KR20060058476A - Method for promoting the differentiation of embryonic bodies to hemopoietic stem cells using human bone marrow stromal cells - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우가 배아줄기세포 자체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우나 배아체 자체를 계속 분화시킨 경우보다 매우 현저하게 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시킴을 증명함으로써 본 기술은 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 분화/ 증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 면역세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있다.The present invention relates to a technique for promoting differentiation into CD34 + 45-human hematopoietic stem cells by complex culture of embryonic bodies prepared from human embryonic stem cells with human myeloid matrix cells. Specifically, in the present invention, when the embryonic body differentiated from human embryonic stem cells for 5 days in combination with normal human bone marrow stromal cells, the embryonic stem cells themselves in complex culture with normal human bone marrow stromal cells or the embryo body itself. By demonstrating that it promotes differentiation into CD34 + 45- human hematopoietic stem cells much more significantly than when differentiated, the present technology provides immune cell supply and artificial blood for cell therapy through promoting differentiation / proliferation of hematopoietic stem cells from human embryonic stem cells. It can be usefully applied to the production of.
Description
도 1은 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체로부터 조혈모세포로의 분화 촉진 기술 흐름도이다. 1 is a flowchart illustrating a technique for promoting differentiation from human embryoid bodies to hematopoietic stem cells using human bone marrow stromal cells.
도 2는 인간배아 줄기세포 집락 배양(도 2a) 및 Alkaline Phosphatase 염색 모습(도 2b)을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다. Figure 2 is a photograph taken by optical microscopy (X 40) of the human embryonic stem cell colony culture (Fig. 2a) and Alkaline Phosphatase staining (Fig. 2b).
도 3은 인간 배아줄기세포로부터 배아체 분화 유도 1일 째(도 3a) 및 5일 째(도 3b) 모습을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다. Figure 3 is a photograph taken with optical microscopy (X 40) of the day 1 (Fig. 3a) and the day 5 (Fig. 3b) induction of embryonic differentiation from human embryonic stem cells.
도 4는 인간 배아체와 복합배양하는 인간 골수기질세포의 모습을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다. Figure 4 is a photograph taken with optical microscopy (X 40) of the appearance of human myeloid matrix cells in complex culture with the human embryoid body.
도 5는 인간 골수 기질세포에 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과이다. 5 is a comparison of the differentiation-inducing effect of CD34 + 45-hematopoietic stem cells in the case of complex culture of embryonic stem cells induced differentiation from human embryonic stem cells in human bone marrow stromal cells for 5 days and in the case of complex culture of embryonic stem cells themselves ( FIG. Flowcytometry).
도 6은 인간 배아줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 배아체만을 단독으로 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과이다. 6 is a comparison of the effect of differentiation induction of CD34 + 45-hematopoietic stem cells in the case of complex culture of embryonic bodies induced differentiation from human embryonic stem cells into human stromal cells and induction of differentiation of only embryonic bodies ( FIG. Flowcytometry).
도 7은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도를 위한 최적 배양기간의 확인한 결과를 나타낸그래프이다. Figure 7 is a graph showing the results of confirming the optimum culture period for induction of differentiation of CD34 + 45-hematopoietic stem cells in embryo culture / human bone marrow stromal cells complex culture.
도 8은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 집락형성 단위(colony forming unit, CFU) 형성 수의 극대화를 위한 최적 배양기간 확인한 결과를 나타낸 그래프이다. 8 is a graph showing the results of confirming the optimum culture period for maximizing the number of colony forming units (CFU) formation during embryonic / human bone marrow stromal cell complex culture.
본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a technique for promoting differentiation into CD34 + 45-human hematopoietic stem cells by complex culture of embryonic bodies prepared from human embryonic stem cells with human myeloid matrix cells.
배아 줄기세포는 내배엽, 중배엽, 외배엽 분화가 모두 가능한 전분화능(totipotency)을 지니고 있기 때문에 난치병 치료를 위한 중요한 연구대상으로 현재 주목을 받고 있다. 그런데, 이와 같은 배아 줄기세포의 전분화능은 배아 줄기세포로부터 특정 세포를 생산하기 위한 표적 분화(directed differentiation) 기술 개발의 면에서는 장애로 작용할 수 있다. 그러므로, 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화를 유도하는 기술 개발을 위해서는 그 목표 달성을 위한 최적의 배양조건을 조성함으로써 배아 줄기세포로부터 원하는 특정 세포로의 분화 효율을 극대화시키고자 하는 조건의 탐색이 우선되어야 하며 이에 관련된 연구 및 기술 개발이 전세계적으로 진행이 되고 있는 실정이다. Embryonic stem cells are attracting attention as an important research target for the treatment of intractable diseases because they have a totipotency capable of endoderm, mesoderm, and ectoderm differentiation. However, such pluripotency of embryonic stem cells may act as an obstacle in terms of development of directed differentiation technology for producing specific cells from embryonic stem cells. Therefore, in order to develop a technology for inducing differentiation from embryonic stem cells to specific cells, the search for conditions to maximize the efficiency of differentiation from embryonic stem cells to specific cells is desired by creating optimal culture conditions for achieving the target. First of all, related research and technology development is in progress worldwide.
본 기술 또한 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화 촉진을 위한 최적의 배양조건을 탐색하는 과정에서 개발된 것으로, 인간 배아 줄기세포로부터 배아체로 분화를 유도한 뒤 이를 인간 기질세포와 복합배양함으로써 조혈모세포의 생산을 촉진시키는 내용으로 아직 국내외적으로 보고되거나 개발된 바 없었다.This technology was also developed in the process of searching for optimal culture conditions to promote differentiation from human embryonic stem cells to hematopoietic stem cells. Hematopoiesis by inducing differentiation from human embryonic stem cells into embryonic bodies and then incubating them with human stromal cells It has not yet been reported or developed at home and abroad to promote the production of hair cells.
현재, 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화 촉진 기술은 배양 조건의 적절한 조절을 통하여 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 여러 다양한 세포들 중 조혈모세포가 다른 계통의 세포들보다 상대적으로 잘 생존하게 하는 개념을 근간으로 하고 있다.Currently, the technology of promoting differentiation from human embryonic stem cells to hematopoietic stem cells allows the hematopoietic stem cells to survive relatively better than other cell lines among various cells differentiated from human embryonic stem cells through appropriate regulation of culture conditions. Based on.
인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포로의 분화유도를 촉진하는 대표적인 기술은 2001 년 Kaufman 등에 의하여 최초로 보고된 바 있었다. Kauffman 등은 인간배아 줄기세포를 cytokine 첨가 없이 fetal bovine serum(FBS)만을 포함한 배지에서 H1 인간 배아 줄기세포 주를 바로 쥐의 기질세포인 S17 세포 혹은 배아 12 일째 쥐 난황에서 비롯된 C166 세포와 같이 배양하여 배양 3-5일에 기질세포에 약하게 부착되어 있는 작고 둥근 모양의 세포들을 관찰 후 이들을 17일간 계속 H1/S17 세포 혹은 H1/C166 세포로 분화시킨 다음 CD34+ 조혈모세포를 분리하고 hematopoiestic growth factor 가 포함된 semisolid methylcellulose-based medium 배양을 통하여 혈액세포 전구체(progenitors) 집락군을 관찰함으로써 조혈모세포의 존재와 기능을 증명한 바 있었다. 그 후 여러 기술 개발이 시도되고 있으나 모두 Kaufman 등이 제시한 기술을 근간으로 하고 있다. 그런데 Kaufman 등은 인간 배아 줄기세포를 쥐의 기질세포인 S17 세포 혹은 배아 12 일째 쥐 난황에서 비롯된 C166 세포와 같이 배양하였는데, 이는 연구목적일 경우에는 모르겠으나 직접 인체에 적용을 하기 위한 조혈모세포를 배양하는 목적으로 사용하기에는 문제(인간 배아 줄기세포와 쥐의 기질세포의 상호 작용 속에서 유전자적으로 변형된 인간 조혈모세포가 발생할 가능성)가 있을 수 있다고 여겨진다.A representative technique for promoting the differentiation of human embryonic stem cells from hematopoietic stem cells was first reported in 2001 by Kaufman et al. Kauffman et al. Cultured H1 human embryonic stem cell lines in human media containing only fetal bovine serum (FBS) without the addition of cytokine, together with S17 cells, which are mouse stromal cells, or C166 cells derived from mouse yolk on day 12. After 3-5 days of culture, small and round cells that are weakly attached to stromal cells were observed and continued to differentiate into H1 / S17 cells or H1 / C166 cells for 17 days, and then CD34 + hematopoietic stem cells were isolated and hematopoiestic growth factor was included. The presence and function of hematopoietic stem cells have been demonstrated by observing colonies of blood cell progenitors in semisolid methylcellulose-based medium. Since then, various technical developments have been attempted, but all are based on the technology proposed by Kaufman et al. However, Kaufman et al. Cultured human embryonic stem cells together with S17 cells, which are mouse stromal cells, or C166 cells derived from rat yolk on day 12 of the embryo, which is not known for research purposes, but cultured hematopoietic stem cells for direct application to the human body. It is believed that there may be a problem (the possibility of genetically modified human hematopoietic stem cells resulting from the interaction of human embryonic stem cells with rat stromal cells).
따라서, 본 발명의 주된 목적은 인간 골수기질세포를 이용하여 인간 배아체로부터 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, a main object of the present invention is to provide a method for promoting differentiation from human embryoid bodies to human hematopoietic stem cells using human bone marrow stromal cells.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 골수기질세포를 이용한 인간 배아체의 인간 조혈모세포로의 분화 촉진용 배지 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a medium composition for promoting differentiation of human embryoid bodies into human hematopoietic stem cells using the human bone marrow stromal cells.
본 기술개발의 목적은 정상 인간 골수 기질세포를 이용하여 인간 배아체로부터 조혈모세포로의 분화 촉진을 유도하는 기술을 개발함으로써 보다 효율적으로 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 분화를 유도할 뿐만 아니라 보다 안전하게 인체에 적용할 수 있는 조혈모세포 생산 기술을 개발함에 있다. 이를 위하여 출원인 등은 인간 배아 줄기세포로부터 배아체를 형성 후 이를 인간 골수 기질세포와의 배양을 시도하였고 그 결과를 유세포분석법 및 배양을 통한 집락형성 단위 측정을 통하여 증명하였다.The purpose of this technology development is to develop a technology that induces the differentiation of human embryonic stem cells from hematopoietic stem cells using normal human bone marrow stromal cells, thereby inducing differentiation of hematopoietic stem cells from human embryonic stem cells more efficiently and safely. In developing a technology for producing hematopoietic stem cells that can be applied to the human body. To this end, Applicants et al. Attempted to culture embryos from human embryonic stem cells and culture them with human bone marrow stromal cells. The results were verified through flow cytometry and measurement of colony forming units through culture.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 방법을 제공한다. In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a method for promoting differentiation into human hematopoietic stem cells by complex culture of embryonic bodies prepared from human embryonic stem cells with human myeloid matrix cells.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 배아체는 배아줄기세포를 종괴로 배양한 어떤 배아체도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 인간 배아 줄기세포로부터 4-6일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양하는 것을 특징으로 한다.In the method of the present invention, the embryo may be any embryonic body cultured embryonic stem cells as a mass, but preferably the embryonic body differentiated from human embryonic stem cells for 4-6 days with the normal human bone marrow stromal cells It is characterized by culturing.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 인간 골수 기질세포는 인간 골수기질세포를 화학제로 불활성화한 어떤 인간 골수기질세포도 사용할 수 있으나, 바람직하게는 인간 골수기질세포를 1,000-2000 cGy의 방사선을 조사하고 20-30 시간 배양한 후 배양용기의 바닥에 지지세포층이 형성되면 배아체를 첨가하는 것을 특징으로 한다.In the method of the present invention, the human bone marrow stromal cells may be any human bone marrow stromal cells in which human bone marrow stromal cells are inactivated with a chemical agent, but preferably, the human bone marrow stromal cells are irradiated with 1,000-2000 cGy of radiation. After 20-30 hours of incubation, when the support cell layer is formed at the bottom of the culture vessel, it is characterized in that the addition of the embryo.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간 골수기질세포를 함유하는 인간 배아체의 조혈모세포 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a medium composition for inducing hematopoietic stem cell differentiation of human embryoid bodies containing human myeloid stromal cells.
본 발명의 조성물은 인간 골수기질세포 외에 조혈모세포의 분화에 도움을 줄 수 있다고 종래 알려진 보조인자를 더 포함할 수 있으나, 바람직하게는 소태아혈청(fetal bovine serum), 말혈청(horse serum), L-글루타민 및 페니실린에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.The composition of the present invention may further include a conventionally known cofactor that may help differentiation of hematopoietic stem cells in addition to human bone marrow stromal cells, preferably fetal bovine serum, horse serum, It further comprises at least one selected from L- glutamine and penicillin.
이하, 본 발명을 단계별로 더욱 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail step by step.
본 기술은 인간 배아줄기세포로부터 배아체의 형성과 형성된 배아체를 인간 골수기질세포와의 복합배양 등 크게 2단계로 이루어 진다. 이에 관한 기술개발 흐름도는 (도 1)과 같다. 우선 SNUhES-3 인간 배아 줄기세포(세포응용연구사업단, 서울대학교 문신용 교수)의 배양을 위하여 약 150-300 세포 정도로 구성된 인간 배아 줄기세포 종괴(clump)를 쥐 배아 섬유아세포로 이루어진 지지세포(STO cell, ATCC, USA) 위에 접종한다. 접종된 인간 배아 줄기세포를 DMEM/F-12(GIBCO, USA), 20% Knockout SR(GIBCO, USA), 0.1 mM nonessential amino acid(GIBCO, USA), 0.1 mM β- mercaptoethanol(Sigma, USA), 100 U/ml penicillin G(Sigma, USA), 100 g/mL streptomycin((Sigma, USA), 4 ng/mL recombinant human βFGF(invitrogen, USA)으로 구성된 인간 배아 줄기세포 배양액을 well 당 0.8 mL 를 첨가하여 37℃, 5% CO2, 습도 95%의 조건에서 배양한다. 배양 48 시간 후 인간 배아 줄기세포가 지지세포 위에 정착하였음을 확인한 후 배양용기로부터 배양액을 제거하고 serum 이 제거된 인간 배아 줄기세포 배양액으로 세척한 다음 다시인간 배아 줄기세포 배양액을 well 당 0.8 mL 를 첨가한다. 이러한 과정으로 배양액을 48시간마다 교환하였다. 약 6-7 일이 경과하면 인간 배아 줄기세포 종괴가 커지면서 내부에서는 분화가 발생하기 시작하기 때문에 지속적인 현미경 육안 관찰을 통하여 종괴의 크기가 충분히 커지고 내부에서 분화가 시작되는 증거가 관찰되면 미분화된 인간 배아 줄기세포 종괴를 물리적인 방법으로 분리하여 다시 계대배양을 시행한다. 그리고 배양된 인간배아 줄기세포 종괴는 ALP 염색 및 SSEA 면역화학법으로 배아 줄기세포 주의 성상을 유지하고 있음을 확인한다(도 2). 배아 줄기세포로부터 배아체 분화, 형성을 위하여 배아 줄기세포 종괴를 계대 배양할 때의 크기보다 3-4 배정도 크게 분리한다. 분리된 종괴를 배양액(DMEM-F12, FBS, βFGF, GIBCO BRL, USA)에서 1시간 동안 응집시킨 후 다시 βFGF가 없는 DMEM-F12 배지에 혼합한다. 이를 48시간동안 incubator 에서 배양한 후 pasteur pipette 과 spoid 를 사용하여 종괴를 둥글게 조작하면서 배지를 1/2 정도 교환시켰다. 이런 방법으로 종괴(배양체)부터 5 일 간 배양하여 배아체를 형성시킨다(도 3). This technology consists of two stages: formation of embryoid bodies from human embryonic stem cells and complex culture of formed embryoid bodies with human bone marrow stromal cells. The technical development flow diagram is as shown in FIG. 1. First of all, for the culturing of SNUhES-3 human embryonic stem cells (Cell Applied Research Center, Professor, Tattoo University, Seoul National University), human embryonic stem cell clumps composed of about 150-300 cells were made of mouse embryonic fibroblasts (STO cell). , ATCC, USA). Inoculated human embryonic stem cells were treated with DMEM / F-12 (GIBCO, USA), 20% Knockout SR (GIBCO, USA), 0.1 mM nonessential amino acid (GIBCO, USA), 0.1 mM β-mercaptoethanol (Sigma, USA), Add 0.8 mL per well of human embryonic stem cell culture consisting of 100 U / ml penicillin G (Sigma, USA), 100 g / mL streptomycin ((Sigma, USA), 4 ng / mL recombinant human βFGF (invitrogen, USA) Incubate at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% humidity for 48 hours after confirming that human embryonic stem cells have settled on the support cells, remove the culture medium from the culture vessel, and remove the human embryonic stem cells from serum. After rinsing with culture, 0.8 mL per well of human embryonic stem cell culture was added again, and the culture was changed every 48 hours, after about 6-7 days, the human embryonic stem cell mass became larger and differentiated internally. Visual observation under continuous microscope because it begins to occur When the size of the tumor is sufficiently enlarged and evidence of differentiation starts, the undifferentiated human embryonic stem cell mass is separated by physical method and subcultured again. It is confirmed that SSEA immunochemistry maintains the state of embryonic stem cell lines (Fig. 2), which is 3-4 times larger than the size when passaged embryonic stem cell masses for embryonic differentiation and formation from embryonic stem cells. The isolated mass is aggregated in culture (DMEM-F12, FBS, βFGF, GIBCO BRL, USA) for 1 hour, and then mixed in DMEM-F12 medium without βFGF, which is incubated in an incubator for 48 hours. The pasteur pipette and spoid were used to round the mass and the medium was changed 1/2. In this way, the embryos are formed by culturing for 5 days from the mass (culture medium) (FIG. 3).
배양된 배아체로부터 조혈모세포의 분화 유도 촉진을 목적으로 한 인간 골수 기질세포(도 4)와의 복합배양을 위하여 인간 골수 기질세포(human stromal cell)를 1,500 cGy의 방사선을 조사하고 well 에서 24 시간 배양한 후 well 의 바닥에 지지세포층이 형성되면 배양된 배아체를 첨가하여 복합배양을 시행한다. 이 때 배지에는 IMDM(KDR, USA)를 사용하고 그 외에 fetal bovine serum, horse serum, L-glutamine, penicillin 등이 첨가되나 조혈성장촉진인자는 포함되지 않는다. 배지액은 1 주일마다 교환한다.Human stromal cells were irradiated with radiation of 1,500 cGy and cultured in wells for 24 hours for complex culture with human bone marrow stromal cells (FIG. 4) for the purpose of promoting differentiation of hematopoietic stem cells from cultured embryos. After the supporting cell layer is formed at the bottom of the well, the cultured embryos are added to the culture. In this case, IMDM (KDR, USA) is used, and fetal bovine serum, horse serum, L-glutamine and penicillin are added, but hematopoietic growth promoting factors are not included. The medium solution is changed every week.
본 기술의 효과 판정을 위하여 CD34+45- 조혈모세포 분화 백분율 및 집락형성 단위(colony forming unit, CFU)의 측정, 비교를 시행한다. 우선 인간 골수 기질세포에 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 및 CFUs 형성 수 차이를 분석, 비교하고 다음 단계로 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 인간 기질세포와의 복합배양 없이 배아체를 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 및 CFUs 형성 수 차이를 비교하여 분석한다(도 4, 5). 그리고 인간 골수 기질세포를 배아체와 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포 분화, 생산이 가장 극대화되는 배양기간을 검증하기 위하여 배양 3일, 5일, 7일, 10일 이후까지의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 및 CFUs 형성 수 차이를 분석, 비교한다.To determine the effectiveness of this technique, the measurement and comparison of CD34 + 45- hematopoietic stem cell differentiation percentage and colony forming unit (CFU) are performed. First, we analyzed and compared the CD34 + 45- hematopoietic stem cell percentage and the number of CFUs formation between the embryo culture of human bone marrow stromal cells and the embryo culture of embryonic stem cells themselves. Is analyzed by comparing the difference in the number of CD34 + 45-hematopoietic stem cells and the number of CFUs formation in the case of the complex culture with human stromal cells and the continuous differentiation of embryoid bodies without the complex culture with human stromal cells (FIGS. 4 and 5). ). CD34 + 45- CD34 + 45- up to 3 days, 5 days, 7 days, and 10 days after culture to verify the culture period of CD34 + 45- hematopoietic stem cell differentiation and production when culturing human bone marrow stromal cells Analyze and compare hematopoietic stem cell percentage and CFUs formation number differences.
CD34+CD45- 세포의 백분율을 측정을 위하여 유세포 분석법(flowcytometry, Beckton-Dickinson, USA)을 이용하였다. 우선 각 배양군으로부터 단핵구를 분리 후 단핵구에 FITC가 부착된 항 CD34 및 CD45 단클론 항체(anti-HPCA-2, Beckton-Dickinson, Mountain View, CA)를 20uL씩 첨가한 후 암소에서 4oC로 25분간 반응시켰다. 이를 0.1%의 sodium azide(Sigma)와 2% 우태아혈청이 함유된 세척액 1mL 및 2mL로 300g에서 각각 7분씩 2회 원침세척한 후, 1mL의 세척액에 부유시켜 FACS scan(Becton-Dickinson, USA)을 이용하여 CD34+CD45- 세포함유 정도를 측정하였다. 이 때 음성 대조군으로는 상기 CD34 양성 단클론 항체와 같은 종류인 anti-mouse IgG2 단세포군 항체를 동일한 조건으로 반응시킨 상층액을 사용하였다.집락형성 단위(CFUs)의 측정, 비교를 위하여 Semisolid methylcellulose-based medium 배양 중 Methocult H4444(Terry Fox Laboratory, USA) 법을 이용하였다. 우선, 각 배양군으로부터 Ficoll-Hypaue(Histopaque: Sigma, USA)을 이용한 밀도 구배 원심 분리법(density gradient centrifugation) 을 통하여 단핵구를 분리하였다. 이 단핵구들은5% 우 혈청 알부민(Bovine serum albumin, BSA, Sigma, USA)과 phosphate-buffered saline(PBS, Sigma, USA)로 1회 세척 후 거름망(30 um mesh)으로 걸러내었다. 그리고, 단핵구를 모아 CD34 단클론 항체 (QBend-10 mouse IgG1, Miltenyi reagent A2)를 이용하여 고 구배 면역자장 분리법(high gradient immunomagnetic separation, HGIS: MidiMACS, Miltenyi biotech, Sunnyvale, CA, USA)을 이용해서 분리하였다. 4℃에서 30 분간 단 클론 항체와 반응시킨 세포들을 PBS 로 1회 세척하며 자장이 걸려있는 분리 컬럼(column)을 통과시컨 CD34+ 세포를 분리하였다. 분리된 CD34+ 세포의. CFUs 집락 배양을 위하여 CD34+ 세포의 최종 농도를 2X103/mL 로 한 다음 이를 H-4444 배지와 10:1 의 비율로 혼합한 후 37℃, 5% CO2, 습도 95%의 조건에서 배양하여 14일 째에 도립 현미경을 통하여 집락 수를 측정하였다.Flow cytometry (Beckton-Dickinson, USA) was used to determine the percentage of CD34 + CD45 − cells. First, after each separating mononuclear cells from the culture group was added by the anti-CD34 and CD45 monoclonal antibodies (anti-HPCA-2, Beckton -Dickinson, Mountain View, CA) FITC is attached to monocytes 20uL at a dark place to 4 o C 25 The reaction was carried out for a minute. This was once washed twice at 300 g for 7 minutes each with 1 mL and 2 mL of 0.1% sodium azide (Sigma) and 2% fetal bovine serum, and then suspended in 1 mL of wash solution and FACS scan (Becton-Dickinson, USA) The degree of CD34 + CD45 − cells was measured using. At this time, the supernatant obtained by reacting the anti-mouse IgG 2 monoclonal antibody of the same type as the CD34 positive monoclonal antibody under the same conditions was used. Semisolid methylcellulose- for measuring and comparing colony forming units (CFUs) Methocult H4444 (Terry Fox Laboratory, USA) was used in the culture of the medium. First, monocytes were separated from each culture group by density gradient centrifugation using Ficoll-Hypaue (Histopaque: Sigma, USA). These monocytes were filtered out with a 30 um mesh after one wash with 5% bovine serum albumin (BSA, Sigma, USA) and phosphate-buffered saline (PBS, Sigma, USA). Then, the monocytes were collected and separated using CD34 monoclonal antibody (QBend-10 mouse IgG1, Miltenyi reagent A2) using high gradient immunomagnetic separation (HGIS: MidiMACS, Miltenyi biotech, Sunnyvale, CA, USA). It was. Cells reacted with monoclonal antibody at 4 ° C. for 30 minutes were washed once with PBS, and CD34 + cells were separated through a magnetic column. Of isolated CD34 + cells. For colonization of CFUs, the final concentration of CD34 + cells was 2 × 10 3 / mL, which was then mixed with H-4444 medium at a ratio of 10: 1, followed by incubation at 37 ° C., 5% CO 2 , and 95% humidity. On the day, colony counts were measured through an inverted microscope.
본 기술 발명은 특히 세포 치료에 필요한 혈액세포 생산 및 인공 혈액의 생산에 매우 유용하게 응용될 수 있다.The present invention can be very usefully applied to the production of blood cells and the production of artificial blood, which are particularly necessary for cell therapy.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. Since these examples are only for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1:Example 1: 배아체와의 복합배양을 위한 골수기질세포 제조 및 배양 기술 Bone marrow matrix cell production and culture technology for complex culture with embryonic body
본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 비롯한 배아체와 복합 배양 시킴으로써 조혈모세포의 생산을 촉진하기 위한 인간 골수기질세포를 제조하기 위한 기술에 관한 것이다. 우선 1,500 cGy의 방사선을 조사한 정상 골수 기질세포(도 4)와 배아체를 복합 배양을 시행할 배양 용기에에서 24 시간 배양을 시행한다. 24시간 후 배양 용기의 바닥에 지지세포층이 형성됨이 육안적으로 확인이 되면 인간 배아 줄기세포로부터 생산된 배아체를 첨가하여 복합배양을 시행한다. 이 때 배지에는 IMDM(KDR, USA)를 사용하고 그 외에 fetal bovine serum, horse serum, L-glutamine, penicillin 등이 첨가되나 조혈성장촉진인자는 포함되지 않는다. 도 4는 인간 배아체와 복합배양하는 인간 골수기질세포의 모습을 광학현미경 촬영한(X 40)한 사진이다.The present invention relates to a technique for producing human bone marrow stromal cells for promoting the production of hematopoietic stem cells by complex culture with embryos including human embryonic stem cells. First, the normal bone marrow stromal cells (FIG. 4) irradiated with 1,500 cGy and embryonic bodies were cultured for 24 hours in a culture vessel to be subjected to a complex culture. After 24 hours, it is visually confirmed that the support cell layer is formed on the bottom of the culture vessel, and the embryo culture produced from human embryonic stem cells is added. In this case, IMDM (KDR, USA) is used, and fetal bovine serum, horse serum, L-glutamine and penicillin are added, but hematopoietic growth promoting factors are not included. Figure 4 is a photograph taken with optical microscopy (X 40) of the appearance of human myeloid matrix cells in complex culture with the human embryoid body.
실시예 2:Example 2: 인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 CD34+45- 세포 생산 효과 Effect of CD34 + 45- Cell Production on Human Embryonic and Human Bone Marrow Cell Culture
본 기술발명의 핵심에 해당하는 인간 배아체와 인간 골수기질세포와의 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포 분화 촉진 효과를 증명하기 위하여 유세포분석법(flowxytometry)를 이용하여 인간 골수 기질세포에 5일간 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 차이 및 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 인간 기질세포와의 복합배양 없이 배아체를 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포 백분율 차이를 비교하여 분석하였다.In order to demonstrate the effect of promoting the differentiation of CD34 + 45- hematopoietic stem cells in the complex culture of human embryoid bodies and human bone marrow stromal cells, which are the core of the present invention, embryonic 5 days embryos in human bone marrow stromal cells CD34 + 45- Hematopoietic Stem Cell Percentage Difference in the Culture of Sieves and the Culture of Embryonic Stem Cells and the Culture of Human Stromal Cells We compared and analyzed CD34 + 45- hematopoietic stem cell percentage difference in case of continuous induction of embryoid body without culture.
그 결과, 배아 줄기세포 자체를 바로 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우, 배양 5일 째에 유세포분석법으로 검출된 CD34+45- 세포의 백분율은 0.00-0.23%로 그 중앙값이 0.09%이었음에 반하여 배아 줄기세포로부터 배아체를 형성 후 골수기질세포와 복합배양한 경우 배양 5일째에 CD34+45- 세포의 백분율이 0.92-1.97%로 그 중앙값이 1.16%로 검출됨으로써 유의하게(P<0.01) 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우에서 D34+CD45- 세포 검출이 높았음을 관찰할 수 있었다(도 5). 도 5는 CD34+45- 조혈모세포 분화 백분율의 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 인간 골수 기질세포에 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과, 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양 군에서 유의하게 증가되었다.As a result, when embryonic stem cells themselves were directly incubated with human bone marrow stromal cells, the percentage of CD34 + 45- cells detected by flow cytometry on the 5th day of culture was 0.00-0.23%, whereas the median value was 0.09%. When embryos were formed from embryonic stem cells and combined with bone marrow stromal cells, the percentage of CD34 + 45- cells was 0.92-1.97% and the median was 1.16% on the 5th day of culture, significantly ( P <0.01). It was observed that the detection of D34 + CD45 − cells was high when the sieve was incubated with human bone marrow stromal cells (FIG. 5). 5 is a graph showing the results of measurement of CD34 + 45 − hematopoietic stem cell differentiation percentage. Comparison of the Differentiation Induction Effect of CD34 + 45- Hematopoietic Stem Cells in the Combination Culture of Human Bone Marrow Stromal Cells with Human Embryonic Stem Cells for 5 Days and in Embryonic Stem Cells (Flowcytometry) As a result, it was significantly increased in the embryonic / human bone marrow stromal cell complex culture group.
또한, 배아체 자체만을 분화시킨 경우(0.00-018%)와 비교하여 보아도 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우에서CD34+45- 세포 검출율이 높았음을 확 인할 수 있었다(도 6). 도 6은 CD34+45- 조혈모세포 분화 백분율의 측정결과를 나타낸 그래프이다. 인간 배아줄기세포로부터 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 배아체만을 단독으로 계속 분화유도한 경우에서의 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도 효과 차이 비교(Flowcytometry 법)한 결과, 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양 군에서 유의하게 증가되었다(1.36% ㅁ 0.55) (p < 0.01).In addition, it was confirmed that the detection rate of CD34 + 45- cells was higher in the case of embryo cultured with human bone marrow stromal cells compared with the case of only differentiated embryos (0.00-018%) (Fig. 6). 6 is a graph showing the measurement results of CD34 + 45 − hematopoietic stem cell differentiation percentage. Comparison of the differentiation-induced effects of CD34 + 45- hematopoietic stem cells in complex culture of human embryonic stem cells with human stromal cells for 5 days As a result, it was significantly increased in the embryonic / human bone marrow stromal cell complex culture group (1.36% ㅁ 0.55) ( p <0.01).
실시예 3:Example 3: 인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 집락형성 단위(CFUs) 형성 효과 Effect of Colony Forming Units (CFUs) Formation in Combination of Human Embryonic Body
본 기술발명의 핵심에 해당하는 인간 배아체와 인간 골수기질세포와의 복합배양시 집락형성 단위(CFUs) 형성 효과 를 증명하기 위하여 고 구배 면역자장 분리법(MACS)을 이용하여 인간 골수 기질세포에 5일간 배아체를 복합 배양한 경우와 배아 줄기세포 자체를 복합배양한 경우에서의 CFUs 형성 차이 및 5일간 분화 유도된 배아체를 인간 기질세포에 복합배양한 경우와 인간 기질세포와의 복합배양 없이 배아체를 계속 분화유도한 경우에서의 CFUs 형성 차이를 분석하였다.In order to demonstrate the effect of colony forming units (CFUs) formation in the complex culture of human embryoid bodies and human bone marrow stromal cells, which are the core of the present invention, the high gradient immunomagnetic field separation (MACS) method was applied to human bone marrow stromal cells. Differences in the Formation of CFUs and Combination of 5-day Differentiated Induced Embryos into Human Stromal Cells and Without Embryonic Culture with Human Stromal Cells The difference in CFUs formation when the sieve continued to induce differentiation was analyzed.
그 결과, 배아 줄기세포 자체를 바로 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우, 배양 5일 째에 CFUs는 거의 측정디지 않았음에 반하여 배아 줄기세포로부터 배아체를 형성 후 골수기질세포와 복합배양한 경우 CFUs는 60-130으로 유의하게(P<0.01) 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우(2-10)보다 CFUs 형성이 많았음을 관찰할 수 있었다. 또한, 배아체 자체만을 분화시킨 경우(CFUs: 0-9)와 비교하여 보아도 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양한 경우에서 CFUs 형성이 많았음을 확인할 수 있었다.(도 6, 7 참조)As a result, when embryonic stem cells themselves were directly cultured with human bone marrow stromal cells, CFUs were hardly measured on the 5th day of culture, whereas when embryos were formed from embryonic stem cells, they were cultured with bone marrow stromal cells. CFUs were 60-130 ( P <0.01), and CFUs formation was higher than that of embryo cultured with human bone marrow stromal cells (2-10). In addition, it was confirmed that the formation of CFUs was higher in the case of complex culture with human bone marrow stromal cells compared to the case of only differentiated embryos (CFUs: 0-9) (see FIGS. 6 and 7).
실시예 4:Example 4: 인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 CD34+45- 세포 생성 및 집락형성단위(CFUs) 최적 생산기간 CD34 + 45- Cell Production and Optimal Production of Colony Forming Units (CFUs) in Human Embryonic and Human Bone Marrow Cell Cultures
본 기술발명의 핵심에 해당하는 인간 배아체와 인간 골수기질세포와의 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포 분화 촉진 및 CFUs 형성이 현저히 촉진됨을 확인 후 인간 배아체와 인간 골수기질세포 복합배양시 CD34+45- 세포 및 집락형성단위(CFUs) 최적 생산기간 을 확인하기 위하여 본 실험을 실시하였다. Flowxytometry법으로 실험한 결과, 배양 3-7 일 사이에 CD34+45- 세포가 분리됨을 확인할 수 있었다. 배양기간별로 분리된 세포 수의 중앙값을 살펴보면 배양 3 일에는0.7(0.4-1.2) X 104, 5 일에는 1.8(1.4-2.6) X 104, 7 일 에는 0.6(0.5-0.7) X 104이었으며 배양 1일째 및 배양 10 일 이후에는 CD34+ 세포가 분리되지 않았다(도 7). 그리고, 배양 5일 째에 다른 배양 시간에 비하여 유의하게(P<0.01) 가장 많은 세포가 분리됨을 확인할 수 있었다. 도 7은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 CD34+45- 조혈모세포의 분화 유도를 위한 최적 배양기간의 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.CD34 + 45- Hematopoietic stem cell differentiation and CFUs formation were markedly promoted in the complex culture of human embryoid body and human bone marrow stromal cells, which are the core of the present invention. This experiment was conducted to determine the optimal production period for + 45-cells and colony forming units (CFUs). As a result of experiments by the flowxytometry method, it was confirmed that CD34 + 45- cells were separated between 3-7 days of culture. The median number of cells separated by culture period is 0.7 (0.4-1.2)
그리고, H-4444 Methocult 배양법으로 실험한 결과, CFUs 형성 수에서도 배양 3일에는 0.5(0.2-0.8) X 102, 5 일에는 1.0(0.6-1.3) X 102, 7일에는 0.2(0.1-0.4) X 102으로 배양 5일 째에 다른 배양 시기에 비하여 유의하게(P<0.01) 가장 많은 CFUs 집락이 형성되었음을 관찰할 수 있었다(도 8). 도 8은 배아체/인간 골수 기질세포 복합배양시 집락형성 단위(colony forming unit, CFU) 형성 수의 극대화 를 위한 최적 배양기간 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.And has, H-4444 results of experiments in Methocult culture method, the culture may CFUs formed three days in the 0.5 (0.2-0.8) X 10 2, 5 days, 1.0 (0.6-1.3)
이상 설명한 바와 같이,본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 제조된 배아체를 인간 골수기질세포와 복합배양함으로써 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시키는 기술에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 인간 배아 줄기세포로부터 5일간 분화된 배아체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우가 배아줄기세포 자체를 정상 인간 골수 기질세포와 복합배양한 경우나 배아체 자체를 계속 분화시킨 경우보다 매우 현저하게 CD34+45- 인간 조혈모세포로의 분화를 촉진시킴을 증명함으로써 본 기술은 인간 배아 줄기세포로부터 조혈모세포의 분화/ 증식 촉진을 통하여 세포 치료를 위한 혈액세포 공급 및 인공혈액의 생산에 유용하게 응용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명으로 정상 인간 골수 기질세포가 인간 배아체로부터 비롯한 배아체로부터 조혈모세포로를 분화 촉진을 유도하는 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있다. 또한 상기 인간 골수 기질세포는 기조 기술인 쥐의 골수 기질세포를 이용하는 경우보다 안전하게 인체에 적용할 수 있는 조혈모세포를 생산할 수 있으리라고 기대된다.As described above, the present invention relates to a technique for promoting differentiation into CD34 + 45-human hematopoietic stem cells by complex culture of embryonic bodies prepared from human embryonic stem cells with human bone marrow stromal cells. Specifically, in the present invention, when the embryonic body differentiated from human embryonic stem cells for 5 days in combination with normal human bone marrow stromal cells, the embryonic stem cells themselves in complex culture with normal human bone marrow stromal cells or the embryo body itself. By demonstrating that it promotes differentiation into CD34 + 45- human hematopoietic stem cells much more significantly than when differentiated, the present technology provides blood cell supply and artificial blood for cell therapy through promoting differentiation / proliferation of hematopoietic stem cells from human embryonic stem cells. It can be usefully applied to the production of. In addition, the present invention can be seen that the normal human bone marrow stromal cells exhibit an excellent effect of inducing the differentiation of the hematopoietic stem cells from the embryo, including from the human embryo. In addition, the human bone marrow stromal cells are expected to be able to produce hematopoietic stem cells that can be safely applied to the human body than when using the bone marrow stromal cells of the key technology.
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