KR20050115850A

KR20050115850A - 환경인자를 이용한 솔잎 유래 스틸벤계 화합물의 제조방법및 그 화합물을 함유하는 항염증제

Info

Publication number: KR20050115850A
Application number: KR1020050113137A
Authority: KR
Inventors: 안용현; 피재호; 이상국; 조용진
Original assignee: 피재호; 안용현; 이상국; 조용진
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2005-11-24
Publication date: 2005-12-08

Abstract

본 발명은 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자에 의한 솔잎 유래의 스틸벤계 화합물의 대량생산방법 및 그것의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 솔잎에 처리하여 스틸벤계 화합물의 합성에 관여하는 효소를 코딩하는 솔잎 내 유전자 발현을 증가시켜 스틸벤계 화합물을 대량생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 솔잎 유래의 스틸벤계 화합물인 피노실빈은 항암 및 항염증 활성이 있어 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강음료, 식품, 화장품 및 의약품용 조성물을 제조할 수 있다.

Description

환경인자를 이용한 솔잎 유래 스틸벤계 화합물의 제조방법 및 그 화합물을 함유하는 항염증제{Method for mass producing stilbene compounds from pine tree using the environmental factors and anti-inflammatory agent comprising the compounds}

본 발명은 다양한 환경인자에 따른 솔잎 유래의 스틸벤계 화합물의 대량생산방법 및 그것의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 솔잎에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 인자를 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시켜 스틸벤계 화합물을 대량생산하고, 상기 피노실빈의 항암제 및 항염증제로서의 용도에 관한 것이다.

소나무에 존재하는 스틸벤계 화합물은 원래 식물체에서 외부로부터 침입한 박테리아 및 곰팡이의 성장을 억제하는 방어 물질인 피토알렉신(phytoalexin)으로 알려져 왔다. 스틸벤계 화합물은 극히 일부 식물에서만 생성되는데 지금까지 알려진 바로는 폴리고넘 커스피다툼(Polygonum cuspidatum ), 유칼립투스, 스코틀랜드 전나무 (Scottish pine), 가문비 나무 (spruce), 포도, 땅콩(Arachis hypogaea), 백합 (lily) 등이 있다. 이들 식물 중 스틸벤계 화합물은 스틸벤 합성효소 (stilbene synthase)에 의해 말로닐 코 에이(malonyl-CoA)와 쿠마로일 코 에이(p-coumaroyl-CoA) 혹은 시나모일 코 에이 (p-cinnamoyl-CoA)로부터 합성되며, 곰팡이, UV, 오존과 같은 외부 환경 스트레스로부터 그 합성이 유도된다고 보고되어 있다 (Schoeppner and Kindl H, 1979; Fliegmann et al., 1992; Fritzemeier et al., 1983; Vornam et al., 1988). 최근에는 스틸벤계 화합물의 생합성 메카니즘 및 조절과 관련하여 분자적·유전자적 수준에서 다각적인 연구가 이루어지고 있다. 그 결과 소나무, 포도, 땅콩 등에서 상기 화합물의 생합성에 관여하는 유전자가 분리되었으며(Sparvoli et al., 1994; Preisig-Muller et al., 1999; Schubert et al., 1997), 유전자의 발현 및 그 조절에 대한 많은 정보가 축적되었다.

한편, 지금까지는 상기 스틸벤 화합물의 항 스트레스 작용 및 스트레스 저항성을 이용하여 스틸벤 화합물을 코딩하는 유전자를 특정 작물에 도입하여 얻은 항진균, 항균, 항 바이러스, 항충 등 내병성 형질전환체 작물의 개발이 보고되었다 (Langcake et al., 1979; Kindle et al., 1999; Hain et al., 1998; Schroder et al., 2000). 특히, 대한민국 특허공개공보 제 1993-11817호에는 구충제로서의 스틸벤 화합물의 용도를 개시하고 있다. 그러나, 최근 포도주에서 소나무에서와 유사한 스틸벤계 화합물인 트랜스-레스버라트롤(trans-resveratrol)이 발견되었고, 적절한 포도주의 섭취는 관상동맥 심장병 (coronary heart disease (CHD))에 의한 사망율을 낮춘다는 역학 보고가 나온 이후, 스틸벤의 약리 효과에 대한 많은 실험 결과가 발표되기 시작하였다(Siemann and Creasy, 1992). 특히, 적포도주의 섭취는 혈액 내 항산화 활성을 증가시키고 이로 인해 산화성 LDL(low density lipoprotein, 저밀도지방단백질)의 생성이 억제된다는 보고들이 주목을 받았다 (Maxwell et al., 1994; Fuhrman et al., 1995). 가장 최근에는 이 물질의 항 돌연변이 및 항암작용에 대한 연구 결과가 많이 보고되었다(Carbo et al., 1999; Clement et al., 1998; Huang et al., 1999). 특히, 대한민국 특허공개공보 제 2001-70841에는 작약씨로부터 얻은 스틸벤계 화합물인 항암 및 항돌연변이성 트랜스-레스버라트롤을 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허공개공보 제 2001-33031호에는 작약씨로부터 얻은 레스베라트롤의 골질환 치료제로서의 용도를 개시하고 있다.

그러나 상대적으로 소나무의 스틸벤계 화합물의 약리 기능에 대한 연구는 그리 활발히 수행되지 못하였다. 특히 스틸벤계 화합물의 합성에 관여하는 유전자의 분리와 상기 유전자의 환경 스트레스에 의한 발현 조절에 대한 보고들은 다수 있으나(Raiber,S., Schroder,G. and Schroder,J."Molecular and enzymatic characterization of two stilbene synthases from Eastern white pine(Pinus strobus)". FEBS Lett . 361 (2-3), 299-302 (1995); Toshio Yamaguchi et al., "Cross-reaction of Chalcone Synthase and Stilbene Synthase Overexpressed in Escherichia coli", FEBS Lett. 460 (1999) 457-461), 환경 스트레스를 유발하는 다양한 인자를 정량적으로 처리하거나 또는 이들 환경인자를 복합적으로 처리한 예는 보고된 바 없으며, 무엇보다도 상기 환경인자를 활용하여 고기능성 솔잎 추출물 소재를 제조한 경우는 전무하다.

따라서, 본 발명의 목적은 다양한 환경인자를 솔잎에 정량적으로 처리하여 스틸벤계 화합물의 합성에 관여하는 유전자의 발현을 조절함으로써 스틸벤계 화합물을 대량생산하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 솔잎 추출물 소재에 포함된 항암 및 항염증 활성이 있는 스틸벤계 화합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품, 화장품 및 의약품용 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 솔잎에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 처리하여 솔잎 내 스틸벤계 화합물인 피노실빈의 합성에 관여하는 유전자의 발현을 유도하고, 이를 통해 상기 스틸벤계 화합물의 함량이 증강된 솔잎추출물을 제조하여 상기 추출물에 포함된 스틸벤계 화합물인 피노실빈의 항암 및 항염증활성을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 발명의 구성에서 구체적으로 설명한다.

본 발명은 솔잎에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 처리하여 스틸벤계 화합물의 합성에 관여하는 유전자의 발현 유도단계; 다양한 환경인자에 의해 증가된 스틸벤계 화합물을 포함하는 솔잎추출물의 제조단계; 상기 추출물에 포함된 스틸벤계 화합물의 항암 및 항염증 활성을 조사하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 다양한 환경인자 처리에 따른 솔잎 유래의 스틸벤 합성효소의 코딩유전자의 발현 조절

환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 솔잎에 처리하였을 때 솔잎 스틸벤계 화합물의 발현 유도를 알아보기 위해, RT-PCR(Reverse Transcriptional Polymerase Chain Reaction)을 실시하여 스틸벤 합성효소(stilbene syntase)를 코딩하는 유전자(stsy)의 발현을 조사하였다. 우선, 소나무를 일주일 동안 순화시킨 다음 솔잎만을 분리하여 다양한 조건의 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 처리를 하였다. 즉, UV, 75 mM Al₂Cl₃, 효모추출물(0.1%, 0.5%), UV + 75 mM Al₂Cl₃, UV + 효모추출물(0.1%, 0.5%), UV + O₃, 0.5 M NaCl, 4℃. 처리 후 솔잎을 깨끗하게 준비하여 액체 질소에서 급냉시켜 분말로 만든 다음 RNA를 분리하였다. RT-PCR을 이용하여 스틸벤 합성효소(stilbene synthase)를 코딩하는 유전자의 환경인자에 따른 발현 정도를 확인하여 도 1에 나타내었다.

도 1(a)에 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 자외선, 오존, 효모추출물 등 상기 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 처리한 솔잎에서 스틸벤 합성 유전자의 발현이 증가됨을 확인하였다.

실험예 1 : 다양한 환경인자의 처리에 따른 솔잎 유래의 피노실빈의 함량 조사

다양한 환경인자의 처리에 따른 솔잎 유래의 피노실빈의 함량을 HPLC를 이용하여 조사하였다. 우선, 소나무를 일주일 동안 순화시킨 후 솔잎만을 분리하여 다양한 조건의 환경인자를 실시예 1의 방법에 따라 처리한 다음 솔잎추출물을 제조하였다. 상기 추출물을 메탄올에서 초음파 분쇄하여 원심분리한 다음 상층액만 모아 증류시켰다. 상기 용액에 헥산(n-hexane)을 넣고 다시 원심분리하여 상층액은 버리고 펠렛은 메탄올로 희석시켜 샘플로 사용하였다. HPLC의 이동상은 A: 물 B: 메틸알콜(Me-OH) C: 아세트산 init = A: 60%, B: 35%, C: 5% 25 분 = A: 10%. B: 85%, C: 5%로 기울기 용매를 사용하였으며, 유속은 1.0 mL/min 이었으며, 칼럼은 조벡스 C18(zorbex C18) 역상 칼럼을 사용하였다.

도 1(b)에 나타난 바와 같이, 오존, Al₂Cl₃ _, 자외선, 0.1%와 0.5% 효모추출물을 단독처리한 실험군에서 무처리 대조군에 비해 전체적으로 피노실빈의 함량이 증가하였으며, 특히 0.5% 효모추출물과 오존을 처리한 군에서 피노실빈의 함량이 높았다.

실험예 2: 환경인자의 단독처리와 복합처리에 따른 솔잎 내 피노실빈의 함량 비교

환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 소나무 유묘에 실시예 1의 방법에 따라 단독 혹은 복합 처리하여 피노실빈의 함량을 조사하였다.

도 2에 나타난 바와 같이, UV와 O₃ _,Al₂Cl₃ _,0.1%와 0.5% 의 효모추출물과의 동시에 처리한 군이 단독 처리군과 비교하여 대체적으로 피노실빈의 함량이 높았으며, UV + 0.5% 효모추출물을 복합 처리한 군에서 피노실빈의 함량이 가장 높았다.

실험예 3: 0.5% 효모추출물의 처리에 따른 소나무 유묘와 성숙된 소나무의 솔잎의 피노실빈의 함량 비교

실험예 1과 2의 결과에서 0.5% 효모추출물을 처리한 솔잎에서 피노실빈 함량이 가장 높으므로 이를 소나무 유묘와 성숙된 소나무의 솔잎에 24시간 처리하여 피노실빈의 함량을 비교하여 보았다.

도 3에 나타난 바와 같이, 소나무 유묘의 경우에는 대조군보다 처리군의 피노실빈 함량이 약 3배 정도 많은 것을 확인했으나, 성숙된 소나무 솔잎 경우에는 대조군과 실험군의 함량 차이가 많이 나지 않았다. 또한 소나무 유묘와 성숙된 소나무 솔잎의 대조군의 피노실빈 함량을 비교한 결과, 성숙된 소나무 솔잎에서 피노실빈의 함량이 많은 것으로 보아, 성숙한 소나무 솔잎이 피노실빈을 더 많은 함량으로 함유하는 것으로 보였다. 그러나, 성숙한 소나무 솔잎에 비해 환경인자에 의해 자극을 받은 유묘 솔잎에서 피노실빈의 함량이 더 많은 것은 품종에 따라 또는 자극을 많이 받았던 성숙된 소나무 솔잎의 상태에 따라 전체적으로 약간 감소하는 것으로 생각된다.

실험예 4: 자외선 조사 처리 시간에 따른 피노실빈의 함량 비교

실험예1과 2에서 오존과 자외선을 동시에 처리할 경우 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 함량이 증가하였으므로 오존을 동시에 처리하면서 자외선 조사시간에 따른 피노실빈의 함량을 조사하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 자외선 조사시간이 길수록 피노실빈의 함량은 증가하였다.

실시예 2: 소나무 유래의 피노실빈의 항암 및 항염증 활성 조사

스틸벤계 화합물인 레스베라트롤의 항암활성은 이미 밝혀져 있는 바, 본 발명 솔잎추출물로부터 얻은 스틸벤계 화합물인 피노실빈의 항암 및 항염증 활성을 조사하였다.

실험예 1: 암세포주에 대한 세포 독성시험

여러 종류의 암세포주 (A549; 인간유래의 폐암세포주, Col2; 인간유래의 결장암세포주, SNU-638; 인간유래의 위암세포주, Hepa1c1c7; 쥐유래의 간암세포주, RAW264.7; 쥐의 대식세포)를 10% FBS 및 항생제-항진균제가 첨가된 배지에 5×10⁵ cells (10 mm dish)로 플레이팅한 후 24시간째에 여러 농도의 피노실빈을 가한 후 SRB (sulforhodamin B) 분석을 통해 시간 경과에 따른 세포성장을 측정 비교하였다. 측정결과는 표 1에 나타내었다.

실험예 2: 인간유래의 폐결장암세포주에서 세포독성 시험

사람 암 세포주중 폐결장암(HT29) 세포를 10% FBS, antibiotics-antimycotics가 첨가된 RPMI1640, MEME, DMEM 배지로 2.5 x 10⁴cells/mL이 되게 희석한 후 테스트 플레이트(test plate)에 200 ㎕ 씩 가했다. 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 배양 후 새 배지로 갈아주고 피노실빈을 농도별(0, 1, 5, 10, 25 및 50 ㎍/mL)로 1 ㎕씩 가하고 3일 동안 배양한 후 5 mg/mL MTT를 배지에 넣어 최종 10배 희석되게 하였다. 4시간 동안 37℃, 5% CO₂배양기에서 배양한 후 배지를 제거하고 DMSO 1 mL을 넣어 웰(well)에 고착된 포마잔 결정(formazan crystal)을 녹였다. 이를 96-웰 플레이트에 옮겨 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 농도에 따른 세포의 성장 저해 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 피노실빈의 처리 농도가 증가할 수록 폐결장암 세포주(HT-29)의 성장은 농도의존적으로 억제됨을 볼 수 있었다.

실험예 3: COX-2 억제 활성 효과 측정

본 발명 솔잎 유래 피노실빈의 COX-2에 대한 효과를 알아보기 위해, 마우스 대식세포인 RAW264.7 세포를 10% FBS-DMEM으로 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 1주일에 두 번 계대배양하고, RAW264.7 세포를 10% FBS-DMEM에 현탁하여 10×10⁵ cells/mL로 조정하였다. 상기 현탁액에 최종 농도가 500 μM이 되도록 아스피린을 첨가하여 세포에 잔존하는 COX 효소의 활성을 비가역적으로 억제하였다. 상기 세포 현탁액을 96-웰 플레이트에 각 웰 당 200 ㎕ 씩 가하고 4시간 동안 배양하여 부착시켰다. 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하고, 세포가 부착되어 있는 각 웰에 1 ㎍/mL의 LPS를 함유한 10% FBS-DMEM 200 ㎕ 씩을 넣었다. 이 때, 대조군에는 LPS가 없는 배지를 가하였다. LPS가 포함된 배지로 교환한 후 곧바로 검색 시료를 처리하여 16시간 동안 배양한 후 그 상층액을 취하여 유리된 프로스타글란딘 양을 효소면역분석법으로 정량하고. 항-PGE2 항체가 부착되어 있는 플레이트의 각 웰에 회수한 상층액과 함께 PGE2-아세틸콜린스테라아제 트랙터(PGE2-acetylcholinesterase tracter)를 넣어 상온에서 18시간 배양하였다. 그 후, 웰에 남아 있는 용액을 씻어낸 후 0.05% Tween 20-인산염 완충용액으로 각 웰을 5회 세척한 다음 Ellman 시액 200 ㎕를 각 웰에 가하고 7시간 배양한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE2 표준품으로 검량선을 작성하여 각 시료 처리한 배양액 중의 PGE2 생성량을 구하였다. 100% 활성은 LPS를 처리한 군과 처리하지 않은 군에서 생성된 PGE2의 차이를 기준으로 하여 각 시료의 억제율을 구하였다. 그 결과를 표 1과 도 6에 나타내었다.

화합물	세포독성실험(IC₅₀:㎍/mL)					COX-2 분석(IC₅₀:㎍/mL)
화합물	A549	Col2	SNU-638	Hepa1c1c7	RAW264.7
셀레콕시브(celecoxib)						0.3 ng/mL
피노실빈	17.70	5.61	5.27	3.65	5.33	0.86
엘립티신(ellipticine)	0.30	0.46	0.40	0.07
레스버라트롤	7.36	25.00	25.00	4.04	> 20	0.76
비고	인간유래의 폐암세포주	인간유래의 결장암세포주	인간유래의 위암세포주	쥐유래의 간암세포주	쥐의 대식세포

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 솔잎 유래의 피노실빈은 인간유래의 폐암세포주를 제외한 다른 암세포주에서 항암물질로 알려진 레스버라트롤 보다 낮은 농도에서 세포의 성장을 억제하였으며, COX-2 분석 결과에서도 항염증 활성은 레스버라트롤과 거의 유사하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, LPS에 의해 과발현된 COX-2에 기질인 아라키돈산(Arachidonic acid)과 피노실빈을 처리하여 피노실빈의 COX-2 효소 자체에 대한 억제 작용을 확인한 결과, 최고 농도인 100 μM에서 91.1% 의 저해율을 나타내었고 농도의존적으로 PGE₂ 생성을 저해함을 알 수 있었다. 따라서 피노실빈은 COX-2 효소 자체에 대한 억제 작용을 나타냄을 알 수 있었다.

실험예 4: Inducible nitric oxide synthase ( iNOS ) 억제 효과 검색

본 발명 솔잎 유래의 피노실빈을 마우스 대식세포에 처리하여 LPS에 의한 NO 생성 저해 활성을 검색하였다.

RAW264.7 세포에 페놀레드(phenol red)가 들어 있지 않은 10% FBS-DMEM을 첨가하여 50 x 10⁴ cells/mL이 되게 한 후 24-웰 플레이트의 각 웰 당 1 mL 씩 가하여 24시간 동안 배양하여 부착시켰다. 세포를 PBS로 1회 세척한 다음, LPS 1 ㎍/mL을 포함한 FBS가 없는 배지로 교환하고 동시에 시료를 가하여 20시간 동안 배양하였다. 상층액을 회수하여 96-웰 플레이트에 각 웰 당 배양액 100 ㎕씩 넣고 그리스(Griess) 시약을 180 ㎕씩 가해 10분간 가볍게 흔들어 준 후 ELISA 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. NaNO₂를 표준품으로하여 검량선을 작성하여 각 시료를 처리한 배양액 중의 NO 생성량을 구하였고 이로부터 각 시료 처리군에서의 저해 활성을 측정하였다.

또한, RAW264.7 세포의 LPS에 의한 NO 생성 저해 활성 검색시 실험 조건에서 시험물질이 세포성장에 영향을 미치는지를 알아보기 위하여, 실험한 24-웰 플레이트에 PBS에 녹인 MTT를 최종농도가 500 ㎍/mL이 되도록 가하고 4시간 동안 배양하였다. 그 다음 배양액을 제거하고 생성된 포마잔을 각 웰 당 100% DMSO 1 mL을 넣어 녹인 후 200 ㎕씩 96-웰 플레이트에 옮겨 ELISA 리더를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. LPS와 DMSO를 처리한 군을 대조군으로 하여 시료처리군의 % 생존율을 구하였다.

시료	50 μM에서 억제율%	50 μM에서 생존율%
레스버라트롤	59.7¹⁾	>100
피노실빈	49.1¹⁾	>100

¹⁾ IC₅₀ ; 피노실빈 52.0 μM: 레스버라트롤 37.5 μM

표 2에 나타난 바와 같이, LPS처리에 의해 유도된 iNOS의 활성에 대한 검색시료의 영향을 알아보기 위해 배지내로 유리된 NO양을 Griess reagent로 비색 정량한 결과, 피노실빈의 iNOS 억제 활성농도는 레스버라트롤보다 다소 낮았다.

실험예 5: 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 웨스턴 블랏팅에 의한 COX-2 단백질 발현에 미치는 효과

본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 COX-2 단백질의 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해 웨스턴 블랏팅을 실시하였다. 우선, RAW264.7 세포수를 50 x 10⁴cells/mL로 하여 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 현탁시킨 다음 60 mm 디쉬에 디쉬 당 50 x 10⁵cells로 하여 부착시키고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 2회 세척하고 혈청을 포함하지 않는 DMEM에 시험물질과 LPS(1 ㎍/mL)를 동시에 처리하여 12시간 동안 배양하였다. 그 다음 세포를 PBS로 2회 세척하고 끓는 라이시스 버퍼(lysis buffer, 250 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8), 4% SDS. 10% 글리세롤. 0.006% 브로모페놀 블루, 2% β-머캅토에탄올)를 각 디쉬당 1 mL씩 가하여 세포를 용해시켜 모으고 5분간 끓여 단백질을 변성시켰다. 단백질 양을 BCA 법을 이용하여 정량한 다음 그 중 50 ㎍을 8% 아크릴아마이드 젤을 이용하여 2시간 동안 전기 영동하여 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF(Polyvinylidenedifluoride) 멤브레인에 1시간 20분 동안 트랜스퍼한 다음, 멤브레인을 메탄올과 증류수로 번갈아 세척한 후 공기 중에서 완전 건조시켰다. 건조된 멤브레인을 1/1500으로 희석된 래빗 폴리클로날 콕스 2의 항체(rabbit polyclonal COX-2 antibody), 1/2000으로 희석된 마우스 모노클로날 베타 액틴의 항체(mouse monoclonal β-actin antibody) 및 3% 무지방 분유(non-fat dry milk)가 함유된 PBS 용액에 넣고 상온에서 1시간 30분 동안 배양하였다. 배양 후 멤브레인을 0.1% Tween-20이 함유되어 있는 PBS(PBST)로 5분간 2회 세척하고, 2차 항체 (COX-2는 HRP-conjugated goat anti-rabbit-immunoglobulin G, β-actin은 HRP-conjugated goat anti-mouse-immunoglobulin G임)로 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음 PBST로 5분간 2회 세척하고 ECL(Enhanced chemiluminescence detection system)을 사용해서 검출하였다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, 피노실빈은 LPS에 의해 유도된 COX-2 효소의 발현을 저해하지 못했고 LPS를 처리하지 않은 군에서도 COX-2 효소의 단백질 발현이 된 것으로 보아 피노실빈 자체가 효소을 유도하는 작용이 있음을 알 수 있었다. 이는 COX-2 분석(활성모델)에서, 효소에 대한 직접적인 저해 활성에 의한 네거티브 피드백(negative feedback)일 것으로 보인다.

실험예 6: RT- PCR 법을 이용한 COX-2 및 iNOS mRNA 발현에 미치는 영향 연구

본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 COX-2 및 iNOS mRNA 발현에 미치는 영향을 RT-PCR에 따라 조사하였다. 우선, RAW 264.7 세포수를 5 x 10⁵cells/mL로 하여 10% FBS를 함유한 DMEM 배지에 현탁시킨 다음 100 mm 디쉬에 디쉬 당 5 x 10⁶cells로 하여 부착시키고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 2회 세척하고 5% FBS-DMEM에 시험물질과 LPS(1 ㎍/ml)를 동시에 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 디쉬에 TRI 시약 (시그마사)를 1 mL씩 가하여 세포를 용해시키고, 클로로포름과 이소프로판올을 이용하여 RNA를 추출한 다음, 260 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA의 농도 및 순도를 결정하였다. RT 시스템(프로메가사)을 이용하여 RNA 1 ㎍을 cDNA로 역전사시킨 다음 그 중 1 ㎍을 Taq DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 반응 조건은 COX-2의 경우 94℃에서 45초간 변성시킨 후 매 사이클 당 94℃에서 15초, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분이 되도록 조정하여 총 30 사이클을 수행하였고, 베타 액틴(β-actin)은 25 사이클을 수행하였다. PCR 생성물은 2% 아가로우즈 젤로 90V, 45분을 전기영동시킨 다음 SyBR Gold로 1시간 동안 염색시킨 후 관찰하였다. 사용된 프라이머는 표 3과 같다.

표적 유전자	프라이머	Sequences	생성물의 크기(bp)
COX-2	센스	5'-GGAGAGACTATCAAGATAGTGATC-3'	861
COX-2	안티센스	5'-ATGGTCAGTAGACTTTTACAGCTC-3'	861
베타 액틴	센스	5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3'	514
베타 액틴	안티센스	5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3'	514

도 8에서 나타낸 바와 같이, 피노실빈은 COX-2 mRNA 수준에서 최고 농도인 20 ㎍/mL에서 오히려 발현을 유도하는 것으로 보이며 농도에 따른 경향성은 보이지 않았다. 그러므로 피노실빈의 COX-2 분석(유도 모델)에 대한 활성이 COX-2 mRNA 발현을 저해하는 메카니즘은 아니라는 것을 알 수 있었다.

이상의 실시예와 실험예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명은 솔잎에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 인자를 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시켜 스틸벤계 화합물을 대량생산하는 방법을 제공하는데 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명 솔잎 유래의 스틸벤계 화합물인 피노실빈은 항암 및 항염증 활성이 있어 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강음료, 식품, 화장품 및 의약품용 조성물로 제조될 수 있어 기능성식품제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 다양한 환경인자로써 자외선, 오존, Al₂Cl₃ 및 효모추출물을 솔잎에 처리함에 따른 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현 변화를 보여주는 RT-PCR 분석 결과를 나타낸 사진도(a)와, 사진에서 보이는 밴드의 밝기를 비교하여 상대적인 발현 양을 나타낸 그래프이다(b).

도 2는 다양한 환경인자로써 자외선, 오존, Al₂Cl₃ 및 효모추출물을 솔잎에 단독처리 혹은 복합처리에 따른 본 발명 솔잎추출물의 피노실빈의 함량변화에 대한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 0.5% 효모추출물 처리에 따른 소나무 유묘와 성숙한 소나무의 솔잎 내 피노실빈의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 자외선 조사 시간에 따른 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈 처리에 따른 인간 유래의 폐결장암 세포인 HT-29의 성장 저해 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 항염증 연구를 위한 COX-2 활성모델에서, 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 PEG2 생성에 대한 농도의존적 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 COX-2 단백질 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 사진도이다.

도 8은 본 발명 솔잎 유래의 피노실빈의 COX-2 발현에 미치는 영향을 유전자 수준에서 확인한 RT-PCR 결과를 나타낸 사진도이다.

Claims

솔잎 유래의 항염증 활성이 있는 피노실빈을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항염증제용 조성물.