KR20050098811A - G-csf exon 3-deleted protein and antibody thereof, and producing method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 진단용 마커로서 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF, Granulocyte colony stimulating factor) 유전자에서 나타나는 액손3 결실여부나 결실에 의해 생성된 G-CSF 변이 단백질의 농도를 분석함으로써 암의 발생 여부를 예측 내지 진단하는 방법, 조성물, 마이크로어레이, 항체 또는 키트에 관한 것이다. The present invention provides a cancer diagnostic marker by analyzing the concentration of G-CSF mutant protein produced by axon3 deletion or deletion in the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) gene of granulocytes. It relates to a method, composition, microarray, antibody or kit for predicting or diagnosing.
Description
본 발명은 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF, Granulocyte Colony Stimulating Factor) 유전자의 변이 특성을 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 진단용 마커로서 G-CSF에서 나타나는 액손3 결실여부를 유전자 또는 단백질 수준에서 분석함으로써 암의 발생 여부를 예측 내지 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for diagnosing cancer using the mutant characteristics of the granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) gene of granulocytes. Specifically, the present invention relates to a method for predicting or diagnosing the occurrence of cancer by analyzing whether axon 3 deletion in G-CSF is detected at the gene or protein level as a marker for cancer diagnosis.
현대사회에 있어 각종 사고를 제외한 성인의 사망원인 1-2위를 다투고 있는 질병인 암에 있어서 그 조기 진단 및 근원적 치료법의 개발이 중요한 과제가 되고 있다. 일반적으로 말기상태의 암은 치료가 거의 불가능한 반면 초기 상태의 암은 치료율이 훨씬 높으며 치료방법 또한 훨씬 간단하다고 알려져 있다. 따라서 정확하고 신속한 진단방법의 개발이 절실히 요구되고 있다. In modern society, early diagnosis and the development of the underlying treatment are becoming important issues in cancer, a disease that is competing in the 1-2th place of death of adults except various accidents. In general, late stage cancers are almost impossible to treat, while early stage cancers are known to have much higher cure rates and simpler treatments. Therefore, the development of accurate and rapid diagnostic method is urgently required.
현재 일반적으로 행해지고 있는 암의 진단은 (1) 광학현미경, 전자현미경 등을 이용한 형태학적 분석을 통한 형태학적 진단, (2) 암조직 내에서 발현되는 특정한 단백질의 분석을 통한 면역조직화학적 진단(Iran. Biomed.J. 3 (3 & 4): 99-101, 1999; Lancet 2:483-6,1986), (3) 암조직 내에서 나타나는 유전자의 돌연변이와 같은 분자 생물학적 이상의 분석을 통한 분자생물학적 진단 등의 방법들을 이용하여 이루어진다. 이들 방법 중 형태학적 진단이나 면역조직학적 진단의 경우 분자생물학적 진단과 비교하여 훨씬 더 많은 시간이 소요되며 경제적인 부담 또한 훨씬 높다. 분자생물학적 방법은 그 작업이 상대적으로 단순하며 몇몇 경우에는 단시간에 결과를 알 수 있기 때문에 현재 새로운 진단방법 개발 연구의 중심이 되고 있다. 최근 상해에 있는 Health Digit사가 다양한 암 진단을 위한 단백질칩 시스템을 개발하였고, 세계 최초로 중국 의약품 안전청으로부터 임상 진단 허가를 받았다는 보고도 있었다(www.health-digit.com). 하지만, 이것 역시 하나의 바이오마커(biomarker)로 모든 암을 진단하는 형태가 아니라, 10개 이상의 많은 단백질을 이용하는 형태이다.The current diagnosis of cancer is (1) morphological diagnosis through morphological analysis using optical microscope, electron microscope, etc., and (2) immunohistochemical diagnosis through analysis of specific proteins expressed in cancer tissue. Biomed. J. 3 (3 & 4): 99-101, 1999; Lancet 2: 483-6,1986), (3) Molecular biological diagnosis through analysis of molecular biological abnormalities such as mutation of genes in cancerous tissues And other methods. Among these methods, morphological or immunohistologic diagnosis is much more time-consuming and economically expensive compared to molecular biological diagnosis. Molecular biological methods are now central to the development of new diagnostic methods because their work is relatively simple and in some cases the results are available in a short time. Recently, Health Digit in Shanghai has developed a variety of protein chip systems for the diagnosis of cancer, and the world's first report has received a clinical diagnostic license from the Chinese Drug Administration (www.health-digit.com). However, this is not a form of diagnosing all cancers with a single biomarker, but rather using more than 10 proteins.
상기와 같은 방법들의 효율적인 적용에 있어서 가장 중요한 것은 암 발생여부를 보다 정확하고 손쉽게 확인할 수 있는 암 진단 마커의 선택 및 사용이다. 암 진단 마커(marker)로서 몇몇 유전자(Steve M. et al., J. Clin. Oncology 20:3165-3175, 2002; Sridlhar R. et al, J. Clin. Oncology 20:1932-1941, 2002) 또는 단백질(Goessl et al., Urology 58:335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res Treat 66:217-224, 2001; 김철근 외, 대한민국 특허공개번호 2001-0061173)이 보고되어 있으며 이 중에서 실제 진단에 이용되고 있는 경우도 있다. 기존에 사용되고 있는 암에 대한 마커의 경우 장기 특이성이 낮은 CEA, BFP, TPA, IAP의 경우는 민감도가 떨어져서 가양성(false positive)의 우려가 있으며, 반면, 장기 특이성이 높은 AFP, PIVKA II, Esterase I, CA19-9, CA50, SPan-1, Antigen, CA15-3, BCA 225 등의 마커의 경우는 당초부터 표적장기를 목적으로 이용하는 때에만 유용한 단점이 있다. 따라서 암 진단에 있어 정확성뿐만 아니라 경제적이고 간편한 진단을 위해서도 다양한 종류의 암을 진단할 수 있는 새로운 마커의 개발이 절실히 요구된다.The most important in the effective application of the above methods is the selection and use of cancer diagnostic markers that can more accurately and easily determine whether cancer occurs. Some genes as cancer diagnostic markers (Steve M. et al., J. Clin. Oncology 20: 3165-3175, 2002; Sridlhar R. et al, J. Clin. Oncology 20: 1932-1941, 2002) or Proteins (Goessl et al., Urology 58: 335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res Treat 66: 217-224, 2001; Kim Chul-Keun et al., Korean Patent Publication No. 2001-0061173) It may be used for actual diagnosis. In the case of markers for cancer, which are currently used, CEA, BFP, TPA, and IAP, which have low long-term specificity, have low sensitivity, which may result in false positives, whereas AFP, PIVKA II, and Esterase, which have high long-term specificity, may be false. In the case of markers such as I, CA19-9, CA50, SPan-1, Antigen, CA15-3, BCA 225, there are disadvantages that are useful only when the target organ is used for the first time. Therefore, the development of new markers for diagnosing various types of cancers is urgently needed for accurate and economical and easy diagnosis.
이에 따라, 본 발명자들은 다양한 종류의 암을 진단한 수 있는 암 진단 마커를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과 암환자의 경우 G-CSF의 전사 과정에서 액손3 영역의 결손이 나타남을 확인하고 G-CSF mRNA 단편 또는 단백질을 암 진단 마커로 사용함으로써 다양한 암환자를 간편하고 경제적으로 또한 빠르게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made intensive studies to develop cancer diagnostic markers capable of diagnosing various types of cancers. As a result, cancer patients have confirmed that axon 3 region defects appear during G-CSF transcription. The present invention has been accomplished by confirming that various cancer patients can be diagnosed easily, economically and quickly by using fragments or proteins as cancer diagnostic markers.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 DNA 서열이 결손된 G-CSF 유전자를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질의 제조 방법 및 이로부터 제조된 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질을 제공한다. In one aspect, the present invention comprises the steps of introducing an expression vector comprising a G-CSF gene is missing the DNA sequence of the axon 3 region into the host cell; Culturing the host cell; And separating the G-CSF protein from which the amino acid sequence of the axon 3 region is deleted from the culture, and the method of preparing the G-CSF protein from which the amino acid sequence of the axon 3 region is deleted, and the axon 3 region prepared therefrom. It provides a G-CSF mutant protein lacking the amino acid sequence of.
다른 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 동물에 투여하는 단계; 상기 동물로부터 혈액을 채취하는 단계; 및 상기 혈액으로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 분리하는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법 및 이로부터 제조된 항체를 제공한다. In another aspect, the present invention comprises the steps of administering to the animal a G-CSF protein lacking the amino acid sequence of the axon3 region; Collecting blood from the animal; And separating the antibody specific for the G-CSF protein lacking the amino acid sequence of the axon 3 region from the blood, wherein the antibody specific for the G-CSF protein having the amino acid sequence of the axon 3 region is deleted. It provides an antibody prepared therefrom.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질을 동물에 투여하는 단계; 상기 동물로부터 상기 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 세포를 분리하는 단계; 상기 분리된 세포와 골수종 세포를 세포융합 하는 단계; 상기 세포융합된 세포로부터 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마를 분리하는 단계; 및 상기 하브리도마를 이용하여 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체를 얻는 단계를 포함하는, 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 단백질에 특이적인 항체의 제조 방법 및 이로부터 제조된 항체를 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for treating an animal comprising administering a G-CSF protein lacking the amino acid sequence of an axon3 region to an animal; Isolating a cell producing an antibody specific for the G-CSF protein lacking the amino acid sequence of the axon 3 region from the animal; Cell fusion of the isolated cells with myeloma cells; Separating hybridomas producing an antibody specific for the G-CSF protein lacking the amino acid sequence of the axon 3 region from the cell-fused cells; And using the hybridoma, obtaining an antibody specific for the G-CSF protein lacking the amino acid sequence of the axon 3 region, wherein the antibody specific for the G-CSF protein having the amino acid sequence of the axon 3 region is deleted. Methods of preparation and antibodies prepared therefrom are provided.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 G-CSF의 엑손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 제공한다.In another aspect, the present invention provides an antibody, preferably a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, that specifically binds to a G-CSF variant in which the amino acid sequence of the exon3 region of G-CSF is deleted.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단제, 암 진단용 키트, 또는 암 진단용 마이크로어레이를 제공한다. As another aspect, the present invention provides a cancer diagnostic agent, cancer diagnostic kit, or cancer diagnostic microarray comprising an antibody specific for a G-CSF mutant protein lacking the amino acid sequence of the axon 3 region.
본 발명은 암 진단용 마커로서 인체유래 G-CSF에서 나타나는 액손3 결실여부를 유전자 또는 단백질 수준에서 분석함으로써 암의 발생 여부를 예측 내지 진단하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for predicting or diagnosing cancer by analyzing whether axon 3 deletion in human-derived G-CSF is detected at a gene or protein level as a marker for cancer diagnosis.
단구성 대식세포(macrophage), T-세포 및 섬유아세포와 같은 세포에서 생산되는 것으로 알려진 콜로니 자극인자(colony stimulating factor, CSF)는 정상적으로 생체내에서 광범위하게 분포되어 있다. CSF는 크게 과립성 백혈구의 콜로니 자극인자(G-CSF), 단구성 대식세포 콜로니 자극인자 및 과립성 백혈구-단구성 대식세포 콜로니 자극인자의 3가지로 구분되며, 이중 G-CSF는 조혈성 간세포가 증식 및 분화되어 일어나는 여러 가지 혈구 생성에 매우 중요한 역할을 하는 단백질이다. 이의 주요 작용은 과립구 특히 외부 감염으로부터 생체를 보호하는데 중요한 역할을 하는 호중구(neutrophil)의 수적 증가를 촉진시키는 일이다. 증식성 종양에 대해 최근 널리 이용되고 있는 화학적 치료법은 종양의 성장을 억제하는 동시에 호중구 전구체의 성장 또한 억제하므로 환자로부터 호중구 보호작용의 감소현상을 일으켜 심한 부작용을 유발하게 된다. G-CSF는 이러한 약물치료 환자들에게 투여되었을 때 호중구의 수적 증가를 촉진시켜 감염성 질환을 예방하고 치료하는데 효과가 있는 것으로 알려졌다. 1986년 인체유래 G-CSF 유전자가 나가타(Nagata) 등에 의해 그 염기서열이 처음 밝혀졌고 이의 COS 세포내에서의 발현이 보고되었다(Nagata et al., Nature 319:415-418, 1986).Colony stimulating factors (CSFs) known to be produced in cells such as macrophage, T-cells and fibroblasts are normally widely distributed in vivo. CSF is largely divided into three groups: granulocyte leukocyte colony stimulating factor (G-CSF), monocytic macrophage colony stimulating factor, and granulative leukocyte-monocytic macrophage colony stimulating factor, of which G-CSF is a hematopoietic stem cell Is a protein that plays a very important role in the production of various blood cells caused by proliferation and differentiation. Its main action is to promote an increase in the number of neutrophils, which play an important role in protecting living organisms from granulocytes, especially from external infections. Recently widely used chemotherapy for proliferative tumors inhibits tumor growth and inhibits the growth of neutrophil precursors, resulting in a decrease in neutrophil protection from patients, leading to severe side effects. G-CSF has been shown to be effective in preventing and treating infectious diseases by promoting the increase in the number of neutrophils when administered to these drug patients. In 1986, a human-derived G-CSF gene was first identified by Nagata et al. And its expression in COS cells was reported (Nagata et al., Nature 319: 415-418, 1986).
사람 G-CSF(hG-CSF)는 30개의 아미노산으로 구성된 분비신호 펩타이드(signal peptide)와 174개의 아미노산으로 구성된 당단백질(glycoprotein)이다. 5개의 시스테인(cystein)이 존재하며 이 중 4개의 시스테인(Cys36-Cys42, Cys64-Cys74)이 두 개의 황이중 결합(disulfide bond)을 형성하여 단백질 접힘(folding) 및 활성(activity)에 중요하게 관여하는 것으로 알려졌다(Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167-5171, 1993). 도 1에 나타낸 바와 같이 인체 유래 G-CSF 유전자는 인체 게노믹 DNA 상에 모두 5개의 액손 및 4개의 인트론으로 구성되어 있으며 이 게노믹 DNA로부터 전사작용(transcription)을 통하여 mRNA가 만들어지고 다시 스프라이싱(splicing)과정을 통하여 4개의 인트론이 제거되고 5개의 액손으로만 구성된 성숙 mRNA가 만들어진다. 이후 번역작용(translation)을 통하여 204개의 아미노산으로 구성된 G-CSF 전구체가 만들어지고 다시 N-말단에 존재하는 30개의 아미노산으로 구성된 분비신호서열(signal peptide)가 제거되면서 비로소 생물학적 활성을 갖는 G-CSF 단백질(174개 아미노산)이 생산되게 된다(Nagata et al., EMBO J. 5:575-581, 1986; Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167-5171, 1993).Human G-CSF (hG-CSF) is a secretory signal peptide consisting of 30 amino acids and glycoprotein consisting of 174 amino acids. There are five cysteines, four of which (Cys 36 -Cys 42 , Cys 64 -Cys 74 ) form two disulfide bonds that affect protein folding and activity. Significant involvement (Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167-5171, 1993). As shown in FIG. 1, the human-derived G-CSF gene is composed of all five axons and four introns on human genomic DNA, and mRNA is produced and respliced through transcription from the genomic DNA. The splicing process removes four introns and produces a mature mRNA consisting of only five axons. Subsequently, the G-CSF precursor consisting of 204 amino acids was formed through translation, and the secreted peptide consisting of 30 amino acids present at the N-terminus was removed. Protein (174 amino acids) will be produced (Nagata et al., EMBO J. 5: 575-581, 1986; Hill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5167-5171, 1993).
본 발명자들은 사람 G-CSF 유전자를 클로닝하여 이의 생산을 위한 연구를 수행하던 중 암세포에서 유래한 G-CSF cDNA에서 액손3 부분(108 bp)이 정확하게 결실되어 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 특정 액손의 결실은 G-CSF가 아닌 다른 유전자에서는 적지 않게 보고가 되어 있었으나 인체유래 G-CSF 유전자에 있어서는 아직까지 보고된 적이 없다. 사람 G-CSF 유전자는 액손2 말단의 3개 아미노산이 있는 경우와 없는 경우가 있고 이들 두 가지 경우 모두 같은 활성을 갖고 있다고 보고된 바 있다(Nagata et al., EMBO J. 5:575-581, 1986). 따라서, G-CSF 유전자의 액손3의 결실 여부를 측정하여 암을 진단하는 방법은 G-CSF의 모든 아형에 동일한 원리에 따라 적용될 수 있다. 또한, 다른 포유동물 유래의 G-CSF 또한 거의 동일한 활성을 나타내고 있는 것으로 알려져 있으므로, 당업자는 본 발명에 따른 G-CSF 유전자의 액손3의 결실 여부를 측정하여 암을 진단하는 방법이 다른 동물 유래의 G-CSF에도 동일한 원리에 따라 적용될 수 있음을 이해할 것이다. The present inventors were able to confirm that the axon 3 portion (108 bp) of the G-CSF cDNA derived from cancer cells was correctly deleted while cloning the human G-CSF gene. Deletion of this specific axon has been reported in many genes other than G-CSF, but has not been reported in human-derived G-CSF gene. Human G-CSF genes have been reported to have three amino acids at the axon2 terminus and none, and both have the same activity (Nagata et al., EMBO J. 5: 575-581, 1986). Therefore, the method of diagnosing cancer by measuring the deletion of axon 3 of the G-CSF gene can be applied to all subtypes of G-CSF according to the same principle. In addition, since G-CSF derived from other mammals is known to exhibit almost the same activity, those skilled in the art can determine whether axon 3 of the G-CSF gene according to the present invention is deleted to diagnose cancer. It will be appreciated that the same principles can be applied to the G-CSF.
암세포에서 특이적으로 발현되는 (또는 억제되는) 유전자 및 유전적 돌연변이 등을 확인하는 분자생물학적 방법으로 예를 들면 (a) 중합효소 연쇄반응(PCR, Polymerase Chain Reaction)(Bottema, C.D., Mutat Res. 233:93-102, 1993; Nelson, D.L., Curr. Opin. Genet. Dev. 1: 62-68, 1991; Pourzand, C. and Cerutti, P., Mutat. Res. 288:113-121, 1993; Holland PM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7276-7280, 1991), (b) 단일 가닥 입체 다형화(SSCP, Single-Stranded Conformation Polymorphism)(Glavac D., Hum. mutat. 19:384-394, 2002; Strippoli, P. et al., Int. J. Mol. Med 8:567-572, 2001; Methods Mol Biol 187:151-63, 2002), (c) DNA 염기서열분석(DNA Sequencing Analysis)(Sanger, F. et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1997), (d) 단백질 절단 테스트(PTT, Protein Truncation Test)(Hardy, C.A., Methods Mol. Biol. 187:87-108, 2002), (e) 자동염기서열 분석법(Boutin P. et al., Hum. Mutat. 15(2):201-203, 2000), (f) LOH(loss of heterozygosity) 연구(Yang Q. et al., Clin. Cancer Res. 8:2890-2893, 2002), (g) MSI(microsatellite instability) 연구(Furlan, D. et al., J Pathol 197:603-609, 2002), (h) MALDI-TOF를 이용한 유전자 검사(Leushner J., Expert Rev. Mol. Diagn. 1:11-18, 2001), (i) 혼성화 반응(Hybridization)을 통한 유전자 검사(Wetmur, J. G., Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol. 26:227-259, 1991), (j) DNA 칩을 통한 유전자 검사(Goessl et al., Urology 58:335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res. Treat. 66:217-224, 2001; 김철근 외, 대한민국 특허공개번호 2001-0061173), (k) 단백질 칩을 이용한 검사(Pharmacogenomics 1:385-393, 2000) 등이 진단에 사용될 수 있다. 당업자는 상기 열거된 방법을 포함한 공지된 분자생물학적 방법을 적절히 응용하여 G-CSF 유전자 또는 단백질의 액손3 영역 결손을 용이하게 확인할 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 이용될 수 있는 상기 많은 방법 가운데, 본 발명에 따른 G-CSF 유전자 또는 단백질의 액손3 영역 결손 확인은 PCR, 혼성화 반응, DNA 칩, 단백질 칩 또는 효소면역측정법을 이용하는 것이 바람직하다.Molecular biological methods for identifying genes and genetic mutations that are specifically expressed (or inhibited) in cancer cells include, for example, (a) Polymerase Chain Reaction (PCR) (Bottema, CD, Mutat Res. 233: 93-102, 1993; Nelson, DL, Curr. Opin. Genet. Dev. 1: 62-68, 1991; Pourzand, C. and Cerutti, P., Mutat.Res. 288: 113-121, 1993; Holland PM et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8: 7276-7280, 1991), (b) Single-Stranded Conformation Polymorphism (SSCP) (Glavac D., Hum. Mutat. 19 : 384-394, 2002; Strippoli, P. et al., Int. J. Mol. Med 8: 567-572, 2001; Methods Mol Biol 187: 151-63, 2002), (c) DNA sequencing ( DNA Sequencing Analysis (Sanger, F. et al., Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467, 1997), (d) Protein Truncation Test (PTT) (Hardy, CA, Methods Mol. Biol. 187: 87-108, 2002), (e) automated sequencing (Boutin P. et al., Hum. Mutat. 15 (2): 201-203, 2000), (f) LOH (loss) of heterozygosity (Yang Q. et al., Clin. Cancer Res. 8: 2890-2893, 2002), (g) microsatellite instability (MSI) study (Furlan, D. et al., J Pathol 197: 603- 609, 2002), (h) Genetic testing using MALDI-TOF (Leushner J., Expert Rev. Mol. Diagn. 1: 11-18, 2001), (i) genetic testing via hybridization (Wetmur, JG, Critical Reviews in Biochem. Mol. Biol. 26: 227-259, 1991), (j) DNA chips Genetic testing (Goessl et al., Urology 58: 335-338, 2001; Zhou et al., Breast Cancer Res. Treat. 66: 217-224, 2001; Kim Chul-Keun et al., Korean Patent Publication No. 2001-0061173), ( k) Tests using protein chips (Pharmacogenomics 1: 385-393, 2000) can be used for diagnosis. Those skilled in the art will appreciate that appropriate application of known molecular biological methods, including those listed above, can readily identify axon3 region deletions of the G-CSF gene or protein. However, among many of the above methods that can be used, it is preferable to use a PCR, hybridization reaction, DNA chip, protein chip or enzyme immunoassay to identify axon 3 region deletion of the G-CSF gene or protein according to the present invention.
본 발명에 따른 암 진단을 위해 선행되어야 하는 것은 피검 조직 또는 세포로부터 G-CSF 유전자 또는 단백질 시료를 획득하는 것이다. 보통 조직 또는 세포로부터 분리되는 특정 유전자 시료는 미량이므로 PCR 반응에 의해 증폭되어야 하며 이러한 증폭을 위해서는 프라이머가 고안되어야 한다. 본 발명에 있어서 G-CSF 유전자의 액손3 영역의 전체 또는 이의 일부를 증폭하기 위해 액손3 영역의 결실 여부를 측정하기 위한 프라이머인 DNA 핵산 단편이 필요하다. 즉, 본 발명에서 프라이머는 액손3 일부 또는 전체를 포함하는 G-CSF 유전자의 핵산서열을 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 의미한다. 이러한 프라이머를 고안하는 것은 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 따라서, 액손3 일부 또는 전체를 포함하는 G-CSF를 증폭하기 위해 당업자가 디자인할 수 있는 모든 프라이머가 본 발명의 프라이머 범위에 포함된다. 본 발명 프라이머의 일 예는 hG-CSF 유전자의 액손2의 일부부터 액손5까지(Thr1 - Pro174) 증폭할 수 있는 서열번호 1과 서열번호 2로 표시된 올리고뉴클레오티드, hG-CSF 유전자의 액손2의 일부부터 액손3(Ile24 - Leu71)까지 증폭할 수 있는 서열번호 3과 서열번호 5로 표시된 올리고뉴클레오티드, hG-CSF 유전자의 액손3 부터 액손4의 일부(Cys36 - Ser80)를 증폭할 수 있는 서열번호 4와 서열번호 6으로 표시된 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명자들은 8종의 정상조직 및 세포와 17종의 암세포주로부터 mRNA 및 cDNA를 확보하여 이들 프라이머 군으로부터 G-CSF 유전자 및 액손 3을 확인할 수 있었다.What should be preceded for the diagnosis of cancer according to the present invention is the acquisition of a G-CSF gene or protein sample from the test tissue or cell. Usually, specific gene samples isolated from tissues or cells are traces and must be amplified by PCR reactions, and primers must be designed for such amplification. In the present invention, in order to amplify all or part of the axon 3 region of the G-CSF gene, a DNA nucleic acid fragment which is a primer for measuring the deletion of the axon 3 region is required. That is, in the present invention, the primer refers to an oligonucleotide capable of amplifying a nucleic acid sequence of a G-CSF gene including a part or all of axon 3. Designing such primers can be readily made by those skilled in the art. Thus, all primers that can be designed by those skilled in the art to amplify G-CSF, including some or all of axon 3, are included in the primer range of the present invention. One example of the primer of the present invention is an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 that can be amplified from a portion of axon 2 to axon 5 (Thr1-Pro174) of the hG-CSF gene, a part of axon 2 of the hG-CSF gene Oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, which can amplify from Axon 3 (Ile24-Leu71), and SEQ ID 4, which can amplify a portion of Axon 4 (Cys36-Ser80) from axon 3 of the hG-CSF gene And an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 6. The inventors obtained mRNA and cDNA from 8 normal tissues and cells and 17 cancer cell lines, and identified G-CSF gene and axon 3 from these primer groups.
본 발명은 G-CSF 유전자의 액손3 영역을 증폭하여 그 결실여부를 측정하는데 사용하는 프라이머쌍으로서 이들로 한정되는 아니지만 다음의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다: The present invention provides the following oligonucleotides, including, but not limited to, primer pairs used to amplify the axon 3 region of the G-CSF gene and determine its deletion:
센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과 Sense 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 1) and
안티센스 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(서열번호 2);Antisense 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 2);
센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과 Sense 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 1) and
안티센스 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(서열번호 5);Antisense 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3 '(SEQ ID NO: 5);
센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과 Sense 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 1) and
안티센스 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(서열번호 6);Antisense 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3 '(SEQ ID NO: 6);
센스 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(서열번호 1)과 Sense 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3 '(SEQ ID NO: 1) and
안티센스 5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(서열번호 9);Antisense 5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3 '(SEQ ID NO: 9);
센스 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(서열번호 3)과Sense 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3 '(SEQ ID NO: 3) and
안티센스 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(서열번호 2);Antisense 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 2);
센스 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(서열번호 3)과Sense 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3 '(SEQ ID NO: 3) and
안티센스 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(서열번호 5);Antisense 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3 '(SEQ ID NO: 5);
센스 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(서열번호 3)과Sense 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3 '(SEQ ID NO: 3) and
안티센스 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(서열번호 6); Antisense 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3 '(SEQ ID NO: 6);
센스 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(서열번호 4)와 Sense 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3 '(SEQ ID NO: 4) and
안티센스 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(서열번호 2);Antisense 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 2);
센스 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(서열번호 4)와;Sense 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3 '(SEQ ID NO: 4);
안티센스 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(서열번호 5); 및Antisense 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3 '(SEQ ID NO: 5); And
센스 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(서열번호 4)와;Sense 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3 '(SEQ ID NO: 4);
안티센스 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(서열번호 6).Antisense 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3 '(SEQ ID NO: 6).
상기 핵산 단편은 G-CSF 유전자의 액손3 영역을 포함하지 않아도 액손2 또는 액손4 영역에 해당하는 프라이머를 이용하여 액손3 영역의 결실을 확인할 수 있는 핵산 단편을 포함한다.The nucleic acid fragment includes a nucleic acid fragment which can identify the deletion of the axon 3 region by using a primer corresponding to the axon 2 or axon 4 region even without including the axon 3 region of the G-CSF gene.
본 발명의 한 양태는 G-CSF 유전자의 액손 3 영역 전체 또는 이의 일부를 포함한 DNA 단편이 부착되어 있고 암을 진단하는데 유용한 유전자 마이크로어레이 또는 멤브레인을 포함한다. 유전자 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스(slide glass) 표면 위에 올리고뉴클레오티드 탐침을 부착하여 혼성화 방법으로 탐침에 상보적인 유전자를 검출하는데 이용될 수 있는 것으로 DNA 칩 등이 이에 포함된다. 멤브레인은 혼성화 반응에 있어서 슬라이드 글라스 대신 사용할 수 있는 것으로 특별히 한정되지 않으며 DNA 단편을 고정화할 수 있는 것은 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는, 나일론 또는 니트로셀룰로스 멤브레인을 이용할 수 있다.One aspect of the invention includes a gene microarray or membrane to which a DNA fragment comprising all or part of the axon 3 region of the G-CSF gene is attached and useful for diagnosing cancer. Gene microarrays can be used to detect genes complementary to probes by hybridization by attaching oligonucleotide probes to slide glass surfaces treated with specific reagents, including DNA chips. The membrane is not particularly limited to be used in place of the slide glass in the hybridization reaction, and any one capable of immobilizing the DNA fragment may be used. Preferably, nylon or nitrocellulose membranes can be used.
본 발명에 따른 마이크로어레이의 표면에는 탐침으로서 G-CSF 유전자의 액손3 영역에 해당하는 핵산 단편과 함께 액손1, 2, 4 및 5로 이루어진 그룹중에서 선택되는 한 개 이상의 핵산 단편이 부착된다. 여기서 핵산 단편 탐침은 각 액손의 전체 길이 또는 이의 일부분이 모두 가능하다. 본 발명에서 탐침으로 사용되는 액손3 영역의 핵산 단편으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 TGTGCCACCTACAAGCTGTG(서열번호 14), GAGCTGGTGCTGCTCGGACA(서열번호 15), GGACACTCTCTGGGCATCCC(서열번호 16) 및 CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA이 포함된다. 액손1, 2, 4 및/또는 5의 핵산 단편은 대조용 탐침으로 사용되며 이의 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC(서열번호 10), AGAAGCTGTGGTGCCAC(서열번호 12), TGAGTGAGTGTGCCAC(서열번호 13), GCAGGCTGCTTGAGCCAA(서열번호 18), AGAAGCTGGCAGGCTG(서열번호 19) 및 TGAGTGAGGCAGGCTG(서열번호 20)이 포함된다. At least one nucleic acid fragment selected from the group consisting of axons 1, 2, 4 and 5 is attached to the surface of the microarray according to the present invention along with a nucleic acid fragment corresponding to the axon 3 region of the G-CSF gene as a probe. Wherein the nucleic acid fragment probe can be the entire length of each axon or a portion thereof. Nucleic acid fragments of the axon 3 region used as probes in the present invention include, but are not limited to, TGTGCCACCTACAAGCTGTG (SEQ ID NO: 14), GAGCTGGTGCTGCTCGGACA (SEQ ID NO: 15), GGACACTCTCTGGGCATCCC (SEQ ID NO: 16), and CTGAGCAGCTGCCCCAGCCA. Nucleic acid fragments of axons 1, 2, 4 and / or 5 are used as control probes and examples thereof include, but are not limited to, CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC (SEQ ID NO: 10), AGAAGCTGTGGTGCCAC (SEQ ID NO: 12), TGAGTGAGTGTGCCAC (SEQ ID NO: 13), GCAGGCTGCTTGAGCCAA (SEQ ID NO: 18), AGAAGCTGGCAGGCTG (SEQ ID NO: 19), and TGAGTGAGGCAGGCTG (SEQ ID NO: 20).
슬라이드 글라스, 멤브레인 등의 표면에 탐침을 스폿팅하는 것은 본 분야의 공지 기술을 통해 용이하게 실시될 수 있다. 또한, 표적의 준비 및 혼성화와 스트립핑도 통상적인 기술에 따라 실시될 수 있다.Spotting the probe on the surface of the slide glass, membrane, etc. can be easily carried out through known techniques in the art. In addition, preparation and hybridization and stripping of targets can also be carried out according to conventional techniques.
본 발명의 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손3 영역 전체 또는 이의 일부를 포함한 DNA 단편과 진단학적으로 허용되는 통상적인 담체를 포함하는 암 진단용 조성물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손3 영역의 아미노산이 결실된 G-CSF 변이체와 이 변이체에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 이용하여 암을 진단하는 방법을 포함한다. 여기서, "액손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체"는 성숙한 단백질이 번역되는 과정에서 액손1 영역 내지 액손5 영역 중에서 액손3 영역을 포함하여 결실이 일어나서 생성된 G-CSF 변이 단백질을 말한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태는 G-CSF 유전자의 액손3 영역 전체 또는 이의 일부를 포함한 DNA단편과 이것을 이용한 DNA 마이크로 어레이를 포함한 진단 키트를 포함한다. 본 발명의 또 다른 특정 양태로서, 본 발명은 G-CSF 변이체 및 G-CSF 변이체에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날항체를 이용한 단백질 어레이를 포함한 진단 키트를 포함한다.Another particular aspect of the present invention includes a cancer diagnostic composition comprising a DNA fragment comprising all or a portion of the axon3 region of the G-CSF gene and a conventionally acceptable carrier. Another specific embodiment of the present invention encompasses G-CSF variants lacking amino acids in the axon3 region of the G-CSF gene and methods of diagnosing cancer using polyclonal or monoclonal antibodies to the variants. . Here, the "G-CSF variant in which the amino acid sequence of the axon 3 region is deleted" refers to a G-CSF variant protein generated by the deletion including the axon 3 region among the axon 1 to axon 5 regions during the translation of the mature protein. Say. Another particular aspect of the invention includes a diagnostic kit comprising a DNA fragment comprising all or a portion of an axon3 region of the G-CSF gene and a DNA microarray using the same. In another particular embodiment of the invention, the invention comprises a diagnostic kit comprising a G-CSF variant and a protein array using a polyclonal antibody or monoclonal antibody against the G-CSF variant.
본 발명에 따른 액손3 영역의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체 및 이에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체는 본 분야의 통상적인 방법으로 생산할 수 있다(Harlow, E. and Lane, D., Antibodies. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Wilson, L. and Matsudaira, P. eds. Antibodies in Cell Biology (Methods in Cell Biology, Vol.37). New York: Academic Press, 1933).G-CSF variants lacking the amino acid sequence of the axon3 region according to the present invention and polyclonal or monoclonal antibodies thereto can be produced by conventional methods in the art (Harlow, E. and Lane, D. Antibodies.A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Wilson, L. and Matsudaira, P. eds.Antibodies in Cell Biology (Methods in Cell Biology, Vol. 37) .New York: Academic Press, 1933).
본 발명에 따르면, 17종의 암세포주로부터 mRNA 및 cDNA를 제조하고 hG-CSF 유전자의 액손3 부위를 포함하는 서열을 증폭한 다음 그 염기서열을 분석함으로써 위암, 유방암, 육종, 장암, 폐암 자궁경부암 및 악성 흑색종 세포에서 유래한 hG-CSF cDNA의 경우 액손3 부위(108bp)가 결실되어 있는 것으로 밝혀졌다(도 2 및 도 3). 17종의 암세포주 유래의 hG-CSF cDNA를 주형으로 하여 상기 본 발명에 따른 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과, 16종의 암세포주로부터 유래된 PCR 산물이 정상 세포주로부터 유래된 PCR 산물에 비해 그 크기가 작음을 확인하였고 이의 유전자 염기서열을 확인한 결과 정상적인 G-CSF 유전자를 구성하는 다섯 개의 액손 중에 정확히 액손3 부위가 결실되어 있음이 확인되었다.According to the present invention, mRNA and cDNA were prepared from 17 cancer cell lines, amplified sequences including the axon3 region of the hG-CSF gene, and then analyzed for sequencing. Gastric cancer, breast cancer, sarcoma, bowel cancer, lung cancer and cervical cancer And in the case of hG-CSF cDNA derived from malignant melanoma cells, the axon 3 site (108 bp) was found to be deleted (FIGS. 2 and 3). As a result of performing polymerase chain reaction using the primers according to the present invention using hG-CSF cDNA derived from 17 cancer cell lines as a template, PCR products derived from 16 cancer cell lines were PCR-derived from normal cell lines. Its size was smaller than that of the product, and its sequencing sequence confirmed that the axon 3 site was deleted correctly among the five axons constituting the normal G-CSF gene.
또한, 혼성화 반응을 이용하여 G-CSF cDNA의 액손3 결실여부를 확인할 수 있다. 예를 들면, 정상 hG-CSF 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행함으로써 액손3 부위의 DNA 절편과 액손2 영역의 DNA 절편을 획득하고 이를 나일론 멤브레인에 고정화한 다음 암세포주의 cDNA 표적과 혼성화시킨 후 표적와 액손3 DNA 단편과의 결합여부를 확인하여 액손3 결핍 여부를 용이하게 확인할 수 있다.In addition, hybridization reactions can be used to confirm the axon 3 deletion of G-CSF cDNA. For example, by performing PCR using a normal hG-CSF gene as a template, DNA fragments of the axon 3 region and DNA fragments of the axon 2 region are obtained, immobilized on a nylon membrane, and hybridized with the cDNA target of the cancer cell line. 3 DNA fragments can be easily identified by axon 3 deficiency.
또한, DNA칩을 이용하여 G-CSF cDNA의 액손3 결실여부를 확인할 수 있다. 각 액손 영역의 올리고뉴클레오타이드를 탐침으로 슬라이드 상에 고정화한 뒤 hG-CSF 액손 영역의 유전자를 주형으로 하여 PCR를 수행한 것을 탐침과 반응시킴으로서 액손3 영역의 결실여부를 확인할 수 있다.In addition, the DNA chip may be used to confirm the axon 3 deletion of G-CSF cDNA. The oligonucleotide of each axon region was immobilized on the slide with a probe, and then PCR was performed using the gene of the hG-CSF axon region as a template to react with the probe to confirm the deletion of the axon 3 region.
또한, 액손3 영역의 결실이 일어난 변이 염기서열로부터 변이 G-CSF에 대한 재조합 단백질을 만들고 여기에 대한 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체를 제작하여 효소면역측정법을 통해 정상인과 여러 가지 암환자간의 G-CSF 변이 단백질의 수치를 측정함으로써 액손3 영역의 결실여부를 쉽게 확인할 수 있다. In addition, a recombinant protein for mutant G-CSF was prepared from the mutant nucleotide sequence in which the axon 3 region was deleted, and a polyclonal antibody and a monoclonal antibody were prepared. Determination of the axon 3 region can be easily confirmed by measuring the level of G-CSF mutant protein.
다른 양태로서, 본 발명은 면역크로마토그라피 분석을 포함한다. 이의 대표적인 것으로 측방유동분석법(lateral flow assay)이 있다. 이 측방유동분석 타입의 키트 구조를 살펴보면 시료가 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 시료가 이동하여 분리되고 항체 항원 반응이 일어나는 전개용 막(주로, 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동하기 위한 흡수패드(absorption pad)로 되어 있다. 탐지용 항체는 탐지를 표지하기 위하여 예를 들면 콜로이드성 금입자에 고정되어 있다. 금입자 대신 라텍스 비드(latex bead) 또는 탄소입자를 사용하기도 한다. 측방유동분석용 진단 키트는 대개 샌드위치 형태로 분석물을 탐지하도록 고안되어 있다. 시료 속에 들어 있는 분석물이 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 먼저 방출패드에 코팅되어 탐지용항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 전개막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획 항체는 전개막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 금입자의 양으로 판단한다.In another aspect, the present invention includes immunochromatography assays. A representative example of this is a lateral flow assay. Looking at the kit structure of the lateral flow analysis type, a sample pad to which a sample is applied, a release pad coated with a detection antibody, and a membrane for development in which the sample is moved and separated and an antibody antigen reaction occurs ( Predominantly nitrocellulose) or strips, and absorption pads for continuous movement of the sample. Detection antibodies are immobilized, for example, on colloidal gold particles to label detection. Latex beads or carbon particles may be used instead of gold particles. Diagnostic kits for lateral flow analysis are usually designed to detect analytes in the form of sandwiches. As the analyte in the sample is applied to the sample pad and begins to move, it is first coated on the release pad, reacts with the detection antibody, and continues to develop in the form of an antigen-antibody conjugate. As it moves, it reacts once more with the capture antibody immobilized on the developing membrane to form a sandwich-type complex. Since the capture antibody is immobilized on the developing membrane, if antigen-antibody reactions continue to occur, accumulation of the complex takes place on the fixed side of the capture antibody. Since proteins are transparent to the naked eye, the formation and relative amount of complexes are determined by the amount of gold particles attached.
본 발명의 또 다른 관점은 G-CSF 유전자의 액손3 부위의 결실여부를 분석함으로서 암을 진단하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 인간 또는 동물의 조직 또는 세포 시료로부터 핵산시료를 획득한 다음 분자생물학적 방법을 이용하여 상기 핵산시료에서 G-CSF 유전자의 액손3 부위가 결실되었는지 여부를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. 인간의 조직 또는 세포 시료는 인간 기원의 액상시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포 및 그 자손이 포함된다. 또한, 상기 시료들은 시약처리, 가용화된 시료 또는 배양세포, 세포 상등액 및 세포 용해물도 포함한다. 보다 상세하게는, 본 발명의 목적상 인간의 조직 또는 세포시료는 종양 조직 또는 종양성으로 생각되는 조직을 포함하며, 예컨대 절제수술, 생검, 흡인법 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 얻어진다. 인간의 조직 또는 세포시료로부터 핵산시료의 분리는 당업계에 공지된 방법에 의해 획득될 수 있다.Another aspect of the invention provides a method for diagnosing cancer by analyzing the deletion of the axon3 region of the G-CSF gene. Specifically, the present invention can diagnose cancer by obtaining a nucleic acid sample from a human or animal tissue or cell sample, and then confirming whether the axon 3 region of the G-CSF gene is deleted from the nucleic acid sample by using a molecular biological method. have. Human tissue or cell samples include solid tissue samples such as liquid samples, biopsy specimens, tissue cultures of human origin or cells derived therefrom and their progeny. The samples also include reagent treatment, solubilized samples or cultured cells, cell supernatants and cell lysates. More specifically, for the purposes of the present invention, human tissues or cell samples include tumor tissues or tissues considered to be neoplastic, such as obtained by excisional surgery, biopsy, aspiration or other methods known in the art. . Isolation of nucleic acid samples from human tissue or cell samples can be obtained by methods known in the art.
본 발명에 따른 암 진단 방법은 상기에 설명한 바와 같이 액손3 결실여부를 유전자의 염기서열분석을 통해서 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 유전자가 발현되어 만들어진 G-CSF 단백질상의 액손3에 특이적인 탐침 예를 들어, 액손3의 아미노산 서열이 결실된 G-CSF 변이체에 특이적인 항체를 이용하여 그 결실여부를 측정함으로서도 가능하다.As described above, the cancer diagnosis method according to the present invention can not only diagnose axon 3 deletion by sequencing a gene, but also a probe specific to axon 3 on the G-CSF protein, in which the gene is expressed. For example, it is also possible to measure the deletion using an antibody specific for the G-CSF variant in which the amino acid sequence of Axon 3 is deleted.
본 발명의 암의 진단방법의 대상 암으로는 위암, 유방암, 육종, 장암, 폐암 자궁경부암, 간암, 전립선암, 설암, 후두암, 인두암, 구강암, 갑상선암, 대장암, 식도암, 고환암 등의 암을 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.The cancer of the present invention is a cancer of the stomach cancer, breast cancer, sarcoma, intestinal cancer, lung cancer, cervical cancer, liver cancer, prostate cancer, tongue cancer, laryngeal cancer, pharyngeal cancer, oral cancer, thyroid cancer, colon cancer, esophageal cancer, testicular cancer. It can be useful for diagnosis.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the examples.
실시예 1Example 1
암세포주로부터 mRNA 및 cDNA의 제조 Preparation of mRNA and cDNA from Cancer Cell Lines
8종의 정상 세포 및 조직과 17종의 암세포주로부터 mRNA 및 cDNA를 제조하였다. 본 발명의 실시예에서 사용한 정상 세포주와 암세포주는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.MRNA and cDNA were prepared from 8 normal cells and tissues and 17 cancer cell lines. Normal cell lines and cancer cell lines used in Examples of the present invention are shown in Table 1 below.
상기 암세포주 모두는 상기 표에 기재된 기관으로부터 자유롭게 분양받아 이용될 수 있는 것이다. 또한, 사람의 정상 임파구, 단핵구, 표피조직, 진피조직, 모낭세포, 지방세포, 근육세포 등도 연세대학 의과대학 암전이연구센터로부터 용이하게 분양받을 수 있다. 연세대학교 의과대학 암전이연구센터로부터 분양받은 암세포주 YCC-7은 다음의 방법으로 제작된 것이다. 진행성 암환자로부터 무균적으로 복수를 얻어 세포의 클럼핑(clumping)을 방지하기 위하여 헤파린(heparin) 10unit/ml을 첨가 후, 400 x g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리하여 획득한 침전세포를 25㎠ 플라스크에 배양하였다. 적혈구가 다량 함유된 경우에는 피콜-하파큐(Ficoll-Hypaque)로 800 x g에서 비중원심 분리 후 단핵구층만을 얻어 5% CO2 37℃에서 배양하였다. 배양 하루(16-18시간)후 배양액을 다시 400 x g에서 10분간 원심분리하고 침전세포를 다른 25㎠ 플라스크에 배양하였다. 배양액중의 세포 상태를 위상차 현미경으로 관찰하면서 주 2-3회 새로운 배지로 교환하였다. 세포 관찰시 암세포 군락이 확인되면 효소인 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA)를 처리하거나 또는 콜로니(colony)를 얻거나 또는 스크래퍼(scraper)를 이용하여 암세포 군락만을 획득하거나 또는 부유액에 존재하는 암세포를 다시 원침하여 정상세포 등을 제거하여 순수한 암세포만을 얻어 패시지(passage)별로 세포 동결하여 보관하였다.All of the cancer cell lines can be used freely from the organs listed in the table. In addition, human normal lymphocytes, monocytes, epidermal tissue, dermal tissue, hair follicle cells, adipocytes, muscle cells, etc. can be easily distributed from the cancer metastasis research center of Yonsei University College of Medicine. Cancer cell line YCC-7, which was distributed from Yonsei University College of Medicine Cancer Metastasis Research Center, was produced by the following method. In order to obtain aseptic ascites from advanced cancer patients, 10 units / ml of heparin was added to prevent clumping of cells, and then centrifuged at 400 × g for 10 minutes. Precipitated cells obtained by centrifugation were incubated in a 25 cm 2 flask. When red blood cells are much contained, the Ficoll-pakyu and takes the monocyte layer only after the specific gravity centrifugation at 800 xg to (Ficoll-Hypaque) and cultured in 5% CO 2 37 ℃. After one day of culture (16-18 hours), the culture was again centrifuged at 400 xg for 10 minutes and the precipitated cells were incubated in another 25 cm 2 flask. The cell state in the culture was replaced with fresh medium 2-3 times a week while observing with a phase contrast microscope. If cancer cell colonies are identified during cell observation, treatment with the enzyme Trypsin-EDTA or colonies are obtained, or only a cancer cell colony is obtained using a scraper, or cancer cells present in the suspension are recovered. By removing the normal cells by centrifugation, only pure cancer cells were obtained, and the cells were stored by freezing each passage.
각 암세포주, 정상 세포 및 정상 조직으로부터 전체 RNA는 TRI-REAGENT (GIBCO-BRL, 미국)를 이용하여 분리하였다. 액체질소를 이용해 급속 동결시켜 갈아진 조직샘플(tissue sample)에 트리졸 시약(Trizol reagent) 1 mL를 첨가하고 상온에서 5분 동안 반응시켰다. 여기에 0.2 mL 클로로포름을 첨가한 후 심하게 15초 동안 흔들어준 후 상온에서 5분간 반응시켰다. 상기 샘플을 12000 x g, 4℃에서 15분 동안 원심분리 한 후 수용성층(aqueous phase)을 새로운 튜브로 옮기고 이소프로필 알콜(isoproply alcohol)을 동량 첨가하고 4℃에서 10분간 반응시켰다. 반응액을 12000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리한 다음 침전물(pellet)이 떨어지지 않게 상층액을 버리고 70% 에탄올로 7500 x g, 4℃에서 5분간 침전물을 세척하였다. RNA를 잘 건조시킨 후 RNA 가수분해효소-자유수(RNase-free water)로 용해하였다.Total RNA from each cancer cell line, normal cells and normal tissues was isolated using TRI-REAGENT (GIBCO-BRL, USA). 1 mL of Trizol reagent was added to the tissue sample, which was rapidly frozen with liquid nitrogen, and reacted at room temperature for 5 minutes. After 0.2 mL chloroform was added thereto, the mixture was shaken vigorously for 15 seconds and then reacted at room temperature for 5 minutes. The sample was centrifuged at 12000 × g, 4 ° C. for 15 minutes, then the aqueous phase was transferred to a new tube, and an equal amount of isopropyl alcohol was added and reacted at 4 ° C. for 10 minutes. The reaction solution was centrifuged at 12000 × g, 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was discarded so that the pellets did not fall off. The precipitate was washed with 7500 × g, 4 ° C. for 5 minutes with 70% ethanol. The RNA was dried well and then dissolved in RNA hydrolase-free water.
각각의 세포주 및 사람조직 유래의 암세포 및 정상세포로부터 얻은 mRNA로부터 cDNA를 합성하기 위해 다음과 같은 역전사 중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 수행하였다. 전체 RNA 2㎍과 올리고(dT)16-프라이머(oligo(dT)16 -primer) 1㎕에 RNA 가수분해효소-자유수(RNase-free water)를 첨가하여 최종부피가 11㎕이 되도록 한 후 90℃에서 5분간 반응시키고 얼음에 빠르게 옮겼다. 다른 튜브에 반응완충용액 4㎕, 10mM dNTPs 2㎕, RNA 가수분해효소 억제제(RNase inhibitor) 1㎕, RTase 2㎕를 혼합한 후, 이 혼합물을 튜브(pre-mixture tube)에 8.5㎕씩 분주하고 실온에서 10분간 반응시켰다. 상기 반응물을 42℃에서 90분 동안 반응시키고 95℃로 옮겨 15분간 다시 반응시킨 후 재빨리 얼음에 옮겨서 반응을 종료시켜 각각의 cDNA를 제조하였다.The following reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was performed to synthesize cDNA from mRNAs from cancer cells and normal cells derived from each cell line and human tissue. Oligonucleotide with total RNA 2㎍ (dT) 16 - primer (oligo (dT) 16 -primer) RNA hydrolase in 1㎕ - after the final volume by the addition of free water (RNase-free water) such that the 11㎕ 90 Reaction was carried out for 5 minutes at ℃ and quickly transferred to ice. 4 μl of reaction buffer solution, 2 μl of 10mM dNTPs, 1 μl of RNAase inhibitor and 2 μl of RTase were mixed, and 8.5 μl of the mixture was mixed into a pre-mixture tube. The reaction was carried out at room temperature for 10 minutes. The reactants were reacted at 42 ° C. for 90 minutes, transferred to 95 ° C. for 15 minutes, and then quickly transferred to ice to terminate the reaction, thereby preparing respective cDNAs.
실시예 2Example 2
중합효소 연쇄반응을 통한 hG-CSF 유전자의 검색Search for hG-CSF Gene by Polymerase Chain Reaction
각각의 암세포주에서 정상적인 hG-CSF 유전자의 발현여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 cDNA를 주형(template DNA)으로 하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다. PCR은 도 2에 나타낸 바와같이, hG-CSF 유전자의 액손2의 일부부터 액손5까지(Thr1 - Pro174)를 증폭한 PCR1 반응과 액손2의 일부부터 액손3까지(Ile24 - Leu71)를 증폭한 PCR2 반응 및 액손3부터 액손4의 일부분(Cys36 - Ser80)을 증폭한 PCR3 반응을 수행하였다. In order to confirm the normal expression of hG-CSF gene in each cancer cell line, each polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR) was performed using each cDNA prepared in Example 1 as a template (template DNA). As shown in FIG. 2, PCR1 reaction amplified from a part of axon 2 to axon 5 (Thr1-Pro174) of the hG-CSF gene and PCR2 amplified from part of axon 2 to axon 3 (Ile24-Leu71) as shown in FIG. 2. Reaction and PCR3 reactions in which axons 3 to axons 4 (Cys36-Ser80) were amplified.
PCR1 반응은 각각의 암세포주 cDNA를 주형으로 하여 프라이머쌍 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(센스, 서열번호 1)과 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3'(안티센스, 서열번호 2)를 이용하여 수행하였다. PCR2 반응은 각각의 암세포주 cDNA를 주형으로 하여 프라이머쌍 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3'(센스, 서열번호 3)과 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(안티센스, 서열번호 5)를 이용하여 수행하였다. PCR3 반응은 각각의 암세포주 cDNA를 주형으로 하여 프라이머쌍 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(센스, 서열번호 4)과 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3'(안티센스, 서열번호 6)을 이용하여 수행하였다. PCR 반응은 고도의 PCR 시스템(High Fidelity PCR system, Boehringer Mannheim Co., 독일)을 이용하여 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 7분간 한번 하였고, 두 번째 변성은 94℃에서 40초, 교잡(annealing)은 56℃에서 40초, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 7분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. PCR1 reaction was performed using primer pairs 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3 '(sense, SEQ ID NO: 1) and 5'-TCAGGGCTGGGCAAGGTG-3' (antisense, SEQ ID NO: 2) using each cancer cell line cDNA as a template. The PCR2 reaction was carried out using primer pairs 5'-ATCCAGGGCGATGGCGCAGCG-3 '(sense, SEQ ID NO: 3) and 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3' (antisense, SEQ ID NO: 5) using each cancer cell line cDNA as a template. PCR3 reaction was carried out using primer pair 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3 '(sense, SEQ ID NO: 4) and 5'-CGCTATGGAGTTGGCTCAAGC-3' (antisense, SEQ ID NO: 6) using each cancer cell line cDNA as a template. The PCR reaction was performed under the following conditions using a high PCR system (High Fidelity PCR system, Boehringer Mannheim Co., Germany). The first denaturation was performed once at 94 ° C for 7 minutes, the second denaturation was performed at 94 ° C for 40 seconds, the annealing for 40 seconds at 56 ° C, and the extension for 1 minute at 72 ° C. Repeated times. Then, the last extension was performed once for 7 minutes at 72 ° C.
PCR 반응결과로 생성된 산물을 아가로스 겔 전기영동법(agarose gel electrophoresis)으로 확인하였다. 전기영동 실험 결과, PCR1 반응산물의 경우 암세포주로부터 유래된 대부분의 PCR 산물은 정상적인 G-CSF 유전자보다 작은 크기를 갖고 있었으며 U-87MG의 경우에만 정상적인 G-CSF 유전자의 크기를 갖고 있었다(도 3a에서 M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:YCC-7, 레인3:AGS, 레인4:SNU-1, 레인5:MDA-MB-231, 레인6:MCF-7, 레인7:SK-BR-3, 레인8:HT-1080, 레인9:HCT-116, 레인10:COLO205; 도 3b에서 M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:DLD-1, 레인3:HT-29, 레인4:A549, 레인5:NCI-H460, 레인6:HeLa, 레인7:C-33A, 레인8:B16, 레인9:U-87MG). PCR2 반응산물과 PCR3 반응산물의 각 아가로스 겔 전기영동 분석결과의 경우는 상기 PCR1의 반응산물에서 정상으로 확인된 U-87MG 세포주에서만 PCR 산물을 얻을 수 있었으며 나머지 암세포주에서는 PCR 산물을 획득할 수 없었다(도 6 및 도 7). 또한, 상기 PCR2 반응과 PCR3 반응을 통해 획득한 U-87MG 세포주의 PCR 산물은 정상세포로부터 획득한 PCR 산물과 크기가 같음을 알 수 있었다. The product produced as a result of the PCR reaction was confirmed by agarose gel electrophoresis. As a result of the electrophoresis experiment, most PCR products derived from the cancer cell line had a smaller size than the normal G-CSF gene, and only U-87MG had a normal G-CSF gene size (FIG. 3A). M: size marker, lane 1: normal cell line, lane 2: YCC-7, lane 3: AGS, lane 4: SNU-1, lane 5: MDA-MB-231, lane 6: MCF-7, lane 7: SK-BR-3, lane 8: HT-1080, lane 9: HCT-116, lane 10: COLO205; in FIG. 3B, M: size marker, lane 1: normal cell line, lane 2: DLD-1, lane 3: HT -29, lane 4: A549, lane 5: NCI-H460, lane 6: HeLa, lane 7: C-33A, lane 8: B16, lane 9: U-87MG). In the agarose gel electrophoresis analysis of PCR2 and PCR3 reaction products, PCR products were obtained only in U-87MG cell lines identified as normal in the PCR1 reaction products, and PCR products could be obtained from the remaining cancer cell lines. None (FIG. 6 and FIG. 7). In addition, the PCR product of the U-87MG cell line obtained through the PCR2 reaction and PCR3 reaction was found to be the same size as the PCR product obtained from normal cells.
또한, PCR1 반응산물의 유전자 염기서열을 자동염기서열 분석기(automatic DNA sequencer, ABI Prism model 377, Perkin Elmer Co. 미국)로 분석하였다. PCR1 반응산물의 염기서열 분석 결과, U-87MG 세포주로부터 획득한 PCR 산물은 정상 세포의 G-CSF 유전자와 동일한 서열(서열번호 7)을 갖고 있는 반면 나머지 암세포주에서 획득한 PCR 산물은 정상 세포의 G-CSF 유전자 염기서열과 비교하였을 때 중간에 108bp가 결실(deletion)된 서열(서열번호 8)을 갖고 있음을 확인하였다(도 4 및 도 5). 결실된 부분을 제외한 나머지 부분은 정상 세포 G-CSF 유전자의 염기서열과 완전히 일치하였다. 결실된 108bp에 해당하는 G-CSF 유전자의 염기서열을 확인한 결과, 총 5개의 액손으로 구성된 G-CSF 유전자에서 액손3에 해당하는 부분임을 알 수 있었다. In addition, the gene sequence of the PCR1 reaction product was analyzed by an automatic DNA sequencer (ABI Prism model 377, Perkin Elmer Co. USA). Sequence analysis of the PCR1 reaction product revealed that the PCR product obtained from the U-87MG cell line had the same sequence as the G-CSF gene of the normal cell (SEQ ID NO: 7), whereas the PCR product obtained from the remaining cancer cell lines was determined as When compared with the G-CSF gene nucleotide sequence it was confirmed that it has a 108bp deletion (SEQ ID NO: 8) in the middle (Figs. 4 and 5). Except for the deleted part, it was completely identical to the nucleotide sequence of the normal cell G-CSF gene. As a result of confirming the base sequence of the G-CSF gene corresponding to the deleted 108 bp, it was found that the portion corresponding to axon 3 in the G-CSF gene consisting of a total of five axons.
본 발명자들은 정상인의 조직에서도 정상 세포와 같은 PCR 결과가 나타나는지 알아보기 위해 정상인 임파구, 단핵구, 표피조직, 진피조직, 모낭세포, 지방세포, 근육세포 등에서 RNA를 채취하여 RT-PCR을 실시한 결과 정상조직에서는 액손 3결실이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 암세포에서 G-CSF 유전자의 액손3 결실이 단순히 PCR 과정에서 일어날 수 있는 결과가 아님을 보여주는 것이다. 실제로, 액손3 결실에 의해 암세포에서는 정상의 G-CSF가 아닌 변이 G-CSF 단백질이 만들어지고 있다는 것을 확인하였다(도 11). 또한, 상기 액손3이 결실된 변이 G-CSF 단백질은 그 원래의 활성부위가 없어지고 결합(folding)구조도 정상의 G-CSF 단백질과는 상이하게 형성될 가능성이 크며 이에 따라 암세포에서는 G-CSF 단백질이 정상적인 역할을 하지 못할 것으로 생각된다.The present inventors carried out RT-PCR by RNA from normal lymphocytes, monocytes, epidermal tissue, dermal tissues, hair follicle cells, adipocytes, muscle cells, etc. to determine whether PCR results, such as normal cells, appear in normal tissues. It was confirmed that the axon 3 deletion did not appear. This shows that axon3 deletion of the G-CSF gene in cancer cells is not simply a result of PCR. In fact, it was confirmed that the axon 3 deletion produced a mutant G-CSF protein instead of the normal G-CSF in cancer cells (FIG. 11). In addition, the mutant G-CSF protein, in which the axon 3 is deleted, is likely to lose its original active site and to have a folding structure different from that of the normal G-CSF protein. Protein is not thought to play a normal role.
실시예 3Example 3
혼성화(Hybridization)방법을 통한 G-CSF 유전자의 검색Search for G-CSF Gene by Hybridization Method
혼성화 방법을 통해 암세포주에서의 G-CSF cDNA의 액손3 결실을 확인하였다. 정상 세포주로부터 유래된 G-CSF 유전자를 주형으로 하고 프라이머쌍 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3'(센스, 서열번호 4)와 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3'(안티센스, 서열번호 5)를 이용하여 PCR을 수행하여 G-CSF 유전자의 액손3 부위의 DNA절편(108bp)를 획득하였다. Hybridization method confirmed axon 3 deletion of G-CSF cDNA in cancer cell lines. PCR was performed using the G-CSF gene derived from the normal cell line as a template and primer pairs 5'-TGTGCCACCTACAAGCTGTGC-3 '(sense, SEQ ID NO: 4) and 5'-CAGCTGCAGGGCCTGGCT-3' (antisense, SEQ ID NO: 5). The DNA fragment (108 bp) of the axon 3 site | part of the G-CSF gene was obtained.
또한, 정상 세포주로부터 유래된 G-CSF 유전자를 주형으로 하고 프라이머쌍 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3'(센스, 서열번호 1)과 5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3'(안티센스, 서열번호 9)를 이용하여 PCR을 수행함으로써 G-CSF 유전자의 액손2 부위의 DNA절편(105bp)을 획득하였다. PCR was also performed using the G-CSF gene derived from the normal cell line as a template and primer pairs 5'-ACCCCCCTGGGCCCTGCC-3 '(sense, SEQ ID NO: 1) and 5'-CAGCTTCTCCTGGAGCGC-3' (antisense, SEQ ID NO: 9). The DNA fragment (105bp) of the axon 2 site | part of the G-CSF gene was obtained by performing the following.
나일론 멤브레인(Boehringer Mannheim, 독일)에 각각의 분리 정제한 각각의 DNA 단편 50ng/㎕를 스팟팅(spotting)한 다음 80℃에서 2시간동안 놓아두어 고정화하였다.50 ng / μl of each separated and purified DNA fragment on a nylon membrane (Boehringer Mannheim, Germany) was spotted and then immobilized by leaving it at 80 ° C. for 2 hours.
멤브레인의 액손2 및 액손3의 혼성화 반응을 위한 각 세포주의 표적(target)은 다음과 같은 방법으로 제작하였다. 역전사 반응은 먼저 반응액 A(총 RNA 2㎍, 올리고(dT)16-프라이머(oligo(dT)16-primer) 1㎕, 최종부피 15㎕)만 넣어둔 튜브를 94℃에 2분간 두어 변성(denaturation) 과정을 수행하였으며, 이후 온도를 42℃로 천천히(20분 이내) 낮춘 후 반응액 B(dATP, dGTP, dCTP 각 333μM, 역전사효소 완충용액 1x, 20μCi [α-33P] dCTP (2,000 내지 3,000 Ci/mmol), AMV 역전사효소 50 U, 최종 부피 30㎕)를 더한 후 42℃에 2시간동안 역전사 반응을 수행하였다. 역전사 반응 후 중합반응에 이용되지 않은 [α-33P] dCTP를 비롯한 dNTP는 QIAquick Nucleotide Removal Kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 제거하였다.The target of each cell line for hybridization of axon 2 and axon 3 of the membrane was prepared by the following method. Reverse transcription reaction is first reaction solution A - a couple of 2 minutes denatured the only left in the tube (the total RNA 2㎍, oligo (dT) 16 primer (oligo (dT) 16 -primer) 1㎕, 15㎕ final volume) in 94 ℃ ( denaturation) and then the temperature was slowly lowered to 42 ° C. (within 20 minutes), followed by reaction solution B (dATP, dGTP, dCTP each 333 μM, reverse transcriptase buffer solution 1 ×, 20 μCi [α- 33 P] dCTP (2,000 to 3,000 Ci / mmol), AMV reverse transcriptase 50 U, final volume 30 μl) was added and then reverse transcription was performed at 42 ° C. for 2 hours. After the reverse transcription reaction, dNTP including [α- 33 P] dCTP, which was not used in the polymerization, was removed using a QIAquick Nucleotide Removal Kit (Qiagen, Germany).
이렇게 제작된 cDNA 표적을 이용하여 G-CSF의 액손2 및 액손3 부분이 고정화되어 있는 나일론 멤브레인에서 혼성화 반응을 수행하였다. 먼저 나일론 멤브레인을 2X SSPE 완충용액[1x SSPE : 0.18M NaCl, 10 mM 인산나트륨, pH 7.7, 1mM EDTA] 에 5분간 담궈둔 뒤 이를 제거하고 65℃로 미리 데워진 혼성화 용액[5x SSPE, 2% SDS, 1x Denhardt 시약, 100㎍/mL 음파 변성된 연어 정자 DNA] 2mL를 다시 첨가하였다. 65℃에서 1시간 동안 놓아둔 뒤, cDNA 프로브 10㎕를 혼성화 용액 0.5mL에 더한 후 10분간 끓였다. 이를 멤브레인이 담긴 밀봉된 비닐에 같이 넣어 65℃에서 18시간 동안 혼성화 과정을 수행하였다. 혼성화 과정이 끝난 뒤 세척용액[0.5x SSPE, 0.2% SDS]을 이용하여 65℃에서 30분씩 모두 세 번을 교환하여 수행하였다. 모든 혼성화 과정이 끝난 뒤 X-선 필름을 이용하여 혼성화 되어 있는 방사능을 판독하였다. Using the cDNA target thus prepared, a hybridization reaction was performed on a nylon membrane in which axon 2 and axon 3 portions of G-CSF were immobilized. First, the nylon membrane was immersed in 2X SSPE buffer solution [1x SSPE: 0.18M NaCl, 10 mM sodium phosphate, pH 7.7, 1mM EDTA] for 5 minutes, then removed and the pre-warmed hybridization solution [5x SSPE, 2% SDS , 1 × Denhardt reagent, 100 mL / mL sonically denatured salmon sperm DNA] 2 mL were added again. After 1 hour at 65 ° C., 10 μl of the cDNA probe was added to 0.5 mL of the hybridization solution and boiled for 10 minutes. This was put together in a sealed vinyl containing a membrane and the hybridization process was performed at 65 ℃ for 18 hours. After the hybridization process was performed by replacing all three times at 65 ℃ using a washing solution [0.5x SSPE, 0.2% SDS] for 30 minutes. After all the hybridization process, the hybridized radioactivity was read using an X-ray film.
실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 암세포주(YCC-7, AGS, HT-29, A549, MCF-7)에서 분리한 표적의 경우 액손2에는 결합을 하고 있으나 액손3에는 결합하지 않았다(도 8a, 8b, 8c, 8d, 8e). 반면에, 정상 유전자를 갖고 있는 U-87MG의 경우 액손2와 액손3에 모두 결합하고 있음을 확인할 수 있었다(도 8f). 이와 같이 혼성화 방법을 이용하여 액손3 결핍 여부를 쉽게 확인할 수 있었다. 혼성화 방법은 최근 급발전하고 있는 DNA 마이크로어레이를 이용한 검색 방법에도 쉽게 적용이 가능하며, 따라서 이를 이용한 다양한 방법들이 용이하게 개발이 될 수 있으며 이를 통한 암 진단이 매우 용이하고 정확하게 이뤄질 수 있을 것으로 생각된다.As a result, as shown in FIG. 8, targets separated from cancer cell lines (YCC-7, AGS, HT-29, A549, MCF-7) bind to axon 2 but not to axon 3 (FIG. 8A). , 8b, 8c, 8d, 8e). On the other hand, U-87MG having a normal gene was confirmed that it binds to both axon 2 and axon 3 (Fig. 8f). In this way, it was easy to determine whether the axon 3 deficiency by using the hybridization method. Hybridization method can be easily applied to search method using DNA microarray which is rapidly developing recently. Therefore, various methods using this method can be easily developed, and cancer diagnosis can be made very easy and accurate. .
실시예 4Example 4
액손 3 결실 검색용 DNA 칩을 통한 G-CSF 유전자 검사G-CSF Genetic Testing with DNA Chips for Axon 3 Deletion Detection
G-CSF의 액손3 부분이 결실여부를 확인하기 위한 도구로서 DNA 칩을 적용할 수 있는지를 알아보기 위해 유리판 위에 고정화시킬 DNA 단편 탐침을 제작하였다.A DNA fragment probe to be immobilized on a glass plate was fabricated to see if the axon 3 portion of G-CSF could be applied as a tool to confirm the deletion.
탐침은 G-CSF의 액손2 부분에서 하나의 탐침, 액손3 부분에 서로 겹치지 않게 4개의 탐침을, 액손4 부분에서 하나의 탐침을 20개의 올리고뉴클레오티드로 구성하게끔 디자인하였다. 또한, 액손2-액손3에 걸쳐 하나의 탐침을, 액손3-액손4에 걸쳐 하나의 탐침을, 액손2-액손4에 걸쳐 하나의 탐침을 각 액손의 염기서열을 8개씩 가지고 있게끔 하여 디자인하였다. G-CSF 의 액손2 부분은 교대 스플라이싱(alternative splicing) 기작에 의해 두 종류(사람 G-CSFa, 사람 G-CSFb)를 가지고 있으므로(Tshuchiya M. et al., EMBO J 5:575-581, 1986), 액손 2부분에서 디자인한 탐침은 각각 두 종류 모두 디자인하였다. The probe was designed to consist of one probe in the axon 2 part of G-CSF, four probes in the axon 3 part so as not to overlap each other, and one probe in the axon 4 part of 20 oligonucleotides. We also designed one probe across Axon2-Axon3, one probe across Axon3-Axon4, and one probe across Axon2-Axon4, each with eight base sequences for each axon. . The axon2 portion of G-CSF has two types (human G-CSFa, human G-CSFb) by alternating splicing mechanisms (Tshuchiya M. et al., EMBO J 5: 575-581). , 1986). In each of the two axons, two types of probes were designed.
DNA 탐침을 고정화하기 위해서 모든 DNA 단편 탐침을 합성할 때, 3' 첫번째 위치에 아미노링커컬럼(Aminolinker column, Cruachem, Glasgrow, Scotland)을 이용하여 아민기(amino residue)를 가진 염기를 삽입하였고, 슬라이드 글라스(slide glass)은 알데히드기(aldehyde residue)로 코팅화되어 있는 것을 구입(CEL Associates, Inc., Huston, Taxas, USA)하였다. 탐침을 3× SSC (0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 완충 용액에 용해시킨 상태로 본 실험실에서 자체 제작한 마이크로어레이어(microarrayer)를 이용하여(Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol. 10:21-26, 2000) 집적한 후, 55% 정도의 습도가 유지되는 조건에서 1시간 이상 화학 반응을 유도하고, 6시간 이상 방치하여 DNA 탐침을 고정화하였다. 균 검색용 탐침은 100μM의 농도로 전체 탐침을 275㎛ 간격을 두고 순서대로 집적화시켜 마이크로어레이를 제작하였다.When synthesizing all DNA fragment probes to immobilize the DNA probe, a base having an amino residue was inserted using an aminolinker column (Aminolinker column, Cruachem, Glasgrow, Scotland) at the 3 'first position, and then slide. Glass (slide glass) was coated with an aldehyde residue (CEL Associates, Inc., Huston, Taxas, USA) was purchased. The probe was dissolved in 3 × SSC (0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH 7.0) buffer solution using a microarray made in-house (Yoon et al, J. Microbiol. Biotechnol. 10). : 21-26, 2000) After integration, chemical reactions were induced for 1 hour or more under conditions of 55% humidity and left for 6 hours to immobilize DNA probes. The microorganism was prepared by integrating the total probes in order of 275 μm intervals at a concentration of 100 μM.
탐침의 아민기와 유리판 위의 알데히드 사이의 반응이 원활히 이루어져 고정화가 잘 이루어졌는지 확인하기 위해 사이브로 그린 II (SYBRO green II, Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands)로 염색하여 확인하였다.In order to confirm that the reaction between the amine group of the probe and the aldehyde on the glass plate was smooth and well immobilized, it was confirmed by staining with SYBRO green II (Molecular Probe, Inc., Leiden, Netherlands).
각각의 세포주에서 추출한 G-CSF 유전자를 주형으로 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)을 수행하여 단편 유전자를 제작하고 이를 유리판 위에 고정될 탐침으로 사용하였다. 단편 유전자는 프라이머쌍 5'-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3'(센스, 서열번호 10)와 5'-FITC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3'(안티센스, 서열번호 11)의 첨가비율을 1:5로 차별화 함으로써 한번의 중합효소연쇄반응으로 획득하였다. 슬라이드 글라스 위에 고정화시킨 탐침은 하기 표 2에 수록되어 있다.The G-CSF gene extracted from each cell line was subjected to asymmetric amplification (Asymmetric PCR) as a template to prepare a fragment gene, which was used as a probe to be fixed on a glass plate. Fragment gene is a single polymerase by differentiating the addition ratio of primer pair 5'-CTGCAGCTGCTGCTGTGGCAC-3 '(sense, SEQ ID NO: 10) and 5'-FITC-CTGCTGCCAGATGGTGGT-3' (antisense, SEQ ID NO: 11) by 1: 5. Obtained by chain reaction. The probes immobilized on the slide glass are listed in Table 2 below.
비대칭 증폭방법을 위한 PCR 반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 첫 번째 변성은 94℃에서 5분간, 두 번째 변성은 94℃에서 1분간 수행하였다. 교잡은 56℃에서 1분, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 10회 반복하였다. 그 후, 다시 세 번째 변성은 94℃에서 1분, 교잡은 58℃에서 1분, 연장은 72℃에서 30초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다. PCR reaction for the asymmetric amplification method was performed under the following conditions. The first denaturation was performed at 94 ° C. for 5 minutes and the second denaturation at 94 ° C. for 1 minute. Hybridization was performed at 56 ° C. for 1 minute and extension at 72 ° C. for 30 seconds, which was repeated 10 times. Thereafter, the third denaturation was performed at 94 ° C for 1 minute, hybridization at 58 ° C for 1 minute, and extension at 72 ° C for 30 seconds, which was repeated 30 times. Thereafter, the last extension was performed once at 72 ° C. for 5 minutes.
PCR 반응결과로 생성된 산물은 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다. 각 균들에 대해 DNA 이중 가닥과 단편 가닥이 동시에 합성되었음을 확인하였다. G-CSF 액손3이 결실된 플라스미드와 결실되어 있지 않은 플라스미드를 가지고 G-CSF 부분을 비대칭 증폭 방법을 통해 증폭한 후, DNA 칩을 이용하여 검색하여 보았다. 혼성화 완충용액(6× SSPE, 20%(v/v) 포름아미드)에 비대칭 증폭 방법(Asymmetric PCR)으로 증폭시킨 유전자를 15㎕ 넣어서 총 부피가 200㎕가 되도록 제조하였다. 제조된 용액을 탐침이 고정화되어 있는 유리판 위에 분주한 후 프로브-클립 프레스-씰 배양실(probe-clip press-seal incubation chamber, Sigma Co., St. Louis, MO.)로 덮은 후, 30℃ 항온진탕배양기(shaking incubator)에서 6시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도해 보았다. 시간이 경과한 후 3× SSPE(0.45M NaCl, 15mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 2× SSPE(0.3M NaCl, 10mM C6H5Na3O7, pH 7.0), 1× SSPE(0.15M NaCl, 5mM C6H5Na3O7, pH 7.0) 순으로 각각 5분씩 세척하였다. 스캔어레이(Scanarray) 5000(GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.)을 이용하여 검색하였다.The resulting product was confirmed by agarose gel electrophoresis. For each bacterium, DNA double strands and fragment strands were synthesized at the same time. G-CSF moieties were amplified by asymmetric amplification using a plasmid without G-CSF axon 3 and a plasmid without deletion, and then searched using a DNA chip. 15 μl of amplified gene (Asymmetric PCR) was added to hybridization buffer solution (6 × SSPE, 20% (v / v) formamide) to prepare a total volume of 200 μl. After dispensing the prepared solution on the glass plate to which the probe is immobilized, and then covered with a probe-clip press-seal incubation chamber (Sigma Co., St. Louis, MO.), 30 ℃ constant temperature shaking The reaction was induced for 6 hours in a shaking incubator to induce complementary binding. After elapse of time 3 × SSPE (0.45M NaCl, 15 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 , pH 7.0), 2 × SSPE (0.3M NaCl, 10 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 , pH 7.0), 1 SSPE (0.15 M NaCl, 5 mM C 6 H 5 Na 3 O 7 , pH 7.0) was washed for 5 minutes each. Search was performed using Scanarray 5000 (GSI Lumonics Inc., Bedford, MA.).
도 9에서 보듯이, 액손3이 결실되지 않은 플라스미드의 경우, 모든 탐침에 시그널이 나타나는 반면, 액손3이 결실된 플라스미드의 경우, 액손2와 액손4 부분에만 시그널이 나타남을 볼 수 있다. 이 플라스미드는 액손2의 a타입의 염기서열을 가지고 있다.As shown in FIG. 9, in the case of the plasmid without axon 3, a signal appears in all probes, whereas in the plasmid in which axon 3 was deleted, a signal appears only in the axon 2 and axon 4 portions. This plasmid has a base sequence of a type of axon 2.
이 결과로 인해, 상기에 제시한 프라이머와 탐침을 이용하여 G-CSF의 액손3 부분의 결실여부를 검색할 수 있는 DNA 칩 개발이 가능함을 알 수 있다. As a result, it can be seen that it is possible to develop a DNA chip that can detect the deletion of the axon 3 portion of G-CSF using the primers and probes presented above.
실시예 5Example 5
유가식 재조합 G-CSF 변이체 단백질 생산Federated Recombinant G-CSF Variant Protein Production
재조합 대장균을 이용하여 G-CSF 변이 단백질을 대량 생산하기 위하여 재조합 플라스미드 pED-CSF4BLIIE를 가지고 있는 E. coli BL21(DE3)(Novagen Inc., USA)의 유가식 발효를 수행하였다. pED-CSF4BLIIE는 플라스미드 pET21c(Novagen Inc., USA)에 액손 3영역의 염기서열이 결실된 G-CSF 변이체에 대한 염기서열을 클로닝한 것이다. 제조방법은 다음과 같다. 먼저 사람 유방암 cDNA 라이브러리(library)를 주형으로 하여 EcoRI 부위를 가지고 있는 포워드 프라이머(Primer 1) 5'-GCGAATTCATGGCTGGACCTGCCACCCAG-3'과 BamHI 부위를 가지고 있는 리버스 프라이머(Primer 2) 5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3'를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 반응물에 EcoRI과 BamHI으로 제한효소 처리하여 먼저 pUC19(Stratagene, USA)에 클로닝하여 p19CSF 플라스미드를 작제하였다(도 12). pUC19내에 클로닝된 이 CSF 유전자는 액손3 영역이 없는 상태이다.Fed-batch fermentation of E. coli BL21 (DE3) (Novagen Inc., USA) with recombinant plasmid pED-CSF4BLII E was performed to mass produce G-CSF mutant proteins using recombinant E. coli . pED-CSF4BLII E cloned the nucleotide sequence for the G-CSF variant in which the nucleotide sequence of the axon 3 region was deleted in plasmid pET21c (Novagen Inc., USA). The manufacturing method is as follows. First, the human breast cancer cDNA library was used as a template. After the polymerase chain reaction, the reaction product was treated with restriction enzymes with EcoRI and BamHI and first cloned into pUC19 (Stratagene, USA) to construct a p19CSF plasmid (FIG. 12). This CSF gene, cloned in pUC19, is devoid of axon3 regions.
p19CSF 플라스미드를 주형으로 하여 Nde I을 가지고 있는 포워드 프라이머(Primer 4) 5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3'과 BamHI 부위를 가지고 있는 리버스 프라이머 5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3' (Primer 2)를 사용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후 얻은 DNA에 NdeI과 BamHI 제한효소로 처리하여 pET21c 플라스미드에 클로닝하였다. 여기서 첫 번째 아미노산이 번역되는 시점의 염기서열을 박테리아에게 최적한 염기서열로 바꾸기 위해 상기 포워드 프라이머를 5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3' 대신에 5'-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3'로 바꿔 마찬가지로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 얻은 DNA에 NdeI과 BamHI 제한효소로 처리하여 pET21c 플라스미드에 클로닝하여 최종적으로 pED-CSF4BLIIE를 제작하였다(도 13). 유가식 배양에 사용한 배지 및 공급 기질은 표 3에 나타내었다.Polymerization chain reaction using p19CSF plasmid as a template using a forward primer (Primer 4) 5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3 'and a reverse primer 5'-GCGGATCCTTATTAGGGCTGGGCAAGGTGGCG-3' (Primer 2) having a BamHI site After DNA treatment, the obtained DNA was treated with NdeI and BamHI restriction enzymes and cloned into the pET21c plasmid. Here, the polymerase chain reaction was performed by changing the forward primer to 5'-GCGAATTCATATGACTCCGTTAGGTCCAGCCAGC-3 'instead of 5'-GCGAATTCATATGACCCCCCTGGGCCCTGCCAGC-3' in order to change the nucleotide sequence at the time of the first amino acid translation to the optimal sequence for bacteria. Subsequently, the obtained DNA was treated with NdeI and BamHI restriction enzymes and cloned into pET21c plasmid to finally prepare pED-CSF4BLIIE (FIG. 13). The medium and feed substrate used for the fed-batch culture are shown in Table 3.
종배양은 회전 진탕기(rotary shaker)에서 250ml 플라스크를 이용하여 8시간 동안 37℃에서 배양하였다. 200mL의 종배양물을 1.8L의 발효액을 포함하는 5.0L 발효기(5.0L, NBS 발효기)에 접종을 하였다. 온도와 pH는 각각 37℃와 6.8로 제어가 되었다. pH는 28% NH4OH 용액을 이용하여 유지하였다. 필요한 경우에 순수 산소도 공급하였다. 기질의 공급(feeding) 전략으로 pH-stat를 사용하였는데, pH가 6.88로 증가하면 글루코즈 2.0-3.0g, 효모 추출물 0.3g, MgSO4·7H2O 0.1g을 배양액에 자동적으로 첨가하였다. 유가식 배양중 배양액 중의 글루코즈 농도는 5 g/L이하를 유지하였고, OD600 = 30에서 1mM IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)를 이용하여 유도하여 미생물의 농도가 OD600 = 90 까지 이르는 고농도 배양이 이루어졌다. 생산된 G-CSF 변이 단백질의 양은 밀도측정기(densitometer)를 이용하여 염색된 단백질 밴드의 강도를 측정하여 정량화 하였다(도 10). 성숙 G-CSF의 분자량은 18.7 kDa정도이나 액손 3영역이 결실된 염기로부터 번역된 G-CSF 변이체 단백질의 분자량은 약 13 kDa 정도가 된다.Species cultures were incubated at 37 ° C. for 8 hours using a 250 ml flask on a rotary shaker. 200 mL of the seed culture was inoculated into a 5.0 L fermenter (5.0 L, NBS fermenter) containing 1.8 L of fermentation broth. Temperature and pH were controlled at 37 ° C and 6.8, respectively. pH was maintained using 28% NH 4 OH solution. Pure oxygen was also supplied if necessary. As a substrate feeding strategy, pH-stat was used. When the pH was increased to 6.88, glucose 2.0-3.0 g, yeast extract 0.3 g, and 0.1 g MgSO 4 · 7H 2 O were automatically added to the culture. The glucose concentration in the culture medium during the fed-batch culture was maintained below 5 g / L, and the concentration of microorganisms was induced by using 1 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) at OD 600 = 30. High concentration cultures up to 600 = 90 were achieved. The amount of G-CSF mutant protein produced was quantified by measuring the intensity of the stained protein bands using a densitometer (FIG. 10). The molecular weight of the mature G-CSF is about 18.7 kDa, while the molecular weight of the G-CSF variant protein translated from the base from which the axon 3 region is deleted is about 13 kDa.
실시예 6Example 6
G-CSF 변이 단백질 특이적 폴리클로날 항체의 제조Preparation of G-CSF Mutant Protein Specific Polyclonal Antibodies
본 실시예에서는 재조합 G-CSF 변이체를 대장균(E. coli)로부터 획득한 후에 항 토끼 변이 사람 G-CSF를 얻기 위한 항원으로 사용하였다. 항원 특이적 폴리클로날 항체를 생성하기 위하여 1mg/ml 농도로 인산완충용액 중에 용해된 정제된 돌연변이 사람 G-CSF 용액 400㎕를 동량의 프로인트 면역보강제(Freund's adjuvant, BRL사에서 시판)로 유화시킨 후 10주된 토끼에게 11일 간격으로 4회 근육주사하였다. 4번째 근육주사한 10일 후 심장천공법으로 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 상온에서 30분 그리고 4℃에서 하룻밤동안 방치하여 완전 응고시킨 후 2,500rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 취함으로써 혈청을 얻었다. 이것에 최종 농도가 40%되도록 황산암모늄을 첨가하여 침전시키고 10mM 인산완충용액(pH 7.0)에 하룻밤동안 투석시킨 후 DEAE Affi-Gel Blue gel(Bio-Rad사에서 시판)로 항체를 정제하였다(Smith, C.P., Jensen, D., Allen, T. and Kreger, M. (Eds.) Information Resources for Adjuvants and Antibody Production. U. S. Dept. of Agriculture, 1997; Hanly W. C. et al., ILAR Journal 37:93-118, 1995) In this example, the recombinant G-CSF variant was obtained from E. coli and used as an antigen for obtaining anti-rabbit variant human G-CSF. To generate antigen-specific polyclonal antibodies, 400 μl of a purified mutant human G-CSF solution dissolved in phosphate buffer at a concentration of 1 mg / ml was emulsified with the same amount of Freund's adjuvant (available from BRL). After the injection, the 10-week-old rabbit was injected four times at 11-day intervals. Ten days after the fourth intramuscular injection, blood was collected by cardiac puncture. Serum was obtained by allowing the collected blood to stand at room temperature for 30 minutes and overnight at 4 ° C. for complete coagulation and centrifugation at 2,500 rpm for 30 minutes to obtain supernatant. This was precipitated by adding ammonium sulfate to a final concentration of 40%, dialyzed overnight in a 10 mM phosphate buffer solution (pH 7.0), and the antibody was purified by DEAE Affi-Gel Blue gel (commercially available from Bio-Rad). , CP, Jensen, D., Allen, T. and Kreger, M. (Eds.) Information Resources for Adjuvants and Antibody Production.US Dept. of Agriculture, 1997; Hanly WC et al., ILAR Journal 37: 93-118 , 1995)
실시예 7Example 7
G-CSF 변이 단백질 특이적 모노클로날 항체의 제조Preparation of G-CSF Mutant Protein Specific Monoclonal Antibodies
1mg/ml 농도의 정제된 사람 G-CSF 변이 단백질 100㎕을 동일한 양의 프로인트 면역보강제로 유화시킨 후 생후 6-8주된 BALB/c 생쥐에게 2주 간격으로 3회 복강내에 주입하였다. 마지막 주입 후 항 G-CSF 변이 단백질에 대한 항체의 생성을 확인하고 2주 후에 100㎍의 사람 G-CSF 변이 단백질로 마지막으로 면역시킨 다음 3일 후 생쥐로부터 비장세포를 추출하고 Sp2/0-Ag14 골수종(myeloma) 세포와 10:1 비율로 혼합하여 이 혼합액을 50% 폴리에틸렌글리콜 1500 용액에 3분 동안 방치시켜 세포융합을 실시하였다. 이것을 1,200rpm에서 8분 동안 원심분리하여 세포 침전물을 얻은 후 10% 우태아 혈청(fetal calf serum)을 함유한 HAT RPMI-1640 배지에 ml당 3.5×106 세포가 되도록 부유시켜 96-웰 평판(96-well plate)에 웰당 0.1ml씩 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 3일 후 10% 우태아 혈청 함유 HAT RPMI-1640 배지를 웰당 0.1ml씩 첨가하고 4일 마다 배지의 반 정도를 신선한 배지로 갈아주었다(Amyx, H.L., JAVMA 191:1287-1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589-2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989).100 μl of purified human G-CSF mutant protein at a concentration of 1 mg / ml was emulsified with the same amount of Freund's adjuvant and injected intraperitoneally into BALB / c mice 6-8 weeks old three times at two week intervals. Confirmation of the production of antibodies to anti-G-CSF mutant protein after the last injection, after 2 weeks of final immunization with 100 μg of human G-CSF mutant protein, 3 days later splenocytes were extracted from mice and Sp2 / 0-Ag14 Myeloma cells (myeloma) cells were mixed in a 10: 1 ratio, and the mixture was left in 50% polyethylene glycol 1500 solution for 3 minutes to carry out cell fusion. After centrifugation at 1,200 rpm for 8 minutes to obtain cell precipitate, the 96-well plate was suspended in HAT RPMI-1640 medium containing 10% fetal calf serum to 3.5 × 10 6 cells per ml. 96 ml per well was dispensed into 96-well plates and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. After 3 days HAT RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum was added 0.1 ml per well and about half of the medium was changed to fresh medium every 4 days (Amyx, HL, JAVMA 191: 1287-1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135: 2589-2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989).
HAT 선택 배양 후 하이브리도마 세포의 항체 생산 여부를 효소면역측정법으로 확인하였다. 즉, 상기에서 면역에 사용했던 사람 G-CSF 변이 단백질을 0.01 M 카보네이트 바이카보네이트(carbonate-bicarbonate) 완충액(pH 9.6)에 0.1㎍/ml로 희석하여 웰마다 50㎕씩 넣고 4℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 그 다음에 PBST(phosphate buffer saline, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, 0.15 % Tween 20)로 4회 세척하고, 0.1% 알부민으로 37℃에서 30분 동안 반응(blocking)시켰다. 세포의 배양상등액은 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후에 PBST로 4회 세척하였다. 바이오틴이 붙어있는 2차 항체인 항 생쥐 면역글로불린 항체(Biotin conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody)를 1㎍/ml이 되도록 0.1% BSA-PBST로 희석한 후에 웰마다 50㎕씩 넣고 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 다시, PBST로 4회 세척한 후에 스트렙트아비딘-퍼옥시다아제(Streptavidin-Horseradish Peroxidase)를 0.1% BSA-PBST로 1000배 희석하여 웰마다 50㎕씩 넣고 30분 동안 37℃에서 반응시킨 후에 다시 PBST로 4회 세척하였다. 효소반응을 위한 기질로는 티엠비(Tetra-Methylbenzidine, TMB)용액을 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 반응시킨 후에 2N-황산으로 반응을 정지시키고 450nm 파장에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 항 사람 G-CSF 변이 단백질 항체의 생성여부를 확인하여 양성을 보이는 웰에서 얻은 세포들은 제한희석법(limiting dilution)으로 웰당 0.3 세포가 되도록 3회 전클로닝(subcloning)하여 배양함으로써 모노클로날화하여 항 사람 G-CSF 변이체 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻었다. 하이브로도마로부터 항 사람 G-CSF 변이체 모노클로날 항체를 얻었다(Amyx, H.L., JAVMA 191:1287-1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135:2589-2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989)After HAT selective culture, the production of antibodies of hybridoma cells was confirmed by enzyme-immunoassay. That is, the human G-CSF mutant protein used for immunization was diluted to 0.1 µg / ml in 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6), and 50 µl of each well was added and coated overnight at 4 ° C. It was. Then washed four times with PBST (phosphate buffer saline, 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na 2 HPO 4 , 2mM KH 2 PO 4 , 0.15% Tween 20) and reaction with 0.1% albumin at 37 ° C. for 30 minutes. (blocking) The culture supernatant of the cells was added to 50 μl per well and reacted for 2 hours at room temperature, and then washed 4 times with PBST. Biotin-conjugated secondary antibody, Biotin conjugated anti-mouse immunoglobulin antibody, was diluted with 0.1% BSA-PBST to 1µg / ml, and 50µl of each well was added at 37 ° C for 1 hour. Reacted. Again, after washing four times with PBST, streptavidin-Horseradish Peroxidase was diluted 1000-fold with 0.1% BSA-PBST, and 50 µl of each well was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Wash 4 times. As a substrate for the enzymatic reaction, 50 μl of Tetra-Methylbenzidine (TMB) solution was added to each well, and the reaction was performed at room temperature. The reaction was stopped with 2N-sulfuric acid, and absorbance was measured using an ELISA reader at 450 nm. Anti-human G-CSF variant protein cells obtained from the positive wells confirmed the production of anti-human monoclonalization by subcloning three times (0.3 cells per well) by limiting dilution (limiting dilution) Hybridomas producing the G-CSF variant monoclonal antibody were obtained. Anti human G-CSF variant monoclonal antibodies were obtained from hybridomas (Amyx, HL, JAVMA 191: 1287-1289, 1987; Akerstrom, B. et al., J Immunol 135: 2589-2592, 1985; Anon, Vet Health Inspectorate 6 pp. Rijswijk, The Netherlands, 1989)
실시예 8Example 8
효소면역측정법(ELISA) 방법을 통한 G-CSF 변이 단백질 수치를 이용한 진단Diagnosis using G-CSF Mutant Protein Levels by Enzyme Immunoassay (ELISA)
상기에서 면역에 사용했던 재조합 G-CSF 변이체에 대한 항 토끼 변이 사람G-CSF 또는 항 생쥐 변이 사람 G-CSF를 셀룰로플라스민을 0.01M 카보네이트-바이카보네이트 완충액(pH 9.6)에 10㎍/웰로 희석하여 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 그 다음에 PBST(0.15% Tween 20)로 4회 세척하고, 0.1% 알부민으로 37℃에서 1시간동안 반응(blocking)시켰다. 같은 방법으로 세척한 다음 표준 희석 완충액(Standard Diluent Buffer) 50㎕와 샘플을 넣고 천천히 섞어주면서 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후에 PBST로 4회 세척하였다. 페록시다아제가 붙어있는 2차 항체인 항 면역글로불린 항체(Peroxidase conjugated anti-human immunoglobulin antibody)를 2.5㎍/웰이 되도록 0.15N NaCl이 들어있는 10mM 포스페이트 완충액에 희석한 후에 웰마다 넣고 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 PBST로 4회 세척하였다. 효소반응을 위한 기질로는 티엠비 용액을 웰마다 50㎕씩 넣고 실온에서 암반응시킨 후에 2.5N-황산으로 반응을 정지시키고 450 nm 파장에서 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. Anti-rabbit mutant human G-CSF or anti-mouse mutant human G-CSF against recombinant G-CSF variants used for immunization were then replaced with cellulose plasmin at 0.01 μg / well in 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer (pH 9.6). Diluted and coated overnight at 4 ° C. It was then washed four times with PBST (0.15% Tween 20) and blocked with 0.1% albumin at 37 ° C. for 1 hour. After washing in the same manner, 50μl of standard diluent buffer (Standard Diluent Buffer) was added to the sample, and the mixture was slowly reacted at 37 ° C. for 2 hours, followed by washing 4 times with PBST. Peroxidase-conjugated anti-immunoglobulin antibody (Peroxidase conjugated anti-human immunoglobulin antibody) was diluted in 10 mM phosphate buffer containing 0.15N NaCl to 2.5 ug / well, and then added to each well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Reacted. Again washed 4 times with PBST. As a substrate for enzymatic reaction, 50 μl of TEMB solution was added to each well, and after dark reaction at room temperature, the reaction was stopped with 2.5 N-sulfuric acid and absorbance was measured with an ELISA reader at 450 nm.
도 11에서 나타난 바와 같이, 사람 G-CSF 변이 단백질의 수치는 암환자에서 훨씬 상승되는 결과를 알 수 있다. 각 암환자 별로 수치를 비교해 보았을 때, 특히 유방암의 경우 사람 G-CSF 변이 단백질의 수치가 월등히 상승되었음을 알 수 있다.As shown in FIG. 11, the level of human G-CSF mutant protein is found to be much higher in cancer patients. Comparing the levels of each cancer patient, especially in the case of breast cancer it can be seen that the level of human G-CSF mutant protein is significantly increased.
이상의 실시예에서 자세히 예시하였듯이 G-CSF 액손3 영역의 결실을 PCR이나 DNA 칩으로 혹은 G-CSF 변이 단백질에 대한 효소면역측정법을 사용함으로써 암의 진단이 수월하여질 것이다. 기존에 사용되고 있는 암에 대한 마커의 경우 장기 특이성이 낮은 CEA, BFP, TPA, IAP의 경우는 민감도가 떨어져서 가양성(false positive)의 우려가 있으며, 반면, 장기 특이성이 높은 AFP, PIVKA II, 에스터라제 I, CA19-9, CA50, SPan-1 항원, CA15-3, BCA 225 등의 마커의 경우는 당초부터 표적 장기를 목적으로 이용하는 때에만 유용한 단점이 있다. 본 발명자들이 발견한 G-CSF 액손3 영역의 결실에 대한 암진단 마커는 면역화학적요법 및 분자생물학적 방법으로 검색에 이용하면 간단하고 용이하게 암진단이 가능하다. 이 신규 암 진단 마커의 개발 및 사용으로 앞으로 암의 조기 발견이 수월하게 되어 암의 진단에 큰 기여를 하게 될 것이다. As illustrated in detail in the above examples, the deletion of the G-CSF axon 3 region may be facilitated in the diagnosis of cancer by PCR or DNA chip or by using enzyme-linked immunoassay for G-CSF mutant protein. In the case of markers for cancer, which are used in the past, CEA, BFP, TPA, and IAP, which have low organ specificity, are less sensitive, and thus, false positives may occur. Markers such as Terase I, CA19-9, CA50, SPan-1 antigen, CA15-3, BCA 225 have disadvantages that are useful only when initially used for target organs. The cancer diagnosis marker for deletion of the G-CSF axon 3 region found by the present inventors can be easily and easily diagnosed when used for screening by immunochemical and molecular biological methods. The development and use of these new cancer diagnostic markers will facilitate the early detection of cancer and contribute significantly to the diagnosis of cancer.
본 발명은 G-CSF 유전자의 액손3 결실여부를 판별하여 종양을 진단할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 암진단 방법은 하나의 특정 암이 아닌 여러 종류의 암 진단에 널리 이용될 수 있으며 중합효소 연쇄반응 또는 혼성화 반응과 DNA 칩을 통한 분자생물학적 방법이나 ELISA와 같은 비교적 간단한 면역화학적 방법을 이용하여 용이하게 암을 진단할 수 있는 효과가 있다. 이와 더불어, G-CSF 액손3 결실 확인용 DNA 칩은 한 유전자를 가지고 모든 암을 진단할 수 있다는 장점과 더불어 기존의 방법보다 보다 간편하고 빠르고 정확한 암 진단을 할 수 있으며, 한꺼번에 많은 수의 임상 검체를 적용할 수 있어 인류 의학 개발 발전과 복지 향상에 이바지함은 물론, DNA 칩 관련 기술에도 크게 공헌할 것으로 기대된다.The present invention provides a method for diagnosing tumors by determining whether axon 3 is deleted in the G-CSF gene. The cancer diagnosis method according to the present invention can be widely used for diagnosing a variety of cancers rather than one specific cancer, and a relatively simple immunochemical method such as a molecular biological method through a polymerase chain reaction or hybridization reaction and a DNA chip or an ELISA can be used. It can be used to easily diagnose cancer. In addition, the G-CSF Axon3 Deletion DNA Chip has the advantage that all cancers can be diagnosed with one gene, which makes diagnosis of cancer easier, faster and more accurate than conventional methods. It is expected to contribute to the development of human medicine development and welfare, as well as to contribute greatly to DNA chip technology.
또한, 본 발명자들이 발명한 액손3 영역의 아미노산이 결실된 G-CSF 변이체에 대한 항체로 G-CSF 변이체 단백질을 측정함으로써 정상인과 암환자를 용이하게 구분할 수 있다. 이것 또한 G-CSF 변이체에 대한 확인만으로도 정확히 암을 진단할 수 있음을 시사하고 있으며, 한꺼번에 많은 수의 임상 검체를 적용할 수 있고, 나아가 단백질 어레이 관련 기술에도 크게 공헌하게 될 것이다.In addition, the present inventors can easily distinguish between normal and cancer patients by measuring the G-CSF variant protein with an antibody against the G-CSF variant in which the amino acid of the axon 3 region is invented. It also suggests that cancer can be diagnosed accurately by just identifying G-CSF variants, and it will be able to apply a large number of clinical samples at once, and further contribute to protein array-related technologies.
도 1은 인체유래 G-CSF 유전자의 정상적인 전사, 스프라이싱 및 번역과정을 도시한 것이다.Figure 1 illustrates the normal transcription, splicing and translation of the human-derived G-CSF gene.
도 2는 중합효소 연쇄반응에 사용한 각각의 프라이머 위치를 도시한 것이다.Figure 2 shows each primer position used in the polymerase chain reaction.
도 3a는 PCR1 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:YCC-7, 레인3:AGS, 레인4:SNU-1, 레인5:MDA-MB-231, 레인6:MCF-7, 레인7:SK-BR-3, 레인8:HT-1080, 레인9:HCT-116, 레인10:COLO205).Figure 3a shows the results of analyzing the PCR1 reaction product by agarose gel electrophoresis method (M: size marker, lane 1: normal cell line, lane 2: YCC-7, lane 3: AGS, lane 4: SNU-1 Lane 5: MDA-MB-231, lane 6: MCF-7, lane 7: SK-BR-3, lane 8: HT-1080, lane 9: HCT-116, lane 10: COLO205).
도 3b는 PCR1 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타내 것이다(M:사이즈 마커, 레인1:정상 세포주, 레인2:DLD-1, 레인3:HT-29, 레인4:A549, 레인5:NCI-H460, 레인6:HeLa, 레인7:C-33A, 레인8:B16, 레인9:U-87MG).Figure 3b shows the results of analysis of PCR1 reaction product by agarose gel electrophoresis method (M: size marker, lane 1: normal cell line, lane 2: DLD-1, lane 3: HT-29, lane 4: A549 Lane 5: NCI-H460, lane 6: HeLa, lane 7: C-33A, lane 8: B16, lane 9: U-87MG).
도 4는 정상세포에서 유래한 PCR1 반응산물의 유전자 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 4 shows the results of analyzing the gene sequence of the PCR1 reaction product derived from normal cells.
도 5는 암세포에서 유래한 PCR1 반응산물의 유전자 염기서열 분석결과를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the gene sequence analysis of the PCR1 reaction product derived from cancer cells.
도 6a는 PCR2 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3a에 나타낸 바와 같음).Figure 6a shows the results of analyzing the PCR2 reaction product by agarose gel electrophoresis method (each lane is as shown in Figure 3a).
도 6b는 PCR2 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3b에 나타낸 바와 같음).Figure 6b shows the results of analyzing the PCR2 reaction product by agarose gel electrophoresis method (each lane is as shown in Figure 3b).
도 7a는 PCR3 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3a에 나타낸 바와 같음).Figure 7a shows the results of analyzing the PCR3 reaction product by agarose gel electrophoresis method (each lane is as shown in Figure 3a).
도 7b는 PCR3 반응산물을 아가로스 겔 전기영동 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(각 레인은 도 3b에 나타낸 바와 같음).Figure 7b shows the results of analyzing the PCR3 reaction product by agarose gel electrophoresis method (each lane is shown in Figure 3b).
도 8은 정상세포의 액손2 DNA 단편과 액손3 DNA 단편이 고정된 나일론 멤브레인과 암세포주로부터 유래된 표적을 혼성화(hybrization)한 다음 X-선으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(A: YCC-7, B: AGC, C: HT-29, D: A549, E: MCF-7, F: U-87MG).FIG. 8 shows the results of hybridization of a target derived from a nylon membrane to which axon 2 DNA fragments and axon 3 DNA fragments of a normal cell and a cancer cell line were immobilized, and then analyzed by X-ray (A: YCC-7). , B: AGC, C: HT-29, D: A549, E: MCF-7, F: U-87MG).
도 9는 G-CSF 유전자의 액손3 영역의 결손 여부를 DNA 칩으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.Figure 9 shows the results of analyzing the DNA chip to determine whether the axon 3 region of the G-CSF gene.
도 10은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 재조합 G-CSF 변이체 단백질을 생산하고 분리한 결과를 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.Figure 10 shows the results of the production and isolation of recombinant G-CSF variant protein lacking the amino acid sequence of the axon 3 region by SDS-PAGE.
도 11은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질의 수치를 변이 단백질에 대한 항체를 이용하여 정상인과 암환자에서 측정한 결과이다.FIG. 11 shows the results of measuring the levels of G-CSF mutant proteins lacking the amino acid sequence of the axon 3 region in normal and cancer patients using antibodies to the mutant proteins.
도 12는 플라스미드 p19CSF의 작제도이다. 12 is a schematic of plasmid p19CSF.
도 13은 액손3 영역의 아미노산 서열이 결손된 G-CSF 변이 단백질을 발현하는 재조합 플라스미드 pED-CSF4BLIIE의 작제도이다.FIG. 13 is a construct of recombinant plasmid pED-CSF4BLII E expressing a G-CSF variant protein lacking the amino acid sequence of the axon3 region.
<110> MEDIGENES YOO, WON MIN YOO, NAE CHOON KEUM, KI CHANG <120> G-CSF Exon 3-Deleted Protein and Antibody thereof, and Producing Method thereof <130> P05-0788 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 acccccctgg gccctgcc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcagggctgg gcaaggtg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atccagggcg atggcgcagc g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtgccacct acaagctgtg c 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagctgcagg gcctggct 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgctatggag ttggctcaag c 21 <210> 7 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(523) <223> G-CSF <400> 7 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag 120 ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc 180 ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc 240 ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt 300 cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag 360 atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc 420 gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctagttg cctcccatct gcagagcttc 480 ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga 525 <210> 8 <211> 417 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(417) <223> exon 3 deletion G-CSF <400> 8 acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa 60 gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctggcagg ctgcttgagc 120 caactccata gcggcctttt cctctaccag gggctcctgc aggccctgga agggatctcc 180 cccgagttgg gtcccacctt ggacacactg cagctggacg tcgccgactt tgccaccacc 240 atctggcagc agatggaaga actgggaatg gcccctgccc tgcagcccac ccagggtgcc 300 atgccggcct tcgcctctgc tttccagcgc cgggcaggag gggtcctagt tgcctcccat 360 ctgcagagct tcctggaggt gtcgtaccgc gttctacgcc accttgccca gccctga 417 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cagcttctcc tggagcgc 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer and probe <400> 10 ctgcagctgc tgctgtggca c 21 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgctgccag atggtggt 18 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 agaagctgtg gtgccac 17 <210> 13 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 13 tgagtgagtg tgccac 16 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 14 tgtgccacct acaagctgtg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 gagctggtgc tgctcggaca 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 ggacactctc tgggcatccc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 17 ctgagcagct gccccagcca 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 gcaggctgct tgagccaa 18 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 19 agaagctggc aggctg 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 20 tgagtgaggc aggctg 16<110> MEDIGENES YOO, WON MIN YOO, NAE CHOON KEUM, KI CHANG <120> G-CSF Exon 3-Deleted Protein and Antibody about, and Producing Method <130> P05-0788 <160> 20 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 acccccctgg gccctgcc 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcagggctgg gcaaggtg 18 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atccagggcg atggcgcagc g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtgccacct acaagctgtg c 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagctgcagg gcctggct 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cgctatggag ttggctcaag c 21 <210> 7 <211> 525 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene (222) (1) .. 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