KR20050090656A - 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 혈소판응집억제제용 조성물 및 이를 이용한 혈소판 응집억제제 - Google Patents

포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 혈소판응집억제제용 조성물 및 이를 이용한 혈소판 응집억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물 및 이를 이용한 혈소판 응집억제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 혈소판 응집억제제용 조성물은 포도씨 또는 포도과피로부터 추출된 추출물 또는 분말형태로 24.0% 이상의 폴리페놀을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물이며, 또한 본 발명의 상기 혈소판 응집억제용 조성물 0.1∼10 중량%를 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제는 생체 내에서 우수한 응집 억제 효과를 나타내므로 심혈관계 질환의 중요유발 인자인 혈전생성 예방 및 치료를 위한 새로운 자원으로서 이용될 수 있다.

Description

포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물 및 이를 이용한 혈소판 응집억제제{COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OR POWDER FROM GRAPE SEED OR GRAPE COAT FOR THE INHIBITION OF AGGREGATING PLATELET AND AN INHIBITOR USING IT}
본 발명은 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물 및 이를 이용한 혈소판 응집억제제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 포도씨 추출물, 포도과피 추출물, 포도씨 분말 및 포도과피 분말로 구성된 군에서 선택된 단독 또는 동일 상과의 혼합형태의 조성물로 이루어지며, 상기 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제에 관한 것이다.
암, 백내장, 당뇨병 등의 많은 질병들은 자유 라디칼 산화반응 메카니즘에 의해 야기된다고 알려져 있으며, 비타민 E, 비타민 C 및 그 밖의 다른 산화방지 영양분은 많은 기관 및 조직에서 자유 라디칼 산화반응을 억제하는 효과를 갖는다. 이러한 산화방지제로서 폴리페놀은 자유 라디칼/산화반응 질병 특히, 관상동맥성심장병의 치료 또는 예방에 가장 효과적이라고 알려져 있다.
대표적인 일례로, 프랑스인들은 육류와 유제품 소비량이 월등히 높으면서도 심장질환에 의한 사망률이 낮은 것으로 보고되고 있는데, 이는‘프렌치 파라독스' 라고 불리는 와인의 섭취 때문인 것으로 밝혀졌다. 포도에 함유되어 있는 쿼세틴(quercetin), 레스베라트롤(resveratrol) 및 스틸벤(stilbene)과 같은 폴리페놀 성분이 생체 내에서 생리활성을 나타내기 때문이다[Lancet, 1992, 339, 1523-1526; A paradox. Circulation, 1993, 88, 2771-2779; A review. Medicine, 1986, 65, 242-267].
포도는 매년 약 650만 톤의 수확량을 자랑하는 세계적으로 가장 많이 생산되고 있는 과일 중 하나이다. 천연색소로 알려져 있는 안토시아닌(anthocyanidin)은 포도과피에 다량 함유되어 있으며, 포도씨에는 (+)-카테킨((+)-catechin), (-)-에피카테킨((-)-epicatechin), (-)-에피카테킨-3-갈레이트(epicatechin-3-O-gallate) 등의 모노머, 다이머, 트라이머 및 테트라머의 프로시아닌(procyanidin)이 풍부하다. 특히 포도와 와인에서 발견되는 레스베라트롤은 항암[J. M. Science, 1997, 275, 218-220; J. Microbiol. Biotechnol., 1999, 9, 691-693], 항산화 작용을 한다고 알려져 있다[Arch. Biochem. Biophys., 2001, 391, 79-89].
그럼에도 불구하고, 관상동맥성심장병은 서방 세계의 사망률 및 질병률의 주요 원인으로 지목되고 있으며, 최근 우리나라도 빠른 경제발전과 생활수준의 향상에 따른 식생활의 서구화 및 육류소비의 증가로 인해 심장질환, 동맥경화, 고혈압과 같은 혈관 순환기계 질환으로 인한 사망률이 점차 증가하고 있는 추세이다.
관상동맥성심장병의 발병은 아태롬성동맥경화 플라크의 발전, 이어서 동맥 폐색증을 야기시킬 수 있는 플라크상에 혈전(응혈)의 형성(혈전증이라 불리는 과정)을 수반하는 두 단계 과정으로 진행된다. 상기 과정의 결과로 심근경색 또는 급사에 이를 수 있으며, 혈전증에 의해 야기되는 그 밖의 질환은 발작 및 정맥 혈전증이 있다. 혈전 형성에 있어 초기 단계는 혈소판의 응집이며, 그런 다음, 응고 인자를 피브린 응혈을 생성시키는 혈액으로 방출시킨다. 일단 혈괴가 형성되면, 이들은 분해 생성물로 피브린의 분해 및 응혈의 분해에 필수적인 피브리놀리시스로 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 이와 같이, 혈소판의 응집을 억제하거나 피브리놀리시스를 증가시킴으로써 혈전증이 예방될 수 있는 두 가지 이상의 방법이 있다. 따라서, 혈소판 응집의 역할 및 트롬빈 형성시 피브리놀리시스 때문에, 혈소판 응집을 감속시키고/거나 피브리놀리시스를 증가시키는 방법은 일반적으로 혈전증 질환, 특히 관상동맥성심장병을 치료하는 방법으로서 사용될 수 있었다.
최근 이들의 항 혈소판 작용에 대한 연구결과에서 테이세드레 등[J. Sci. Food Agric., 1996, 70, 55-61]은 포도와 와인 속에 함유되어 있는 페놀계 화합물이 저밀도 지질단백질(이하,‘LDL’이라고 한다) 산화를 억제하여 뇌ㆍ심혈관계 질환을 예방하는데 큰 영향을 끼칠 것이라고 발표한 바 있으며, 블라체 등은 철을 공급한 쥐에서 (+)-카테킨((+)-catechin)이 혈소판의 기능을 유의적으로 증진시킨다고 보고하였다[Free Radic. Biol. Med., 2002, 33, 1670-1680].
또한, 포도를 비롯한 과일, 이들의 가공식품 또는 채소에 다량 함유되어 있는 폴리페놀 성분이 혈소판 응집을 억제하여 심혈관계 질환을 예방한다고 보고하고 있다[FASEB J., 1999, 13:239A(abs); Pharm. Biol., 1998, 36: S21-S27; J. Nutr., 2000, 130: 53-56].
특히 적포도주에 다량 함유되어 있는 폴리페놀 성분인 트랜스-레스베라트롤과 쿼세틴은 트롬빈(thrombin)과 ADP에 의해 유도된 혈소판 응집을 억제하며, 특히 트랜스-레스베라트롤은 아라치도네이트(arachidonate)로부터 TXB2, HHT, 12-HETE의 생합성을 억제하여 적포도주 음용으로 동맥경화 및 심혈관계 질환을 예방할 수 있다고 주장한 바 있다[Clin. Chem. Acta. 1995, 235, 207-219].
이외에도 프랭클 등은 캘리포니아산 적포도주가 37∼65%까지 LDL 산화를 억제하고, 이러한 결과는 갈산(gallic acid), 카테킨 및 말비딘 3,5-디글루코사이드 농도와 밀접한 상관관계가 있다고 밝힌 바 있다[J. Agri. Food Chem., 1995, 43, 890-894]. 그러나, 상기 보고에서 저자는 페놀계 화합물이 유사한 화학 특성을 지니고 있더라도 일련의 시험관내 실험의 결과로부터 이들의 환원 능력 즉, 이들의 산화방지제 활성에 대한 예측은 정확하지 않다고 밝히고 있다. 실제로, 당업자는 시험관내 실험 결과로부터 체내 상태까지의 외삽이 부적합하다는 것을 인정하고 있다. 그의 일례로 맥룬(McLoone) 등의 문헌[Proc. Nutr. Soc., 1995, 54, Abstract 168A]을 들 수 있으며, 상기 문헌은 화합물 루테인이 시험관내에서 LDL 산화반응을 억제하는 잠재성을 지니고 있지만, 상기 루테인을 사람 지원자를 대상으로 혈장내에서 루테인의 수준을 6배 증가시켜 2주 동안 식이 보충한 결과, LDL 산화반응 억제에 전혀 효력이 없었음을 제시하였다. 이외에도 묽은 적포도주가 시험관내 검정에서 LDL 산화반응을 억제할 수 있다는 수개의 보고서가 있으나, 이러한 시험관내 실험 결과는 체내 상황으로 반드시 확대될 수는 없으므로, 적포도주가 LDL 산화반응에 어떠한 영향을 미친다는 명백한 증거는 아직까지 제시하지 못하고 있다.
따라서, 본 발명자는 폴리페놀 성분에 의한 항 혈소판 작용에 대해 꾸준히연구한 결과, 폴리페놀 성분을 섭취한 토끼의 혈소판을 분리한 후, 혈소판 응집 유도물질인 콜라겐을 농도별로 투여한 실험 즉, 생체 내(in vivo) 시스템 상에서 혈소판 응집 억제활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 포도씨 또는 포도과피로부터 추출된 24.0% 이상의 폴리페놀을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포도씨 또는 포도과피로부터 추출된 24.0% 이상의 폴리페놀을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포도씨 또는 포도과피로부터 추출된 24.0% 이상의 폴리페놀을 함유하는 혈소판 응집억제제용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 포도씨 추출물, 포도과피 추출물, 포도씨 분말 및 포도과피 분말로 구성된 군에서 선택된 단독 또는 동일 상과의 혼합형태의 조성물 0.1∼10 중량%를 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제를 제공한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 조성물은 포도씨 추출물, 포도과피 추출물, 포도씨 분말 및 포도과피 분말로 구성된 군에서 선택된 단독 또는 동일 상(相)과의 혼합형태이다.
먼저, 포도씨 추출물은 실온에서 건조하여 잘게 분쇄하고, 상기 분쇄된 포도씨에 메탄올 용매 단독으로 속실렛 추출하여 제조되며, 24.0% 이상의 폴리페놀을 함유하고 더욱 바람직하게는 24.8% 내지 33.5% 이상의 폴리페놀을 함유한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 포도의 종은 특별히 제한하지 않으나, 구체적으로는 켐벨, 머스켓 오브 알렉산드리아, 거봉, 청포도, 머루, 홍부사 및 모르겐션로 이루어진 군에서 선택된 단독 또는 이들의 혼합형태가 가능하다. 더욱 바람직하게는 포도씨 추출물의 경우 거봉, 청포도 또는 머루를 사용하며, 이때 폴리페놀 함유량이 거봉의 경우 84.1%, 청도포는 22.1%, 또는 머루는 67.6%이다.
상기 포도씨 추출물이 혈소판 응집억제제 용도로서 사용하기 위한 바람직한 사용량은 전체 조성에 대하여 0.1∼1.0 중량%를 첨가하는 것이며, 이때 0.1 중량% 미만일 경우 혈소판 응집억제 효과가 미흡하고, 1.0 중량% 초과 시에는 혈소판 응집억제 효과에 큰 차이를 보이지 않으므로 과량사용이 바람직하지 않다.
포도과피 추출물은 실온에서 건조하여 용해성을 증진하기 위하여 적당한 크기로 분쇄하고, 상기 분쇄된 포도과피에 알코올을 함유하는 혼합용매를 이용하여 24.8%의 폴리페놀을 함유한 추출물을 얻는다. 상기 혼합용매는 포도과피 내 안토시아닌 함량을 효과적으로 추출할 수 있는 용매 형태라면 특별히 제한되지 않으나 바람직하게는 비교적 페놀함량이 높고 우수한 항산화효과를 보이면서 식용가능한 0.1% 구연산 0.1∼0.5중량%를 에탄올 용매에 첨가한 혼합형태이다. 상기 구연산은 저장기간에 따른 항산화 효과에 의존하여 첨가농도를 조절한다.
또한 본 발명의 조성물은 상기의 포도씨 추출물 또는 포도과피 추출물을 회전감압 농축하여 동결 건조되어 제조된 포도씨 분말 또는 포도과피 분말을 사용할 수 있다. 상기 포도씨 분말 또는 포도과피 분말이 전체 조성에 대하여 5∼10 중량%를 첨가함으로써, 우수한 혈소판 응집억제 효과를 기대할 수 있다. 이때, 분말 5 중량% 미만인 경우는 혈소판 응집억제 효과가 떨어지고 10 중량%를 초과하면, 상기 중량보다 소량 사용한 경우와 비교시 혈소판 응집억제 효과면에서 큰 차이를 없으므로 비경제적이다.
본 발명은 포도씨 추출물, 포도과피 추출물, 포도씨 분말 및 포도과피 분말로 구성된 군에서 선택된 단독 또는 동일 상과의 혼합형태의 조성물을 0.1∼10 중량%를 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제를 제공한다.
보다 바람직하게는 포도씨 추출물 또는 포도과피 추출물은 0.1∼1.0 중량%, 포도씨 분말 또는 포도과피 분말은 5∼10 중량%를 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제를 제공한다.
도 1 내지 도 5는 본 발명의 포도씨 추출물, 포도과피 추출물, 포도씨 분말 및 포도과피 분말로 구성된 군에서 선택된 단독 또는 동일 상(相)과의 혼합형태로 이루어진 조성물을 토끼에게 일정기간 섭취시킨 후 혈소판을 분리하고, 상기 분리한 혈소판에 혈소판 응집 유도물질인 콜라겐을 농도별로 투여하여 혈소판 응집 실험을 수행한 결과이다. 도 1에서 □는 비교예 1, ■는 비교예 2 (콜레스테롤 유도군), △는 실시예 1(포도씨 추출물), ○는 실시예 2(포도과피 추출물), ◇는 실시예 3(포도씨 추출물+포도과피 추출물), ▲은 실시예 4(포도씨 분말), ●는 실시예 5(포도과피 분말) 및 ◆: 실시예 6(포도과피 분말+포도과피 분말)을 나타낸다.
상기 실험결과, 조성물의 형태가 포도씨 또는 포도과피의 분말보다 추출물의 경우 혈소판 응집억제 효과가 우수하였으며, 가장 바람직하게는 혈소판 응집 유도물질인 콜라겐의 저농도(0.05 ㎍/mL)일 경우, 포도씨 추출물 및 포도과피 추출물의 1:1 혼합 조성 또는 포도씨 분말 및 포도과피 분말의 1:1 혼합 조성이 0% ∼ 1.0%의 혈소판 응집율을 보였다. 혈소판 응집 유도물질인 콜라겐의 고농도(0.2 ㎍/mL)일 경우, 본 발명의 조성물을 식이하지 않고 콜라겐을 투여한 비교예 2의 경우, 66%의 혈소판 응집율을 보인 반면 포도씨 추출물 및 포도과피 추출물의 혼합 조성 또는 포도씨 분말 및 포도과피 분말의 혼합 조성의 경우, 각각 13% 또는 2%의 혈소판 응집율을 보임으로써, 생체 내(in vivo) 시스템 상에서 혈소판 응집 억제활성을 확인할 수 있다.
본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 유효성분으로 함유한 조성물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 유효성분으로 함유한 조성물은 각종의 투여 경로를 통하여 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기 용도는 약제학적으로 허용되는 담체를 함께 함유한다. 보다 구체적으로 약제학적으로 허용되는 담체로는 멸균용액, 정제, 코팅정 및 캡슐과 같은 공지된 제형들에 사용될 수 있는 표준의 약제학적 담체라면 어느 것이든 가능하다. 통상적으로 담체는 전분, 밀크, 당, 특정종류의 클레이, 젤라틴, 스테아린산, 탈크, 식물성 기름 또는 오일, 검, 글리콜류 등의 부형제 또는 기타 다른 공지의 부형제를 포함할 수 있으며 또한 풍미제, 색소 첨가제 및 다른 성분들이 포함될 수 있다.
본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 유효성분으로 함유한 조성물을 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제제는 통상적인 방법으로 경구, 정맥내, 근육내, 경피 투여의 방법에 의해 투여할 수 있지만, 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다. 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합물의 물추출물의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제가 포함될 수 있다. 바람직하게는 정제, 캅셀 또는 액제로 만들어 의약품 형태로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 유효성분으로 함유한 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 혼합물의 물추출물을 포함하여 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.
본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1 일에 1 회 내지 3 회 나누어 투여할 수 있으며 바람직하기로는 10 ∼ 700 ㎎/㎏, 더욱 바람직하게는 100 ∼ 500 mg/kg의 농도로 투여되도록 제형화될 수 있다. 상기 제제의 정확한 양, 투여경로 및 횟수는 제제의 특성, 투여대상의 체중 및 상태, 그리고 사용하고자 하는 특정 유도체의 특성에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체 예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.
<실시예 1∼6> 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물 제조
단계 1: 실험동물
실험동물은 2 kg 체중의 뉴질랜드산 흰토끼 수컷(바이오링크 구입) 48 마리를 일주일간 환경에 적응시킨 후, 온도 20±3℃, 습도는 55∼60% 조건으로 유지하고 체중은 일주일에 한번씩 일정시간에 측정하였으며, 사료 섭취량과 음료수 음용량은 매일 같은 시간에 측정하여 전날 공급량에서 남아있는 양을 빼서 일일섭취량으로 계산하였다.
단계 2: 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물 제조
포도는 옥천포도 시험장 포장에서 재배된 켐벨(Campbell early) 포도종을 사용하였다. 포도씨 및 포도과피는 각각 분리하여 실온에서 건조시킨 뒤 분쇄장치를 이용하여 분쇄하였다. 이후 분쇄된 포도과피에 에탄올 용매에 0.1% 구연산을 첨가하여 혼합된 혼합용매를 이용하여 실온에서 3 회 반복 추출하여 포도과피 추출물을 얻었다.
또한 상기 분쇄된 포도씨는 100% 메탄올을 이용하여 70℃에서 8 시간 속실렛(soxhlet) 추출하여 포도씨 추출물을 얻었다.
상기에서 얻은 각 추출물을 회전감압 농축장치를 이용하여 알코올을 제거하고 동결 건조하여 포도씨 또는 포도과피의 분말을 얻었다.
상기 얻어진 조성에서 폴리페놀 함량은 AOAC 법[AOAC. Official Methods of Analysis. 14th ed. Washington, DC, USA (1980)]에 의해 측정하였다. 구체적으로 시료에 2% Na2CO3를 가하고 2분간 실온에서 정치한 후 50% 2 N의 폴릭-씨오칼리에킥(folic-ciocaliecic)시약을 첨가하여 잘 혼합하고 다시 실온에서 30분 정치한 다음, 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 카테킨을 0∼1.0 mg/mL의 농도로 조제하여 y=7.362x + 0.2023 (R2=0.9565)에서 작성하여 검량하였고, 모든 처리는 3회 반복하여 평균으로 나타내었다.
단계 3: 실험식이
단계 1에서 준비된 토끼에 (주)퓨리나 사의 토끼사료를 기본식이로 공급하여, 일반대조군의 비교예 1로 설정하였다. 또한, 상기 일반대조군에 동맥경화를 유발하기 위해 1 중량%로 고농도의 콜레스테롤(Sigma Co.)을 투여하여 비교예 2로 설정하였다.
이에 대하여, 주성분이 단백질 15.0 중량%, 지방 2.0 중량%, 식이섬유 15.0 중량%, 회분 10.O 중량%, 칼슘 0.8 중량%, 인성분 0.4 중량% 등으로 이루어진 일반 식이의 영양성분에 본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물을 하기 표 1과 같이 구성하여 실시예 1 내지 6으로 설정하여 관찰하였다.
실시예 1 ∼ 6의 구성 성분
단백질함유 지방함유 식이섬유 함유 회분 함유 칼슘 함유 인성분 함유 콜레스테롤 함유 포도씨 함유 포도과피 함유
비교예 1 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4%
비교예 2 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1%
실시예 1 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1% 0.2%
실시예 2 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1% 0.2%
실시예 3 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1% 0.1% 0.1%
실시예 4 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1% 10.0%
실시예 5 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1% 10.0%
실시예 6 ≥15.0% ≥2.0% ≤15.0% ≤10.0% ≥0.8% ≥0.4% 1% 5.0% 5.0%
상기에서 실시예 1은 콜레스테롤이 투여된 비교예 1의 성분에 0.2 중량%의 포도씨 추출물를 첨가하였다.
실시예 2는 콜레스테롤이 투여된 비교예 1의 성분에 0.2 중량%의 포도과피 추출물를 첨가하였다.
실시예 3은 콜레스테롤이 투여된 비교예 1의 성분에 0.1 중량%의 포도씨 추출물 및 0.1 중량%의 포도과피 추출물을 혼합하여 첨가하였다.
실시예 4는 콜레스테롤이 투여된 비교예 1의 성분에 10 중량%의 포도씨 분말을 첨가하였다.
실시예 5는 콜레스테롤이 투여된 비교예 1의 성분에 10 중량%의 포도과피 분말을 첨가하였다.
실시예 6은 콜레스테롤이 투여된 비교예 1의 성분에 5 중량%의 포도씨 분말 및 5 중량%의 포도과피 분말을 첨가하였다.
<실험예 1> 항 혈소판 실험
단계 1: 혈소판 준비단계
상기 실시예에서 준비한 고콜레스트롤을 섭취한 토끼의 귀 동맥을 70% 에탄올로 확장시킨 후 1% EDTA 용액(혈액량의 1/10)에 채혈하여 230 × g로 10 분간 원심분리하였고 혈소판 상등액(platelet rich plasma)을 다시 800 × g로 10 분간 원심분리하였다. 또한 혈소판 침전물(platelet rich pellet)을 HEPES 완충용액[137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.6 mM 글루코오스, 3.8 mM HEPES, pH 6.5 용액]으로 두 번 세척한 후 800 × g로 10 분간 원심분리하고 HEPES 완충용액[pH 7.4의 buffer 용액]으로 부유하여 세정된 혈소판 상등액(washed platelet rich plasma)에서 혈소판의 갯수가 3 × 108 개/mL가 되도록 준비하였다.
단계 2: 혈소판 응집 실험
상기 실시예에서 준비된 조성물에 대한 혈소판 응집 유발 인자의 사용에 따라 혈소판 활성화 작용 및 응집 억제활성을 측정하기 위하여, 하기와 같이 실험하였다.
상기 실시 예에서 준비된 조성물을 실험식이로 10주 동안 공급시킨 후, 흡광기(Aggregometer 470-vs, Chrono-log Co. PA, USA)를 사용하여 광 투광도 변화를 측정하였다.
세정된 혈소판 상등액(3 × 108 개/mL)을 37℃에서 1,000 rpm으로 3 분간 교반하고, CaCl2을 최종농도가 1 mM이 되도록 투여한 후 다시 3 분간 인큐베이션 하였으며, 3 분이 경과 후, 혈소판 응집 유발 인자인 콜라겐(Chrono Co.)을 0.05, 0.1, 0.2 및 1 ㎍/mL의 농도별로 투여하여 혈소판 활성화 및 응집 억제활성을 측정하였다.
도 1은 상기 실시예에서 준비된 본 발명의 조성물에 대한 콜라겐에 대한 응집율을 관찰하고, 이로부터 혈소판 응집 억제활성을 실험하였다. 상기 응집율은 아래 수학식 1에 의하여 산출되었다.
(상기에서 A: 시료를 첨가하지 않은 세정 혈소판의 흡광도이고, B: 각 시료를 첨가한 세정 혈소판의 흡광도이다.)
콜라겐에 대한 혈소판 응집 억제활성
응집율실험군 콜라겐 투여농도 (㎍/mL)
0.05 0.1 0.2 1.0
비교예 1 0% 1% 8% 67%
비교예 2 44% 51% 66% 67%
실시예 1(포도씨추출물) 1% 2% 48% 58%
실시예 2포도과피 추출물 0% 9% 49% 58%
실시예 3(포도씨+포도과피 추출물) 0% 1% 13% 61%
실시예 4(포도씨 분말) 1% 22% 46% 62%
실시예 5(포도과피 분말) 0% 7% 63% 64%
실시예 6(포도씨+포도과피 분말) 0% 0% 2% 64%
상기 표 2 및 도 1∼도 5에서 보는 바와 같이, 비교예 및 실시예의 조성은 혈소판 응집 유발 인자인 콜라겐의 투여농도에 대하여, 혈소판 응집활성이 농도 의존적으로 나타났음을 확인하였다.
특히, 혈소판 응집 유발 인자인 콜라겐의 투여농도 0.05 ㎍/mL에 대해서, 본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물을 첨가한 실험군에서는 0∼1.0%의 혈소판 응집 억제활성을 보였다(도 2).
또한, 혈소판 응집 유발 인자인 콜라겐의 투여농도가 0.1 ㎍/m인 경우, 비교예 2는 51%로 형소판의 응집율을 보였으나, 추출물의 형태인 실시예 1 내지 실시예 3, 분말형태인 실시예 5 내지 실시예 6은 10% 미만의 혈소판 응집율을 보임으로써 응집 억제효과를 나타내었다. 반면에 실시예 4의 경우, 22%의 혈소판 응집율을 보였으나, 비교예 2와 비교시 현저하게 낮은 결과이다(도 3).
도 4 및 도 5는 각각 또한, 혈소판 응집 유발 인자인 콜라겐의 투여농도가 0.2 ㎍/mL 또는 1.0 ㎍/mL인 경우로서, 본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물을 첨가한 실험군의 혈소판 응집율이 농도의존적으로 증가하였다. 보다 구체적으로, 콜라겐의 투여농도가 0.2 ㎍/mL일 경우, 본 발명의 조성물을 식이하지 않고 콜라겐을 투여한 비교예 2의 경우 66%의 혈소판 응집율을 보인 반면, 포도씨 추출물 및 포도과피 추출물의 혼합 조성 또는 포도씨 분말 및 포도과피 분말의 혼합 조성인 실시예 3 또는 실시예 6은 각각 13% 또는 2%의 혈소판 응집율을 보임으로써, 생체 내(in vivo) 시스템 상에서 우수한 혈소판 응집 억제효과를 보였다.
상기의 결과에서, 본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물은 인위적으로 동맥경화를 유발하기 위하여, 1 중량%의 콜레스테롤이 함유된 환경에서 농도 의존적으로 혈소판 응집억제 효과를 확인하였으며, 바람직하게는 포도씨 또는 포도과피의 추출물이 분말의 경우보다 높은 혈소판 응집억제 효과를 나타내었으며, 가장 바람직하게는 동일 상(相)과의 혼합형태, 즉, 포도씨 추출물 및 포도과피 추출물의 혼합 조성 또는 포도씨 분말 및 포도과피 분말의 혼합 조성이 우수한 혈소판 응집억제 효과를 나타내었다.
상기에서 살펴본 결과, 본 발명의 포도씨 또는 포도과피 성분을 함유하는 조성물에 의한 혈소판 응집 억제효과를 생체 내(in vivo) 시스템 상에서 확인함으로써, 주위에서 쉽게 구입할 수 있는 포도의 재료로부터 혈전생성 예방 및 치료를 위한 의약품을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실험군의 콜라겐에 대한 혈소판 응집 억제활성의 결과이고,
도 2는 콜라겐 0.05 ㎍/mL 농도에 대한 실험군의 혈소판 응집 억제활성의 결과이고,
도 3은 콜라겐 0.1 ㎍/mL 농도에 대한 실험군의 혈소판 응집 억제활성의 결과이고,
도 4는 콜라겐 0.2 ㎍/mL 농도에 대한 실험군의 혈소판 응집 억제활성의 결과이고,
도 5는 콜라겐 1.0 ㎍/mL 농도에 대한 실험군의 혈소판 응집 억제활성의 결과이다.

Claims (7)

  1. 포도씨 또는 포도과피로부터 추출된 24.0% 이상의 폴리페놀이 함유된 혈소판 응집억제제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 포도씨 또는 포도과피를 실온에서 건조하여 분쇄하고, 메탄올 단독용매로 추출하여 제조된 포도씨 추출물인 것을 특징으로 하는 상기 혈소판 응집억제제용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 포도과피를 실온에서 건조하여 분쇄하고, 에탄올 용매에 0.1% 구연산이 첨가되어 혼합된 혼합용매로 추출하여 제조된 포도과피 추출물인 것을 특징으로 하는 상기 혈소판 응집억제제용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물이 포도씨 추출물 또는 포도과피 추출물을 회전감압 농축하여 동결 건조되어 제조된 24.8% 내지 33.5% 이상의 폴리페놀이 함유된 포도씨 분말 또는 포도과피 분말인 것을 특징으로 하는 상기 혈소판 응집억제제용 조성물.
  5. 포도씨 추출물, 포도과피 추출물, 포도씨 분말 및 포도과피 분말로 구성된 군에서 선택된 단독 또는 동일 상과의 혼합형태의 조성물 0.1∼10 중량%를 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집억제제.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 혈소판 응집억제제가 포도씨 추출물, 포도과피 추출물 및 이들의 혼합형태의 조성물 0.1∼1.0 중량%를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 혈소판 응집억제제.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 혈소판 응집억제제가 포도씨 분말, 포도과피 분말 및 이들의 혼합형태의 조성물 5∼10 중량%를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 상기 혈소판 응집억제제.
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