KR20050089492A

KR20050089492A - 환경인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법

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Publication number: KR20050089492A
Application number: KR1020040014945A
Authority: KR
Inventors: 피재호; 형남인; 조명동; 박서준; 박희승; 윤익구; 최인명; 전성호
Original assignee: 피재호; 형남인; 조명동; 박서준; 박희승; 윤익구; 최인명; 전성호
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2005-09-08
Also published as: KR100582737B1

Abstract

본 발명은 환경인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명은 재배과정 중 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 포도에 처리하여 레스베라트롤의 합성에 관여하는 효소 유전자의 발현을 증가시킴으로써 항암 및 항균효과가 있는 레스베라트롤을 다량 함유하는 포도의 생산방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 포도는 항암 및 항균활성의 레스베라트롤을 고도로 함유하여 이를 유효성분으로 함유하는 다양한 기능성 식품 및 의약품용 조성물을 제조할 수 있으므로 식품산업 및 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

환경인자를 이용한 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법{A method for producing grapevine containing high resveratrol content using the environmental factors}

본 발명은 환경인자를 이용한 레스베라트롤(resveratrol) 고함유 포도의 생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 재배과정 중 포도에 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 처리하여 레스베라트롤의 합성에 관여하는 효소 유전자의 발현을 증가시킴으로써 레스베라트롤을 다량 함유하는 포도의 생산방법에 관한 것이다.

레스베라트롤(resveratrol)은 식물체에서 외부로부터 침입한 곰팡이의 성장을 억제하는 방어물질인 피토알렉신(phytoalexin)으로 알려져 왔다. 레스베라트롤은 극히 일부 식물에서만 생성되는데 지금까지 알려진 바로는 폴리고넘 커스피다툼(Polygonum cuspidatum), 유칼립투스, 가문비나무(spruce), 스코틀랜드 전나무(Scottish pine), 포도, 땅콩, 백합 등이 있다. 이들 식물에서 레스베라트롤은 스틸벤 합성에 의해 malony-CoA와 p-coumaroyl-CoA로부터 합성되며, 곰팡이, 자외선, 오존과 같은 외부 환경 스트레스로부터 그 합성이 유도된다고 보고되었다(Schoeppner and KindI H, 1979; Fliegmann et al., 1992; Fritzemeier et al., 1983; Vornam et al., 1988). 근래에는 이 물질의 생합성 기작 및 조절에 대해 분자 및 유전자 수준에서 다각적인 연구가 이루어졌다. 그 결과 소나무, 포도, 땅콩 등에서 이 물질의 생합성에 관여하는 유전자가 분리되었으며(Sparvoli et al., 1994; Preisig-Muller et al., 1999; Schubert et al., 1997), 유전자의 발현, 조절에 대한 많은 정보가 축적되어 유전자를 이용하기 위한 발판이 마련되었다.

한편, 포도에서의 레스베라트롤에 관한 연구는 오래 전부터 시작되었으며, 이 화합물의 항 스트레스 작용은 잘 알려져 왔다(Langcake et al., 1979). 기존에는 레스베라트롤의 항 스트레스 작용 및 스트레스 저항성을 이용한 합성 유전자를 특정 작물에 도입함으로써 항균, 항세균, 항바이러스, 항충 등 내병성 형질전환체 작물을 개발하여 왔다(Kindle et al., 1999; Hain et al., 1998; Schroder et al., 2000). 그러나 최근 포도주에서 전이 레스베라트롤(trans-resveratrol)이 발견되고, 적절한 포도주 섭취가 관상동백 심장병에 의한 사망율을 낮춘다는 역학적인 보고가 나온 이후, 레스베라트롤의 약리효과에 대해 많은 실험결과가 발표되기 시작했다(Siemann and Creasy, 1992). 특히 적포도주 섭취로 혈액내 항산화 활성이 증가하고 이로 인해 산화성 LDL의 생성이 억제된다는 보고들이 주목을 받았다(Maxwell et al., 1994; Fuhrman et al., 1995). 가장 최근에는 이 물질의 항 돌연변이 및 항암 작용에 대한 연구 결과가 많이 보고되었다(Carbo et al., 1999; Clement et al., 1998; Huang et al., 1999).

그러나 이와 같이 항암, 항산화 활성 등이 밝혀지고 있는 레스베라트롤은 그 가능성이 확인된 유망천연 기능성 자원으로서 앞으로 다양한 연구를 통해 기능성 식품 소재 및 신약 소재로 활용될 수 있음에도 불구하고, 아직 국내산 포도 품종을 대상으로 이 물질의 함량을 증가시키기 위한 재배생리 및 생명공학 측면에서의 연구는 거의 이루어지지 않았다. 이와 관련하여 최근 레스베라트롤의 함량을 증폭시키기 위한 방법으로 수확된 포도에 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola) 균주를 인위적으로 접종하는 방법(국내공개특허공보 제2003-21976호), 수확 후 포도에 UV-C 광선을 처리하는 방법(J. Argic Food Chem. 2002 Oct 23;50(22):6322-9; ;WO A23L 10/25 W00200192) 또는 알루미늄을 포도에 처리하는 방법(US A01N 59/06 US6834398) 등이 개시된 바 있으나, 이는 모두 포도수확 후 처리방법이거나 포도재배시 단처리방법으로서 아직까지 포도 재배과정 중 다양한 환경인자, 특히 효모 추출물과 같은 미생물 처리제를 이용하여 레스베라트롤의 함량을 증진시키는 방법은 전무한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 점을 감안하여 안출된 것으로 포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 함량을 증진시키기 위하여 먼저 실험실 조건에서 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 포도삽목 및 포도베리에 단독으로 혹은 복합적으로 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 유도함으로써 실제 재배에 적용할 수 있는 환경인자 조건을 1차 선발하고, 이를 바탕으로 다시 필드 조건에서 재배과정 중에 다양한 환경인자를 포도에 처리하여 레스베라트롤의 함량을 증진시킬 수 있는 최적의 환경인자 조건을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 재배과정 중 다양한 환경인자를 포도에 정량적으로 처리하여 레스베라트롤 합성에 관여하는 유전자의 발현을 조절함으로써 항암 및 항균활성의 레스베라트롤을 고도로 함유하는 포도의 생산방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 먼저 실험실 조건에서 포도삽목 및 포도베리에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 유도함으로써 실제 재배에 적용할 수 있는 환경인자 조건을 1차 선발하고, 이를 바탕으로 다시 필드 조건에서 재배과정 중 포도에 다양한 환경인자를 처리하여 레스베라트롤의 함량을 증진시킬 수 있는 최적의 환경인자 조건을 확인함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

본 발명은 실험실 조건에서 포도삽목 및 포도베리에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 유도함으로써 실제 재배에 적용할 수 있는 환경인자 조건을 1차 선발하는 단계; 및 이를 바탕으로 다시 필드 조건에서 재배과정 중 다양한 환경인자를 포도에 처리하여 레스베라트롤의 함량을 증진시킬 수 있는 최적의 환경인자 조건을 확인하는 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험실 조건에서 다양한 환경인자 처리에 따른 스틸벤 합성효소 유전자의 발현 조사

본 실시예에서는 재배환경에 따른 레스베라트롤의 증진 요인을 조사하기 위하여 유묘를 이용한 환경 인자에 의한 레스베라트롤의 함량 변화 시험을 실험실 조건에서 실시하였다.

실험예 1: 포도삽목에 처리

환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자에 의한 레스베라트롤 생합성 유전자, 즉 스틸벤 합성효소 유전자의 활성변화를 분자 수준에서 분석하기 위하여 한달간 생장을 유도한 삽목(Campbell Early)을 각각의 그룹으로 나누어 환경인자를 단독으로 또는 복합적으로 처리하였다(도 1 및 도 2 참조).

먼저, 단독처리로 UV는 304nm 파장, 30cm 거리에서 10분간 처리하고 상온에 4시간 방치한 후 액체질소를 사용하여 급냉하였으며, 오존은 3g/hr 조건으로 8시간 처리, 효모 추출물은 0.5% 4시간 처리, 상처(wounding)는 유도 후 4시간 상온에 방치한 후 각각 동일한 방법으로 급냉하여 -70℃에서 보관하였다. 또한, AlCl₃는 75mM 및 100mM을 4시간 처리하여 급냉보관하였다. 복합처리는 UV+75mM AlCl₃, UV+상처, UV+O₃, UV+0.1% 효모 추출물, 상처+75mM AlCl₃, 상처+100mM AlCl₃, 상처+O ₃, O₃+75mM AlCl₃, O₃+100mM AlCl₃, O₃+0.1% 효모 추출물로 처리하였다.

각각의 스트레스를 처리한 삽목의 잎과 줄기를 취하여 액체질소로 분쇄한 다음 2X CTAB 용액(1.4M NaCl, 2% w/v CTAB, 100mM Tris pH 8.0, 20mM EDTA)을 사용하여 DNA와 RNA를 추출한 후, 2M LiCl을 이용하여 RNA만 선택적으로 분리하였다.

준비한 RNA 2㎍을 M-MLV 역전사효소 200 유닛(promega)을 첨가하여 37℃에서 한시간 반응하여 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 사용하여 PCR 하였으며, 해당 프라이머는 염기서열 분석을 통하여 다음과 같이 합성하였다.

센스(Sense): 5'-ATGGCTTCAGTCGAGGAAATTAG-3'

안티센스(Antisense): 5'-ACCATAGGAATG-3'

PCR은 94℃에서 3분간 전-변성(pre-denaturation) 후 94℃ 40초, 51℃ 40초, 72℃ 40초를 30회 수행한 후 최종적으로 72℃에서 3분간 반응을 시켰다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보듯이 스틸벤 합성효소 유전자가 UV, AlCl₃, 효모 추출물, 오존(O₃)에 의해 발현이 유도되는 것을 확인하였다. 그러나 AlCl₃ 중에서도 100mM AlCl₃나 상처에 의해서는 발현이 유도되지 않고 있거나 아주 소량 유도되고 있었으며, 상처와 AlCl₃를 복합적으로 처리하더라도 스틸벤 합성효소 유전자의 발현을 증가시키지 못한다는 것을 알 수 있었다. 또한 UV+O₃, UV+0.1% 효모 추출물 처리시에는 스틸벤 합성효소 유전자의 발현이 가장 많이 유도된 반면 UV+75mM AlCl₃ 처리시에는 오히려 단용 처리보다도 스틸벤 합성효소 유전자의 발현을 억제시키는 결과를 보였다.

실험예 2: 포도 베리(berry)에 처리

포도 삽목의 결과를 토대로 포도 베리에서 RNA를 분리하여 스틸벤 합성효소 유전자의 활성을 조사하였다.

(1) 수확 후의 캠벨 어얼리(Campbell Early) 포도의 베리에 UV를 304nm 파장, 30cm 거리에서 시간별로 5분, 10분, 30분간 처리한 후 상온에 24시간 방치한 것과 48시간 방치한 포도를 액체질소를 사용하여 급냉하였다. 0.1%, 0.5% 효모 추출물은 24시간 용액에 베리를 담구었고, MJ, BA 호르몬은 농도와 시간별로 담구어 처리한 후 동일한 방법으로 급냉하여 -70℃에서 보관하였다.

상기와 같이 포도송이에 스트레스를 처리한 후 과피, 과육을 분리하여 -80℃에서 보관하였다. 과피를 막자사발을 이용하여 고운 가루로 만든 후 조직 그램당 5㎖의 추출 버퍼[extraction buffer (2% CTAB, w/v; 1.4M NaCl; 1% PVP, w/v; 0.2% β- mercaptoethanol, v/v; 20mM EDTA; 100mM Tris-HCl, pH 9.0; 0.4g PVPP/g)]를 첨가하였다. 그리고 막자를 이용하여 갈려진 조직과 버퍼를 잘 섞어 주었다. 그런 뒤 1.5㎖의 마이크로센트리퓨지 튜브(microcentrifuge tube)로 옮겨 60℃의 항온 수조에서 10분간 정치시켰다. 동량 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1, v/v/v)을 첨가하여 혼합시킨 뒤 12,000 ×g으로 원심분리했으며 이 과정을 두 번 반복하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮겨서 0.6배의 이소프로판올(isopropanol)을 넣고, -20℃에서 30분간 침전시킨 뒤, 12,000 ×g으로 20분간 원심분리하여 핵산 펠렛을 얻었다. 펠렛은 0.6㎖의 DEPC(diethyl pyrocarbonate) 처리가 된 멸균된 증류수를 넣고 녹인 뒤 동량의 4M LiCl을 넣고 4℃에서 침전을 시킨 뒤, 70% 에탄올로 씻고 20㎕의 DEPC 처리 멸균 증류수에 녹여서 -80℃에 보관하며 사용하였다. UV 정량은 UV 분광광도계(Perkin elmer, USA)를 사용하였고, 1.8%의 포름알데히드가 들어있는 디네이쳐레이팅 아가로스 겔(denaturating agarose gel)에서 RNA 분리상태를 확인하였다. Total RNA 등 RNA 시료는 UV 분광광도계와 RNA 겔을 사용하여 그 질을 측정하였다.

(2) RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)

과피에서 분리한 2㎍의 total RNA를 올리고 dT 프라이머를 첨가하여 75℃ 5분간 반응시키고, 다시 M-MLV 역전사효소(Promega)를 첨가하여 37℃ 1시간 반응하여 cDNA를 합성하고, PCR의 주형으로 사용하였다. 이미 보고된 쉬라즈(Shiraz) 포도의 스틸벤 합성효소(stilbene synthase) cDNA(16)의 염기서열을 분석하여 오픈 리딩 프레임(open reading frame)의 시작 및 끝 부위로부터 PCR 프라이머를 구상하여 제조하였다. 센스 및 안티센스 방향의 프라이머는 각각 다음과 같다.

센스: 5'-ATGGCTTCAGTCGAGGAAATT-3'

안티센스: 5'-TTAATTTGTCACCATAGGAAAG-3'

PCR 반응은 일반적인 방법에 따라 수행하였으며, 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분간, 30회 반복하였다. PCR 생산물을 겔에서 확인한 다음 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)를 사용하여 서브클로닝하였다.

그 결과, UV를 시간을 달리해서 처리했을 때에는 도 3에서 보듯이 10분 내지 15분 처리시 유도가 가장 잘 일어났으며, UV 처리 후 24시간 방치한 것과 48시간 방치한 실험결과를 보면, UV 10분이상 처리후 48시간 방치했을 때가 스틸벤 합성효소 유전자가 더 많이 발현되었다. 또한 도 4를 보면, 포도 삽목의 결과와 같이 오존과 UV를 함께 처리한 것이 포도 베리에서 스틸벤 합성효소 유전자의 발현을 더 많이 유도하였다. 한편, 효모 추출물을 처리했을 때에는 대조군이 더 많이 유도되어 실험을 분석하기 어려웠지만, 삽목의 경우와는 달리 포도 베리에서는 UV와 효모 추출물을 함께 처리했을 때 스틸벤 합성효소 유전자가 발현되지 않았다(도 5 참조).

호르몬을 처리한 경우, 먼저 MJ는 6시간 이후에 스틸벤 합성효소 유전자가 유도되지만 UV를 함께 처리해 주었을 때 스틸벤 합성효소 유전자의 발현이 더 잘 유도되는 것을 볼 수 있었다(도 6 참조). BA는 100uM 처리했을 경우에는 12시간 때 가장 많이 유도되었고, 200uM 처리했을 때에는 1시간때가 가장 많이 유도되었다(도 7 참조). SA에 의해서도 스틸벤 합성효소 유전자의 발현이 유도되었다(데이터 미제시).

이와 같이 포도의 베리와 포도의 삽목에서 환경인자에 대해 반응이 다르게 나타나는 것을 볼 수 있었는데, 이는 조직 특이적으로 다르게 발현하는 스틸벤 합성효소 유전자가 있고, 상기 유전자의 프로모터 내의 시스-요소(cis-element)가 환경인자에 의해 다르게 반응이 일어나기 때문일 것으로 생각되었다. 종합해 보면, 포도 수확 전에도 포도 삽목에 환경 인자를 처리하여 레스베라트롤을 증진시킬 수 있지만, 포도 수확 이후에도 UV, O₃, 효모 추출물 등의 환경인자와 호르몬(BA, MJ 등)을 사용해서 과실 내의 레스베라트롤의 함량을 증진시킬 수 있을 것이라고 사료되었다.

실시예 2: 필드 조건에서 다양한 환경인자의 처리에 따른 레스베라트롤 함량의 변화 조사

상기 실시예 1에서의 결과를 바탕으로, 2000년 12월부터 2003년 12월까지 3년간 필드에서 재배과정 중 다양한 환경인자의 처리에 따른 레스베라트롤의 함량변화를 조사하는 실험을 수행하였다. 본 발명의 실험을 위하여 1년차인 2001년에는 수원의 원예연구소 과수재배와 포장에서 실험을 수행하였으며, 2002년에는 환경 인자 중 일조와 온도의 차이가 레스베라트롤의 함량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 3개의 지역(수원, 양구, 대부도)를 선정하여 실험을 수행하였는데, 3개 지역 중 양구 및 대부도는 농가에서, 수원은 원예연구소 과수재배와 포장에서 실험을 수행하였다. 2003년에는 김천과 천안의 농가에서 수행하였다.

한편, 본 실시예에서 레스베라트롤의 함량분석은 다음과 같은 방법을 이용하였다.

[레스베라트롤 함량분석]

추출방법은 오쿠다(Okuda)와 요코츠카(Yokotsuka)(1996)의 분석방법을 응용하였다. 냉동보관 중이던 각 시료를 해동시키고 정량한 후 에틸아세테이트(ethylacetate) 30mL를 첨가하여 균질기[homogenizer(Ultra Turrax T25, IKA Labortechnik, USA)를 이용하여 13,000rpm으로 5분간 분쇄하고, 소닉 배스(sonic bath)에 넣어 30℃에서 15분간 초음파 분해(sonication)한 후, 감압 글래스 퓨넬(glass funnel)에 Whatman No. 2 여과지(filter paper)로 에틸아세테이트 30mL를 가하면서 3회 여과하였고, 추출된 용액에 잔류되어 있는 물을 제거하기 위하여 Na₂SO₄를 소량 첨가하고 한번 더 여과하였다. 추출용액을 볼 플라스크(ball flask)에 넣어 40℃로 조정된 회전식 증발기(rotary evaporator)에서 농축시키고, 농축된 용액에 MeOH 5mL를 첨가하여 분해(resolving)시킨 후, 0.45㎛ 멤브레인 필터(membrane filter)로 필터링한 후, 암버 바이얼(amber vial)에 주입하여 인젝션(injection)하였다. 추출을 위한 모든 전처리 과정은 빛에 의한 레스베라트롤의 분해를 방지하기 위하여 용기를 알루미늄 포일로 싸서 빛을 차단하였다.

함량 분석은 디그래서(Degasser), 쿼터네리 펌프(Quaternary Pump), 오토샘플러(Autosampler), 칼럼 컴파트먼트(Column Compartment) 및 다이오드 디텍터(Diode Detector)로 구성된 Hewlett Packard 1100 series(Agilent Co., USA)에서 칼럼(column)은 Eclipse XDB-C18(4.6×250mm, Hewlett Packard)를 이용하였다. 이동상으로는 아세토니트릴(acetonitrile) 20 : 버퍼 80(sodium phosphate(NaH₂PO₄) 30mM, pH 2.5 with phosphoric acid)으로 조정하여 사용하였다. 이동상의 흐름은 1mL/min, 칼럼 온도는 35℃로 설정하였고, 검출 파장은 306nm, 검출시간은 14.1분이었다.

레스베라트롤 표준(Resveratrol standard)은 Sigma(R 5010, USA)에서 제조한 전이-레스베라트롤(trans-resveratrol)(trihydoxy stilbene)을 구입하여 분석하였으며, 레스베라트롤 표준(resveratrol standard)과 전처리한 시료의 LC 분석 크로마토그램은 도 8 및 도 9와 같다.

실험예 1: 기후조건이 레스베라트롤 함량에 미치는 영향

포도 재배지역의 기후조건이 레스베라트롤 함량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 국내 주요 포도품종 중 하나인 캠벨 어얼리(Cambell Early)를 대상으로 실험을 수행하였는바, 수원을 비롯하여 해발 600m 이상이며 우리나라 포도재배지역 중 최북단으로 기온이 낮고 생육기간이 긴 양구와, 리아스식 해양성 기후 특징을 갖고 있는 서해안의 대부도 지역을 선정(도 10 참조)하여 상기 3개 지역간 변색기와 수확기 과실의 레스베라트롤 함량을 비교분석하였다.

이들 3개 지역의 생육특성을 파악하기 위하여 각 시험 포장마다 수세가 비슷한 6~8년생 캠벨 어얼리(Campbell Early) 9주씩을 선정하여 착과기, 변색기, 수확기, 총생육일수 등을 조사하였는데, 착과기는 만개 후 5일을 기준으로 하였고, 변색기는 과피착색이 전체 과피표면의 5% 수준이 되었을 때를 기준으로 하였으며, 수확기는 각 지역별 포장에서 상품(商品)으로 판매 가능한 첫 수확시기를 기준으로 하였다.

또한 이들 지역의 생육기간 중 국지기상 환경을 분석하기 위하여 각 지역의 착과기부터 수확기까지의 기온과 일사량을 측정하였는데, 각 지역 조사 포도원내 3지점을 선정하여 기온은 웨더 스테이션[weather station(Watchdog 450, Spectrum Technologies, USA)]으로 측정하였다. 이 때, 센서가 직사광선에 노출되지 않도록 지상 1.2m 지점에 간이백엽상을 설치하였으며, 일사량은 300~1,100nm의 파장대역을 측정할 수 있는 솔라 래디에이션 센서[Solar radiation sensor(Spectrum # 3670, Spectrum Technologies, USA)]를 사용하였다. 일사량 센서는 수관의 그늘에 의해 가려지지 않도록 지상 1.7m 높이에 설치한 후 수평계로 센서의 수평을 보정하였다. 자료는 매 시간 10분 단위로 6번 측정하여 매 시간 평균으로 하였고, 1일 24회 평균, 누적, 최고, 최저값을 산출하였으며, 생육전반부(착과기~변색기)와 후반부(변색기~수확기)의 적산온도 및 일사량의 지역간 차이가 각 지역의 레스베라트롤 함량에 영향을 미치는지 알아보았다.

지역간 캠벨 어얼리(Cambell Early)의 레스베라트롤 함량차이를 변색기와 수확기로 나누어 분석한 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 표 1을 보면, 모든 지역에서 변색기에 비하여 수확기에 레스베라트롤의 함량이 증가하였음을 알 수 있다. 지역간에는 변색기와 수확기 모두 다른 두 지역보다 양구에서 재배된 포도의 레스베라트롤 함량이 현저하게 많은 것으로 조사되었으며, 수원과 대부도간에는 큰 차이가 없었다.

지역간 과실(과피)내 레스베라트롤 함량

지역	레스베라트롤(㎍/g)
지역	변색기	수확기
수원	0.43 b^z	2.58 b
대부도	0.38 b	2.82 b
양구	0.69 a	3.90 a
z: 던컨의 다중검정법을 이용하여 5% 유의차로 산출

해발 600m가 넘는 양구지역에서 재배된 포도가 다른 지역에 비하여 레스베라트롤의 함량이 높은 것은, 재배상 외적인 환경조건의 영향을 받았을 것으로 생각되어 지역간 온도와 일사량을 비교한 결과, 하기 표 2에서처럼 양구지역은 수원과 대부도에 비하여 생육기간중의 평균, 최고, 최저온도가 현저하게 낮은 특징을 보였고 적산온도도 적었다. 특히 양구지역에서 다른 두 지역에 비하여 변색기 이후 수확기까지의 적산온도가 변색기 이전의 적산온도보다 차이가 큰 것으로 나타났다. Okuda와 Yokotsuka(1996)는 포도 과피내 레스베라트롤 함량이 고온다습한 지역에 비하여 서늘하고 건조한 지역에서 약 2배 높았다고 하였고, David 등(1995)은 서늘한 지역에서 생산된 과실의 포도주에서 레스베라트롤 함량이 많다고 한 바 있는데, 양구지역에서 수원과 대부도에 비하여 레스베라트롤 함량이 많은 것은 생육기간 중의 낮은 온도가 외적 자극 요인이 되어 피토알렉신 생성기능을 촉진하였고, 특히 변색기 이후 적산온도의 심한 차이는 더욱 영향을 미쳤을 것으로 생각되었다.

생육기간 중 지역간의 온도차이는 표 2와 같이 주요 생육 단계의 경과기간에도 영향을 미치는 것으로 생각되는데, 착과기는 수언이 대부도보다 4일 빨랐으나, 이후 변색기와 수확기는 두 지역간 차이가 없었다. 생육기간 중의 온도가 낮았던 양구는 수원과 대부도에 비해 착과기는 6~10일, 변색기는 17~28일, 수확기는 25일 지연되었다(표 3).

2002년 6월부터 10월까지 생육기간 및 생육단계 동안 3개 지역의 온도 및 적산 온도

지역	온도(℃)			적산 온도(℃)
지역	평균	최고	최저	착과기~변색기	변색기~수확기	총
수원	23.1	28.1	18.7	912.9	448.6	1364.5
대부도	23.4	29.3	19.2	867.2	471.8	1339.0
양구	18.1	23.1	14.1	743.6	243.6	987.2

기후 조건을 달리하는 3개 지역에서 자란 포도의 각 생육기간

지역	착과기(A)	변색기	수확기(B)	생육기간(A-B)
수원	6월 1일	8월 9일	9월 12일	104
대부도	6월 5일	8월 8일	9월 12일	99
양구	6월 11일	8월 26일	10월 9일	120

또한 이들 3지역에서 또 하나의 외적환경요인이라 할 수 있는 생육기간 중의 누적 일사량을 알아보고, 이것을 착과기에서 변색기까지, 변색기에서 수확기까지 구분하여 비교한 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 생육기간 중의 총일사량은 대부도에서 현저하게 낮았고, 수원과 양구는 비슷하였다. 반면, 레스베라트롤 함량이 많았던 양구의 경우 변색기 이후 수확기까지 즉, 과실 성숙기의 누적 일사량이 수원과 대부도에 비하여 두드러지게 많은 것으로 나타났다.

일사량과 레스베라트롤 함량과 관련된 연구결과는 찾아볼 수 없었으나, 광은 안토시아닌과 같은 피놀릭 대사(phenolic metabolism)에 중요한 역할을 하며, 이러한 피놀릭 대사는 적색광과 자외선의 조화에 의하여 촉진되는 상승효과가 있다는 보고(Machenix 등, 1990)와, 산간지역에서 자외선이 높으며(Langcake와 Pryce, 1977) 자외선 처리에 의하여 resveratrol 함량이 증진된다는 보고(Fliegmann, 1992; Cantos, 2001; Cantos 등, 2000)로 미루어, 일사량을 300~1,100nm 파장대역으로 측정한 본 발명의 지역간 일사량 비교에서 성숙기 양구에서 많았던 것은, 자외선과 적색광을 포함하는 상승효과가 있었을 것으로 추측된다. 또한 양구의 경우 변색기 이후 수확기까지 과실의 성숙기가 8월 26일에서 10월 9일로, 실제로 이 기간은 우리나라에서 장마가 지난 시기로서 대부분의 성숙기간이 8월 중인 수원과 대부도와는 달리 과실 성숙기의 시기적인 차이가 양구에서 누적 일사량이 많았던 것으로 생각된다. 따라서 이러한 광환경이 온도와 더불어 양구에서 레스베라트롤 함량이 많게 하는데 영향을 미쳤을 것으로 판단된다.

2002년 포도 착과기에서 수확기까지 생육 단계 동안의 포도 재배지역간 일사량

지역	일사량(solar radiation)(W/m²)
지역	착과기~ 변색기	변색기~ 수확기	총일사량
수원	674,430	226,710	901,140
대부도	583,420	215,140	794,960
양구	604,450	276,940	881,390

실험예 2: 다양한 신호(elicitor) 처리가 레스베라트롤 함량에 미치는 영향

캠벨 어얼리(Cambell Early) 품종 포도의 삽목에 대하여 AlCl₃, UV, 효모 추출물(yeast extract), 오존(O₃) 등 다양한 신호(elicitor)를 처리한 후, 그에 따른 레스베라트롤 함량증진 효과를 조사하였다. 이를 위하여 2002년 2월에 전정목을 채취하여 비닐로 밀봉하여 5℃ 저온저장고에 보관한 후, 6월에 2아지(芽枝) 중 하부 눈은 제거하여 삽수를 조제하고, 유리온실에서 버미큘라이트 50 : 펄라이트 50으로 조성된 삽목상에서 삽목하였으며, 온도는 25~30℃로 관리하였다. 삽목묘에서 제3엽 출현 즉시 UV, O₃, AlCl₃ 및 효모 추출물 등의 신호(elicitor)를 처리하였으며, 처리 후 24시간이 경과한 뒤 잎을 포함한 신초를 채취하여 레스베라트롤 함량 분석을 하였다. 각 신호(elicitor) 처리에 있어서, UV는 254nm 파장에 10분간 처리하였고, O₃는 밀폐실에서 5ppm으로 12시간 처리하였으며, AlCl₃는 75mM 농도로 4시간 침지하였고, 효모는 0.5%로 4시간 침지하였다.

그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. 표 5를 보면 모든 처리에서 무처리에 비해 레스베라트롤 함량이 높은 것으로 조사되었으며, 특히 AlCl₃처리구가 가장 높은 11.02㎍/g 함량을 보였다. 이는 무처리에 비해 무려 7배 정도 높은 수준이었다. 한편, AlCl₃를 제외한 다른 신호 처리구는 무처리보다 2배 정도 높은 레스베라트롤 함량을 보였다. 따라서 결과적으로 상기 모든 신호 처리가 레스베라트롤의 함량 증진에 효과가 있는 것으로 나타났다.

캠벨 어얼리 품종 포도의 삽목에 대한 다양한 신호(elicitor) 처리에 따른 줄기 레스베라트롤의 함량

처리	레스베라트롤 함량(㎍/g)
무처리	1.67 c^z
AlCl₃(75mM)	11.02 a
UV(254nm)	2.54 b
효모 추출물(0.5%)	2.89 b
오존(5ppm)	2.82 b
z: 던컨 다중검정법을 이용하여 5% 유의차로 산출

실험예 3: 효모 추출물 처리가 레스베라트롤 함량에 미치는 영향

실용적으로 사용되고 있는 비병원성 미생물제의 레스베라트롤 함량 증진 가능성을 알아보고자 상기 실험예 2에서의 신호(elicitor) 처리 중 효모 추출물을 2002년에 생육기 중 포도에 처리하고, 수확기에 과실을 수확하여 포도과피내 레스베라트롤 함량을 분석하였다. 이 때 시험수는 원예연구소 포장에 식재되어 있는 10년생 캠벨 어얼리(Cambell Early) 포도를 선정하여 주당 1반복씩 난괴법 3반복으로 배치하였으며, 효모는 박토 효모(Bacto yeast; Difco, USA) 0.5%와 1%를 변색기 7일전, 변색기 및 변색기 7일후 등 3회 수관 살포하였다.

효모 추출물 처리가 포도과피내 레스베라트롤 함량에 미치는 영향을 조사한 결과를 하기 표 6에 나타내었다. 표 6을 보면, 각각 0.0% 처리시 2.58㎍/g, 0.5% 처리시 5.61㎍/g, 1.0% 처리시 4.37㎍/g으로 조사되어 상기 두 효모 추출물 처리 모두 레스베라트롤 함량을 증가시키는 효과가 있는 것으로 나타났다. 특히, 1.0% 처리보다 0.5% 처리구에서 함량증진 효과가 더 큰 것으로 나타났다.

효모 추출물의 잎살포 처리에 따른 캠벨 어얼리(Cambell Early) 포도의 과피내 레스베라트롤 함량

농도	레스베라트롤 농도(㎍/g)
0.0%	2.58 c^z
0.5%	5.61 a
1.0%	4.37 b
z: 던컨 다중검정법을 이용하여 5% 유의차로 산출

실험예 4: 효모 추출물과 생효모 처리가 레스베라트롤 함량에 미치는 영향

실험예 3과 같은 목적으로 2003년 캠벨 어얼리(Cambell Early)와 거봉(Kyoho) 품종에 효모 추출물과 시중에서 제빵용으로 사용한 생효모를 농도별로 처리하여 레스베라트롤 함량을 분석하였다. 여기서 제빵용 생효모는 수분함량이 67%이며 구입가격이 실험용 효모인 효모 추출물보다 가격이 1/20 정도로 저렴하기 때문에 농가에서 이용할 경우 경제적으로 도움이 될 것으로 생각되어 선택하게 되었다. 시험수는 캠벨 어얼리의 경우 경북 김천에서, 거봉의 경우는 천안시 입장면 소재 농가에서 상기 실험예 3에서와 같은 방법으로 수행하였다.

그 결과를 표 7에 나타내었다. 상기 실험예 3에서 캠벨 어얼리에 효모 추출물을 처리하였을 경우에는 1.0%보다 0.5%에서 레스베라트롤의 함량이 높았으나, 본 실험예에서 효모 추출물의 농도를 더 낮추어 처리한 결과 저농도인 0.1%에서 함량이 더 높은 것으로 나타났다. 거봉의 경우에는 0.5% 처리에서 레스베라트롤의 함량증가가 가장 많았으며, 캠벨 어얼리의 경우 생효모 처리보다는 효모 추출물 처리구에서 상대적으로 레스베라트롤의 함량이 많았다. 한편 거봉은 0.5%에서 가장 효과가 좋았지만, 처리농도별 함량차이는 그리 크지 않았다.

캠벨 어얼리 및 거봉포도의 과피내 레스베라트롤 함량에 대한 효모 잎살포 처리의 영향

처리	캠벨 어얼리(Cambell Early)		거봉(Kyoho)
처리	효모 추출물	생효모	효모 추출물	생효모
0.1%	3.77±0.57^z	3.19±0.19	1.58±0.02	2.21±0.29
0.5%	2.90±0.33	1.89±0.03	3.84±0.03	2.57±0.39
1.0%	2.28±0.24	2.17±0.11	1.76±0.15	2.32±0.35
대조구	1.79±0.08	1.79±0.08	1.40±0.10	1.40±0.10
z: 수치는 평균±표준편차를 의미한다.

실험예 5: 봉지 재배가 과실 내 레스베라트롤 함량에 미치는 영향

봉지재배가 과실내 레스베라트롤 함량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 2002년 수원에서 봉지 재배를 한 유대과실과 무봉지 재배를 한 무대과실간의 레스베라트롤 함량을 변색기와 수확기로 구분하여 분석 비교하고 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

2002년 수원에서 봉지 재배한 유대과실과 무봉지 재배를 한 무대과실의 변색기 및 수확기에서의 레스베라트롤 함량

처리	레스베라트롤 함량(㎍/g)
처리	변색기	수확기
무봉지 재배	2.18 a^z	9.30 a
봉지 재배	0.43 a	2.58 a
z: 던컨 다중검정법을 이용하여 5% 유의차로 산출

상기 표 8을 보면, 변색기와 수확기 모두 무대재배에서 유대재배에 비하여 레스베라트롤 함량이 월등히 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 Palomino 등(2000)의 연구결과와 일치하는 것으로 과실봉지는 병, 해충으로부터 과실을 보호하고, 과종에 따라서는 과실의 착색 또는 미려도를 향상시키기 위해 사용되고 있는데, 병, 해충으로부터 과실을 보호하면 광선의 투과성을 억제하여 단파장인 자외선 차단효과가 클 것으로 추측된다. 따라서 봉지에 의해 병해충이 억제되고 자외선을 포함한 광선이 차단되는 것은 과실 내 피토알렉신의 합성기능을 제한하여, 과실 내 레스베라트롤 함량을 낮게 하는 것으로 생각된다.

이상의 실시예와 실험예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 재배과정 중 포도에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 인자를 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시켜 레스베라트롤을 고도로 함유하는 포도를 생산하는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 생산된 포도는 항암 및 항균활성의 레스베라트롤을 고도로 함유함으로써 이를 유효성분으로 하는 기능성 식품 및 의약품용 조성물을 제조할 수 있어 식품산업 및 의약품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 캠벨 어얼리(Cambell Early)품종 포도의 삽목을 촬영한 사진이다. 사진에서 1은 R.T로 처리한 대조구, 2는 물로 처리한 대조구, 3은 UV처리(304nm, 10분), 4는 오존처리(3g/hr), 5는 상처처리, 6은 효모 추출물 처리(0.5% water)한 삽목을 나타낸다.

도 2는 포도 삽목에 환경 스트레스를 유발하는 다양한 환경인자 처리에 따른 스틸벤 합성효소 유전자의 발현정도를 조사하기 위해 RT-PCR한 결과이다. 이 때, 18S rRNA를 로딩컨트롤로써 사용하였다. 여기에서 1번은 대조구, 2번은 UV 처리, 3번은 75mM AlCl₃처리, 4번은 100mM AlCl₃처리, 5번은 상처처리, 6번은 UV+ 75mM AlCl₃처리, 7번은 UV+상처처리, 8번은 UV+오존처리, 9번은 UV+0.1% 효모 추출물 처리, 10번은 상처+75mM AlCl₃처리, 11번은 상처+100mM AlCl₃처리, 12번은 상처+오존처리, 13번은 오존+75mM AlCl₃처리, 14번은 오존+75mM AlCl₃처리, 15번은 오존+0.1% 효모 추출물 처리한 것을 나타낸다.

도 3은 포도 베리에 UV 처리에 따른 스틸벤 합성효소 유전자의 발현정도를 RT-PCR로 분석한 결과이다. 여기에서, a는 UV 5분, b는 대조구, c는 UV 10분, d는 대조구, e는 UV 30분, f는 대조구(24시간 방치 후 동결), g는 UV 5분, h는 대조구, i는 UV 10분, j는 대조구, k는 UV 30분, l은 대조구(48시간 방치 후 동결)를 나타낸다.

도 4는 2시간 동안 스트레스를 처리한 포도 베리에서의 스틸벤 합성효소 유전자의 발현정도를 조사한 결과이다. 여기에서 1번은 R.T로 처리한 대조구, 2번은 물로 처리한 대조구, 3번은 UV 10분 + 오존 처리구, 4번은 UV 10분 + 0.1% 효모 추출물 처리구를 나타낸다.

도 5는 효모 추출물로 처리한 포도 베리에서의 스틸벤 합성효소 유전자의 발현정도를 조사한 결과이다. 여기에서 1번은 0.1% 효모 추출물 처리구, 2번은 0.5% 효모 추출물 처리구, 3번은 UV 15분+ 0.1% 효모 추출물 처리구, 4번은 UV+ 0.5% 효모 추출물 처리구, 5번은 대조구를 나타낸다.

도 6은 100uM 메틸자스몬산(MJ)으로 처리한 포도 베리에서의 스틸벤 합성효소 유전자의 발현정도를 조사한 결과이다. 여기에서 1번은 MJ 1시간 처리구, 2번은 UV 15분+ MJ 1시간 처리구, 3번은 대조구, 4번은 MJ 6시간 처리구, 5번은 UV 15분+ MJ 6시간 처리구, 6번은 대조구, 7번은 MJ 24시간 처리구, 8번은 UV 15분+ MJ 24시간 처리구, 9번은 대조구를 나타낸다.

도 7은 BA로 처리한 포도 베리에서의 스틸벤 합성효소 유전자의 발현정도를 조사한 결과이다. 여기에서 1번은 BA 100uM 1시간 처리구, 2번은 5시간 처리구, 3번은 12시간 처리구, 4번은 24시간 처리구/ 5번은 BA 200uM 1시간 처리구, 6번은 5시간 처리구, 7번은 12시간 처리구, 8번은 24시간 처리구/ 9번은 BA 대조구 1시간 처리구, 10번은 5시간 처리구, 11번은 12시간 처리구, 12번은 24시간 처리구를 나타낸다.

도 8은 306nm에서 레스베라트롤 표준 크로마토그램 피크곡선을 나타낸 것이다. 여기에서 화살표는 레스베라트롤의 피크를 표시한다.

도 9는 캠벨 어얼리(Cambell Early) 품종 포도의 과실(과피)내 레스베라트롤 함량을 HPLC 크로마토그램한 것이다. 여기에서 화살표는 레스베라트롤의 피크를 표시한다.

도 10은 본 발명에서 캠벨 어얼리(Cambell Early)에 대해 필드 실험한 3개 지역을 나타낸 지도이다.

Claims

재배과정 중 환경 스트레스를 유발하는 환경인자를 단독으로 혹은 복합적으로 포도에 처리하여 스틸벤 합성효소를 코딩하는 유전자의 발현을 유도함으로써 레스베라트롤의 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 환경 스트레스를 유발하는 환경인자는 온도, 일사량, UV, AlCl₃, 효모 추출물, 오존 및 상처 처리를 포함함을 특징으로 하는 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법.
제2항에 있어서, UV는 254nm ~ 304nm 파장에서 처리함을 특징으로 하는 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법.
제2항에 있어서, AlCl₃는 75mM ~ 100mM 처리함을 특징으로 하는 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법.
제2항에 있어서, 오존은 5ppm 처리함을 특징으로 하는 레스베라트롤 고함유 포도의 생산방법.
제2항에 있어서, 효모 추출물은 0.1% ~ 1.0% 처리함을 특징으로 하는 레스베라롤 고함유 포도의 생산방법.
제1항의 방법에 의해 생산된 레스베라트롤 고함유 포도.
제1항의 방법에 의해 생산된 포도로부터 추출한 레스베라트롤을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항암성 식품 조성물.
제1항의 방법에 의해 생산된 포도로부터 추출한 레스베라트롤을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항암제용 조성물.