KR20060007078A - 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 콜라겐 ⅰ형의ｃ-말단에서 유래된 펩타이드에 ｔａｔ 펩타이드가 결합된융합 펩타이드 분석방법 - Google Patents

고성능 액체 크로마토그래피에 의한 콜라겐 ⅰ형의ｃ-말단에서 유래된 펩타이드에 ｔａｔ 펩타이드가 결합된융합 펩타이드 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 콜라겐 I형의 C-말단에서 유래된 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합펩타이드 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 부타 실란기 또는 옥타 실란기를 고정상으로 하고 물을 이동상으로 포함하는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 분석방법에 관한 것이다.
고성능 액체 크로마토그래피, 분석, 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드

Description

고성능 액체 크로마토그래피에 의한 콜라겐 Ⅰ형의 Ｃ-말단에서 유래된 펩타이드에 ＴＡＴ 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 분석방법{METHOD OF ANALYSING FUSION PEPTIDE COMPRISING TAT PEPTIDE AND TYPE-Ⅰ COLLAGEN DERIVED PEPTIDE USING HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY}
도 1은 본 발명에 따른 방법으로 콜라겐Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 2는 비교예의 방법으로 콜라겐Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 자가 세포 침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 분석한 결과를 크로마토그램이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 사람 콜라겐 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 옥타실란(C8)기 또는 부타 실란(C4)기를 고정상으로 하고 물을 이동상으로 하여 시료내 존재하는 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 분석하는 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
콜라겐(collagen)은 포유류의 전체 단백질의 25 %정도를 차지하는 세포외기질(ECM; extra-cellular matrix)의 주요 구성 성분이다. 콜라겐의 비정상적인 합성 또는 비정상적인 분해는 피부 노화, 특히 피부의 주름 형성에 매우 깊이 관여되어 있다. 사람 콜라겐 Ⅰ형(human α1(I) procollagen) C-말단의 일부 펩타이드를 사람의 섬유아세포(human fibroblast)에 첨가하면 콜라겐 Ⅰ형(collagen Ⅰ), 콜라겐 Ⅲ형 및 피브로넥틴(fibronectin)의 합성이 강화되는 것으로 알려져 있다(K. Katayama et al.(1991), Biochemistry, 30, 7097 ;K. Katayama et al.(1993), J. Biol. Chem. 268(14), 9941; Aycock, R.S. et. al.(1986), J. Biol. Chem. 261, 14355). 이에, 상기한 콜라겐 Ⅰ형의 일부가 섬유아세포에 전달되면 콜라겐의 합성을 통해 세포의 성장과 세포외기질의 생성을 촉진시킨다는 보고를 근간으로, 사람 콜라겐 Ⅰ형에서 유래한 펩타이드가 주름개선에 효과가 있을 것으로 예상하고 여러 펩타이드를 합성하여 스크리닝한 결과, 특히 사람 콜라겐 Ⅰ형의 아미노산 서열 중 182∼216, 197∼241 서열의 펩타이드가 콜라겐 합성을 통한 주름개선에 효과가 있음이 밝혀졌다(PCT/FR99/02178, WO 00/15188호). 그러나 상기한 펩타이드는 수용성의 물성으로 인하여 피부 흡수력이 미약하여 피부 주름개선 효과를 크게 기 대하기 어렵다는 단점을 가지고 있다.
상기한 펩타이드의 피부 흡수를 증가시키기 위한 하나의 방법으로, 펩타이드의 지용성을 증가시키기 위하여 말단에 팔미틴산 등의 긴 사슬의 지방산을 그래프팅하는 방법(프랑스 특허출원 제 2788058호, PCT 공개공보 WO 00/40611호)이 제시되었으나, 그 흡수 증대효과는 크게 개선되지 못하였다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 상기한 펩타이드에 세포침투성 Tat 펩타이드(transactivator of transcription peptide)가 결합된 융합 펩타이드가 개발되고 있다.
또한 그와 더불어, 피부주름 개선제로 사용가능한 펩타이드의 안정성을 확인하기 위한 분석방법 개발이 요구되고 있다. 통상적인 분석방법으로는 각종 고체 또는 액체를 고정상(stationary phase)으로 하고, 기체 또는 액체를 이동상(mobile phase)으로 하여 이동상이 고정상을 통과토록 하면서 상기 이동상에 시료를 투입하여 시료가 상기 이동상과 고정상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용 하여 시료를 성분별로 분리하는 방법, 즉 크로마토그래피가 있으며, 그 종류로는 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피가 있다.
크로마토그래피는 다양한 종류가 개발되어 시판되고 있으나, 시료의 최적 분리 및 분석조건은 획일적으로 정의 또는 결정될 수 없고, 분석하고자 하는 시료의 물리적 성질, 즉 고정상과 이동상 사이에서의 분배계수, 분자량 및 이온성 등에 따라 최적의 조건을 확립하여야 한다. 따라서, 피부주름 개선제로 사용가능한 펩타이드를 최적으로 분리 및 분석할 수 있는 조건을 확립할 필요가 있다.
기존에 제시된 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 자가 세포 침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 분석방법으로는, 고정상으로 옥타데실 실란(C18)기를, 이동상으로 물과 아세토니트릴 용매를 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 있으나 분리관의 비극성도가 높고 이동상의 종류 및 조성이 적절치 못하여 융합 펩타이드를 분석하기 부적합한 단점이 있다.
따라서, 본 발명은 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를, 옥타실란(C8)기 또는 부타 실란(C4)기를 고정상으로 하고 물을 이동상으로 하는 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 방법에 있어서, 극성이 높은 고정상 및 분리도가 높은 이동상을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드(transactivator of transcription peptide)가 결합된 융합 펩타이드를 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 방법으로서, 부타 실란기 또는 옥타 실란기가 충진된 분리관을 갖는 고성능 액체 크로마토그래피에 물을 이동상으로 하여 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 분석하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에서 언급하는 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드는 하기 화학식 1로 표시된다.
(화학식 1)
Figure 112004030872749-PAT00001
상기 화학식 1에서,
상기 []Tat는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드로서, R1은 글루타민, 라이신, 알지닌, 및 글리신의 곁사슬(side chain)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되며, n은 4 내지 12 범위의 정수이고,
상기 []collagen DP는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열중 21번에서 25번 아미노산을 포함하며 5 내지 35개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서, R2는 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산의 곁사슬이며, m은 5 내지 35 범위의 정수이다.
상기 []Tat (Tat 펩타이드)의 일례로는 서열번호 2의 Tat 펩타이드(Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg), 서열번호 3의 Tat 펩타이드(Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys) 및 서열번호 4의 펩타이드(Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg)가 있다.
상기 []collagen DP의 일례로는, 서열번호 1의 펩타이드, 서열번호 5의 펩타이드(Tyr-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Ser) 및 서열번호 6의 펩타이드(Val-Ile-Tyr-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-Ser-Arg-Leu)가 있다.
본 발명에 따른 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드의 분석방법은, (a) 고성능 액체 크로마토그래피의 고정상으로서 최적 비극성을 갖는 분리관을 연결하는 분리관 설정단계, (b) 시료를 분리관으로 이동시키는 이동상 설정단계, (c) 이동상의 압력을 조절하는 이동상 유속 조절단계 및 (d) 분리관을 통하여 용출되는 용출물을 검출기로 유입시켜 검출하는 검출단계를 포함한다.
분리관 설정단계에서, 분리관에 사용하는 고정상은 부타 실란(C4)기 또는 옥타 실란(C8)기이다. 상기 고정상들은 본 발명에 따른 융합 펩타이드 를 분리하기에 최적인 비극성을 갖고 있다. 상기 비극성 고정상이 충진된 분리관은 상용적으로 구입하여 사용할 수 있다.
이동상 설정단계에서, 이동상은 물이 바람직하다. 물에 유기용매를 혼합하는 경우 용매의 극성이 낮고 분리관에서 머무르는 시간이 짧아져 분석 시간이 짧아 질 수 있으므로, 이동상으로 물을 사용하는 것이 본 발명에 따른 융합 펩타이드 분리에 최적의 조건을 제공할 수 있다. 그외 이동상의 설정단계는 당해기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 자들에게는 적절한 실험을 통하여 설정가능하다.
상기 이동상 유속 조절 단계에서, 유속은 이동상의 압력 및 분석시간을 고려하여 적절한 범위로 설정할 수 있다. 일례로, 유속은 이동상의 압력인 2000 내지 2500 psi로 유지되는 0.8 내지 1.3 ㎖/min 일 수 있다. 유속이 1.3 ㎖/min 보다 높은 경우 이동상의 압력이 2500 psi에 비하여 높아져 장시간 사용하는 경우 기기에 무리가 생길 수 있으며, 유속이 0.8 ㎖/min 보다 낮은 경우 분석시간이 길어질 수 있다.
검출단계에서, 분리관을 통하여 용출되는 용출물은 UV/VIS 검출기로 유입되도록 설정되며, 이때 검출파장은 190 내지 240 nm일 수 있다. 상기 파장이 190 nm 미만이거나, 240 nm 초과하는 경우 본 발명에 따른 융합 단백질의 검출 효율이 낮을 수 있다. 상기 UV/VIS 검출기는 빛을 흡수할 수 있는 시료에 일정 파장의 빛을 쬐어 흡수가 일어나는 정도에 따라 검출하는 통상의 검출기이다.
상기에서 언급한 고성능 액체 크로마토그래피 분석방법을 이용하여, 콜라겐Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 효과적으로 분리 및 분석할 수 있으며, 또한 수득한 크로마토그램에서 체류 시간이 3.0분에서 13.8분까지 얻어지는 피크를 표준물질의 피크와 비교하여 정량분석할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위 한 것일 뿐 본 발명의 보호범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1-3)
실시예 1 내지 3의 유화물 을 메탄올에 녹여 0.45 ㎛ 여과막으로 여과하여 시료로 사용하였다. 고성능 액체 크로마토그래피 장치는 미합중국 소재 휴렛 팩커드사의 HP 1100 시리즈를 사용하였다.
고성능 액체 크로마토그래피 장치의 부타 실란(C4)기가 충진된 휴렛 팩커드의 Zorbax C4분리관(150 x 4.6 mm, HP, USA)은 물을 흘려주어 평형화시키고, 시료를 투입하여 분석하였다. 유속은 1 ㎖/min으로 하고, 검출은 220 nm의 UV/VIS에서 실시하였다. 상기 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 분석결과는 도 1에 도시하였다.
도 1의 크로마토그램에 나타난 바와 같이, 시료내 존재하는 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 자가 세포침투성 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드가 분리되었다. 이에, 상기 크로마토그램에서 나타난 피크를 합한 후 검량선을 그려, 상기 융합펩타이드를 정량분석하였다. 정량분석 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
구 분 융합 펩타이드 함량 (중량%) 검출량 (중량%) 회수율( %)
실시예 1 1.00 0.98 98
실시예 2 0.70 0.71 101
실시예 3 0.50 0.49 98
(비교예)
실시예 1-3과 동일한 방법으로 시료를 준비하여 고성능 액체 크로마트그래피 실시하였다. 이때 이동상으로 아세토니트릴: 물이 85: 15부피비율로 혼합된 수용액을 사용하였고, 고정상으로는 옥타데실 실란(C18)기를 사용하였으며, 유속은 1.0 ㎖/min으로 수행하였다. 검출은 261 nm의 UV/VIS 검출기로 실시하였고, 그 결과는 도 2의 크로마토그램으로 나타내었다.
도 2에서, 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드는, 고정상으로 옥타데실 실란을 이용하여 이동상으로 아세토니트릴 및 물의 혼합용매를 사용하여 크로마토그래피하는 조건에서는 분리되지 않음을 확인할 수 있었다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드의 분석방법을 제공하여, 시료에 포함된 상기 융합 펩타이드를 정확하고 용이하게 정량할 수 있으며, 이를 이용하여 상기 융합 펩타이드를 이용한 시료의 안정성을 쉽게 검사할 수 있다.

Claims (5)

  1. 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드(transactivator of transcription peptide)가 결합된 융합 펩타이드를 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 방법으로서,
    부타 실란기 또는 옥타 실란기가 충진된 분리관을 갖는 고성능 액체 크로마토그래피에 물을 이동상으로 하여 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하는 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 분석하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은 크로마토그래피 수행으로 수득한 크로마토그램의 피크를 합산한 다음 검량선을 그려서 사람 콜라겐 Ⅰ형의 C-말단에서 유래한 펩타이드에 Tat 펩타이드가 결합된 융합 펩타이드를 정량 분석하는 것을 더욱 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 융합 펩타이드는 하기 화학식 1로 표시되는 것인 방법:
    (화학식 1)
    Figure 112004030872749-PAT00002
    상기 화학식 1에서,
    상기 []Tat는 자가 세포침투성 Tat 펩타이드로서, R1은 글루타민, 라이신, 알지닌, 및 글리신의 곁사슬(side chain)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되며, n은 4 내지 12 범위의 정수이고,
    상기 []collagen DP는 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열중 21번에서 25번 아미노산을 포함하며 5 내지 35개의 연속적인 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서, R2는 상기 펩타이드를 구성하는 아미노산의 곁사슬이며, m은 5 내지 35 범위의 정수이다.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 이동상은 0.8 내지 1.3 ㎖/min의 유속을 갖는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 크로마토그래피는 분리관으로부터 용출되는 용출물을 190 nm 내지 240 nm의 파장을 갖는 UV/VIS 검출기로 검출하는 방법.
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