KR20050071341A

KR20050071341A - 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀의 정제방법

Info

Publication number: KR20050071341A
Application number: KR1020040106884A
Authority: KR
Inventors: 표상현; 김문숙; 조진숙; 송봉규; 최호준
Original assignee: 주식회사 삼양제넥스
Priority date: 2003-12-31
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2005-07-07
Also published as: KR100624104B1

Abstract

본 발명은 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀을 정제하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 파클리탁셀 함유물질에 유기용매를 가하여 추출하고 추출액을 농축하는 단계, 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 유기용매층을 분리하고, 이를 감압농축하는 단계, 순상 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 분리하는 단계, 용출물을 아세톤 또는 디클로로메탄에 용해시키고, 펜탄 또는 헥산을 가하여 침전물을 형성하는 단계 또는 용출물을 메탄올에 용해시키고 물을 가하여 침전물을 형성하는 단계 및 침전물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 파클리탁셀 정제방법을 제공한다. 본 발명의 방법으로 파클리탁셀 함유물질로부터 99.5 % 이상의 고순도의 파클리탁셀을 고수율로 쉽게 분리할 수 있어, 파클리탁셀의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀의 정제방법{Method for separation and purification of paclitaxel from paclitaxel-containing materials}

본 발명은 파클리탁셀(paclitaxel) 함유물질로부터 파클리탁셀의 정제방법에 관한 것이다.

파클리탁셀은 1960년대 미국 국립 암연구소의 항암활성 물질에 대한 대규모 스크닝 프로그램을 통하여 검색되었으며, 난소암, 유방암 등에 가장 중요한 항암물질로 알려져 있다. 파클리탁셀은 1992년 FDA 의 승인을 받으면서 널리 이용되고 있는 항암제이다.

파클리탁셀은 파클리탁셀의 함량이 0.02%로 매우 낮은 주목 나무의 수피로부터 분리 및 정제되므로, 정제과정에 고비용이 요구되며 자원과 생태계 파괴의 문제점을 야기한다. 상기한 문제점을 극복하기 위한 방안으로, 주목의 잎으로부터 파클리텍셀을 반합성하는 방법과 주목세포배양법을 이용한 대량 생산 방법이 개발되어 있다. 파클리탁셀의 정제방법에 관한 공지 기술은 하기와 같다.

국제특허 공개공보 제2000/40573호는 파클리탁셀 함유물질에서 액체/액체 추출공정으로부터 얻은 낮은 순도의 농축물을 실리카 컬럼을 통해 1차 정제한 후 아세톤/물 용액을 이용하여 침전시키고, 실리카 컬럼과 결정화를 반복함으로써 고순도의 파클리탁셀을 얻는 공정이 제시하고 있다. 그러나 고순도의 파클리탁셀을 얻기 위해서는 총 3회의 실리카 크로마토그래피의 수행과 2번의 결정화 단계를 반복적으로 수행하여야 하며, 이에 따라 많은 용매와 시간이 소요될 뿐만 아니라, 아세톤/물 용액을 이용한 침전 방법이 선행되어야 했으며 회수율이 49-73%로 현저히 떨어지는 단점이 있다.

국제특허 공개공보 제2000/078741호는 택산(taxanes)의 천연 원료를 유기용매로 추출하고, 염기 또는 산으로 침전물을 형성시키고, 이를 아세톤으로 녹여 핵산에 의한 퍼칼라라이징(percolorizing)으로 수지 및 색소를 제거하고, 염기 또는 산으로 침전물을 형성하고, 1회 이상의 크로마토그래피 실시 및 1회 이상의 아세톤과 핵산에 의한 결정화 단계를 포함하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 일반적으로 파클리탁셀은 산 또는 염기 조건에서 10-디아세텔파클리탁셀 및 바카틴 III으로 분해되는 것으로 알려져 있어, 파클리탁셀을 고수율로 정제하기 어려울 뿐만 아니라, 복잡한 과정으로 인해 다수의 시간이 소요되는 문제가 있다.

미국특허 제 5,900,367호는, 유기용매 추출물에 합성 흡착제를 처리하여 타르성분을 제거하고, 헥산에 침전시키고, 침전물을 메탄올과 정제수를 이용하여 분별침전시키고, 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 파클리탁셀을 얻는 방법을 제시하고 있다. 상기 방법은 디클로로메탄, 메탄올 및 헥산 3종류의 추출용매만을 사용하여 적은 용매량으로 고순도로 추출정제 할 수 있다는 장점은 있으나, 메탄올과 정제수를 이용한 분별침전의 순도와 수율을 높이기 위해서는 그 침전여액을 재분별침전을 실시하여야 하는 문제점 등이 있다.

본 발명의 목적은 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀을 효과적으로 추출 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 파클리탁셀 정제과정을 단순화하면서도 고순도의 파클리탁셀을 용이하게 정제할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀을 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 '파클리탁셀 함유물질'은 택서스 속(Taus genus) 식물체 또는 상기 식물체에서 유래된 세포를 이용하여 세포배양한 조직, 세포 또는 배지를 포함하는 세포배양물을 의미한다. 상기 택서스속 식물체로는 택서스 브레비폴리아(Taxus brevifolia), 택서스 카나덴시스(Taxus canadensis), 택서스 쿠스피다타(Taxus cuspidata), 택서스 바카타(Taxus baccata), 택서스 글로보사(Taxus globosa), 택서스 플로리다나(Taxus floridana), 택서스 월리치아나(Taxus wallichiana), 택서스 메디아(Taxus media), 택서스 치넨시스(Taxus chinensis) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 파클리탁셀 정제방법은

(a) 파클리탁셀 함유물질에 유기용매를 가하여 추출하고 추출액을 농축하는 단계;

(b) 상기 (a)의 농축물에 유기용매를 가하여 유기용매층을 분리하고, 이를 감압농축하는 단계;

(c) 상기 (b)의 감압농축물을 순상 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 분리하는 단계;

(d) 상기 (c)의 용출물을 아세톤 또는 디클로로메탄에 용해시키고, 펜탄 또는 헥산을 가하여 침전물을 형성하는 단계;

(e) 상기 (d)의 침전물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 파클리탁셀 정제방법은

(d') 상기 (c)의 용출물을 메탄올에 용해시키고, 물을 가하여 침전물을 형성하는 단계;

(e) 상기 (d')의 침전물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 디클로로메탄로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하기로는 상기 유기용매는 메탄올이다. 유기용매는, 파클리탁셀 함유물질에 20 내지 200 %(v/w)로, 바람직하게는 40 내지 140%(v/w)을 가할 수 있으며, 상온에서 30분간 교반하여 여과하는 과정을 2회 이상 반복하여 파클리탁셀 및 탁산 유도체를 추출한다. 추출액은 감압농축 등의 방법으로 농축할 수 있다.

(b) 단계는, 상기 (a)의 추출액 또는 이의 농축물에 유기용매를 10 % 내지 50 %(v/v), 바람직하게는 20 % 내지 30 %(v/v)로 가하여 교반하고, 분배하여 유기용매층을 분리하는 단계이다. 유기용매층 분리는 2회 이상 반복실시할 수 있으며, 분리된 층은 감압농축 및 건조시킨다. (b) 단계에서 사용되는 유기용매는 물과 혼합되지 않는 유기용매이며, 예컨대 비극성 유기용매일 수 있다. 유기용매의 예로 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름(chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane) 등의 알킬할라이드, 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether) 등의 에테르, n-부탄올, n-펜탄올 등의 C₄ - C₆의 알콜류, 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone) 등이 있다. (b) 단계를 통하여 극성 물질을 일부 제거한다.

(c) 단계는, (b) 단계에서 건조한 건조물을 유기용매에 현탁한 후 이를 순상 컬럼 크로마토그래피를 실시하는 단계이다. 컬럼의 충진제로는 통상적인 실라카겔 예를 들면, 실리카겔 40(63 - 200 ㎛), 실리카겔 60 (63 - 200 ㎛) 또는 실리카겔 60F254(200 - 500 ㎛)을 사용할 수 있다. 상기 건조물을 현탁시키는 유기용매는 디클로로메탄, 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유기용매일 수 있다. 순상 컬럼 크로마토그래피는 아이소크래틱(isocartic) 용출 또는 단계적 농도구배(step gradient) 용출을 통하여 분획을 용출시킬 수 있다. 아이소크래틱 용출은, 전개용매로 메탄올 및 디클로로메탄이 0.5 내지 10 : 99.5 내지 90.0 부피비로 혼합된 용매를 사용할 수 있다. 단계적 농도구배 용출은 전개용매로는 디클로로메탄 또는 메탄올 및 디클로로메탄 0.1 내지 5 : 99.9 내지 95 부피비로 혼합된 용매를 사용할 수 있으며, 용출용매로는 0.5 내지 100 %(v/v)의 메탄올 및 잔량의 디클로로메탄을 포함하는 용매를 사용할 수 있다.

상기 '아이소크래틱 방법'은 동일 조성의 용매를 이용하여 용출시키는 방법이고, '단계적 농도구배 방법'은 용매의 조성(농도)를 단계적으로 변화시키면서 용출하는 방법을 의미한다.

상기 (c) 단계에서 순상 크로마토그래피를 이용하여 용출시킨 분획물은 감압농축 및 건조 단계를 더욱 실시할 수 있다. 상기 순상 크로마토그래피 단계는 기존의 합성 흡착제 처리 및 헥산에 의한 침전 공정을 대체하는 공정으로, 기존 정제공정에 비해 공정을 단순화하면서도 파클리탁셀 수율을 현저히 향상시킨다. 또한 순상 크로마토그래피를 통하여 회수된 분획은 이후 단계인 침전 단계를 통하여 고수율의 침전물로 용이하게 회수할 수 있다.

(d) 단계는 (c) 단계의 건조물에 아세톤 또는 디클로로메탄을 가하여 용해시키고, 펜탄 또는 헥산을 가하여 침전물을 형성시키는 단계이다. 아세톤 또는 디클로로메탄 1 ml당 5 내지 100 mg의 건조물을 용해시킬 수 있 수 있으며, 펜탄 또는 헥산은 아세톤 또는 디클로로메탄에 대하여 1: 1 내지 20 부피비로, 바람직하기로는 1: 5 내지 10 부피비로 혼합할 수 있다. 펜탄 또는 헥산을 가한 후 침전 시간 및 온도는 특별히 한정되지 않으나, 침전시간은 1일 내지 5일, 바람직하게는 1일 내지 2일일 수 있으며, 온도는 35℃이하, 바람직하게는 0℃ 내지 15℃일 수 있다. 침전물은 통상의 방법으로 여과하여 수득한다.

(d') 단계는 (c) 단계의 건조물에 메탄올을 가하여 용해시키고, 물을 가하여 침전물을 형성시키는 단계이다. 메탄올 1 ml당 5 내지 100 mg의 건조물을 용해시킬 수 있 수 있으며, 물은 메탄올에 대하여 1: 1 내지 20 부피비로, 바람직하기로는 1: 5 내지 10 부피비로 혼합할 수 있다. 물을 가한 후 침전 시간 및 온도는 특별히 한정되지 않으나, 침전시간은 1일 내지 5일, 바람직하게는 2일 내지 3일일 수 있으며, 온도는 35℃이하, 바람직하게는 0℃ 내지 15℃일 수 있다. 침전물은 통상의 방법으로 여과하여 수득한다.

(e) 단계는 (d) 또는 (d')단계의 침전물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계이다. 컬럼 충진제는 소수성 수지, 예컨대 비극성 불순물을 제거하는 ODS(Octadecylsilylated, C₁₈), C₈ 또는 C₄일 수 있으며, 역상 고속액체 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 전개용매로는 55 내지 75 %(v/v)의 메탄올 및 잔량의 정제수를 사용한다. 역상 고속액체 크로마토그래피를 통하여 용출된 분획은 감압농축 건조후 극성 불순물을 제거하는 실리카를 충진한 순상 고속액체 크로마토그래피로 더욱 정제한다. 2차 크로마토그래피는 전개용매 95 내지 99 %(v/v) 디클로로메탄 및 잔량의 메탄올 혼합용액을 사용하여 실시되며, 최종적으로 99.5% 고순도의 파클리탁셀을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 방법으로, 장시간의 침전 과정 없이 순도 99.5% 이상의 파클리택셀을 65.4% 이상의 수율, 바람직하게는 80.7% 이상의 수율로 얻을 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 단계별로 수득할 수 있는 시료내 파클리탁셀의 순도 및 회수율 범위를 표 1에 나타내었다.

	침전물의 순도(%)	회수율(%)
출발 파클리탁셀 함유물질	0.01-0.05	100
(a) 단계: 메탄올 추출	0.1-0.5	93-97
(b) 단계: 액액 추출(liquid-liquid extraction)	3.0-9.0	94-96
(c) 단계: 순상 칼럼 크로마토그래피	20-35	95-97
(d) 단계: 아세톤/펜탄 침전	65-85	92-97
(d') 단계: 메탄올/물 침전	52-82	89-92
(e) 단계: 역상 고속액체크로마토그래피	90-98	93-96
(e) 단계: 순상 고속 액체크로마토그래피	99.5-99.9	92-96
최종	99.5-99.9	65.4-80.7

상기 파클리탁셀의 순도 및 회수율은 하기 표 2의 조건에서 HPLC를 실시하여 정량분석한 것이다.

기기	Hewlett Packard 1090 HPLC
컬럼	Curosil PFP 4.6 - 250
컬럼 온도	35 ℃
이동상	아세토나이트릴:물(35-65% 농도구배)
유속	1ml/분
주입량	10 ul
검출기	UV(227 nm)

도 1은 각 단계별 파크리탁셀의 순도 및 회수율을 확인한 HPLC 차트이다. (A)는 (b)단계의 유기용매 추출후 HPLC 분석결과이고, (B)는 (c)단계의 순상 크로마토그래피 후 HPLC 분석결과이고, (C)는 (d) 단계의 아세톤/펜탄 침전 후 HPLC 분석결과이고, (D)는 (e) 단계의 고속액체 크로마토그래피 후 HPLC 분석결과이다. 도 2a는 (d') 단계의 메탄올/증류수 침전후 HPLC 분석결과이고, 도 2b는 상기 도 2a의 (e) 단계 이후의 파크리탁셀의 순도 및 회수율을 확인한 HPLC 차트이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.

실시예 1: 식물 세포배양액의 유기용매 추출 및 액액 추출(liquid-liquid extraction)

택서스 치넨시스에서 유래된 식물세포(SYG-1, KCTC-0232BP)를 배양하여 얻은 식물 세포 100 kg에 메탄올 110 L를 가하고, 상온에서 30분간 교반한 후 여과하였다. 상기 추출과정을 4회 반복하여 메탄올 추출액을 수득하였고, 감압농축하여 약 20L의 농축물을 수득하였다. 상기 농축물에 디클로로메탄 5400 ml을 가하여 교반하고, 분배하여 디클로로메탄층을 분리한 후 감압농축 및 건조하여 순도 6.9%의 건조물 737 g을 수득하였다.

실시예 2 : 순상 컬럼 크로마토그래피(이소크래틱 용출)

실시예 1의 건조물 15 g은 200 ml 디클로로메탄으로 녹이고, 실리카겔 60N(Timely사, Japan)이 충진된 직경 19 mm x 길이 900 mm 스테인레스 스틸로 만든 칼럼에 용해물을 주입하였다. 전개용매로 1 %, 1.5 % 및 2 %(v/v)의 메탄올/디클로로메탄을 각각 사용하였으며, 용출분획을 회수하였다. 회수한 용출분획내 파크릴탁셀의 순도 및 회수율은 하기 표 3과 같다.

실험번호	% (v/v), 메탄올/디클로로메탄	순도(%)	회수율(%)
A	1.0/99.0	32.6	84.0
B	1.5/98.5	31.8	90.5
C	2.0/98.0	30.7	97.5

실시예 3 : 순상 컬럼 크로마토그래피(단계적 농도구배 용출)

실시예 1의 건고물 15 g은 200 ml의 디클로로메탄으로 녹이고, 실리카겔 60N(Timely사, Japan)이 충진된 직경 19mm x 900mm 스테인레스 스틸로 만든 칼럼에 주입하였다. 전개용매는 디클로로메탄, 메탄올/디클로로메탄(0.5 : 99.5 부피비) 혼합용매 및 메탄올/디클로로메탄(1 : 99 부피비) 혼합용매 각각을 사용하였고, 용출용매로는 메탄올 및 디클로로메탄이 2:98 부피비로 포함된 용매를 사용하였다. 용출분획을 회수하였으며, 분획내 파크릴탁셀의 순도 및 회수율을 하기 표 4에 나타낸다.

실험번호	전개용매, 메탄올 : 디클로로메탄 %(v/v)	순도(%)	회수율(%)
D	0 : 100	22.7	96.9
E	0.5 : 99.5	24.2	96.5
F	1.0 : 99.0	25.5	97.3

실시예 4: 순상 컬럼 크로마토그래피(단계적 농도구배 용출)

실시예 3의 단계를, 대량 공정으로 실시하였다.

실시예 1의 건조물 510 g을 5600 ml의 디클로로메탄으로 녹이고, 1 %(v/v)의 메탄올 및 잔량의 디클로로메탄을 포함하는 전개용매로 채워진 실리카겔 60N(Timely사, Japan)이 충진된 컬럼(직경 100 mm x 길이 900 mm, 스테인레스 스틸 재질)에 주입하였다. 이후 용출용매로 2 %(v/v)의 메탄올 및 98 %(v/v)의 디클로로메탄을 포함하는 용매를 가하여 용출분획을 수득하였다. 상기 분획은 감압농축하여 99.9 g의 건조물로 수득하였다. 상기 과정으로 정제된 파클리탁셀의 순도는 32.2 %이고, 수율은 97.0 %이다.

실시예 5: 아세톤/펜탄 침전

실시예 4의 건조물 40 mg에 아세톤 2 ml을 가하여 용해시킨 후, 펜탄을 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18 mL을 각각 가한 후 4 ℃에서 48시간 방치하였다. 이후 여과하여 침전물을 회수하였으며, 침전물내 파클리탁셀의 순도 및 회수율을 확인하여 하기 표 5에 나타내었다.

실험번호	출발물질		아세톤, ml	펜탄, ml	침전물
실험번호	순도 (%)	양, mg	아세톤, ml	펜탄, ml	순도 (%)	회수율 (%)
G	32.2	40	2	6	85.1	82.2
H	32.2	40	2	8	81.4	83.9
I	32.2	40	2	10	79.8	95.4
J	32.2	40	2	12	77.4	96.5
K	32.2	40	2	14	77.1	96.6
L	32.2	40	2	16	76.5	97.6
M	32.2	40	2	18	70.4	97.6

실시예 6 : 아세톤/펜탄 침전

하기 표 6의 조건으로 침전 과정을 실시하였으며, 실험방법은 실시예 5과 동일하게 하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타낸다.

실험번호	출발물질		아세톤, ml	펜탄, ml	침전물
실험번호	순도 (%)	양, mg	아세톤, ml	펜탄, ml	순도 (%)	회수율(%)
N	32.2	10	2	12	74.7	83.7
O	32.2	20	2	12	79.5	93.4
P	32.2	40	2	12	77.4	96.5
Q	32.2	80	2	12	54.5	98.9

실시예 7: 아세톤/펜탄 침전

순상 크로마토그래피에서 수득한 서로 다른 순도를 갖는 분획의 건조물에 대하여, 하기 표 7의 조건으로, 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 그 결과는 하기 표 7과 같다.

실험번호	출발물질		아세톤, ml	펜탄, ml	침전물
실험번호	순도 (%)	양, mg	아세톤, ml	펜탄, ml	순도(%)	회수율 (%)
R	10.2	40	2	12	24.4	85.4
S	15.4	40	2	12	50.2	90.3
T	21.7	40	2	12	62.4	96.5
U	30.1	40	2	12	74.2	98.8
V	50.2	40	2	12	73.8	98.5

실시예 8 : 아세톤/헥산 침전

순상 크로마토그래피에서 수득한 서로 다른 순도를 갖는 분획의 건조물에 대하여, 하기 표 8의 조건으로, 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 수행하였고, 다만, 펜탄 대신 헥산을 사용하였다. 그 결과는 하기 표 8과 같다.

실험번호	출발 물질		아세톤, ml	헥산, ml	침전물
실험번호	순도 (%)	양 (mg)	아세톤, ml	헥산, ml	순도 (%)	회수율 (%)
W	30.0	20	2	12	72.1	95.4
X	45.8	20	2	12	75.4	96.2

실시예 9 : 디클로메탄/헥산 침전

순상 크로마토그래피에서 수득한 서로 다른 순도를 갖는 분획의 건조물에 대하여, 하기 표 9의 조건으로, 실시예 5와 동일한 방법으로 실험을 수행하였고, 다만, 아세톤 대신 디클로로메탄을, 펜탄 대신 헥산을 사용하였다. 그 결과는 하기 표 9와 같다.

실험번호	출발 물질		디클로메탄, ml	헥산, ml	침전물
실험번호	순도 (%)	양 (mg)	디클로메탄, ml	헥산, ml	순도 (%)	회수율 (%)
Y	30.0	20	2	20	52.7	93.4
Z	48.3	20	2	20	72.4	91.6

실시예 10: 메탄올과 정제수를 이용한 침전

순상 크로마토그래피에서 수득한 서로 다른 순도를 갖는 분획의 건조물에 대해하여 하기 표 10의 조건으로 메탄올에 시료를 용해하고 정제수를 가한 후 4 ℃에서 3일간 방치하였다. 침전물은 여과하여 수득하였고, 침점물에 함유된 파클리탁셀의 함량 및 순도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 10와 같다.

실험번호	출발물질		메탄올, ml	정제수, ml	침전물
실험번호	순도 (%)	양, mg	메탄올, ml	정제수, ml	순도 (%)	회수율(%)
1	32.2	1.0	100	250	52.2	90.5
2	34.4	0.2	7	4.7	70.7	89.8
3	49.1	0.2	10	6.7	81.1	91.9

실시예 11 : 고속 액체 크로마토그래피

실시예 5의 실험번호 J의 침전물의 건조물을 70% 메탄올에 용해시키고, ODS(C₁₈)를 충진한 역상 고속액체크로마토그래피에 주입하였다. 전개용매로 65 %(v/v)의 메탄올 및 35 %(v/v)의 정제수를 포함하는 용매를 사용하였고, 이소크래틱 용출로 분획물을 수득하였다. 분획물은 순도 95%의 파클리탁셀을 포함하며, 수율 95%이다.

상기 분획물은 실리카가 충진된 고속액체 크로마토그래피에 주입하고, 98 %(v/v)의 디클로로메탄 및 2 %(v/v)의 메탄올을 포함하는 전개용매를 흘려주어, 용출되는 분획을 수득하였다. 상기 분획은 99.5% 고순도의 파클리탁셀을 포함하며, 이의 수율은 95%이다.

또한 실시예 10의 실험번호 1의 침전물에 대해서도 상기와 같은 동일한 방법으로 정제하여 순도 99.5%의 파클리탁셀 포함 분획을 얻었으며, 수율은 94%였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 파클리탁셀의 정제방법은, 기존의 합성 흡착제 처리 및 헥산에 의한 침전 공정을 순상 크로마토그래피로 대체함으로써 공정 단계를 단순화하고 동시에 수율을 현저히 향상시켰으며, 순상 크로마토그래피를 통하여 회수된 분획은 이후 단계인 침전 단계를 통하여 고수율의 침전물로 용이하게 회수할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 파클리탁셀 함유물질로부터 파클리탁셀을 고순도로 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 회수율 역시 현저히 향상시키므로, 파클리탁셀의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 파클리탁셀의 정제 단계별 파크리탁셀의 순도 및 회수율을 확인한 HPLC 차트이다.

도 2a는 (d') 단계의 메탄올/증류수 침전후 HPLC 분석한 차트이고, 도 2b는 상기 도 2a의 (e) 단계 이후의 파크리탁셀의 순도 및 회수율을 확인한 HPLC 차트이다.

Claims

(a) 택서스 속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 유기용매를 가하여 추출하고 추출액을 농축하는 단계;

(b) 상기 (a)의 농축물에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 유기용매층을 분리하고, 이를 감압농축하는 단계;

(c) 상기 (b)의 감압농축물을 순상 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 분리하는 단계;

(d) 상기 (c)의 용출물을 아세톤 또는 디클로로메탄에 용해시키고, 펜탄 또는 헥산을 가하여 침전물을 형성하는 단계;

(e) 상기 (d)의 침전물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계;

를 포함하는 파클리탁셀의 정제방법.
(a) 택서스 속(Taxus genus) 식물체, 이의 세포 또는 이의 세포 배양액에 유기용매를 가하여 추출하고 추출액을 농축하는 단계;

(b) 상기 (a)의 농축물에 물과 혼합되지 않는 유기용매를 가하여 유기용매층을 분리하고, 이를 감압농축하는 단계;

(c) 상기 (b)의 감압농축물을 순상 크로마토그래피를 실시하여 용출물을 분리하는 단계;

(d) 상기 (c)의 용출물을 메탄올에 용해시키고, 물을 가하여 침전물을 형성하는 단계;

(e) 상기 (d)의 침전물을 고속액체 크로마토그래피로 정제하는 단계;

를 포함하는 파클리탁셀의 정제방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (a) 단계의 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 디클로로메탄로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택되는 것인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기용매는 알킬할라이드, 에테르, 탄소수 4 내지 6의 알콜류, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및 메틸 에틸 케톤(methyl ethyl ketone)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 (b) 단계의 유기용매는 디클로로메탄, 카본 테트라클로라이드(carbon tetrachloride), 클로로포름(chloroform), 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane), 디-에틸 에테르(di-ethyl ether), 메틸-t-부틸 에테르(methyl-t-butyl ether), 디-이소-프로필 에테르(di-iso-propyl ether), n-부탄올 및 n-펜탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (c)단계에서 감압농축물은 디클로로메탄, 메탄올, 벤젠, 아세톤, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이상의 유기용매에 현탁시켜, 순상 크로마토그래피를 실시하는 것인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (c)단계의 순상 크로마토그래피는 0.5 내지 10 %(v/v)의 메탄올 및 99.5 내지 90 %(v/v)의 디클로로메탄으로 이루어진 전개용매로 실시되는 것인 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 (c)단계의 순상 크로마토그래피는 디클로로메탄 또는 0.1 내지 5 %(v/v)의 메탄올 및 99.9 내지 95 %(v/v)의 디클로로메탄으로 이루어진 전개용매와, 0.5 내지 100%(v/v)의 메탄올 및 잔량의 디클로로메탄으로 이루어지는 용출용매로 실시되는 것인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 (d)단계에서 용출물은 아세톤 또는 디클로로메탄 1 ml당 5 내지 100 mg으로 용해시키고, 아세톤 또는 디클로로메탄에 대하여 펜탄 또는 헥산을 1 : 1 내지 20 부피비로 가하는 것을 포함하는 방법.
제 2항에 있어서, 상기 (d)단계에서 용출물은 메탄올 1 ml당 5 내지 100 mg으로 용해시키고, 메탄올에 대하여 물을 1 : 1 내지 20 부피비로 가하는 것을 포함하는 방법.