KR20060012201A

KR20060012201A - 자감초 추출물을 포함하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR20060012201A
Application number: KR1020040060957A
Authority: KR
Inventors: 정재인; 임순성; 신현경; 이형규; 박정한윤
Original assignee: 학교법인 한림대학교
Priority date: 2004-08-02
Filing date: 2004-08-02
Publication date: 2006-02-07
Also published as: KR100624703B1

Abstract

본 발명은 자감초 추출물을 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 암세포, 특히 전립선 암세포에 대하여 현저한 세포증식 억제 효과를 가지며 동시에 정상세포에는 부작용을 유발하지 않아, 암 예방 및 치료용도로 용이하게 사용가능한 자감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

자감초, 전립선암

Description

자감초 추출물을 포함하는 항암 조성물{ANTI-CANCER CONPOSITION COMPRISING EXTRACT OF BAKED LICORICE}

도 1a 및 1b는 MAT-LyLu 세포에 대한 자감초 물 추출물(1a) 및 자감초 에탄올 추출물(1b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 2a 및 2b는 MAT-LyLu 세포에 대한 감초 물 추출물(2a) 및 감초 에탄올 추출물(2b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 3a 및 3b는 DU145 세포에 대한 자감초 물 추출물(3a) 및 자감초 에탄올 추출물(3b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 4a 및 4b는 DU145 세포에 대한 감초 물 추출물(4a) 및 감초 에탄올 추출물(4b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 자감초 에탄올 추출물의 소장 크립트 세포에 대한 세포증식 영향을 확인한 그래프이다.

도 6은 자감초 물 추출물 및 자감초 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.

도 7은 글리시리진의 표준 검량선이다.

도 8은 이소리퀴리티제닌의 표준 검량선이다.

도 9는 글리시리진 산가수분해 산물의 HPLC 크로마토그램이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 자감초 추출물을 포함하는 항암 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암세포, 특히 전립선 암세포에 대하여 현저한 세포증식 억제 효과를 가지며 동시에 정상세포에는 부작용을 유발하지 않는 자감초 추출물에 관한 것이다.

[종래기술]

암의 발생률과 암으로 인한 사망률은, 의학의 혁신적인 발전에도 불구하고 계속 증가추세에 있다. 세계보건기구는 암 발생을 높이는 서구식 식습관의 확산과 현재의 흡연추세로 볼 때 2020년에는 암진단자가 1천500만 명으로 50%이상 증가할 것으로 예상하였다. 또한 우리나라 보건복지부와 국립암센터에 따르면 2001년에 발생, 등록된 암은 9만1천9백44건으로 전년에 비해 9.7% 증가했으며, 여자는 유방암, 남자는 전립선암이 크게 늘어나는 등 우리나라 암 발생이 선진국과 비슷한 양상을 보이는 것으로 조사되었다.

암화(carcinogenesis)는 (a) 발암물질에 의해 DNA에 돌연변이가 유도되는 개시단계, (b) 양성 종양 (benign tumor)이 나타나는 촉진단계, (c) 양성종양이 악성종양 (malignant tumor)으로 변환되는 진행단계, (d) 악성 정도의 증가 및 전이로의 진행단계와 같이 다단계로 진행된다. 각 단계로의 진전속도나 다음 단계로의 진행은 여러 물질에 의해 증가되거나 억제될 수 있다.

암의 치료에는 외과적 수술방법 이외에도 화학 요법, 방사선 요법 등이 널리 사용되어 왔으나, 이런 치료요법은 암세포뿐만 아니라 정상 세포에도 영향을 미쳐 소화기관과 골수 조직의 손상, 탈모, 면역력 저하 등 여러 부작용을 일으키는 단점이 있다. 또한 발견 당시 원격전이가 된 경우가 많아서 이미 암으로 발전한 후에는 각종 물리, 화학적 요법을 동원하여도 완전한 치료가 어렵다고 할 수 있다.

따라서 암발생 및 암으로 인한 사망률을 감소시키기 위해 치료보다는 암발생을 차단하거나 암화과정을 억제 또는 역전시키는 암예방에 대한 연구가 필요하며, 이러한 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다. 특히, 야채, 과일, 전통 의학에서 약제로 사용되어 온 식물유래 성분들 중에서 암 예방 및 치료 물질을 개발하고자 하는 것이 최근의 연구경향이다.

한편, 전립선암은 미국이나 유럽에서 남성 암사망자의 약 20%를 차지하는 빈도 높은 암으로써, 우리나라도 식생활의 서구화 및 고령화 사회로의 이행에 따라 전립선암과 유방암의 발생이 급격히 증가하는 추세이다. 전립선암 치료법으로 안드로겐-결핍(androgen-deprivation) 요법을 사용하나, 내분비요법은 병의 진행을 완화시키기는 하나 골다공증, 지방대사의 이상, 빈혈, 무력, 성욕감소, 피로 등의 부작용을 유발할 뿐만 아니라, 그 효과가 오래 지속되지 않아 결국 모든 전립선암 환자들이 이 요법에 반응을 보이지 않는 안드로겐 비의존성 상태로 발전하여 치료가 거의 불가능하게 된다. 따라서 현재의 전립선암에 대한 치료는 조기 발견하여 암이 전립선에 국한되어 있을 때 전립선을 제거하는 수술 방법이 제일 성공적인 처치 방법이다. 그러나 발견 당시 암이 전립선에 국한되지 않고 원격전이가 되어 수 술적 처치가 적용되지 않는 경우가 빈번한 실정이다. 이에 특히, 호르몬 비의존성 전립선암에 효과적인 약제의 필요성이 절실한 상태이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 자감초 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 항암 효과가 우수하며 부작용이 없는 자감초 추출물을 포함하는 항암 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 자감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 인체 안전성이 확보된 한약재를 대상으로 항암 활성을 갖는 성분을 검색하던 중, 자감초 추출물이 암세포 증식을 특이적으로 억제하며 암세포 세포사멸을 유도할 수 있음을 확인하여, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 자감초는 감초를 열에 구운 것으로, 한약재명 자감초로 판매되며 감초와는 구분되어 사용되고 있다. 감초는 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생 초본으로 감초(Glycyrrhiza uralensis Fisch) 및 민감초(Glycyrrhiza glabra L) 등을 건조시킨 근 및 근경이다. 자감초는 상기 감초를 물에 묻혔다가 불에 굽어 제조한 것으로, 통상 물에 적신 새끼줄로 감초를 감은 후 잿불속에 묻어서 제조하나 근래에는 감초를 종이로 한번 싸고 그 위에 젖은 종이로 다시 싼 후 불에 구워 제조한 다. 본 발명에서 언급하는 자감초는 제조방법상에 차이가 있을 수 있으나 한의약에서 자감초라 분류하고 시판되고 있는 모든 것들을 포함한다.

본 발명은 항암 조성물에 관한 것으로, 자감초 추출물을 유효성분으로 포함한다. 자감초 추출물은 물 또는 유기용매로 추출 및/또는 분획하여 제조할 수 있으며, 바람직하기로는 유기용매로 추출 및/또는 분획하여 제조한다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 5의 저가 알콜 또는 알콜희석수, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 아세톤일 수 있으며, 상기 저가 알콜은 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 및 이소프로판올 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 알콜희석수는 알콜을 50 내지 97 부피 %로 물에 희석한 것일 수 있다. 본 발명의 자감초 추출물은 바람직하기로는 에탄올 희석수로 추출한 자감초 에탄올 추출물일 수 있다. ,

일예로, 자감초 추출물은 자감초 100 g당 에탄올 0.2 내지 2 L를 가한 후 추출하는 방법으로 실시된다. 추출 온도는 4 내지 120 ℃일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다. 추출시간은 한정되진 않으나 10분 내지 1달일 수 있으며, 통상의 추출기기나 초음파분쇄 추출기를 이용할 수 있다. 제조된 추출액은 이후 감압 여과 및 동결건조하여 용매를 제거한다.

본 발명에 따른 자감초 추출물은 암세포 증식을 현저히 억제하며(도 1b 및 도 3b), 동시에 정상세포의 증식에는 영향을 미치지 않는다(도 5). 특히 자감초 추출물중 자감초 에탄올 추출물의 항암 활성이 우수할 뿐만 아니라 감초 추출물에 비하여 2-3배의 증강된 활성을 가진다(도 1b, 도 2b, 도 3b 및 도 4b).

본 발명의 일실시예로, 자감초 에탄올 추출물의 유효성분을 분석한 결과, 자 감초 물 추출물이 극성 분자를 함유하나 자감초 에탄올 추출물은 물 추출물에 비하여 극성 분자의 함량은 감소되고 비극성 물질의 함량이 증가된 것으로 확인되었다. 이는 자감초 에탄올 추출물이 자감초 물 추출물에 비하여 현저한 항암 활성을 가진다는 실험결과에 비추어, 항암활성은 자감초 에탄올 추출물내 함유된 비극성 분자에 의한 것으로 추정된다. 상기 비극성 분자는 감초가 기존에 함유하고 있는 사포닌계열의 비극성물질들과 자감초의 제조과정에서 극성물질들이 변화(배당체의 당가수분해 등)에 의한 비배당체(aglycone)들의 생성과 당분해산물(maillard products)등으로 구성된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 자감초 추출물은 극성 물질 및 비극성 물질이 30 내지 60 : 70 내지 40 중량비율로 포함된 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 자감초 추출물은, 글리시리진 및 이소리퀴리티제닌을 포함하고 있다. 상기 글리시리진 및 이소리퀴리티제닌 각각은 항암 활성을 나타내나, 농도 대비시 자감초 추출물에 비해선 낮은 것으로 확인되어, 자감초 추출물의 항암 활성은 단순히 상기 글리시리진 및/또는 이소리퀴리티제닌에 의한 것이 아니라, 자감초 추출물에 포함된 그 외 다양한 종류의 성분들의 조합에 의한 것임을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 자감초 물 추출물은 자감초 에탄올 추출물에 비하여 글리시리진 및 이소리퀴리티제닌의 함량이 매우 높으나, 항암 활성은 현저히 낮다는 실험 결과로부터, 자감초 추출물의 항암 활성은 글리시리진 및/또는 이소리퀴리티제닌 이외 성분들이 관여하고 있음을 입증한다.

이에, 본 발명에서는 상기 자감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물을 제공한다. 상기 자감초 추출물은 바람직하기로는 자감초 에탄올 추출물이 다.

본 발명의 항암 조성물은, 상기 유효성분을 단독으로 포함할 수 있으며, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 혼합물로 제공되는 경우, 유효성분은 항암 조성물에 0.1 내지 99.9 중량%로 포함될 수 있으나, 통상 0.001 내지 50 중량%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 항암 조성물은 각종 암, 예컨대 위암, 유방암, 대장암, 피부암, 식도암, 폐암, 자궁암, 전립선암 또는 간암의 예방 및 치료의 목적으로 사용가능하다.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 락토스, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수, 덱스트로스, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유가 있으며, 이들은 1종이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용가능하다. 또한 항암 조성물을 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 항암 조성물은, 자감초 추출물 이외에 공지의 항암활성을 갖는 화합물 또는 식물 추출물을 더욱 포함할 수 있으며, 자감초 추출물 100 중량부에 대하여 각각 5 내지 20 중량부로 포함될 수 있다.

본 발명의 항암 조성물은 약제, 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제 등으로 사용가능하다. 항암 조성물은 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있으나, 바람직하기로는 경구 투여이다. 항암 조성물은 약제로 사용되는 경우 항암제일 수 있으며, 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제로 사용되는 경우, 각종 식품류, 육류, 음료수, 초콜렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올 음료, 비타민 복합제, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 항암 조성물은 최종 제조된 약제, 식품 또는 음료에 0.001 내지 50 중량%으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

항암 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화하는 것이 좋다. 구체적인 제형의 예로는 경고제, 과립제, 로션제, 리니멘트제, 리모나데제, 산제, 시럽제, 안연고제, 액제, 에어로솔제, 엑스제(EXTRACTS), 엘릭실제, 연고제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 점안제, 정제, 좌제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

본 발명에 따른 항암 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다. 일예로, 본 발명의 항암 조성물은 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 0.1 내지 100 ㎎/㎏(체중)으로 1회 이상 투여가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되진 않는다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 자감초 물추출물 제조

감초를 음지에서 실온으로 약 5일간 건조시킨 후, 분쇄하였다. 분쇄된 시료를 무쇠 솥에 넣고 중간 불에서 감초의 누런색이 고동빛이 나타날 때까지 약 20분간 볶은 후, 여기에 3차 증류수를 1:10 무게 비율로 가하고 3시간정도 약탕기에서 추출하였다. 여과후 여과액은 12시간 냉동고에 보관한 후 냉동건조기로 수분을 제거하였다.

실시예 2: 자감초 에탄올 추출물 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 구운 감초 분쇄시료를 제조한 후, 추출용매로 95% 에탄올을 이용하여 추출하였다. 추출시 기기 추출(ASE300 ACCELERATED SOLVENT EXTRACOR)과 초음파분쇄 추출(BRANSON Ultrasonics corporation)방법을 병행하였다. 기기 추출시 분쇄시료 30 g당 95% 에탄올 200 mL을 첨가하여 50℃에서 1500 psi 압력으로 20분 동안 추출하였고, 초음파 분쇄 추출시에는 분쇄시료 100g당 1L의 95% 에탄올을 첨가하여 50℃에서 2-3주간 추출하였다. 추출된 시료는 Biotron corporation, Modul spin 40을 이용하여 45℃에서 감압 농축하였다.

비교예 1: 감초 물 추출물 제조

실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 감초는 굽지 않고 사용하였다.

비교예 2: 감초 에탄올 추출물 제조

실시예 2와 동일한 방법으로 실시하였으며, 다만 감초는 굽지 않고 사용하였 다.

실험예 1: 자감초 추출물의 항암 활성 검증

가. 암 세포주 및 시약

인간의 전립선 암세포인 DU145 세포와 흰 쥐의 소장 크립트(crypt)에서 유래한 세포인 IEC-6 세포, 랫에서 유래한 전립선 암세포인 MAT-LyLu 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. 세포배양에 사용한 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12 (DMEM/F12), FBS(Fetal Bovine Serum), 트립신-EDTA, L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신 및 셀레늄은 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA)에서 구입하였다. MTT(3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolum bromide), 덱사메타손, BSA(Bovine Serum Albumin) 및 트랜스패린은 Sigma(St. Louis, MO, U.S.A)에서 구입하였다.

나. 세포배양

DU145 세포, IEC-6 세포 및 MAT-LyLu 세포는 DMEM/F12 배지를 사용하여 37℃ 습윤한 CO₂ 배양기(5% CO₂/ 95% air)에서 배양하였다. DU145 세포를 유지하기 위해, DMEM/F12 배지에 10% FBS, 100 units/㎖ 페니실린 및 100 ㎕/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였고, IEC-6 세포의 경우 10 ㎍/㎖ 인슐린을 첨가였다. MAT-LyLu 세포는 3.125 pg/㎖ 덱사메타손, 2.25 ㎍/㎖ 글루타민을 첨가하여 배양하였다. 세포가 80% 컨플루언시로 배양되면, PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% 트립신-2.65 mM EDTA를 처리하여 계대 배양하였고, 배지는 2일마다 교환해주었다.

다. MTT 분석

실시예 1-2 및 비교예 1-2의 각각의 추출물은, 10% FBS가 포함된 배지에 0, 7.5, 15, 30 ㎍/㎖로 희석하여 준비하였다. MAT-LyLu 세포를 10,000 cells/well의 밀도로 12 웰 플레이트에 분주하였고, DU145세포 및 IEC-6 세포는 50,000 cells/well의 밀도로 24 웰 플레이트에 각각 분주하였다. DU145세포와 IEC-6 세포는 24 시간 경과후, MAT-LyLu 세포는 48시간이 경과후, 무혈청 배지(DMEM/F12, transferrin 5 ㎍/㎖, selenium 5 ng/㎖, BSA 0.1 ㎎/㎖)로 배지를 교환하였고, 혈청이 고갈된 후, 상기에서 준비한 희석 시료로 배지를 교체하였다. 실시예 1-2 및 비교예 1-2 추출물이 들어 있는 시료로 DU145 세포와 IEC-6 세포 배지를 2일마다 교체하였고 MAT-LyLu 세포는 매일 교체하여 주었다. 24시간, 48시간 및 72시간 경과시마다, MTT 분석으로 살아있는 세포수를 측정하였다. MTT 분석은 미토콘드리아 내에 존재하는 숙시네이트디하이드로게나제가 MTT를 환원하여 푸른색의 포르마잔을 형성하는데 형성된 포르마잔을 이소프로판올로 용해하여 570 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더(BioRad, Hercules, CA, U.S.A)를 이용하여 흡광도를 측정하여, 살아있는 세포수를 간접적으로 측정하는 방법이다.

라. 결과

(1) 자감초 추출물의 랫 유래 전립선 암세포에 대한 항암 활성

도 1a 및 1b는 MAT-LyLu 세포에 대한 실시예 1의 자감초 물 추출물(1a) 및 실시예 2의 자감초 에탄올 추출물(1b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이고, 상기 도 1b의 그래프 수치는 하기 표 1로 나타내었다.

(표 1)

평균	0 hours	24 hours	48hours	72hours
0 ㎍/㎖	0.472	0.967	1.189	1.535
7.5 ㎍/㎖	0.472	0.868	0.639	0.278
15 ㎍/㎖	0.472	0.665	0.155	0.162
30 ㎍/㎖	0.472	0.118	0.15	0.114
% of control (0 ㎍/㎖)
	0 hours	24 hours	48 hours	72 hours
0 ㎍/㎖	100	100	100	100
7.5 ㎍/㎖	100	90.8	53.67	18.9
15 ㎍/㎖	100	68.7	13.06	10.53
30 ㎍/㎖	100	12.1	10.53	7.4

도 2a 및 2b는 MAT-LyLu 세포에 대한 비교예 1의 감초 물 추출물(2a) 및 비교예 2의 감초 에탄올 추출물(2b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이고, 상기 도 2b의 그래프 수치는 하기 표 2로 나타내었다.

(표 2)

평균	0 hours	24 hours	48hours	72hours
0 ㎍/㎖	0.455	0.934	1.168	1.544
7.5 ㎍/㎖	0.455	0.879	0.979	1.295
15 ㎍/㎖	0.455	0.788	0.652	0.404
30 ㎍/㎖	0.455	0.58	0.165	0.191
% of control (0 ㎍/㎖)
	0 hours	24 hours	48 hours	72 hours
0 ㎍/㎖	100	100	100	100
7.5 ㎍/㎖	100	94.1	83.8	82.1
15 ㎍/㎖	100	84.3	55.8	26.2
30 ㎍/㎖	100	62.09	26.2	12.36

상기 도 1a - 1b 및 표 1에서, 자감초 에탄올 추출물은 처리 24시간경과시 30 ㎍/㎖의 농도에서 89.9%의 현저한 전립선 암세포 증식억제효과를 나타내었으며, 48시간에 7.5 ㎍/㎖의 농도에서 암세포 증식을 약 50% 감소시켰다. 반면에, 비교예로 확인한 감초 에탄올 추출물은 처리 24시간부터 암세포의 증식억제 작용이 관 찰되긴 하였으나, 자감초에 비하여 항암활성이 낮은 것으로 확인하였다(도 2a, 2b 및 표 2).

또한 자감초 에탄올 추출물과 감초 에탄올 추출물의 IC₅₀을 비교하여 보면, 각각 4.3 ± 0.1 ㎍/㎖ 및 12 ± 0.1 ㎍/㎖으로, 자감초 에탄올 추출물가 감초 에탄올 추출물에 비하여 약 3배 이상의 암세포 증식활성을 나타내었다.

(2) 자감초 추출물의 사람 유래 전립선 암세포에 대한 항암 활성

도 3a 및 3b는 DU145 세포에 대한 실시예 1의 자감초 물 추출물(3a) 및 실시예 2의 자감초 에탄올 추출물(3b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이고, 상기 도 3b의 그래프 수치는 하기 표 3으로 나타내었다.

(표 3)

평균	0 hours	24 hours	48hours	72hours
0 ㎍/㎖	0.4425	0.621	0.8563	1.306
7.5 ㎍/㎖	0.4425	0.5	0.749	0.532
15 ㎍/㎖	0.4425	0.465	0.598	0.136
30 ㎍/㎖	0.4425	0.254	0.104	0.105
% of control (0 ㎍/㎖)
	0 hours	24 hours	48 hours	72 hours
0 ㎍/㎖	100	100	100	100
7.5 ㎍/㎖	100	80.5	87.4	40.7
15 ㎍/㎖	100	74.8	66.3	10.4
30 ㎍/㎖	100	40.9	12.1	8

도 4a 및 4b는 DU145 세포에 대한 비교예 1의 감초 물 추출물(4a) 및 비교예 2의 감초 에탄올 추출물(4b)의 세포증식 억제효과를 나타낸 그래프이고, 상기 도 4b의 그래프 수치는 하기 표 4로 나타내었다.

(표 4)

평균	0 hours	24 hours	48hours	72hours
0 ㎍/㎖	0.4425	0.652	0.853	1.343
7.5 ㎍/㎖	0.4425	0.613	0.682	0.808
15 ㎍/㎖	0.4425	0.592	0.68	0.669
30 ㎍/㎖	0.4425	0.583	0.757	0.217
% of control (0 ㎍/㎖)
	0 hours	24 hours	48 hours	72 hours
0 ㎍/㎖	100	100	100	100
7.5 ㎍/㎖	100	94	79.9	60.1
15 ㎍/㎖	100	90.7	79.7	49.8
30 ㎍/㎖	100	89.4	88.7	16.1

자감초 에탄올 추출물은 30 ㎍/㎖ 처리농도에서 24 경과시 전립선 암세포의 증식을 59.1%로 억제하였으며, 48시간 경과시 약 88%의 세포증식 억제효과를 나타내었다. 반면에 비교예인 감초 에탄올 추출물은 30 ㎍/㎖ 처리농도에서 약 72시간 경과시 약 84%의 암세포 증식억제 효과를 갖는 것으로 확인되어, 자감초 에탄올 추출물이 감초 에탄올 추출물에 비하여 암세포 증식억제효과가 현저히 우수한 것을 알 수 있다.

또한 자감초 에탄올 추출물과 감초 에탄올 추출물의 IC₅₀을 비교하여 보면, 각각 6 ± 0.1 ㎍/㎖이 및 12.3 ± 0.2 ㎍/㎖로, 자감초 에탄올 추출물이 감초 에탄올 추출물에 비하여 약 2배 높은 암세포 증식활성을 나타내었다.

(3) 자감초 추출물의 정상세포에 대한 부작용 확인

항암제는 정상세포에도 영향을 미쳐 특히 소장 상피세포에 영향을 주어 설사 등의 부작용이 유발되는 것으로 알려져 있다. 이에, 항암효과가 있는 자감초 에탄올 추출물의 정상세포에 대한 부작용을 실험하였다.

도 5는 자감초 에탄올 추출물의 소장 크립트 세포에 대한 세포증식 영향을 확인한 것으로, 자감초 에탄올 추출물은 IEC-6세포의 증식에 아무런 영향을 미치지 않은 것으로 관찰되었다. 따라서, 자감초 에탄올 추출물은 정상세포에는 영향을 미치지 않아, 항암제로 적용할 수 있다.

실시예 3: 자감초 물 추출물 및 자감초 에탄올 추출물의 성분 분석

(1) HPLC

자감초 물 추출물 및 자감초 에탄올 추출물 각각을 HPLC로 분석하였다.

-HPLC 조건 -

기기 : Dionex

컬럼 : Phenomenex Luna 5micrometer (250 x4.6mm)

용매 : A - 2% 아세트산

B - 아세토니트릴

운용 : 0-5분(B, 20%), 5-55분(B, 20% --> 90%)

검출파장 : 254 nm

도 6은 자감초 물 추출물 및 자감초 에탄올 추출물의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것으로, "1"은 비교예 1의 감초 물 추출물이고, "2"는 실시예 1의 자감초 물 추출물이고, "3"은 비교예 2의 감초 에탄올 추출물이고, "4"는 실시예 2의 자감초 에탄올 추출물이고, "5"는 화학식 2의 이소리퀴리티제닌(isoliquritigenin)이고, "6"은 화학식 3의 글리시리진(glycyrrhizin)이다.

(화학식 2)

(화학식 3)

도 6에서, 물 추출물은 감초와 자감초 모두 좌측 박스를 포함한 앞쪽에만(retention time(r.t.) 30min 이전) 피크들이 분포하여 극성이 큰 물질이 함유된 것을 알 수 있다. 반면에 에탄올 추출물은 극성이 큰 물질과 함께 우측 박스 내의 비극성물질을 포함하는 특징을 나타내었다.

(2) 글리시리진 및 이소리퀴리티제닌 함량 측정

감초의 유효성분으로 알려져 있는 트리테르펜계 사포닌인 글리시리진과 플라보노이드계 칼콘인 이소리퀴리티제닌 성분의 함량변화를 측정하였다.

먼저 글리시리진과 이소리퀴리티제닌의 표준 검량선을 도 7 및 8로 각각 작성한 후, 여기에 HPLC로 측정한 수치를 대입하여 각 추출물의 함량을 구하였고, 그 결과는 표 5에 나타내었다.

(표 5)

	글리시리진	이소리퀴리티제닌
감초 물추출물	167.50	0.74
자감초 물추출물	143.81	0.95
감초 에탄올추출물	34.85	0.52
자감초 에탄올추출물	20.63	0.26

글리시리진은 글루쿠로나이드가 두개 붙어 있는 사포닌계 배당체로서 물에 잘 추출됨을 알 수 있다. 또한, 가열에 의한 배당체의 가수분해로 자감초에서는 그 함량이 가소되는 것을 볼 수 있으며, 이소리퀴리티제닌은 자감초 물 추출물에서는 증량되나, 자감초 에탄올 추출물에서는 감소되는 것으로 나타났다.

자감초의 에탄올 추출물이 항암효과에서 가장 우수한 결과를 나타낸 이유를 위의 HPLC 연구로부터 비극성물질에 기인 할 것이라는 추측을 가능케 한다. 이 비극성물질군은 감초가 함유하고 있는 사포닌계열의 비극성물질들과 자감초의 제조과정에서 극성물질들이 변화(배당체의 당가수분해 등)에 의한 비배당체(aglycone)들의 생성과 당분해산물(maillard products)등으로 구성되어 있는 것으로 판단된다.

도 9는 글리시리진 산가수분해 산물의 HPLC 크로마토그램으로, "1"은 글리시리진이고 "2"는 글리시리진을 pH3에서 산가수분해한 산물이다. 도 6에 나타나 있듯이 글리시리진의 가수분해에 의해 비극성물질들이 생성됨을 관찰할 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 자감초 추출물은 암세포, 특히 전립선 암세포에 대하여 현저한 세포증식 억제 효과를 가지며 동시에 정상세포에는 부작용을 유발하지 않아, 암 예방 및 치료용도로 용이하게 사용가능하다.

Claims

자감초 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 자감초 추출물을 0.001 내지 50 중량%로 포함하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 자감초 추출물은 자감초를 유기용매로 추출한 것인 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 유기용매는, 탄소수 1 내지 5의 알콜, 에틸아세테이트, 핵산, 아세톤, 클로로포름 및 이들의 희석수로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약제, 식품, 식품첨가제, 음료, 또는 음료 첨가제인 항암 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항암 조성물은 전립선암에 적용되는 것인 항암 조성물.