KR20060025692A - Composition comprising sal-2(salicylideneamino-2-thiophenol) as an effective component using as an anti-oxidant, anti-inflammatory or anti- aging agent - Google Patents
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Abstract
본 발명은 살리실레이트 (Salicylate) 유도체 SAL-2(SalicylideneaminoThe present invention is a salicylate derivative (Salicylideneamino SAL-2)
-2-thiophenol) 화합물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 SAL-2 화합물은 페록시니트라이트 (Peroxynitrite, ONOO-)를 제거하여 이로부터 유발되는 질환의 치료 및 예방용 의약품으로 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 SAL-2 화합물은 활성산소종을 제거하고, 노화 또는 염증이 진행되는 동안 증가하는 것으로 알려진 NF-κB (Nuclear factor κB)를 저해하여 IκB-α 분해 억제, 사이클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2), 유도성 니트릭 옥사이드 (inducible nitric oxide, iNOS) 등의 발현을 억제함으로서 노화 또는 염증에 대한 억제효과가 우수하므로 항산화, 항염증 또는 항노화용 의약품 및 건강기능식품으로 사용될 수 있다.Relates to a -2-thiophenol) compounds, specifically, the SAL-2 compounds of the present invention are peroxy nitrite (Peroxynitrite, ONOO - which may be used as a therapeutic and preventive medicine for diseases to remove) caused therefrom, In addition, the SAL-2 compound of the present invention removes reactive oxygen species, inhibits NF-κB (Nuclear factor κB), which is known to increase during aging or inflammation, inhibits IκB-α degradation, and cyclooxygenase-2 (Cyclooxygenase-2, COX-2) and inducible nitric oxide (inducible nitric oxide, iNOS) by inhibiting the expression of anti-aging or inflammation as it has an excellent effect on antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging drugs and health functional foods Can be used as
SAL-2, 페록시니트라이트, NF-κB, COX-2, iNOS, 항노화작용, 의약품, 건강기능식품SAL-2, peroxynitrite, NF-κB, COX-2, iNOS, anti-aging, medicine, health food
Description
도 1은 SAL-2의 슈퍼옥사이드(Superoxide, O2 -) 억제효과를 나타내는 그래프이며,Is a graph showing an inhibitory effect, - Fig. 1 is a superoxide (Superoxide, O 2) of the SAL-2
도 2는 SAL-2의 페록시니트라이트(Peroxynitrite, ONOO-) 억제효과를 나타내는 그래프이며,Is a graph showing an inhibitory effect, - Figure 2 is a peroxy nitrite of the SAL-2 (Peroxynitrite, ONOO)
도 3은 SAL-2의 총 활성산소종 억제효과를 나타내는 그래프이며,3 is a graph showing the total active oxygen species inhibitory effect of SAL-2,
도 4는 SAL-2의 노화 흰 쥐의 신장에서 발생하는 총 활성 산소종의 소거능(도 4a), 글루타치온 생성능(도 4b)을 나타낸 도이며, 4 is a diagram showing the scavenging ability of total reactive oxygen species (FIG. 4A) and glutathione generating ability (FIG. 4B) in the kidneys of aging white rats of SAL-2.
도 5는 SAL-2의 HNE(4-Hydroxynonenal)에 의해 유도된 NF-κB(도 5a), COX-2도 5c), iNOS(도 5d)의 발현 억제효과 및 IκB-α(도 5b)의 분해(degradation) 억제효과를 나타내는 그래프이다.5 shows the inhibitory effects of NF-κB (FIG. 5A), COX-2 (FIG. 5C), iNOS (FIG. 5D) and IκB-α (FIG. 5B) induced by HNE (4-Hydroxynonenal) of SAL-2. This graph shows the effect of inhibiting degradation.
본 발명은 SAL-2를 유효성분으로 함유하여 페록시니트라이트에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 또는 항산화, 항염증 또는 항노화용 약학조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diseases caused by peroxynitrite or containing antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging, containing SAL-2 as an active ingredient.
노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 과정으로 인체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에 일어나며, 대사속도의 저하, 질병증가, 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 노화 과정 및 원인을 설명하는 학설은 크게 유전자설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol. 2 : pp1-11, 1992)과 소모설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol. 2 : pp 1-11, 1992)로 나뉜다. 유전자설은 생물체가 태어날 때부터 이미 수명을 결정하는 프로그램이 짜여진 유전자를 갖고 있으며, 노화와 관련된 유전자의 활동에 의해 예정된 순서대로 노화가 진행된다는 이론으로 노화시계이론(aging clock theory), 다면발현성 유전자설(pleiotropic gene theoty), 텔로미어 이론(telomere theory), 돌연변이축적설(mutation accumulation theory) 등이 대표적이다.Aging is a functional, structural, and biochemical process that occurs continuously from birth to death, and occurs throughout the cells and tissues that make up the human body. It shows metabolic rate, increased disease, and decreased adaptability. This is a phenomenon that leads to the death of the whole body. Theories explaining the aging process and causes are largely genetic (Chung. HY et al., Kor. J. Gerontol. 2 : pp1-11, 1992) and consumption theory (Chung. HY et al., Kor. J. Gerontol). 2 : pp 1-11, 1992). The theory of genes is the theory that aging clock theory and pleiotropicity are genes that have genes that have been programmed to determine lifespan from the birth of an organism, and that aging proceeds in a predetermined order by the activity of genes related to aging. Pleiotropic gene theoty, telomere theory, and mutation accumulation theory are typical.
한편, 소모설은 기계를 오래 사용하면 소모가 되는 것처럼 생물체의 구성세포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하거나(wear & teat theory), 유해물질의 축적에 의한 것으로 설명하며, 특히 그 중에서도 인체 대사과정, 방사능 노출, 바이러스, 중금속 및 대기오염 등을 통해 생성되는 자유라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할 뿐 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유 라디칼 이론(free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여지고 있다.On the other hand, consumption theory explains that constituent cells of living organisms deteriorate with time (wear & teat theory) as if the machine is consumed for a long time, or it is explained by accumulation of harmful substances. Free radical theory that free radicals generated by human metabolism, radiation exposure, viruses, heavy metals and air pollution form toxic substances that not only promote aging but also cause various diseases related to aging This is the most influential theory.
자유 라디칼은 최외곽 전자궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는데, 그 구조가 매우 불안정하여 전자를 얻어 안정화하려는 성질로 인해 반응성이 매우 높다. 특히 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 활성산소라 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA손상, 단배질의 산화등을 유발하여 세포내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 되며 특히 혈관노화의 원인으로 염증과정에 관여함으로써 동맥경화, 알츠하이머, 혈중에 호모시스테인을 증가시킨다. Free radicals collectively refer to a material having an electron that is not paired with the outermost electron orbit, and its structure is very unstable and highly reactive due to its nature of obtaining and stabilizing electrons. In particular, free radicals derived from oxygen are called free radicals, and they react with proteins, lipids, and carbohydrates, causing lipid peroxidation, DNA damage, and oxidation of proteins, resulting in damage to intracellular structures, resulting in cell death. In particular, it is involved in the inflammatory process as a cause of vascular aging and increases homocysteine in arteriosclerosis, Alzheimer's, and blood.
산소와 관련된 인체 내 독성물질을 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 하는데 이러한 ROS의 종류로는 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실(hydroxyl), 페록실(peroxyl), 알콕실(alkoxyl), 히드로페록실(hydroperoxyl)과 같은 프리라디칼(유리기, free radical)과 히드로젠페록사이드(hydrogenperoxide), 히포클로로스 산(hypochlorous acid), 오존(ozone), 일중항 산소(singlet oxygen), 페록시니트라이트(peroxinitrite) 등과 같은 비(非)프리 라디칼(비유리기, non free radial)이 있다. 이 중에서 산소 독성 중 가장 많이 연구되어 왔고 중요한 역할을 하는 것은 수퍼옥사이드로 프리 라디칼(superoxide free radical, 활성 산소 또는 유해산소)이라고 알려져 있다(Fridovich L., Science, 201: pp175-180,1978). Oxygen-related toxic substances in humans are called reactive oxygen species (ROS). These types of ROS include superoxide, hydroxyl, peroxyl, alkoxyl, Free radicals such as hydroperoxyl and hydrogen peroxide, hypochlorous acid, ozone, singlet oxygen, and peroxynit There are non free radicals, such as peroxinitrite. The most studied and important role of oxygen toxicity is superoxide free radical (active oxygen or harmful oxygen) is known (Fridovich L., Science , 201 : pp175-180,1978).
특히 생체내에서는 나이트릭옥사이드(NO: Nitric Oxide)와 수퍼옥사이드( O2 -: superoxide)가 동시에 발생하는 조건에서 라디칼-라디칼 반응으로 비프리라디칼 페록시니트라이트(Peroxynitrite, ONOO-)가 쉽게 생성된다. 페록시니트라이트는 그 반감기가 밀리초(milisecond)로 다른 라디칼에 비하여 오랜 시간 존재하며 그 반응성 또한 매우 높으므로 활성 질소종 유래 독작용의 가장 큰 원인이라 할 수 있다. 페록시니트라이트의 독성 작용은 알츠하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부 염증 등 여러 질환 및 노화 관련 질환과 관련되는 것으로 보고되고 있다(Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol., Oxidants, antioxidants and carcinogenesis., Nov;40(11): pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock. Skin nitric oxide and its metabolites are increased in nonburned skin after thermal injuries., Sep;22(3): pp278-282, 2004; Lancel S et al., J. Am. Coll. Cardiol., Peroxynitrite decomposition catalysts prevent myocardial dysfunction and inflammation in endotoxemic rats., 16;43(12): pp2348-2358, 2004).In particular, in vivo in the old trick oxide (NO: Nitric Oxide) and superoxide (O 2 -: superoxide) - non-free radical peroxy nitrite (Peroxynitrite, ONOO -) by radical reaction is a radical from the conditions that occur at the same time is easy to produce do. Peroxynitrite has a half-life in milliseconds (milliseconds) compared to other radicals for a long time and its reactivity is also very high, which is the biggest cause of poisoning derived from active nitrogen species. The toxic effects of peroxynitrite have been reported to be associated with various diseases and age-related diseases such as Alzheimer's, cancer, arthritis, arteriosclerosis, and skin inflammation (Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol. , Oxidants, antioxidants and carcinogenesis., Nov; 40 (11) : pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock.Skin nitric oxide and its metabolites are increased in nonburned skin after thermal injuries., Sep; 22 (3) : pp278 -282, 2004; Lancel S et al., J. Am. Coll. Cardiol., Peroxynitrite decomposition catalysts prevent myocardial dysfunction and inflammation in endotoxemic rats., 16; 43 (12) : pp2348-2358, 2004).
이렇게 생성된 페록시니트라이트는 그 반감기가 밀리초 범위(millesecond range)로 세포를 통과하기에 충분한 시간이며, 세포내 표적물과 반응해서 산화, 니트로화를 일으키고 세포신호전달을 혼란시킨다. 페록시니트라이트는 니트릭옥사이드(NO)와 슈퍼옥사이드(O2 -)보다 독성이 더 강한 것으로 알려져 있으며, 지질, 단백질, 그리고 DNA의 산화와 니트로화 과정을 통해 혈관 평활근 세포의 이완, 혈소판 응집 저해 및 아미노산의 변형, 지질과산화의 유도에 의한 세포독성 등에 관여한다. 이러한 페록시니트라이트가 암, 관절염, 동맥경화 뿐만 아니라 노화 과정에서도 중요한 역할을 한다는 것으로 보고되고 있다.(Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol., Oxidants, antioxidants and carcinogenesis., Nov;40(11): pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock. Skin nitric oxide and its metabolites are increased in nonburned skin after thermal injuries., Sep;22(3): pp278-282, 2004; Lancel S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., Peroxynitrite decomposition catalysts prevent myocardial dysfunction and inflammation in endotoxemic rats., 16;43(12): pp2348-2358, 2004)The resulting peroxynitrite is sufficient time for its half-life to pass through the cell in the millisecond range, reacting with intracellular targets, causing oxidation, nitration and disrupting cellular signaling. Peroxy nitrite is nitric oxide (NO) and superoxide (O 2 -), and more toxicity is known to be more resistant, lipid, protein, and through oxidation and nitration process of DNA vasodilator of smooth muscle cells, platelet aggregation It is involved in the inhibition and modification of amino acids and cytotoxicity by induction of lipid peroxidation. These peroxynitrites have been reported to play important roles in the aging process as well as in cancer, arthritis and atherosclerosis (Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol. , Oxidants, antioxidants and carcinogenesis., Nov; 40 (11) : pp 1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock.Skin nitric oxide and its metabolites are increased in nonburned skin after thermal injuries., Sep; 22 (3) : pp278-282, 2004; Lancel S et al., J. Am. Coll. Cardiol., Peroxynitrite decomposition catalysts prevent myocardial dysfunction and inflammation in endotoxemic rats., 16; 43 (12) : pp2348-2358, 2004).
상기의 페록시니트라이트에 의한 산화적 손상을 예방하기 위한 다양한 노력이 진행되어 왔으며, 천연물에서 유래한 항산화제와 합성산화제가 다수 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다. 특히 생체에는 페록시니트라이트를 제거하는 효소가 없으므로, 천연물을 이용한 페록시니트라이트에 대한 독성을 방지하는 연구들이 몇몇 연구자들에 의해 연구되어, 플라보노이드(flavonoids), 비타민 E 등이 보고되었다. (Stevens JF et al., Chem. Res. Toxicol., Inhibition of peroxynitrite-mediated LDL oxidation by prenylated flavonoids: the alpha,beta-unsaturated keto functionality of 2'-hydroxychalcones as a novel antioxidant pharmacophore., 16(10): pp1277-1286, 2003; Beharka AA et al., Free Radic. Biol. Med., Mechanism of vitamin E inhibition of cyclooxygenase activity in macrophages from old mice: role of peroxynitrite., 15;32(6): pp503-511, 2002).Various efforts have been made to prevent oxidative damage caused by peroxynitrite, and many antioxidants and synthetic oxidants derived from natural products have been developed and used in medicine and food fields. In particular, since there is no enzyme for removing peroxynitrite in the living body, studies to prevent toxicity against peroxynitrite using natural products have been studied by several researchers, and flavonoids and vitamin E have been reported. Stevens JF et al., Chem. Res. Toxicol., Inhibition of peroxynitrite-mediated LDL oxidation by prenylated flavonoids: the alpha, beta-unsaturated keto functionality of 2'-hydroxychalcones as a novel antioxidant pharmacophore., 16 (10) : pp. 1277-1286, 2003; Beharka AA et al., Free Radic. Biol.Med., Mechanism of vitamin E inhibition of cyclooxygenase activity in macrophages from old mice: role of peroxynitrite., 15; 32 (6) : pp503-511, 2002).
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.Inflammatory reactions are associated with various mediators and immune cells of local blood vessels and body fluids when infected with tissues (cells) or external infectious agents (bacteria, fungi, viruses, and various types of allergens). It has a series of complex physiological reactions, including substance secretion, fluid infiltration, cell migration, and tissue destruction, as well as external symptoms such as erythema, edema, fever, and pain. In normal cases, the inflammatory response removes external infectious agents and regenerates damaged tissues to restore the function of life.However, if the inflammatory response is excessive or persistent due to the absence of antigens or internal substances, the mucosal damage is promoted. Some lead to diseases such as cancer.
생체에 있어서 염증의 발생원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 니트릭옥사이드(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제(nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX (cyclooxygenase)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.In vivo, inflammation causes various biochemical phenomena. Especially, nitric oxide synthase (NOS) and prostaglandin, enzymes that generate nitric oxide (NO), are involved. Enzymes associated with biosynthesis are known to play an important role in mediating the inflammatory response. Therefore, NOS, an enzyme that produces NO from L-Arginine, and COX (cyclooxygenase), an enzyme involved in synthesizing prostaglandins from arachidonic acid, are the main targets in blocking inflammation.
최근의 연구 결과에 따르면, NOS는 몇 가지 종류가 존재하는데 뇌에 존재하는 bNOS (brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 NO는 신경전달이나 혈관확장을 유도하는 등 정상적인 신체의 항상성 유지에 중요한 역할을 하는데 반하여, 각종 사이토카인(cytokines)이나 외부 자극물질에 의해 유도되는 iNOS(induced NOS)에 의해 급격히 과량 발생되는 NO는 세포독성이나 각종 염증반응을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 만성 염증은 iNOS 활성의 증가와 관련 있다는 연구가 있다(Miller M. J. et al., Mediators of inflammation, 4, pp387-396, 1995 : Appleton L. et al., Adv. Pharmacol., 35 , pp27-28, 1996). According to recent research, there are several types of NOS, such as bNOS (brain NOS) in the brain, neuronal NOS in the nervous system, and endothelial NOS in the vascular system. It is expressed at a level, and a small amount of NO produced by them plays an important role in maintaining normal homeostasis, such as inducing neurotransmission and vasodilation, whereas iNOS induced by various cytokines or external stimulants NO, which is rapidly over-produced by induced NOS, is known to cause cytotoxicity and various inflammatory reactions, and chronic inflammation has been associated with an increase in iNOS activity (Miller et al., Mediators of inflammation , 4 , pp 387-396, 1995: Appleton L. et al., Adv. Pharmacol. , 35 , pp 27-28, 1996).
또한, 시클로옥시게나제도 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증반응시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다(Weisz A., Biochem. J., 316, pp209-215, 1996). NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease) 및 결장암(colon cancer)을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다. In addition, there are two kinds of isoforms of cyclooxygenases. Cyclooxygenase-1 (COX-1) is always present in the cell, and is used to synthesize prostaglandins (PGs) necessary for cytoprotective action. In contrast, COX-2 is known to play an important role in causing an inflammatory response due to a rapid increase in cells during the inflammatory response (Weisz A., Biochem. J. , 316 , pp209-215, 1996). Transcriptional inflammatory factors, including iNOS and COX-2, which enhance the degree of NO and PGs, are chronic diseases including various sclerosis, parkinson's disease, Alzheimer's disease and colon cancer. Related to the etiology of.
NF-κB는 Rel 유전자계(Rel gene family)의 핵단백질로서, 세포질에서는 I-κB와 결합되어 불활성인 형태로 존재하나, 유해산소(reactive oxygen), TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1 (Interleukin-1)과 같은 케모카인(chemokines) 및 지질다당체(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 다양한 자극에 의해 I-κB 키나제(kinase)가 활성화된 후 인산화 과정을 통해 I-κB가 떨어져 나가게 된다. p50과 p65의 헤테로다이머(heterodimer)로 구성된 NF-κB는 활성화된 후, 핵으로 이동하여 염증 반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Oh, G. T. et al., Atherosclerosis, 159(1), pp17-26, 2001 : Epstein, F. H. et al., The New England Journal of Medicine, 336(15), pp1066-1071, 1997 : Zhang W. J. et al., FASEB J, 15(130), pp2423-2432, 2001 : Denk, A. et al., J. Biol. Chem., 276(30), pp28451-28458, 2001 : Sahnoun Z. et al., Physiology, 53(4), pp315-339, 1998 : Lindner V., Pathobiology, 66(6), pp311-320, 1998 : Landry, D. B. et al., Am. J. Pathol., 151(4), pp1085-1095, 1997 : Gerritsen, M. E. et al., Am. J. Pathol., 147(2), pp278-292, 1995).NF-κB is a nuclear protein of the Rel gene family. In the cytoplasm, NF-κB binds to I-κB and exists in an inactive form. However, NF-κB is reactive oxygen, TNF-α (tumor necrosis factor-α), I-κB kinase is activated by various stimuli such as chemokines and lipopolysaccharide (LPS) such as IL-1 (Interleukin-1), and then I-κB is released through phosphorylation. . NF-κB, composed of p50 and p65 heterodimers, is known to promote gene expression that, after being activated, moves to the nucleus to induce an inflammatory response (Oh, GT et al., Atherosclerosis , 159 (1)). , pp 17-26, 2001: Epstein, FH et al., The New England Journal of Medicine , 336 (15), pp 1066-1071, 1997: Zhang WJ et al., FASEB J , 15 (130), pp 2423-2432, 2001: Denk, A. et al., J. Biol. Chem. , 276 (30), pp28451-28458, 2001: Sahnoun Z. et al., Physiology , 53 (4), pp315-339, 1998: Lindner V ., Pathobiology , 66 (6), pp 311-320, 1998: Landry, DB et al., Am. J. Pathol. , 151 (4), pp 1085-1095, 1997: Gerritsen, ME et al., Am. J Pathol. , 147 (2), pp 278-292, 1995).
SAL-2(Salicylideneamino-2-thiophenol)는 살리실레이트의 유도체로서, 여기서 살리실레이트에 대해 살펴보기로 한다. 살리실레이트(Salicylate, Salicylic acid)은 O - 옥시벤조산에 해당한다. 화학식 C7H6O3 , 분자량 138.12, 녹는점 159℃, 비중 1.443, 승화성이 있고, 에테르, 에탄올 등 유기용매에 녹는다. 산성이고, 또 페놀이기도 하므로 염화철(Ⅲ)수용액을 가하면 보라색을 띤다. 천연으로는 에스테르의 형태로 대부분의 정유속에 함유되어 있는데, 특히 석남과 가울테리아속의 잎의 향유는 살리실산메틸이 주성분이기 때문에, 옛날부터 이것에서 살리실레이트를 얻었다. 건조한 나트륨페녹시드와 이산화탄소를 가열, 가압하여 반응시키면 생긴다. 이 반응은 1861년 A.W. 콜베가 처음 합성에 성공한 것을 R.슈미트가 개량하였으므로 콜베-슈미트의 반응(Kolbe-Schmitt reaction) 이라 한다. 살리실레이트는 해열, 진통의 작용을 지니고 있으므로, 나트륨염이나 칼슘염으로 내복하며, 또 각종 약물에 살리실레이트를 결합시켜 용해성, 안정성, 약리성 등을 개량하는데 쓰인다. 또 각질의 병적인 증식(사마귀, 티눈)을 제거하기 위한 고약으로 사용되고 메틸에스테르는 외용 도포약으로 진통, 소염 등에, 페닐에스테르는 장, 요도 등의 방부제로 사용된다. 또한 식품 방부제로 사용되었으나, 독성이 문제가 되어, 현재는 사용되지 않고 있다.Salicylideneamino-2-thiophenol (SAL-2) is a derivative of salicylate, which will be discussed here. Salicylate (Salicylic acid) corresponds to O-oxybenzoic acid. It has a chemical formula of C 7 H 6 O 3, a molecular weight of 138.12, a melting point of 159 ° C., a specific gravity of 1.443, and a sublimation property, and is soluble in organic solvents such as ether and ethanol. Acidic and phenolic, purple (III) solution is purple when added. Naturally, it is contained in most essential oils in the form of esters. Especially, salicylates have been obtained from ancient times since the leaves of the leaves of Suknam and Gauteria are the main component of methyl salicylate. It forms when dry sodium phenoxide and carbon dioxide are heated and pressurized. This reaction is called the Kolbe-Schmitt reaction because it was first improved by A. Kolbe in 1861 by R. Schmidt. Since salicylate has the action of antipyretic and analgesic, it is internally treated with sodium salt or calcium salt, and is used to improve solubility, stability and pharmacology by combining salicylate with various drugs. In addition, it is used as a plaster for removing pathological proliferation (warts, corns) of keratin, and methyl ester is used as an external coating agent for analgesic, anti-inflammatory, and phenyl ester is used as an antiseptic agent for intestines and urethra. In addition, it was used as a food preservative, but toxicity is a problem, and it is not currently used.
그러나 상기 문헌 어디에도 SAL-2가 인체에 유해한 페록시니트라이트를 제거하고, 노화 또는 염증의 지표로 알려진 NF-κB의 작용기전을 조절하여 IκB-α 분해 억제, 사이클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2), 유도성 니트릭 옥사이드(inducible nitric oxide, iNOS) 등의 발현을 억제하는 활성이 있음이 교시되거나 개시된 바 없다.However, even in this document, SAL-2 eliminates harmful peroxynitrite and regulates the mechanism of action of NF-κB, which is known as an indicator of aging or inflammation, to inhibit IκB-α degradation and cyclooxygenase-2. 2, COX-2), inducible nitric oxide (inducible nitric oxide (iNOS), etc. It is not taught or disclosed that there is activity to inhibit the expression.
이에 본 발명자들은 살리실레이트의 유도체인 SAL-2(Salicylideneamino-2-thiophenol)이 페록시니트라이트를 제거하여 이에 의해 유발되는 질환의 치료 및 예방용 약학조성물으로 사용될 수 있으며, 활성산소종을 제거하고, 노화 또는 염증이 진행되는 동안 증가하는 것으로 알려진 NF-κB (Nuclear factor κB)를 억제하여 IκB-α 분해 억제, 사이클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2), 유도성 니트릭 옥사이드(inducible nitric oxide, iNOS)등의 발현을 억제함으로서 노화 또는 염증에 대한 억제효과가 우수함을 확인하여 상기 물질이 항산화, 항염증 또는 항노화용 약학조성물로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors can be used as a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of diseases caused by SAL-2 (Salicylideneamino-2-thiophenol), which is a derivative of salicylate, removes peroxynitrite, and removes free radical species. Inhibits IκB-α degradation, cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitrics by inhibiting NF-κB (Nuclear factor κB), which is known to increase during aging or inflammation By inhibiting the expression of oxide (inducible nitric oxide, iNOS) and the like to confirm that the inhibitory effect against aging or inflammation is excellent, confirming that the substance can be used as a pharmaceutical composition for antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging to complete the present invention It was.
본 발명의 목적은 SAL-2 화합물을 포함하여 페록시니트라이트에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료 또는 항산화, 항염증 또는 항노화용 약학조성물을 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diseases caused by peroxynitrite or antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging, including SAL-2 compounds.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화학구조를 갖는 SAL-2(Salicylideneamino-2-thiophenol) 화합물 또는 이의 약리학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 페록시니트라이트에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention is induced by peroxynitrite containing SAL-2 (Salicylideneamino-2-thiophenol) compound having the chemical structure of
상기 페록시니트라이트에 의해 유발되는 질환에는 알츠하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부염증 등이 포함된다.Diseases caused by the peroxynitrite include Alzheimer's, cancer, arthritis, arteriosclerosis, dermatitis and the like.
또한, 본 발명은 상기 SAL-2 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 약학조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging comprising the SAL-2 compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
상기 약학조성물은 총활성산소종의 발생을 특이적으로 억제하고, 노화가 진행되는 동안에 증가하는 것으로 알려진 NF-κB 조절기전을 통한 IκB-α 분해 억제, COX-2, 또는 iNOS 의 발현을 억제함에 기인하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.The pharmaceutical composition specifically inhibits the development of total reactive oxygen species, inhibits IκB-α degradation through the NF-κB regulatory mechanism known to increase during aging, and inhibits the expression of COX-2, or iNOS. It provides a pharmaceutical composition, characterized in that the resulting.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명의 SAL-2 화합물은, 당업계에서 잘 알려진 합성방법에 의하여 수득하거나 시중구입이 가능하다.SAL-2 The compounds of the present invention, obtained by well-known synthetic methods in the art or can be purchased commercially.
따라서 본 발명은 SAL-2 화합물을 유효성분으로 함유하는 페록시니트라이트에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of diseases caused by peroxynitrite containing SAL-2 compound as an active ingredient.
또한, 본 발명은 SAL-2 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 약학조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging containing the SAL-2 compound as an active ingredient.
상기 SAL-2 화합물의 항산화, 항염증, 항노화 효능을 알아보기 위하여, SAL-2의 수퍼옥사이드와 페록시니트라이트의 제거능을 측정한 결과, SAL-2의 농도 의존적으로 수퍼옥사이드, 페록시니트라이트, 총활성산소종의 생성이 억제되었고, YPEN-1세포에서 HNE에 의해 유도된 NF-κB, COX-2, iNOS의 발현이 SAL-2의 농도 의존적으로 억제되었고, IκB-α의 분해가 SAL-2에 의해 억제됨을 확인하여 SAL-2 화합물의 항산화, 항염증, 항노화 활성을 확인하였다.In order to determine the antioxidant, anti-inflammatory, and anti-aging effects of the SAL-2 compound, the superoxide and peroxynit of SAL-2 were determined as a result of measuring the removal ability of the superoxide and peroxynitrite of SAL-2. The production of light, total reactive oxygen species was inhibited, HNE-induced expression of NF-κB, COX-2, iNOS in YPEN-1 cells was inhibited in a concentration dependent manner of SAL-2, and the degradation of IκB-α Inhibition by SAL-2 confirmed the antioxidant, anti-inflammatory and anti-aging activity of the SAL-2 compound.
상기 화학식 1로 표기되는 본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다. The compound of the present invention represented by
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.As the pharmaceutically acceptable salt, acid addition salts formed by free acid are useful. Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equal molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethylether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.In this case, organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, etc. may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, Citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid ( gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid, and the like.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained by, for example, dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. At this time, as the metal salt, it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).
상기의 화학식 1의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다. Pharmaceutically acceptable salts of
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.5 내지 50 중량%로 포함한다.The pharmaceutical composition comprising the compound of the present invention comprises 0.5 to 50% by weight of the compound based on the total weight of the composition.
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.Pharmaceutical compositions comprising the compounds of the present invention may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.Pharmaceutical dosage forms of the compounds of the present invention may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts, and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable collection.
본 발명에 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알 지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions comprising the compounds of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. Can be used. Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition comprising the compound include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose in the compound. Or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.01 내지 500mg/kg으로, 바람직하게는 0.01 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.Preferred dosages of the compounds of the present invention depend on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, but may be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the compound of the present invention is preferably administered at 0.01 to 500 mg / kg, preferably 0.01 to 100 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. The compounds of the present invention can be administered to mammals such as mice, mice, livestock, humans, and the like by various routes. All modes of administration can be expected, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
본 발명은 상기 SAL-2 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.The present invention provides a dietary supplement comprising the SAL-2 compound and a food supplement acceptable food supplement. Examples of the food to which the compound of the present invention can be added include various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, and health functional foods.
또한, 상기 SAL-2 화합물은 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.1 내지 3 g, 바람직하게는 0.1 내지 2.3g의 비율로 가할 수 있다. In addition, the SAL-2 compound may be added to food or beverage. At this time, the amount of the compound in the food or beverage can be added in 0.01 to 15% by weight of the total food weight, the health beverage composition is added in a ratio of 0.1 to 3 g, preferably 0.1 to 2.3g based on 100 ml Can be.
본원에서 정의되는 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함하며, 하기에 예시한다.Food supplement additives as defined herein include food additives customary in the art, such as flavorings, flavors, colorants, fillers, stabilizers, and the like, and are exemplified below.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같 이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.The health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except for containing the compound as essential ingredients in the indicated ratios, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. . Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those mentioned above, natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the compounds of the present invention include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, coloring and neutralizing agents (such as cheese and chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid and its Salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like. In addition, the compounds of the present invention may contain flesh for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not so critical but is usually selected in the range of 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the compound of the present invention.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.Below, The invention is illustrated in detail by the following examples and experimental examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Experimental Examples are only illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following Experimental Examples.
실시예 1. 실험의 준비Example 1 Preparation of Experiment
1-1. 시약1-1. reagent
SAL-2는 TCI(Tokyo kasei), 페니실라민(penicillamine)은 시그마알드리치(Sigma Chemical Co. - St. Louis, MO, USA)에서, HNE(4-hydroxynonenal) 와 페록시니트라이트(peroxynitrite, ONOO-)는 케이만사(Cayman Chemical Co. - Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하여 사용하였다.SAL-2 is TCI (Tokyo kasei), penicillamine is Sigma Chemical Co.- St. Louis, MO, USA, HNE (4-hydroxynonenal) and peroxynitrite (ONOO) - ) Was purchased from Cayman Chemical Co.-Ann Arbor, MI, USA.
디하이드로로다민(dihydrorhodamine)123, DCFDA(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)는 몰레큘라 프로브사(Molecular probes - Eugene, OR, USA)에서 구입하였으며, 디아미노플루오리세인(diaminofluorescein)은 다이이치화학회사(Daiichi Chemicals., Japan)로부터 구입하였다. YPEN-1 세포(rat prostate endothelial cells)는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD,USA)에서, NF-κB, IκB-α, COX-2, iNOS 항체들과 이들의 2차 항체인 염소 폴리(goat poly), 토끼 폴리(rabit poly)는 산타쿠르즈 바이오 테크놀로지 사(Santa Cruz Biotechnology - Santa Cruz CA. USA)에서 구입하였다. 그 밖에 세포배양에 사용된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium Media)배지, 스트렙토마이신(streptomycin), 트립신(trypsin), 소태아혈청(fetal bovine serum)은 GIBSCO에서 구입하였고, 암포테리신 B(amphotericin B)는 시그마에서, 단백질 분석 시약(protein assay reagents)은 파이오엘스(Pioerce)사에서 구입하였다. 디벨로프 (develope)는 아머샴(Amersham life science)에서 구입한 ECL (enhanced chemiluminescence)을 사용하여 관찰하였다.Dihydrorhodamine 123, DCFDA (2 ′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate) was purchased from Molecular probes (Eugene, OR, USA), and diaminofluorescein It was purchased from a chemical company (Daiichi Chemicals., Japan). YPEN-1 cells (rat prostate endothelial cells) are NF-κB, IκB-α, COX-2, iNOS antibodies and their secondary antibodies, goat poly, from the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA. (goat poly), rabbit poly (rabit poly) was purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology-Santa Cruz CA. USA). In addition, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium Media) medium, streptomycin, trypsin, and fetal bovine serum used for cell culture were purchased from GIBSCO and amphotericin B (amphotericin B). In Sigma, protein assay reagents were purchased from Pierce. The development was observed using enhanced chemiluminescence (ECL) purchased from Amersham life science.
1-2. 실험기기1-2. Experiment apparatus
미세판 형광 판독기(microplate fluorescence Genious, Tecan, Austria), 웨스턴 블랏 시스템-3 키트(Western blot system-3 kit, Mini-protean 3 cell, Bio Rad)를 사용하였다.Microplate fluorescence Genious (Tecan, Austria) and Western blot system-3 kit (Mini-protean 3 cell, Bio Rad) were used.
1-3. 실험 동물의 준비1-3. Preparation of Experimental Animals
실험동물로 400 g 내외, 6개월령 및 24개월령의 피셔 344(Fischer 344) 수컷 흰주를 샘타코(경기도 오산, 한국)에서 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 실험환경에 적응시킨 다음 실험에 착수하였다.As an experimental animal Around 400 g, 6 months and 24 months Fischer 344 male white liquor was purchased from Samtaco (Osan, Gyeonggi-do, Korea) and adapted to the experimental environment for one week with sufficient feed and water.
실험예 1. SAL-2의 수퍼옥사이드, 페록시니트라이트, 총활성산소종 제거능 측정Experimental Example 1. Determination of superoxide, peroxynitrite and total reactive oxygen species removal ability of SAL-2
1-1. 수퍼옥사이드(superoxide)에 대한 제거효과 측정1-1. Determination of Removal Effect on Superoxide
DCFDA(2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate) 어세이를 위해 99.9 %의 에탄올에 용해한 12.5 mM DCFDA와 3차 증류수에 용해한 600 U/㎖ 에스테라아제(esterase)를 -20℃에 스탁 솔루션(stock solution)으로 저장하였으며, 실험시 10 μM DCFDA와 6 U/에스테라아제 또는 산화적 가수분해를 받아 비형광성인 DCFH(2,7-dichlorodihydrofluorescein)로 탈아세틸화되며, DCFH는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF(2,7-dichlorofluorescein)가 되므로 이를 여기파장 485nm과 방출파장 530nm에서 측정한다. 이 실험에서는 본 발명의 SAL-2를 0.2, 1, 10uM 처리한 후 30분간 5분 간격으로 미세판 형광 판독기로 측정하였다. For 2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) assay, 12.5 mM DCFDA dissolved in 99.9% ethanol and 600 U / ml esterase dissolved in tertiary distilled water were stored at -20 ° C as a stock solution. In experiments, 10 μM DCFDA and 6 U / esterase or oxidative hydrolysis deacetylated to non-fluorescent DCFH (2,7-dichlorodihydrofluorescein), which was oxidized by free radicals to give strong fluorescence of DCF (2 , 7-dichlorofluorescein), so it is measured at excitation wavelength 485nm and emission wavelength 530nm. In this experiment, the SAL-2 of the present invention was treated with 0.2, 1, 10 uM, and measured with a microplate fluorescent reader at 5 minute intervals for 30 minutes.
상기 실험의 수행 결과, 도 1에서 나타나는 바와 같이, 수퍼옥사이드의 생성이 각각 16, 55, 41 % 억제되었으므로, SAL-2의 첨가 농도가 1uM 이하일때 SAL-2의 농도 의존적으로 수퍼옥사이드 생성 억제 작용이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. As a result of the experiment, as shown in Figure 1, the production of superoxide was inhibited by 16, 55, 41%, respectively, concentration-dependent superoxide production inhibitory effect of SAL-2 when the concentration of SAL-2 is less than 1uM It was confirmed that this increase.
1-2. 페록시니트라이트(peroxynitrite)에 대한 제거 효과 측정1-2. Determination of Removal Effect on Peroxynitrite
본 발명의 SAL-2가 페록시니트라이트에 대하여 제거 작용을 갖는지를 확인하기 위하여 쿠이(Kooy)등의 방법(Kooy, N et al., Free Radic. Biol. Med., Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine 123. 16: pp149-156, 1994)을 변형하여 디하이드로로다민(dihydrorhodamine) 123의 산화를 측정함으로써 수행하였다. 90 mM 염화나트륨, 50 mM 인산나트륨, 5 mM 염화칼슘 (pH 7.4) 및 100 mM, 디에틸렌 트리아민펜타-아세트산(diethylene triamine penta-acetic acid) 으로 구성된 완충액에 시료와 페록시니트라이트 용액을 넣어 산화된 디하이드로로다민(dihydrorhodamine) 123의 형광강도를 여기파장 480 nm, 방출파장 530 nm인 미세판 형광 판독기에서 측정하였다. In order to confirm whether SAL-2 of the present invention has a removal effect on peroxynitrite, the method of Koy et al. (Kooy, N et al., Free Radic. Biol. Med., Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine 123 16:. pp149-156, 1994) was performed by modification by measuring the oxidation of the dihydro-rhodamine (dihydrorhodamine) 123. The sample and peroxynitrite solution were oxidized in a buffer consisting of 90 mM sodium chloride, 50 mM sodium phosphate, 5 mM calcium chloride (pH 7.4) and 100 mM, diethylene triamine penta-acetic acid. The fluorescence intensity of dihydrorhodamine 123 was measured in a microplate fluorescence reader with excitation wavelength 480 nm and emission wavelength 530 nm.
상기 실험의 수행 결과, 도 2에서 나타나는 바와 같이 SAL-2의 농도를 10, 50, 100 uM 첨가한 경우에 디하이드로로다민의 활성을 각각 79, 94, 97 % 억제하였 으므로, SAL-2의 첨가 농도가 높을수록 페록시니트라이트(ONOO- )의 활성은 감소하는 것을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, as shown in FIG. 2, when SAL-2 concentrations of 10, 50, and 100 uM were added, the activity of dihydrodamine was suppressed by 79, 94, and 97%, respectively. As the concentration was higher, the activity of peroxynitrite (ONOO − ) decreased.
1-3. 총활성산소종에 대한 제거효과 측정1-3. Determination of Total Oxygen Free radicals
DCFDA어세이를 위해, 99.9%의 에탄올에 용해한 12.5 mM DCFDA와 LPS(Lipopolysacharide) 처리한 쥐 신장 균등액(rat kidney homogenate)을 -80℃에 스탁솔루션으로 저장하였으며, 실험시 10 μM DCFDA와 균등액은 산화적 가수분해를 받아 비형광성인 DCFH로 탈아세틸화되며, DCFH는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF가 되므로 이를 여기파장 485nm과 방출파장 530nm에서 측정한다. 본 실험에서는 SAL-2를 10, 50, 100uM 처리한 후 30분간 5분 간격으로 미세판형광 판독기로 측정하였다. For DCFDA assay, 12.5 mM DCFDA and Lipopolysacharide (LPS) in 99.9% ethanol Treated rat kidney homogenate was stored as a stock solution at -80 ° C. During the experiment, 10 μM DCFDA and the equivalent solution were subjected to oxidative hydrolysis and deacetylated to non-fluorescent DCFH, and DCFH was active. Oxidized by oxygen, it becomes DCF which shows strong fluorescence, so it is measured at excitation wavelength 485nm and emission wavelength 530nm. In this experiment, the SAL-2 was measured with a microplate fluorescence reader at 10 minutes, 50 minutes, and 100 minutes for 5 minutes.
상기 실험의 수행 결과, 도 3에서 나타나는 바와 같이 본 발명의 SAL-2를 투여한 경우에 총활성산소종의 생성이 각각 40, 62, 67 % 억제되었으므로, SAL-2의 첨가 농도 의존적으로 총활성산소종 생성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, as shown in FIG. 3, total active oxygen species production was suppressed by 40, 62, and 67%, respectively, when the SAL-2 of the present invention was administered. It was confirmed that oxygen species production was suppressed.
1-4. SAL-2의 생체내 항산화능 측정1-4. In vivo antioxidant activity of SAL-2
본 발명의 SAL-2가 생체내에서도 항산화능을 갖는지를 검색하기 위하여 실시예 1-3 에서 준비한 24개월령의 노화된 흰 쥐에 본 발명의 SAL-2를 쥐 무게의 0.03%, 0.06% 농도로 먹이와 섞어 경구 투여하여 10일 후 해부하여 신장을 절제하 고 파쇄하여 DCFDA를 이용하여 형광의 변화를 관찰하기 위하여, 여기 파장 484nm, 방출 파장 535nm에서 30분간 5분 간격으로 미세형광 판독기로 측정하였다. 6개월령의 어린 흰 쥐의 대조군(Young), 24개월령의 노화된 흰 쥐의 대조군(Old), 나머지는 24개월의 노화된 흰 쥐에 SAL-2를 각 쥐 무게의 0.03%, 0.06% 농도로 투여하였다.In order to detect whether the SAL-2 of the present invention has antioxidant capacity in vivo, the SAL-2 of the present invention was fed to the aged 24-month old rats prepared in Examples 1-3 at 0.03% and 0.06% of the weight of the rat. After 10 days of oral administration and dissection, the kidneys were excised and crushed to measure the change in fluorescence using DCFDA, and measured with a microfluorescence reader at an interval of 5 minutes at an excitation wavelength of 484 nm and an emission wavelength of 535 nm for 30 minutes. Young 6-month-old control rats (Young), 24-month-old aging rats (Old), and the rest of the 24-month old white rats in the SAL-2 concentration of 0.03%, 0.06% of each rat weight Administered.
상기 실험 수행의 결과, 도 4a에서 보는 바와 같이 노화된 흰 쥐의 경우 어린 흰 쥐에 비해 생체내 활성 산소의 생성이 증가되었고, 노화된 흰 쥐에 본 발명의 SAL-2를 투여한 경우 SAL-2 농도 의존적으로 노화된 흰 쥐의 생체내 활성 산소의 생성이 감소됨을 확인할 수 있었다.As a result of the above experiment, as shown in FIG. 4A, the generation of free radicals in vivo was increased in the aged white rats compared to the young white rats, and when the SAL-2 of the present invention was administered to the aged white rats, SAL- 2 It was confirmed that the production of free radicals in vivo in white rats aged in a concentration-dependent manner.
1-5. SAL-2의 생체내 항산화조절계인 글루타치온(glutathione, GSH) 측정1-5. Measurement of glutathione (GSH), an in vivo antioxidant regulator of SAL-2
본 발명의 SAL-2가 생체내에서 항산화조절계인 GSH를 보호하는지 검토하기 위하여 실시예 1-3에서 준비한 24개월령의 노화된 흰 쥐에 본 발명의 SAL-2를 쥐무게의 0.03%, 0.06% 농도로 먹이와 섞어 경구 투여하여 10일 후 해부하여 신장을 절제하고 파쇄하여 형광의 변화를 여기 파장 360nm, 방출 파장 460nm에서 미세판 형광 판독기로 1회 측정하였다. 6개월령의 어린 흰 쥐의 대조군(Young), 24개월령의 노화된 흰 쥐의 대조군(Old), 나머지는 24개월의 노화된 흰 쥐에 SAL-2를 쥐무게의 0.03%, 0.06% 농도로 투여하였다. In order to examine whether the SAL-2 of the present invention protects GSH, an antioxidant regulatory system in vivo, the SAL-2 of the present invention was treated with 0.03% and 0.06% of the SAL-2 of the present invention in 24 months old aged rats prepared in Examples 1-3. After 10 days of mixing with the food and orally administered, dissecting the kidneys, dissecting and crushing, the change in fluorescence was measured once with a microplate fluorescence reader at excitation wavelength 360nm, emission wavelength 460nm. The control group of young white rats (6 months old), the control group of aged white mice (Old) of 24 months old, and the rest were administered SAL-2 at 0.03% and 0.06% of the rats. It was.
상기 실험 수행의 결과, 도 4b에서 보는 바와 같이 노화된 흰 쥐의 경우 어린 흰 쥐에 비해 글루타치온 생성능이 감소되었고, 노화된 흰 쥐에 본 발명의 SAL- 2를 투여한 경우 노화된 흰 쥐의 글루타치온의 생성이 SAL-2 농도 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다. As a result of the experiment, as shown in FIG. 4B, glutathione production ability was decreased in the aged white rats as compared to the young white rats, and glutathione in the aged white rats when SAL-2 of the present invention was administered to the aged white rats. It was confirmed that the production of SAL-2 concentration-dependently increased.
실험예 2. YPEN-1 세포 에서 HNE에 의해 유도된 NF-κB, COX-2, iNOS 발현 억제능, IκB-α 의 분해 억제능 측정Experimental Example 2 Determination of HNE-induced NF-κB, COX-2, iNOS Expression Inhibition and IκB-α Degradation Inhibitory Activity in YPEN-1 Cells
2-1. SAL-2의 NF-κB(2-1. NF-κB of SAL-2 ( PP 65)의 DNA 결합활성 억제효과 65) Inhibitory Effect of DNA Binding Activity
본 발명의 SAL-2가 생체내에서 페록시니트라이트(ONOO- )에 의해 발생되는 단백질 질화(nitration)에 대한 저해효과를 나타내는지 확인하기 위하여 동물세포에서 NF-κB(P65) 유전자 발현정도를 측정하는 하기와 같은 실험을 수행하였다. 본 실험예에서는 YPEN-1 세포(rat prostate endothelial cells)에 활성종을 일으키는 HNE 15uM과 본 발명의 SAL-2를 농도별로 투여한 후 라디칼의 생성 억제 정도를 관찰하여 24시간 후 세포를 모아 사용하였으며, 단백질 양의 확인은 웨스턴 블러팅(western blotting)을 실시하였다. Degree of NF-κB ( P 65) Gene Expression in Animal Cells to Determine Whether SAL-2 of the Present Invention Inhibits the Protein Nitrification Induced by Peroxynitrite (ONOO − ) In Vivo The following experiment was performed to measure. In this experiment, after administration of HNE 15uM and SAL-2 of the present invention, which cause active species to YPEN-1 cells (rat prostate endothelial cells) by concentration, the cells were collected and used after 24 hours to observe the degree of inhibition of radical production. The amount of protein was confirmed by western blotting.
먼저, 동물세포는 브롬페놀 블루(bromophenol blue)염색액과 동량 섞은 후 10 % SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다. 이후 NF-κB(P65)에 대한 토끼의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응 시킨 다음, 2차 항체로서 항 토끼 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS( Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.First, animal cells were electrophoresed in 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) after mixing the same amount with bromophenol blue dye. After electrophoresis, the protein was transferred to the polyvinylidene fluoride membrane (Milliposa), and tris buffered saline (TBS) containing 0.5% skim milk was used. The nonspecific reaction was blocked by soaking in solution (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1
상기 실험의 수행결과, 도 5a에서 나타나는 바와 같이, 활성종을 일으키는 HNE에 비해 본 발명의 SAL-2 를 처리한 동물세포에서 NF-κB(P65) 유전자 발현이 감소되었음을 확인할 수 있었다.As a result of the experiment, as shown in Figure 5a, it was confirmed that the expression of NF-κB ( P 65) gene in the animal cells treated with SAL-2 of the present invention compared to HNE causing the active species.
2-2. SAL-2의 IκB-α 분해(degradation) 억제효과 2-2. Inhibitory Effect of SAL-2 on IκB-α Degradation
본 발명의 SAL-2가 생체내에서 페록시니트라이트(ONOO-)에 의해 발생되는 단백질 질화에 대한 저해효과를 나타내는지 확인하기 위하여, IκB-α 분해 억제능을 측정하는 하기와 같은 실험을 수행하였다. 본 실험에서는 동물세포에 활성종을 일으키는 HNE 15μM과 본 발명의 SAL-2를 투여하여 24시간 후 세포를 모아 사용하였으며 단백질 양의 확인은 웨스턴 블러팅을 실시하였다. In order to determine whether SAL-2 of the present invention exhibits an inhibitory effect on protein nitrification caused by peroxynitrite (ONOO − ) in vivo, the following experiment was performed to measure the inhibition of IκB-α degradation. . In this experiment, HNE 15μM, which causes active species in animal cells, and SAL-2 of the present invention were administered and collected after 24 hours, and protein quantification was performed for Western blotting.
먼저, 동물세포를 브롬페놀 블루 염색액과 동량 섞은 후 12 % SDS-PAGE 에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS-tween 용액(10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다. 이후 IκB-α에 대한 토끼의 항체를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로 서 항 토끼 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.First, animal cells were mixed with bromine phenol blue dye in the same amount and electrophoresed on 12% SDS-PAGE. After electrophoresis, protein was transferred to polyvinylidene fluoride membrane and TBS-tween containing 0.5% skim milk. The nonspecific reaction was blocked by soaking in solution (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1
상기 실험의 수행 결과, 도 5b에서 나타나는 바와 같이 활성종을 일으키는 HNE에 비해 본 발명의 SAL-2를 처리한 동물세포에서 IκB-α 분해가 억제됨을 확인 할 수 있었다.As a result of the experiment, it was confirmed that IκB-α degradation was inhibited in the animal cells treated with SAL-2 of the present invention as compared to HNE causing active species as shown in FIG. 5B.
2-3. SAL-2의 COX-2/iNOS 유전자 발현 억제효과 2-3. Inhibitory Effect of SAL-2 on COX-2 / iNOS Gene Expression
본 발명의 SAL-2가 생체내에서 페록시니트라이트(ONOO-)에 의해 발생되는 단백질 질화에 대한 저해효과를 나타내는지 확인하기 위하여 COX-2 유전자 발현정도를 측정하는 하기와 같은 실험을 수행하였다. 본 실험에서는 동물세포에 활성종을 일으키는 HNE 10uM과 본 발명의 SAL-2를 투여하여 24시간 후 세포를 모아 사용하였으며 단백질 양의 확인은 웨스턴 블러팅을 실시하였다. In order to determine whether SAL-2 of the present invention exhibits an inhibitory effect on protein nitrification caused by peroxynitrite (ONOO − ) in vivo, the following experiment was performed to measure the expression level of COX-2 gene. . In this experiment, 24 hours after the administration of HNE 10uM and SAL-2 of the present invention, which causes active species to animal cells, the cells were collected and used for Western blotting.
먼저, 동물세포를 브롬페놀 블루 염색액과 동량 섞은 후 10 % SDS-PAGE 에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막에 단백질을 전이시키고, 0.5% 탈지유가 포함된 TBS-tween 용액(10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다. 이후 COX-2에 대한 토끼의 항체를 1/2000으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 토끼 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS-tween 용액으로 4 회 세척하고 ECL 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.First, animal cells were mixed with bromine phenol blue dye in the same amount and electrophoresed on 10% SDS-PAGE. After electrophoresis, the protein was transferred to the polyvinylidene fluoride membrane, and the nonspecific reaction was performed by immersing it in TBS-tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1
상기 실험의 수행 결과, 도 5c에서 나타나는 바와 같이, 활성종을 일으키는 HNE에 비해 본 발명의 SAL-2를 처리한 동물세포에서 COX-2 유전자 발현이 감소됨을 확인 할 수 있었다.As a result of the experiment, as shown in Figure 5c, it was confirmed that COX-2 gene expression is reduced in the animal cells treated with SAL-2 of the present invention compared to HNE causing the active species.
또한 상기 COX-2 유전자 발현에 대한 SAL-2 의 효과를 실험한 과정과 동일한 과정을 수행하여 iNOS유전자 발현에 대한 SAL-2의 효과를 실험한 결과, 도 5d와 같이 활성종을 일으키는 HNE에 비해 본 발명의 SAL-2를 처리한 동물세포에서 iNOS유전자 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다.In addition, the effect of SAL-2 on iNOS gene expression was tested by performing the same process as that of SAL-2 on COX-2 gene expression, compared to HNE causing active species as shown in FIG. 5D. In animal cells treated with SAL-2 of the present invention, iNOS gene expression was reduced.
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.Examples of the pharmaceutical compositions containing the compounds of the present invention will be described, but the present invention is not intended to be limited thereto, but is intended to be described in detail.
제제예 1. 주사제제의 제조Formulation Example 1 Preparation of Injection
SAL-2 화합물 100㎎SAL-2 Compound 100mg
소디움 메타비설파이트 3.0㎎Sodium Metabisulfite 3.0mg
메틸파라벤 0.8㎎Methylparaben 0.8mg
프로필파라벤 0.1mgPropylparaben 0.1mg
주사용 멸균증류수 적량Appropriate sterile distilled water for injection
상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2㎖로 한 후, 2㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.The above ingredients are mixed and made into 2 ml by a conventional method, and then filled into 2 ml ampoules and sterilized to prepare an injection.
제제예 2. 정제의 제조Formulation Example 2 Preparation of Tablet
SAL-2 화합물 200㎎SAL-2 Compound 200mg
유당 100㎎Lactose 100mg
전분 100㎎Starch 100mg
스테아린산 마그네슘 적량Magnesium stearate proper amount
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.The above components are mixed and tableted according to a conventional method for producing tablets to produce tablets.
제제예 3. 캡슐제의 제조Formulation Example 3 Preparation of Capsule
SAL-2 화합물 100㎎SAL-2 Compound 100mg
유당 50㎎Lactose 50mg
전분 50㎎Starch 50mg
탈크 2㎎Talc 2mg
스테아린산 마그네슘 적량Magnesium stearate proper amount
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.Capsules are prepared by mixing the above ingredients and filling into gelatin capsules according to a conventional method for preparing capsules.
제제예 4. 액제의 제조Formulation Example 4 Preparation of Liquid
SAL-2 화합물 1000㎎SAL-2 Compound 1000mg
설탕 20g20 g of sugar
이성화당 20g20 g of isomerized sugar
레몬향 적량Lemon flavor
정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.Purified water was added to make a total of 1000 ml. According to the conventional method for preparing a liquid, the above components are mixed, and then filled into a brown bottle and sterilized to prepare a liquid.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, use purpose.
제제예 5. 건강 식품의 제조Formulation Example 5 Preparation of Healthy Food
SAL-2 화합물 1000 ㎎SAL-2 Compound 1000mg
비타민 혼합물 적량Vitamin mixture proper amount
비타민 A 아세테이트 70 ㎍70 μg of Vitamin A Acetate
비타민 E 1.0 ㎎Vitamin E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 ㎎Vitamin B 1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 ㎎Vitamin B 2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 ㎎Vitamin B 6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍0.2 μg of vitamin B 12
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍10 μg biotin
니코틴산아미드 1.7 ㎎Nicotinic Acid 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎Calcium Pantothenate 0.5mg
무기질 혼합물 적량Mineral mixture
황산제1철 1.75 ㎎Ferrous Sulfate 1.75 mg
산화아연 0.82 ㎎Zinc Oxide 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 ㎎Magnesium carbonate 25.3 mg
제1인산칼륨 15 ㎎Potassium monophosphate 15 mg
제2인산칼슘 55 ㎎Dibasic calcium phosphate 55 mg
구연산칼륨 90 ㎎Potassium Citrate 90 mg
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎Magnesium chloride 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.Although the composition ratio of the above-mentioned vitamin and mineral mixtures is mixed with a component suitable for a health food in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified, and the above ingredients are mixed according to a conventional health food manufacturing method. The granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
제제예 6. 건강 음료의 제조Formulation Example 6 Preparation of Healthy Drink
SAL-2 화합물 1000 ㎎SAL-2 Compound 1000mg
구연산 1000 ㎎Citric acid 1000 mg
올리고당 100 g100 g oligosaccharides
매실농축액 2 gPlum concentrate 2 g
타우린 1 g1 g of taurine
정제수를 가하여 전체 900 ㎖Add 900 ml of purified water
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. After mixing the above components in accordance with a conventional healthy beverage production method, and stirred and heated at 85 ℃ for about 1 hour, the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilization and then refrigerated and stored in the present invention For the preparation of healthy beverage compositions.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment, the composition ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, use purpose.
상술한 바와 같이, 본 발명의 SAL-2 화합물은 페록시니트라이트를 억제하여 이에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 이용될 수 있고. 또한 활성산소종을 제거하고, 노화 또는 염증이 진행되는 동안 증가하는 것으로 알려진 NF-κB를 저해하여 IκB-α 분해 억제, 사이클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2, COX-2), iNOS(inducible nitric oxide) 등의 발현을 억제함으로서 노화 또는 염증에 대한 억제효과가 우수하여 효과적인 항산화, 항염증 또는 항노화용 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.As described above, the SAL-2 compound of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for inhibiting peroxynitrite and preventing and treating diseases caused by it. It also inhibits IκB-α degradation, cyclooxygenase-2 (COX-2), and iNOS (inducible) by removing reactive oxygen species and inhibiting NF-κB, which is known to increase during aging or inflammation. By inhibiting the expression of nitric oxide, etc., it has an excellent inhibitory effect on aging or inflammation and can be usefully used as an effective antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging pharmaceutical composition and health functional food.
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