KR20050093477A

KR20050093477A - 항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장 추출물

Info

Publication number: KR20050093477A
Application number: KR1020040018947A
Authority: KR
Inventors: 임현수; 최명락
Original assignee: 대한민국(여수대학교)
Priority date: 2004-03-19
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-09-23

Abstract

본 발명은 항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장 추출물에 관한 것으로, 본태성고혈압의 원인인 안지오텐신 전환효소를 억제함으로써 항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장의 열수추출물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 홍어 발효 시 폐기되는 홍어 내장의 열수추출물이 항고혈압 활성을 가지고 있음을 규명함으로써 홍어 부산물의 재활용 가능성을 제시하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장 추출물{Extract from viscera of Raja kenojei having anti-hypertensive activity}

본 발명은 항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 홍어의 가식부 또는 내장에서 추출한 열수추출물의 항고혈압 활성을 평가하고 안지오텐신 전환효소 억제물질을 분리하기 위해 세파덱스 컬럼 크로마토그래피를 통해 분자량별로 분획을 분리하고 상기 분획의 항고혈압 효과를 검색함으로써 홍어 내장 유래의 항고혈압 활성을 갖는 천연물질을 제공함에 관한 것이다.

홍어(Skate, Raja kenojei Muller et Henle)는 가오리과에 속하는 연골, 저서성 어류로써 우리나라의 남서해 및 일본의 중부이남해역과 동중국해에 많이 분포하고 있다. 특히, 목포, 영광, 부산 등지에서 많이 어획되고 있다. 최근 우리 연안에서 거의 잡히지 않고, 칠레나 캐나다 등지에서 수입에 의존하고 있다. 홍어의 주식은 오징어류, 젓새우류, 게류, 갯가재류 등으로 홍어 자체의 영양성이 매우 우수하다. 또한, 홍어가 주목을 받는 이유는 목포 등지에서 전통 식품으로 홍어를 발효시켜 즐겨 애용 인구가 증가하고 있기 때문이며, 그 독특한 향과 맛으로 점차 애용인구가 증가하고 있다. 홍어는 바다 깊은 곳에서 삼투압조절을 위하여 내부에 요소 및 요소 전구체를 많이 함유하고 있기 때문에 발효가 진행됨에 따라 코를 자극하는 향과 톡 쏘는 맛이 형성된다. 또한 홍어 및 발효제품에서는 유리 아미노산인 안세린(anserine), 타우린(taurine), 알라닌(alanine), 라이신(lysin) 등이 다량 검출되었는데, 안세린은 감칠맛을 줄 뿐만 아니라 근육의 완충능(Suyama, M. and T. Shimizu. 1982. Bull. Jan. Soc. Sci. Fish. 48, 89-95), 마이로신 ATPase(myrosine ATPase)의 부활작용(Aneva, R. M. and W. J. Brown. 1969. J. Biol. Chem. 244, 1600-1604)과 사이토크롬 옥시다아제(cytochrome oxidase) 의 활성화를 위한 철이온 수송에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 타우린(Brown C. E. 1981. J. Biol. Chem. 88, 245-256)은 홍어발효 중에 오히려 더 많이 생산되어지는데 콜레스테롤 축적을 예방하는 이외에 여러 가지 생리기능을 갖고 있다고 알려지고 있으며 차(Cha, Y. J., C. B. Ahn, T. H. Lee, Y. H. Chung, Y. H. Lee and S. K. Kim. 1985. J. Korea Soc. Food Sci. Nutr. 14, 370-375)등이 보고한 가오리는 같은 목에 속한 것이나 C_25:0는 분석되지 않았고, 홍어에서만 특이하게 분석되었다. 또한 n-3 지방산인 EPA와 DHA도 상당량 분석되었다(Nam, H. K. and M. K. Lee. 1995. J. Kor. Oil Chemist's Soc. 12, 55-58). 또한 홍어 폐기물인 간유에는 EPA(에이코사펜타에노산, eicosapentaenoic acid)와 DHA(도코사 헥사에노산, docosa hexaenoic acid)가 34%나 함유되어 있다. DHA와 EPA는 LDL-콜레스테롤을 감소시키고, HDL-콜레스테롤을 증가시키며, 중성지방을 저하시키는 작용이 강하여 관상동맥질환, 혈전증의 유발을 억제하는 등 성인병을 예방할 수 있는 물질이어서 주목된다. 특히 DHA는 망막 및 뇌 조직의 주요성분이다. 이밖에도 홍어발효식품으로 사용되지 않는 부분, 내부장기, 껍질등은 전량 폐기되고 있는 실정이다. 그러나 이러한 조직은 많은 단백질을 함유하고 있을 뿐 아니라 발효 후 숙성에 의한 유리 아미노산이 증가하여 영양 및 소화 흡수에 유리한 조건을 제공하므로써 사료로도 사용 가능하며 또한 ACE(안지오텐신 전환효소, angiotensin converting enzyme)의 작용을 억제하는 물질의 존재가 예상된다. 왜냐하면 현대 성인병의 대표적인 질환인 고혈압증의 대부분을 차지하고 있는 본태성고혈압(本態性高血壓)의 원인인 ACE는 여러 식품 중의 단백질에 의해 억제되는데, 특히 카세인(casein)과 옥수수 단백질인 제인(zein)의 가수 분해물을 비롯하여 차(茶)의 폴리페놀 성분, 무화과 유액, 간장 및 청주(淸酒)와 그 부산물의 가수 분해물이 ACE 저해작용을 나타낸다고 보고되고 있다. 또한, 어육단백질인 정어리와 고등어 근육단백질 가수분해물의 ACE 저해작용도 보고되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 전남 특산물인 홍어 발효의 과학화의 일환으로써 부산물로 생산되어 폐기되고 있는 홍어의 내장과 가식부 열수추출물의 항고혈압 활성을 평가하고, 항고혈압 활성을 갖는 물질을 분리하기 위해 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(Sephadex column chromatography)를 통해서 분자량별 분획의 분리와 분리된 분획별 항고혈압 효과를 검색함으로써 홍어 내장 유래의 항고혈압 활성을 갖는 천연물질을 제공하고자 한다.

본 발명의 상기 목적은 홍어의 내장과 가식부를 열수추출하고 각각의 추출물의 안지오텐신 전환효소 저해활성을 측정하고 상기로부터 항고혈압 효과를 나타내는 물질의 일반성분을 분석하고, 원소분석기로 원소를 분석하고, 유리아미노산을 분석한 후, 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피로 상기 물질의 분획물을 얻고 각 분획물의 안지오텐신 전환효소 저해활성을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 홍어의 내장과 가식부의 열수추출단계; 상기 추출물들의 안지오텐신 전환효소 저해활성을 측정단계; 상기 물질의 일반성분, 원소 분석, 및 유리아미노산 분석단계; 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피 실시단계; 및 각 분획물의 안지오텐신 전환효소 저해활성 조사단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 본 발명 홍어 추출물의 제조

본 발명 홍어 추출물을 얻기 위해, 전라남도 나주시 (주)영산포 식품으로부터 지원 받은 홍어(Raja kenojei)를 냉동 보관한 상태로 실험실로 운반하여 완전해동한 후 홍어 표면을 수돗물로 두 번, 증류수로 한번 세척하였다. 이를 멸균한 거즈로 표면의 물기를 제거한 다음 10℃에서 습도를 60-90%로 설정하여 10일 동안 발효시키면서 발효기간에 따라 가식부와 내장을 세절하여 열수추출한 후 동결 건조기(Freeze dry system/Freezone 4.5, Labconco Co, England)에서 동결 건조한 것을 시료로 사용하였다. 홍어 내장 및 가식부를 마쇄하여 환류 냉각기를 부착시킨 플라스크에 시료 1 g 당 30 mL의 증류수를 넣고 30분간 100℃로 3회 반복 추출한 액을 여과지(Whatman No.2)로 여과하고, 여과된 액을 다시 동결 건조하여 홍어 가식부 및 내장의 열수추출물로 하였다.

실시예 2: 본 발명 홍어 추출물의 항고혈압 활성 조사

상기 실시예 1에서 얻은 홍어의 가식부 및 내장의 열수추출물 각각의 항고혈압 활성은 본태성 고혈압의 원인물질인 ACE(안지오텐신 전환효소, angiotensin converting enzyme, peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1)의 저해활성으로 측정하였으며, Cushman과 Cheung의 방법(Biochemical Pharmacology. 20, 1637-1648, 1971)을 변형하여 측정하였다.

ACE 0.38 ㎎을 300 mM 염화나트륨을 포함한 50 mM HEPES HCl 완충액(pH 8.3) 3 mL에 용해시켰으며, 기질인 Hippuryl-His-Leu(HHL)은 300 mM 염화나트륨을 포함한 50 mM HEPES HCl 완충액(pH 8.3)에 용해시켜 0.3%의 HHL 기질용액을 만들었다. 홍어 각 부위별 열수추출물 시료는 0.5%, 1%, 2%로 제조하여 시료 50 ㎕에 0.3% HHL 기질용액 200 ㎕을 첨가하여 37℃에서 10분간 전배양시켰다. 반응액에 ACE용액 50 ㎕ 첨가한 후 37℃에서 15분 반응시킨다. 반응이 끝나면 1M HCl 250 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 에틸 아세테이트 2,000 ㎕를 가하여 60초간 강하게 흔든 다음 3,000 rpm에서 2분간 원심분리 시켜 상징액 1 mL을 취한다. 이 상징액을 140℃에서 10분간 건조 후 3차 증류수 3 mL을 가해 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정한 후 계산식(Inhibitory ratio(%) = C-S/C-S'×100)에 따라 ACE 저해율을 나타내었다. 앞의 식에서 S는 시료의 흡광도이고, C는 대조군(시료 대신 증류수를 넣은 군)의 흡광도이며, S'는 시료 대조군 (HCl에 의한 반응 정지 후 효소를 넣은 군)의 흡광도를 나타낸 것이다.

도 1에 나타난 바와 같이, 홍어 가식부 열수추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0, 4, 8, 10일째에 각각 29.0%, 17.0%, 20.0%, 16.0%로 나타났고, 시료 1% 첨가의 경우 발효 0, 4, 8, 10일째에 각각 10.0%, 9.0%, 13.0%, 12.0%로 나타났다. 따라서 홍어 가식부 열수추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 29.0%로 가장 높게 나타났다. 홍어 가식부의 ACE 저해 작용은 다소 낮으나 상시 섭취될 수 있는 식품이란 측면에서 볼 때 그 유용성이 기대된다고 할 수 있다. 또한, 홍어 내장 열수추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71%로 가장 높게 나타났고, 발효 4, 8, 10 일째에 각각 65.0%, 37.0%, 42.0%의 저해효과를 나타내었다. 시료 1% 첨가의 경우 발효 0일째에 30.0%로 시료 2% 첨가의 경우와 함께 가장 높은 ACE 저해효과를 나타내었다. 발효 4, 8, 10일째에 각 각 15.0%, 10.0%, 8.0% 저해효과를 나타내었다. 멸치 젓갈 숙성 중 시료 액의 ACE 저해 효과는 아미노 질소 함량이 최고 치에 달하는 숙성 60일에 최대 값을 나타내다가 그 후 다소 감소하는 경향을 나타내었다(Oshima, G., H. Shimabukuro and K. Nagasawa. 1979. Biochim. Biophys. Acta. 566, 128-130). 그와 달리 홍어 내장 열수추출물의 ACE 저해 효과는 시료 2% 첨가의 경우 발효 0일째에 71.0%로 가장 높게 나타났으며, 발효가 진행되면서 ACE 저해 효과는 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 본 발명 홍어 추출물의 일반 성분 및 원소 분석

상기 실시예 1에서 추출한 홍어 추출물 중 항고혈압 효과를 나타내는 물질의 일반성분을 분석하기 위하여 수분의 정량은 일정량의 홍어내장과 가식부의 열수추출물을 채취하여 고온 건조 후 그 감량의 함량 값을 수분으로 하였으며, 환원당 정량은 DNS법에 의하여 환원당을 정량하였다. 즉, 시료를 0.01 g/mL로 조제하고, 시료 1에 DNS 시약 3 mL을 넣고 끓는물에서 5분간 끓였고, 흐르는 물에서 식힌 후 550 nm에서 비색 정량하였다. 환원당 함량은 미리 구해둔 표준곡선으로 시료의 농도를 환산하였으며, 순 단백질 정량은 Biuret법에 의거하여 순 단백질을 정량하였다.

또한, 홍어의 항고혈압 효과를 나타내는 물질의 대략적인 성분을 알기 위하여 원소분석기(EA1110, CE Instruments, Italy)를 사용하여 분석하였다. 원소분석기는 순동(pure copper)을 충전한 반응관에 GC 컬럼과 TCD(thermal conductive detector)를 사용하였다. 회화온도는 1000℃, 오븐 온도는 60℃이고, 이동상은 헬륨 가스를 사용하였으며, 유속(flow rate)은 120 mL/min이었다.

홍어 내장의 열수추출물의 성분분석

구성 성분	함량(%)
습도	14.67±0.21^*
단백질	58.70±0.10
환원당	1.03±0.06

* : 평균±표준편차

홍어 내장의 열수추출물의 원소성분

원소	함량(%)
질소	7.76±0.20^*
탄소	40.87±0.06
수소	8.10±0.02
황산	0.50±0.01
산소	27.90±0.02

* : 평균±표준편차

표 1에 나타난 바와 같이, ACE 저해 율이 가장 높았던 발효 0일째 홍어내장 열수추출물에는 순 단백질의 함량이 가장 높아서 ACE를 억제할 수 있는 물질들이 많이 있으리라 사료되었다.

또한, 표 2의 원소분석 결과, C, H, O, N의 성분비가 당류라기 보다는 펩티드계인 것으로 예상되었다. Yeom, D. M. 등의 정어리 어 간장의 연구에서 ACE 저해 작용을 가지는 펩티드가 가열에 대하여 안정한 것으로 나타났다고 하였는데 본 발명 역시 열수추출물이지만 ACE 저해율이 높게 나타났으며 ACE를 억제하는 펩티드를 함유하리라 예상되었다.

실시예 4: 본 발명 홍어 내장의 열수추출물의 유리 아미노산 분석

상기 실시예 2에서 항고혈압 효과가 높았던 홍어 내장 열수추출물의 ACE 억제 펩티드의 아미노산 조성을 알기 위하여 홍어 내장 열수추출물을 동결건조하고, 완충액은 리튬 완충액, 제제는 닌히드린, 분석시간은 3 hr/L 시료, 주입 부피는 20 ㎕로 아미노산 자동분석기(Biochrom 20, Pharmacia Biotech, England)로 질소화합물의 종류와 양을 분석하였다.

홍어 내장의 열수추출물의 유리 아미노산 함량

	함량(mg%)
유리 아미노산	가식부	내장
α-아미노아디프산발린이소루신DL-알로시스타티온글리신티로신하이드록시리신메티오닌글루탐산알라닌하이드로프롤린페닐알라닌루신트레오닌리신오르니틴아르기닌세린타우린히스티딘포스포세린3-메틸히스티딘아스파르트산	6.2209.7144.319.9229.1277.5137.1118.2350.3544.713.1190.3299.894.7403.3168.950.444.91167.646.837.938.677.5	0435.9335.132.3288.9798.4151.4238.2699.8627.915.6552.8736.3188.2612.0158.9438.9270.01108.6126.2133.1107.7328.9
총	4670.8	8384.9

표 3에 나타난 바와 같이, ACE 억제효과가 높았던 홍어 내장 열수추출물의 유리 아미노산을 분석한 결과, 생체 조절기능을 갖는 식품 성분 중 생리활성 펩티드는 구조 및 활성이 다양하고, 프로테아제류에 의해 분해되며, 유전공학기술에 의해 생산 및 개조가 가능하며, 높은 안전성을 가진다. 특히, 젤라틴의 가수분해물로 부터 식품단백질 유래의 ACE 저해 펩티드가 발견된 이후, 다른 식품단백질에서 ACE 저해 펩티드를 찾으려는 연구가 지속적으로 진행되어 왔다. 고혈압을 일으키는 원인물질의 하나인 ACE를 억제하는 펩티드는 아미노산 중 C-말단에 트립토판, 티로신, 페닐알라닌 및 프롤린과 같은 방향족 아미노산이 있고, N-말단에는 발린, 이소루이신과 같은 가지형 지방족 아미노산이 있는 경우 우수한 ACE 저해 효과를 보이며 발린-트립토판(Val-Trp)로 구성된 디펩티드는 IC₅₀=1.6 μM으로 가장 우수하다고 하여 ACE 저해 펩티드는 C-말단을 구성하는 2-3개의 아미노산의 특성이 매우 중요한 것으로 생각되고 있다. 이들 펩티드들은 ACE에 대해 안지오텐신-I과 경쟁적으로 결합하여 ACE의 활성을 감소시키는 것으로 추정되고 있다. 또한, N-말단에 염기성 아미노산인 히스티딘의 함량이 특징적으로 높은 것이 ACE 저해활성과 관계가 있었다는 보고와 같이 홍어 내장 열수추출물의 유리 아미노산 함량 중 히스티딘의 함량이 가식부보다 높아(표 3) 히스티딘 함량도 ACE 억제효과에 영향을 주었으리라 예상되었으나 좀 더 깊이 있는 연구가 필요하리라 사료된다. 또한, 홍어 내장 열수추출물에는 방향족 아미노산인 티로신 및 페닐알라닌이 가식부보다 많았으며 가지형 지방족 아미노산인 발린도 가식부보다 2배 이상 많아서, 홍어 내장 중에 이러한 기능성 펩티드가 존재하리라 예상되고 좀 더 깊이 있는 연구를 위해 구성아미노산의 분석이 필요하리라 사료된다.

실시예 5: 본 발명 홍어 내장 열수추출물의 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피에 의한 항고혈압 물질의 조분리 및 성분 분석

상기 실시예 2에서 홍어 발효 0일된 내장 열수추출물의 ACE 저해 효과가 가장 우수하여 이들 인자를 보다 구체적으로 살펴보기 위하여 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피에 의해 획분을 분리하여 분획물들의 ACE 저해 효과 등 기능성을 살펴보았다.

세파덱스 G-25(MWCO : 5 kD) 100 g을 10배 부피의 완충액(50 mM-인산나트륨, 0.1 M 염화나트륨, pH 7.0)에 넣고, 이를 수조(99℃)에서 가끔씩 손으로 흔들어 주면서 1시간 동안 중탕한 후 충분히 식혀서 컬럼(2.5×100 cm)에 충전하였다. 시료는 시린지 필터(0.2 ㎛)로 여과하여 세파덱스 G-25 컬럼(1.25×100 cm)에 주입하고 완충액(50 mM-인산나트륨, 0.1 M 염화나트륨, pH 7.0)로 0.4 mL/min의 속도로 용출하여 10분 간격으로 4 mL씩 분획을 모아 280 nm에서 측정하여 분획물(A, B, C)을 만들었다.

도 2 및 3에 나타난 바와 같이, 이들 획분 A(60~110), B(111~160), C(161~210) 중 분획물 A에서는 1% 정도로 낮았고, 분획물 C를 0.05% 첨가한 군에서 56.9%로 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다. 그리고 분획물 B에서는 농도가 0.05, 0.1, 0.2%에서 각각 65.1, 64.1, 67.8%로 나타났으며, 분획물 중 가장 높은 ACE 저해 효과를 나타내었다.

상기 결과로부터, 홍어 내장 열수추출물의 ACE 저해인자는 가열에 대하여 안정한 비교적 저분자의 펩티드와 같은 물질이라고 추정할 수 있었다.

한편, 지금까지 밝혀진 대부분의 ACE 저해 펩티드는 분자량이 2000 이하인 것으로 보고되었다. 따라서 본 발명자는 홍어 내장 열수추출물의 항고혈압 물질은 저분자의 펩티드라고 사료되며, 이러한 ACE 저해 작용은 펩티드 함량보다는 그 중의 펩티드의 종류 즉, 아미노산의 배열순서 및 그 기질이나 구조 등에 따라 서로 다른 것으로 추정된다.

상기 본 발명의 실시예들을 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장 추출물에 관한 것으로, 본태성고혈압의 원인인 안지오텐신 전환효소를 억제함으로써 항고혈압 활성을 갖는 홍어 내장의 열수추출물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명은 홍어 발효 시 폐기되는 홍어 내장의 열수추출물이 항고혈압 활성을 가지고 있음을 규명함으로써 홍어 부산물의 재활용 가능성을 제시하는 뛰어난 효과가 있다. 따라서, 본 발명은 고혈압에 효과가 있는 기능성 식품으로 제조될 수 있어 기능성식품제조산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 발효 기간 중 홍어 내장 및 가식부 열수추출물의 ACE 저해활성을 나타낸 그래프이다.

도 2는 홍어 내장의 열수추출물의 세파덱스 G-25 젤 여과의 용출 프로파일을 나타낸 것이다.

도 3은 홍어 내장의 열수추출물의 세파덱스 G-25 젤 여과의 ACE 억제 활성을 나타낸 것이다.

Claims

안지오텐신 전환효소(angiotensin converting enzyme)의 활성을 저해함으로써 항고혈압 활성을 나타내며, 열수추출물 형태임을 특징으로 하는 홍어 내장 추출물.
안지오텐신 전환효소의 저해활성을 갖는 홍어 내장 열수추출물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항고혈압제용 조성물.