KR20060013639A - 반추동물 식이에서 먹이 이용을 증가시키는 단백질가수분해 효소의 용도 - Google Patents
반추동물 식이에서 먹이 이용을 증가시키는 단백질가수분해 효소의 용도 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20060013639A KR20060013639A KR1020057016306A KR20057016306A KR20060013639A KR 20060013639 A KR20060013639 A KR 20060013639A KR 1020057016306 A KR1020057016306 A KR 1020057016306A KR 20057016306 A KR20057016306 A KR 20057016306A KR 20060013639 A KR20060013639 A KR 20060013639A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- protease
- forage
- dry matter
- feed
- silage
- Prior art date
Links
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 438
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 435
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 title claims abstract description 59
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 title claims description 90
- 230000037213 diet Effects 0.000 title description 61
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 title 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 405
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 208
- 239000004459 forage Substances 0.000 claims abstract description 180
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 150
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 claims abstract description 75
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 43
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 claims abstract description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 178
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 178
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 178
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 155
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 132
- 239000004460 silage Substances 0.000 claims description 99
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 claims description 71
- 241000219823 Medicago Species 0.000 claims description 67
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 62
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 62
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 62
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 62
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 48
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 36
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 32
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 claims description 32
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 32
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 32
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 claims description 29
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 28
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 26
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 24
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 24
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 23
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 23
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 claims description 22
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 22
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 22
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 22
- 239000005414 inactive ingredient Substances 0.000 claims description 21
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 16
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 16
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 15
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 15
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 15
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 15
- -1 glucanase Proteins 0.000 claims description 15
- 239000008188 pellet Substances 0.000 claims description 15
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 claims description 14
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 claims description 14
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 14
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 14
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 14
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 14
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 claims description 13
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 claims description 13
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 claims description 12
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 claims description 12
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 claims description 12
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 claims description 12
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 12
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 11
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 11
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 11
- 239000004463 hay Substances 0.000 claims description 11
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 claims description 11
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 11
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims description 11
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 11
- 229940098396 barley grain Drugs 0.000 claims description 10
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 10
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims description 10
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 19
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 18
- 239000002386 air freshener Substances 0.000 claims 10
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 claims 10
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 abstract description 46
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 31
- 230000029087 digestion Effects 0.000 abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 50
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 48
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 33
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 32
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 30
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 30
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 30
- 210000004767 rumen Anatomy 0.000 description 27
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 17
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 17
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 16
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 14
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 description 14
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 13
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 13
- 108010038658 exo-1,4-beta-D-xylosidase Proteins 0.000 description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101710112457 Exoglucanase Proteins 0.000 description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 11
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 10
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 10
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 108010084650 alpha-N-arabinofuranosidase Proteins 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 230000009471 action Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N nitrocyclohexatriene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=C=C[CH]1 ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229920001221 xylan Polymers 0.000 description 8
- 150000004823 xylans Chemical class 0.000 description 8
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 7
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 7
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 7
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 6
- 239000000120 Artificial Saliva Substances 0.000 description 5
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010013043 Acetylesterase Proteins 0.000 description 4
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 4
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 4
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 4
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 4
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 4
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 4
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 241000555712 Forsythia Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036617 Monoacylglycerol lipase ABHD2 Human genes 0.000 description 3
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 3
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 3
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 239000007986 glycine-NaOH buffer Substances 0.000 description 3
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 3
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 3
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 3
- OBMBUODDCOAJQP-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-4-phenylquinoline Chemical compound C=12C=CC=CC2=NC(Cl)=CC=1C1=CC=CC=C1 OBMBUODDCOAJQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3,4-dinitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C([N+]([O-])=O)=C1O WDMUXYQIMRDWRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000282979 Alces alces Species 0.000 description 2
- 229920000310 Alpha glucan Polymers 0.000 description 2
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 2
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 2
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 2
- 230000010665 Enzyme Interactions Effects 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283011 Rangifer Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 2
- 229920002000 Xyloglucan Polymers 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 238000003763 carbonization Methods 0.000 description 2
- 238000007705 chemical test Methods 0.000 description 2
- 238000003053 completely randomized design Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 229940124568 digestive agent Drugs 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 108010091371 endoglucanase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010091384 endoglucanase 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010092450 endoglucanase Z Proteins 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002615 fibrolytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- GTZCVFVGUGFEME-HNQUOIGGSA-N trans-aconitic acid Chemical compound OC(=O)C\C(C(O)=O)=C/C(O)=O GTZCVFVGUGFEME-HNQUOIGGSA-N 0.000 description 2
- GTZCVFVGUGFEME-UHFFFAOYSA-N trans-aconitic acid Natural products OC(=O)CC(C(O)=O)=CC(O)=O GTZCVFVGUGFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)O[C@H](O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-DEVYUCJPSA-N 0.000 description 1
- SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[(3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl)oxymethyl]-3,5-dihydroxy-4-methoxyoxan-2-yl]oxy-2-(hydroxymethyl)-6-methyloxane-3,5-diol Chemical compound OC1C(OC)C(O)COC1OCC1C(O)C(OC)C(O)C(OC2C(C(CO)OC(C)C2O)O)O1 SATHPVQTSSUFFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000189 Arabinogalactan Polymers 0.000 description 1
- 239000001904 Arabinogalactan Substances 0.000 description 1
- 235000007558 Avena sp Nutrition 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 description 1
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M Butyrate Chemical compound CCCC([O-])=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 241000590988 Danainae Species 0.000 description 1
- 239000003109 Disodium ethylene diamine tetraacetate Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 101000744882 Homo sapiens Zinc finger protein 185 Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 1
- 239000005717 Laminarin Substances 0.000 description 1
- 229920002097 Lichenin Polymers 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000219830 Onobrychis Species 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 229920002230 Pectic acid Polymers 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003667 Serine Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000083 Serine Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 1
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 240000004584 Tamarindus indica Species 0.000 description 1
- 235000004298 Tamarindus indica Nutrition 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 241000219793 Trifolium Species 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 1
- 102100040032 Zinc finger protein 185 Human genes 0.000 description 1
- UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N [5-[3,5-dihydroxy-2-(1,3,4-trihydroxy-5-oxopentan-2-yl)oxyoxan-4-yl]oxy-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical group OC1C(OC(CO)C(O)C(O)C=O)OCC(O)C1OC1C(O)C(O)C(COC(=O)\C=C\C=2C=CC(O)=CC=2)O1 UGXQOOQUZRUVSS-ZZXKWVIFSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000019312 arabinogalactan Nutrition 0.000 description 1
- 229920000617 arabinoxylan Polymers 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229920005549 butyl rubber Polymers 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 108010085318 carboxymethylcellulase Proteins 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N chembl564271 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]2C(C)SC[C@H](N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NC(=O)[C@@H](NC2=O)CSC1C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C(=C\C)/NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]2NC(=O)CNC(=O)[C@@H]3CCCN3C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]3N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NC(=O)C(=C)NC(=O)CC[C@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(O)=O)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)C1=CC=CC=C1 RKLXDNHNLPUQRB-TVJUEJKUSA-N 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000019301 disodium ethylene diamine tetraacetate Nutrition 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002307 isotope ratio mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- JBXYCUKPDAAYAS-UHFFFAOYSA-N methanol;trifluoroborane Chemical compound OC.FB(F)F JBXYCUKPDAAYAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N methyl 2-hydroxypropionate Chemical compound COC(=O)C(C)O LPEKGGXMPWTOCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 125000006501 nitrophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021238 nutrient digestion Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004798 organs belonging to the digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000010318 polygalacturonic acid Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003614 protease activity assay Methods 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 108010082567 subtilin Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229940070710 valerate Drugs 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
- A23K50/10—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for ruminants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Birds (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 포함하는 사료 부가제 또는 사료 조성물을 공급함에 의해 반추동물들에 섬유소화를 증진하는 방법을 제공한다. 특별하게는, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계; 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계; 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계; 및 동물에 이 조성물을 투여하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 마초 또는 낱알 사료의 소화성을 증진하는 방법을 제공한다. 더욱이 본 발명은 프로테아제를 포함하는 사료 부가제 및 사료 조성물, 이들의 제조 및 용도까지 신장한다.
반추동물, 프로테아제, 섬유 소화 증진
Description
본 발명은 프로테아제를 포함하는 사료 부가제 또는 사료 조성물을 공급함으로써 반추동물들의 섬유소화를 증진시키는 방법에 관한 것이다.
반추동물들 혐기성 미생물(박테리아, 곰팡이, 원생동물)의 활성을 통해 식물 섬유의 효과적 소화가 일어나는 특별한 소화 기관인 유위(rumen)를 가지는 동물이다. 반추동물들은 일차적으로 불용성의 다당류, 특히 셀룰로스 및 헤미셀룰로스로 구성된 식물 섬유를 갖는 풀 및 콩과 식물인 리굼(legumes)에서 유래한 식물 섬유에 의존하여 살아간다. 대부분의 척추동물들은 이러한 다당류를 소화하기 위해 필요한 효소가 결핍되어 있어, 반추동물들은 소화제로서 미생물에 의존한다. 먹이가 유위에 잔류하는 동안 셀룰로스 가수분해 미생물은 셀룰로스를 디사카라이드 셀로비오스와 유리 글루코스 단위로 가수분해한다. 그런 다음 방출된 글루코스는 박테리아가 발효를 통하여 휘발성 지방산(예를 들어, 아세틱, 프로피오닉 및 부티릭)과 가스(이산화탄소 및 메탄)가 생산된다. 휘발성 지방산은 유위벽을 통과하여 혈액의 흐름으로 들어가 그 주요 에너지원으로 반추동물에 의해 산화된다. 이산화탄소 및 메탄은 트림에 의해 대기중으로 제거된다. 부가하여, 미생물은 아미노산과 비타민 을 생합성한다.
비록 유위는 소화에 효과적인 메커니즘이지만, 이 과정이 느리고 때로는 불완전한데, 특히 보다 높은 섬유질 먹이일 때 불완전하다. 이러한 비효율성은 가축 사육 생산성의 증가된 비용과 먹이원의 증가된 사용 및 반추동물 생산의 증진된 환경적 충격을 가져온다. 물리적 처리(그라인딩, 스팀 처리, 펠렛화 등) 또는 화학적 처리(알카리, 암모니아, 우레아, 오존 등)를 사용한 반추동물들에 의한 섬유의 이용 정도를 증가하기 위한 접근법은 인간 및 환경에 대한 위험성과 비용에 기인하여 바람직하지 않을 수 있다.
유위에서 먹이 소화를 촉진하기 위한 생물학적 촉매 또는 효소와 같은 대안적인 처리가 바람직하다. 증진된 사료 소화는 동물의 생산성을 증진하고 그 생산 비용을 감소할 수 있다. 뿐만 아니라 동물에 의해 배출된 분뇨의 양을 줄이고 특정한 생산성을 얻기 위해 요구된 사료의 양을 감소시키기 때문에 가축 생산 환경에 대한 충격을 감소할 수 있다.
효소는 생물학적 반응을 촉진하거나 또는 촉매하는 단백질로 미생물(주로 곰팡이 또는 박테리아)에 의해 분비된다. 식물 세포벽 또는 섬유를 분해하는 효소는 이들이 분해하는 섬유 분획(셀룰로스 또는 헤미셀룰로스)에 따라 셀룰라제 또는 헤미셀룰라제를 총괄적으로 지칭하는 용어이다. 셀룰라제 또는 헤미셀룰라제는 섬유, 음식, 양조, 세제, 및 사료 산업에서 광범위하게 사용된다. 동물 영양에서는, 이들은 단위소화(가금 및 돼지) 산업에서 사용되지만, 그러나 이들의 반추동물들에서의 사용은 미개발 상태로 남아있다.
반추동물 식이에 효소를 사용한 초기 연구는 사용된 효소의 빈약한 특성에 기인하여 결론이 나지 않았다. 더욱이, 보호되지 않은 효소는 높은 단백질 분해 활성에 기인하여 유위에서 빠르게 불활성화되기 때문에 이 사용은 회의적으로 전망되었다. 게다가, 유위의 미생물은 그 자체적으로 부가되어진 것과 동일한 형태의 분비효소를 이용하여 공급물을 분해하기 때문에, 보충된 효소는 어떤 긍정적인 효과도 갖지 않을 것으로 생각되었다.
그러나 신규하고 보다 양호한 특성의 효소 혼합물을 사용한 연구는 효소가 소화성을 변경하기에 충분한 시간 동안 유위 환경에 저항할 수 있을 뿐 아니라 특정 효소 혼합물의 부가는 사료 소화성과 동물 수행성(예를 들어, 육우 및 젓소)을 증진한다는 것을 입증했다. Beauchemin 등의 미국 특허 제5,720, 971호는 어떤 바람직한 비율과 수준으로 세룰라제 및 크실라나제(Xylanases)의 혼합물을 포함하는 섬유-소화 효소 보충제 및 반추동물용 콩과 식물 마초(사료)와 낱알 사료의 소화성을 증진하기 위한 이들의 용도를 개시한다.
전통적인 반추동물 연구는 셀룰라제 및 헤미셀룰라제에, 그리고 때로는 펙티나제 및 아밀라제에 초점이 맞추어진다. 대조적으로, 반추동물 식이에서 프로테아제의 사용은 무시되어 왔다. 가능한 이유는 유위에서의 지나친 단백질 분해로, 이것이 동물로부터 보다 높은 질소 손실과 오염 증가를 유도하기 때문에 영양적으로 비효과적인 것으로 생각되었기 때문이다.
그러나 본 발명은 놀랍게도 반추동물 식이에서 프로테아제의 사용이 사료 소화성에 있어서 효과적이고 유익하다는 것을 입증하였다.
본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 포함하는 사료 부가제 또는 사료 조성물을 공급함으로써 반추동물들에 섬유소화를 증진하는 방법을 광범위하게 제공한다. 특히, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여함으로써 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 마초 또는 낱알 사료의 소화성을 증진하는 방법을 제공한다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하는 단계를 포함함으로써 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물을 사육하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하는 단계를 포함함으로써 소화성에서의 증가가 효과적인 소화성을 증진하기 위한 마초 또는 낱알 사료를 처리하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 사료 부가제를 형성하기 위해 프로테아제를 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 혼합하는 단계 및 반추동물에 사료 부가제를 공급하는 단계 또는 이 사료 부가제를 마초 또는 낱알 사료에 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 사료 부가제를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 마초 또는 낱알 사료를 제공하는 단계 및 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 반추동물에 공급하기 위한 사료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 조합된 적어도 하나의 사료-등급 프로테아제를 포함하는 사료 부가제를 제공하고, 여기서 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 적용되고 동물에 공급될 때 마초 또는 낱알 사료의 소화성을 증진하는 양으로 포함된다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제와 조합된 마초 또는 낱알 사료를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물에 공급하기 위한 사료 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물을 사육하기 위한 프로테아제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 사료 부가제를 형성하기 위해 프로테아제를 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 혼합하는 단계 및 반추동물에 사료 부가제를 공급하는 단계 또는 이 사료 부가제를 마초 또는 낱알 사료에 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 사료 부가제를 생산하기 위한 프로테아제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 마초 또는 낱알 사료를 제공하는 단계 및 조성물을 형성하기 위해 프로테아제를 마초 또는 낱알 사료에 적용하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 사료 조성물을 생산하기 위한 프로테아제의 용도를 제공한다.
여기서 그리고 청구의 범위에 사용된 것으로, 아래에 제시된 용어 및 구는 다음의 정의를 갖는다.
"유위"는 반추동물의 위의 가장 큰 구획을 의미한다.
"반추동물" 또는 "반추동물들"은 복잡하고 많은 방을 갖는 위를 가지는 소, 양, 염소, 낙타, 물소, 사슴, 순록, 카리부(북미산 순록; caribou) 및 엘크를 포함하는 것을 의미한다.
"사료물질"은 마초 또는 낱알 사료 또는 이들의 조합을 의미한다.
"낱알 사료"는 씨앗의 외피, 꼬투리 또는 외부 껍질을 포함하거나 또는 포함하지 않은 반추동물에 전형적으로 공급되는 식물의 씨앗을 의미한다. 낱알 사료의 예로는 여기에 제한되지는 않지만, 보리, 밀, 귀리, 사탕수수, 라이밀, 호밀, 지방종자를 포함한다.
"마초"는 동물이 뜯어먹을 수 있도록 사료로 제공할 수 있거나 반추동물들에 공급하기 위해 수확될 수 있는 별도의 낱알 외에 식물의 먹을 수 있는 부분을 의미한다.
콩과 식물인“리굼 마초"는 식물학상의 과(科)의 하나인 리구미노새(Leguminosae)인 쌍떡잎 식물 종인 동물 사료로 사용되는 식물의 부분을 의미한다. 예를 들어, 여기에 제한되지는 않지만, 자주개자리(alfalfa), 유럽산 통과 목초인 사인포인(sainfoin) 클로버 및 살갈퀴(vetches)를 포함한다. 이 용어는 리구미노새 과로부터 식물물질 50% 이상과 다른 종으로부터의 나머지 식물 물질을 포함하는 마초를 포함하는 것을 의미한다.
"혼합된 건초"는 리구미노새 혼합 건초를 의미한다.
"TMR"로 약칭된 "전체 혼합 사료"는 둘 또는 그 이상의 사료물질의 조합을 의미한다.
"건조"는 15% (w/w) 이하의 수분 함량을 가지는 사료물질을 의미한다.
"젖은"은 15% (w/w) 이상의 수분 함량을 가지는 사료물질을 의미한다.
"DM"으로 약칭된 "건조물"은 일정한 중량으로 오븐 건조 후 남아있는 식물 내의 기질을 의미한다.
"OM"으로 약칭되는 "유기물"은 원래의 사료 조성물과 최소한 3시간 동안 500℃이상에서 연소함에 의해 결정된 그의 회분 함량 사이의 차이를 의미한다.
"CP"로 약칭되는 "조(crude) 단백질"은 전체 질소(n) 함량 x 6.25의 결정에 기한 단백질의 계산치를 의미한다.
"NDF"로 약칭되는 "중성 세정(detergent) 섬유"는 중성 세정제에 불용성이고, 펙틴을 제외한 세포벽 구성분과 유사한 사료의 부분을 의미한다.
"ADF"로 약칭되는 "산 세정 섬유"는 산 세정제로 사료 물질의 추출에 따른 불용성 잔사, 또는 헤미셀룰로스를 뺀 세포벽 구성성분을 의미한다.
"ADL"로 약칭되는 "산 세정 리그닌"은 진한 황산으로 ADF의 추출에 따른 리그닌 또는 잔사를 의미한다.
"헤미셀룰로스"는 식물의 세포벽의 셀룰로스 및 리그닌과 결합된 다딩류를 의미하고 글루칸(전분 외), 만난, 자일란, 아라비난 또는 폴리글루쿠론 산 또는 폴리갈락튜론 산을 포함한다. 이것은 NDF와 ADF 사이의 차이로 결정된다.
"셀룰로스"는 β1,4 결합으로 연결된 글루코스 단위로 구성된 탄화수소이다.
"명백한 소화성"은 배설을 뺀 사료 소비로 계산된 동물 섭취 시험으로 결정된 소화성을 의미하고 사료 조성물의 백분율로 표시되지만, 대변에서 내인성 배설물을 고려하지 않는다.
"진정한 소화성"은 대변에서 내인성 배설물이 계산되어 동일한 소화 물질의 대변 손실과 섭취와의 사이의 밸런스에 의해 표현된 것으로 사료, 마초 또는 영양분의 실제 소화성 또는 이용성을 의미한다. 이 용어는 또한 생체 외 소화성을 반영한다.
"VFA"로 약칭되는 "휘발성 지방산"은 유위에서 미생물 발효의 최종 산물이고, 숙주 동물에 에너지를 공급한다. VFA는, 여기에 한정되는 것은 아니지만 초산, 프로피온산 및 부틸산을 포함한다. 분지쇄(branched-chain) 휘발성 지방산은 "BCVFA"로 약칭된다.
"효소 혼합물"은 적어도 하나의 프로테아제를 포함하는 효소의 조합을 의미한다.
"셀룰라제"는 헥소스 단위로 셀룰로스를 자르는 효소를 의미한다.
"프로테아제" 또는 "프로테아제류"는 펩티드 결합을 단리할 수 있는 효소를 의미한다. 이 용어는 제한적이지는 않지만, 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 및 세린 프로테아제를 포함한다.
"프로테아제 활성"은 프로테아제의 활성, 즉 기질로 0.4% 아조카제인을 사용하여 39℃, pH 6.0에서 분석할 때 프로테아제 활성 또는 펩티드 결합을 단리하는 능력을 의미한다.
"주요 구성분으로서 프로테아제"는 주요 구성분으로 프로테아제로, 비록 다른 활성이 존재하더라도 아무런 다른 효소 활성을 요구하지 않는 것을 의미한다.
"세린 프로테아제"는 펩티드 결합의 가수분해의 촉매작용을 책임지고, 활성 사이트에 활성인 세린 잔기를 갖는 효소를 의미한다. 이 용어는 매우 다른 촉매적 스카폴드(scaffolds)이지만 동일한 공간적 배열의 촉매적 His, Asp, 및 Ser을 가지는 트립신형 또는 서브틸리신형(Subtilisin-like)을 언급하는 것을 의미한다.
"서브틸리신형 세린 프로테아제"는 그 촉매적 활성이 세린 프로테아제의 트립신 과의 것에 유사한 전하 릴레이 시스템(charge relay system)에 의해 공급되지만 독립적인 진화에 의해 진화되는 세린 프로테아제를 의미한다. 촉매적 3가 원소(아스파르트산, 세린 및 히스티딘)에 포함된 잔기 주위의 시퀀스는 트립신 세린 프로테아제에서의 유사 잔기의 것과는 완전히 다르고 프로테아제의 그 범주에 특이적인 신호로 사용될 수 있다.
"트립신형 세린 프로테아제"는 대략 230 잔기를 갖는 트립신, 키모트립신, 엘라스타제, 칼리크렌(kallikren) 및 트롬빈과 같은 포유동물 효소 및 대략 190 잔기를 갖는 박테리아 효소의 양자를 포함하는 것을 의미한다.
"농도"는 프로테아제로 처리된 사료 물질을 포함하는 사료 조성물의 건조물 kg 당 프로테아제의 활성 수준을 의미한다.
"안정한"은 프로테아제가 활성적으로 되고 사료 물질이 처리 후 적어도 약 일 년 동안 곰팡이 나거나, 썩거나 또는 그렇지 않으면 질이 저하되지 않는 것을 의미한다.
"사료 조성물"은 사료 물질에 효소를 부가함에 의해 형성된 복합체를 의미한다.
"사료-등급"은 동물에 먹여질 때 비독성인 것을 의미한다.
도 1은 효소 혼합물에 의해 영향을 받는 것으로서 사료 부가 후 (0900 h) 연속적 배양 발효조의 pH의 매일의 등락을 기술하기 위해 공급 후 시간의 작용으로서 발효조의 pH를 플롯트한 그래프이다. 값은 최소 사각 평균(Least Square Means)이고 수직 막대는 SEM을 나타낸다.
본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 포함하는 사료 부가제 또는 사료 조성물을 공급함에 의해 반추동물들에 섬유소화를 증진하는 방법을 광범위하게 제공한다. 특별하게는, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하고 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 마초 또는 낱알 사료의 소 화성을 증진하는 방법을 제공한다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물을 사육하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 소화성을 증진하기 위한 마초 또는 낱알 사료를 처리하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 사료 부가제를 형성하기 위해 프로테아제를 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 혼합하는 단계 및 반추동물에 사료 부가제를 공급하는 단계 또는 이 사료 부가제를 동물용 마초 또는 낱알 사료에 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 사료 부가제를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와 마초 또는 낱알 사료를 제공하는 단계 및 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계를 포함하고 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물에 공급하기 위한 사료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 조합된 적어도 하나의 프로테아제를 포함하는 사료 부가제를 제공한다. 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제와 조합된 마초 또는 낱알 사료를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물에 공급하기 위한 사료 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계와, 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계 및 동물에 이 조성물을 투여하는 단계를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 반추동물을 사육하기 위한 프로테아제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 사료 부가제를 형성하기 위해 프로테아제를 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 혼합하는 단계 및 반추동물에 사료 부가제를 공급하는 단계 또는 이 사료 부가제를 동물용 마초 또는 낱알 사료에 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 사료 부가제를 생산하기 위한 프로테아제의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계와, 마초 또는 낱알 사료를 제공하는 단계 및 조성물을 형성하기 위해 프로테아제를 마초 또는 낱알 사료에 적용하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 효과적인 단계를 포함하는 사료 조성물을 생산하기 위한 프로테아제의 용도를 제공한다.
반추동물은, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 소, 양, 염소, 낙타, 물소, 사슴, 순록, 카리부 및 엘크를 포함한다.
마초 또는 낱알 사료는, 여기에 한정되는 것은 아니지만, 자주개자리 건초 및 사일리지(사일리지), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합을 포함한다. 바람직한 마초는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 자주개자리를 포함한 식이 및 자주개자리-글라스 혼합 마초를 포함하는 자주개자리와 자주개자리 혼합물을 포함한다. 마초 또는 낱알 사료는 건조되거나(수분 함량 15% 이상) 또는 젖을 수 있다(수분 함량 15% 이하).
사료 부가제 또는 사료 조성물은 주요 성분으로 프로테아제를 포함하여, 비록 다른 활성이 존재하더라도 다른 효소 활성이 요구되지 않는다. 프로테아제는 제한적이지는 않지만, 트립신형 또는 서브틸리신형일 수 있는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 및 세린 프로테아제를 포함한다. 프로테아제는 몇몇 다른 방법에 의해 제조될 수 있다는 것은 이 기술 분야의 전문가에게 쉽게 이해된다. 예를 들어, 프로테아제는 표준 기술에 의해 특정 양으로 바람직한 프로테아제를 생산하기 위해 숙주 기관에 컨스트럭팅함에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, 프로테아제는 미생물로부터 또는 이런 프로테아제를 포함하거나 생산할 수 있는 미생물의 발효로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제는 바실러스 (Bacillus) 속으로부터의 종과 같은 박테리아로부터 또는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속으로부터의 종과 같은 곰팡이로부터 유래될 수 있다. 택일적으로, 여기에 한정되 는 것은 아니지만, 다음: Protex 6L (Genencor International, Rochester, NY)을 포함하는 상업적으로 이용할 수 있는 프로테아제가 사용될 수 있다. 적절한 세린 프로테아제는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 다음: 서브틸리신형 특성(E. C. 3.4. 21.62)을 갖는 알카린 세린 엔도펩티다제를 포함한다. 적절한 서브틸리신은 여기에 한정되는 것은 아니지만, 다음: 세인트 루이스 MO. 시그마 화학사(Sigma Chemicals)로부터 얻은 서브틸리신 칼스버그(Subtilisin Carlsberg) (Type Ⅷ, Cat. No. P5380)를 포함한다.
프로테아제는 사료 소화성과 동물 실행성(생산성)을 최대화 하기 위해 특정 농도와 활성을 제공하기 위한 충분한 양으로 제공된다. 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 바람직하게는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20.0 mL/kg 범위의 양으로, 보다 바람직하게는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로, 가장 바람직하게는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 적용된다.
마초 또는 낱알 사료에 부가된 프로테아제의 양은 얻어진 마초 또는 낱알 사료가 1,000 내지 23,000 프로테아제 단위/건조물 kg의 범위, 보다 바람직하게는, 2,300 내지 11,000 프로테아제 단위/건조물 kg의 범위, 가장 바람직하기로는 3,300 내지 6,800 프로테아제 단위/건조물 kg의 범위로 되는 충분한 프로테아제 활성을 포함하도록 된다. 프로테아제 활성은 기질로 0.4% 아조카제인을 사용하여 39℃, pH 6.0에서 분석할 때 프로테아제 활성 또는 펩티드 결합을 단리하는 능력을 언급한다.
비록 서브틸리신형 프로테아제는 알카린(예를 들어, 최적 활성 pH7 이상))이고, 적절한 프로테아제는 바람직하기로는 유위의 특징적 pH 영역에 상응하는 5-7 사이의 pH 영역에서 활성을 나타낸다.
본 발명은 특정의 반추동물 사료 부가제 및 사료 조성물까지 확장된다. 프로테아제의 다양한 제형이 섬유소화를 증진하기 위해 반추동물들에 투여하기 위해 바람직하다. 프로테아제는 다음과 같이 고형, 액체, 현탁제, 사료 부가제, 혼합물, 또는 사료 조성물로 제제화 될 수 있다.
i) 고형 - 프로테아제는 미네랄 블럭, 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말과 같이 고형으로 제형화 될 수 있다. 분말의 형태에 있어서, 프로테아제는 피드 번크(feed bunks)에 흩뿌려지거나 일정비율로 혼합될 수 있다.
ii) 액체 및 현탁제 - 프로테아제는 적절한 액체에 동결건조된 또는 분말화된 프로테아제를 부가함에 의해 액체에 합체될 수 있어, 액체 또는 현탁액으로 제제화 될 수 있다. 프로테아제는 동물의 식수와 혼합될 수 있거나 또는 소비용 다른 액체 형태로 제공될 수 있다.
iii) 사료 부가제 - 프로테아제는 프로테아제가 부가된 동결건조된 미생물의 제제를 포함하는 사료 부가제의 형태로 부가될 수 있다. 사료 부가제는 동물의 규정식으로 포함될 수 있다. 사료 부가제는 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 조합하여 mL 또는 g 당 100 내지 500,000 단위의 프로테아제를 포함하는 적어도 하나 이상의 사료-등급 프로테아제를 포함할 수 있다.
iv) 혼합제 - 사료물질에 활성 성분의 합체는 일반적으로 활성 성분의 프리믹스를 제조하고, 이 프리믹스를 비타민 및 광물과 혼합하고, 그런 다음 사료에 프리믹스 또는 사료 부가제를 부가함에 의해 달성된다. 프로테아제는 이 분야에서 알려진 다 른 활성 성분, 예를 들어 여기에 한정되는 것은 아니지만, 셀룰라제, 자일란나제, 글루카나제, 아밀라제, 에스테라제를 포함하는 다른 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics) 및 프로바이오틱(probiotics)과 혼합될 수 있다. 프로테아제 단독 또는 다른 활성 성분과의 조합하여 포함하는 활성성분은 영양소와 혼합되어 미리 혼합된 보충물을 제공한다. 영양소는 비타민, 광물과 같은 미세영양소와 거대영양소 양자를 포함한다. 프리믹스는 그런 다음 사료물질에 부가될 수 있다.
v) 사료 조성물 - 프로테아제는 프로테아제로 처리된 마초 또는 낱알 사료를 포함하는 사료 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 프로테아제는 건조된 형태로, 예를 들어 분말로 또는 예를 들어 침적 또는 스프레이와 같이 사용되는 액체로 마초 또는 낱알 사료와 혼합될 수 있다.
이들 제제는 다른 단백질이나 화학적인 제제의 부가를 통해 안정화될 수 있다.
약학적으로 허용될 수 있는 담체, 희석제, 및 부형제가 또한 이 제형에 합체되어 질 수 있다. 동물이 충분한 양을 소비하는 것을 확실히 하기 위해, 동물에 입맛에 맞는 형태로 프로테아제를 제공하기 위해 풍미제가 부가될 수 있다.
프로테아제는 몇 가지의 방법으로 투여되어 질 수 있다; 그러나, 동물의 사료로 경구투여가 바람직하다. 프로테아제의 복용량은 이 기술 분야에서 전문가에게 잘 알려진 많은 요인, 예를 들어 동물의 타잎, 연령 및 중량에 의존한다. 프로테아제는 동물에 일일 기준으로 투여될 수 있다.
동물사료의 소화성에서의 증진을 달성하기 위하여, 프로테아제는 어떤 절차와 변수에 조화하여 마초 또는 낱알 사료에 적용되어야 한다. 마초 또는 낱알 사료의 총량 을 참고하여, 충분한 분말화 또는 액체 프로테아제가 물에 희석되어 1,000 내지 23,000 프로테아제 단위/kg 건조물의 범위로, 보다 바람직하게는 2,300 내지 11,000 프로테아제 단위/kg 건조물의 범위로, 그리고 가장 바람직하게는 3,300 내지 6,800 프로테아제 단위/kg 건조물의 범위로 바람직한 활성 수준을 제공한다.
액체 형태로 이들과 같은 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 적용되어 마초 또는 낱알 사료로 수성 용액의 고른 분산을 제공한다. 전형적으로, 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료 상에 분산될 것이고, 마초 또는 낱알 사료는 동시적으로 혼합되어 프로테아제의 고른 분산을 도와준다.
마초 또는 낱알 사료의 처리는 프로테아제 처리의 전 후에 일어날 수 있는 다양한 전형적인 사료가공 단계와 조합될 수 있다. 이러한 가공 단계는 여기에 한정되는 것은 아니지만, 사료를 드라이 롤링(dry rolling), 스팀-롤링, 스팀-박편화(steam-flaking), 입방화(cubing), 완화(tempering), 튀기기(popping), 굽기(roasting), 쿠킹(cooking) 또는 파쇄(exploding)를 포함한다. 가공 단계가 높은 온도를 포함할 때, 프로테아제는 바람직하게는 가동 후 적용된다.
본 발명자 등은 실시예에 기술된 바와 같이 반추동물들에 마초 또는 낱알 사료의 소화성을 증진하기 위한 프로테아제의 놀라운 효율성을 결정하였다. 실시예 1에 도시된 바와 같이 22가지 상업적으로 이용할 수 있는 효소 혼합물이 처음으로 스크린되어, 이들의 단백질 농도, 효소적 활성 및 자연적 기질에 대한 가수분해능(예를 들어, 반출된 당을 감소)을 평가했다.
실시예 2는 반추동물 식이에서 공통적으로 사용된 마초의 생체외 유위의 분해를 포 함하는 세 가지 실험을 설정하였다. 주요하기로는, 효소 혼합물이 유위액의 존재하에 검사되었다. 실험 1에서 후보 효소 혼합물은 동정되고, 자주개자리 및 옥수수 사일리지에 대한 이들의 분해 효소에 대해 실험 2에서 더욱 전개되었다. 그런 다음 이들 인자들 사이의 관계를 확립하기 위해 상관관계가 수행되었다. 두 가지 효소 혼합물이 이에 의해 선택되고, 생체 외에서 마초 분해의 비율과 정도에 대한 이들의 효과가 실험 3에서 더 결정되었다.
실시예 3에 나타난 바와 같이, 전체 혼합된 사료(오븐 또는 동결-건조된 것 대신에 신선한 것이 사용됨)의 선택된 프로테아제 효소 혼합물이 연속 배양을 사용하여 시험되었다. 유위의 대사 반응은 이중 흐름 연속 배양 발효조를 사용함에 의해 생체외에서 유사하게 될 수 있다. 이 시스템은 유위-누관화 소(ruminally-fistulated cattle)로부터 얻어진 유위액으로 접종하고; 연속적으로 대조 또는 시험 사료물질을 공급하고; 그리고 연속적으로 인공 타액이 주입되는 일련의 발효조로 구성된다. 이 발효조는 유사한 식이를 소모하는 반추동물들에서 발견된 것에 매치되는 비율로 소화제의 연속적 흐름, 온도, pH 및 혐기적인 조건을 유지한다. 더욱이, pH는 높은 농도의 식이가 소에 공급될 때 전형적으로 발생하는 타액분비 과다에서의 감소를 자극하는 두 가지 다른 pH 영역 (5.4 - 6.0, 및 6.0 - 6.7)을 형성하도록 조절된다(Van Soest, 1994). 프로테아제 효소 혼합물이 식이의 분해성을 개선하는지 안하는지, 그리고 개선의 정도가 높은 pH에서 보다 낮은 pH에서 더 낮은지 아닌지를 조사했다. 박테리아 수, 효소적 활성 및 화학적 시험을 포함하는 분석이 수행되었다. 박테리아 수, 효소적 활성 및 화학적 시험을 포함한 분석이 수행되었다. 다른 pH 조건하에 프로테아제 효소 혼합물의 부가는 단지 단백질 분해의 수치상 증가로 섬유 분해를 고양한다. 전반적으로, 이들 발견은 더욱이 반추동물들에서의 프로테아제 효소 혼합물의 작용 모드가 유위에서 사료 및 미생물 개체군 양자에 발휘된 직접적 및 간접적 영향의 조합인 것을 제시한다.
실시예 4에서, 선택된 프로테아제 효소 혼합물의 분석은 더욱이 프로테아제의 타입이 서브틸린형인 것으로 나타나지만, 섬유소화에 대한 유익한 영향은 단지 이 타입의 프로테아제에 한정되지는 않을 것이다.
특징적으로, 본 발명자 등은 반추동물 식이에 일반적으로 사용된 사료에 특정 프로테아제 효소 혼합물을 부가하는 것은 유위에서 60% (기대된 범위: 10 내지 45%) 까지 섬유(NDF) 소화를 증진한다는 것을 발견하였다. 더욱이 섬유소화에서의 이 증가는 유위의 단백질 분해 또는 메탄 생산의 크고 바람직하지 못한 증가를 수반하지 않는다. 부가된 프로테아제에 기인한 섬유소화에서의 증가는 자주개자리 및 자주개자리 마초를 함유하는 식이에 대해 최대이지만, 이 개선은 자주개자리-기재 식이에 한정되지는 않는다.
이 증대의 섬유소화에서의 증진은 동물에 이용할 수 있는 에너지의 양을 증진하는 결과를 가져올 것이 기대되고, 이에 의해 성장률 또는 우유 생산성을 증진한다. 이들 프로테아제가 섬유소화를 증진하는 메커니즘은 섬유 소화 미생물 및 그들의 효소에 구조적인 장애로서 작용하는 단백질성 존재의 제거에 관련되는 것으로 나타난다. 자주개자리에서, 유효한 효소는 소화 가능한 분획의 미생물적인 콜로니화를 지연하는 구조적 장애를 제거함에 의해 작용함으로 분해 비율을 증진하는 것으로 여 겨진다. 옥수수 사일리지에서, 유효한 효소는 마초를 보다 빠르게 분해하기 위해서 유위 효소와 상호작용하는 것으로 나타난다. 섬유소화에서의 증진의 정도가 관찰되는 것을 고려할 때, 반추동물 식이에 프로테아제의 부가는 이들 식이가 제공된 동물의 성장률 또는 우유 생산성이 증진할 것으로 기대된다.
실시예 5는 젖소의 식이에 `프로테아제 효소를 부가하는 것은 식이의 소화성을 증가한다는 것을 보여준다. DM, OM, N, ADF 및 NDF의 소화성은 프로테아제 효소에 기인하여 지속적으로 증진된다. 소화성의 증진은 높은 마초 식이에 비하여 보다 낮은 마초 식이(예를 들어, 높은 생산성의 낙농 소에 상업적으로 공급되는 전형적인 식이)에 대해 일반적으로 크지만 소화성의 증진은 양 식이에 대해 상당하다.
실시예 6은 실시예 5에서 보고된 사료공급 연구에서 사용된 개개 마초의 소화성에서의 증진을 나타낸다. 식이의 개개의 마초 성분이 별도로 처리될 때, 프로테아제 효소는 자주개자리 건초의 소화를 증진하지만, 보리 사일리지의 소화성은 개선하지 않는다. 그러나 이들 동일한 마초가 실시예 6에서 소에 공급된 식이에 포함될 때, 전체 식이의 소화성은 증진된다.
자주개자리 건초는 단지 식이의 16%를 구성하기 때문에 소화성의 증진은 자주개자리 건초 성분의 소화성에서의 증진에 의해서만 설명될 수 있는 것보다 크다. 실시예 5에서 도시된 유위액의 증진된 효소 활성은 프로테아제 효소를 공급하는 것이 외인성 효소 작용과 유위의 미생물 사이의 상승효과를 나타내는 유위의 전반적인 섬유 소화능을 증진하는 것을 나타낸다. 따라서 식이에 프로테아제를 부가함에 의해, 섬유를 소화하기 위한 유위의 능력은 증진된다. 실시예 5에서 관찰된 소화에서 의 증진은, 마초가 별도로 접종될 때 실시예 6에서의 경우에서 같이 단지 식이의 자주개자리 건초 성분에 한정되지 않는다.
여기에 명백하게 기술된 것 외에 대안적인 방법, 시약, 과정 및 기술이 본 발명을 실행하기 위해 채용될 수 있고 쉽게 적용될 수 있다는 것은 이 분야의 통상인에게 명백할 것이다. 본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해 더 자세히 기술된다. 여기서 사용된 모든 약어는 이 분야에서 사용된 표준 약어이다. 실시예에 상세하게 기술되지 않은 특정의 과정은 이 분야에 잘 알려진 것이다.
-
실시예1
:
효소 혼합물의 초기 스크리닝
22 가지 상업적으로 이용할 수 있는 효소 혼합물이 사용된다. 실험 코드(RT 1180 내지 RT1201)가 각 효소 혼합물 (뉴욕 Rochester의 Genecor Int.사로부터 RT1180 내지 RT1194; 네덜란드 Naarden의 Quest Int.사로부터의 RT 1195 내지 RT 1198; 네덜란드 Delft의 DSM사로부터의 RT1199 내지 RT1201)에 할당된다. 부가하여, 공지된 효능의 세가지 상업적 효소 혼합물이 양성 대조군으로 작용한다; 실험 코드 P, PD, 및 PB (Cargill Inc., St Louis, MO).
a. 단백질 농도
단백질의 양은 송아지 혈청 알부민을 표준으로 바이오-래드 디씨 프로테인 디터미네이션 키트(Bio-Rad DC 단백질 determination kit; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 결정된다. 각 희석된 효소 혼합물의 5㎕가 마이크로타이터 플레이트에 부가되고, 이어서 25 ㎕의 바이오-래드 시약 A와 200 ㎕의 시약 B가 부가된다. 반응은 15분 동안 실온에서 진행되고, 흡광도는 MRX-HD 플레이트 리더 (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)를 사용하여 630 nm에서 판독된다.
b. 효소 활성
i. 다당류 활성
다당류 활성은 증류수에서 기질 용액 또는 현탁액(1% w/v)을 사용하여 세개조에서 결정된다. 자일란 (자작나무 또는 귀리 스펠트밀(사료의 일종) 유래), 카르복시메틸셀룰로스 (CMC, 중간 점도), 시그마셀(Sigmacell) 50, 지의류(lichenan), 라미나린(laminarin) 및 가용성 전분(전부 MO, St Louis의 Sigma Chemicals사로부터 수득)이 각각 자일라나제(EC 3.2.1.8), 엔도글루카나제(EC 3.2.1.4), 엑소글루카나제(EC 3.2.1.91), 알파-1,3-알파-1,4-글루카나제(EC 3.2.1.73), 알파-1,3-글루카나제(EC 3.2.1.6), 및 알파-아밀라제(EC 3.2.1.1)의 결정을 위해 사용된다. 부가하여. 보리 알파-글루칸, 자일로글루칸(타마린드 종자 유래) 및 밀 아라비노실란이 Megazyme International Ltd(Wicklow, Ireland)사로부터 얻어진다.
적절한 희석된 효소 (50㎕) 및 기질 용액(450㎕)은 활성에 의존하여 5 내지 60분 동안 인큐베이트되고, Wood 및 Bhat (1988)에 따라 분석된다. 간략하게는, 반응이 두 배 부피의 소모기이-넬슨 시약(Somogyi-Nelson's reagent; Somogyi사, 1952)의 부가에 의해 종료되고, 10분 동안 끓여진다. 당 감소는 색도계로 630 nm에서 결정된다. 일 유닛의 활성은, 이들 분석의 조건하에서, 1μmol 당량 자일로스 또는 글루코스 min-1 g-1 효소 산물을 방출하기 위해 요구되는 효소의 양으로 정의된다.
ii. 글리코시다제 활성.
평가된 글리코시다제 활성은 Wood 및 Bhat (1988)에 기술된 바와 같이 파라-니트로페닐 유도체(Sigma Chemicals, St Louis, MO) 1mM 용액을 사용한 베타-D-글루ㅋ코시다제(EC 3.2.1.21), 베타-D-자일로시다제(EC 3.2.1.37), 알파-L-아라비노시다제(EC 3.2.1.55), 베타-D-갈락토시다제(EC 3.2.1.23) 및 아세틸 에스테라제(EC 3.1.1.6)이다. 백(100) ㎕의 각 기질이, 아세틸 에스테라제 활성에 대해서는 제외하고 각 희석된 효소 혼합물(12.5㎕)과 완충액(37.5㎕)으로 39℃에서 30분 동안 배양된다(n=6). 배양에 의해, 반응은 150㎕의 0.4 M 글리신-NaOH 완충액 (pH 10.8)의 부가에 의해 종료되고 흡광도는 420nm에서 측정된다. 아세틸 에스테라제 결정을 위해, 연속적인 판독이 배양의 0, 5, 10 및 15분에 취해지고, 활성은 340nm에서 흡광도의 증가에 기해 계산된다. 일 유닛의 활성은 1 μmol 니트로페닐 min-1 g-1 효소 혼합물을 방출하기 위해 요구되는 효소의 양으로 정의된다.
iii. 프로테아제 활성
프로테아제 활성은 방사상 확산 분석방법(Brown, etal., 2001)을 사용하여 결정된다. 10mL의 1% (w/v) 몰타르 아가(molter agar; Fermtech Agar, EM Science, Gibbstown, NJ)가 시트레이트-포스페이트 버퍼(0.1 M, pH 6.0)에 준비되고, 기질로서 0.5 % (w/v) 젤라틴(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)을 포함하여 페트리 디쉬(직경 90mm)에 부어진다. 0.01% 소디움 아지드(w/v)가 포함되어 미생물 성장을 방지한다. 아가의 고형화에 의해, 6 mm 웰(well)이 코르크 송곳을 사용하여 각 플 레이트에 형성된다. 그리고 5㎕의 비희석된 효소 혼합물 플러스 20㎕의 증류수가 부가된다. 이 플레이트는 39℃에서 16시간 동안 배양된다. 배양의 종료 시점에, 비 가수 분해된 젤라틴은 포화 암모니움 설페이트 용액의 부가에 의해 침전된다. 웰 주위의 클리어한 방사상의 영역(효소에 의해 분해된 영역을 지칭)이 전자 디지털 캘리퍼(Traceable, Model No 62379-531, Control Company, Friendswood, TX)를 사용하여 두 명의 독립된 관찰자에 의해 측정된다. 프로테아제 활성은 그런 다음 웰의 직경에 의해 보정된 후, 분해된 젤라틴의 mm의 형태로 표현된다.
c. 천연의 기질로부터 환원당의 방출
가수분해 잠재능은 효소 혼합물(50㎕)을 가지고 pH 6.0(450㎕의 0.1 M 시트레이트-포스페이트 버퍼)와 39℃에서 15분 동안 배양 후 25mg의 자주개자리 건초 또는 옥수수 사일리지(동결 건조되고 1mm 스크린을 통과하도록 마쇄된 것)로부터 방출된 환원당을 측정함에 의해 3배로 결정된다. 분말화 효소 혼합물은 증류수로 250 배 희석되고, 액체 효소 혼합물은 25배 희석된다. 동결 건조에 앞서, 기질은 증류수로 두 시간 동안 실온에서 수세되어 가용성 성분을 추출한다. 기질을 포함하는 블랭크(Blank) 만이 보정에 포함된다. 방출된 환원당은 ㎍ 글루코스 당량/mg 부가된 효소 산물로 표현된다.
표 1은 단백질 함량, 효소활성 및 모든 효소 혼합물에 대해 자주개자리 건초 및 옥수수 사일리지의 배양으로부터 방출된 환원당을 나타낸다. 단백질의 함량은 주로 이들의 제형에 공통적으로 사용된 다양한 미생물원, 생산 과정 및 보전제 또는 담체에 기인하여 모든 효소 혼합물 사이에서 다양하다. 효소적 활성에 대해서는, RT 1197은 시험된 것 중 가장 농축된 것으로, 17 개의 결정된 활성 중 14개의 활성에서 제일의 다섯 제제 내에 랭크된다. RT 1191, RT 1192, RT 1196 및 RT 1200 또한 일반적으로 높은 활성을 보인다. RT 1191, RT 1192 및 RT 1197은 셀룰로스에 대해 가장 활성적이다. RT 1190, RT 1191, 및 RT1192는 양 기질로부터 환원당을 방출하는 데 가장 성공적이다.
효소 활성과 자주개자리 건초 및 옥수수 사일리지로부터 환원당의 방출 간의 관계가 결정된다(표 2). 환원당의 방출에 대한 단백질 함량과 효소적 활성의 단계적 퇴보는 단백질 함량 홀로 각각 자주개자리 건초 및 옥수수 사일리지에 대한 전체 변화의 60% 및 59%(P<0.001)를 설명한다는 것을 보여준다. 알파-글루칸에 대한 활성은 자주개자리 건초에서 추가적인 24%(P<0.001)의 변화를 설명하지만, 환원당의 방출과의 그 관계는 부정적이다. 대비적으로, 옥수수 사일리지로부터 환원당의 방출은 귀리 스펠트 크실란 (P<0.03), CMC (P<0.07) 및 결정 셀룰로스 (P<0.05)에 대한 활성에 대해 긍정적으로 상호 관계되지만, 자작나무 (P<0.01), 스타치 (P<0.001) 및 pNP-글루코피라노사이드(P< 0.003)에 대한 활성에 대해서는 부정적으로 상호 관계된다. 이와 함께, 모든 이들 변화는 옥수수 사일리지로부터 환원당의 방출에서의 전체 변화의 96%를 설명한다. 양 기질로부터 환원당을 방출과 단백질 함량 사이의 강한 긍정적 상관관계는 농축된 효소가 보다 더 희석된 샘플보다 양호하게 또는 적어도 빠르게 작용하여, 할당된 단시간에 보다 단순한 분자로 다당류를 자르는 충분한 효소활성을 제공한다는 것을 추측할 수 있다.
-
실시예
2 : 프로테아제 활성을 가진 효소 혼합물에 대한
생체외
유위
분해 분석
몇 가지의 실험이 수행되어 유위액의 존재 하에 우수한 프로테아제 활성을 갖는 효소 혼합물 및 자주개자리 건초 및 옥수수 사일리지에 대한 이들의 효과를 동정하였다. 사료물질의 동일한 통(batch)이 모든 실험에 사용되었다. 1gDM의 자주개자리 건초 또는 옥수수 사일리지 (± 20mg, 건조되고, 2mm 스크린을 통과하도록 마쇄된 것)가 계량되어 125 mL의 발효조(Wheaton Scientific, Millville, NJ)에 삽입된다. 자주개자리 건초는 382.0 및 252.4 g/kg DM의 NDF 및 ADF를 각각 포함하고, 옥수수 사일리지는 467.4 및 254.1 g/kg DM의 NDF 및 ADF를 각각 포함한다.
통계적 분석에 대해서, 실험 1은 고정 효과로서 효소 처리와 기질을 포함한 모델로, 완전하게 랜덤화된 디자인이다. 유의성 있는 효소-기질 상호작용이 발견되어, 분석은 각 마초 소스(개나리 건초 및 옥수수 사일리지)에 대해 별도로 수행되었다. 표준 편차가 유발된 PDIFF 코맨드(command)로 'Mixed Procedures of SAS' (SAS Inst. Inc., Cary, NC, 1996)을 사용하여 분석되었다. 단백질 함량, 전체 활성 및 방출된 환원당은 'SAS의 단계적 퇴화 과정(Stepwise Regression Procedures of SAS)'을 사용하여 각 마초 소스에 대한 건조물 소화(DMD) 값에 상호 관계된다. 실험 2 및 3으로부터의 데이타는 고정 효과로서 효소와 랜덤 효과로서 실험적 수행을 포함한 모델을 사용하여, 처리의 공장 배열로 완전하게 랜덤화된 디자인으로 분석된다. 달리 기술되지 않는다면, 유의성은 P < 0.05에서 결정되고, 반면 경향은 P < 0.10에서 토의된다.
① 실험 1 - 개나리 건초 또는 옥수수 사일리지의 분해에 대한 효소 혼합물의 부가의 효과
22종류의 효소 혼합물이 유위액으로 접종하기 20시간 전에 1.5 mg/g DM 마초의 비율로 적용된다. 세 가지 상업적 효소 혼합물이 양성 대조로서 사용된다: P, PD, 및 PB. 125 mg의 각 효소 혼합물이 50 mL의 증류수에 용해되고, 0.6 mL가 각 발효조에 부가된다. 처리는 세배로 계량된다.
3 시간 후, 40 mL의 혐기성 버퍼 배지(Goering 및 Van Soest, 1970)가 1 M 트랜스-아코니트산(trans-aconitic acid; Sigma Chemicals, St Louis, MO)를 사용하여 pH 6.0으로 조정되어, 부가되고, 발효조는 25℃에서 밤 세워 보관된다.
유위액은 옥수수 사일리지 기재 전체 혼합 사료가 공급된 유위로 누관된 젖소에서 3 락테이트화로부터 수집되었다. 공급은 수집되는 액에 대해 4시간 전에 공급자로부터 공급이 철회된다. 유위 함량은 연속적인 이산화탄소의 흐름 하에 4 층의 치즈클로스(cheesecloth)를 통해 스트레인(strain)되고, 미리 따뜻해진 더모스 플라스크(Thermos flasks)로 실험실에 이송된다. 10 mL의 유위액이 이미 39℃로 예비로 데워진 각 발효조에 접종된다. 기질만 또는 유위액만을 포함하는 대조는 또한 세배로 포함된다. 발효조는 39℃에서 18 시간 동안 배양되고, 비분해된 잔사는 바로 미리-계량된 소결된 글라스 도가니(glass crucibles; 다공성 1,100-160 ㎛ 구멍 사이즈)를 통해 여과된다. 잔사는 110℃에서 24 시간 동안 건조되어 g/kg로 표현된 명백한 건조물 분해(DMD)를 결정한다. 효소 혼합물의 서열화는 대조에 비하여 DMD에서의 그들의 상대적인 증가에 기하여 결정된다.
표 3은 자주개자리 건초 또는 옥수수 사일리지에 대한 효소 혼합물의 효과를 나타낸다. 개나리 건초에 대해서는, 다섯 효소 혼합물이, 유위액으로 배양 18시간 후 비처리된 대조에 비해 DMD를 증가시켰다(P<0.05). 옥수수 사일리지에 대해서는, 11 효소 혼합물이 DMD를 증가시켰다(P<0.05). 흥미롭게도, 자주개자리 건초에 대한 가장 효과적인 효소 혼합물은 옥수수 사일리지에 대해서는 효과적이지 않은 것으로 강한 효소-공급 특이성을 암시한다.
유위액으로 접종 18시간 후 자주개자리 건초 및 옥수수 사일리지의 명백한 DMD과 효소 활성과의 사이의 관계가 시험 되었다(표 4). 단백질 농도, 전체 효소 활성 및 생체외에서 유위 분해 값으로 환원당 방출의 단계적 퇴화가 실행될 때, 자일라나제(귀리 스펠트)와 자주개자리 DMD 사이의 긍정적인 상관관계(P = 0.01)가 관찰되었다. 프로테아제 활성 또한 자주개자리 DMD에 긍정적으로 관련된다(P< 0.10). 그러나 모델에 의해 표현된 변화의 비율은 40% 이하이다. 귀리 스펠트 자일란에 대한 활성 또한 옥수수 사일리지에 대해 유의성이 있지만(P = 0.04), 상관관계의 특성은 부정적이다(표 4). 그러나 이 부정적인 관계가 옥수수 사일리지에서의 낮은 자일라나제 활성과 높은 DMD 사이의 원인 및 효과 관계를 나타내는지는 명확하지 않다.
② 실험 2 - 선택된 프로테아제 효소 혼합물로 처리되거나 또는 비처리된 자주 개자리 건초 또는 옥수수 사일리지의 건조물 분해 운동학
실험 1의 결과에 기하여, RT1184 및 RTl197은 자주개자리를 사용한 추가적인 평가를 위해 사용되었고, 반면 RT1181 및 RT1183는 옥수수 사일리지를 연구하기 위해 선택되었다. 데이지(Daisy) II 생체외 발효 시스템(ANKOM Corp., Fairport, NY)이 이들 효소 혼합물로 처리된 마초의 DM 및 섬유 분해의 비율 및 정도를 시험하기 위해 사용되었다. 500mg (±20 mg)의 자주개자리 건초 또는 옥수수 사일리지가 계량 되어 가열 밀봉된 인공 섬유 백(#F57, ANKOM Corp.)에 삽입되었다. 보정을 위한 6개의 빈 백을 포함하는 30 백의 그룹이 플라스틱 컨테이너에, 150 mL의 버퍼(pH 6.0)와 함께 바르게 세워 위치된다. 이 전-처리에 사용된 버퍼는 환원 용액의 부가 없이 'Goering 및 Van Soest (1970)'에 따른 것이다. 효소는 1 mL의 증류수에 용해되어 유위액의 부가 20 시간 전에 적당한 비율(1.5 mL/g 마초 DM) 로 컨테이너에 부가된다. 혼합물은 적절한 혼합을 가능하게 하기 위해 온화하게 흔들어지고, 실온(24℃)에서 보관된다. 유위액은 실험 1에서 기술된 바와 같이 세 마리 소로부터 채취된다.
400 mL의 유위액이 그런 다음 1,600 mL의 혐기성 버퍼(pH 6.0으로 조정)와 함께 각 ANKOM 발효 자(jar)에 부가된다. 백, 그리고 플라스틱 컨테이너 내의 모든 액체 성분은 발효 자에 부가되고, 발효는 39℃에서 96시간 동안 지속된다. 백은 배양의 0, 6, 18, 30, 48, 및 96 시간에 네 배로(시간 포인트당 하나의 빈 백을 더함)제거되고, 과잉의 물이 깨끗이 흐를 때까지 냉각 탭 워터(cold tap water) 하에서 수세된다. 백은 55℃에서 48시간 동안 건조되고 DMD가 결정된다. 섬유(NDF 및 ADF) 분해가 Van Soest 등(1991)에 따라 ANKOM200 섬유 분석 시스템(fiber analysis system) (ANKOM Corp., Fairport, NY)를 사용하여 동일한 백에서 연속적으로 결정된다. NDF 분석을 위해, α-아밀라제가 포함되지만, 소디움 설피트(sodium sulfite)는 배제된다. 각 분석 후, 백은 DMD 결정에서 기술된 바와 같이 건조된다. 실험은 두 번 반복하였다.
표 5는 효소 혼합물로 처리되거나 비처리된 자주개자리 건초 또는 옥수수 사일리지의 건조물 분해 운동학을 나타낸다. RT1184은 0시간에서 분해를 증가(+8.8%)하는 방향으로의 경향(P<0.10)으로 6시간 후 자주개자리 건초의 분해(+9.0%)를 증가했다(P<0.05). 자주개자리로 처리에 대한 배양의 6시간 후에 다른 차이는 검지되지 않았다. 옥수수 사일리지에서, RT1181은 배양의 6시간 후에 DMD를 증가했고(P < 0.05), 30시간에 DMD를 증가(P < 0.10)하는 경향이 있다. 부가하여, RT1181 및 RT1183은 48시간에 DMD를 증가했다(P < 0.05). 후자는 효소가 분해의 정도가 아니라 비율을 증가한다는 놀라운 일반적인 동의를 제공한다(Colombatto, 2000; Beauchemin et al., 2001). 그러나, 상당한 분해가 이 시간 후 여전히 발생(10 내지 14 백분율 단위 사이)하기 때문에, 48시간에 DMD는 옥수수 사일리지에 대한 종말점이 아니다. 자주개자리 건초에서 관찰된 것에 대비하여, 활성적 분해가 30 내지 48 시간 배양 기간 동안 여전히 진행되기 쉽다
표 6은 자주개자리 건초에 대한 섬유(NDF, ADF, 및 헤미셀룰로스) 분해 운동학을 나타낸다. RT1184는 거의 100% 까지, 배양의 6시간에 자주개자리 건초의 헤미셀룰로스 분해를 증진하고(P < 0.05), 반면 상당한 증가(비록 유의적이지 않기는 하지만)가 동일한 효소 처리에 대한 배양의 6 내지 18시간 후에 NDF에서 관찰되었다. 이에 대하여, RT1197은 대조에 대해여 차이를 나타내지 못하였다. 대부분의 이용 가능한 섬유는 48시간까지 분해되어 지고, 효소는 단지 분해율을 증가한다는 것이 명확하다. 6시간 후에 증진된 헤미셀룰로스 분해와 연계된 매우 적은 섬유 분획이 0시간에 분해된다는 사실은 RT1184가 분해에 물리적인 장애가 되는 몇 가지의 성분 을 제거한다는 것을 강력하게 추정하게 한다. RT1184가 주로 프로테아제 활성을 포함한다는 사실은 단백질이 제거되어지는 성분이라는 것을 추정할 수 있다.
표 7은 옥수수 사일리지에 대한 섬유(NDF, ADF, 및 헤미셀룰로스) 분해 운동학을 나타낸다. RT1181은 48시간 배양까지 모든 시간에 NDF 및 ADF 분해를 증진하여, 이 값이 18 및 48시간에 유의성(P < 0.05)을 달성한다. 헤미셀룰로스 분해는 6시간 배양에 동일한 효소에 의해 증진되고(P < 0.05) 18시간(+17%) 및 48시간(11%)에 대조군에 비해 높게(P < 0.10) 되는 경향이 있다. 자주개자리 건초에 대비하여, 대조와 어떤 효소 처리 사이의 "예비-섭취" 효과의 어떠한 징후도 없다(즉, 0시간 차이). 이 발견은, 옥수수 사일리지로는, 효소 혼합물이 단지 유위의 수준에서 작동한다는 것을 제시한다. 자주개자리는, 가능하기로는 세포벽에 대한 적은 구조적 변화에 기인하여, 전-처리 기간에 의해 이익을 얻고(Nsereko et al., 2000), 반면 옥수수 사일리지에서의 상황은 불명료하다. 따라서 공급 전에 효소-공급 상호작용 시간의 최적 길이는 마초의 타입에 의존할 수 있다고 나타난다.
표 8은 섬유 분획에 기여할 수 있는 DMD에서의 증진의 비율을 결정하기 위해 비-섬유 분획의 분해 프로필을 나타낸다. RT1184가 자주개자리에 부가될 때, 섬유 분해는 처음의 18시간 배양 동안 약 ⅓의 DMD에 대해 설명한다. RT1181가 옥수수 사일리지에 부가될 때, 섬유 분해는 섬유 분해에서의 증가에 의해 거의 전체적으로 설명된(86.4%) 48시간에서 발견된 DMD에서의 유의성 있는 증가로, 분해에서 전체 증가의 적어도 50%에 기여했다. 이들 발견은 더욱이, RT1181 및 RT1184가 다른 작용 모드를 가진다는 것을 확인한다. 트리콘더마 롱기브라키아튬( Trichonderma longibrachiatum )으로부터 유래된 RT1181은 일단 생체외의 유위 시스템에서 섬유에 그 작용이 집중되는 것으로 여겨진다. 바실러스 종(Bacillus sp .)으로부터 유래된 RT1184는 0시간 배양에서 명확한 효과를 갖는 비-섬유성 분획(가능하기로는 단백질) 상에 주로 작용하여, 미생물의 콜로니화와 자주개자리의 분해를 지연하는 구조적 장애의 제거를 제시한다.
③
실험 3 - 혼합된
마초
상에 또는 조합에서 선택된 프로테아제 효소 혼합물의 효과.
실험 2는 RT1181 및 RT1184가 옥수수 사일리지 및 자주개자리 건초를 각각 유효하게 분해하기 때문에, 본 발명자 등은 이들 효소 혼합물이 혼합된 마초(1: 1, w/w의 자주개자리 건초 및 옥수수 사일리지)에 유효한지 또는 효소 혼합물이 혼합("8184")될 때 유효한지를 시험했다. 그 방법은 실험 2에서 기술된 것과 동일했다. 처리된 그룹은 다음과 같다.
1. 대조 (무효소)
2. RT1181 단독
3. RT1184 단독
4. 두 최종 준위에서, 0.5 (8184 Low) 또는 1.5 (8184 High) mL/g 마초 DM으로 R1181와 RT1184(1:1, v/v)의 조합.
표 9에 나타난 바와 같이, RT1184는 6 및 18시간 배양에서 자주개자리-옥수수 사일리지 조합의 DMD를 증가시켰다(P < 0.05). 이것은 또한, "예비-섭취" 효과의 존재를 나타내는 0시간에 DMD를 증가시켰다(P < 0.05). 더욱이, 대조에 대한 개선의 정 도는 0과 18시간 사이에 사실상 일정하게 되어, 가장 즉시 소화할 수 있는 분획(예를 들어, 처음 12시간 배양 내에 분해된 것)의 소비에도 0시간에서의 개선은 성취되지 않는다는 것을 제시한다. 이것은 6 또는 18시에서의 분해성이 대조의 분해성에 동등하게 되는 경우가 되었던 것이었을 것이다. 이용 가능한 증거는 생체 외에서 배양될 때 섬유 분획이 유위 미생물에 의해 공격받는 시간과 일치하는 18 내지 30시간 사이에서 분해 비율이 늦추어지기 시작한다는 것을 추정한다.
RT1184 처리에서 섬유 분해의 분석은 DMD에서의 증가가 6시간에서 NDF 분해의 증가(P < 0.05) 와 18시간에서 NDF 분해의 증가 및 6시간 및 18시간에서 헤미셀룰로스의 분해를 증가(표 10)시키는 방향으로의 경향(P < 0.10)에 의하여 수반된다는 것을 나타낸다.
RT1181와 RT1184의 조합은 대조와 RT1184 사이의 중간값을 보이고(표 9), 처리 8184 하이(High)는 6시간 배양에서 DMD을 증가하는 경향을 나타내며(P < 0.10) NDF 및 헤미셀룰로스 분해의 증가(P < 0.05)가 수반된다. RT1181는 DMD 또는 섬유 분해를 유의적으로 증가시키지 못했기 때문에, 자주개자리-옥수수 조합에서 발견된 모든 증가는 RT1184 단독의 작용에 기인된다는 것을 고려하는 것이 합리적이다. 더욱이, RT1184 적용 비율은 섬유 분해에서의 효율성을 상실하지 않고 반감될 수 있는 것으로 여겨진다.
특히 흥미로운 것은 RT1184 및 RT1181과 RT1184의 두 조합은 DMD 및 NDF 종말점(end-point) (96 시간) 분해를 모두 증가시킨다(P < 0.05)는 사실이다. 이것은 효소가 마초에 부가될 때 일반적으로 관찰되는 것과 대비된다(Yang 등, 1999; Colombatto, 2000). 비록 DMD에서의 증가가 생물학적으로 유의성 있는 것과는 다르지만, NDF 분해로 달성된 개선의 정도(RT1184, 8184 로우(Low), 및 8184 하이에 대해 각각 +2.0, +3.5 및 +3.5%)는 고무적이고, 특히 RT1184 및 8184 하이를 포함하는 처리가 거의 모든 배양시간에서 보다 높은 NDF 분해를 보일 때 더욱 그렇다.
비-섬유 분획의 분해 프로필이 고려될 때, 처음의 18시간 배양 동안에 RT1184로 관찰된 증가는, 섬유분획은 DMD에서의 25 내지 50%의 증가사이에서 설명되기 때문에,오로지 섬유 분획에서의 증가에서만 기인될 수는 없다는 것이 발견되었다. 이들 발견은 실험 2와 동시에 발생되어, RT1184가 주로 비-섬유 분획에 작용하고 혼합된 마초 뿐 아니라 순수한 자주개자리 건초 단독에도 유효하다는 것을 나타낸다.
-
실시예
3 : 전체 혼합된
사료의 효소 활성, 미생물 수 및 섬유 분해에 있어서 선택된 프로테아제 효소 혼합물의 효과
전체 혼합된 사료에 선택된 프로테아제 효소 혼합물의 효과가 시험되었다. 더욱이, 두 발효 pH 영역(5.4 - 6.0, 및 6.0 - 6.7)이 인공 타액의 농도를 조정함에 의해 유지되었다. 효소 혼합물이 식이의 분해성을 개선하는지, 개선의 정도가 높은 pH 보다 낮은 pH에서 보다 낮은지가 조사되었다.
a. 사료 물질의 제조
전체 혼합된 사료 (TMR)는 30% 자주개자리, 30% 옥수수 사일리지 및 늦은 락테이트화를 위해 중간에 착유소에 급식되는 전형적인 상업적 식이인 40% 롤된(rolled) 옥수수 낱알(DM 기재)로 구성된다. 마초: 농도 비율은 따라서 60:40이다. 자주개자리 건초는 4.5-mm 스크린(Arthur H. Thomas Co. , Philadelphia, PA)을 통과하도록 마 쇄되고, 롤된 옥수수는 Knifetec 1095 샘플 밀(샘플 mill) (Foss Tecator, Hoganas, Sweden)로 두 시간 동안 갈아져 낱알이 부분적으로 파열된다. 양 기질은 실온에서 사용할 때까지 보관된다. 옥수수 사일리지는 레더브릿지 리서치 센터(Lethbridge Research Centre) (Lethbridge, A)에 위치한 번커 사일로(bunker silo)에서 다른 위치에서 샘플되어 사용 시까지 -40℃에서 저장된다. 필요로 할 때 사일리지의 샘플(3일간 급식에 충분한 양)이 해동되어 Knifetec 1095 샘플 밀 (Foss Tecator, Hoganas, Sweden)을 사용하여 10초 동안 신선하게 마쇄된다. 마쇄된 샘플은 4℃에서 최대 3일 동안 저장된다. TMR은 개개의 급식분을 계량함에 의해 1L 플라스틱 컨테이너에 매 3일 마다 준비된다. 내용물은 완전하게 혼합되어 4℃에서 저장된다. 표 11은 개개의 사료 물질과 TMR의 화학적 성분을 요약했다.
b. 효소 혼합물 및 프로테아제 활성의 결정
상업적으로 이용 가능한 효소 혼합물 RT1184가 이 연구에 사용되었다. 이 효소 혼합물은 바실러스 바실러스 리센니포르미스(Bacillus licheniformis )에서 유래되고, 무사할 만한 양의 셀룰라제, 헤미셀룰라제 및 알파-아밀라제 활성을 포함한다(Colombatto et al., 2003).
프로테아제 활성은 기질로 0.4%(wt/vol) 아조카제인(Bhat 및 Wood, 1989)을 사용하여 39℃에서 pH 6.0에서 결정된다. 간략하게는, 0.5 mL 아조카제인, 0.5 mL 시트레이트-포스페이트 버퍼, 및 25㎕의 효소(증류수에서 1:100으로 희석)를 포함하는 반응 혼합물이 39℃에서 15분 동안 배양된다. 비가수분해된 아조카제인은 80㎕의 25% (wt/vol) 트리클로로초산을 부가함에 의해 침전되고 그런 다음 실온에서 10분 동안 2,040 x g에서 원심분리함에 의해 제거된다. 0.5mL 상등액 샘플은 0.5mL의 0.5M NaOH와 혼합되고 시약 블랭크에 대해 420nm에서 흡광도를 읽는다. 효소(무기질) 및 기질(무 효소) 블랭크는 또한 보정을 위해 포함된다. 일 유닛의 프로테아제 활성은 동일한 조건에서 분석된 10㎍의 표준 프로테아제(Streptomyces griseus, Type XIV, Sigma Chemicals, St Louis, MO)의 작용에 의해 420nm에서 측정된 흡광도로 한정된다. 효소 혼합물의 프로테아제 활성은 다음과 같이 계산된 4507 units/mL(SD = 161.0, n = 5)인 것으로 결정되었다:
10㎍의 표준은 0.278의 흡광도를 냄
25㎕의 효소 혼합물 1:100 희석 용액은 0.313의 흡광도를 냄
따라서, 1 프로테아제가 0.278이면, 용액 포함(0.313/0.278) 단위 = 1.126 단위.
이것을 mL 당 단위로 변환하기 위해, 희석 인자(100) 및 부가된 양(㎕)이 사용된다:
1.126 x 40 x 100 = 4,507 단위/mL 비희석된 효소 혼합물.
c. 생체외 유위 분해 평가
세 마리의 락테이트화된 착유우가 이 실험에 사용된다. 소는 'Canadian Council on Animal Care (1993)'에 의해 확립된 가이드라인에 따라 돌보아지고, 유위-누관이 되어진다. 소에는 발효조에 공급된 것과 같은 유사한 식이가 공급된다.
네-단위 이중 유동 연속적 배양 시스템(four-unit dual flow continuous culture system) (Hoover, 등. 1989에 의해 기술된 것에 유사)이 4 연속적인 기간에 사용된다. 유위액 접종원이 2 시간 후-공급 동물로부터 채취되었다. 유위의 내용물은 산 소-유리 이산화탄소류 하에서 1분 동안 와링 브렌더(Waring blender) (Waring Product Division, New Hartford, CT)로 균질화되었다. 균질물은 그런 다음 4 층의 치즈클로스(cheesecloth)를 통해 스트레인되고, 미리-데워진 더모스 플라스크(Thermos flasks) 내 실험실로 이송된다. 15 mL/min의 비율로 이산화탄소의 유입에 의해 혐기적 조건이 유지된다. 인공 타액이 발효조(McDougall, 1948)로 연속적으로 유입된다. 각 기간 동안, 두 발효조는 정상적인 농도로 타액을 수용하며, 다른 두 발효조는 정상의 60%로 되는 농도로 증류수에 희석한 타액을 수용하다. 인공 타액은 0.2 g/L의 우레아를 포함하여 재순환된 질소 및 0.015g의 암모니아 15N ((l5NH4)2SO4, 10.6% 원자 백분율 15N ; Isotec, Miamisburg, OH)를 자극한다. 각 발효조에 공급된 15N의 매일의 양은 약 1.5mg이다. 액체 및 고체의 희석 비율은 각각 10 및 4.5%/h로 일정하게 유지된다. 일(day) 당 전체의 80g의 DM이 0900 및 2100h에 두 동등한 식사가 공급된다. 네 처리 군은 다음과 같다.
| pH 영역 | 인공 타액 | ||
| HC | 대조 TMR 을 가진 높은 pH | 6.0 - 6.6 | 정상 |
| HT | 효소 혼합물로 처리된 TMR 을 가진 높은 pH | 6.0 - 6.6 | 정상 |
| LC | 대조 TMR 을 가진 낮은 pH | 5.4 - 6.0 | 희석(정상의 60%) |
| LT | 효소 혼합물로 처리된 TMR 을 가진 낮은 pH | 5.4 - 6.0 | 희석(정상의 60%) |
효소 혼합물의 적용을 위해, 60㎕의 효소 혼합물이 440㎕의 증류수에 용해되고, 전도에 의해 혼합된 250-mL 플라스틱 컨테이너 내 40g TMR (DM 기준)에 부가된다. 대조 처리는 500㎕의 증류수를 수용한다. 효소 혼합물과 사료물질의 상호 작용 기간은 4℃에서 12 내지 24h 사이로 된다.
실험적 디자인은 네 개의 9-일 기간을 가진 4x4 라틴 스퀘어(Latin square)이고, 각각은 적응을 위한 6일 및 샘플링을 위한 3일을 구성한다. 샘플링 날에, 수집 베셀(vessels)은 미생물의 작용을 막기 위해 4℃에서 유지된다. 고체 및 액체 유출수들이 혼합된다. 250 mL 샘플이 16,000 x g에서 40분 동안 4℃에서 원심 분리하여 유출수 DM(예를 들어, 비소화된 단백질)결정한다. 제 이의 500mL 샘플은 16,000 x g에서 40분 동안 4℃에서 원심분리하여 55℃에서 건조하여 앙금을 얻어, 회분, 질소, NDF, ADF, 산 세정제 리그닌 (ADL) 및 전분를 분석한다.
각 샘플링 기간의 1 및 2일에 발효조 pH는 발효조에 삽입된 pH 탐침자를 사용하여 0800에서 2100h까지 매시간 측정되었다. 여액으로부터의 액체 샘플은 암모니아 및 휘발성 지방산(VFA)을 결정하기 위해 아침에 여물을 공급하기 전에 바로 그리고 나서, 여물을 공급한 후 2h, 5h, 8h, 및 12h에 수득되었다. 5mL의 여액의 서브-샘플은 암모니아를 결정하기 위해 1mL의 1% 황산(v/v)으로 산성화되었다. 다른 5-mL의 서브-샘플은 VFA를 분석하기 위해 1mL의 25% 메타포스포르 산(w/v)으로 산성화되었다. 샘플은 분석 시까지 -40℃에서 동결 보관되었다. 아침에 여물을 공급한 후 6시간 (즉, 1500 h)에, 가스 샘플이 가스 조성(CO2 및 CH4)의 분석을 위해 취해졌다. 동시적으로, 전체와 셀룰로스 분해 박테리아를 정량하기 위해 발효조로부터 유위 액의 2.0mL 샘플이 제거된다. 부가적인 1.5mL 샘플이 효소 활성의 결정을 위해 얻어졌다.
박테리아는 각 기간의 마지막 날에 발효조로부터 분리되었다. 발효조 내용물은 고 체상 박테리아를 제거하기 위해 '와링 브렌더 (Waring Products Division, New Hatford, CT)'를 사용하여 1분 동안 느린 속도로 균질화되고, 그런 다음, 4 층의 치즈클로스를 통해 스트레인되었다. 여액은 1,196 x g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리되어 사료 입자 및 프로토조아를 제거하고, 그리고나서 16,000 x g에서 40분 동안 4℃에서 원심 분리되어 박테리아 펠렛을 분리한다. 펠렛은 동결 건조되고, 몰타르 및 유봉(pestle)을 사용하여 갈아지고, 그리고나서 15N 풍부성 정도가 분석된다. DM, OM, 및 N의 명백하고 진정한(즉, 미생물 부분에 의해 보정된) 소화가 계산된다. NDF, ADF, ADL 및 전분의 소화 또한 결정된다.
i. 통계적 분석
고정된 영향으로 pH, 효소 및 이들의 상호작용을 포함하는 모델을 사용하여 데이타는 'Mixed Procedures of SAS' (SAS Inst. Inc., Cary, NC)을 사용하여 분석되었다. 발효조 및 기간은 랜덤 효과로 여겨진다. 표준편차는 P < 0.05에서 유의성 있는 것으로 선언되고 반면 경향은 달리 기술이 없으면 P < 0.15에서 토의된다.
ii. 박테리아 수
전체의 생존가능한 박테리아를 정량하기 위해, 여과된 발효조 내용물의 혐기성 일련의 희석물(10-6 내지 10-9)이 0.1% 펩톤, 0.1% 레아쥬린(resazurin), 0.05% 시스테인, 및 0.35% Na2C03 (Bryant 및 Burkey, 1953)를 포함하는 배지를 사용하여 제조된다. 각 희석은 셀로비오스(cellobiose), 자일란, 전분, 및 글루코스(각각 0.5mg/mL)를 포함하는 별도의 롤 튜브(roll tubes)에 세배로 접종된다. 생육할 수 있는 콜로니는 39℃에서 접종 48시간 후 그 수가 세어진다. 셀룰로스 분해 박테리아는 유일한 탄수화물 소스로 왓트만 1번(Whatman No. 1) 여과지를 사용하여 각 희석(10-l 내지 10-4)으로 세배 튜브에서 39℃에서 접종 14일 후 그 수가 세어진다. 가장 신용할 수 있는 계수 절차가 사용된다(Garthright, 1998). 통계적 분석에 앞서, 미생물 데이타는 에러의 분산을 정상화하기 위해 로그 변형(log transformation)된다(Dehority et al. 9 1989).
iii. 효소활성의 분석
액체 상 내의 효소 활성은 Colombatto, 등, 2003 에 따라 결정되었다. 엔도글루카나제 (EC 3.2.1.4), 엑소글루카나제 (EC 3.2.1.91), β-D-글루코시다제 (EC 3.2.1.21), 자일라나제 (EC 3.2.1.8), β-D-자일로시다제 (EC 3.2.1.37), 프로테아제, 및 α-L-아라비노퓨라노시다제 (EC 3.2.1.55) 활성이 결정되었다.
자일라나제
및
엔도글루카나제
귀리 스펠트 자일란 및 10mg/mL의 농도로 중간 점도 카르복시메틸셀룰로스 (Sigma Chemicals, St Louis, MO)가 자일라나제 및 엔도글루카나제에 대한 기질로 각각 사용되었다. 40㎕의 효소가 1mL 기질, 0.90mL 버퍼(0.1 M 시트레이트-포스페이트 버퍼, pH 6.0), 및 0.06mL 증류수로 배양된다. 배양은 39℃에서 60분 (자일라나제) 또는 120분 (엔도글루카나제) 동안 세배로 수행된다. 효소 반응은 디니트로살리실산 시약을 부가함에 의해 종료되고, 흡광도는 MRX-HD 플레이트 리더(Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)를 사용하여 530nm에서 판독된다. 흡광도 값은 동일한 조건 하에서 전개된 표준 자일로스 또는 글루코스 곡선을 사용하여 환원당으로 전환된다. 브랭크, 기질 단독(즉, 비 효소) 및 효소 단독(즉, 비 기질)이 또한 포함되어 각각 효소 샘플에 존재하는 기질 자가분해 및 당을 보정한다. 일 단위의 활성은 이들 분석 조건하에서 1 nmol의 자일로스 또는 글루코스 당량 min-1을 방출하기 위해 요구된 효소의 양으로 정의된다.
프로테아제 활성
프로테아제 활성은 배양 시간이 120 분이고, 40㎕의 샘플이 배양되는 것을 제외하고는 상술한 바와 같이 0.4% (w/v) 용액의 아조카제인을 사용하여 pH 6.8에서 분석된다. 일 단위의 프로테아제 활성은 동일한 조건하에서 그리고 각 배양 시리즈에 동시에 분석된 1㎍의 표준 프로테아제(Streptomyces griseus, Type XIV, Sigma Chemicals, St Louis, MO)의 작용에 의해 420nm에서 측정된 흡광도로서 정의된다. 1㎍이 다른 분석 길이에 기인한 표준으로 사용된다. 만일 10㎍이 사용되었다면, 흡광도는 너무 커 광학적 밀도의 직선 영역 내로 되지 못한다.
아릴-
글리코시다제
(Aryl-
glycosidase
) 활성
파라-니트로페닐(ρ-NP) 유도체의 저장 용액(lmM)이 사용되었다. 기질은 파라-NP-β-D-셀로비오사이드, 파라-NP-β-D-글루코피라노사이드, 파라-NP-β-D-자일로피라노사이드, 및 파라-NP-α-L-아라비노퓨라노사이드(Sigma Chemicals, St Louis, MO)이다. 비희석된 효소 샘플(20㎕)이 180분 동안 39℃에서 80㎕의 상응하는 기질(버퍼 pH 6.0에 준비됨)로 배양된다. 이 반응은 1 부피의 글리신-NaOH 버퍼 (0.4 M, pH 10.8)의 부가에 의해 종료된다. 파라-니트로페닐의 방출은 420nm에서 색도계로 결정된다. 일 단위의 효소 활성은 이들 분석 조건하에서 1 nmol의 파라-니트로페닐 min-1을 방출하기 위해 요구된 효소의 양으로 정의된다.
iv. 화학적 분석
다음의 화학적 분석이 수행되었다.
| 분석된 변수 | 결정 방법 |
| 유출수 건조물(예를 들어, 비소화된 단백질) | 48시간 동안 강제 통풍 오븐에서 55℃에서 건조 |
| 식이 및 박테리아 샘플의 건조(DM)물 내용물 | 24시간 동안 110℃에서 건조 |
| 유기물(OM) | 500℃에서 하룻밤 탄화 후 차이 |
| 샘플의 조 단백질 (CP) (N x 6.25) | AOAC (1990)에 따라 신선 연소, 크로마토그라피에 의한 분리, 및 샘플 열 전도성(Carlo Erba Instruments, Milan, Italy) |
| 중성(NDF) 및 산(ADF) 분해 섬유 | Van Soest, 등(1991)에 따른 ANKOM200 섬유 아날라이저(ANKOM Corp., Fairport, NY). 열-안전성 아밀라제가 NDF 과정 동안 사용되지만, 소디움 설파이트는 제외됨. |
| 전분 | Rode, 등(1999)에 따라 α-링커된 글루코스 중합체의 효소 가수분해. |
| 암모니아 함량 | Berthelot 반응(Verdouw, 1978)의 변형. |
| 휘발성 지방산(VFA) | 30m(0.32 mm i.d.) 융합 실리카 컬럼(Nukol column, Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON)을 사용하여 가스크로마토그라피(Hewlett Packard 5890, Agilent Technologies, Mississauga, ON)에 의해 분리되고 정량됨 |
| 두 시간 후-급식에서 유산 함량 수득된 메틸 에스테라제 | Supelco Bulletin No. 856 (1998)에 따라 보론 트리플루오라이드-메탄올(메탄올 내 14% BF)로 유도 캐리어(28cm/s)로 헬륨을 사용한 가스 크로마토그라피. 메틸 DL-락테이트 샘플이 흘러 유도체의 지연 시간을 확인함. |
| 가스 조성물(이산화탄소 및 메탄) | 26 게이지 바늘(leur-lock)이 끼워진 10mL 주사기 안으로 포트를 통해 가스의 헤드스페이스(Headspace) 샘플이 6시간 후-공급 제거된다. 이 샘플은 빈 1드램 바이알로 바로 주입되어 10-m PoraPlot Q 컬럼을 사용한 가스 크로마토그라피(Micro GC CP3900, Varian Specialties Ltd. , Brockville, ON)에 의해 분석된다. |
| 발효조 내용물로부터 분리된 박테리아 펠렛 내의 15N의 풍부성 정도(Enrichment) | 동위원소 비 질량 스펙트로메트리(isotope ratio mass spectrometry) (VG Isotech, Middlewich, UK)로 신선 연소(Model 1500, Carlo. Erba, Instruments, Milan, Italy). 15N-인리치 박테리아의 자연적 풍성에 대한 보정이 높은 pH와 두 낮은 pH에서 두 발효조를 사용한 15N의 유입없이 부가적인 실험 기간을 진행함에 의해 이루어진다. 박테리아의 생산은 박테리아의 펠렛의 15N 인리치먼트에 유출수로의 15N 흐름의 비율에 의해 측정된다. |
도 1은 두 가지 다른 pH 프로필을 얻기 위해 타액 농도를 변화함에 의해 얻어진 pH의 영역을 나타낸다. 표 12는 전체 생존 가능한 박테리아와 셀룰로스 분해 박테리 아에 pH 및 효소 혼합물의 영향을 보여준다. 전체 생존가능한 박테리아의 수는 낮은 pH(P < 0.03)에서 그리고 효소 혼합물의 부가(P < 0.13)로 증가했다. 셀룰로스분해 박테리아는 낮은 pH (P < 0.02)에서 감소했지만, 효소 혼합물 (P > 0. 88)에는 영향을 받지 않았다.
표 13은 6 시간 후-공급시 pH 및 효소 혼합물의 영향을 보여준다. 엔도글루카나제 및 β-D-자일로시다제 활성은 낮은 pH (P < 0.05)에서 보다 낮은 반면, 엑소글루카나제 활성은 감소되었다(P < 0.11). 대비적으로, 프로테아제 활성은 낮은 pH (P < 0.001)에서 보다 높고, 이는 주로 LT 그룹에 의해 나타난 활성의 증가에 기인한다. 효소 혼합물은 자일라나제, 엔도글루카나제, 및 프로테아제 활성을 증가시켰고(P < 0.02), β-D-글루코시다제 (P < 0.07) 및 엑소글루카나제 (P < 0.12)를 증가시켰다. 효소 혼합물이 높은 pH에서 이 활성을 증가하지만, 낮은 pH에서는 감소하는 것으로 나타나기 때문에, 유의성 있는 pH x 효소 상호작용(P <0.05)이 β-D-자일로시다제에서 검지되었다. 프로테아제 활성에 대해, 전술한 바와 같이, 유의성 있는 pH x 효소 상호작용은 LT 그룹에 의해 나타난 활성의 큰 증가에 기인한다. 단지 α-L-아라비노퓨라노시다제 만이 pH 또는 효소 혼합물에 영향을 받지 않는다.
표 14는 DM, OM, NDF, ADF 및 전분에 pH 및 효소 혼합물의 영향을 보여준다. 진정한 OM 소화성은 낮은 pH에서 보다 낮지만(P < 0.05); 그러나, 진정한 DM 소화성 만은 낮아지는(P < 0.07) 경향을 보였다. 효소 혼합물은 진정한 DM (P > 0.36) 또는 OM (P > 0.27) 의 소화성에 영향을 미치지 않는다. NDF 및 ADF 소화는 낮은 pH에서 크게 감소하지만(P < 0.001), 효소 혼합물은 NDF 소화성을 증가(P < 0.005)한다. 효소 혼합물은 헤미셀룰로스 소화성을 증가(P < 0. 001)하지만, 셀룰로스 소화성에는 영향을 미치지 않는다. 진정한 조 단백질 (CP) 및 전분 양자의 분해성은 처리에 의해 영향을 받지 않는다(P > 0.15).
표 15 VFA 생산, 유산 및 가스 농도에 pH 및 효소 혼합물의 영향을 보여준다. 전체 VFA 생산은 낮은 pH에서 보다 낮다(P < 0.006). 분지쇄 휘발성 지방산(BCVFA) 생산 또한 낮은 pH로 감소를 보였다(P < 0.001). 높은 pH는, 증가(P < 0.14)하는 경향을 보이는 카포레이트(caproate)를 가지고, 아세테이트, 부틸레이트, 이소-부틸레이트 및 이소-발러레이트의 부분을 증가시킨다(P < 0. 01). 그러나, 높은 pH는 프로피오네이트 및 발러레이트의 부분을 감소시킨다(P <0.01). 아세테이트:프로피오네이트 비율은 높은 pH 보다 낮은 pH에서 보다 낮다(P <0.001). 효소 혼합물은 VFA에 영향을 갖지 않는다(P > 0.20). 유산의 수준이 낮아 아마 생물학적으로 의미가 없을 것이지만, 높은 pH에서 보다 높은 수준으로 향하는 경향이 관찰되었다(P < 0.10). 전체 가스 조성물에 대해, 메탄의 부분은 낮은 pH에 의해 크게 감소(P < 0.001)하는 반면, CO2 부분은 높은 pH에서 보다 높다(P < 0.04).
표 16은 유위의 미생물의 질소 대사작용에 pH 및 효소 혼합물의 영향을 보여준다. 전체 N 흐름은 높은 pH에서 보다 높지만(P < 0.15) 효소 혼합물에 의해 감소된다(P < 0.08). 박테리아 뿐 아니라 식이의 N 흐름이 처리에 의해 영향을 받지 않는다(P > 0.15). 암모니아 수준이 극히 낮고, 그리고 높은 pH (P < 0.003) 및 효소 혼합물 (P < 0.07)에서 보다 높다. 결과적으로, 미생물 단백질 합성의 효율성은 낮은 pH에 서보다 높은 pH에서 높아지는 경향이 있다(P < 0.10).
프로테아제 효소 혼합물의 부가는 건조물 및 단백질 분해의 상당한 증가(각각 4.5 및 5.5%)로 섬유(대부분 헤미셀룰로스) 분해를 크게 증가한다(비처리된 대조에 비하여 43%까지). 이들 증가는 전체 미생물 수의 증가 및 이들 분비된 효소의 활성 증가와 같이 일어난다. 전반적으로, 이들의 발견은 이 프로테아제의 부가가 마초에 존재하는 구조적인 장애를 제거하여 미생물에 의해 기질에 보다 빠른 접근을 가능하게 하여, 다음으로 보다 빠른 미생물 복제 및 기질의 분해를 가져온다는 가설과 일치한다. 메탄 생산은 낮은 pH에서 감소하지만, 프로테아제 효소 혼합물의 부가에 의해서는 영향을 받지 않는다. 이러한 결과는 또한 프로테아제 효소 혼합물이 환경에 유해한 반추동물에 의한 메탄 생산을 증가함이 없이 섬유 소화성을 증진하는 유용한 것이다 라는 것을 나타낸다. 더욱이, 프로테아제 효소 혼합물의 영향은 유위 내의 특징적인 보다 높은 pH 조건에서 크다.
-
실시예
4 : 프로테아제 효소 혼합물에서 프로테아제의 타입의 결정
실시예 3의 프로테아제 효소 혼합물 (RT1184)이 더욱 더 평가되어 혼합물 내의 프로테아제의 타입이 결정된다. 프로테아제 활성 분석은 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF, 세린 프로테아제의 저해제), EDTA (메탈로프로테아제의 저해제) 및 파라-클로로머큐리벤조에이트(CMB, 시스테인 프로테아제의 저해제)와 같은 특정 프로테아제 저해제의 부가 또는 부가없이 수행되었다. 혼합물에 존재하는 단백질의 분자 사이즈는 SDS-PAGE 테크닉을 사용하여 해결되었다. 영향을 미치는 분획이 열-분안정성인지를 결정하기 위해, 생체외 분해 연구가 천연의 형태(예를 들어, 그 자체 로) 또는 오토크레빙 후(예를 들어, 효소를 적어도 30분 동안 높은 압력 및 121℃로 처리함)의 양 효소를 사용하여 수행되었다. 마찬가지로, 복용-반응 연구가 분해 변수에 대한 부가하는 증가분 효소의 수준의 영향을 시험하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 유위액으로 배양 0h(즉, 유위액의 부가 전에 전-처리) 및 배양 18h으로부터 샘플이 전자 현미경 기법을 사용하여 정량되었다.
저해제 연구는 단지 하나의 타입의 프로테아제인, 세린 프로테아제만이 존재한다는 것을 보여주었다. 1mM 디소디움 EDTA 또는 0.1mM CMB의 부가는 단백질 분해작용을 저해하지 않고, 반면 3mM PMSF는 프로테아제를 36%저해하고, 따라서 효소 혼합물에 세린 프로테아제의 존재와 메탈로프로테아제의 부존재를 나타낸다. SDS-PAGE에 의해 판단하면, 효소 혼합물은 22 및 10 kDa 주위의 작은 밴드들을 가지며 32 kDa의 주요 밴드를 포함한다.
생체외 유위 분석은 유위액 부가에 앞서 1.5㎕/g DM 2h로 부가된, 효소 혼합물이 자주개자리 건초의 DM 분해(22h 배양)를 11.8% 증가로 유효하다는 것을 입증한다. 더욱이, 분해는 적용 비율의 증가(10㎕/g 까지)로 21%까지 증가하지만, 상관관계는 이차함수적이다(P < 0.001, R2 = 0.85). 오토클레이빙은 이러한 능력을 파괴하고 또한 이전에 천연(즉, 오토크레이브 되지 않은 것)의 효소에서 관찰된 섬유소화에 대한 모든 긍정적인 효과를 제거하여, 활성성분이 열-변성이 쉬운 것이라는 것을 나타낸다.
현미경 연구는 효소 혼합물이 0h(예를 들어, 미처리 효과)에 또한 관찰된 몇몇 효 과를 가지고 유위액으로 배양의 18h 후 자주개자리 건초의 분해 영역을 증가한다는 것을 밝힌다. 이것은 프로테아제 혼합물이 마초에 존재하는 구조적 장애를 제거하여, 유위 미생물의 보다 빠른 콜로니화와 섬유의 분해를 가능하게 한다는 것을 추정케 한다.
이들 발견은 프로테아제 활성과 마찬가지로 활성성분이 열-변성이 쉬운 것이라는 것을 암시한다. 부가적인 생체외의 연구는 이 효소 혼합물에 대한 비교로서 세린 프로테아제(서브틸리신, St. Louis, MO의 Sigma Chemicals사로부터 입수)의 상업적으로 정제된 제품을 사용하여 수행되었다. 적용 비율은 이 효소 혼합물에 의해 제공된 것과 유사한 프로테아제 활성을 제공하기 위해 조정되었다. 정제된 서브틸리신은 이 효소 혼합물에 매우 유사한 방식으로 작용하였고, 더욱이 관찰된 섬유소화의 증가에서 이 특정 타입의 프로테아제에 대해 역할을 제시한다는 것을 보여준다.
따라서 본 발명자 등은 서브틸리신-형 특징을 갖는 특정의 프로테아제는 반추동물 사료에 일정 범위로 부가될 때 섬유소화를 증가한다는 것을 밝혀냈다. 이들 효과는 단백질 소화의 증가와 같이 일어나고, 마초에 존재하는 구조적인 장애(가능하기로는 기관 내의 단백질성의 것)의 제거에 근원을 두는 것으로 여겨지고, 이에 의해 유의 미생물에 의한 기질에의 보다 빠른 접근을 가능하게 한다. 관찰된 섬유소화의 증가의 정도가 주어질 때, 반추동물 식이에 프로테아제의 부가는 이들 식이가 제공된 동물의 성장률 또는 우유 생산을 증가할 것이라는 것이 기대된다.
-
실시예
5 : 영양소 소화성에 대한 전체 혼합된 사료에 대해 선택된 프로테아제 효소 혼합물의 부가의 효과
착유우에 급식된 전체 혼합된 사료(TMR)에 선택된 프로테아제 효소 혼합물의 부가의 효과가 시험되었다. 더욱이, 전체 소화관에서 영양소 소화에 대한 효과가 평가되었다.
a. 동물 및 실험적 디자인
여덟 마리의 다산 포유 홀스테인 카우(Holstein cows)가 사용되었고, 네 마리는 유위 도관이 외과수술로 장착되었다. 소는 실험 시작 시 밀크에 있어서 일 63± 32(평균± SD)이었다. 평균 체중은 실험시작 시 690± 44(평균± SD)kg이었고, 실험 종료 시 685± 40(평균± SD)kg이었다.
실험 디자인은 각 기간이 21일(처리 적응의 10일 및 데이타 수집의 11일) 지속하는 4x4 더블 라틴 스퀘어 이다. 소는 이들이 캐뉼레이트 되었는지, 두 스퀘어가 동시적으로 수행되었는지에 따라 스퀘어에 할당된다. 각 기간 동안, 소는 사분의 일의 식이를 받는다. 처리는 2x2 팩토리얼(factorial)(효소 보충물을 가지거나 가지지 않는, 식이에서 마초의 두 가지 수준)로 배열된다.
b. 사료물질의 식이 및 제조
높은 또는 낮은 수준의 마초를 포함하는 두 가지 식이가 사용되었다. 높은 마초 식이는 60% 마초를 포함하는 반면, 낮은 마초 식이는 34% 마초를 포함한다(DM 기준). 각 식이는 다음과 같이 네 가지 처리 그룹을 형성하기 위해 외인성 프로테아제 효소를 가지거나 가지지 않고 공급된다:
| 처리 그룹 | 상세한 설명 |
| 프로테아제 없는 높은 마초 | 프로테아제 효소 없이 높은 마초 조절 |
| 프로테아제 있는 높은 마초 | 프로테아제 효소 있는 높은 마초 |
| 프로테아제 없는 낮은 마초 | 프로테아제 효소 없이 낮은 마초 조절 |
| 프로테아제 있는 낮은 마초 | 프로테아제 효소 있는 낮은 마초 |
식이의 마초 구성분은 자주개자리 건초 및 보리 사일리지의 혼합물로 구성된다. 농축물은 스팀-롤된 보리, 건조-롤된 옥수수 및 펠렛화된 보충물을 포함한다. 식이는 'Cornell-Penn-Miner System (CPM Dairy, Version 2.0)을 사용하여 제형되고, 충분한 대사 가능한 에너지와 3.5% 지방 및 3.3% 단백질을 갖는 40kg/d의 밀크를 생산하기 위해 단백질, 비타민, 및 미네랄을 제공하기 위해 균형이 맞추어진다. 표 17은 식이의 화학적 조성을 나타낸다.
c. 선택된 프로테아제 효소 혼합물
이 연구에서 사용된 효소 산물은 상업적으로 이용할 수 있는 프로테아제 (Protex 6Lδ Genencor International, Rochester, NY)이었다. 이것은 1.25 ml/kg의 식이 DM의 비율로 부가되었다. 이 상업적 효소 산물은 사료-등급 효소에 대한 현행의 규정에 맞고 일반적으로 안전한 것으로 인식된 바실러스 바실러스 리센니포르미스(Bacillus licheniformis)의 균주에서 유래된 프로테아제 활성을 가짐을 특징으로 한다. 이 효소 산물은 제조시 농축물 상에 스프레이 된다. 이 농축물은 그런 다음 TMR을 생산하기 위해 일일 마초와 혼합된다.
d. 동물의 사육 및 관리
식이가 적어도 10%의 매일의 공급 거부로 임의의 섭취를 위해 TMR 공급되었다. 모든 소는 개별적으로 매일 삼회 공급되었고, 물은 자유로이 공급했다. 소는 'Canadian Council on Animal Care guidelines (Ottawa, ON, Canada)'에 따라 사육 되었다. 소는 고무 메트레스가 갖추어져있고, 나무 받침대로 깔려진 소 외양간 축사에 개별적으로 수용되어, 매일 두번 착유된다. 소는 매일의 운동을 위해 건조-장소에 바깥쪽으로 돈다.
e. 공급 샘플링
공급되고 거부된 사료가 측정되어 매일 기록된다. 보리 사일리지, 잘려진 자주개자리 건초, 및 농축물이 매주 샘플되어 DM 함량을 결정한다. 식이는 DM 함량을 변화를 고려하기 위해 조정된다. 공급되고 거부된 TMR의 샘플이 매일 수집되어 55℃에서 건조되고 1-mm 스크린(standard model 4; Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA)을 통과하도록 마쇄되고, 이어지는 분석을 위해 저장된다.
f. 소화성
영양소의 명백한 전체 도관 소화는 2g Yb/d/cow의 섭취를 달성하기 위해 8.7g YbCl3/d/cow의 비율로 사료의 펠렛화된 농축 부분 상에 바로 위치된 YbCl3(Rhone-Poulenc, Inc., Shelton, CT)를 사용하여 측정되었다. 배설물 샘플(직장으로부터)이 하루 동안 여러 번 6일부터 12일까지 모든 소로부터 수집되었다. 샘플은 각 소에대해 샘플링 시간을 통해 혼합되고, 55℃에서 건조되고, 1-mm 스크린(standard model 4)을 통과하도록 마쇄되고, 화학적 분석을 위해 저장된다. 명백한 전체 도관 영양소 소화성이 다음 방정식을 사용하여 공급된 식이에서 Yb 및 영양소의 농도, 찌꺼기, 및 배설물로부터 계산된다:
(1) 명백한 소화성 = 100 - (100 x (Ybd/Ybf) x (Nf/Nd))
여기서, Ybd = 소비된 식이에서 Yb 농도(즉, 제공된 찌꺼기),
Ybf = 배설물에서의 Yb 농도,
Nf = 배설물에서의 영양소의 농도, 및
Nd = 소비된 식이에서 영양소의 농도(즉, 제공된 찌꺼기).
g. 유위 샘플링
효소 활성의 결정을 위해, 유위의 내용물은 캐뉼레이트된 소로부터 19 및 20일에 오후 사료 공급 후 0 및 4 시간에 샘플된다. 소에 의해 합성된 대략 1L의 유위의 내용물이 유위 내의 전부 흉추, 전부 복부, 중앙 복부, 후부 흉추 및 후부 복부 위치로부터 수득되어, PeCAP® 폴리에스터 스크린(포어 사이즈 355 ㎛ ; B & S H Thompson, Ville Mont-Royal, QC, Canada)을 통해 스크린된다. 전체 유위 내용물로부터 스트레인된 잔사의 고형물은 0.9% NaOH와 조합되고(1:1, wt/vol), 2분 동안 블렌더(blender) (Waring Products Division, New Hartford, CT)에서 균질화되고, PeCAP®폴리에스터 스크린(포어 사이즈 355 ㎛)을 통해 재스트레인 되고, 여과된 유위액과 혼합된다. 두-단계 여과 과정으로부터 얻어진 50mm의 유위액이 샘플된다. 모든 샘플은 효소 활성의 분석 시까지 -20℃에서 저장된다.
h. 실험실적 평가
다음의 평가가 수행되었다:
| 분석 | 방법학 |
| 공급 | |
| 분석적 건조물(DM) | 135℃에서 3 시간 동안 오븐 건조 |
| 유기물 (OM) | 탄화 |
| 질소 (N) | 신성 연소 (Carlo Erba Instruments, Milan, Italy) (AOAC, 1990) |
| 중성 디터전트 섬유(NDF) | 회사(Van Soest 등, 1991에 기재된)에 의해 공급된 방법학에 따른 ANKOM200 /220 섬유 분석기(ANKOM Technology, Fairport, NY). 소디움 설페이트 및 열-안정성 아밀라제 사용 |
| 산 디터전트 섬유(ADF) | 회사(Van Soest 등, 1991에 기재된)에 의해 공급된 방법학에 따른 ANKOM200 /220 섬유 분석기(ANKOM Technology, Fairport, NY). |
| 전분 | α-링크된 글루코스 중합체의 효소적 가수분해(Rode 등, 1999) |
| Yb | 원자흡수 (AOAC, 1990) |
| 효소 활성 | |
| 자일라나제 활성 | 기질은 0.1 M 시트레이트 포스페이트 버퍼(pH 6.0; 10 mg/ml) 내 자작나무 자일란임. 40㎕의 스트레인된 유위액이 1ml의 기질로 배양됨. 배양은 60분 동안 세배로 수행됨. 효소 반응은 디니트로살리실산 시약을 부가함에 의해 종료됨. 반응 내용물은 15분 동안 가열되고 냉수에서 냉각됨. 흡광도를 530nm에서 MRX-HD 플레이트 리더를 사용하여 판독함. 이들 값은 자일로스 표준을 사용하여 환원당으로 전환됨. 블랭크, 기질 단독 및 효소 단독이 각각 기질 자가분해 및 효소 샘플 내의 당을 보정하기 위해 사용됨. 일 유닛의 활성은 1nmol의 자일로스/분을 방출하기 위해 요구된 효소의 양으로 정의됨. |
| 카르복시메틸셀룰라제활성 (CMC) | 기질은 중간 점도의 카르복시메틸셀룰로스 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO)임. 분석은 39℃에서 120분 동안 배양되는 것을 제외하고는 자일라나제에 대한 것과 동일함.흡광도 값을 표준 글루코스 커버를 사용하여 환원당으로 전환됨. 일 유닛의 활성은 1nmol의 글루코스/분을 방출하기 위해 요구된 효소의 양으로 정의됨. |
| 엑소글루카나제, β-D-글루코시다제, β-D-자일로시다제, 아라비노퓨라노시다제 | 유도체의 저장액(1mM)을 사용하여 수행됨; 파라-NP-β-D-셀로비오사이드, p-NP-β-D-글루코피라노사이드, 파라-NP-β-D-자일로피라노사이드 및 파라-NP-α-L-아라비노퓨라노사이드 각각의 저장 용액(1mM)을 사용하여 수햄함. 스트레인된 유위액(20㎕)의 샘플이 39℃에서 60분 동안 80㎕의 기질(0.1 M 시트레이트 포스페이트 버퍼에서 준비됨, pH 6.0)로 배양됨. 반응은 100㎕의 1 M 글리신-NaOH 버퍼 (pH 10.8)를 부가함에 의해 종료됨. 파라-니트로페닐의 방출은 420nm에서 색도계적으로 결정됨. 일 유닛의 각 효소 활성은 1nmol의 파라-니트로페닐/분을 방출하기 위해 요구된 효소의 양으로 정의됨. |
| 프로테아제 활성 | Brock 등. (1982)의 방식에 유사하게 기질로 아조카제인(로트 25H7125, Sigma Chemical, St. Louis MO)을 사용하여 분석됨. 스트레인된 유위액(0.4 ml)이 0.1 M 시트레이트 포스페이트 버퍼(pH 6.8) 내의 0.5ml의 아조카제인(2% wt/vol)에 부가됨. 세개 조의 튜브가 혼합되고, 39℃에서 1시간 동안 배양됨. 반응은 0.5ml의 15%(wt/vol) 트리클로로초산(TCA)의 부가에 의해 정지됨. 반응이 TCA로 종료된 후 아조카제인이 부가되는 백그라운드 대조 또한 포함됨. TCA의 부가 후, 튜브는 혼합되어, 30분 동안 얼음에 위치되고, 그리고 나서 실온에서 5분 동안 15,600 x g에서 원심분리됨. 상등액(0.75ml)은 0.75ml의 0.5M NaOH와 혼합되고, 흡광도는 420nm에서 MRX-HD 플레이트 리더를 사용하여 스펙트로포토미터로 측정됨. |
h.통계적 분석
모든 데이타는 SASTM (SAS Institute, 1999, Cary, NC)의 혼합된 모델 과정을 사용하여 통계적으로 분석되었다. 데이타 소화성은 스퀘어의 고정된 효과(예를 들어, 비-캐뉼레이트된 것 대 캐뉼레이트된 소), 식이에서 마초 수준의 고정된 효과(즉, 높은 마초 대 낮은 마초), 효소의 고정된 효과(예를 들어, 비-프로테아제 대 프로테아제), 마초와 효소 간의 상호작용에서의 고정된 효과, 스퀘어 내에서 기간의 랜덤한 효과, 및 나머지 에러를 고려한 모델을 사용하여 분석되었다. 유위의 효소 활성에 대한 데이타는 동일한 모델이지만 또한 반복된 측정을 고려하여 분석되었다. 편차는 P < 0.05에서 유의성 있는 것으로 여겨진다.
표 18은 식이에 프로테아제 효소를 부가하는 것은 식이의 소화성을 증진한다는 것을 보여준다. DM, OM, N, ADF, 및 NDF의 소화성은 프로테아제 효소에 기인하여 일치되게 증가한다. 소화성에서의 증가의 정도는 보다 높은 마초 식이에서 보다 낮은 마초 식이에서 일반적으로 크지만, 양자 식이에 대한 소화성에서 개선은 상당하다.
표 19는 식이에 프로테아제 효소를 부가하는 것에 의해, 유위액에서의 효소 활성이 증진한다는 것을 보여준다. 특히, 자일라나제, 엔도글루카나제, 및 프로테아제의 활성이 증진된다. 효소 산물은 측정할 수 없는 자일라나제 또는 엔도글루카나제 활성을 포함하기 때문에, 유위액에서 높은 활성은 증가된 미생물의 활성의 결과인 것이다. 이들 데이타는 착유우의 식이에 프로테아제 효소를 부가하는 것은 유위 내의 전반적인 섬유 분해 활성을 증가했다는 것을 명백히 보여준다. 따라서, 프로테아제를 부가하는 것은 미생물 군주와 시너지 작용을 유발한다. 유위의 섬유-소화 능의 증가는 표 18에 나타난 사료 소화의 증가로 고려된다.
-
실시예
6 :
생체외에서
마초의
소화성에 대한 프로테아제 효소의 영향
이 연구는 실시예 5의 생체내 연구로부터 마초를 사용하여 수행되었다. 이 연구는 생체외에서 측정된 마초 소화성에 프로테아제 효소 산물 부가의 효과를 결정하기 위해 수행되었다.
마초의 생체외 유위 가스 생산은 Mauricio 등(1999)에 의해 기술된 것에 유사한 시스템을 사용하여 측정되었다. 실시예 5에 기술된 생체내 실험에서 사용된 자주개자리 건초 및 보리 사일리지의 신선한 샘플은 Knifetec™ 1095 샘플 밀(Foss Tecator, Hoganas, Sweden)을 사용하여 10초 동안 밀링된다. 대략 1g의 DM에 동등한 밀링된 마초의 샘플은 그런 다음 여덟 개의 복제를 갖는 가스-차단 혈청 배양 바이얼(125ml 용량) 안으로 계량된다. 실시예 5에서 사용된 동일한 상업적으로 이용될 수 있는 프로테아제 산물(Protex 6L® Genencor International, Rochester, NY)이 사용된다. 효소는 실시예 5에서 사용된 동일한 적용 비율인 유위액으로 배양 20시간 전 1.25㎕/g DM 마초의 비율로 적용된다. 효소가 튜브에 부가된 3시간 후, Goering and Van Soest(1970)에 기술된 것 같이 제조되어 1M 트랜스-아코니트산(aconitic acid) (Sigma Chemicals)을 사용하여 pH 6.0으로 조정된 40ml의 혐기성의 버퍼 배지가 부가되고, 그리고 바이알은 20℃에서 하룻밤 저장된다.
유위액은 보리 사일리지, 잘려진 자주개자리 건초, 롤링된 옥수수 낱일 및 농축물로 구성된 식이를 공급한 착유우로부터 급식(1100 h) 후 4시간에 얻어진다. 실시예 5에 기술된 바와 같이 수집된 스트레인된 유위액은 밀봉되고 미리 가열된 컨테이너 내에서 실험실로 이송되어 수조에서 39℃로 유지된다. 접종원이, 인큐베이터에서 39℃로 가열되고 산소-유리 이산화탄소류로 흘린 배양 바이알에 분배된다(바이알 당 10ml) 그런 다음 이 바이알은 적하 후 즉시 14mm 부틸 고무 스토퍼(butyl rubber stopper) 플러스 알루미늄 크림프 캡(aluminium crimp cap)으로 밀봉되어 48시간 동안 배양된다. 음성 대조(유위액 플러스 버퍼 단독 및 유위액 플러스 버퍼와 효소 산물) 또한 여덟 개의 레플리케이션(replications)에서 배양된다. 이들 대조는 접종원으로부터 직접 얻어진 가스 방출 및 발효 찌꺼기를 보정하기 위해 사용된다. 기질 발효에 의해 생산된 선단 가스는 바이알 디스플레이(Data Track, Christchurch, UK)에 연결된 압력 변환기(type T443A, Bailey and Mackey, Birmingham, UK)에 부착된 23게이지(0.6mm) 바늘을 삽입함에 의해 접종 후 2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 및 48시간에 측정된다. 이 변환기는 그런 다음 환기를 허용하는 위치로 바늘을 옮겨 제거된다. 배양된 기질 유기물의 양에 의해 보정되고 음성 대조로부터의 가스 방출을 위한 압력 밸브가 Mauricio 등(1999)에 의해 보고된 방정식(가스 부피 = 0.18 + 3.697 x 가스압력 + 0. 0824 x 가스 압력2)을 사용하여 부피 측정을 하기 위해 사용되었다. 이송으로, 바이알은 2시간 동안 4℃에서 냉장고에 위치되어 발효를 중단하고 여과된다.
표 20은 자주개자리 건초에 배양 2시간에 출발하여 가스 생산을 증가하고, 이 증가는 배양을 통해 유지된다는 것을 보여준다. 증가된 가스 생산은 미생물 소화의 개선을 나타낸다. 대비하여, 프로테아제를 부가하는 것은 보리 사일리지의 가스 생산에 영향을 가지지 않는다.
참 고 문 헌
Beauchemin, K. A. , Morgavi, D. P., McAllister, T. A. , Yang, W. Z. and Rode, L. M. (2001) The use of feed enzymes in ruminant diets. In Recent Advances in Animal Nutrition. P. C. Garnsworthy and P. J. Wiseman, eds. Nottingham University Press, Nottingham, UK.
Brown, R. L. , Chen, Z. Y., Cleveland, T. E., Cotty, P. J. and Cary, J.W. (2001) Variation in ire vl tro a-amylase and protease activity is related to the virulence of Aspergillus flavus isolates. J. Food Prod. 64: 401-404.
Blyant, M. P. andBurkey, L. A. (1953) Cultural methods and some characteristics of some of the more numerous groups of bacteria in the bovine rumen. J. Dairy Sci. 36 : 205-207.
Colombatto, D. (2000) Use of enzymes to improve fibre utilization in ruminants: a biochemical and in vitro rumen degradation assessment. PhD. Thesis. The University of Reading. Reading, UK.
Colombatto, D. , Morgavi, D. P. , Furtado, A. F. andBeauchemin, K. A. (2003) Screening of fibrolytic enzymes as additives for ruminant diets: relationship between enzyme activities and the in vitro degradation of enzyme-treated forages. Proc. Brit. Soc. Anim. Sci. BSAS, York, UK, p. 210.
Colombatto, D. , Mould, F. L. , Bhat, M. K., Morgavi, D. P. , Beauchemin, K. A. and Owen, E. (2003) Influence of fibrolytic enzymes on the hydrolysis and fermentation of pure cellulose and xylan by mixed ruminal microorganisms in vitro. Proc. Brit. Soc. Anim. Sci. BSAS, York, UK, p. 208.
Dehority, B. A., Tirabasso, P. A. and Grifo Jr. , A. P. (1989) Most probable-number procedures for enumerating ruminal bacteria, including the simultaneous estimation of total and cellulolytic numbers in one medium. Appl. Environ. Microbiol. 55 : 2789-2792.
Goring, H. K. andVan Soest, P. J. (1970) Forage Fiber Analyses : Apparatus, Reagents, Procedures and Some Applications. Agri. Handbook No. 379, ARS-USDA, Washington, DC.
Hoover, W. H. , Miller, T. K., Stokes, S. R. and Thayne, W. V. (1989) Effects offish meals on ruminal bacterial fermentation in continuous culture. J. Dairy Sci. 72 : 2991-2998.
Mauricio, R. M. , Mould, F. L., Dhanoa, M. S. , Owen, E. , Channa, K. S. and Theodorou, M. K. (1999) A semi-automated in vitro gas production technique for ruminant feedstuff evaluation. Anim. Feed Sci. Technol. 79:321-330.
McDougall, E. I. (1948) Studies on ruminant saliva. 1. The composition and output of sheep's saliva. Biochem. J. 43 : 99-109.
Nsereko, V. L. , Morgavi, D. P. , Rode, L. M., Beauchemin, K. A. andMcAllister, T. A. (2000) Effects of fungal enzyme preparations on hydrolysis and subsequent degradation of alfalfa hay fiber by mixed rumen microorganisms in vitro. Anim. Feed Sci. Technol. 88: 153-170.
Rode, L. M., Yang, W. Z. and Beauchemin, K. A. (1999) Fibrolytic enzyme supplements for dairy cows in early lactation. J. Dairy Sci. 82 : 2121-2126.
Van Soest, P. J., Robertson, J. B. and Lewis, B. A. (1991) Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarchpolysaccharides in relation to animal nutrition. J. Dairy Sci. 74: 3583- 3597.
Van Soest, P. J. (1994) Nutritional Ecology of the Ruminant. Comell University Press, Ithaca, New York.
Verdouw, H. (1978) Ammonia determination based on indophenol formation with sodium salicylate. Water Res. 12: 399-402.
Wood, T. M. and Bhat, M. K. (1988) Methods for measuring cellulase activities. In Methods of Enzymology. W. A. Wood and S. T. Kellogg, eds. Academic Press, Inc., London, UK, pp. 87- 112.
Yang, W. Z. , Beauchemin, K. A. and Rode, L. M. (1999) Effects of an enzyme feed additive on extent of digestion and milk production of lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 82 : 391-403.
특 허
문 헌
Beauchemin, K. A. , Rode, L. and Sewalt, V. J.의 1998년 2월 24일 공고된(issued) 미국특허 제5,720, 971호의 'Enzyme additives for ruminant feeds'.
본 명세서에서 언급된 모든 공보는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상인의 수준의 것을 암시한다. 개개의 공보가 특별하게 되고 참고문헌에 의해 합체되어 지도록 개별적으로 나타내는 것처럼 모든 공보는 동일한 정도로 참고문헌에 의해 여기에 합체된다.
비록 앞의 발명이 명료 및 이해의 목적을 위해 상세한 설명 및 실시예의 방법으로 상세하게 기술되었지만, 다음의 청구범위에 한정된 발명의 범위 또는 정신으로부터 떨어짐이 없이 어떤 변경 및 변형이 만들어질 수 있을 것이다.
xOSX = 자일라나제 (귀리 스펠트); BX = 자일라나제 (자작나무); CMC = 엔도글루카나제; SCELL = 엑소글루카나제; BG = 베타-글루카나제; XG = 자일로글루칸; AGAL = 아라비노갈락탄; LICH = 리케나제; AX = 아라비노자일란; AMYL = 알파-아밀라제; LAM = 라미나리나제; ES = 에스테라제 ; AF = 아라비노퓨라노시다제; GPY = 베타-글루토시다제; XPY = 베타-자일로시다제; PRT = 프로테아제; GAPY = 갈락토시다제
yRS = 세배의 각 효소 산물로 39℃에서 15분 동안 25mg의 동결 건조된 기질의 배양 후 결정된 환원당.
zPromote N.E.T. (Lot MO-E100)이 사용됨.
w DMD에 따른 상대 서열.
x ND = 미 결정.
y,z 각각 P < 0.05 및 P < 0.01에서 대조로부터 차이.
a,b 기질 및 컬럼 내에서, 공통된 윗첨자 없는 평균은 다름 (P < 0.05).
a,b 분획 및 컬럼 내에서, 공통된 윗첨자 없는 평균은 다름 (P < 0.05).
a,b 분획 및 컬럼 내에서, 공통된 윗첨자 없는 평균은 다름 (P < 0.05).
a,b 컬럼 내에서, 공통된 윗첨자 없는 평균은 다름 (P < 0.05).
Y 대조 = 효소부가 없음; RT1181 및 RT1184 = 1.5uL/g DM로 효소 부가; 8184Low = 0.5uL/g DM로 부가된 RT1181와 RT1184의 혼합물(1:1) ; 8184High = 1.5uL/g DM로 부가된 RT1181와 RT1184의 혼합물(1:1)
a,b,c 분획 및 컬럼 내에서, 공통된 윗첨자 없는 평균은 다름 (P < 0.05).
Y 대조 = 효소 부가 없음; RT1181 및 RT1184 = 1.5μL/g DM으로 효소 부가; 8184Low = 0.5μL/g DM로 부가된 RT1181와 RT1184의 혼합물(1:1) ; 8184High = 1.5uL/g DM으로 부가된 RT1181와 RT1184의 혼합물(1:1)
a 전체 혼합된 사료는 30% 자주개자리 건초, 30% 옥수수 사일리지, 및 40% 롤된 옥수수로 구성됨(DM 기준)
a HC = 대조 TMR을 가진 높은 pH; HT = 효소 처리 TMR을 가진 높은 pH; LC = 대조 TMR을 가진 낮은 pH; LT = 효소 처리 TMR을 가진 낮은 pH.
a HC = 대조 TMR을 가진 높은 pH; HT = 효소 처리 TMR을 가진 높은 pH; LC = 대조 TMR을 가진 낮은 pH; LT = 효소 처리 TMR을 가진 낮은 pH.
b XY = 자일라나제; END = 엔도글루카나제 ; EXO = 엑소글루카나제 ; GPY = 베타-D-글루코시다제 ; XPY = 베타-D-자일로시다제 ; PROT = 프로테아제 ; AF = 알파-L-아라비노퓨라노시다제.
c XY 및 END는 nmol 자일로스 또는 글루코스 min-1 mL-1로 표현됨; EXO, GPY, XPY, 및 AF는 nmol 파라-니트로페닐 min-1 mL-1로 표현됨; PROT는 동일한 실험조건 하에서 1μg의 표준 프로테아제(S. griseus 유래)의 작용으로부터 측정된 흡광도에 동등한 것으로 표현됨.
a HC = 대조 TMR을 가진 높은 pH; HT = 효소 처리 TMR을 가진 높은 pH; LC = 대조 TMR을 가진 낮은 pH; LT = 효소 처리 TMR을 가진 낮은 pH.
a 표현된 값은 하루를 통해 4번 측정(발효조에 아침 사료 공급 후 0, 2, 5 및 8h)의 평균임.
b HC = 대조 TMR을 가진 높은 pH; HT = 효소 처리 TMR을 가진 높은 pH; LC = 대조 TMR을 가진 낮은 pH; LT = 효소 처리 TMR을 가진 낮은 pH.
a HC = 대조 TMR을 가진 높은 pH; HT = 효소 처리 TMR을 가진 높은 pH; LC = 대조 TMR을 가진 낮은 pH; LT = 효소 처리 TMR을 가진 낮은 pH.
bEMPS = 미생물 단백질 합성의 효율성(진정으로 소화된 g N/kg OM).
1 펠렛화된 보출물에 있는 성분
2 NRC(2001)로부터의 값에 기초됨
F = 식이에서 마초의 수준 (높은 마초 대 낮은 마초)
P = 프로테아제 (비-프로테아제 대 프로테아제)
F x P = F와 P의 상호작용.
NS = 비유의성 (P > 0. 15).
DM = 건조물; NDF = 중성 세정 섬유; ADF = 산 세정 섬유
a,b,c 다른 윗첨자를 갖는 같은 열에서 평균이 다름(P < 0.05).
F = 식이에서 마초의 수준(높은 마초 대 낮은 마초), P = 프로테아제 (비-프로테아제 대 프로테아제), 및 F x P = F와 P의 상호작용.
XY = 자일라나제; END = 엔도글루카나제; EXO = 엑소글루카나제; GPY = 베타-D-글루코시다제; XPY = 베타-D-자일로시다제; PROT = 프로테아제; AF = 알파-L-아라비노퓨라노시다제.
XY 및 END는 분당 밀리리터당 자일로스 또는 글루코스의 나노몰로 표현됨; EXO, GPY, XPY, 및 AF는 분당 밀리리터당 파라-니트로페닐의 나노몰로 표현됨; PROT는 시간당 밀리리터당 가수분해된 아조카제인으로 표현됨
NS = 비유의성 (P > 0. 15).
a,b 다른 윗첨자를 갖는 같은 열에서 평균이 다름(P < 0.05).
F = 마초의 소스(자주개자리 건초 대 보리 사일리지)
P = 프로테아제(비-프로테아제 대 프로테아제), 및 F x P = F와 P 간의 상호작용.
3NS = 비-유의적 (P > 0.15).
a,b,c 다른 윗첨자를 갖는 같은 열에서 평균이 다름(P < 0.05).
본 발명은 프로테아제를 포함하는 사료 부가제 또는 사료 조성물을 공급함으로써 반추동물들의 섬유소화를 증진킬 수 있다. 또한, 이로 인해 섬유소화의 증가의 정도가 주어질 때, 반추동물 식이에 프로테아제의 부가는 이들 식이가 제공된 동물의 성장률 또는 우유 생산을 증가할 것이 기대된다.
Claims (188)
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계;c) 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계; 및d) 동물에 조성물을 투여하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 마초 또는 낱알 사료의 소화성을 증진하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 7항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 방법.
- 제 4항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20.0 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 10항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 방법.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계;c) 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계; 및d) 동물에 조성물을 투여하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 반추동물 사육방법.
- 제 20항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 20항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 26항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 방법.
- 제 23항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20.0 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 29항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 35 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 방법.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 반추동물에 적절한 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계;c) 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 적용하는 단계; 및d) 동물에 조성물을 투여하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 소화성을 증가시키기 위해 마초 또는 낱알 사료를 처리하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 39항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 42항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 42항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 42항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 45항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 방법.
- 제 42항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 방법.
- 제 42항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20.0 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방 법.
- 제 48항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 54 내지 제 56항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 방법.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 사료 조성물을 형성하기 위해 프로테아제를 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 혼합하는 단계; 및c) 반추동물에 사료 부가제를 공급하는 단계 또는 이 사료 부가제를 동물용 마초 또는 낱알 사료에 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 사료 부가제를 생산하는 방법.
- 제 58항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 58항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 58항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 61항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 61항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 61항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 64항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 방법.
- 제 61항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징 으로 하는 방법.
- 제 61항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 67항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 방법.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계; 및c) 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 반추동물에 공급하기 위한 사료 조성물을 생산하는 방법.
- 제 77항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 77항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 77항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 80항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 80항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 80항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 83항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 방법.
- 제 80항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 방법.
- 제 80항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합 된 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 86항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 92항 내지 제 94항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 방법.
- 하나 또는 그 이상의 비활성 또는 활성 성분과 조합된 적어도 하나의 사료-등급 프로테아제를 포함하고, 여기서 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 부가되고 동물에 공급될 때 마초 또는 낱알 사료의 소화성을 증진하는 양으로 포함되는 사료 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래되고, 여기서 프로테아제의 양은 하나 또는 그 이상의 사료-등급 비활성 또는 활성 성분과 조합하여 mL 또는 g 당 100 내지 500,000 단위의 프로테아제 범위임을 특징으로 하는 사료 부가제.
- 제 97항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 97항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제 97항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 100항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 97항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 97항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양을 생산하도록 부가제에 존재하고 건조물은 마초 또는 낱알 사료임을 특 징으로 하는 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양을 생산하도록 부가제에 존재하고 건조물은 마초 또는 낱알 사료임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양을 생산하도록 부가제에 존재하고 건조물은 마초 또는 낱알 사료임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 부가될 때 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위로 프로테아제 활성을 나타내도록 하는 양으로 존재함을 특징으로 하는 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 부가될 때 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위로 프로테아제 활성을 나타내도록 하는 양으로 존재함을 특징으로 하는 부가제.
- 제 96항에 있어서, 프로테아제는 마초 또는 낱알 사료에 부가될 때 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위로 프로테아제 활성을 나타내도록 하 는 양으로 존재함을 특징으로 하는 부가제.
- 제 107항 내지 제 109항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 부가제.
- 제 104 내지 제 109항 중 어느 한 항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 부가제.
- 제 104 내지 제 109항 중 어느 한 항에 있어서, 마초는 자주개자리 건초 또는 자주개자리-글라스 건초 혼합물임을 특징으로 하는 부가제.
- 적어도 하나의 프로테아제와 조합된 마초 또는 낱알 사료를 포함하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 나타나는, 반추동물에 공급하기 위한 사료 조성물.
- 제 113항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼 합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 113항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 113항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 116항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 116항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 116항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 119항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 116항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 116항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 부가되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 부가되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 부가되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 122항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
- 제 128항 내지 제 130항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 조성물.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계;c) 사료 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 부가하는 단계; 및d) 동물에 조성물을 투여하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 반추동물에 공급하기 위한 프로테아제의 용도.
- 제 132항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 132항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 132항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 135항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특 징으로 하는 용도.
- 제 135항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 135항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 138항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 용도.
- 제 135항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 용도.
- 제 135항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제는 소비된 식이 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 141항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 147항 내지 제 149항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 용도.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 사료 부가제를 형성하기 위해 프로테아제를 하나 또는 그 이상의 활성 또는 비활성 성분과 혼합하는 단계를 포함하는 사료 부가제를 생산하기 위한 프로테아제의 용도.
- 제 151항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 152항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 152항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 152항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 155항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 용도.
- 제 152항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 용도.
- 제 152항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제는 소비된 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양으로 생산하도록 부가제에 존재되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제는 소비된 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 생산하도록 부가제에 존재되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제는 소비된 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 생산하도록 부가제에 존재되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 생산하는 양으로 존재되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 생산하는 양으로 존재되는 것임을 특 징으로 하는 용도.
- 제 158항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 생산하는 양으로 존재되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 164항 내지 제 166항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 용도.
- 제 161항 내지 제 166항 중 어느 한 항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 161항 내지 제 166항 중 어느 한 항에 있어서, 마초는 자주개자리 건초 또는 자주개자리-글라스 혼합물임을 특징으로 하는 용도.
- a) 적어도 하나의 프로테아제를 제공하는 단계;b) 마초 또는 낱알 사료를 공급하는 단계; 및c) 조성물을 형성하기 위해 마초 또는 낱알 사료에 프로테아제를 부가하여 이에 의해 소화성에서의 증가가 달성되는 단계를 포함하는 사료 조성물을 생산하기 위한 프로테아제의 용도.
- 제 170항에 있어서, 마초 또는 낱알 사료는 자주개자리 건초 및 사일리지(silage), 글라스 건초 및 사일리지, 혼합 건초 및 사일리지, 밀집, 옥수수 사일리지, 옥수수 낱알, 보리 사일리지, 보리 낱알, 지방종자(oilseeds) 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 170항에 있어서, 마초는 자주개자리 마초 또는 자주개자리-글라스 마초 혼합물인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 170항에 있어서, 프로테아제는 박테리아류 또는 곰팡이류로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 173항에 있어서, 박테리아류는 바실러스 (Bacillus) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 173항에 있어서, 곰팡이류는 트리코더마 ( Trichoderma ) 속의 종인 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 173항에 있어서, 프로테아제는 시스테인 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아스파테이트 프로테아제 및 세린 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 176항에 있어서, 프로테아제는 세린 프로테아제임을 특징으로 하는 용도.
- 제 173항에 있어서, 프로테아제는 서브틸리신-형(subtilisin-like)임을 특징으로 하는 용도.
- 제 173항에 있어서, 프로테아제는 고체, 액체 또는 현탁액으로 제형된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 179항에 있어서, 프로테아제는 미네랄 블럭(mineral block), 염, 그래뉼, 환, 펠렛 또는 분말로 제형된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 179항에 있어서, 프로테아제는 담체; 희석제; 방향제; 부형제; 셀룰라제, 자일라나제, 글루카나제, 아밀라제 및 에스테라제로 구성된 군에서 선택된 효소; 항생물질; 프리바이오틱(prebiotics); 프로바이오틱(probiotics); 미세영양원; 비타민; 광물 및 거대영양원에서 선택된 하나 이상의 활성 또는 비활성 성분과 조합 된 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 181항에 있어서, 프로테아제는 소비된 건조물의 0.1 내지 20 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 181항에 있어서, 프로테아제는 소비된 건조물의 0.5 내지 2.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 181항에 있어서, 프로테아제는 소비된 건조물의 0.75 내지 1.5 mL/kg 범위의 양으로 마초 또는 낱알 사료에 적용되는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 181항에 있어서, 프로테아제의 양은 1,000 내지 23,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 181항에 있어서, 프로테아제의 양은 2,300 내지 11,000 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 181항에 있어서, 프로테아제의 양은 3,300 내지 6,800 프로테아제 units/kg 건조물의 범위의 프로테아제 활성을 포함하는 것임을 특징으로 하는 용도.
- 제 185항 내지 제 188항 중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 활성은 기질로서 아조카제인을 사용하여 pH 6.0 및 39℃에서 분석됨을 특징으로 하는 용도.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US45273703P | 2003-03-07 | 2003-03-07 | |
| US60/452,737 | 2003-03-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060013639A true KR20060013639A (ko) | 2006-02-13 |
Family
ID=32962745
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020057016306A KR20060013639A (ko) | 2003-03-07 | 2004-02-13 | 반추동물 식이에서 먹이 이용을 증가시키는 단백질가수분해 효소의 용도 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20040202697A1 (ko) |
| EP (1) | EP1603403A1 (ko) |
| JP (1) | JP2006519597A (ko) |
| KR (1) | KR20060013639A (ko) |
| CN (1) | CN1784147A (ko) |
| AU (1) | AU2004216921A1 (ko) |
| CA (1) | CA2517604A1 (ko) |
| MX (1) | MXPA05009315A (ko) |
| WO (1) | WO2004077960A1 (ko) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9420807B2 (en) | 2007-04-02 | 2016-08-23 | Purina Animal Nutrition Llc | Method of feeding young monogastric mammals and composition fed to young monogastric mammals |
| US8815571B2 (en) * | 2007-10-12 | 2014-08-26 | Archer Daniels Midland Co. | Increased fiber hydrolysis by protease addition |
| BR112014003560A2 (pt) | 2011-08-19 | 2017-03-01 | Novozymes A / S | polipeptídeo, composição, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de produção de polipeptídeo, para melhoria do valor nutricional de uma alimentação animal, e para o tratamento de proteínas, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, uso de pelo menos um polipeptídeo, aditivo de alimentação animal, e, alimentação animal |
| WO2013041689A1 (en) | 2011-09-22 | 2013-03-28 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| MX358963B (es) | 2011-12-28 | 2018-09-11 | Novozymes As | Polipeptidos con actividad proteasa. |
| AU2013213601B8 (en) | 2012-01-26 | 2018-01-18 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents |
| US20150140165A1 (en) | 2012-06-20 | 2015-05-21 | Novozymes A/S | Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents |
| US9771570B2 (en) | 2012-09-05 | 2017-09-26 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity |
| US9551042B2 (en) | 2012-12-21 | 2017-01-24 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| MX2015010078A (es) | 2013-02-06 | 2016-01-25 | Novozymes As | Uso de polipeptidos con actividad proteasa en alimentos para animales. |
| EP3119209A2 (en) * | 2014-02-25 | 2017-01-25 | DSM IP Assets B.V. | A method for improving maize digestibility in bovine animals |
| DE102014009813A1 (de) | 2014-07-03 | 2016-01-07 | Biopract Gmbh | Verfahren zur Prophylaxe von Pilzinfektionen bei Nutz- und Zierpflanzen, bevorzugt beim Weinbau, sowie bei Gehölzen |
| CN104814276B (zh) * | 2015-05-13 | 2020-02-28 | 济南益邦生物科技有限公司 | 一种饲喂动物的生物除臭剂 |
| PL3344063T3 (pl) * | 2015-09-01 | 2023-03-06 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Sposoby zwiększenia wchłaniania witamin rozpuszczalnych w tłuszczach w paszy |
| AR112955A1 (es) * | 2017-09-01 | 2020-01-08 | Novozymes As | Aditivos de alimento animal que comprenden polipéptidos que tienen actividad proteasa y usos de los mismos |
| MX2020003483A (es) | 2017-10-12 | 2020-07-20 | Syngenta Participations Ag | Composiciones de pienso para animales mejoradas y metodos de uso. |
| WO2020043836A1 (en) * | 2018-08-31 | 2020-03-05 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same |
| CN109596837B (zh) * | 2018-12-10 | 2022-02-08 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种猪饲料蛋白质消化率的仿生消化测定方法 |
| KR102255611B1 (ko) * | 2019-10-14 | 2021-05-24 | 염상구 | 복합 균주를 이용한 완전배합 발효사료의 제조방법 |
| EP4152945A1 (en) * | 2020-05-18 | 2023-03-29 | DSM IP Assets B.V. | Animal feed compositions |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU512690B2 (en) * | 1976-09-27 | 1980-10-23 | W. R. Grace & Co | A method of increasing the feed efficiency ofan animal |
| US4737365A (en) * | 1986-01-13 | 1988-04-12 | Central Soya Company, Inc. | Method of feeding cattle to improve protein utilization |
| US7005128B1 (en) * | 1993-12-17 | 2006-02-28 | Genencor International, Inc. | Enzyme feed additive and animal feed including it |
| GB9416841D0 (en) * | 1994-08-19 | 1994-10-12 | Finnfeeds Int Ltd | An enzyme feed additive and animal feed including it |
| GB2358135A (en) * | 1999-12-09 | 2001-07-18 | Finnfeeds Int Ltd | Animal feed additives comprising betaine and a protease |
| US6960462B2 (en) * | 2000-02-08 | 2005-11-01 | Dsm Ip Assets B.V | Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed |
| US6506423B2 (en) * | 2000-12-21 | 2003-01-14 | Kansas State University Research Foundation | Method of manufacturing a ruminant feedstuff with reduced ruminal protein degradability |
| AU2003240800A1 (en) * | 2002-05-29 | 2003-12-19 | Npp Packaging Graphics Specialists, Inc. | Vacuum laminator |
-
2004
- 2004-02-13 WO PCT/CA2004/000200 patent/WO2004077960A1/en active Application Filing
- 2004-02-13 KR KR1020057016306A patent/KR20060013639A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-02-13 CA CA002517604A patent/CA2517604A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-13 CN CNA2004800122412A patent/CN1784147A/zh active Pending
- 2004-02-13 EP EP04710767A patent/EP1603403A1/en not_active Withdrawn
- 2004-02-13 MX MXPA05009315A patent/MXPA05009315A/es not_active Application Discontinuation
- 2004-02-13 JP JP2006504061A patent/JP2006519597A/ja not_active Withdrawn
- 2004-02-13 US US10/778,925 patent/US20040202697A1/en not_active Abandoned
- 2004-02-13 AU AU2004216921A patent/AU2004216921A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2004216921A1 (en) | 2004-09-16 |
| CN1784147A (zh) | 2006-06-07 |
| CA2517604A1 (en) | 2004-09-16 |
| JP2006519597A (ja) | 2006-08-31 |
| WO2004077960A1 (en) | 2004-09-16 |
| MXPA05009315A (es) | 2005-11-08 |
| EP1603403A1 (en) | 2005-12-14 |
| US20040202697A1 (en) | 2004-10-14 |
| WO2004077960A8 (en) | 2005-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20060013639A (ko) | 반추동물 식이에서 먹이 이용을 증가시키는 단백질가수분해 효소의 용도 | |
| Klingerman et al. | An evaluation of exogenous enzymes with amylolytic activity for dairy cows | |
| Beauchemin et al. | Developments in enzyme usage in ruminants. | |
| Eun et al. | Assessment of the efficacy of varying experimental exogenous fibrolytic enzymes using in vitro fermentation characteristics | |
| Lee et al. | Influence of an anaerobic fungal culture administration on in vivo ruminal fermentation and nutrient digestion | |
| Wang et al. | Rumen microbes, enzymes and feed digestion-a review | |
| Eun et al. | Enhancing in vitro degradation of alfalfa hay and corn silage using feed enzymes | |
| KR100307654B1 (ko) | 반추동물사료용효소보충재,이를함유한사료혼합체및이사료혼합체의생산방법 | |
| AU2015208030A1 (en) | Use of an enzymatic composition in the feed of ruminants | |
| Eun et al. | Use of an in vitro fermentation bioassay to evaluate improvements in degradation of alfalfa hay due to exogenous feed enzymes | |
| Lee et al. | In vitro stimulation of rumen microbial fermentation by a rumen anaerobic fungal culture | |
| US20030035822A1 (en) | Compositions and methods for enhancing fiber digestion | |
| Paul et al. | Effect of administration of an anaerobic gut fungus isolated from wild blue bull (Boselaphus tragocamelus) to buffaloes (Bubalus bubalis) on in vivo ruminal fermentation and digestion of nutrients | |
| Ranilla et al. | Effects of an exogenous fibrolytic enzyme preparation on in vitro ruminal fermentation of three forages and their isolated cell walls | |
| Król et al. | Anaerobic rumen fungi and fungal direct-fed microbials in ruminant feeding | |
| US20030165487A1 (en) | Amylase feed supplements for improved ruminant nutrition | |
| Partridge et al. | Enzymes in farm animal nutrition | |
| Kim et al. | Effects of dietary addition of surfactant Tween 80 on ruminal fermentation and nutrient digestibility of Hanwoo steers | |
| WO2016080805A1 (ko) | 베타 만난아제 함유 반추동물용 사료효소제 | |
| He et al. | Inoculum source and transfer of rumen contents from bison to cattle improved in vitro gas production and feed digestibility, but not the responses to exogenous enzymes supplementation | |
| Kabré et al. | Enzyme activities of rumen solid‐adherent microorganisms in chronically underfed ewes | |
| Hong et al. | Effects of enzyme application method and levels and pre-treatment times on rumen fermentation, nutrient degradation and digestion in goats and steers | |
| López et al. | Influence of exogenous enzymes on in vitro gas production kinetics and dry matter degradability of a high concentrate diet | |
| Shakya et al. | Improved dairy production through enzyme supplementation | |
| Dado | Effects of multiple exogenous enzyme products on in vitro fermentation by rumen microbes in batch and continuous culture fermentation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |