KR20060083208A - 비만 및/또는 당뇨를 진단, 관찰 및 치료하기 위한 조성물,시약 및 키트와 이를 위한 방법 - Google Patents

비만 및/또는 당뇨를 진단, 관찰 및 치료하기 위한 조성물,시약 및 키트와 이를 위한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자의 선택적 스플라이싱의 13개 신규 변형체에 관한 것이다.
비만 및/또는 당뇨 핵산 서열, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물, 선택적 스플라이싱.

Description

비만 및/또는 당뇨를 진단, 관찰 및 치료하기 위한 조성물, 시약 및 키트와 이를 위한 방법{COMPOSITIONS, REAGENTS AND KITS FOR AND METHODS OF DIAGNOSING, MONITORING AND TREATING OBESITY AND/OR DIABETES}
관련 출원과의 상호참조
본 출원은 미국 특허출원 일련번호 10/659,782호 (2003년 9월 11일 출원) (여기에서 그 전체내용이 참고문헌으로 포함됨)의 특권을 특허청구한다.
본 발명은, 비만 및 당뇨 마커, 비만 및 당뇨 마커 전사체 및 번역 생성물을 검출할 수 있는 시약, 비만 및 당뇨 마커 전사체 및 번역 생성물을 검출하기 위한 키트 및 방법, 개개인에서 비만 및 당뇨를 선별 및 진단하고 비만 및 당뇨로 진단된 환자에서 치료에 대한 반응, 질병 진행 및 질병 재발을 관찰하기 위한 방법 및 키트, 비만 및/또는 당뇨 마커 전사체의 번역 생성물에 특이적으로 결합하는 화합물, 비만 및 당뇨 마커 또는 그들의 번역 생성물의 하나 또는 몇몇의 조성물을 치료제로서 사용하는 비만 및/또는 당뇨의 치료, 비만 및/또는 당뇨를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
비만은 미국에서 예방가능한 사망 원인의 두번째로 가장 중요하고, 단지 흡연 만이 이를 초과하고 있다. 비만은 58,000,000명의 사람을 괴롭히는 것으로 추 정되고, 미국에서 매년 300,000명을 사망시키는 원인이 되며, 그 이환율이 점점 증가하고 있다. 질병을 앓고 있는 개개인들은 고혈압, 지질 장애, 관상동맥 심장병, 유형 II 당뇨병, 발작, 담낭 질환, 골관절염, 수면중 일시 호흡 곤란증, 호흡기 문제 및 특정한 암으로부터의 병이 증가될 위험에 놓여 있다.
에너지 사용에 비해 과다한 에너지가 섭취될 때 비만이 발생한다. 이러한 과다한 에너지의 원인은 환자마다 다를 수도 있고, 다양한 유전적, 사회적 및 환경적 요인으로부터 유래되는 것으로 생각된다. 현재의 연구는, 동일한 환경 조건하에서도 서로 다른 사람들은 상이한 비율로 체중이 늘고, 체중이 느는 양은 아마도 유전적으로 결정될 것이라는 관점을 지지하고 있다. 자연발생적인 도태는, 우리의 먼 조상들이 이후 다가올 굶주림 동안 신체를 지탱하기 위하여 진수성찬으로부터 지방을 저장하는 능력을 증대시키는 '절약 유전자'를 획득하도록 한 것으로 제안되고 있다. 오늘날의 고 지방, 고 열량의 "서양 스타일" 음식을 과식하는 환경에서, "절약 유전자"가 오히려 불리해 지고 있다.
더 많은 과학자 및 내과의사들이, 불량한 식이요법 및 운동 부족 만이 비만의 원인이라는 전통적인 믿음을 거부하고 있고, 그것을 의학적인 병으로 점점 더 간주하고 있다. 건강 경제전문가들은, 미래 연구 및 국가 건강 통계치를 사용하여, 1995년에 미국에서 비만의 비용을 992억 달러로 계산하고 있다. 2005년까지 세계에서 12억 명 이상이 비만할 것으로 추정된다. 미국에서 비만의 경제적 영향은, 이제 당뇨의 영향에 필적하고, 심장병 및 고혈압에 대한 지출과 함께 순위를 차지하고 있다. 의학 연구자들은, 유형 II 당뇨병의 모든 경우의 적어도 88%, 관 상동맥 심장병 사례의 57%, 유방암의 11% 및 과체중 미국인에서 진단된 결장암의 10%가 비만에 기인하는 것으로 추정한다.
세계 건강 기구는 비만 상태를 유행병으로 분류하고 있고, 인간 건강 및 복지에 대한 가장 큰 위험 중의 하나와 맞붙을 특별 전문 위원회를 설립하였다.
비만 및/또는 당뇨 특이적 마커가 여전히 요구되고 있다. 환자로부터의 시료 중에 비만 및/또는 당뇨 마커의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 시약 및 키트도 여전히 요구되고 있다. 환자로부터의 시료 중에서 비만 및/또는 당뇨가 미래에 발생할 경향을 검출하기 위해 사용될 수 있는 시약 및 키트가 여전히 요구되고 있다. 비만 및/또는 당뇨를 가진 개인을 선별 및 진단하는 방법, 및 비만 및/또는 당뇨로 진단된 환자에서 치료에 대한 반응, 질병 진행 및 질병 재발을 관찰하기 위한 방법이 여전히 요구되고 있다.
뚱뚱한 개인이 갖고 있는 비만 및/또는 당뇨의 유형을 결정하기 위한 시약, 키트 및 방법이 여전히 요구되고 있다. 또한, 비만 및/또는 당뇨 관련 세포를 특이적으로 표적화할 수 있는 조성물이 요구되고 있다. 비만 및/또는 당뇨를 앓고 있는 것으로 의심되는 개인의 개선된 치료 방법이 여전히 요구되고 있다.
용어풀이
하기 상세한 설명 및 청구의 범위에서, 때때로 여러 용어들이 사용되며, 본 발명에 따라 해석되어야 할 이러한 용어들의 의미는 다음과 같다:
"비만 및/또는 당뇨 핵산 서열" - 상기 서열 및 최소 15 b.p. 길이의 상기 서열의 단편(하기 표 2 참조)에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 서열 1 내지 서열 4 및 서열 22 내지 서열 25 서열의 어느 하나에 나타낸 서열(하기 표 2 참조). 이러한 서열들은, 244개 아미노산의 인간 30kDa 당단백질을 코드화하는 서열인 좌 Hs.9370 (수탁 번호 NM_004797)로서 로커스 링크(Locus Link)에 나타낸, 천연 및 공지된 아디포넥틴의 자연 발생적인 선택적 스플라이스 변형체를 코드화하는 서열이다. 본 발명의 신규 변형체는 아디포넥틴의 선택적 스플라이싱으로부터 생겨난 천연 발생 서열이고, 단순히 유전자의 끝 절단(truncated), 돌연변이화 또는 단편화 형태가 아니라는 것이 강조되어야 한다.
- 상기 서열 및 최소 15 b.p. 길이의 상기 서열의 단편(하기 표 2 참조)에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 서열 5 내지 서열 9 및 서열 26 내지 서열 30 서열의 어느 하나에 나타낸 서열(하기 참조) . 이러한 서열들은, 247개 아미노산의 생쥐 30kDa 당단백질을 코드화하는 서열인 좌 Mn.11450 (수탁 번호 NM_009605)로서 로커스 링크(Locus Link)에 나타낸, 천연 및 공지된 아디포넥틴의 자연 발생적인 선택적 스플라이스 변형체를 코드화하는 서열이다. 본 발명의 신규 변형체는 아디포넥틴의 선택적 스플라이싱으로부터 생겨난 천연 발생 서열이고, 단순히 유전자의 끝 절단, 돌연변이화 또는 단편화 형태가 아니라는 것이 강조되어야 한다.
- 상기 서열 및 최소 15 b.p. 길이의 상기 서열의 단편(하기 표 2 참조)에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 서열 10 내지 서열 11 및 서열 31 내지 서열 32 서열의 어느 하나에 나타낸 서열(하기 표 2 참조). 이러한 서열들은, 117개 아미노산의 인간 13kDa 당단백질을 코드화하는 서열인 좌 Hs.51738 (수탁 번호 NM_016362)로서 로커스 링크(Locus Link)에 나타낸, 천연 및 공지된 그렐린의 자연 발생적인 선택적 스플라이스 변형체를 코드화하는 서열이다. 본 발명의 신규 변형체는 그렐린(Ghrelin)의 선택적 스플라이싱으로부터 생겨난 천연 발생 서열이고, 단순히 유전자의 끝 절단, 돌연변이화 또는 단편화 형태가 아니라는 것이 강조되어야 한다.
- 상기 서열 및 최소 15 b.p. 길이의 상기 서열의 단편(하기 표 2 참조)에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 서열 12 내지 서열 18 및 서열 33 내지 서열 39 서열의 어느 하나에 나타낸 서열(하기 표 2 참조). 이러한 서열들은, 292개 아미노산의 인간 32kDa 당단백질을 코드화하는 서열인 좌 Hs.3290 (수탁 번호 NM_005525)로서 로커스 링크(Locus Link)에 나타낸, 천연 및 공지된 11-베타-HSD의 자연 발생적인 선택적 스플라이스 변형체를 코드화하는 서열이다. 본 발명의 신규 변형체는 11-베타-HSD의 선택적 스플라이싱으로부터 생겨난 천연 발생 서열이고, 단순히 유전자의 끝 절단, 돌연변이화 또는 단편화 형태가 아니라는 것이 강조되어야 한다.
- 상기 서열 및 최소 15 b.p. 길이의 상기 서열의 단편(하기 표 2 참조)에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 서열 19 내지 서열 21 및 서열 40 내지 서열 42 서열의 어느 하나에 나타낸 서열(하기 표 2 참조). 이러한 서열들은, 292개 아미노산의 생쥐 32kDa 당단백질을 코드화하는 서열인 좌 Mn.15483 (수탁 번호 NM_008288)로서 로커스 링크(Locus Link)에 나타낸, 천연 및 공지된 11-베타-HSD의 자연 발생적인 선택적 스플라이스 변형체를 코드화하는 서열이다. 본 발명의 신규 변형체는 11-베타-HSD의 선택적 스플라이싱으로부터 생겨난 천연 발생 서열이고, 단순히 유전자의 끝 절단, 돌연변이화 또는 단편화 형태가 아니라는 것이 강조되어 야 한다.
비만 및/또는 당뇨 관련 유전자 변형체의 설명 및 근원 서열과의 차이점을 하기 표 1에 요약한다.
서열 비만 및 당뇨 관련 유전자 진뱅크(GeneBank) 인간 좌 ID 진뱅크 생쥐 좌 ID 유전자 기호 변형 설명
1 아디포넥틴 -WT (변형체 1) 9370 (11450) APM 인간 야생형 단백질의 뉴클레오티드 서열(인간)
2 아디포넥틴 변형체 2 변형체2의 뉴클레오티드 서열(인간)
3 아디포넥틴 변형체 3 변형체3의 뉴클레오티드 서열(인간)
4 아디포넥틴 변형체 4 변형체4의 뉴클레오티드 서열(인간)
5 아디포넥틴 -WT (변형체 1) (9370) 11450 APM 생쥐 야생형 단백질의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
6 아디포넥틴 변형체 2 변형체2의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
7 아디포넥틴 변형체 3 변형체3의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
8 아디포넥틴 변형체 4 변형체4의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
9 아디포넥틴 변형체5 변형체5의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
10 그렐린-WT (변형체1) 51738 (58991) GHRL 인간 야생형 단백질의 뉴클레오티드 서열
11 그렐린 변형체2 변형체2의 뉴클레오티드 서열(인간)
12 11-베타-HSD-WT(변형체1) 3290 (15483) HSD11 B1 야생형 인간 단백질의 뉴클레오티드 서열
13 11-베타-HSD 변형체 2 변형체2의 뉴클레오티드 서열(인간)
14 11-베타-HSD 변형체 3 변형체3의 뉴클레오티드 서열(인간)
15 11-베타-HSD 변형체 4 변형체4의 뉴클레오티드 서열(인간)
16 11-베타-HSD 변형체 5 변형체5의 뉴클레오티드 서열(인간)
17 11-베타-HSD 변형체 6 변형체6의 뉴클레오티드 서열(인간)
18 11-베타-HSD 변형체 7 변형체7의 뉴클레오티드 서열(인간)
19 11-베타-HSD-WT (변형체 1) 생쥐 야생형 단백질의 뉴클레오티드 서열
20 11-베타-HSD 변형체 8 변형체 8의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
21 11-베타-HSD 변형체 9 변형체 9의 뉴클레오티드 서열(생쥐)
22 아디포넥틴-WT (변형체1) 9370 (11450) APM 야생형 인간 단백질 서열
23 아디포넥틴 변형체2 선택적 개시 (인간)
24 아디포넥틴 변형체3
25 아디포넥틴 변형체4
26 아디포넥틴-WT (변형체1) 야생형 생쥐 단백질 서열
27 아디포넥틴 변형체 2 선택적 개시 (생쥐)
28 아디포넥틴 변형체 3 156개 아미노산을 가진 변형체를 생성하는 야생형 단백질에서 위치 111로부터의 대체 45개 아미노산 (생쥐)
29 아디포넥틴 변형체 4 169개 아미노산을 가진 변형체를 생성하는 야생형 단백질에서 위치 111로부터의 대체 58개 아미노산
30 아디포넥틴 변형체 5 짧은 변형체 76개 아미노산 길이(생쥐)
31 그렐린-WT (변형체 1) 51738 (58991) GHRL 야생형 인간 단백질 서열
32 그렐린 변형체 2 117개 아미노산을 가진 변형체를 생성하는 야생형 단백질에서 위치 35로부터의 대체 70개 아미노산(인간)
33 11-베타-HSD-WT (변형체 1) 3290 (15483) HSD11 B1 야생형 인간 단백질 서열
34 11-베타-HSD 변형체 2 야생형 단백질에서 아미노산 64로부터의 18개 아미노산 및 나머지를 대신하는 16개 아미노산의 대체 엑손의 결실 (인간)
35 11-베타-HSD 변형체 3 295개 아미노산을 가진 변형체를 생성하는 아미노산 286으로부터의 대체 9개 아미노산(인간)
36 11-베타-HSD 변형체 4 야생형 단백질에서 아미노산 137 내지 아미노산 155까지의 18개 아미노산 결실(인간)
37 11-베타 HSD 변형체 5 야생형 단백질에서 아미노산 64 내지 아미노산 84까지의 20개 아미노산 결실(인간)
38 11-베타-HSD 변형체 6 야생형 단백질에서 아미노산 번호 31에서의 선택적 개시(인간)
39 11-베타-HSD 변형체 7 야생형 단백질에서 아미노산 173 내지 아미노산 221까지의 48개 아미노산의 결실(인간)
40 11-베타-HSD -WT (변형체1) 야생형 생쥐 단백질 서열
41 11-베타-HSD 변형체 8 야생형 단백질에서 아미노산 29 내지 아미노산 71까지의 32개 아미노산 결실
42 11-베타-HSD 변형체 9 192개 아미노산을 가진 변형체를 생성하는 아미노산 173으로부터 대체 19개 아미노산(생쥐)
서열 1-21은 뉴클레오티드 서열이다. 서열 22-42는 서열 1-21에 의해 코드화된 단백질 서열이다.
Figure 112006017069834-PCT00001
Figure 112006017069834-PCT00002
Figure 112006017069834-PCT00003
Figure 112006017069834-PCT00004
Figure 112006017069834-PCT00005
Figure 112006017069834-PCT00006
Figure 112006017069834-PCT00007
Figure 112006017069834-PCT00008
Figure 112006017069834-PCT00009
Figure 112006017069834-PCT00010
Figure 112006017069834-PCT00011
Figure 112006017069834-PCT00012
Figure 112006017069834-PCT00013
Figure 112006017069834-PCT00014
Figure 112006017069834-PCT00015
Figure 112006017069834-PCT00016
Figure 112006017069834-PCT00017
Figure 112006017069834-PCT00018
Figure 112006017069834-PCT00019
Figure 112006017069834-PCT00020
Figure 112006017069834-PCT00021
Figure 112006017069834-PCT00022
Figure 112006017069834-PCT00023
"비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물" (때때로, "비만 및/또는 당뇨 변형체 단백질" 또는 "비만 및/또는 당뇨 변형체 폴리펩티드"라고도 일컬어짐)은, 선택적 스플라이싱의 결과로서 수득된 자연 발생 mRNA 서열인, 비만 및/또는 당뇨 변형체 핵산 서열에 의해 코드화되는 아미노산 서열이다. 아미노산 서열은 펩티드, 단백질 뿐만 아니라, 당펩티드 또는 당단백질과 같은 화학적 변성 아미노산(하기 참조)을 가진 펩티드 또는 단백질일 수도 있다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물은 서열 22 내지 서열 42중의 어느 하나에 나타낸다. 용어는 또한, 하나 이상의 아미노산이 첨가, 결실, 치환(하기 참조) 또는 화학적 변성(하기 참조)된 상기 서열 뿐만 아니라, 적어도 10개의 아미노산을 가진 서열의 단편(하기 참조)의 상동체(하기 참조)를 포함한다.
"비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 핵산 서열의 단편" - 변형체와 근원 서열 사이에서 뉴클레오티드 변형을 함유하는 영역을 포함한, 서열 1 내지 서열 21의 어느 하나의 부분 서열. 이러한 영역(아미노산 수준에서)은 상기 표 1에 나타낸 것과 같다.
"비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 생성물의 단편" - 변형체가 표 1에 나타낸 것과 같은 근원 서열과는 상이한 영역을 함유하는, 상기 핵산 단편에 의해 코드화되는 아미노산 서열.
"핵산 서열" - DNA 뉴클레오티드, RNA 뉴클레오티드 또는 양쪽 유형의 조합으로 구성된 서열이고, 천연 뉴클레오티드, 화학적 변성 뉴클레오티드 및 합성 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
"아미노산 서열" - 20개 천연 발생 아미노산, 화학적 변성된 아미노산 중의 어느 하나로 구성되거나 합성 아미노산으로 구성된 서열.
"변형체/생성물의 상동체" - 하나 이상의 아미노산이 첨가되거나 결실되거나 치환된 변형체의 아미노산 서열. 변경된 아미노산은, 예를들어 변형체가 표 1에서의 설명에 따른 근원 서열과 상이한 영역에 있어야 한다.
"보존적 치환" - 하나의 부류에 있는 아미노산을 동일한 부류의 아미노산으로 치환하는 것을 가리키고, 여기에서 부류는 일반적인 물리화학적 아미노산 측쇄 성질 및, 예를들어 표준 데이호프(Dayhoff) 빈도수 교환 모형 또는 블로섬(BLOSUM) 모형에 의해 결정되는 바와 같이, 자연에서 발견되는 상동성 단백질의 높은 치환 빈도수에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 일반적인 6개 부류가 분류되어 있고 부류 I (Cys); 부류 II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 부류 III (Asn, Asp, Gln, Glu); 부류 IV (His, Arg, Lys); 부류 V (Ile, Leu, Val, Met); 및 부류 VI (Phe, Tyr, Trp)을 포함한다. 예를들어, 다른 부류 III 잔기, 예컨대 Asn, Gln 또는 Glu에 대한 Asp의 치환은 보존적 치환이다.
"비-보존적 치환" - 하나의 부류에 있는 아미노산을 다른 부류로부터의 아미노산으로 치환하는 것을 가리킨다; 예를들어 부류 II 잔기 Ala를 부류 III 잔기, 예컨대 Asp, Asn, Glu 또는 Gln으로 치환.
"화학적 변성" - 본 발명의 생성물을 언급할 때, 그의 아미노산 잔기의 적어도 하나가 자연적 과정, 예컨대 프로세싱 또는 기타 후-번역 변성에 의해 변성되거나, 또는 당 기술분야에 공지된 화학적 변성 기술에 의해 변성되어진 생성물(단백질)을 의미한다. 전형적이지만 비-독점적인 다수의 공지된 변성 중에는, 아세틸화, 아실화, 옥타노일화, 아미드화, ADP-리보실화, 글리코실화, GPI 앵커(anchor) 형성, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 메틸화, 미리스틸화, 페길화, 프레닐화, 포스포릴화, 유비큐틴화 또는 다른 유사한 과정을 포함한다.
"생물학적 활성" - 일부 종류의 생물학적 활성, 예를들어 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자 또는 공지된 바와 같은 근원 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자의 기타 작동질에 결합할 수 있는 능력을 가진 변형체 생성물을 가리킨다.
"면역학적 활성" - 적절한 동물 또는 세포에서 특이적 면역 반응을 유도하고 특정한 항체와 결합할 수 있는 천연, 재조합 또는 합성 변형체 생성물 또는 그의 단편의 능력을 한정한다. 예를들어, 변형체 생성물의 면역학적 활성 단편은, 변형체 생성물의 면역학적 성질, 예를들어 특이적 항-변형체 생성물 항체를 결합할 수 있는 성질의 일부 또는 전부를 보유하거나 또는 이러한 항체를 발생시키는 면역 반응을 유도하거나 변형체를 생성하는 특이적 면역 세포의 증식을 유발할 수 있는 단편을 나타낸다.
"최적의 정렬" - 가장 높은 퍼센트 동일성 스코어를 제공하는 정렬로서 정의된다. 이러한 정렬은 다양한 통상적으로 입수가능한 서열 분석 프로그램, 예컨대 1의 ktup, 디폴트 매개변수 및 디폴트 PAM을 사용하는 로컬 정렬 프로그램 LALIGN을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직한 정렬은, 10.0의 개방 간격 페널티, 0.1의 연장 간격 페널티 및 블로섬(BLOSUM) 유사성 모형으로 조작되는 클루스탈(CLUSTAL-W) 프로그램(MacVectorTM)을 사용하여 수행되는 것이다. 첫번째 서열을 두번째 서열과 최적으로 정렬하기 위해 첫번째 서열 내에 간격을 삽입하는 것이 필요하다면, 퍼센트 동일성은 상응하는 아미노산 잔기와 쌍을 이루는 잔기 만을 사용하여 계산된다 (즉, 계산은 첫번째 서열의 "간격"에 있는 두번째 서열 내의 잔기를 고려하지 않는다). 공지된 유전자 서열을 새로운 변형체의 서열과 정렬하는 경우에, 최적의 정렬은 항상 양쪽 서열의 동일한 부분들을 함께 정렬하고, 이어서 서로 상이한 서열의 부분들을 분리하고 정렬해체시키는 것을 포함하였다.
"적어도 90% 동일성을 갖는" - 2개의 아미노산 또는 핵산 서열에 대하여, 서열이 최적으로 정렬될 때 2개의 서열에서 동일한 잔기의 퍼센트를 가리킨다. 즉, 90% 아미노산 서열 동일성은, 2개 이상의 최적으로 정렬된 폴리펩티드 서열에서 아미노산의 90%가 동일함을 의미한다.
"변형체 핵산 서열을 가진 단리된 핵산 분자" - 비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 핵산 코드화 서열을 포함하는 핵산 분자이다. 상기 단리된 핵산 분자는, 비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 핵산 서열을 독립적 삽입물로서 포함할 수도 있거나; 변형체 코드화 서열이 우세한 코드화 서열인 융합 단백질을 함께 코드화하는, 추가의 코드화 서열에 융합된 비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 핵산 서열을 포함할 수도 있거나 (예를들어, 추가의 코드화 서열은 시그날 펩티드를 코드화할 수도 있다); 비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 핵산 서열은, 적절한 숙주에서 코드화 서열의 발현을 위해 효과적인 비-코드화 서열, 예를들어 인트론 또는 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 터미네이터 요소 또는 5' 및/또는 3' 비번역 영역과 조합될 수도 있거나; 또는 비만 및/또는 당뇨 관련 변형체 단백질 코드화 서열이 이종성인 벡터일 수도 있다.
"발현 벡터" - 외래 세포에서 이종 DNA 단편을 혼입하고 발현하는 능력을 가진 벡터를 가리킨다. 많은 원핵 및 진핵 발현 벡터가 공지되어 있고/있거나 통상적으로 입수가능하다. 적절한 발현 벡터의 선택은 당업자의 지식 범위 내이다.
"결실" - 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 각각 부재하는, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 변화이다.
"삽입" 또는 "첨가" - 자연 발생 서열에 비하여, 각각 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 첨가되어지는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
"치환" - 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 각각 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산으로 대체하는 것. 아미노산 서열에 관하여, 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수도 있다.
"항체" - IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgG 항체를 가리킨다. 이 정의는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체를 포함한다. 이 용어는 전체 항체 또는 항-변형체 생성물 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 항체의 단편, 예를들어 Fc 부분을 갖지 않은 항체, 단일 사슬 항체, 항체의 가변 항원-결합 도메인 만으로 필수적으로 구성된 단편.
"질병의 치료" - 질병과 연관된 증상을 개선시키거나, 심각성을 줄이거나 질병을 치료하거나, 또는 질병이 발생하는 것을 예방하는데 효과적인 치료 물질을 투여하는 것을 가리킨다.
"검출" - 질병, 장애, 병리학적 또는 정상 상태를 검출하는 방법을 가리킨다. 이 용어는 질병 소인을 검출하는 것 뿐만 아니라 질병의 심각성을 결정함으로써 환자의 예후를 안정시키는 것을 가리킬 수도 있다.
"프로브" - 시료 내에서 다른 유사한 서열의 존재 또는 이 서열과 일부 상동성을 가진 서열의 존재를 검출하기 위해 사용될 때, 비만 및/또는 당뇨 변형체 핵산 서열, 또는 이것과 상보성인 서열. 검출은 프로브 및 분석된 서열 사이에서 하이브리드화 착물의 동정에 의해 수행된다. 프로브는 고체 지지체 또는 검출가능한 표지에 부착될 수도 있다.
"근원 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자" - 선택적 스플라이싱의 결과로서 본 발명의 비만 및/또는 당뇨 관련 변형체가 변경되어지는 아미노산 또는 핵산 서열. 근원 핵산 서열은 인간 아디포넥틴에 대해 서열 1로 나타낸 인간 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자의 서열이고, 근원 아미노산 서열은 그것에 의해 코드화되는 서열이며;생쥐 아디포넥틴에 대한 서열 5 및 근원 아미노산 서열은 그것에 의해 코드화되는 서열이고; 그렐린에 대한 서열 10 및 근원 아미노산 서열은 그것에 의해 코드화되는 서열이고; 인간 11-베타-HSD에 대한 서열 12 및 근원 아미노산 서열은 그것에 의해 코드화되는 서열이고; 생쥐 11-베타-HSD에 대한 서열 19 및 근원 아미노산 서열은 그것에 의해 코드화되는 서열이다.
발명의 요약
본 발명은 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 서열 및 적어도 15개의 뉴클레오티드를 포함하는 그의 단편을 가진 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21을 포함하는 단리된 핵산 분자 및 적어도 15개 뉴클레오티드를 포함하는 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21의 단편을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 주형으로서 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21의 서열을 사용하여 생성물을 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은 비만 및/또는 당뇨에 대해 개개인을 선별, 진단 및 관찰하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 시료 중에서 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 전사 생성물의 존재, 부재 또는 양을 검출하는 것을 포함한다. 상기 전사 생성물의 존재 또는 양은 비만 및/또는 당뇨의 지표이다.
본 발명은 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 서열을 가진 전사체의 번역 생성물을 투여하는 단계를 포함하는 비만 및/또는 당뇨를 앓는 개개인의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명은 비만 및/또는 당뇨에 대해 개개인을 선별, 진단 및 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21 및 그의 면역학적 단편으로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코드화되는 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열로 코드화된 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 검출가능한 표지 또는 활성 인자에 연결되는 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코드화되는 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 활성 인자에 연결되는 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코드화되는 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한 제약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 비만 및/또는 당뇨를 앓고 있는 것으로 의심되는 개인을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 활성 인자에 연결되는 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코드화된 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 개개인에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 개개인의 비만 및/또는 당뇨 세포에 핵산 분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 방법은 서열 2-4; 6-9; 11; 13-18; 20-21 및 핵산 분자로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코드화된 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한 제약학적 조성물을 개개인에게 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 인간 기원의 4개 아미노산 서열(서열 22 내지 서열 25에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 2는 생쥐 기원의 5개 아미노산 서열(서열 26 내지 서열 30에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 3은 인간 기원의 2개 아미노산 서열(서열 31 내지 서열 32에 나타냄)의 근원 서열에 대한 정렬을 나타낸다;
도 4는 인간 기원의 7개 아미노산 서열(서열 33 내지 서열 39에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 5는 인간 기원의 3개 아미노산 서열(서열 40 내지 서열 42에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 6은 인간 기원의 4개 핵산 서열(서열 1 내지 서열 4에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 7은 생쥐 기원의 5개 핵산 서열(서열 5 내지 서열 9에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 8은 인간 기원의 2개 핵산 서열(서열 10 내지 서열 11에 나타냄)의 근원 서열에 대한 정렬을 나타낸다;
도 9는 인간 기원의 7개 핵산 서열(서열 12 내지 서열 18에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다;
도 10은 인간 기원의 3개 아미노산 서열(서열 19 내지 서열 21에 나타냄)의 상호간 및 근원 서열에 대한 다중 정렬을 나타낸다.
본 출원인들은 모든 인용된 참고문헌의 전체 내용을 본 개시내용에 특별하게 통합시켰다. 또한, 양, 농도 또는 다른 수치 또는 매개변수가 범위, 바람직한 범위, 또는 바람직한 상한치 및 바람직한 하한치의 목록으로 주어진다면, 범위가 별도로 개시되어 있는지의 여부와는 무관하게, 상한 범위 한계 또는 바람직한 값과 하한 범위 한계 또는 바람직한 값의 쌍으로부터 형성된 모든 범위들을 특별하게 개시하고 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 수치의 범위가 열거된다면, 달리 언급되지 않는 한, 범위는 그의 끝점 및 범위 내의 모든 정수 및 분수를 포함하는 것으로 해석된다. 본 발명의 범위는 범위를 한정할 때 열거된 특정한 값에 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 핵산 서열
본 발명의 핵산 서열은 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 및 그의 단편 및 유사체를 코드화하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 대안적으로 상기 코드화 서열에 상보적이거나 상기 코드화 서열의 영역에 상보적인 서열일 수도 있다. 코드화 서열의 발현을 피하기 위해서는 상보적 서열의 길이가 충분하다. 핵산 서열은 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수도 있고, 메신저 RNA, 합성 RNA, 및 DNA, cDNA 및 게놈 DNA를 포함한다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수도 있고, 만일 단일-가닥이라면 코드화 가닥 또는 비-코드화 (안티-센스, 상보적) 가닥일 수도 있다. 핵산 서열은 dNTPs, rNTPs 뿐만 아니라 비-자연 발생 서열을 모두 포함할 수도 있다. 서열은 아미노산 서열과 핵산 서열 사이에서 하이브리드의 일부일 수도 있다.
일반적인 구현양태에서, 핵산 서열은 서열 2 내지 서열 4 또는 서열 6 내지 서열 9 또는 서열 11 또는 서열 13 내지 서열 18 또는 서열 20 내지 서열 21로서 동정된 서열의 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는다.
핵산 서열은 그 자체로 코드화 서열을 포함할 수도 있다. 다른 대안으로서, 코드화 영역은, 적절한 숙주에서 및/또는 변형체 핵산 서열이 이종 서열로서 도입된 벡터 또는 숙주 환경에서, 추가의 코드화 서열, 예컨대 융합 단백질 또는 시그날 펩티드를 코드화하는 서열과 조합되거나, 코드화 서열의 발현을 위해 효과적인 비-코드화 서열, 예컨대 인트론 및 조절 요소, 프로모터 및 터미네이터 요소 또는 5' 및/또는 3' 비번역 영역과 조합될 수도 있다.
본 발명의 핵산 서열은, 변형체 생성물의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 대해 프레임 내에서 융합된 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 코드화 서열을 가질 수도 있다. 마커 서열은 예를들어 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 헥사히스티딘 표지일 수도 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주, 예를들어 COS-7 세포가 사용될 때 헤마글루티닌(HA) 표지일 수도 있다. HA 표지는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다 (Wilson,I. 등, Cell 37:767 (1984)).
전형적으로 코드화 서열 핵산 서열의 영역에 상응하는 적어도 17개 염기, 바람직하게는 17 내지 30개 염기를 가진 올리고뉴클레오티드로서 언급된 상기 정의된 것과 같은 단편이 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 공지된 방법에 따르면 안티센스 인자로서 상보적일 때, 단편은 프로브, 프라이머 등으로서 사용될 수도 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 핵산 서열은 실질적으로 서열 2 내지 서열 4 또는 서열 6 내지 서열 9 또는 서열 11 또는 서열 13 내지 서열 18 또는 서열 20 내지 서열 21 또는 그의 단편 또는 상기 설명된 것과 같은 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 서열에 나타낸 것과 같을 수도 있다. 대안적으로, 유전자 코드의 변성 성질에 기인하여, 서열은 서열 23 내지 서열 25 또는 서열 27 내지 서열 30 또는 서열 32 또는 서열 34 내지 서열 39 또는 서열 41 내지 서열 42 또는 상기 아미노산 서열의 단편 또는 유사체의 아미노산 서열의 어느 하나를 코드화하는 서열일 수도 있다.
A. 핵산 서열의 제조
상기 개시된 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 핵산 서열에 하이브리드될 수 있거나 PCR-증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 라이브러리를 선별함으로써 핵산 서열이 수득될 수도 있다. 각종 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리는 통상적으로 입수가능하고, cDNA 클론을 선별하고 단리하기 위한 절차는 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 기술은 예를들어 문헌 [Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (제2판), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. 및 Ausubel FM 등 (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기재되어 있다.
프로모터, 조절 요소, 및 5' 및 3' 비번역 영역(UTRs)와 같은 상류 및 하류 서열을 수득하기 위하여 핵산 서열이 연장될 수도 있다. 입수가능한 전사 서열의 연장은 당업자에게 공지된 다수의 방법, 예컨대 PCR 또는 프라이머 연장(Sambrook 등, 상동)에 의해, 또는 예를들어 마라톤 레이스(Marathon RACE) 키트 (클론테크, 목록 #K1802-1)를 사용하는 레이스(RACE) 방법에 의해 수행될 수도 있다.
대안적으로, 공지된 좌에 인접한 부활 플랭킹 서열에 대해 보편적인 프라이머를 사용하는 "제한효소-부위" PCR의 기술 (Gobinda 등, PCR Methods Appl. 2:318-22 (1993))이 사용될 수도 있다. 먼저, 링커 서열에 대한 프라이머 및 공지된 영역에 대해 특이적인 프라이머의 존재하에서 게놈 DNA가 증폭된다. 증폭된 서열을 동일한 링커 프라이머 및 첫번째 것에 대해 본질적인 다른 특이적 프라이머를 사용하여 두번째 주기의 PCR로 처리한다. 각각의 PCR 주기의 생성물을 적절한 RNA 폴리머라제로 전사시키고, 역 전사효소를 사용하여 서열결정한다.
공지된 영역을 기초로 한 분기 프라이머를 사용하여 서열을 증폭 또는 연장시키기 위해 역 PCR이 사용될 수 있다 [Triglia,T. 등, Nucleic Acids Res. 16:8186 (1988)]. 올리고(R) 4.06 프라이머 분석 소프트웨어 (1992; 내셔날 바이오사이언스 인코포레이티드(National Biosciences Inc.) 미국 미네소타주 플라이마우스) 또는 다른 적절한 프로그램을 사용하여, 50% 이상의 GC 함량을 갖고 약 68 내지 72℃의 온도에서 표적 서열에 어닐링되고 22 내지 30 뉴클레오티드 길이가 되도록, 프라이머를 설계할 수도 있다. 방법은 유전자의 공지된 영역에서 적절한 단편을 발생시키기 위해 몇 개의 제한 효소를 사용한다. 이어서, 분자내 결찰에 의해 단편을 원형화하고 PCR 주형으로서 사용한다.
포획 PCR [Lagerstrom,M. 등, PCR Methods Appl. 1:111-19 (1991)]은 인간 및 효모 인공 염색체 DNA에서 공지된 서열에 인접한 DNA 단편의 PCR 증폭 방법이다. 포획 PCR은, 처리된 이중-가닥 서열을 PCR 전에 DNA 분자의 플랭킹 부분 내에 위치시키기 위하여, 다수의 제한 효소 소화 및 결찰을 필요로 한다.
플랭킹 서열을 부활시키기 위해 사용될 수 있는 다른 방법은 문헌 [Parker J.D. 등, Nucleic Acids Res. 19:3055-60 (1991)]에 기재된 방법이다. 추가로, 게놈 DNA를 "도입(walk in)" 하기 위하여 PCR, 네스티드(nested) 프라이머 및 프로모터파인더(PromoterFinder)TM 라이브러리를 사용할 수 있다(PromoterFinderTM, 미국 캘리포니아주 팔로알토 클론테크). 이 방법은 라이브러리를 선별할 필요를 없애고, 인트론/엑손 접합부를 찾아내는데 유용하다. 전체 길이 cDNA를 선별하기 위해 바람직한 라이브러리는 더욱 큰 cDNA를 포함하도록 크기-선택된 것이다. 또한, 유전자의 5' 및 상류 영역을 함유하는 더 많은 서열을 함유한다는 점에서, 무작위 프라임 라이브러리가 바람직하다.
올리고 d(T) 라이브러리가 전체-길이 cDNA를 생성하지 않는다면, 무작위 프라임 라이브러리가 특히 유용할 수도 있다. 5' 비번역 조절 영역 내로의 연장을 위하여 게놈 라이브러리가 유용하다.
공지된 합성 방법에 따라 고체상 방법에 의해 본 발명의 핵산 서열 및 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 전형적으로, 약 100개 이하의 염기의 단편을 개별적으로 합성한 다음 결합시켜, 수백개 염기 이하의 연속 서열을 형성한다.
B. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 제조를 위한 비만 및/또는 당뇨 변형체 핵산 서열의 사용
본 발명에 따르면, 상기 규정된 핵산 서열을 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 발현을 지시하는 재조합 DNA 분자로서 사용할 수도 있다.
당업자에 의해 이해되는 것과 같이, 인간 게놈에서 자연적으로 발생하는 것인 서열 2 내지 서열 4 또는 서열 6 내지 서열 9 또는 서열 11 또는 서열 13 내지 서열 18 또는 서열 20 내지 서열 21에 나타난 것 이외의 코돈을 처리하는 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물-코드화 뉴클레오티드 서열을 제조하는 것이 유리할 수도 있다. 예를들어 변형체 생성물 발현의 속도를 증가시키거나, 바람직한 성질, 예컨대 자연 발생 서열로부터 생성된 전사체에 비해 더욱 긴 반감기를 가진 재조합 RNA 전사체를 제조하기 위하여, 특정한 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 바람직한 코돈[Murray, E. 등, Nucleic Acids Res. 17:477-508 (1989)]이 선택될 수 있다.
이에 한정되지 않지만 생성물의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을 변경시키는 변화를 포함한 여러 이유 때문에, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 코드화 서열을 변화시키기 위해 본 발명의 핵산 서열을 조작할 수 있다. 예를들어, 새로운 제한효소 부위를 삽입하고, 글리코실화 패턴을 변화시키고, 코돈 선호도를 바꾸기 위하여, 당 기술분야에 공지된 기술, 예를들어 부위-특이적 돌연변이유발을 사용하여 변화를 도입할 수도 있다.
본 발명은 상기에 광범위하게 기재된 하나 이상의 서열을 포함하는 재조합 구조물을 포함한다. 구조물은 본 발명의 핵산 서열이 정 또는 역 배향으로 삽입되어진 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 이 구현양태의 바람직한 측면에서, 구조물은 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열, 예를들어 프로모터를 더욱 포함한다. 다수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당업자에게 공지되어 있으며 통상적으로 입수가능하다. 원핵 및 진핵 숙주와 함께 사용하기 위해 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Sambrook 등 (상동)]에 기재되어 있다.
본 발명은 본 발명의 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 생성물의 제조에 관한 것이다. 숙주 세포는 본 발명의 벡터, 예를들어 클로닝 벡터 또는 발현 벡터로 유전자 조작된다 (즉, 형질도입, 형질전환 또는 형질이입). 벡터는 예를들어 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등의 형태일 수도 있다. 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나 또는 변형체 핵산 서열의 발현을 증폭시키기 위해 적절하게 개질된 통상적인 영양 배지에서, 유전자조작된 숙주 세포를 배양할 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도, pH 등은, 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 핵산 서열은 생성물을 발현하기 위한 여러 발현 벡터의 어느 하나에 포함될 수도 있다. 이러한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를들어 SV40의 유도체; 세균 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 바이러스 DNA, 예컨대 박시니아, 아데노바이러스, 가금류 폭스바이러스 및 가성광견병을 포함한다. 그러나, 벡터가 복제가능하고 숙주내에서 생존가능한 이상 다른 벡터가 사용될 수도 있다. 적절한 DNA 서열을 다양한 절차에 의해 벡터 내에 삽입할 수도 있다. 일반적으로, DNA 서열이 당업자에게 공지된 절차에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입된다. 이러한 절차 및 관련된 서브-클로닝 절차는 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
발현 벡터에서 DNA 서열은 mRNA 합성을 지시하기 위해 적절한 전사 조절 서열(프로모터)에 작동적으로 연결된다. 이러한 프로모터의 예는 LTR 또는 SV40 프로모터, 이.콜리 lac 또는 trp 프로모터, 파지 람다 PL 프로모터 및 원핵 또는 진핵 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 다른 프로모터 또는 이들의 바이러스를 포함한다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 함유한다. 벡터는 발현을 증폭시키기 위해 적절한 서열을 포함할 수도 있다. 또한, 발현 벡터는 바람직하게는, 디히드로폴레이트 환원효소 또는 진핵 세포 배양을 위한 네오마이신 내성, 또는 이. 콜리에서의 테트라사이클린 또는 암피실린 내성과 같이 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 특성을 제공하기 위하여 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유한다.
숙주가 단백질을 발현할 수 있도록 적절한 숙주를 형질전환하기 위하여, 상기 기재된 것과 같은 적절한 DNA 서열 뿐만 아니라 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 함유하는 벡터가 사용될 수도 있다. 적절한 발현 숙주의 예는 세균 세포, 예컨대 이.콜리, 스트렙토마이세스, 살모넬라 타이피무리움; 진균 세포, 예컨대 효모; 곤충 세포, 예컨대 드로소필라 및 스포도프테라 Sf9; 동물 세포, 예컨대 CHO, COS, HEK 293 또는 보웨스 멜라노마; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 포함한다. 적절한 숙주의 선택은 여기에 기재된 내용으로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 본 발명은 사용된 숙주 세포에 의해 제한되지 않는다.
세균 체계에서, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 위한 용도에 의존하여 다수의 발현 벡터가 선택될 수도 있다. 예를들어, 항체의 유도를 위하여 다량의 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물이 요구될 때, 쉽게 정제되는 융합 단백질의 다량 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수도 있다. 이러한 벡터는, 이에 한정되지 않지만, 다작용성 이.콜리 클로닝 및 발현 벡터, 예컨대 블루스크립트(Bluescript)(R) (스트라타진) (여기에서 비만 및/또는 당뇨 변형체 폴리펩티드 코드화 서열이 베타-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 연속 7개 잔기를 위한 서열과 함께 프레임 내에서 벡터 내에 결찰될 수도 있으며 그 결과 하이브리드 단백질이 생성된다); pIN 벡터 (Van Heeke & Schuster J.Biol.Chem. 264:5503-5509 (1989)); pET 벡터 (미국 위스콘신주 매디슨 노바겐) 등을 포함한다.
효모 사카로마이세스 세레비지애에서, 구성 또는 유도 프로모터, 예컨대 알파 인자, 알콜 산화효소 및 PGH를 함유하는 다수의 벡터가 사용될 수도 있다. 검토를 위하여, 문헌 [Ausubel 등 (상동) 및 Grant 등, (Methods in Enzymology 153: 516-544 (1987)]을 참조한다.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우에, 서열 코드화 변형체 생성물의 발현은 다수의 프로모터에 의해 조종될 수도 있다. 예를들어, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터 (Brisson 등, Nature 310:511-514 (1984))가 단독으로 사용되거나 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 조합되어 사용될 수도 있다 [Takamatsu 등, EMBO J. 6:307-311 (1987)]. 대안적으로, RUBISCO의 작은 소단위와 같은 식물 프로모터 [Coruzzi 등, EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie 등, Science 224:838-843 (1984)]; 또는 열 충격 프로모터 [Winter J 및 Sinibaldi R.M. Results Probl.Cell Differ. 17: 85-105 (1991)]이 사용될 수도 있다. 이러한 구조물은 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체-매개 형질도입에 의해 식물 세포 내에 도입될 수 있다. 이러한 기술의 검토를 위하여, 문헌 [Hobbs S. 또는 Murry L.E. (1992) McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, N.Y. 191-196] 또는 [Weissbach 및 Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, N.Y. pp.421-463]을 참조한다.
또한, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물은 곤충 체계에서 발현될 수도 있다. 이러한 하나의 체계에서, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 오토그래파 캘리포르니카 핵 다각체 바이러스(AcNPV)가 사용된다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 코드화 서열이 바이러스의 비필수 영역, 예컨대 폴리헤드린 유전자 내에 클론화될 수도 있고, 폴리헤드린 프로모터의 제어 하에 위치한다. 비만 및/또는 당뇨 코드화 서열의 성공적인 삽입은, 폴리헤드린 유전자를 불활성화시킬 것이고, 코트 단백질 코트가 결실된 재조합 바이러스를 생성할 것이다. 이어서, 변형체 단백질이 발현되는 에스.프루기페르다(S.frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충을 감염시키기 위하여 재조합 바이러스를 사용한다 [Smith 등, J.Virol. 46:584 (1983); Engelhard, E.K. 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:3224-7 (1994)].
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기재 발현 체계가 사용될 수도 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우에, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 코드화 서열을, 후기 프로모터 및 3분절계 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 착물 내에 결찰시킬 수도 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역에서의 삽입은, 감염된 숙주 세포에서 변형체 단백질을 발현할 수 있는 생존가능한 바이러스를 만들 것이다 [Logan 및 Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81: 3655-59 (1984)]. 또한, 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시키기 위해, 전사 인핸서, 예컨대 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서가 사용될 수도 있다.
변형체 생성물 코드화 서열의 효율적인 번역을 위해 특정한 개시 시그날이 요구될 수도 있다. 이러한 시그날은 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 코드화 서열, 그의 개시 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터 내에 삽입되는 경우에, 추가의 번역 조절 시그날이 요구되지 않을 것이다. 그러나, 단지 코드화 서열 또는 그의 일부 만이 삽입되는 경우에, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 전사 조절 시그날이 제공되어야 한다. 또한, 전체 삽입물의 전사를 보장하기 위하여 개시 코돈이 정확한 판독 프레임 내에 있어야 한다. 외인성 전사 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원, 즉 천연 및 합성 양쪽 모두일 수 있다. 발현의 효율은 사용 시에 세포 체계에 적절한 인핸서를 포함시킴으로써 증진될 수도 있다 [Scharf,D. 등, Results Probl.Cell Differ. 20:125-62 (1994); Bittner 등, Meth.Enzymol. 153:516-544 (1987)].
추가의 구현양태에서, 본 발명은 상기 기재된 구조물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 고등 진핵 세포, 예컨대 포유동물 세포 또는 하등 진핵 세포, 예컨대 효모 세포일 수 있거나, 숙주 세포는 세균 세포와 같은 원핵 세포일 수 있다. 숙주 세포 내에 구조물을 도입하는 것은 칼슘 포스페이트 형질이입, DEAE-덱스트란 매개 형질이입 또는 일렉트로포레이션 [Davis,L., Dibner,M., 및 Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biology]에 의해 실행될 수 있다. 본 발명의 DNA 구조물로부터 유래된 RNA를 사용하여 폴리펩티드를 생성하기 위해, 세포-자유 번역 체계가 또한 사용될 수도 있다.
삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 방식으로 발현된 단백질을 처리할 수 있는 능력에 대하여 숙주 세포 균주가 선택될 수도 있다. 단백질의 이러한 변형은, 이에 한정되지 않지만 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 포스포릴화, 지질화 및 아실화를 포함한다. 단백질의 "프리-프로(pre-pro)" 형태를 절단하는 후-번역 프로세싱이 정확한 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능을 위해 중요할 수도 있다. CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 등과 같은 상이한 숙주 세포는 후-번역 활성을 위하여 특이적인 세포 구성 및 특징적인 메카니즘을 갖고 있으며, 도입된 외래 단백질의 정확한 변경 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다.
재조합 단백질의 장-기간 고-수율 생성을 위하여, 안정한 발현이 바람직하다. 예를들어, 바이러스 복제 기원 또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터를 사용하여, 변형체 생성물을 안정하게 발현하는 세포주가 형질전환될 수도 있다. 벡터의 도입 후에, 배지가 선택 배지로 전환되기에 앞서서, 강화 배지에서 1 내지 2일 동안 세포를 생육시킬 수도 있다. 선택가능한 마커의 목적은 선택을 위해 저항성을 부여하는 것이고, 그것의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 생육 및 회수를 가능하게 한다. 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 덩어리를 증식시킬 수 있다.
형질전환된 세포주를 회수하기 위하여 다수의 선택 체계가 사용될 수 있다. 이들은 이에 한정되지 않지만 각각 tk- 또는 aprt-세포에서 사용될 수 있는 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제[Wigler M. 등, Cell 11: 223-32 (1977)] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (Lowy I. 등, Cell 22: 817-23 (1980)] 유전자를 포함한다. 또한, 선택을 위한 기초로서 항대사물질, 항생물질 또는 제초 저항성, 예를들어 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (Wigler M. 등 Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:3567-70 (1980)); 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 대한 저항성을 부여하는 npt (Colbere-Garapin, F. 등 J.Mol.Biol. 150: 1-14(1981)]; 및 각각 클로르술푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 부여하는 als 또는 pat(Murry, 상동)이 사용될 수 있다. 추가의 선택가능한 유전자, 예를들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하도록 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD (Hartman S.C. 및 R.C.Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci. 85:8047-51 (1988)]이 기재되어 있다. 눈에 보이는 마커의 사용이 인기를 얻고 있으며, 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 그의 기질, GUS 및 루시퍼라제 및 그의 기질, 루시페린 및 ATP와 같은 마커가 형질전환체를 동정하기 위해서 뿐만 아니라 특정한 벡터 체계에 기인한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량하기 위해 널리 사용되고 있다 [Rhodes, C.A.등, Methods Mol.Biol. 55:121-131 (1995)].
세포 배양액으로부터 코드화된 단백질의 발현 및 회수를 위해 적절한 조건하에서, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 숙주 세포를 배양할 수도 있다. 사용된 서열 및/또는 벡터에 의존하여 재조합 세포에 의해 생성된 생성물이 분비될 수 있거나 세포 내에 함유될 수도 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터는, 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물이 분비될 수 있도록 하는 시그날 서열을 갖도록 설계될 수 있다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물은 단백질 정제를 촉진하기 위해 첨가된 하나 이상의 추가의 폴리펩티드 도메인을 가진 재조합 단백질로서 발현될 수도 있다. 이러한 정제 촉진 도메인은, 이에 한정되지 않지만, 고정화된 금속 위에서 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트화 펩티드, 고정화된 면역글로블린 상에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 연장/친화 정제 시스템(미국 워싱턴주 시애틀의 이뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp.))에서 사용되는 도메인을 포함한다. 정제 도메인과 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 사이에 프로테아제-절단가능한 폴리펩티드 링커 서열을 포함시키는 것은 정제를 수월하게 하는데 도움이 된다. 이러한 한가지 발현 벡터는, 엔테로키나아제 절단 부위에 의해 분리된 폴리히스티딘 영역에 융합되어진 변형체 폴리펩티드를 손상시키는 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 IMIAC 상에서 정제를 촉진하는 반면(고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피, 문헌[Porath 등, Protein Expr.Purif. 3:263-281 (1992)]참조), 엔테로키나아제 절단 부위는 융합 단백질로부터 변형체 폴리펩티드를 단리하기 위한 수단을 제공한다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외래 폴리펩티드를 발현하기 위하여 pGEX 벡터 (프로메가, 미국 위스콘신주 메디슨)가 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 리간드-아가로스 비드(예, GST-융합의 경우에 글루타티온-아가로스)에 흡착시킨 다음, 이어서 유리 리간드의 존재하에서 용출시킴으로써, 용해된 세포로부터 쉽게 정제될 수 있다.
적절한 숙주 균주의 형질전환 및 적절한 세포 밀도까지 숙주 균주를 생육시킨 후에, 선택된 프로모터를 적절한 수단 (예, 온도 변화 또는 화학적 유도)에 의해 유도하고, 세포를 추가의 기간 동안 배양한다. 세포를 전형적으로 원심분리에 의해 수집하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 붕괴시키고, 얻어진 조 추출물을 추가의 정제를 위해 유지시킨다. 단백질의 발현에서 사용되는 미생물 세포는, 동결-해동 순환, 초음파분해, 기계적 붕괴, 또는 세포 용해제의 사용 또는 당업자에게 공지된 다른 방법를 포함하는 통상적인 방법에 의해 붕괴될 수 있다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물은, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 당 기술분야에 공지된 다수의 방법에 의해, 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 필요에 따라 성숙한 단백질의 형태를 완성함에 있어서 단백질 리폴딩 단계가 사용될 수 있다. 마지막으로, 고 성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다.
C. 핵산 서열을 사용한 진단 용도
본 발명의 핵산 서열은 다양한 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 mRNA의 존재를 검출함으로써, 환자의 세포, 예를들어 생검 조직에서 비만 및/또는 당뇨 변형체의 발현을 검출하고 정량화하기 위하여 핵산 서열이 사용될 수도 있다. 대안적으로, 혈청 또는 혈액에서 가용성 변형체를 검출하기 위해 분석이 사용될 수도 있다. 이러한 분석은 전형적으로 조직 또는 혈청으로부터 전체 mRNA를 수득하고, mRNA를 핵산 프로브와 접촉시키는 것을 포함한다. 프로브는, 하이브리드형성 조건하에서 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 핵산 분자의 서열 내에 포함된 서열과 특이적으로 하이브리드형성하고, 프로브에 대해 하이브리드형성된 mRNA의 존재를 검출하고 이에 의해 변형체의 발현을 검출할 수 있는, 적어도 20개 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 30개 뉴클레오티드의 핵산 분자이다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 부재, 존재 및 과다 발현을 구별하고, 치료 중재 동안에 비만 및/또는 당뇨 변형체 발현의 수준을 관찰하기 위해 이러한 분석법이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 비만 및/또는 당뇨 변형체의 수준을, 이로부터 변형이 일어난 근원 비만 및/또는 당뇨 서열의 수준 또는 상호 간의 수준과 비교하기 위해 분석법이 사용될 수도 있으며, 이러한 비교는 일부 생리학적 의미를 가질 수도 있다.
본 발명은 또한, 유전적으로 결손된 변형체 서열로부터 발생되는 질병, 또는 비만 및/또는 당뇨 변형체가 변형되어지는 근원 비만 및/또는 당뇨 서열의 양 대 본 발명의 신규 비만 및/또는 당뇨 변형체의 양의 비율이 변화된 질병을 위한 진단으로서, 핵산 서열의 용도에 관한 것이다. 이러한 서열은 결손 (즉, 변이) 비만 및/또는 당뇨 변형체 코드화 영역의 서열을 정상 코드화 영역의 서열과 비교함으로써 검출될 수 있다. 변이 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 서열과 비정상적인 변형체 생성물 활성과의 결합이 입증될 수도 있다. 또한, 변이 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하는 서열이, 돌연변이를 확인하거나 동정하기 위한 또 다른 수단으로서의 기능 분석 체계(예, 비색 분석, HEK 293 세포의 변형체 단백질 결손 균주에서의 상보성 실험)에서 발현을 위해 적절한 벡터 내에 삽입될 수 있다. 돌연변이 유전자가 일단 동정되면, 돌연변이 유전자의 담체를 위해 주요 개체군을 선별할 수 있다.
본 발명의 핵산 서열 내에 돌연변이를 보유하는 개체를, 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출할 수도 있다. 진단을 위해 사용된 핵산은 환자의 세포로부터, 예를들어 이에 한정되지 않지만 혈액, 뇨, 타액, 태반, 조직 생검 및 부검 물질로부터 수득될 수도 있다. 검출을 위해 게놈 DNA가 직접 사용될 수도 있거나 또는 분석에 앞서서 PCR을 사용함으로써 효소적으로 증폭시킬 수도 있다 [Saiki 등, Nature 324:163-166 (1986)]. 동일한 목적을 위하여 RNA 또는 cDNA가 사용될 수도 있다. 예로서, 본 발명의 유전자에서 돌연변이를 확인하고 분석하기 위하여 본 발명의 핵산에 대해 상보성인 PCR 프라이머가 사용될 수 있다. 정상 유전자형에 비해 증폭된 생성물의 크기 변화에 의하여 결실 및 삽입을 검출할 수 있다.
본 발명의 방사능표지된 RNA 또는 대안적으로 본 발명의 방사능표지된 안티센스 DNA 서열에 대해 증폭된 DNA를 하이브리드형성함으로써 점 돌연변이를 동정할 수 있다. 특정한 위치에서 서열 변화는 뉴클레아제 보호 분석, 예컨대 RN아제 및 S1 보호 또는 화학 절단 방법 (예, Cotton, 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:4397-4401 (1985))에 의해 또는 융점 차이에 의해 밝혀질 수도 있다. 점 돌연변이 또는 다른 서열 변화를 검출할 뿐만 아니라 변형체 생성물의 발현 수준을 관찰하기 위하여, 본 발명의 핵산에 상보적인 "분자 신호기(beacons)" (Kostrikis L.G. 등, Science 279: 1228-1229 (1998)), 헤어핀-형태, 단일-가닥 합성 올리고뉴클레오티드가 사용될 수도 있다. 이러한 진단은 태아기 시험을 위해 특히 유용하다.
돌연변이를 검출하기 위한 다른 방법은, 공지되거나 의심되는 돌연변이(들)의 영역이 이웃한 염기에 있거나 그 근처에 있는 경우에, 이웃한 염기와 함께 표적의 인접한 영역에 하이브리드형성되도록 설계된 2개의 DNA 프로브를 사용하는 것이다. 양쪽 프로브가 프로브 접합의 영역에서 정확하게 염기 쌍을 이루고 있는 경우에만, 2개의 프로브를 이웃한 염기에서, 예를들어 리가제 효소의 존재하에 연결시킬 수도 있다. 돌연변이의 존재 또는 부재는 결찰된 프로브의 존재 또는 부재에 의해 검출될 수 있다.
또한, 예를들어 미국 특허 5,547,839호에 기재된 바와 같이 하이브리드형성에 의한 서열화(SBH)를 기초로 하는 올리고뉴클레오티드 정렬 방법이, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 코드화 서열에서 돌연변이를 검출하기 위해 적절하다. 전형적인 방법에서, DNA 표적 분석물을 마이크로칩 위에 형성된 올리고뉴클레오티드 정렬과 함께 하이브리드형성한다. 이어서, 어레이에 대한 표적 결합 패턴으로부터 표적의 서열을 "판독"할 수 있다.
D. 핵산 서열의 치료적 용도
치료적 목적을 위해 본 발명의 핵산 서열을 사용할 수도 있다. 본 발명의 두번째 측면 (즉, 비만 및/또는 당뇨 변형체의 발현 억제)에 대해 언급하자면, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 발현은 안티센스 기술을 통해 조정될 수도 있고, 이것은 유전자 코드화 변형체 생성물의 대조군, 5' 또는 조절 영역에 대한 상보적 핵산 서열, 즉 안티센스 DNA 또는 RNA의 하이브리드형성을 통해 유전자 발현을 조절한다. 예를들어, 약 10 내지 40염기 쌍 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계하기 위하여 본 발명의 생성물을 코드화하는 핵산 서열의 5' 코드화 부위가 사용된다. 전사 출발 부위, 예를들어 출발 부위로부터 -10 내지 +10 위치로부터 유래된 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. 전사에 관련된 핵산 서열의 영역에 상보적이 되도록 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드가 설계되며 (Lee 등, Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney 등, Science 241: 456 (1988); 및 Dervan 등, Science 251: 1360 (1991)), 이에 의해 변형체 생성물의 전사 및 생산을 방해한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 mRNA에 대해 하이브리드형성되고, mRNA 분자가 변형체 생성물로 번역되는 것을 막는다 (Okano, J.Neurochem. 56: 560 (1991)). 안티센스 구조물은 당 기술분야에 공지된 절차에 의해 세포로 전달될 수 있고, 그 결과 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현될 수도 있다. 안티센스는 이러한 안티센스 mRNA를 코드화할 수 있는 안티센스 mRNA 또는 DNA 서열일 수도 있다. 안티센스 mRNA 또는 그를 코드화하는 NDA는 비만 및/또는 당뇨 변형체 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 전체 서열, 또는 단백질 생성물의 생성을 억제하기에 충분한 서열의 단편에 대해 상보적일 수 있다. 다른 변형체에 비해 하나의 변형체의 발현을 억제하거나, 또는 근원 서열에 비해 변형체(들)의 발현을 억제하기 위하여, 안티센스 기술이 또한 사용될 수도 있다.
이제, 본 발명의 첫번째 측면, 즉 비만 및/또는 당뇨 변형체의 발현을 검토해보면, 원하는 숙주에서 그의 발현을 종료시키는 적절한 조절 요소의 제어하에서 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 코드화하기 위한 코드화 서열을 제공함으로써 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 발현을 증가시킬 수도 있다.
본 발명의 핵산 서열이 적절한 제약학적 담체와 조합하여 사용될 수도 있다. 이러한 조성물은 치료적 유효 량의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 이에 한정되지 않지만 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함한다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 생성물은 생체 내에서 이러한 폴리펩티드의 발현에 의해 사용될 수도 있다 (종종 "유전자 요법"이라 일컬어짐). 환자로부터의 세포를 생체 외에서 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열(DNA 또는 RNA)로 조작할 수도 있고, 조작된 세포를 폴리펩티드로 처리되어진 환자에게 제공한다. 이러한 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어, 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 RNA를 함유한 레트로바이러스 입자의 사용에 의하여 당 기술분야에 공지된 절차에 의해 세포를 조작할 수도 있다.
유사하게, 당 기술분야에 공지된 절차에 의해 생체내에서 폴리펩티드의 발현을 위해 세포를 생체내에서 조작할 수도 있다. 당 기술분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 코드화하는 RNA를 함유한 레트로바이러스 입자를 생성하기 위한 생산자 세포를, 생체내에서의 세포 조작 및 생체내에서의 폴리펩티드 발현을 위해 환자에게 투여할 수도 있다. 이러한 방법에 의해 본 발명의 생성물을 투여하기 위한 상기 및 기타 방법은, 본 발명의 교시내용으로부터 당업자에게 명백해야 한다. 예를들어, 세포를 조작하기 위한 발현 전파체는 레트로바이러스 이외의 것, 예를들어 적절한 전달 전파체와 조합 후에 생체내에서 세포를 조작하기 위해 사용될 수도 있는 아데노바이러스일 수도 있다.
상기 언급된 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유래될 수도 있는 레트로바이러스는, 이에 한정되지 않지만 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하베이 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식 육종 바이러스, 및 포유동물 종양 바이러스를 포함한다.
생산자 세포 주를 형성하기 위하여 패키징 세포 주를 형질도입하기 위해 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 사용된다. 형질이입될 수도 있는 패키징 세포의 예는 이에 한정되지 않지만, 문헌 [Miller, Human Gene Therapy, Vol.1 5-14면 (1990)]에 기재된 바와 같이, PE501, PA317, psi-2, psi-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, psi-CRE, psi-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포 주를 포함한다. 벡터는 당 기술분야에 공지된 수단을 통해 패키징 세포를 형질도입할 수도 있다. 이러한 수단은 이에 한정되지 않지만 엘렉트로포레이션, 리포좀의 사용 및 CaPO4 침전법을 포함한다. 하나의 대안에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 리포좀 내로 캡슐화되거나, 지질에 결합될 수도 있고, 이어서 숙주에 투여될 수도 있다.
생산자 세포 주는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열(들)을 포함한 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성한다. 이러한 레트로바이러스 벡터 입자는 진핵 세포를 시험관내 또는 생체내에서 형질도입하기 위해 사용될 수도 있다. 형질도입된 진핵 세포는 폴리펩티드를 코드화하는 핵산 서열(들)을 발현할 것이다. 형질도입될 수도 있는 진핵 세포는 이에 한정되지 않지만 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포 뿐만 아니라 조혈 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 근아세포, 각화세포, 내피 세포 및 기관지 상피 세포를 포함한다.
세포 내에 도입된 유전자는, 방사능, 예를들어 종양을 치료하기 위한 방사능 요법에 대해 반응하는 변형체 생성 또는 안티센스 억제를 자극하기 위하여, 유도가능한 프로모터, 예컨대 방사능-유도가능한 Egr-1 프로모터 (Marceri,H.J. 등, Cancer Res. 56(19):4311 (1996))의 제어하에 위치할 수도 있다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물
본 발명의 실질적으로 정제된 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물은 본 발명의 핵산 서열로부터 코드화된 생성물로서 상기 정의되어 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열은 서열 23 내지 서열 25 또는 서열 27 내지 서열 30 또는 서열 32 또는 서열 34 내지 서열 39 또는 서열 41 내지 서열 42로서 동정된 서열에 대해 적어도 90% 동일성을 가진 아미노산 서열이다. 단백질 또는 폴리펩티드는 상기 정의된 바와 같이 성숙 및/또는 변형된 형태일 수도 있고, 예를들어 리더 서열의 절단에 의해 변형된다. 또한, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 뿐만 아니라 상기 설명된 상동체로부터 유래된 적어도 5개의 연속 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 5 내지 20개 잔기를 가진 단백질 단편이 의도된다.
서열 변형은 바람직하게는 상기 정의된 것과 같은 보존적 치환으로 간주되는 것이다. 즉, 그것이 변형되어지는 근원 펩티드에 대해 동일하지 않은 이상 (전형적으로 변형체가 예를들어 표 1에서와 같은 근원 서열과는 상이한 영역에서 치환이 일어난다), 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 보존적 치환을 사용함으로써, 예를들어 서열 23 내지 서열 25 또는 서열 27 내지 서열 30 또는 서열 32 또는 서열 34 내지 서열 39 또는 서열 41 내지 서열 42로서 동정된 생성물과 적어도 90% 서열 동일성을 가진 서열을 갖는 단백질이 본 발명의 일부이다. 더욱 특정한 구현양태에서, 단백질은 서열 23 내지 서열 25 또는 서열 27 내지 서열 30 또는 서열 32 또는 서열 34 내지 서열 39 또는 서열 41 내지 서열 42로 동정된 서열을 갖거나 함유한다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물은 (i) 상기 기재된 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 또는 비-보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)로 치환되는 것, 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환 기를 포함하는 것, 또는 (iii) 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물이 다른 화합물, 예컨대 단백질의 반감기를 증가시키기 위한 화합물(예를들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)) 또는 표적 조직 또는 표적 세포 개체군(예컨대 항체)에 단백질을 보내기 위한 표적화 수단으로 작용하는 잔기와 융합된 것, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물에 융합된 것을 포함한다. 이러한 단편, 변형체 및 유도체는 여기의 개시내용으로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
A. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 제조
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물, 및 단백질의 단편을 생성하고 단리하기 위한 재조합 방법이 상기 기재되어 있다.
재조합 생성에 추가로, 변형체 생성물의 단편 및 일부는 고체-상 기술을 사용하는 직접적 펩티드 합성에 의해 생성될 수도 있다 (참조, Stewart 등 (1969), 고체상 펩티드 합성, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J., J.Am.Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)). 시험관내 펩티드 합성은 수동 기술을 사용하거나 자동화에 의해 수행될 수도 있다. 자동화 합성은 예를들어 제조업자에 의해 제공된 지시에 따라서 어플라이드 바이오시스템스 431A 펩티드 합성장치 (Perkin Elmer, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 달성될 수도 있다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 단편은 전체 길이 분자를 생성하기 위한 화학 방법을 사용하여 별도로 화학적 합성되고 조합될 수도 있다.
B. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 사용한 치료적 용도 및 조성물
비만 및/또는 당뇨를 치료함에 있어서 본 발명의 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물이 일반적으로 유용하다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 또는 단편은 표적 기관 또는 조직에서 화합물의 일정하고 예측가능한 농도를 제공하도록 설계된 다수의 경로 및 방법에 의해 투여될 수도 있다. 생성물-함유 조성물을 단독으로 투여하거나 다른 약제, 예컨대 안정화 화합물과 조합하고 및/또는 다른 제약학적 약제, 예컨대 약물 또는 호르몬과 조합하여 투여한다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물-함유 조성물은, 이에 한정되지 않지만 경구, 정맥, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 내 수단 뿐만 아니라 비내 적용을 포함한 다수의 경로에 의해 투여될 수도 있다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물-함유 조성물은 리포좀을 통해 투여될 수도 있다. 이러한 투여 경로 및 적절한 제제는 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 정맥내 또는 복강내 주사를 통해 제공할 수 있다. 유사하게, 생성물을 신체의 다른 국소 영역에 주사할 수도 있다. 생성물은 비내 흡입을 통해 투여될 수도 있다. 장내 투여도 또한 가능하다. 이러한 투여를 위하여, 생성물을 경구 투여를 위해 적절한 캡슐 또는 엘릭시르로 또는 직장 투여를 위해 좌약으로 제형해야 한다.
상기 일례의 투여 방식은, 생성물을 예를들어 연고, 겔 또는 좌약을 포함한 적절한 담체로 제형되는 것을 필요로 할 것이다. 적절한 제형은 당업자에게 공지되어 있다.
생성물의 투여는 선택된 특정한 폴리펩티드의 효능 및 치료 지수에 의존하여 변할 것이다.
치료 방법에서 사용하기 위한 치료적 조성물은 멸균 주사용액 중의 생성물, 경구 전달 부형제 중의 폴리펩티드, 비내 투여를 위해 적절한 에어로졸 중의 생성물, 또는 분무화 형태 중의 생성물을 포함할 수 있고, 이들은 모두 잘 알려진 방법에 따라 제조된다. 이러한 조성물은 치료적 유효 량의 화합물 및 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 이에 한정되지 않지만 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 생성물은 내피 분화 및 증식을 조절할 뿐만 아니라 예를들어 세포 배양물에서 생체외 또는 시험관 내에서 세포사멸을 조절하기 위해 사용될 수도 있다.
항-변형체 항체
A. 합성
본 발명의 다른 측면에서, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 활성, 분포 및 발현에 관련된 진단 및 치료적 용도를 가진 항-변형체 항체를 생성하기 위하여 정제된 변형체 생성물이 사용된다.
비만 및/또는 당뇨 변형체에 대한 항체는 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 생성될 수도 있다. 이러한 항체는 이에 한정되지 않지만 다클론성, 단클론성, 키메라, 인체화, 단일 사슬, Fab 단편 및 Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함할 수도 있다. 항체, 즉 이량체 형성을 억제하는 항체가 치료적 용도를 위해 특히 바람직하다.
생물학적 활성을 특징화하기 위해 항체 유도를 위한 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 단편이 요구되는 것이 아니라, 면역학적 활성을 특징화해야 한다; 그러나, 단백질 단편 또는 올리고펩티드가 항원성이어야 한다. 특정한 항체를 유도하기 위해 사용되는 펩티드는 서열 23 내지 서열 25 또는 서열 27 내지 서열 30 또는 서열 32 또는 서열 34 내지 서열 39 또는 서열 41 내지 서열 42에 규정된 서열의 적어도 5개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 10개의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 가질 수도 있다. 바람직하게는, 이들은 천연 단백질의 아미노산 서열의 일부를 모방해야 하고, 작은 천연발생 분자의 전체 아미노산 서열을 함유할 수도 있다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 단백질 아미노산의 짧은 사슬을 다른 단백질, 예컨대 키홀 림페트 헤모시아닌 및 키메라 분자에 대해 생성된 항체와 융합할 수도 있다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물에 대한 항체의 생성을 위해 당 기술분야에 공지된 절차가 사용될 수 있다.
항체의 생성을 위하여, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 또는 면역원성 성질을 보유하는 부위, 단편 또는 올리고펩티드로의 주입에 의해, 염소, 토끼, 쥐, 생쥐 등을 포함한 다양한 숙주를 면역화할 수도 있다. 숙주 종에 의존하여, 면역원성 반응을 증가시키기 위해 다양한 아쥬반트를 사용할 수도 있다. 이러한 아쥬반트는 이에 한정되지 않지만 프뢴드, 미네랄 겔, 예컨대 수산화알루미늄 및 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 풀루로닉 폴리올, 다중음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림페트 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 포함한다. BCG (바실리 칼메트-게린) 및 코리네박테리움 파르붐이 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트이다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 단백질에 대한 단클론성 항체는, 배양액 중의 연속 세포 주에 의하여 항체 분자의 생성을 제공하는 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 이들은 이에 한정되지 않지만 코엘러(Koehler) 및 밀스테인(Milstein) [Nature 256: 495-497 (1975)]에 의해 기재된 하이브리도마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술[Kosbor 등, Immunol. Today 4:72 (1983); Cote 등,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:2026-2030 (1983)] 및 EBV-하이브리도마 기술[Cole 등, Mol.Cell Biol. 62:109-120 (1984)]을 포함한다.
"키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술인, 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 가진 분자를 수득하기 위해 생쥐 항체 유전자를 인간 항체 유전자에 스플라이싱하는 기술이 사용될 수 있다 [Morrison 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Neuberger 등, Nature 312:604-608 (1984); Takeda 등, Nature 314:452-454 (1985)]. 대안적으로, 변형체 단백질에 대해 특이적인 단쇄 항체를 생성하기 위하여 단쇄 항체의 생성을 위해 기재된 기술(미국 특허 4,946,778호)이 적용될 수 있다.
문헌 [Orlandi 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86: 3833-3837 (1989)] 및 [Winter G 및 Milstein C. (Nature 349:293-299 (1991)]에 기재된 바와 같이, 백혈구 개체군에서 생체내 생성을 유도하거나, 또는 고 특이적 결합 시약의 재조합 면역글로블린 라이브러리 또는 패널을 선별함으로써, 항체가 생성될 수도 있다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 단백질에 대해 특이적 결합 부위를 함유하는 항체 단편이 또한 생성될 수도 있다. 예를들어, 이러한 단편은 이에 한정되지 않지만 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디설파이드 다리를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함한다. 대안적으로, 목적하는 특이성을 가진 단클론성 Fab 단편을 빠르고 쉽게 동정할 수 있도록 Fab 발현 라이브러리가 구축될 수도 있다 [Huse W.D. 등, Science 256:1275-1281 (1989)].
B. 항체의 진단 용도
안정된 특이성을 가진 다클론성 또는 단클론성 항체를 사용하여 경쟁적 결합 또는 면역방사능측정 분석을 위한 각종 프로토콜이 당 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 면역분석은 전형적으로 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물과 그의 특이적 항체 간의 착물 형성 및 착물 형성의 측정과 연관된다. 특정한 변형체 생성물 상에 있는 2개의 비간섭 에피토프에 반응성인 단클론성 항체를 사용하는 2-부위, 단클론성-기초 면역분석이 바람직하지만, 경쟁적 결합 분석이 또한 사용될 수도 있다. 이러한 분석은 Maddox D.E. 등 [J.Exp.Med. 158: 1211 (1983)]에 기재되어 있다.
비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물에 특이적으로 결합하는 항체는, 비만 및/또는 당뇨 변형체의 과다한 발현 또는 부족한 발현에 의한 본 발명의 신규의 비만 및/또는 당뇨 변형체(정상적으로 발현되지 않는 경우에)의 발현을 특징으로 하는 상태 또는 질병을 진단하기 위해서 뿐만 아니라, 본 발명의 비만 및/또는 당뇨 변형체의 양과 이들이 변형되어진 근원 비만 및/또는 당뇨 서열 간의 비율이 변화된 질병을 검출하기 위해 유용하다. 대안적으로, 이러한 항체는 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물로 처리되어진 환자를 관찰하기 위한 분석에서 사용될 수도 있다. 변형체 단백질을 위한 진단 분석은, 항체 및 인간 체액 또는 세포 또는 조직의 추출물 중에서 변형체 생성물을 검출하기 위한 표지를 사용하는 방법을 포함한다. 본 발명의 생성물 및 항체는 변형과 함께 또는 변형 없이 사용될 수 있다. 종종, 단백질 및 항체는 이들을 리포터 분자와 함께 공유 또는 비공유 결합함으로써 표지화될 것이다. 매우 다양한 리포터 분자가 당 기술분야에 공지되어 있다.
각각의 단백질에 대해 특이적인 다클론성 또는 단클론성 항체를 사용하여 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물을 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당 기술분야에 공지되어 있다. 그의 예는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사능면역분석(RIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 상의 2개의 비-간섭 에피토프에 대해 반응성인 단클론성 항체를 사용하는 2-부위 단클론성-기초 면역분석이 바람직하지만, 경쟁적 결합 분석을 사용할 수도 있다. 이러한 분석은 다른 것들 중에서 상기 매독스(Maddox) 등의 문헌에 기재되어 있다. 이러한 프로토콜은 변경되거나 비정상적인 수준의 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 발현을 진단하기 위한 기초를 제공한다. 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물 발현을 위한 정상 또는 표준 값은, 당 기술분야에 공지된 착물 형성을 위해 적절한 조건하에서, 정상 피시험자, 바람직하게는 인간으로부터 추출된 체액 또는 세포 추출물을 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물에 대한 항체와 조합함으로써 설정된다. 표준 착물 형성의 양은 다양한 방법에 의해, 바람직하게는 광도측정 방법에 의해 정량화될 수도 있다. 이어서, 정상 시료로부터 수득된 표준 값을, 잠재적으로 질병에 걸린 피시험자로부터의 시료에서 수득된 값과 비교할 수도 있다. 표준 값과 피시험자 값 사이의 편차는 질병 상태의 존재를 입증한다.
조직 내에서 과다하게 발현되든지 또는 부족하게 발현되든지 간에, 그것이 일단 발현되는지의 여부를 결정하기 위하여, 또는 가변 생성물의 비만 및/또는 당뇨 변형체 수준이 약물 처리에 어떻게 반응하는지의 지표로서, 체액 시료 중에 존재하는 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 수준을 결정하기 위해 항체 분석이 유용하다.
C. 항체의 치료적 용도
진단 용도에 추가로, 항체는, 비만 및/또는 당뇨 변형체 생성물의 활성 감소에 의해 유리한 효과가 달성될 수 있는 병리학적 상태에서, 이들의 활성을 차단하거나 감소시키는데 있어서 치료적 용도를 가질 수도 있다.
사용되는 항체는 바람직하게는 인간화 단클론성 항체 또는 공지된 글로블린-유전자 라이브러리 방법에 의해 생성된 인간 Mab이다. 다른 비경구적 경로가 적절할 수도 있긴 하지만, 항체는 전형적으로 정맥 주사에 의해 멸균 용액으로서 투여된다. 전형적으로, 항체는 피시험자 체중 kg 당 약 1 내지 15mg의 양으로 투여된다. 예를들어 매 1 내지 7일 마다 투약하면서 치료적 개선이 나타날 때까지 치료를 계속한다.
본 발명은 특정한 방법 및 구현양태를 참조하여 설명되었으나, 본 발명에서 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변화를 수행할 수도 있는 것으로 이해된다.
실시예 1 - 분리
Sf-9 세포를, 2의 MOI에서 서열 23 내지 서열 25 또는 서열 27 내지 서열 30 또는 서열 32 또는 서열 34 내지 서열 39 또는 서열 41 내지 서열 42의 아미노산 서열을 포함하는 비만 및/또는 당뇨 변형체 발현 바쿨로바이러스 (AC-비만 및/또는 당뇨 변형체)로 감염시켰다. 세포를 연속 진탕(90rpm)하에 28℃에서 생육시켰다. 감염 후 60 시간(hpi)에서, 배지를 수집하고 5000rpm에서 5분동안 원심분리에 의해 배지로부터 세포를 분리하였다. SP-세파로스 컬럼을 가진 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 10mL 배지를 분리하였다. 컬럼을 PBS pH 6.5로 평형화하고, 컬럼 위에 시료를 부하한 후에, 컬럼을 PBS로 세척하여 비결합 단백질을 용출시켰다 (분 획을 통한 유동). 2mL/분 (5% NaCl/분)의 유량에서 NaCl의 농도를 증가시키면서 용출을 수행하였다. 상이한 분획을 항-비만 및/또는 당뇨 변형체 항체를 사용하여 SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블롯팅으로 처리하였다.
실시예 2 - 분비
2의 MOI에서 비만 및/또는 당뇨 변형체 발현 바쿨로바이러스 (Ac-비만 및/또는 당뇨 변형체)로 Sf-9 세포를 감염시켰다. 세포를 연속 진탕(90rpm)하면서 28℃에서 생육시키고, 1mL 시료를 감염 후 24시간, 48시간 및 60시간(hpi)에서 수집하였다. 원심분리 후에, 세포 펠릿을 용균 완충액(50mM 트리스 pH 7.5, 1% 트리톤×100, 및 프로테아제 억제제 칵테일)으로 4℃에서 30분동안 용해시키고, 30초동안 초음파처리하였다. 시료를 14000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 펠릿으로 명명하였다. 펠릿 제제 및 배지(배지로 명명)의 40㎕를 시료 완충액에 보충하고 15% SDS-PAGE 상에서 전기영동하였다. 전기영동 후에, 겔을 니트로셀룰로스 막 위로 반-건조 단백질 전달하였다. 막을 항-비만 및/또는 당뇨 변형체 항체와 함께 2시간동안 배양하고, 추가로 1시간동안 2차 항-토끼 항체와 함께 배양하였다.
통상적인 웨스턴 블롯 검출 키트를 사용하여 신호의 검출을 수행하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Mintz, Liat <120> Compositions, Reagents and Kits for the Methods of Diagnosing, Monitoring and Treating Obesity and/or Diabetes <130> 28238-001 <140> PCT/US2004/029230 <141> 2004-09-09 <150> 10/659,782 <151> 2003-09-11 <160> 42 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4517 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgattccat accagagggg ctcaggatgc tgttgctggg agctgttcta ctgctattag 60 ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga ctcaagggcc cggagtcctg cttcccctgc 120 ccaagggggc ctgcacaggt tggatggcgg gcatcccagg gcatccgggc cataatgggg 180 ccccaggccg tgatggcaga gatggcaccc ctggtgagaa gggtgagaaa ggagatccag 240 gtcttattgg tcctaaggga gacatcggtg aaaccggagt acccggggct gaaggtcccc 300 gaggctttcc gggaatccaa ggcaggaaag gagaacctgg agaaggtgcc tatgtatacc 360 gctcagcatt cagtgtggga ttggagactt acgttactat ccccaacatg cccattcgct 420 ttaccaagat cttctacaat cagcaaaacc actatgatgg ctccactggt aaattccact 480 gcaacattcc tgggctgtac tactttgcct accacatcac agtctatatg aaggatgtga 540 aggtcagcct cttcaagaag gacaaggcta tgctcttcac ctatgatcag taccaggaaa 600 ataatgtgga ccaggcctcc ggctctgtgc tcctgcatct ggaggtgggc gaccaagtct 660 ggctccaggt gtatggggaa ggagagcgta atggactcta tgctgataat gacaatgact 720 ccaccttcac aggctttctt ctctaccatg acaccaactg atcaccacta actcagagcc 780 tcctccaggc caaacagccc caaagtcaat taaaggcttt cagtacggtt aggaagttga 840 ttattattta gttggaggcc tttagatatt attcattcat ttactcattc atttattcat 900 tcattcatca agtaacttta aaaaaatcat atgctatgtt cccagtcctg gggagcttca 960 caaacatgac cagataactg actagaaaga agtagttgac agtgctattt tgtgcccact 1020 gtctctcctg atgctcatat caatcctata aggcacaggg aacaagcatt ctcctgtttt 1080 tacagattgt atcctgaggc tgagagagtt aagtgaatgt ctaaggtcac acagtattaa 1140 gtgacagtgc tagaaatcaa acccagagct gtggactttg ttcactagac tgtgcccttt 1200 tatagaggta catgttctct ttggagtgtt ggtaggtgtc tgtttcccac ctcacctgag 1260 agccattgaa tttgccttcc tcatgaatta aaacctcccc caagcagagc ttcctcagag 1320 aaagtggttc tatgatgaag tcctgtcttg gaaggactac tactcaatgg cccctgcact 1380 actctacttc ctcttaccta tgtcccttct catgcctttc cctccaacgg ggaaagccaa 1440 ctccatctct aagtgctgaa ctcatccctg ttcctcaagg ccacctggcc aggagcttct 1500 ctgatgtgat atccactttt tttttttttt gagatggagt ctcactctgt cacccaggct 1560 ggagtacagt gacacgacct cggctcactg cagcctcctt ctcctgggtc caagcaatta 1620 ttgtgcctca gcctcccgag tagctgagac ttcaggtgca ttccaccaca catggctaat 1680 ttttgtattt ttagtagaaa tggggtttcg tcatgttggc caggctggtc tcgaactcct 1740 ggcctaggtg atccacccgc ctcgacctcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac 1800 catgcccagt cgatatctca ctttttattt tgccatggat gagagtcctg ggtgtgagga 1860 acacctccca ccaggctaga ggcaactgcc caggaaggac tgtgcttccg tcacctctaa 1920 atcccttgca gatccttgat aaatgcctca tgaagaccaa tctcttgaat cccatatcta 1980 cccagaatta actccattcc agtctctgca tgtaatcagt tttatccaca gaaacatttt 2040 cattttagga aatccctggt ttaagtatca atccttgttc agctggacaa tatgaatctt 2100 ttccactgaa gttagggatg actgtgattt tcagaacacg tccagaattt ttcatcaaga 2160 aggtagcttg agcctgaaat gcaaaaccca tggaggaatt ctgaagccat tgtctccttg 2220 agtaccaaca gggtcaggga agactgggcc tcctgaattt attattgttc tttaagaatt 2280 acaggttgag gtagttgatg gtggtaaaca ttctctcagg agacaataac tccagtgatg 2340 tttttcaaag attttagcaa aaacagagta aatagcattc tctatcaata tataaattta 2400 aaaaactatc tttttgctta cagttttaaa ttctgaacaa tttctcttat atgtgtattg 2460 ctaatcatta aggtattatt ttttccacat ataaagcttt gtctttttgt tgttgttgtt 2520 gtttttaaga tggagtttcc ctctgttgcc aggctagagt gcagtggcat gatctcggct 2580 tactgcaacc tttgcctccc aggtttaagc gattcttctg cctcagcctc ccgagtagct 2640 gggaccacag gtgcctacca ccatgccagg ctaatttttg tatttttagt aaagacaggg 2700 tttcaccata ttggccaggc tggtctcgaa ctcctgacct tgtgatctgc ccgcctccat 2760 tgtgttgtta tttgtgagaa agatagatat gaggtttaga gagggatgaa gaggtgagag 2820 taagccttgt gttagtcaga actctgtgtt gtgaatgtca ttcacaacag aaaacccaaa 2880 atattatgca aactactgta agcaagaaaa ataaaggaaa aatggaaaca tttattcctt 2940 tgcataatag aaattaccag agttgttctg tctttagata aggtttgaac caaagctcaa 3000 aacaatcaag acccttttct gtatgtcctt ctgttctgcc ttccgcagtg taggctttac 3060 cctcaggtgc tacacagtat agttctaggg tttccctccc gatatcaaaa agactgtggc 3120 ctgcccagct ctcgtatccc caagccacac catctggcta aatggacatc atgttttctg 3180 gtgatgccca aagaggagag aggaagctct ctttcccaga tgccccagca agtgtaacct 3240 tgcatctcat tgctctggct gagttgtgtg cctgtttctg accaatcact gagtcaggag 3300 gatgaaatat tcatattgac ttaattgcag cttaagttag gggtatgtag aggtattttc 3360 cctaaagcaa aattgggaca ctgttatcag aaataggaga gtggatgata gatgcaaaat 3420 aatacctgtc cacaacaaac tcttaatgct gtgtttgagc tttcatgagt ttcccagaga 3480 gacatagctg gaaaattcct attgattttc tctaaaattt caacaagtag ctaaagtctg 3540 gctatgctca cagtctcaca tctggtgggg gtgggctcct tacagaacac gctttcacag 3600 ttaccctaaa ctctctgggg cagggttatt cctttgtgga accagaggca cagagacagt 3660 caactgaggc ccaacagagg cctgagagaa actgaggtca agatttcagg attaatggtc 3720 ctgtgatgct ttgaagtaca attgtggatt tgtccaattc tctttagttc tgtcagcttt 3780 tgcttcatat attttagcgc tctattatta gatatataca tgtttagtat tatgtcttat 3840 tggtgcattt actctcttat cattatgtaa tgtccttctt tatctgtgat aattttctgt 3900 gttctgaagt ctactttgtc taaaaataac atacgcactc aacttccttt tctttcttcc 3960 ttcctttctt tcttccttcc tttctttctc tctctctctt tccttccttc cttcctcctt 4020 ttctctctct ctctctctct ctctcttttc ttgacagact ctcgttctgt ggccctggct 4080 ggagttcagt ggtgtgatct tggctcactg ctacctctac catgagcaat tctcctgcct 4140 cagcctccca agtagctgga actacaggct catgccactg cgcccagcta atttttgtat 4200 ttttcgtaga gacggggttt caccacattc gtcaggttgg tttcaaactc ctgactttgt 4260 gatccacccg cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca tcacacctgg 4320 tcaactttct tttgattagt gtttttgtgg tatatctttt tccatcatgt tactttaaat 4380 atatctatat tattgtattt aaaatgtgtt tcttacagac tgcatgtagt tgggtataat 4440 ttttatccag tctaaaaata tctgtctttt aattggtgtt tagacaattt atatttaata 4500 aaatggtgga atttaaa 4517 <210> 2 <211> 484 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgacccggg gctgaaggtc cccgaggctt tccgggaatc caaggcagga aaggagaacc 60 tggagaaggt gcctatgtat accgctcagc attcagtgtg ggattggaga cttacgttac 120 tatccccaac atgcccattc gctttaccaa gatcttctac aatcagcaaa accactatga 180 tggctccact ggtaaattcc actgcaacat tcctgggctg tactactttg cctaccacat 240 cacagtctat atgaaggatg tgaaggtcag cctcttcaag aaggacaagg ctatgctctt 300 cacctatgat cagtaccagg aaaataatgt ggaccaggcc tccggctctg tgctcctgca 360 tctggaggtg ggcgaccaag tctggctcca ggtgtatggg gaaggagagc gtaatggact 420 ctatgctgat aatgacaatg actccacctt cacaggcttt cttctctacc atgacaccaa 480 ctga 484 <210> 3 <211> 718 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgattccat accagagggg ctcaggatgc tgttgctggg agctgttcta ctgctattag 60 ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga ctcaagggcc cggagtcctg cttcccctgc 120 ccaagggggc ctgcacaggt tggatggcgg gcatcccagg gcatccgggc cataatgggg 180 ccccaggccg tgatggcaga gatggcaccc ctggtgagaa gggtgagaaa ggagatccag 240 gtcttattgg tcctaaggga gacatcggtg aaaccggagt acccggggct gaaggtcccc 300 gaggctttcc gggaatccaa ggcaggaaag gagaacctgg agaaggtgcg ttactatccc 360 caacatgccc attcgcttta ccaagatctt ctacaatcag caaaaccact atgatggctc 420 cactggtaaa ttccactgca acattcctgg gctgtactac tttgcctacc acatcacagt 480 ctatatgaag gatgtgaagg tcagcctctt caagaaggac aaggctatgc tcttcaccta 540 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tattgcttag tttgagagtc ctgagtatta tccacacgtg tactcacttg ttcattaaac 960 gactttataa aaaataattt gtgttcctag tccagaaaaa aaggcactcc ctggtctcca 1020 cgactcttac atggtagcaa taacagaatg aaaatcacat ttggtatggg ggcttcacaa 1080 tattcgcatg actgtctgga agtagaccat gctatttttc tgctcactgt acacaaatat 1140 tgttcacata aaccctataa tgtaaatatg aaatacagtg attactcttc tcacaggctg 1200 astgtatgaa ttctaaagac ccataagtat taaagtggta gggataaatt ggaaaaaaaa 1260 aaaaaaaaaa agaaaaactt tagagcacac tggcggccgt tactag 1306 <210> 6 <211> 1184 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gctcattcat cttttaattc acccataaag gctttgaaaa ctaaggctgg agatgaactt 60 ataggagcct gccaggccgt ggagagtgag gaagcagaga tgacggagat gatgtctttc 120 cttgtcctgt gaaatggatt gtgggtagag gttccggaga taatgcctct tgctggaaac 180 agtctgggca gttctgttcc cgccattcac agaattcttc tcactttcta ggtcttcttg 240 gtcctaaggg tgagacagga gatgttggaa tgacaggagc tgaagggcca cggggcttcc 300 ccggaacccc tggcaggaaa ggagagcctg gagaagccgc ttatgtgtat cgctcagcgt 360 tcagtgtggg gctggagacc cgcgtcactg ttcccaatgt acccattcgc tttactaaga 420 tcttctacaa ccaacagaat cattatgacg gcagcactgg caagttctac tgcaacattc 480 cgggactcta ctacttctct taccacatca cggtgtacat gaaagatgtg aaggtgagcc 540 tcttcaagaa ggacaaggcc gttctcttca cctacgacca gtatcaggaa aagaatgtgg 600 accaggcctc tggctctgtg ctcctccatc tggaggtggg agaccaagtc tggctccagg 660 tgtatgggga tggggaccac aatggactct atgcagataa cgtcaacgac tctacattta 720 ctggctttct tctctaccat gataccaact gactgcaact acccatagcc catacaccag 780 gagaatcatg gaacagtcga cacactttca gcttagtttg agagattgat tttattgctt 840 agtttgagag tcctgagtat tatccacacg tgtactcact tgttcattaa acgactttat 900 aaaaaataat ttgtgttcct agtccagaaa aaaaggcact ccctggtctc cacgactctt 960 acatggtagc aataacagaa tgaaaatcac atttggtatg ggggcttcac aatattcgca 1020 tgactgtctg gaagtagacc atgctatttt tctgctcact gtacacaaat attgttcaca 1080 taaaccctat aatgtaaata tgaaatacag tgattactct tctcacaggc tgagtgtatg 1140 aattctaaag acccataagt attaaagtgg tagggataaa ttgg 1184 <210> 7 <211> 1209 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 atgagacctg gccactttct cctcatttct gtctgtacga ttgtcagtgg atctgacgac 60 accaaaaggg ctcaggatgc tactgttgca agctctcctg ttcctcttaa tcctgcccag 120 tcatgccgaa gatgacgtta ctacaactga agagctagct cctgctttgg tccctccacc 180 caagggaact tgtgcaggtt ggatggcagg catcccagga catcctggcc acaatggcac 240 accaggccgt gatggcagag atggcactcc tggagagaag ggagagaaag gagatgcagg 300 tcttcttggt cctaagggtg agacaggaga tgttggaatg acaggagctg aagggccacg 360 gggcttcccc ggaacccctg gcaggaaagg agagcctgga gaagccgcgt cactgttccc 420 aatgtaccca ttcgctttac taagatcttc tacaaccaac agaatcatta tgacggcagc 480 actggcaagt tctactgcaa cattccggga ctctactact tctcttacca catcacggtg 540 tacatgaaag atgtgaaggt gagcctcttc aagaaggaca aggccgttct cttcacctac 600 gaccagtatc aggaaaagaa tgtggaccag gcctctggct ctgtgctcct ccatctggag 660 gtgggagacc aagtctggct ccaggtgtat ggggatgggg accacaatgg actctatgca 720 gataacgtca acgactctac atttactggc tttcttctct accatgatac caactgactg 780 caactaccca tagcccatac accaggagaa tcatggaaca gtcgacacac tttcagctta 840 gtttgagaga ttgattttat tgcttagttt gagagtcctg 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Val Asn Phe 130 135 140 Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln 145 150 155 160 Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser Leu Ala Gly Lys Met Thr 165 170 175 Gln Pro Met Ile Ala Pro Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly 180 185 190 Phe Phe Ser Thr Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Ile Thr Lys Val Asn Val 195 200 205 Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met 210 215 220 Lys Glu Ile Ser Gly Ile Ile Asn Ala Gln Ala Ser Pro Lys Glu Glu 225 230 235 240 Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Thr Ala Leu Arg Lys Ser Glu Val 245 250 255 Tyr Tyr Asp Lys Ser Pro Leu Thr Pro Ile Leu Leu Gly Asn Pro Gly 260 265 270 Arg Lys Ile Met Glu Phe Phe Ser Leu Arg Tyr Tyr Asn Lys Asp Met 275 280 285 Phe Val Ser Asn 290 <210> 41 <211> 250 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 41 Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Leu Gln Lys Val 20 25 30 Val Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala 35 40 45 Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala 50 55 60 Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr 65 70 75 80 Gln Thr Ser Leu Ser Leu Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg 85 90 95 Val Met Glu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala 100 105 110 Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser 115 120 125 Leu Ala Gly Lys Met Thr Gln Pro Met Ile Ala Pro Tyr Ser Ala Ser 130 135 140 Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe Ser Thr Ile Arg Thr Glu Leu Tyr 145 150 155 160 Ile Thr Lys Val Asn Val Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile 165 170 175 Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Glu Ile Ser Gly Ile Ile Asn Ala Gln 180 185 190 Ala Ser Pro Lys Glu Glu Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Thr Ala 195 200 205 Leu Arg Lys Ser Glu Val Tyr Tyr Asp Lys Ser Pro Leu Thr Pro Ile 210 215 220 Leu Leu Gly Asn Pro Gly Arg Lys Ile Met Glu Phe Phe Ser Leu Arg 225 230 235 240 Tyr Tyr Asn Lys Asp Met Phe Val Ser Asn 245 250 <210> 42 <211> 192 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 42 Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu 20 25 30 Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg 35 40 45 Glu Met Ala Tyr His Leu Ser Lys Met Gly Ala His Val Val Leu Thr 50 55 60 Ala Arg Ser Glu Glu Gly Leu Gln Lys Val Val Ser Arg Cys Leu Glu 65 70 75 80 Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met 85 90 95 Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly 100 105 110 Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Gln Thr Ser Leu Ser Leu 115 120 125 Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg Val Met Glu Val Asn Phe 130 135 140 Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln 145 150 155 160 Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser Leu Ala Gly Gly Arg Thr 165 170 175 Val Pro Gln Gln Arg Ser Arg Ser Val Thr Pro Asp Ser Arg Gly Pro 180 185 190

Claims (22)

  1. 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 20, 서열 21 및 이들의 상보체로부터 선택되는 단리된 핵산 서열.
  2. 제1항의 단리된 핵산 서열의 적어도 15개 연속 염기 쌍 분절을 포함하는 핵산 단편.
  3. 제2항에 있어서, 제1항의 단리된 핵산 서열의 15 내지 30개 연속 염기 쌍 분절을 포함하는 핵산 단편.
  4. 제2항의 핵산 단편을 포함하는 프라이머.
  5. 제2항의 핵산 단편을 포함하는 프로브.
  6. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 바람직한 코돈이 상기 서열의 적어도 하나의 코돈을 치환하는 단리된 핵산 서열.
  7. 제1항의 단리된 핵산 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산 서열이 서열 24, 서열 25, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 41 및 서열 42로부터 선택되는 것인 아미노산 서열.
  9. 제8항의 아미노산 서열의 적어도 5개 연속 아미노산 분절을 포함하는 펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 제8항의 아미노산 서열의 5 내지 20개 연속 아미노산 분절을 포함하는 펩티드.
  11. 숙주 세포 내에서 서열의 발현을 위한 조절 요소에 작동적으로 결합된 제1항의 단리된 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제11항의 발현 벡터로 형질이입(transfect)된 숙주 세포.
  13. 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 20, 서열 21로부터 선택된 핵산 서열의 역 상보체의 10 내지 40개 연속 염기 쌍 분절을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  14. (a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 20, 서열 21 또는 이들의 상보체로부터 선택되는 단리된 핵산 서열을 생물학적 시료의 핵산 물질에 혼성화하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)에 의해 생성된 혼성화 착물을 검출하는 단계
    를 포함하고, 혼성화 착물의 존재는 생물학적 시료 중에서 적어도 하나의 변형체 핵산 서열의 존재와 상관관계를 갖는 것인, 생물학적 시료 중에서 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자의 적어도 하나의 변형체 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 방법.
  15. (a) 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 20, 서열 21 또는 이들의 상보체로부터 선택되는 단리된 핵산 서열을 생물학적 시료의 핵산 물질에 혼성화시키는 단계;
    (b) 단계 (a)에 의해 생성된 혼성화 착물의 양을 결정하는 단계; 및
    (c) 생물학적 시료 중의 변형체 핵산 서열의 수준을 제공하기 위해 혼성화 착물의 양을 표준화하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 시료 중에서 변형체 핵산 서열의 수준을 결정하기 위한 방법.
  16. (a) 첫번째 생물학적 시료 중에서 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자 변형체의 첫번째 핵산 서열의 수준을 결정하는 단계;
    (b) 두번째 생물학적 시료 중에서 변형체의 선택적 스플라이싱 형태의 두번째 핵산 서열의 수준을 결정하는 단계; 및
    (c) 단계 (a) 및 단계 (b)에서 수득된 수준을 비교하여 비율을 얻는 단계
    를 포함하는, 첫번째 생물학적 시료 중에서 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자 변형체의 핵산 서열의 수준과 두번째 생물학적 시료 중에서 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 변형체의 수준 간의 비율을 결정하기 위한 방법.
  17. 제16항에 있어서, 첫번째 생물학적 시료 및 두번째 생물학적 시료가 동일한 시료인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 첫번째 핵산 서열과 두번째 핵산 서열이 mRNA 전사체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 첫번째 핵산 서열 및 두번째 핵산 서열이 핵산 칩 위에 배치되는 방법.
  20. (a) 서열 24, 서열 25, 서열 27, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 41 및 서열 42로부터 선 택된 아미노산 서열을 제공하는 단계;
    (b) 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자의 적어도 하나의 수용체의 존재하에서 아미노산 서열과 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
    (c) 적어도 하나의 수용체에 대한 아미노산 서열의 결합에 미치는 후보 화합물의 효과를 결정하는 단계; 및
    (d) 상기 단백질의 수용체에 대한 비만 및/또는 당뇨 관련 단백질의 결합 친화력에 영향을 미칠 수 있는 화합물을 선택하는 단계
    를 포함하는, 상기 단백질의 수용체에 대한 비만 및/또는 당뇨 관련 단백질의 결합 친화력에 영향을 미칠 수 있는 화합물의 동정 방법.
  21. (a) 첫번째 생물학적 시료 중에서 비만 및/또는 당뇨 관련 유전자 변형체의 첫번째 아미노산 서열의 수준을 결정하는 단계;
    (b) 두번째 생물학적 시료 중에서 변형체의 선택적 스플라이싱 형태의 두번째 아미노산 서열의 수준을 결정하는 단계; 및
    (c) 단계 (a)와 단계 (b)에서 수득된 수준을 비교하여 비율을 얻는 단계
    를 포함하는, 첫번째 생물학적 시료 중에서 비만 및/또는 당뇨 관련 단백질 변형체의 수준과 두번째 생물학적 시료 중에서 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 변형체의 수준 간의 비율을 결정하기 위한 방법.
  22. (a) 특정한 비만 및/또는 당뇨 관련 핵산 서열을 프라이머 쌍으로 증폭시키 는 단계 (여기에서 프라이머의 적어도 하나가 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 11, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 20, 서열 21 및 이들의 상보체로부터 선택되는 핵산 서열의 적어도 15개 연속 염기 쌍 분절을 포함함); 및
    (b) 단계 (a)의 핵산 생성물을 검출하는 단계
    를 포함하는, 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 특정한 비만 및/또는 당뇨 관련 핵산 서열을 검출하는 방법.
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