KR20050076876A - Detection kit for liver cancer by measuring the expression of hepatic cancer-related genes - Google Patents

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Abstract

본 발명은 간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 간암을 진단하는데 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 간암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다. The present invention relates to a liver cancer gene marker and a liver cancer diagnosis kit using the same. More specifically, the liver cancer diagnosis developed to be very useful for diagnosing liver cancer by measuring the expression level of high and low expression genes for liver cancer It relates to a method and a diagnostic kit.

Description

간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트{DETECTION KIT FOR LIVER CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF HEPATIC CANCER-RELATED GENES} Liver cancer genetic marker and liver cancer diagnostic kit using the same {DETECTION KIT FOR LIVER CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF HEPATIC CANCER-RELATED GENES}

본 발명은 간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 간암 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 간암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다. The present invention relates to a liver cancer gene marker and a liver cancer diagnostic kit using the same. More particularly, the liver cancer diagnosis method was developed to be very useful for diagnosing liver cancer by measuring the expression level of high and low expression genes for liver cancer. And diagnostic kits.

간암은 전 세계적으로 발생 빈도가 높은 암 중 하나로 매년 백만명의 환자들이 간암으로 사망하고 있으며, 특히 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생되는 가장 흔한 암이다[Parkin 등, Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Luo 등, Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., pp. 435-445, 1997; Chen 등, J. Gastroenterol. Hepatol. 12:S294-308, 1997]. 간조직 기원에서 발생하는 암의 85%은 간암(hepatocellular carcinoma)이며 간암의 발생은 간 조직에 B형 간염과 C형 간염 바이러스의 감염과 아플라톡신 β1의 노출이 그 원인으로 보고되고 있다[Bosch 등, Semin. Cancer Dis. 19:271-285, 1999; Luo 등, Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., pp. 435- 445, 1997]. 그러나, 정확한 기작은 아직까지 알려져 있지 않다. 기존의 연구에 따르면 TGF-α(transforming growth factor α)와 TGF-β와 같은 몇 가지 생장인자(growth factor)들이 간암의 진행기작에 연관됨이 보고되고 있으며, 암 억제인자로 잘 알려진 RB, p53 단백질도 간암 형성 과정에 중요한 역할을 수행하는 후보 유전자들이 있다[Collier 등, Liver 13:151-155, 1993; Abou-Shady 등, Am. J. Surg. 177:209-215, 1999; Naka 등, Anticancer Res. 18:555-564, 1998]. 또한, 세포주기 기작에서 G1 단계로 진행하는 세포주기 조절물질들의 변화가 간암 형성에 관련되어 있다는 보고도 있다[Hui 등, Hepatogasteroenterology 45:1635-1642, 1998]. 이외에도 DNA 돌연변이와 유전자 발현의 유전적 변화(genetic alteration)등이 간암 환자조직에서 확인된다고 보고되고 있다[Park 등, Cancer Res. 59:307-310, 1999; Bjersing 등, J. Intern. Med. 234:339-340, 1993; Tsopanomichalou 등, Liver 19:305-311, 1999; Kusano 등, Hepatology 29:1858-1862, 1999; Keck 등, Cancer Genet. Cytogenet. 111:37-44, 1999]. 이와 같이, 간암의 발생과 진행은 몇몇 특정 유전자들에 의해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있다. 따라서, 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 간암의 형성 기작을 연구하는 것 보다 정상 간세포와 간암 세포주들 사이의 다량의 유전자 발현정도를 비교 분석하여 간암에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있는 것이다.Liver cancer is one of the most common cancers worldwide. One million patients die of liver cancer every year. In particular, liver cancer is the most common cancer in Asia, including Korea and Japan [Parkin et al., Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Luo et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., Pp. 435-445, 1997; Chen et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 12: S294-308, 1997. Eighty-five percent of cancers originating from hepatic tissue are hepatocellular carcinoma, and the incidence of hepatocellular carcinoma is due to hepatitis B and hepatitis C virus infection and aflatoxin β1 exposure to liver tissue [Bosch et al. Semin. Cancer Dis. 19: 271-285, 1999; Luo et al., Basic Biology and Clinical Sciences 1st Ed., Pp. 435-445, 1997]. However, the exact mechanism is not known yet. Previous studies have reported that several growth factors, such as transforming growth factor (α) and TGF-β, are involved in the mechanism of liver cancer, and RB, p53, a well known cancer suppressor. Proteins also have candidate genes that play an important role in liver cancer formation [Collier et al., Liver 13: 151-155, 1993; Abou-Shady et al., Am. J. Surg. 177: 209-215, 1999; Naka et al., Anticancer Res. 18: 555-564, 1998]. Further, the change of cell cycle regulators to proceed to step G 1 in the cell cycle, the mechanism has been reported that are involved in the formation of liver cancer [Hui, etc., Hepatogasteroenterology 45: 1635-1642, 1998] . In addition, genetic alterations of DNA mutations and gene expression have been reported in liver cancer tissues [Park et al., Cancer Res. 59: 307-310, 1999; Bjersing et al., J. Intern. Med. 234: 339-340, 1993; Tsopanomichalou et al., Liver 19: 305-311, 1999; Kusano et al., Hepatology 29: 1858-1862, 1999; Keck et al., Cancer Genet. Cytogenet. 111: 37-44, 1999. As such, the development and progression of liver cancer is not caused by some specific genes, but rather by the complex interaction of many genes involved in various cellular signaling and regulatory mechanisms that occur as cancer progresses. . Therefore, rather than studying the mechanism of liver cancer focusing on a few specific genes, it is more important to study new genes related to liver cancer by comparing and analyzing the gene expression level between normal liver cells and liver cancer cell lines. It is.

이와 같이, 암의 형성은 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 발현 및 조절 기작이 복합적으로 연관되어 진행되므로 최근 들어 다량의 유전자를 사용한 cDNA 마이크로어레이나 유전자 칩으로 간암 관련 유전자들의 발현율을 비교하여 간암의 새로운 진단이나 치료의 마커를 발굴하기 위한 연구가 이루어지고 있다[Shirota 등, Hepatology 33:832-840, 2001; Xu 등, Cancer Res. 61:3176-3181, 2001; Tackels-Horne 등, Cancer 92:395-405, 2001; Chen 등, Mol. Biol. Cell 13:1929-1939, 2002; Li 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128:369-379, 2002; Lee 와 Thorgeirsson, Hepatology 35:1134-1143, 2002; Goldenberg 등, Mol. Carcinog. 33:113-124, 2002; Midorikawa 등, Jpn. J. Cancer Res. 93:636-643, 2002]. 이들의 연구에서는 적게는 1K 칩에서 많게는 12K DNA 칩을 이용하여 간암 환자들의 조직들을 비교한 결과를 보고하고 있다. 간암 세포에서 발현이 증가하거나 감소하는 유전자들은 세포 분열(cell division), 세포신호전달(cell signaling), 세포 골격(Cell structure), 세포운동(cell mobility), 세포방어(cell defense), 유전자 및 단백질의 발현(gene/protein expression) 그리고 세포 내 물질대사(cell metabolism) 등 여러 부분에 관여하는 것으로서 환자 조직들에 따라 동일한 발현 변화를 보이는 유전자가 있는 반면 다른 발현 변화를 보이는 유전자들이 많았다. 이것은 각각 환자들의 특이성 때문일 가능성이 크므로 연구하는 대상의 환자 조직들의 정확한 병리학적 소견과 분류가 따라야 하며 정확한 유전자를 이용한 진단에는 보다 많은 새로운 유전자들의 검색과 확인이 이루어져야 한다. As such, the formation of cancer proceeds by a combination of various genes and the expression and regulation mechanisms of these genes. Recently, cDNA microarrays or gene chips using a large number of genes have been used to compare the expression rates of liver cancer-related genes. Research is underway to identify markers for diagnosis or treatment [Shirota et al., Hepatology 33: 832-840, 2001; Xu et al., Cancer Res. 61: 3176-3181, 2001; Tackels-Horne et al., Cancer 92: 395-405, 2001; Chen et al., Mol. Biol. Cell 13: 1929-1939, 2002; Li et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 369-379, 2002; Lee and Thorgeirsson, Hepatology 35: 1134-1143, 2002; Goldenberg et al., Mol. Carcinog. 33: 113-124, 2002; Midorikawa et al., Jpn. J. Cancer Res. 93: 636-643, 2002. Their study reports a comparison of tissues from liver cancer patients using as few as 1K chips and as many as 12K DNA chips. Genes that increase or decrease expression in liver cancer cells include cell division, cell signaling, cell structure, cell mobility, cell defense, genes and proteins The genes involved in various parts of gene / protein expression and cell metabolism were found to have the same expression change according to patient tissues, while many genes showed different expression changes. This is most likely due to the specificity of each patient, so accurate pathological findings and classification of the patient's tissues under study should be followed, and more new genes should be searched and identified for diagnosis.

한편, 인간 게놈 프로젝트의 한 연구 분야로 수행되어 온 "EST(expressed sequence tag) 수집"은 특정 조직이나 세포주에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴[Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat. Genet. 21:191-194,1999], 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석[Okubo 등, Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]이 가능하다고 보고되고 있다. 또한, Xu 등이 보고한 29개의 간암환자들의 간암조직과 주변 정상조직을 사용하여 각각 cDNA 라이브러리를 구축한 후 그 발현빈도를 분석한 보고에 따르면, 간암세포에서 발현빈도가 높은 유전자들로 주로 혈청 알부민(serum albumin), α1-항트립신, 인터-α-트립신 저해제, 아포지질단백질 AII, 피브리노겐, 셀레노프로테인 P, 알돌라아제 등이 보고되고 있다. 이와 같이, 특정 세포내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 간암 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 간암의 진행에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이고 나아가 간암의 진단이 가능하게 될 것이다. Meanwhile, "expressed sequence tag (EST) collection", which has been conducted as a research field of the human genome project, manufactures cDNA libraries from specific tissues or cell lines and analyzes the sequencing of cDNA clones randomly selected therefrom. A project to collect genes expressed in cell lines. Discovery of new genes through this EST collection method [Adams et al., Science 252: 1651-1656, 1991; Adams et al., Nature 377: (Suppl.) 3-174, 1995; Hillier et al., Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra et al., Nat. Genet. 21: 191-194,1999], analysis of expression patterns of genes expressed in specific tissues or cell lines, quantitative analysis [Okubo et al., Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams et al., Science 252: 1651-1656, 1991; Adams et al., Nature 377: (Suppl.) 3-174, 1995; Liew et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo et al., Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]. In addition, Xu et al reported that cDNA libraries were constructed using hepatocellular carcinoma and surrounding normal tissues of 29 liver cancer patients and analyzed for their expression frequency. Albumin (serum albumin), α1-antitrypsin, inter-α-trypsin inhibitor, apolipoprotein AII, fibrinogen, selenoprotein P, aldolase and the like have been reported. As such, it is possible to discover genes related to liver cancer by analyzing the frequency of expression of specific genes in specific cells, thereby understanding the molecular mechanisms of the progression of liver cancer, and furthermore, to diagnose the liver cancer.

본 발명에서는 Park 등이 간암으로부터 만든 SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-475와 HLK1, HLK3, J-SHC 등의 간암 세포주를 이용하여 정상 간조직과 유전자의 발현빈도를 분석하고 이로부터 간암 고발현 유전자 및 저발현 유전자를 선별하고자 하였다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995]. 현재까지 SNU 간암 세포주를 이용한 연구가 많이 수행되어, SNU 세포주들간의 특이적인 발현을 보이는 유전자에 대해 보고되고 있다. 즉, SNU-368 세포주에서는 트랜스페린(transferrin), IGF-II(insulin-like growth factor II) 그리고 IGF-1R(insulin growth factor-1 receptor)이 과발현이 되고 있음이 보고 되어있고, 또한 세포사멸에 관련된 파스(fas) 리간드의 발현도 증가되어 있음이 보고되었다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995; Shin 등, Int. J. Cancer 82:587-591, 1999; Kim 등, Cancer Res. 56:3831-3836, 1996]. SNU-354 세포주는 알부민의 발현이 매우 높고 세포막에 파스의 발현 또한 높다고 보고되고 있다[Park 등, Int. J. Cancer 62:276-282, 1995; Shin 등, Int. J. Cancer 82:587-591]. 그러나, 여러 세포주에서 동일하게 유전자 발현의 변화를 보이는 유전자들은 아직까지 규명되지 않고 있다. 따라서, 몇 종류들의 간암 세포주들과 정상 간암조직에서 유사한 유전자 발현 패턴을 보이는 유전자들은 간암 마커로서 사용 가능할 것이다. In the present invention, using the liver cancer cell lines such as SNU-354, SNU-368, SNU-387, SNU-475 and HLK1, HLK3, J-SHC made by Park et al. From this, high and low expression genes for liver cancer were selected [Park et al., Int. J. Cancer 62: 276-282, 1995]. To date, a number of studies using SNU liver cancer cell lines have been conducted, and reports have been made on genes showing specific expression between SNU cell lines. In other words, it has been reported that transferrin, insulin-like growth factor II (IGF-II) and insulin growth factor-1 receptor (IGF-1R) are overexpressed in the SNU-368 cell line. It has also been reported that expression of fas ligands is also increased [Park et al., Int. J. Cancer 62: 276-282, 1995; Shin et al., Int. J. Cancer 82: 587-591, 1999; Kim et al., Cancer Res. 56: 3831-3836, 1996. The SNU-354 cell line has been reported to have high albumin expression and high expression of pars in the cell membrane [Park et al., Int. J. Cancer 62: 276-282, 1995; Shin et al., Int. J. Cancer 82: 587-591. However, genes showing the same change in gene expression in various cell lines have not been identified yet. Therefore, genes showing similar gene expression patterns in several types of liver cancer cell lines and normal liver cancer tissues may be used as liver cancer markers.

본 발명에서는 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자를 발굴하였으며, 이들은 간암과의 관련성이 보고되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. K-ALPHA-1은 투불린 아이소타입 중 하나로 세포 구조 형성에 관여하며 LDHA(lactate dehydrogenase A)은 당 분해 경로의 효소로서 대장암 세포주[Rutzky 와 Sicikiano, J. Natl. Cancer Inst. 68:81-90, 1982]나 뇌실 상의 세포종(ependymoma)[Korshunov 등, Am. J. Pathol. 163:1721-1727]에서 과발현 되고 있음이 알려져 있으나 간암과의 관련성은 보고된 바 없다. FTL(ferritin, light polypeptide)은 철분을 저장하는 세포내 분자물질이며 RPL4(ribosomal protein L4), RPL9(ribosomal protein L9), RPL10(ribosomal protein L10) 그리도 RPL13A(ribosomal protein L13A)들은 유전자들의 해독 (translation)에 관여하는 라이보좀(ribosome)의 구조단백질로서 정확한 기능이 많이 알려져 있지 않으나 최근 들어 특정 암세포에서 그 발현에 변화를 보인다는 보고가 되고 있다. RPL4는 쥐(rat)의 신경세포의 분열(proliferation)과 분화 (differentiation)에 어떤 역할을 할 가능성이 제시되었고[Ueno 등, Histol. Histopathol. 17:789-798, 2002] PRL9는 NGF(nerve growth factor)를 처리한 신경세포에서 그 발현이 증가한다고 보고되었으며[James 등, BMC Neuroscience. in press, 2002] RPL9는 인간 전립선암 (prostate cancer)에서 안드로젠(androgen) 호르몬에 영향을 받지 않는 유전자로서 그 발현이 증가하는 것으로 보고되었다[Karan 등, Carcinogenesis. 23:967-975, 2002]. RPL13A는 췌장 (pancreas)과 전립선암 조직에서 그 발현에 변화가 없는 유전자로서 다른 유전자들의 발현의 변화를 측정할 때 표준화시키는 대조유전자로서 사용 가능하다는 보고가 되어 있다[Jesnowski 등, Pancreatology. 2:421-424, 2002]. ENO1(enolase 1)은 간암세포주에서 v-src 발암 유전자에 의해 그 발현이 증가하는 유전자로 보고되어 있으나 v-src 신호전달에 국한되어 있는 보고이다[Jiang 등, Cancer Res. 57:5328-5335, 1997]. GNB2L1(guanine nucleotide binding protein, beta polypeptide 2-like 1)은 2003년에 최초로 보고된 유전자로서 기능에 관한 연구는 이루어진 바 없다[Wang 등, Mol. Biol. Rep. 30:53-60, 2003]. AMBP (alpha-1-microglobulin/bikunin precursor)는 혈장 당단백질 중 하나로 급성 간염의 경우 나타나는 저삼투압성 스트레스(hypotonic stress)나 간세포로의 글루타민 섭취에 따라 이 유전자 발현이 감소한다는 보고는 되어 있으나 간암 진단 마커 유전자로서의 보고가 아직 되어 있지 않다[Claeyssens 등, FEBS Lett. 14:15-18, 1998]. GC(group-specific component)는 혈장에 과량 포함된 단백질로서 면역체계에 관여하는 대식세포(macrophage)를 활성화시키며 여러 암에서 면역억제물질로 작용한다는 보고가 되어 있다[Yamamoto 등, Cancer Res. 56:2827-2831, 1996]. 반면에 만성 간질환 환자들의 혈장 내에서의 GC 단백질의 량의 감소가 골형성이상증에 관여한다는 보고도 있다[Mihas 와 Hirschowitz, J. Med. 9:109-115, 1978]. SERPINC1(serine proteinase inhibitor, clade C, member 1)은 안티트롬빈 III로서 혈소판 생성에 관여하나 간암세포에 그 발현의 감소에 대한 보고는 되어있지 않다. A1BG(alpha 1-B glycoprotein)는 최근 들어 cDNA가 클로닝되었으며 면역글로불린 상과(上科, superfamily)의 한 물질로 세포인식(cell recognition)과 세포운동조절(cell behavior regulation)에 관여할 것으로 추정하고 있다[Gardmo 등, endocrinology 142:2695-2701, 2001].In the present invention, 10 kinds of liver cancer high expression genes and 4 kinds of liver cancer low expression genes were identified, and these have not been reported to be related to liver cancer. K-ALPHA-1 is one of the tubulin isotypes and is involved in cell structure formation, and lactate dehydrogenase A (LDHA) is an enzyme of the glycolytic pathway, a colorectal cancer cell line [Rutzky and Sicikiano, J. Natl. Cancer Inst. 68: 81-90, 1982] or ependymoma in the ventricles [Korshunov et al., Am. J. Pathol. 163: 1721-1727], but it has not been reported to be associated with liver cancer. FTL (ferritin, light polypeptide) is an intracellular molecular substance that stores iron, and ribosomal protein L4 (RPL4), ribosomal protein L9 (RPL9), ribosomal protein L10 (RPL10) and ribosomal protein L13A (RPL13A) are the translation of genes. The exact function of ribosome (ribosome) involved in the structure is not known much, but recently, it has been reported that the expression of the change in certain cancer cells. RPL4 has been suggested to play a role in the proliferation and differentiation of rat neurons [Ueno et al., Histol. Histopathol. 17: 789-798, 2002] PRL9 has been reported to increase its expression in neurons treated with NGF (nerve growth factor) [James et al., BMC Neuroscience. in press, 2002] RPL9 is a gene that is not affected by the androgen hormone in human prostate cancer and has been reported to increase its expression [Karan et al., Carcinogenesis. 23: 967-975, 2002. RPL13A is a gene with no change in its expression in pancreas and prostate cancer tissues and has been reported to be used as a control gene to standardize when measuring changes in the expression of other genes [Jesnowski et al., Pancreatology. 2: 421-424, 2002. ENO1 (enolase 1) is reported to be a gene whose expression is increased by v-src oncogenic genes in liver cancer cell lines, but is limited to v-src signaling [Jiang et al., Cancer Res. 57: 5328-5335, 1997. GNB2L1 (guanine nucleotide binding protein, beta polypeptide 2-like 1) is the first gene reported in 2003 and no functional studies have been conducted [Wang et al., Mol. Biol. Rep. 30: 53-60, 2003. Although AMBP (alpha-1-microglobulin / bikunin precursor) is one of the plasma glycoproteins, it has been reported that the expression of this gene decreases due to hypoosmotic stress in acute hepatitis or glutamine ingestion into liver cells. No report as a marker gene has yet been made [Claeyssens et al., FEBS Lett. 14: 15-18, 1998]. GC (group-specific component) is an excess of protein in plasma activates the macrophage (macrophage) involved in the immune system and has been reported to act as an immunosuppressive agent in various cancers [Yamamoto et al., Cancer Res. 56: 2827-2831, 1996. On the other hand, it has been reported that a decrease in the amount of GC protein in the plasma of patients with chronic liver disease is involved in osteoblasts [Mihas and Hirschowitz, J. Med. 9: 109-115, 1978. SERPINC1 (serine proteinase inhibitor, clade C, member 1) is an antithrombin III involved in platelet production, but there are no reports of reduced expression in hepatic cancer cells. A1BG (alpha 1-B glycoprotein) is a clone of cDNA in recent years and is a member of the immunoglobulin superfamily and is thought to be involved in cell recognition and cell behavior regulation. Gardmo et al., Endocrinology 142: 2695-2701, 2001.

이에, 본 발명자들은 간암 세포주와 정상 간조직의 cDNA 라이브러리의 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 하여 간암 고발현 또는 저발현 유전자를 찾아내고 경쟁적 RT-PCR 방법에 의해 간암 세포주와 정상 간 조직 또는 간암 환자 시료에서 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 확인하여 간암을 검출할 수 있는 새로운 간암 종양마커를 밝혀냄으로써 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors analyzed the gene sequences of the cDNA library of liver cancer cell lines and normal liver tissues, and based on the frequency of discovery of these genes, to find the liver cancer high or low expression genes, and the liver cancer cell line by a competitive RT-PCR method The present invention was completed by identifying new liver cancer tumor markers capable of detecting liver cancer by identifying liver cancer high and low expression genes in normal liver tissue or liver cancer patient samples.

따라서, 본 발명은 간암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 간암 진단방법을 제공하는데 그 목적이 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for diagnosing liver cancer by measuring the expression level of genes specifically expressed in liver cancer tissues.

또한, 본 발명은 간암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 간암 진단킷트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다. In addition, another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for liver cancer using measurement of the expression level of genes specifically expressed in liver cancer tissue.

본 발명은 간암 특이적 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A, AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간암을 진단하는 간암 진단방법 및 진단킷트를 그 특징으로 한다.The present invention measures the expression level of at least one gene selected from liver cancer specific genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A, AMBP, SERPINC1, GC and A1BG. It is characterized by a liver cancer diagnostic method and diagnostic kit for diagnosing liver cancer.

이와 같은 본 발명을 보다 상세히 설명한다.This invention will be described in more detail.

본 발명은 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간암을 진단하는 간암 진단킷트에 관한 것이다.The present invention is one or more genes selected from the group consisting of liver cancer specific high expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A, and liver cancer specific low expression The present invention relates to a liver cancer diagnosis kit for diagnosing liver cancer by measuring expression levels of one or more genes selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG.

본 발명의 간암 마커 유전자는 간암 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.Liver cancer marker genes of the present invention include the full length and fragments of genes that are highly or underexpressed in liver cancer tissues.

또한, 본 발명의 진단킷트는 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함한다. In addition, the diagnostic kit of the present invention is a sense of at least one gene selected from the group consisting of liver cancer specific high expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A And antisense primers of at least one gene selected from the group consisting of antisense primers and liver cancer specific low expression genes AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG.

또한, 본 발명의 진단킷트는 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다. In addition, the diagnostic kit of the present invention is complementary to at least one gene selected from the group consisting of liver cancer specific high expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A And probes complementary to one or more genes selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG, which are specific probes and liver cancer specific low expression genes.

또한, 본 발명의 진단킷트는 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다. In addition, the diagnostic kit of the present invention is a liver cancer specific high expression gene K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A by at least one gene selected from the group consisting of And an antibody that recognizes a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of an antibody recognizing a protein to be encoded and AMBP, SERPINC1, GC and A1BG, which are liver cancer specific low expression genes.

또한, 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지변화를 측정하기 위하여 L4-PHA를 포함한다.In addition, the antibody, the substrate, a suitable buffer, a secondary antibody labeled with a chromophore or a fluorescent substance, a chromogenic substrate, etc. may be included, and L4-PHA to measure β1,6-N-acetylglucosamine sugar chain change. It includes.

상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.The substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96 well plate synthesized with a polyvinyl resin, a 96 well plate synthesized with a polystyrene resin, a slide glass made of glass, and the like. The enzyme may be used peroxidase, alkaline phosphatase (Alkaline Phosphatase), the fluorescent material may be used FITC, RITC, etc., the color substrate is ABTS (2, 2'-Azino-bis (3) -ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), or OPD (o-Phenylenediamine) or TMB (Tetramethyl Benzidine) can be used.

본 발명에서 확인된 간암 마커 유전자의 서열정보는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.Sequence information of the liver cancer marker genes identified in the present invention are shown in Table 1 below.

유전자gene 길이Length CDS(단백질 영역)CDS (protein region) 위치location GenBank Accession No.GenBank Accession No. K-ALPHA-1K-ALPHA-1 15961596 68, 142368, 1423 12q13.1212q13.12 NM_006082NM_006082 LDHALDHA 16611661 98, 109698, 1096 11p15.411p15.4 NM_005566NM_005566 FTLFTL 878878 189, 716189, 716 19q13.3-q13.419q13.3-q13.4 NM_000146NM_000146 ANXA2ANXA2 13621362 50, 106950, 1069 15q21-q2215q21-q22 NM_004039NM_004039 RPL4RPL4 14491449 57, 134057, 1340 1q21.2-q21.31q21.2-q21.3 NM_000968NM_000968 ENO1ENO1 18121812 152, 1456152, 1456 1p36.3-p36.21p36.3-p36.2 NM_001428NM_001428 RPL9RPL9 716716 29, 60729, 607 4p134p13 NM_000661NM_000661 GNB2L1GNB2L1 10931093 96, 104996, 1049 5q35.35q35.3 NM_006098NM_006098 RPL10RPL10 21882188 42, 68642, 686 Xq28Xq28 NM_006013NM_006013 RPL13ARPL13A 11421142 23, 63423, 634 19q13.319q13.3 NM_012423NM_012423 AMBPAMBP 14131413 227, 1285227, 1285 9q32-q339q32-q33 NM_001633NM_001633 SERPINC1SERPINC1 13951395 1, 13951, 1395 1q23-q25.11q23-q25.1 NM_000488NM_000488 GCGC 18011801 154, 1578154, 1578 4q12-q134q12-q13 NM_000583NM_000583 A1BGA1BG 33863386 55, 154255, 1542 19q13.419q13.4 NM_130786NM_130786

본 발명에서는 8종의 간암 세포주(SNU475, SNU368, HLK1, SNU354 2 종류,JSHC, SNU387, HLK3)와 3종의 정상 간 조직 표본(N800102, N670205, N803806)을 사용하여 총 11종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 18,211개의 EST 염기 배열을 결정하고 간암 세포주 시료와 정상 간 조직 시료에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 간암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 높은 10종의 간암 고발현 유전자(K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A)와 발굴 빈도가 낮은 4종의 간암 저발현 유전자(AMBP, SERPINC1, GC, A1BG)를 각각 선별하여 간암 마커 유전자를 찾아내었다. In the present invention, a total of 11 cDNA libraries using eight liver cancer cell lines (SNU475, SNU368, HLK1, SNU354, two types, JSHC, SNU387, and HLK3) and three normal liver tissue samples (N800102, N670205, and N803806) were used. The nucleotide sequence of about 18,211 EST was determined, and the frequency of excavation of each gene was analyzed in liver cancer cell line samples and normal liver tissue samples, and 10 liver high expression genes (K- ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A) and four types of low liver cancer low-expression genes (AMBP, SERPINC1, GC, A1BG) were selected and selected. I found it.

유전자 발굴빈도 분석에 사용된 간암 세포주 시료 및 정상 간 시료에서 본 발명의 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 간암 고발현 유전자는 간암 세포주 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 간암 저발현 유전자는 정상 간 조직 시료에서는 고발현되나 간암 세포주 시료에서는 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 간암 마커 유전자들과 간암과의 관련성이 확인되었다. In the liver cancer cell line samples and normal liver samples used for gene discovery frequency analysis, the expression levels of the 10 hepatocellular carcinoma genes and 4 hepatocarcinoma low-expression genes of the present invention were compared by quantitative RT-PCR. The expression gene was observed to be highly expressed in liver cancer cell line samples, and the liver cancer low expression gene was observed to be high in normal liver tissue samples but low in liver cancer cell line samples. Confirmed.

또한, 7명의 환자에서 채취한 7쌍(간암조직 및 정상 간조직)의 임상시료를 사용하여 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자들의 발현량을 비교한 결과, 10종의 간암 고발현 유전자는 정상 간 임상 시료에 비해 대부분의 간암 임상시료에서 고발현됨을 확인하였고, 4종의 간암 저발현 유전자는 대부분의 간암 임상시료에서 저발현됨이 확인되어 임상적으로 간암으로 진단된 조직에서 본 발명의 간암 마커 유전자들의 유용성이 확인되었다. In addition, the expression levels of 10 hepatocellular carcinoma genes and 4 hepatocellular carcinoma genes were compared using 7 pairs (liver cancer tissue and normal liver tissue) clinical samples collected from 7 patients. Hepatocarcinoma high expression genes were found to be higher in most liver cancer clinical samples than in normal liver clinical samples, and four hepatocarcinoma low expression genes were found to be low in most liver cancer clinical samples. The utility of the liver cancer marker genes of the present invention in tissues has been identified.

따라서, 간암 특이적 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A, AMBP, SERPINC1, GC, A1BG의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 간암을 진단할 수 있다. Therefore, liver cancer can be diagnosed by measuring the expression levels of the genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A, AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG. Can be.

또한, 본 발명에 따른 간암 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하여 간암을 진단하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다: 즉,In addition, the method of diagnosing liver cancer by measuring the expression level of liver cancer specific genes according to the present invention will be described in detail as follows:

(a) 시험 간암 조직에서 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,(a) measuring the expression level or protein amount of one or more liver cancer high expression genes selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A in test liver cancer tissue Steps,

(b) 정상 간 조직에서 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,(b) measuring the expression level or protein amount of one or more liver cancer high expression genes selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A in normal liver tissue; Steps,

(c) 시험 간암 조직에서 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계, (c) measuring the expression level or protein amount of one or more liver cancer low expression genes selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC and A1BG in test liver cancer tissue,

(d) 정상 간 조직에서 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및(d) measuring the expression level or protein amount of one or more liver cancer low expression genes selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC and A1BG in normal liver tissue; And

(e) 상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고, 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 간암 여부를 판정하는 단계를 포함한다. (e) comparing the measured value obtained by (a) with the measured value obtained by (b), and comparing the measured value obtained by (c) with the measured value obtained by (d) to determine whether liver cancer It includes a step.

본 발명의 14종의 마커 유전자의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 14종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 서열번호 7 내지 34에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다. The expression amount of the 14 marker genes of the present invention can be measured by a known method using sense primers and antisense primers having base sequences complementary to marker genes or fragments thereof. For example, it can be measured by a competitive RT-PCR method. Such primers contain an array of some or all of the DNA regions encoding proteins among the DNA regions of the 14 marker genes and must be at least 15 bp in length. For example, the primers set forth in SEQ ID NOs: 7-34 can be used. Complementary in the present invention is not limited to the case where the arrangement is completely complementary in at least 15 consecutive nucleotide sequences, it is only necessary to have a homology of 70%, preferably 80% or more on the base sequence.

또한, 본 발명의 14종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화(하이브리다이제이션) 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 14종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며, 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 14종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 14종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.In addition, the expression amount of the 14 marker genes of the present invention can be measured through a known hybridization (hybridization) reaction using a marker gene or a fragment thereof as a probe. For example, Northern hybridization ("Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), in situ hybridization (Jacquemier et al., Bull Cancer 90: 31-8, 2003] or microarrays (Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003). The probe is usually 200 to 1000 bp containing the nucleotide sequences of 14 genes, and preferably has a length of 400 to 800 bp. The base sequence may have 70% or more similarity with that of 14 genes. The probe of the marker gene of the present invention can be produced by conventional methods such as gene amplification (PCR) using sense primers and antisense primers of the 14 kinds of marker genes prepared above.

또한, 상기 14종의 간암 마커 유전자의 발현량은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 간암마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.In addition, the expression amount of the 14 kinds of liver cancer marker genes can be measured by measuring the amount of the protein encoded by each gene. In the above method, the protein can be quantified by conventional ELISA, immunoprecipitation method, etc. using an antibody that specifically binds to liver cancer marker protein.

본 발명의 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 14종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], 모노클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991)등의 특수항체도 포함된다.Antibodies against the 10 hepatocarcinoma high expression genes and 4 hepatocarcinoma low expression genes of the present invention can be obtained by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the marker gene, It can be prepared by the phosphorus method. This includes partial peptides that can be made from 14 proteins, and the partial peptides of the present invention include at least 7 amino acids, preferably 9 amino acids, more preferably 12 or more amino acids. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited and may be polyclonal antibody [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], monoclonal antibodies [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] or some of which are antigen-binding, are included in the antibodies of the invention and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies (Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991).

본 발명의 14종의 간암 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 간암 진단에 사용될 수 있다.The 14 liver cancer marker genes or proteins of the present invention may be used alone or in combination to diagnose liver cancer.

또한, 본 발명의 간암 진단킷트는 상기 간암 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에는 14종 유전자의 고형지지체를 포함한다.In addition, the liver cancer diagnostic kit of the present invention may further include RNA or poly (A) + RNA separation reagents in addition to the sense and antisense primers or probes of the liver cancer specific marker genes, and when the amount of expression is examined through a microarray. Includes solid supports of 14 genes.

또한, 14종의 간암 마커 유전자는 발암 관련 유전자 또는 발암 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 항암제, 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다. In addition, since 14 kinds of liver cancer marker genes are likely to be carcinogenic genes or carcinogenic genes, small molecule compounds that bind to the proteins encoded by these target genes may be candidates for compounds that inhibit or promote the target proteins. It can be used as a medicine for anticancer drugs and treatments.

이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 상기 14종의 간암 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투하이브리드법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 브로팅법["Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝법 [Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자화합물, 합성펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다. As a method of screening such a compound, a method in which the proteins encoded by the 14 liver cancer marker genes are immobilized in an affinity column and contacted with a test sample for purification [Pandya et al., Virus Res 87: 135-143, 2002] , Method of using the hybrid method [Fields, S and Song, O., Nature 340: 245-246, 1989], Western blotting ["Molecular Cloning-A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], a high throughput screening method [Aviezer et al., J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] can be used. Test samples used for screening include, but are not limited to, cell extracts, expression products of gene libraries, synthetic low molecular weight compounds, synthetic peptides, natural compounds, and the like.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited thereto.

실시예 1: 간암 세포주와 정상 간 조직으로부터 총 RNA 분리Example 1 Total RNA Isolation from Liver Cancer Cell Lines and Normal Liver Tissues

10% 소혈청(Fetal Bovine Serum)[Gibco BRL 사], 페니실린(10000 U/㎖)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 RPMI1640[Jeil Biotech 사] 배양액을 15 cm 디쉬에 30 ㎖씩 분주한 후 간암 세포주인 SNU475, SNU368, SNU354, SNU387[한국세포주은행]과 HLK1, HLK3, JSHC[전북대]를 디쉬당 세포가 5 ×106이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO2가 존재하는 배양기에서 배양을 하였다. 3쌍의 정상 간 조직 표본인 N800102, N670205, N803806[을지대학교 의과대학]은 외과적으로 제거된 조직으로부터 얻고, 분석할 때까지 이를 액체 질소에 보관하였다.30 ml aliquots of RPMI1640 [Jeil Biotech Inc.] supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (Gibco BRL), penicillin (10000 U / mL) and streptomycin (10 mg / mL) in 15 cm dishes. After inoculation of liver cancer cell lines SNU475, SNU368, SNU354, SNU387 [Korea Cell Line Bank] and HLK1, HLK3, JSHC [Cheonbuk National University] to have 5 × 10 6 cells per dish and 37 ℃, 5% CO 2 is present. The culture was carried out in the incubator. Three pairs of normal liver tissue samples N800102, N670205, and N803806 [Eulji University Medical College] were obtained from surgically removed tissue and stored in liquid nitrogen until analysis.

세포의 총 RNA는 QIAGEN 키트(RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 우선, 부착 세포는 EDTA와 트립신을 이용해 회수한 후, 150 ㎕의 베타 머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2 ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다. Total RNA of cells was isolated using QIAGEN kit (RNeasy Maxi kit: cat # 75162). First, adherent cells were recovered using EDTA and trypsin, and then lysed in 15 ml of digestion buffer in a kit to which 150 μl of beta mercaptoethanol was added. 15 ml of 70% EtOH was added thereto and mixed well, followed by centrifugation at 3000 g for 5 minutes to attach total RNA to the membrane. After two washing procedures, total RNA was eluted and separated by adding 1.2 ml of RNase-free water.

실시예 2: EST 발굴 빈도에 의해 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 선별 Example 2 Selection of Liver Cancer High and Low Expression Genes by Frequency of EST Excavation

본 발명자는 간암에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, 간암 세포주와 정상 간 조직에서 각종 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.In order to analyze genes expressed in liver cancer, the present inventors construct various cDNA libraries in liver cancer cell lines and normal liver tissues, and randomly select and analyze clones from the liver cancer high expression genes based on the frequency of EST discovery. Expression genes were to be selected.

1) cDNA 라이브러리의 제조 1) Preparation of cDNA Library

상기 실시예 1에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 100 ㎍을 BAP 효소 반응액[100Mm Tris-Hcl(pH 7.0), RNA 2mM DTT, 80U Rnasin(promega사)]에서 3 U의 BAP (Bacterial alkaline Phosphatase)[TakaRa사] 효소로 처리하고, 이어 TAP[Waco사] 효소 반응액[50 mM sodium acetate(pH 5.5), 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 80U Rnasin (promega사)]에서 100 U의 TAP(Tabbaco acid pyrophosphatase) 효소를 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.5 mM ATP, 26% PEG, 100U Rnasin, 서열번호 1의 올리고리보뉴클레오티드 40 pmole, 250U RNA 리가제[TakaRa사]의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.100 μg of total RNA of each sample obtained in Example 1 was analyzed by BAP enzyme reaction solution [100 mM Tris-Hcl (pH 7.0), RNA 2 mM DTT, 80 U Rnasin (promega)] and 3 U BAP (Bacterial alkaline Phosphatase) [TakaRa] enzyme followed by 100 U TAP (Tabbaco) in TAP [Waco] enzyme reaction solution [50 mM sodium acetate (pH 5.5), 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 80 U Rnasin (promega)] acid pyrophosphatase) enzyme was reacted. Then, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 5 mM MgCl 2 , 2 mM DTT, 0.5 mM ATP, 26% PEG, 100 U Rnasin, oligoribonucleotide 40 pmole of SEQ ID NO: 1, 250 U RNA ligase [TakaRa Co., Ltd.] ] Was reacted so that the synthesized oligomer was added only to undigested mRNA having a phosphate group.

이상의 반응을 처리한 총 RNA로부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 [QIAGEN사]를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 서열번호 2의 올리고머를 프라이머로 사용하여 1st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 [Perkin Elmer사]를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5'-말단(서열번호: 3)과 3'-말단의 올리고머(서열번호: 4)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 키트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F'[Invitrogen사] 균주에 형질전환시켜, cDNA 라이브러리를 제조하였다.MRNA was isolated from the total RNA treated with the above reaction using oligotex mRNA purification kit [QIAGEN] and 1 st cDNA was synthesized using oligomer of SEQ ID NO: 2 containing dT17 as a primer. The synthesized cDNA was subjected to PCR reaction containing the 5'-end (SEQ ID NO: 3) and 3'-end oligomer (SEQ ID NO: 4) of the DNA insert synthesized using the XL PCR kit (Perkin Elmer). And amplified in small amounts. The PCR product was treated with an enzyme of SfiI and subjected to agarose gel electrophoresis to separate cDNA fragments of 1.3 kb or more. The isolated cDNA fragment was linked to pCNS-D2 vector treated with DraIII enzyme using TaKaRa ligation kit, and then transformed into E. coli Top10F '[Invitrogen] strain by electroporation to prepare cDNA library. It was.

본 방법에 의해 8종의 간암 세포주 cDNA 라이브러리와 3종의 정상 간 조직 cDNA 라이브러리를 제조하고 EST 분석하였다[표 2]. Eight liver cancer cell line cDNA libraries and three normal liver tissue cDNA libraries were prepared by this method and analyzed by EST [Table 2].

2) cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석2) Determination of cDNA Sequence and Data Analysis

제작한 cDNA 라이브러리를 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96웰 플라스미드 프렙 시스템(plasmid prep system)으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다. The prepared cDNA library was plated on LB agar medium containing ampicillin (100 µg / ml) to culture a number of cDNA clones. In order to analyze the nucleotide sequences of the clones, plasmid DNA was isolated by MWG 96-well plasmid prep system, and sequencing was performed by ABI 3700, an automated nucleotide sequencer.

결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 유니진(UniGene) 데이터베이스(Hs.seq.all, build#163)에서 수행하였다. Similarity search of the determined DNA data was performed in the UniGene database (Hs.seq.all, build # 163) using BLASTN.

총 11 종의 cDNA 라이브러리에서 약 18,211개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 유니진 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 9,028종의 유전자가 발굴되었다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.Approximately 11,211 EST sequences were determined from a total of 11 cDNA libraries and their analysis was performed on the Unijin database. As a result, a total of 9,028 genes were identified. The number of ESTs determined for each library and the types of genes discovered are shown in Table 2 above.

3) 유전자 발굴 빈도 분석3) Analysis of gene discovery frequency

3종의 정상 간 조직 cDNA 라이브러리를 대조군으로 하고 8종의 간암 세포주 cDNA 라이브러리는 간암 시료로 하여 크게 2가지로 분류하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각각의 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한, 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다. Three normal liver tissue cDNA libraries were used as controls and eight liver cancer cell line cDNA libraries were classified into two types, as liver cancer samples. The frequency of excavation of each gene was expressed as the ratio of the total number of genes excavated to the number of specific genes excavated in each sample. In addition, the frequency of excavation of each gene in each library was calculated by calculating the number of specific genes excavated in each library as the ratio of the total number of genes excavated and represented as color.

상기와 같은 분석에 의해 간암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 증가하는 10종의 고발현 유전자와 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 4종이 각각 선별되었다[도 1]. As a result of the above analysis, 10 high-expression genes with increased excavation frequency and 4 low-expression genes with reduced excavation frequency were selected from liver cancer cell line samples [Fig. 1].

실시예 3: RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석Example 3 Analysis of Expression of Selected Target Genes by RT-PCR Response

정상 간 조직 시료와 간암 세포주 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별된 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다. The expression levels of 10 hepatocellular carcinoma genes and 4 hepatocarcinoma low-expression genes selected by gene discovery frequency in normal liver tissue and liver cancer cell line samples were quantitatively analyzed by competitive RT-PCR method.

1) 역전사 효소 반응1) Reverse Transcriptase Reaction

상기 실시예 1에서 분리한 총 9종의 총 RNA에서 각각 5 ㎍을 사용하여 다음 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 9종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.A total of nine 1 st cDNAs were synthesized by reacting for 5 minutes at 42 ° C. for 60 minutes in the following reverse transcription reaction solution using 5 μg of the total 9 kinds of total RNA isolated in Example 1 above. Thereafter, cDNA synthesis was terminated by reacting for 15 minutes in a 70 ° C. heating block.

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4 ㎍/㎕)poly dT (12-18) primer (0.4 μg / μl) 1 ㎕1 μl 5X first-strand buffer5X first-strand buffer 4 ㎕4 μl 10 mM dNTP 혼합물10 mM dNTP mixture 1 ㎕1 μl 0.1M DTT0.1M DTT 2 ㎕2 μl RNaseOUT (40 U/㎕)RNaseOUT (40 U / μl) 1 ㎕1 μl 역전사효소 (200 U/㎕)Reverse transcriptase (200 U / μl) 1 ㎕1 μl 총 RNA (5 ㎍)Total RNA (5 μg) X ㎕X μl 증류수Distilled water (10-X) ㎕(10-X) μl 총부피Total volume 20 ㎕20 μl

2) 경쟁적(competitive) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인2) Confirmation of amplification and expression level of cDNA using competitive PCR

① 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정① Correction of template concentration for competitive PCR

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 B2M 유전자를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현양과 경쟁 DNA의 발현양이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다. B2M gene was used in this experiment as a standard gene for quantifying the marker gene. Priming parts of standard genes and primers are identical, but PCR DNA reactions are performed with competing DNAs (competitors) having different sizes of PCR products with standard genes. The concentration of the sample was corrected so that the concentration of each template used for PCR was equal.

B2M 경쟁 DNA는 3 ㎕의 pCNS 벡터 DNA(2 ng), 10 ㎕의 5 ×PCR premix[바이오니아 사], 1 ㎕의 5' 프라이머(20 pmole: 서열번호 5), 1 ㎕의 3'프라이머 (20 pmole: 서열번호 6), 35 ㎕의 증류수를 함유한 50 ㎕의 반응액에서 PCR 반응을 수행하여 제조하였다. 이때 PCR 반응의 조건은 94 ℃ 30초, 50 ℃ 1분으로 25회 수행하였으며, B2M 경쟁 DNA인 PCR 산물의 길이는 322 bp였다. B2M competition DNA includes 3 μl of pCNS vector DNA (2 ng), 10 μl of 5 × PCR premix (Bionia), 1 μl of 5 'primer (20 pmole: SEQ ID NO: 5), 1 μl of 3' primer (20 pmole: SEQ ID NO: 6), was prepared by performing a PCR reaction in 50 μl of the reaction solution containing 35 μl of distilled water. At this time, the PCR reaction conditions were performed 25 times at 94 ℃ 30 seconds, 50 ℃ 1 minute, the length of the PCR product, B2M competition DNA was 322 bp.

조제한 B2M 경쟁 DNA를 3/108, 7/108, 1/107, 3/107, 7/107 , 1/106, 3/106, 7/106 의 8단계로 희석한 후, 2 ㎕를 상기 1)의 역전사 효소 반응액(역전사 반응에 사용된 RNA의 10 ng에 해당되는 양)과 각각 혼합한 후, 4 ㎕의 5 ×Taq DNA 중합효소 혼합액, 2 ㎕의 B2M 프라이머(5 pmole/㎕)(서열번호 5 및 6), 8 ㎕의 증류수를 함유한 총 20 ㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94 ℃ 40초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.The prepared B2M competition DNA was diluted in 8 steps of 3/10 8 , 7/10 8 , 1/10 7 , 3/10 7 , 7/10 7 , 1/10 6 , 3/10 6 , 7/10 6 2 μl of the reverse transcriptase reaction solution (amount corresponding to 10 ng of RNA used for reverse transcription) and After mixing, 4 μl of 5 × Taq Competitive PCR was performed using a total of 20 μl of 6 PCR reactions containing a DNA polymerase mixture, 2 μl of B2M primer (5 pmole / μl) (SEQ ID NOs: 5 and 6), and 8 μl of distilled water. At this time, PCR reaction conditions were performed 25 times at 94 ℃ 40 seconds, 55 ℃ 1 minutes, 72 ℃ 1 minutes.

PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 3 ㎕씩 로딩하여 100 V에서 30분 전기영동한 후, FrogTM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix 사]을 이용하여, 두 밴드(B2M 경쟁 DNA에서는 322 bp, 원래 B2M유전자에서는 390 bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다.PCR products were loaded on 3 μl of 2% agarose gel, followed by electrophoresis at 100 V for 30 minutes, and gel pictures were taken using a Frog ™ machine (Gel Image Analysis System) [Core Bio]. Finally, the gel band image file (.tif) obtained was screened using the ToltalLab v1.0 program (NonLinear Dynamix) to detect similar concentrations of two bands (322 bp for B2M competition DNA and 390 bp for the original B2M gene). After quantification, the concentration of each sample was corrected.

② PCR을 이용한 cDNA의 증폭② Amplification of cDNA by PCR

상기 ①에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 다음 표 4의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.CDNA of the sample calibrated in ① contains the sense and antisense primers of each gene, and then the PCR of Table 4 Amplified in the reaction solution. At this time, the PCR reaction was performed 25 times at 94 ℃ 1 minute, 55 ℃ 30 seconds, 72 ℃ 1 minute.

10종 간암 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A와 4종의 간암 저발현 유전자 AMBP, SERPINC1, GC, A1BG의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 17 ∼ 22 bp, GC 함량은 50 ∼ 70% 정도이다. 다음은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.Primers of 10 liver cancer high expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A and four liver cancer low expression genes AMBP, SERPINC1, GC, A1BG Designed within the region, the length of each primer is 17-22 bp and the GC content is about 50-70%. Next is PCR The composition of the reaction solution is shown.

cDNAcDNA 5 ㎕5 μl 5 ×PCR 반응 mix[바이오니아 사]5 X PCR reaction mix [Bionian company] 2 ㎕2 μl 정방향 프라이머 (10 pmole/㎕)Forward primer (10 pmole / μl) 1 ㎕1 μl 역방향 프라이머 (10 pmole/㎕)Reverse primer (10 pmole / μl) 1 ㎕1 μl 증류수Distilled water 1 ㎕1 μl 총부피Total volume 10 ㎕10 μl

경쟁적 PCR에 사용한 각 간암 마커 유전자들의 프라이머Primer of each liver cancer marker gene used for competitive PCR 유전자gene 정방향 프라이머Forward primer 역방향 프라이머Reverse primer K-ALPHA-1K-ALPHA-1 서열번호 7 SEQ ID NO: 7 서열번호 8 SEQ ID NO: 8 LDHALDHA 서열번호 9 SEQ ID NO: 9 서열번호 10 SEQ ID NO: 10 FTLFTL 서열번호 11 SEQ ID NO: 11 서열번호 12 SEQ ID NO: 12 ANXA2ANXA2 서열번호 13 SEQ ID NO: 13 서열번호 14 SEQ ID NO: 14 RPL4RPL4 서열번호 15 SEQ ID NO: 15 서열번호 16 SEQ ID NO: 16 ENO1ENO1 서열번호 17 SEQ ID NO: 17 서열번호 18 SEQ ID NO: 18 RPL9RPL9 서열번호 19 SEQ ID NO: 19 서열번호 20 SEQ ID NO: 20 GNB2L1GNB2L1 서열번호 21 SEQ ID NO: 21 서열번호 22 SEQ ID NO: 22 RPL10RPL10 서열번호 23 SEQ ID NO: 23 서열번호 24 SEQ ID NO: 24 RPL13ARPL13A 서열번호 25 SEQ ID NO: 25 서열번호 26 SEQ ID NO: 26 AMBPAMBP 서열번호 27 SEQ ID NO: 27 서열번호 28 SEQ ID NO: 28 SERPINC1SERPINC1 서열번호 29 SEQ ID NO: 29 서열번호 30 SEQ ID NO: 30 GCGC 서열번호 31 SEQ ID NO: 31 서열번호 32 SEQ ID NO: 32 A1BGA1BG 서열번호 33 SEQ ID NO: 33 서열번호 34 SEQ ID NO: 34

③ 경쟁적 PCR을 이용한 발현량 확인③ Confirmation of expression level using competitive PCR

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분간 전기영동한 후, PCR 산물을 상기 ①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다. In order to identify the PCR product amplified by the PCR reaction, the PCR reaction solution was electrophoresed at 100 V for 30 minutes on 2% agarose gel, and then the PCR product was subjected to the ToltalLab v1.0 program (NonLinear Dynamix) as in ①. Ltd.).

도 2와 3에 나타낸 결과와 같이, 도 2는 고발현 유전자를, 도 3은 저발현 유전자를 확인한 결과이며, X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, L3, L4, L5, L9, L12, L13, L16은 간암 세포주들이며 L17, L20은 정상 간 조직을 나타내며, Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량은 먼저 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 후, 고발현 유전자의 발현량은 간암 세포주에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타냈으며, 저발현 유전자의 발현량은 정상 간 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타낸 것이다. 간암 세포주에서 발굴 빈도가 높은 고발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 간암 세포주 시료에서 높았으며, 간암 세포주에서 발굴 빈도가 낮은 저발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 정상 간 조직에 비해 간암 세포주 시료에서 낮게 나타났다. 즉, 10종의 간암 후보 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A는 간암 마커로서 유용함을 확인하였고 4종의 간암 저발현 유전자 AMBP, SERPINC1, GC, A1BG는 간암 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.As shown in Figures 2 and 3, Figure 2 is a result of confirming the high expression gene, Figure 3 is a low expression gene, the X-axis shows a variety of samples, L3, L4, L5, L9, L12, L13, L16 Are liver cancer cell lines, L17 and L20 represent normal liver tissue, Y-axis represents the expression level of the target genes in various samples, the expression level of each gene first divided by the expression level of B2M expressed in various samples, and then high expression The expression level of the gene is expressed as a ratio to the average amount of expression expressed in liver cancer cell lines, and the expression level of low expression genes is expressed as a ratio with respect to the average amount of expression expressed in normal liver tissue. The competitive RT-PCR products of high-expression genes with high frequency of excretion in liver cancer cell lines were higher in liver cancer cell line samples. Low in the sample. That is, the 10 hepatic cancer candidate genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, and RPL13A were found to be useful as liver cancer markers, and four hepatocellular carcinogenic genes, AMBP and SERPINC1. , GC and A1BG were confirmed to be usable as liver cancer suppression markers.

실시예 4: 임상 시료에서 간암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량 확인Example 4 Confirmation of Expression of Hepatocellular Carcinoma and Low Expression Genes in Clinical Samples

본 실험에서는 카톨릭 의과대학교에서 제공한 7명의 간암 환자로부터 직접 채취한 시험 조직/정상 조직(각각 T1 내지 T7 및 N1 내지 N7)의 쌍으로 된 7종의 임상 시료에서, 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR법을 사용하여 수행하였다. In this experiment, 10 hepatocarcinoma high expression genes were obtained from 7 clinical samples of pairs of test tissues / normal tissues (T1 to T7 and N1 to N7, respectively) taken directly from 7 liver cancer patients provided by the Catholic Medical University. The expression levels of and four low expression genes were performed using the competitive RT-PCR method.

1) 총 RNA 분리 및 역전사 효소 반응 1) Total RNA Isolation and Reverse Transcriptase Reaction

실시예 1에서와 같은 방법으로 총 RNA를 분리하고, 실시예 3-1)에서와 같이 각 시료의 총 RNA 5㎍을 사용하여 42 ℃, 60분간 역전사 반응을 수행함으로써 총 14종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.Total RNA was isolated in the same manner as in Example 1, and the reverse transcription reaction was carried out at 42 ° C. for 60 minutes using 5 µg of total RNA of each sample as in Example 3-1), for a total of 14 1 st cDNAs. Was synthesized. Then, cDNA synthesis was terminated by reacting for 15 minutes in a 70 degreeC heating block.

2)경쟁적 PCR을 이용한 각 유전자의 발현량 확인2) Confirmation of expression level of each gene using competitive PCR

PCR에 사용되는 각 주형의 농도는 B2M 프라이머[서열번호: 7 및 8]를 사용하여 얻은 B2M PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 10 ㎕씩 로딩하여 상기 실시예 3-3)-①에서와 같이 TotalLab v1.0 프로그램으로 농도를 정량한 후, 가장 낮은 농도의 시료를 기준으로 나머지 13개의 시료의 농도를 희석하였다. 유전자들의 종류에 따라 주형으로 사용된 시료의 농도가 다르나 적게는 1st cDNA의 1/10 희석한 농도의 시료부터 1/200으로 희석한 시료를 사용하였다. 보정한 시료의 역전사 반응액을 2 ㎕씩 주형으로 이용하여 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 총 15 ㎕의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94 ℃ 30초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분, 25회씩 수행하였다. 사용된 프라이머는 상기 표 5에서 표시된 것과 같다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액 전부를 2%의 아가로스 젤에 100 V로 30분으로 전기영동한 후, PCR 산물을 3-3)-①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화 하였다. 도 4와 도 5에 나타낸 결과와 같이, 도 4는 고발현 유전자를, 도 5은 저발현 유전자를 확인한 결과이며, X축은 임상 시료를 나타낸 것으로, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7은 임상 환자들의 정상 간조직이고 T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7은 임상 환자들의 간암조직을 나타내며, Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량은 먼저 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 후, 가장 낮은 발현량을 보이는 시료를 기준으로 한 비율로서 나타낸 것이다. 그 결과, 간암 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, RPL13A 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 동일 환자에서 채취한 정상 간 조직에서보다 대부분의 시험 조직에서 더 높았으며, 간암 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC, A1BG 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 시험 조직에서보다 대부분의 정상 간 조직에서 더 높게 나타났다.The concentration of each template to be used for PCR was determined by loading 10 μl of the B2M PCR product obtained using B2M primers (SEQ ID NOs: 7 and 8) into 2% agarose gel as in Example 3-3) -①. After quantifying the concentration using the TotalLab v1.0 program, the concentration of the remaining 13 samples was diluted based on the lowest concentration. The concentration of the sample used as a template was different according to the types of genes, but the sample diluted to 1/200 from the sample of 1/10 diluted concentration of 1 st cDNA was used. A total of 15 μl of PCR containing the sense and antisense primers of each gene was used as the template for the reverse transcription reaction solution of the corrected sample. Amplified in the reaction solution. At this time, the PCR reaction was performed at 94 ℃ 30 seconds, 55 ℃ 1 minutes, 72 ℃ 1 minutes, 25 times each. Primers used are as indicated in Table 5 above. To confirm the amplified PCR product, the entire PCR reaction solution was electrophoresed at 100 V on a 2% agarose gel for 30 minutes, and the PCR product was subjected to the ToltalLab v1.0 program (3-3) -①. Quantification was performed using NonLinear Dynamix Ltd.). As shown in Figures 4 and 5, Figure 4 is a high expression gene, Figure 5 is a result of confirming a low expression gene, the X-axis shows a clinical sample, N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7 represents normal liver tissue of clinical patients, T1, T2, T3, T4, T5, T6, and T7 represent liver cancer tissue of clinical patients, and the Y axis represents the expression level of the target gene in various samples. Is first divided by the expression level of B2M expressed in various samples, and then expressed as a ratio based on the sample showing the lowest expression amount. As a result, the competitive RT-PCR products of the liver cancer high-expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, and RPL13A genes were higher than those of normal liver tissues collected from the same patient. It was higher in most test tissues, and the competitive RT-PCR product levels of liver cancer low expression genes AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG genes were higher in most normal liver tissues than in test tissues.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 간암 진단에 유용한 마커로 간암 세포주에서 10종의 간암 고발현 유전자와 4종의 간암 저발현 유전자가 제공되며, 상기 종양 마커 유전자들은 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량하여 간암을 비롯한 다양한 암환자들의 종양의 악성화를 효과적으로 진단하는데 사용될 수 있다.As described above, the present invention provides 10 hepatocarcinoma high expression genes and 4 hepatocarcinoma low expression genes in liver cancer cell lines as markers useful for diagnosing liver cancer, and the tumor marker genes are rapidly and sensitively quantified in patient tissues. Therefore, it can be used to effectively diagnose tumor malignancy of various cancer patients including liver cancer.

도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,1 is a frequency analysis of gene discovery,

도 2는 각종 시료에서 간암 고발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적(competitive) RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다. Figure 2 shows the results of the expression of the liver cancer high expression gene in various samples using a competitive (RT) PCR method.

도 3은 각종 시료에서 간암 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 결과를 나타낸 것이다. Figure 3 shows the results of the expression of liver cancer low expression genes in various samples using a competitive RT-PCR method.

도 4는 간암 임상시료에서 간암 고발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법으로 확인한 것이다. Figure 4 confirms the expression level of liver cancer high expression gene in liver cancer clinical sample by competitive RT-PCR method.

도 5는 간암 임상시료에서 간암 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 RT-PCR 방법을 사용하여 수행한 것이다. Figure 5 is the expression of liver cancer low expression gene in liver cancer clinical sample was performed using a competitive RT-PCR method.

<110> Korea Research Institutes of Bioscience and Biotechnology <120> DETECTION KIT FOR LIVER CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF HEPATIC CANCER-RELATED GENES <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligomer <400> 1 agcaucgagu cggccuuguu ggcccuacug g 31 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dT primer <400> 2 gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-specific primer <400> 3 agcatcgagt cggccttgtt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-specific primer <400> 4 gcggctgaag acggcctatg t 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying B2M <400> 5 ctcgctccgt ggccttag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying B2M <400> 6 caaatgcggc atcttcaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying K-alpha-1 <400> 7 ggcttcaagg ttggcatc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying K-alpha-1 <400> 8 cctctccttc ttcctcacc 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying LDHA <400> 9 atggcaactc taaaggatca gc 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying LDHA <400> 10 gcaacttgca gttcgggc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying FTL <400> 11 atgagctccc agattcgtca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying FTL <400> 12 ccaggaagtc acagagatgg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying ANXA2 <400> 13 atgtctactg ttcacgaaat cc 22 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying ANXA2 <400> 14 gctcctggtt ggttctgg 18 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL4 <400> 15 gagctggcaa aggcaaa 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL4 <400> 16 tccggcgcat ggtcttt 17 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying ENO1 <400> 17 gacttggctg gcaactctg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying ENO1 <400> 18 ggtcatcggg agacttgaa 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL9 <400> 19 atgaagacta ttctcagcaa tc 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL9 <400> 20 tgaacaagca acacctggtc 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GNB2L1 <400> 21 aaccacattg gccacaca 18 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GNB2L1 <400> 22 tgccaatggt cacctgc 17 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL10 <400> 23 atgggccgcc gccccgcc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL10 <400> 24 tgagtgcagg gcccgcca 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL13A <400> 25 atggcggagg tgcaggtc 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL13A <400> 26 gaccaggagt ccgtgggt 18 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying AMBP <400> 27 agtggtacaa cctggccatc 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying AMBP <400> 28 acagccctcc ggactctc 18 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying SERPINC1 <400> 29 atgtattcca atgtgatagg aa 22 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying SERPINC1 <400> 30 tcagttgctg gagggtgtc 19 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GC <400> 31 atgaagaggg tcctggtact ac 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GC <400> 32 tcatttgtgg gttccacgta 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying A1BG <400> 33 atgtccatgc tcgtggtctt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying A1BG <400> 34 tcaggcacct ccagaaactc 20<110> Korea Research Institutes of Bioscience and Biotechnology <120> DETECTION KIT FOR LIVER CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF HEPATIC CANCER-RELATED GENES <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligomer <400> 1 agcaucgagu cggccuuguu ggcccuacug g 31 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dT primer <400> 2 gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 5'-specific primer <400> 3 agcatcgagt cggccttgtt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-specific primer <400> 4 gcggctgaag acggcctatg t 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying B2M <400> 5 ctcgctccgt ggccttag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying B2M <400> 6 caaatgcggc atcttcaa 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying K-alpha-1 <400> 7 ggcttcaagg ttggcatc 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying K-alpha-1 <400> 8 cctctccttc ttcctcacc 19 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying LDHA <400> 9 atggcaactc taaaggatca gc 22 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying LDHA <400> 10 gcaacttgca gttcgggc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying FTL <400> 11 atgagctccc agattcgtca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying FTL <400> 12 ccaggaagtc acagagatgg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying ANXA2 <400> 13 atgtctactg ttcacgaaat cc 22 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying ANXA2 <400> 14 gctcctggtt ggttctgg 18 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL4 <400> 15 gagctggcaa aggcaaa 17 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL4 <400> 16 tccggcgcat ggtcttt 17 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying ENO1 <400> 17 gacttggctg gcaactctg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying ENO1 <400> 18 ggtcatcggg agacttgaa 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL9 <400> 19 atgaagacta ttctcagcaa tc 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL9 <400> 20 tgaacaagca acacctggtc 20 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GNB2L1 <400> 21 aaccacattg gccacaca 18 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GNB2L1 <400> 22 tgccaatggt cacctgc 17 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL10 <400> 23 atgggccgcc gccccgcc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL10 <400> 24 tgagtgcagg gcccgcca 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying RPL13A <400> 25 atggcggagg tgcaggtc 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying RPL13A <400> 26 gaccaggagt ccgtgggt 18 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying AMBP <400> 27 agtggtacaa cctggccatc 20 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying AMBP <400> 28 acagccctcc ggactctc 18 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying SERPINC1 <400> 29 atgtattcca atgtgatagg aa 22 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying SERPINC1 <400> 30 tcagttgctg gagggtgtc 19 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GC <400> 31 atgaagaggg tcctggtact ac 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GC <400> 32 tcatttgtgg gttccacgta 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying A1BG <400> 33 atgtccatgc tcgtggtctt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying A1BG <400> 34 tcaggcacct ccagaaactc 20

Claims (9)

(a) 시험 간암 조직에서 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,(a) measuring the expression amount or protein amount of one or more liver cancer high expression genes selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A in test liver cancer tissue Steps, (b) 정상 간 조직에서 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,(b) measuring the expression level or protein amount of one or more liver cancer high expression genes selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A in normal liver tissue; Steps, (c) 시험 간암 조직에서 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계, (c) measuring the expression level or protein amount of one or more liver cancer low expression genes selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC and A1BG in test liver cancer tissue, (d) 정상 간 조직에서 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 간암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계, 및(d) measuring the expression amount or protein amount of one or more liver cancer low expression genes selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC and A1BG in normal liver tissue, and (e) 상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 간암 여부를 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 진단방법. (e) comparing the measured value obtained by (a) with the measured value obtained by (b) and comparing the measured value obtained by (c) with the measured value obtained by (d) to determine whether liver cancer Liver cancer diagnostic method comprising the step of. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자들의 발현량을 경쟁적 RT-PCR을 통하여 측정하는 것을 특징으로 하는 진단방법.The method of claim 1, wherein the expression level of the genes is measured by competitive RT-PCR. 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 간암을 진단하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.One or more genes selected from the group consisting of liver cancer specific high expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A, and AMBP, a liver cancer specific low expression gene Liver cancer diagnostic kit, characterized in that for diagnosing liver cancer by measuring the expression level of at least one gene selected from the group consisting of, SERPINC1, GC and A1BG. 제 3 항에 있어서, 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머와, 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.4. The sense and antisense of at least one gene according to claim 3, which is selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A, which are liver cancer specific high expression genes. A liver cancer diagnostic kit comprising a primer and sense and antisense primers of at least one gene selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG, which are liver cancer specific low expression genes. 제 4 항에 있어서, 상기 프라이머가 15 bp 이상의 DNA인 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트. The liver cancer diagnostic kit according to claim 4, wherein the primer is DNA of 15 bp or more. 제 3 항에 있어서, 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.The probe of claim 3, wherein the probe is complementary to at least one gene selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10, and RPL13A, which are liver cancer specific high expression genes. And liver cancer specific low expression genes AMBP, SERPINC1, GC and A1BG liver cancer diagnostic kit comprising a probe complementary to at least one gene selected from the group consisting of. 제 6 항에 있어서, 상기 프로브가 200 ∼ 1000 bp인 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트.The liver cancer diagnostic kit according to claim 6, wherein the probe is 200 to 1000 bp. 제 3 항에 있어서, 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단킷트. 4. The method according to claim 3, which is encoded by at least one gene selected from the group consisting of K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A, which are liver cancer specific high expression genes. A liver cancer diagnostic kit comprising an antibody recognizing a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of an antibody recognizing a protein and liver cancer specific low expression genes AMBP, SERPINC1, GC and A1BG. 간암 특이적 고발현 유전자인 K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 및 RPL13A로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질과 간암 특이적 저발현 유전자인 AMBP, SERPINC1, GC 및 A1BG로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 간암 억제제의 스크리닝 방법. Liver cancer specific low protein and protein encoded by one or more genes selected from the group consisting of liver cancer specific high expression genes K-ALPHA-1, LDHA, FTL, ANXA2, RPL4, ENO1, RPL9, GNB2L1, RPL10 and RPL13A A test compound is bound to a protein encoded by at least one gene selected from the group consisting of AMBP, SERPINC1, GC, and A1BG, which are expression genes, and characterized in that the test compound promotes or inhibits the action of the protein. Screening method of liver cancer inhibitor.
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