KR20050112444A

KR20050112444A - 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계를 이용한항암물질의 활성 측정 방법

Info

Publication number: KR20050112444A
Application number: KR1020040037541A
Authority: KR
Inventors: 구효정; 이정원; 김성윤; 심창구; 정석재
Original assignee: 구효정
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2004-05-25
Publication date: 2005-11-30
Also published as: KR100689107B1

Abstract

본 발명은 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계(multicellular layer, 이하 "MCL"로 칭함)를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법에 관한 것으로, 구체적으로 고형암에 유효한 항암 후보물질의 발굴을 위한 검색계 중의 하나인 다층 암세포 배양계 모델을 세포독성 분석(cytotoxicity assay) 방법과 결합시킴으로써 항암제의 조직 투과 후 항암활성을 직접 평가할 수 있도록 설계한 항암물질의 활성 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법은 항암 물질의 암조직 투과성을 정량하는 기존의 방법과는 달리, 생물학적 방법을 이용하여 항암제의 암조직 투과후 활성을 실제로 분석하기 때문에 고형암에 대한 새로운 항암제 혹은 항암병용요법의 효능을 검색하거나 평가하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법{Method of determination of anticancer activity using multicellular layer in conjunction with cytotoxicity assay}

본 발명은 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계(multicellular layer, 이하 "MCL"로 칭함)를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법에 관한 것으로, 구체적으로 고형암에 유효한 항암 후보물질의 발굴을 위한 검색계 중의 하나인 다층 암세포 배양계 모델을 세포독성 분석(cytotoxicity assay) 방법과 결합시킴으로써 항암제의 조직 투과 후 항암활성을 직접 평가할 수 있도록 설계한 항암물질의 활성 측정 방법에 관한 것이다.

항암신약이나 새로운 항암화학요법을 개발하기 위한 전임상 연구의 핵심은 항암활성을 정확하고 신속하게 평가하는 데에 있다. 새로운 항암제 및 항암화학요법을 개발하기 위해서는 비용 및 신속성의 면에서 시험관(in vitro) 실험계가 생체내(in vivo) 실험계에 비해 경제적이고 우수하지만, 시험관 실험계에 있어서 효능평가의 유효성은 상기 실험계가 생체내 상황을 충분히 대변하여 임상적으로 의미있는 효능이 검증될 수 있는지의 여부에 달려있다. 현재까지 전임상 개발 단계를 거쳐 임상시험에 진입한 항암 후보물질들의 약 90%가 최종개발에 실패하였는데 이는 적절한 실험계의 부재로 인해 임상 효능의 가능성을 지닌 화합물의 발굴에 실패했기 때문이다(Staquet M.J. et al., Cancer Treat Rep:67, 753-765, 1983; Twentyman P.R., Ann Oncol:5, 394-396, 1994; von Hoff D.D., Clin Cancer Res:4, 1079-1086, 1998).

지금까지 널리 쓰이고 있는 시험관 내 화학감수성 분석방법(in vitro chemosensitivity assay)으로는 콜로니 형성 분석법(clonogenic assay), 염료 배제 분석법(dye exclusion assay), MTT 분석법(tetrazolium salt 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay) 또는 SRB 분석법(sulforhodamine B assay)이 있다. 상기한 방법은 항암신약개발에 있어서 대량검색 (high-throughput)이 필요한 1차 스크리닝계로서는 의미가 있으나, 인체 고형암의 생체내 조건과는 조건이 매우 달라서, 고형암에 대한 반응률을 예측하기에는 무리가 있다. 고형암의 경우, 항암화학요법제에 대한 반응률이 낮은 이유는 고형암 세포의 삼차원적 조직화와 다세포계(multicellular system)에서 기인하는 세포간 및 세포와 세포간질(extracellular matrix, ECM)간의 상호작용 등이 항암약물의 암조직내 침투저하 및 조직내 농도 저하를 가져오는 등의 여러 기전으로 말미암아 약물에 대한 내성을 유발하기 때문으로 알려져 있다(Wolfgang M.K., Crit Rev Oncol Hematol:36, 123-139, 2000; Bernard D. et al., Crit Rev Oncol Hematol:36, 193-207, 2000).

상기한 고형암세포의 약물투과 장애 및 암세포의 구조적 특성에 기인한 항암제의 문제점을 해결하기 위하여, 그간 많은 학자들이 실제 생체 내에서 고형암의 내성의 원인이 되는 고형암의 특성을 최대한 반영하는 시험관 실험계 모델을 제작하여 항암 후보물질의 전임상 효능검색계로서 실제 임상 결과를 보다 정확히 예측하고자 노력하였다.

초기모델로서 구형 다세포계(multicellular spheroid ; MCS) 모델이 Inch 등에 의해 처음 보고되었는데(Inch W. R. et al., Growth:34, 271-282, 1970), 상기 모델은 Hoechst 33342등을 이용한 간접적 방법으로 고형암 세포 부위에 따른 성장필수성분의 농도, 산소분압, 약물농도, 세포성장속도 및 성장분율의 차이에 초점을 맞춘 실험계로서 고형암에서 약효결정과 관련된 분자유전학적 인자들의 발현 연구 주로 이용되는 실험계이다. 이후, 다층 암세포 배양계(multicellular layer, MCL)가 Cowan 등에 의해 처음으로 개발되어(Cowan D. S. et al., Br J Cancer Suppl:27, S28-31, 1996), 많은 학자들에 의해 변형되거나 단순화되어 약물의 투과장애, 투과에 따른 약물 대사 및 약물의 비활성화의 비교 등의 연구에 유용하게 이용되어 왔다.

1990년대 말 Cowan등이 처음으로 MCL을 이용하여 DNA 인터컬레이터(intercalator)들의 암조직 투과성이 낮다는 사실을 보고한 이후, Tannock 등은 MCL과 쥐 이종이식암조직에서 여러 ECM(extracellular matrix) 성분들의 발현이 유사함을 보이고 MCL에서 항암제의 조직투과성이 세포주와 약물에 따라 특이적임을 밝혔다(Tannock I. F. et al., Clin Cancer Res:8, 878-884, 2002). 또한 Phillips 등은 약물에 따라 MCL 투과능에 차이가 있으며, 이를 좌우하는 요인의 하나는 세포내 약물의 대사임을 밝혔다(Phillips R. M. et al., Br J Cancer:77, 2112-2119, 1998). Hicks 등은 MCL을 이용하여 DNA 인터컬레이터 중 하나인 DAPA의 투과 장애 이유가 라이소좀(lysosome) 내 약물 포획임을 증명하였다(Hicks K. O. et al., Br J Cancer:76, 894-903, 1997). 또한, Hicks등은 MCL 투과를 수학적으로 모델링하고 이를 생체내(in vivo) 약물동태(Pharmacokinetics, PK) 모델과 결합하여 생체내에서 암조직내 약물 농도를 예측할 수 있도록 하여, 우수한 DNA 인터컬레이터의 설계에 응용할 수 있음을 보고하였으며(Hicks K. O. et al., J Pharmacol Exp Ther:297, 1088-1098, 2001), 고형암 조직 내부의 저산소분압 부위에서 활성을 발휘하는 하이포톡신(hypotoxin)인 티라파자민(tirapazamine)의 활성이 암조직 내로의 침투거리가 길어질수록 감소한다는 연구 결과를 바탕으로 시험관내(in vitro) MCL 투과 모델-생체내(in vivo) PK-실제 암조직내 혈관 기하 등을 연계하여 암조직 내 약물 농도를 예측할 수 있는 모델을 만들었다(Hicks K. O. et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys:42, 641-649, 1998). 즉, 우수한 하이포톡신(hypotoxin) 후보물질의 특성 조건을 제시함으로써 신약개발 과정에 있어서 정보 피드백 방법으로서 MCL의 가능성을 증명하였다(Hicks K. O. et al., Cancer Res:15, 5970-5977, 2003; Hicks K. O. et al., Proceedings of the Ninety fourth AACR Annual Meeting, Washington, D.C., American Association for Cancer Research, 2003 Jul 11-14; Wilson W. R., Proceedings of the Ninety fourth AACR Annual Meeting, Washington, D.C., American Association for Cancer Research, 2003 Jul 11-14).

상기 방법들을 이용한 항암약물의 고형암 조직의 투과 및 투과후 활성 평가는 약물의 농도를 직접 정량하는 방법이기 때문에, 신약 개발 단계의 스크리닝 대상 화합물들에 대해서는 비용이나 시간 면에서 큰 어려움이 따랐다. 따라서, 본 발명자들은 항암제의 조직투과후 항암활성을 직접 평가할 수 있는 새로운 생물학적 평가방법(bioassay)의 적용시킨다면 기존의 MCL 방법의 일부 단점들이 보완되어 항암제 신약개발에 있어서 경제성과 응용성이 크게 증가할 것으로 기대하였다.

이에, 본 발명자들은 고형암에 유효한 항암후보물질 발굴을 위한 검색계로서 인체 직장결장 암세포주 DLD-1을 이용한 MCL 모델을 세포독성 분석법(cytotoxicity assay)과 결합시킴으로써 항암제의 조직 투과 후 항암활성을 직접 평가할 수 있도록 설계한 항암물질의 활성 측정 방법을 개발하였으며, 임상에서 직장결장암에 쓰이는 항암제를 모델 항암약물로 선정하여 이들의 암세포 조직 투과후 활성을 효과적으로 측정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고형암에 유효한 항암 후보물질의 발굴을 위한 검색계 로서, 다층 암세포 배양계 모델을 세포 독성 분석(cytotoxicity assay) 방법과 결합시켜 항암제의 조직 투과 후 항암활성을 직접 평가할 수 있도록 설계한 항암물질의 활성 측정 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법을 제공한다.

상기의 항암물질의 활성 측정은 i) 다층 암세포 배양계(multicellular layer)를 수립하는 단계; ii) 항암물질을 상기 단계 i)의 다층 암세포 배양계에 투과시키는 단계; iii) 투과 후의 배지를 단층의 암세포에 처리하여 생존율을 측정함으로써 약물의 세포독성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기에서 세포독성을 측정하는 단계는 단층(monolyer)의 암세포를 이용한 항증식 활성을 SRB 분석방법(sulforhodamine B assay)으로 측정함으로써 수행한다. 즉, 암세포주를 단층 세포(monolayer)로 배양하여, 다층 암세포 배양계를 통과한 다양한 농도의 항암물질에 일정 시간 노출시킨 후 SRB 분석법을 이용하여 세포독성 효과를 결정한다.

또한, 본 발명은 상기 항암 물질의 활성 측정 방법에 있어 사용되는 다층 암세포 배양계를 수립하는 방법을 제공한다.

상기 다층 암세포 배양계(multicellular layer)는 i) 트랜스웰 인서트(Transwell insertⓡ, Corning Costar, Acton, MA)의 상부 쳄버(top chamber, TC)에 계대 배양한 암세포주를 접종하는 단계; ii) 접종한 암세포주를 부착시키는 단계; 및 iii) 하부 쳄버(bottom chamber, BC)에 배지를 첨가하고 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하는 단계로 수립된다.

상기에서 암세포주는 위암세포주, 폐암세포주, 간암세포주, 자궁암세포주 또는 유방암세포주 등의 고형암 세포주를 사용할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 인체 직장결장암 세포주인 DLD-1을 사용한다.

상기 배양된 DLD-1을 이용하여 다층 암세포 배양계를 수립한 결과, DLD-1세포주는 MCL이 성공적으로 형성되었으며, 세포간 통로(Paracellular pathway)로 통과하는 대표적 물질인 만니톨로 투과도를 확인한 결과, 5일과 8일 배양시에는 배양일에 따른 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한, DLD-1은 데스모좀(Desmosme) 이외의 다른 세포간 연결통로(cell junction)는 형성하지 않으므로 기존에 알려진 다른 암세포주에 비하여 형성된 MCL이 높은 투과율을 나타낸다. 즉, 인체 위장관암세포주인 Caco-2는 단층 배양시 잘 발달된 세포간 연결 복합체(junctional complex)가 형성되는 세포주로서 단층으로 배양했을 때 만니톨(5.4 μM) 투과율이 0.25%/h/cm² 이하로 보고된 반면(Riley S. A. et al., Biochim Biophys Acta:1066, 175-182, 1999; Maeng H.J, et al., J Pharm Sci:91, 2614-2621, 2002), 본 발명의 8 일 배양한 DLD-1 MCL에서의 만니톨 투과율은 약 22.4%/h/cm² 정도로 높게 나타났다. 상기한 결과로부터 8 일 배양된 MCL을 이용하면 각 항암 물질의 활성이 측정가능하다.

한편, 항암물질의 일종인 파클리탁셀(paclitaxel, 이하 "PTX"로 약칭함)의 경우에는 만니톨보다 낮은 투과도를 보이는데, 이는 본 발명에서 수립한 MCL이 약물 특이적인 투과 저해를 나타냄을 제시하는 것이다. 또한, PTX의 투과도는 약물농도를 높임으로써 개선되었는데(도 3 참조), 이는 고농도 PTX의 세포독성에 의한 MCL의 구조적 변화에서 기인한 것으로 생각된다.

본 발명의 8 일 배양한 DLD-1 MCL(두께 45 ㎛)에서 6 시간 동안 10 μM PTX의 투과도는 22.3%로 이는 다른 연구자들의 이전 측정값(i.e., 5.9%)보다 높았으며, 쥐 유선암 세포주인 EMT-6의 MCL(200 ㎛)과 인간 방광암 세포주인 MGH-U1의 MCL(200 ㎛)에 6 시간 동안 각각 25 μM의 PTX를 투과시켰을 때의 투과도인 40% 및 42%에 비하여는 낮았다(Nicholson K. M. et al., Eur J Cancer:33, 1291-1298, 1997). 이는 세포수준에서 약물의 수송이나 대사에 관련하는 인자들의 발현이 각 세포주마다 다양하여 PTX의 암조직 투과도가 MCL의 두께와 주입 농도뿐 아니라 세포주의 특성에도 영향을 받기 때문으로 생각된다.

본 발명자들은 본 발명의 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법을 임상에서 사용되고 있는 몇 가지의 항암물질로 조직 투과 후 활성을 실제적으로 분석함으로써 유효성을 검증하였다.

MCL 투과에 의한 항암제의 활성 변화를 측정하기 위해 선택한 주입 약물농도는 문헌에 근거하여 임상에서의 최고 혈중농도에 근접하도록 정하였다. 그 결과, 5-플루오로우라실(fluorouracil, 이하 "5-FU"로 칭함)은 8 일 배양된 MCL을 투과해 나온 약물의 활성이 세공막을 통과한 경우의 활성보다 12.7% 증가하였는데, 이는 5-FU가 체내에서 여러 효소들의 대사에 의해 활성화된다는 사실과 일치한다(도 6 참조).

이와는 반대로 PTX는 10 μM투과시에는 차이가 없었으나 1 μM 투과시 MCL을 투과해 나온 약물의 활성이 세공막을 통과한 경우보다 24.3% 감소하였다(도 6 참조). 또한, PTX의 임상 혈중농도가 1 μM일 때 암조직내 약 45 ㎛에 위치하는 세포들에 대한 항암 활성이 바깥층에 위치하는 암세포에서보다 20.2% 감소할 것이라고 예측할 수 있는데(표 2 참조), 결과적으로 실측된 약물 투과량에 근거한 예측 활성감소율 20.2%가 실측 활성감소율 24.3%에 대하여 차이가 없으며, 이는 PTX가 시험관내 세포배양계에서 대사의 영향을 크게 받지 않는 약물이라는 사실과 일치한다.

상기한 결과들은 본 발명의 MCL 투과후 세포독성 분석법에 의하여 측정된 약물 활성이 그 약물의 유효투과도를 대변할 수 있음을 의미한다.

따라서 본 발명의 세포독성 분석법과 결합된 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법은 기존의 신약 후보 물질을 암조직 투과성을 직접 정량하는 대신 생물학적 방법과 연계한 MCL 이용의 가능성을 충분히 반영하므로, 고형암에 대한 항암제 또는 항암병용요법의 효능을 검색 평가하는데 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 하나의 예시일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 다층 암세포 배양계(Multicellular layer)의 수립

항암 물질의 암조직에 대한 투과 및 투과후 활성을 평가하기 위한 다층 암세포 배양계를 구축하기 위하여, 먼저 암세포를 배양하였다.

본 발명에서 사용한 암세포는 DLD-1(인체 직장결장암 세포주)로서 한국 세포주은행(서울, 한국)에서 분양받았다. 상기 DLD-1을 10% FBS(Sigma), 페니실린 100 unit/ml(Sigma), 스트렙토마이신(streptomycin) 100 ㎍/ml(Sigma)이 함유된 RPMI-1640(Gibco BRL, Grand Island, NY)으로 계대배양하였다. 배양기에는 5% CO₂와 95% 공기를 공급하였고, 36.5℃의 온도와 95%의 습도를 유지시켰다.

트랜스웰 인서트(Transwell insertⓡ, Corning Costar, Acton, MA)의 상부 쳄버(top chamber, TC)에 상기 배양한 2.5×10⁵개/100 ㎕의 암세포를 접종하고, 3 내지 4 시간 동안 부착시킨 후 하부 쳄버(bottom chamber, BC)에 600 ㎕의 배지를 넣어주고 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하였다(도 1의 A). TC 및 BC의 배지는 매일 교환해 주었다. 상기과정으로부터 형성된 MCL을 1 일부터 8 일까지의 배양일별로 4% 포름알데히드로 고정 하여 파라핀에 포매시킨 후, 5 ㎛ 두께로 잘라 그 절편을 헤마톡실린-에오신(H&E)으로 염색하여 MCL의 형성상태와 배양두께를 관찰하였다(도 1의 B).

그 결과, MCL로 배양된 DLD-1이 평평하고 고르게 다층의 형태로 자라는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, 세공막(Microporous membrane, pore size=0.4 ㎛)으로부터의 거리에 따라 세포의 형태에 차이가 있으며, 최상층은 세포가 납작하게 퍼진 모양을 이루면서 성장하였다. 8 일간 연속배양했을 때의 두께는 약 45 ㎛였다.

<실시예 2> MCL의 항암물질 투과효과 비교

상기 <실시예 1>에서 구축된 MCL에 있어, 약물의 투과도를 확인하기 위하여, 세포간 통로(Paracellular pathway)로 통과하는 대표적 물질인 만니톨(Mannitol) 및 항암물질인 파클리탁셀(paclitaxel, 이하 "PTX"로 약칭함)(Drug Synthesis &Chemistry Branch, DTP,NCI,Bethesda, MD)의 투과능을 5 일 및 8 일 배양한 MCL에서 비교하였다. [¹⁴C]mannitol(2 μM, Moravek) 또는 [¹⁴C]파클리탁셀(1 μM또는 10 μM, Moravek) 100 ㎕를 MCL이 배양된 트랜스웰 인서트의 상부 쳄버(TC)에 주입하고, 상기 인서트를 배지가 600 ㎕씩 분주된 24 웰 플레이트의 각 웰에 넣었다. 일정 시간마다 하부 쳄버(BC)에 투과되어 나온 분획을 채취하여 LSC 칵테일(cocktail) 2 ml에 섞은 후 액체섬광계수기(liquid scintillation counter, Packard Tri-Carb 2300 TR, Downers Grove, IL)로 투과되어 나온 양을 측정하였다. 채취 시간마다 인서트를 배지가 들어 있는 다른 웰로 옮겨 주었으며, 하기 식 1에 따라 만니톨 및 PTX의 투과율을 계산하였다.

%투과율(%/h/㎠ (식 1)

그 결과, 만니톨은 5 일과 8 일간 배양한 MCL에서 투과 4 시간째까지 투과도의 직선성을 관찰할 수 있었고, 그 누적 투과도는 각각 33.2±1.8, 29.3±6.2%로서 차이를 보이지 않았다(도 2). 또한, 24 시간 이후부터 대조군인 세포층이 존재하지 않는 인서트의 경우 93.2±11.4%가, 5 일 및 8 일간 배양한 MCL의 경우 각각 79.0± 6.2%, 79.1± 17.3% 가 유의한 차이를 보이지 않고 투과되었다. 직선성을 보이는 투과기간에 대하여 투과율을 계산한 결과, 5 일 및 8 일간 배양한 MCL에서는 각각 25.2±1.4, 22.4± 4.6 %/h/cm²였고, 세포층이 존재하지 않는 인서트의 경우 세공막만을 투과하는 투과율은 63.3±9.0 %/h/cm²였다. 따라서 이후의 실험들에 대하여는 8 일 배양된 MCL 만을 이용하였다.

또한, PTX의 MCL 투과율을 8 일간 배양한 MCL을 이용하여 10 μM과 1 μM에서 관찰하였다(도 3). 세포층이 존재하지 않는 인서트의 경우, 10 μM의 PTX의 투과도는 12 시간에 최종 평형(plateau)에 도달하였으며 투여량의 약 81.1±11.0%가 투과되었다. 8 일간 배양한 MCL을 포함하는 인서트에서 PTX 10 μM의 경우, 4시간에 10.3±4.3%가, 24시간에 59.0±9.8%가 투과되었으며, 1 μM의 경우에는 4시간에 3.8±1.7%가, 24시간에 26.7±1.5%가 투과되었다. 즉, PTX 1 μM의 경우, 4 시간 이후부터 10 μM에 비해 유의하게 낮은 투과도를 보였고(P<0.05), 72 시간째 최종 투과도도 81.5±9.8%의 PTX 10 μM에 비하여 45.1±2.1%로서 유의한 차이를 보였다(P<0.01). 상기한 결과는 5 일 배양한 MCL에서도 8 일 배양한 MCL의 경우와 유의한 차이가 없는 동일한 투과양상으로 나타났다.

상기한 결과에서 보듯이, PTX는 만니톨보다 낮은 투과도를 나타내는데 이는 본 발명의 MCL이 약물 특이적인 투과 저해가 있음을 의미한다. 또한, PTX의 투과도가 약물 농도를 높임으로써 개선되었는데 이는 고농도 PTX의 세포독성에 의한 MCL의 구조적 변화에 기인할 것으로 판단된다.

<실시예 3> 다층 암세포 배양계를 이용한 항암물질의 암세포에 대한 항증식 활성 분석

본 발명의 세포독성 분석법(cytotoxicity assay)과 결합된 다층 암세포 배양계(multicellular layer)를 이용한 항암물질의 활성 측정에 있어, 항암물질의 암세포에 대한 항증식 활성을 측정하기 위하여 SRB 분석방법(sulforhodamine B assay)을 이용하였다. 항증식 활성의 측정은 DLD-1 세포를 1,500 개/100 ㎕/웰로 96 웰 플레이트에 접종하고 24 시간 동안 단층 세포(monolyaer)로 배양하여, 다층 암세포 배양계를 통과한 다양한 농도의 항암물질에 72 시간 동안 노출시킨 후 생존율을 측정함으로써 수행하였다.

SRB 분석은 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, Sigma) 200 ㎕를 이용하여 4℃에서 1시간 동안 고정한 후, 0.4% SRB(Sigma) 용액으로 염색하고 과량의 SRB 용액을 1% 빙초산(glacial acetic acid, J.T.Baker, Phillipsburg, NJ)으로 5 회 세척하여 건조시킨 뒤, 이를 10 mM 트리스(Tris, Amresco, Solon, OH)로 용해시켜 565 nm에서 흡광도를 측정함으로써 수행하였다.

SRB 분석에 의한 세포독성 효과는 하기의 Emax 모델(식 2)을 이용하여 결정하였다(Holford and Sheiner, Pharmacol Ther 16, 143-166, 1982).

(식 2)

상기 식에서 [D]는 약물농도, K_d는 흡광도를 50% 감소시키는 약물농도(IC₅₀), m은 힐-타입 계수(Hill-type coefficient), R은 영향을 받지 않은 잔여 분획(the resistance fraction)이다.

통계분석을 위해서 S-Link^TM(에스링크 (주), 서울, 한국) 통계프로그램을 이용하여 paired t-test를 수행하였다.

<3-1> 각 항암물질의 DLD-1 단층 세포에서의 기준적 항암 활성

먼저, 각 항암물질의 기준데이터로서 DLD-1 단층세포에서 항암활성을 SRB 분석법으로 측정하였다(도 4). 각 항암물질로 72 시간동안 DLD-1 단층세포를 처리하였을 때, 50% 증식억제농도가 이리노테칸(irinotecan, 이하 "CPT"로 칭함)은 6.3±0.4 μM, SN-38은 6.6±0.7 nM, 5-플루오로우라실(fluorouracil, 이하 "5-FU"로 칭함)은 2.4±0.3 μM, 그리고 PTX는 39.6±8.1 nM로 나타났다. 상기 데이터는 하기의 MCL 투과후 항암물질의 활성의 변화를 계산하는 데에 기준데이터로 이용되었다.

<3-2> MCL을 배양하지 않은 인서트의 세공막 투과후 각 항암물질의 항암 활성

MCL을 배양하지 않은 트랜스웰 인서트(Transwell insert^ⓡ)의 TC에 정해진 농도의 항암물질 약물용액을 각각 100 ㎕씩 주입하고 24 시간 동안 투과시켰다. 24 시간 경과 후 투과되어 나온 약물이 함유되어 있는 BC의 배지를 취하여 24 시간 전 96 웰 플레이트에 접종해 놓은 상기의 DLD-1 단층 세포에 100 ㎕씩 처리하고, TC의 약물이 BC로 100% 투과되어 나왔음을 가정하여 제조된 약물-배지 용액을 처리한 군과 72 시간 후 SRB 분석 방법을 이용하여 약물 활성을 측정 비교하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, PTX, CPT, SN-38 및 5-FU 모두 24 시간 동안 MCL이 존재하지 않는 세공막을 통과한 약물의 활성과 100% 투과를 가정한 경우 약물의 활성에 차이가 없었다.

<3-3> MCL이 배양된 인서트를 투과한 각 항암물질의 항암 활성

MCL이 배양된 트랜스웰 인서트(Transwell insert^ⓡ)의 TC에 정해진 농도의 약물을 각각 100 ㎕씩 주입하고 24 시간 동안 투과시켰다. MCL 투과에 의한 약물 활성의 변화를 측정하기 위해 주입된 약물농도는 문헌에 근거하여 임상에서의 최고 혈중농도에 근접하도록 정하였다.

24 시간 경과 후 투과되어 나온 약물이 함유되어 있는 BC의 배지를 취하여 24 시간 전에 배양해놓은 96 웰 플레이트의 DLD-1 단층세포에 처리하였다. 대조군으로는 새 배지, 8 일 동안 24 웰 플레이트에서 약물 없이 배양한 배지 및 MCL을 배양하지 않은 트랜스 웰 인서트 통과 분획을 각각 단층세포에 처리하여 사용하였으며, 72 시간 경과 후 SRB 분석법을 이용하여 상기와 동일한 방법으로 세포독성 활성을 측정함으로써 MCL 투과가 약물 활성에 미치는 영향을 8일간 배양한 MCL을 이용하여 살펴보았다.

그 결과, 도 6에서 보듯이 8 일 배양한 MCL로부터 얻은 새 배지 및 24 시간 동안 약물 없이 트랜스 웰에서 배양한 배지는 증식율에 유의한 차이가 없었다 (P>0.05). CPT 및 SN-38은 MCL 투과후 활성이 세공막만을 투과한 경우보다 각각 10.7±7.6% 및 15.0±2.6% 증가하는 경향을 보였으나 통계적 유의성은 없었다. PTX는 1 μM의 경우에는 MCL 투과후 활성이 세공막만을 투과한 경우보다 24.3±4.9% 감소하였고(P<0.05), 10 μM의 경우에는 차이가 없었다. 반면 5-FU의 경우에는 MCL을 투과해 나온 약물의 활성이 세공막만을 투과한 경우보다 21.8±2.6% 높았는데(P<0.01), 이는 5-FU가 체내에서 여러 효소들의 대사에 의하여 활성화 된다는 사실과 일치한다.

또한, 상기의 결과를 상기 실시예 <3-1>의 단층세포에서 직접 측정된 약물 활성과 비교하여 보았다. 예측활성율은 트랜스웰 인서트에 주입된 약물이 상부 쳄버(TC)에서 하부쳄버(BC)로 일정분율(예를 들어, 표 1에서 100%) 투과해 나왔다고 가정했을때의 농도에서 약물이 단층세포의 성장을 저해하는 능력을 의미하며, 이는 도 4에서의 단층세포의 용량-반응 곡선으로부터 예측될 수 있다. 상기 예측된 약물 활성과 실제 약물의 MCL 투과후 활성의 차이를 약물의 활성 변화율(% change in activity)로 나타내었다(표 1). 예를 들어 활성변화율이 양수인 경우는 예측활성율보다 높은 MCL 투과후 활성율이 관찰된 경우이고, 음수인 경우는 예측활성율보다 낮은 MCL투과후 활성율이 관찰된 경우이다. PTX는 실측 투과도 곡선(도 3)으로부터 24 시간 동안의 투과도(26.7%)를 이용하여 계산하였다.

항암약물의 항증식 활성의 변화

항암제 종류	주입 농도	MCL 투과후 실제 활성율(%)	예측 활성율(100% 투과율 가정)	활성 변화율*
CPT-11	70 μM	51.0 ±9.0	38.6	32.1
SN-38	50 nM	28.7 ±16.0	16.0	· **
5-FU	50 μM	70.7 ±2.5	57.1	23.8
			26.7% 투과율 가정
PTX	1μM	33.0 ±5.3	41.5	-20.2***

* 활성 변화율 = ×100(%)

** ·는 통계적으로 무의미(오차범위 초과)

도 6으로부터 MCL 투과에 의해 활성 증가가 기대된 CPT의 경우 100%의 약물이 투과되었다고 가정했을 때에는 32.1%의 활성증가율이 예측되었다. 만약 50%의 약물이 투과되었다고 한다면 220.8%의 활성증가율이 예측된다. 5-FU의 경우 100%의 약물이 투과되었다고 가정했을 때에는 23.8%, 50%의 약물이 투과되었다고 가정했을 때에도 60.2%의 활성증가율이 예측되었다.

PTX 1 μM의 경우에는 실측 투과량(도 3)을 기초로 계산한 활성 감소율이 20.2%인데, 상기 수치는 실측 활성 감소율인 24.3%와 비교하여 차이가 없으며, 이는 PTX가 시험관내 세포배양계에서 대사의 영향을 크게 받지 않는 약물이라는 사실과 일치한다.

상기한 결과들은 MCL 투과 후 약물 활성이 그 약물의 유효 투과도를 대변할 수 있음을 제시한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 다층 암세포 배양계는 항암 물질의 암조직 투과성을 정량하는 기존의 방법과는 달리, 생물학적 방법을 이용하여 항암제의 암조직 투과후 활성을 실제로 분석하기 때문에 고형암에 대한 새로운 항암제 혹은 항암병용요법의 효능을 검색하거나 평가하는데 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 MCL로 배양된 DLD-1의 성장을 나타낸 것이고,

도 2는 [¹⁴C]mannitol 의 MCL에 대한 투과도를 나타낸 것이고,

●:cell free insert ○:5일 배양된 MCL ▼:8일 배양된 MCL

도 3은 [¹⁴C]paclitaxel의 MCL에 대한 투과도를 나타낸 것이고,

●::MCL 없이 paclitaxel 10 μM 첨가

○:MCL의 존재하에 paclitaxel 10 μM 첨가

▼:MCL의 존재하에 paclitaxel 1 μM 첨가,

도 4는 각 항암제의 DLD-1 단층세포에 대한 항증식 활성을 나타낸 것이고,

A:이리노테칸(CPT) B:SN-38

C:5-플루오르우라실(5-FU) D: paclitaxel(PTX)

도 5는 트랜스웰 인서트의 세공막 투과후 각 항암제의 항증식 활성을 나타낸 것이고,

도 6은 DLD-1의 8일간 배양된 MCL을 통과후 각 항암제의 항증식 활성을 나타낸 것이다.

Claims

세포독성 분석법(cytotoxicity assay)과 결합된 다층 암세포 배양계(multicellular layer)를 이용한 항암물질의 활성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 항암물질의 활성 측정은

i) 다층 암세포 배양계(multicellular layer)를 수립하는 단계;

ii) 항암물질을 상기 단계 i)의 다층 암세포 배양계에 투과시키는 단계;

iii) 투과 후 항암물질이 포함된 배지를 단층(monolayer)의 암세포에 처리하여 생존율을 측정함으로써 약물의 세포독성을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암물질의 활성 측정 방법.
제 2항에 있어서, 상기 단계 i)의 다층 암세포 배양계(multicellular layer)는

i) 트랜스웰 인서트(Transwell insert^ⓡ, Corning Costar, Acton, MA)의 상부 쳄버(top chamber, TC)에 계대 배양한 암세포주를 접종하는 단계;

ii) 접종한 암세포주를 부착시키는 단계; 및,

iii) 하부 쳄버(bottom chamber, BC)에 배지를 첨가하고 37℃의 CO₂ 배양기에서 배양하는 단계로 수립되는 것을 특징으로 하는 항암물질의 활성 측정 방법.
제 3항에 있어서, 상기 단계 i)의 암세포주는 DLD-1(인체 직장결장암 세포주)인 것을 특징으로 하는 항암물질의 활성 측정 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 세포독성을 측정하는 방법은 SRB 분석법인 것을 특징으로 하는 항암물질의 활성 측정 방법.