrie, A.M. 著(2008)文献名「label-free optical biosensor for ligand-directed functional selectivity acting on β2 adrenoceptor in living cells」FEBS Lett. 582, 558-564
２９８． Lee, P.H., Gao, A., van Staden, C., Ly, J., Salon, J., Xu, A., Fang, Y., and Verkleeren, R. 著(2008)文献名「Evaluation of dynamic mass redistribution technology for pharmacological studies of recombinant and endogenously expressed G protein-coupled receptors.」Assay and Drug Development Technologies, 6, 83-93
２９９． Fang, Y., Frutos, A.G., Verklereen, R. 著(2008)文献名「Label-free cell assays for GPCR screening. Comb.」Comb. Chem.& HTS 11, 357-369

Claims (53)

  1. 分子を特徴付けるための方法であって、
    ａ．必要に応じて１次プロファイルを生成している分子のバイオセンサ反応を収集するステップと、
    ｂ．２次プロファイルを生成している前記分子の存在下において細胞パネルにおけるマーカパネルのバイオセンサ反応を収集するステップと、
    ｃ．各バイオセンサシグナルバイオセンサパラメータの特定のセットを抽出するステップと、
    ｄ．ポジティブコントロールに対して各バイオセンサパラメータを規格化して変調比較を生成するステップと、
    ｅ．前記マーカパネルまたは前記細胞パネルの関数として少なくとも１つのバイオセンサパラメータの前記変調比較をプロットして分子変調インデックスを生成するステップと、
    ｆ．必要に応じて、前記分子の前記１次プロファイルと前記分子変調インデックスとを組み合わせて分子バイオセンサインデックスを生成するステップと、
    ｇ．前記分子バイオセンサインデックスとモジュレータバイオセンサインデックスのライブラリとを比較するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  2. 前記バイオセンサはＤＭＲを検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記分子バイオセンサインデックスにおける１つ以上の分子変調プロファイルに類似する前記モジュレータバイオセンサインデックスにおける１以上のマーカ変調プロファイルを特定するステップを更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記分子は、前記分子バイオセンサインデックスが前記モジュレータバイオセンサインデックスに類似するとき、前記モジュレータと活動の類似したモードを共有することを特徴とする請求項２に記載の方法。
  5. 前記ステップａは、アゴニストモードにおいて実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記ステップｄにおける前記ポジティブコントロールは、前記細胞のサンプルが前記マーカのみによって処理されているときに生成されたマーカの１次プロファイルを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記変調比較は、増強を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記変調比較は、抑制を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記変調比較は、非変調を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記モジュレータバイオセンサインデックスのライブラリは分子変調インデックスを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記モジュレータバイオセンサインデックスのライブラリは分子バイオセンサインデックスを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 前記モジュレータバイオセンサインデックスのライブラリは、同一の細胞パネルのための同一マーカパネルに対して異なる分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. 前記分子バイオセンサインデックスとモジュレータバイオセンサインデックスとの間の類似性は、活動のモードのインジケータとして使用されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  14. 前記類似性は前記分子バイオセンサインデックス間のパターン認識分析に基づいていることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  15. 前記類似性は前記分子変調インデックス間のパターン認識分析に基づいていることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  16. 前記類似性は前記分子変調インデックスに関するスコアのマトリックスに基づいていることを特徴とする請求項３に記載の方法。
  17. 前記マーカパネルは、リガンドのライブラリから選択され、前記リガンドの各々は細胞における特定の細胞シグナリング経路を示すバイオセンサシグナルを生成していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  18. 細胞におけるマーカの不存在下または存在下において前記分子の長期間バイオセンサシグナルを生成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  19. 前記マーカは前記分子が前記細胞に添加される前、またはそのとき、またはその後に添加されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  20. 前記細胞パネルは、特定の病気に関連する細胞のタイプ、特定の起源からの細胞のタイプ、特定のターゲットに関連する細胞のタイプ、特定の生理学的機能と関連する細胞のタイプ、を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  21. 前記細胞パネルは、体内に生じた細胞、操作された細胞、変形された細胞、不死化された細胞、主要な細胞、胚幹細胞、成体幹細胞、癌幹細胞、幹細胞由来細胞を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  22. 前記ステップ（ａ）は、前記細胞を特定の投与量の分子と接触させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  23. 前記特定の投与量は１μＭ、５μＭ、１０μＭ、５０μＭから選択される所定の分子濃度であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  24. 前記特定の投与量は１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、 １００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、 １０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌから選択される所定の分子濃度であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  25. 前記特定の投与量は、前記細胞におけるバイオセンサシグナルを誘発するために、マーカのＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、ＥＣ１００であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
  26. 前記ステップ（ｂ）は、前記細胞を前記マーカパネルにおける特定の投与量のマーカと接触させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  27. 前記ステップ（ｂ）は、前記細胞をある期間リガンドに接触させ、その後前記細胞を前記マーカに接触させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  28. 前記ステップ（ｂ）は、前記細胞をある期間前記マーカに接触させ、その後前記細胞を前記分子に接触させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  29. 前記ステップ（ｂ）は、前記細胞を前記マーカおよび前記分子に同時に接触させるステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  30. 前記ステップ（ｄ）は、
    （１）マーカの１次プロファイルのＰ−ＤＭＲの振幅と、前記マーカに対する前記分子の２次プロファイルのＰ−ＤＭＲの振幅
    （２）マーカの１次プロファイルのＮ−ＤＭＲの振幅と、前記マーカに対する前記分子の２次プロファイルのＮ−ＤＭＲの振幅
    （３）マーカの１次プロファイルのＲＰ−ＤＭＲの振幅と、前記マーカに対する前記分子の２次プロファイルのＲＰ−ＤＭＲの振幅
    またはこれらの組み合わせを比較するステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  31. 前記変調比較は変調差、変調割合またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  32. インデックスを生成する方法であって、
    ａ．１より多いマーカに対する分子の変調プロファイルを収集するステップと、
    ｂ．インデックスにおける前記分子の変調比較をリストアップするステップと、を含むことを特徴とする方法。
  33. 変調インデックスは１つの細胞タイプにおいておよび複数のマーカに関して得られることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  34. 変調インデックスは複数の細胞タイプにおいておよび単一のマーカに関して得られることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  35. 変調インデックスは複数の細胞のタイプにおいておよび複数のマーカに関して得られることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  36. 変調インデックスは複数のマーカに関して得られることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
  37. 創薬の方法であって、
    ａ．未知の分子インデックスと既知のモジュレータインデックスとを比較するステップと、
    ｂ．未知の分子リガンドインデックスが前記既知のモジュレータインデックスと類似しているかどうか判定するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  38. 分子を特徴付けるための方法であって、
    ａ．細胞をマーカに接触させるステップと、
    ｂ．前記細胞の前記マーカに対する反応を分析して１次プロファイルを得るステップと、
    ｃ．細胞をマーカおよび分子に接触させるステップと、
    ｄ．前記細胞の前記マーカおよび前記分子に対する反応を分析して変調プロファイルを得るステップと、を含むことを特徴とする方法。
  39. 分子を特徴付けるための方法であって、
    ａ．細胞をマーカおよび分子に接触させるステップと、
    ｂ．前記細胞の前記マーカおよび前記分子に対する反応を分析するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  40. 先行するステップの後に前記分子を合成するステップを更に含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
  41. 前記分子の派生物のライブラリを制作するステップを更に含むことを特徴とする請求項４０に記載の方法。
  42. １以上のステップは機械で実行されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
  43. 前記機械は汎用コンピュータであることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
  44. 前記機械はバイオセンサであることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
  45. 組成を作成する方法であって、
    分子を合成するステップを含み、前記分子は分子として特徴付けられ、分子インデックスは、モジュレータインデックスに対して類似性を有し、請求項１に記載の方法を用いて特定され得ることを特徴とする方法。
  46. 請求項４５のプロセスによって製造された製造物。
  47. バイオセンサ細胞分析を使用して分子をスクリーニングする方法であって、
    ａ．細胞のパネルを選択するステップと、
    ｂ．各々が前記細胞パネルにおける各細胞に対応するように複数のマーカのパネルを選択するステップと、
    ｃ．分子処理された細胞のパネルを生成している分子でパネルにおける各細胞を処理するステップと、
    ｄ．バイオセンサ反応をモニタリングして前記分子の１次プロファイルのパネルを各細胞に関して生成するステップと、
    ｅ．マーカパネルの各マーカを、分子処理された細胞のパネルの各細胞に個別に特定の投与量で加えるステップと、
    ｆ．バイオセンサ反応をモニタリングして、マーカのバイオセンサシグナルに影響を与えている分子の２次プロファイルのパネルを各マーカに関して生成するステップと、
    ｇ．前記細胞のパネルに亘るおよび前記マーカのパネルに対する分子バイオセンサインデックスを生成するステップと、
    ｈ．前記分子バイオセンサインデックスと既知のモジュレータバイオセンサインデックスとを比較するステップと、を含み、
    前記分子バイオセンサインデックスと前記モジュレータバイオセンサインデックスとの間の類似性が前記分子の活動のモードに関するインジケータであることを特徴とする方法。
  48. 前記細胞のパネルは特定の病気、特定の細胞ターゲット、特定の起源に関連し、または特定の人間生理学および病態生理学の代表であることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
  49. 少なくとも１つの細胞システムが前記細胞のパネルに含まれることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
  50. 前記細胞システムは、２つの細胞のタイプからなることを特徴とする請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ステップｅにおける特定の投与量は、前記細胞におけるバイオセンサシグナルを誘発するために、少なくともそのＥＣ５０、ＥＣ８０、ＥＣ９０、ＥＣ９５、ＥＣ１００である濃度を含むことを特徴とする請求項４７に記載の方法。
  52. 分子を特徴付けるための方法であって、
    ａ．既知のリガンドのパネルで細胞のパネルをパニングして前記既知のリガンドが所定の細胞タイプにおいて強いバイオセンサシグナルを誘発できるかどうかを判定するステップと、
    ｂ．マーカとして強いバイオセンサシグナルを誘発し得る既知のリガンドを選択し、所定の細胞タイプのためのマーカのライブラリを生成するステップと、
    ｃ．特定の細胞タイプにおいてバイオセンサシグナルを誘発するその能力に関する各マーカの潜在力および効能を判定するステップと、
    ｄ．特定の細胞タイプにおいて各マーカによって誘発されたシグナリング経路およびネットワーク相互作用を割り出すステップと、
    ｅ．各細胞タイプに関するマーカのパネルをダウンセレクトするステップと、
    ｆ．前記分子の１次プロファイルのパネルを生成するために、前記細胞のパネルにおいてバイオセンサシグナルを誘発する前記分子の能力を調べ、および前記マーカパネルに対する前記分子の２次プロファイルまたは変調プロファイルのパネルを生成するために、前記細胞のパネルにおいてマーカ誘導されたバイオセンサシグナルを変調する前記分子の能力を調べる分析を実施するステップと、
    ｇ．分子バイオセンサインデックスを生成するステップと、
    ｈ．前記分子バイオセンサインデックスと既知のモジュレータバイオセンサインデックスのライブラリを比較するステップと、を含むことを特徴とする方法。
  53. 分子を特徴付けるための方法であって、
    ａ． １次プロファイルを生成している分子のＤＭＲ反応を収集するステップと、
    ｂ．２次プロファイルを生成している分子の存在下において、細胞パネルにおけるマーカパネルのＤＭＲ反応を収集するステップと、
    ｃ．バイオセンサシグナルの各々からＤＭＲパラメータの特定のセットを抽出するステップと、
    ｄ．ポジティブコントロールに対して各ＤＭＲパラメータを規格化して変調比較を生成するステップと、
    ｅ．前記マーカパネルまたは前記細胞パネルの関数として少なくとも１つのバイオセンサパラメータの前記変調比較をプロットして分子変調インデックスを生成するステップと、
    ｆ．必要に応じて、前記分子の前記１次プロファイルと前記分子変調インデックスを組み合わせて分子ＤＭＲインデックスを生成するステップと、
    ｇ．前記分子ＤＭＲインデックスとモジュレータＤＭＲインデックスのライブラリを比較するステップとを含むことを特徴とする方法。
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