KR20050046916A - 닭 퍼옥시레독신 1 단백질 및 그를 코딩하는 핵산분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 닭 유래의 신규한 퍼옥시레독신 1 (Prx1) 단백질, 그를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터 및 형질전환체에 관한 것으로서, 본 발명의 Prx1 단백질은 우수한 항산화능을 갖기 때문에, 생체분자들이 활성산소에 의해 손상을 주는 것을 억제할 수 있으며, 또한, 본 발명의 Prx1 단백질은 Prx1은 세포성 면역능을 증가시키거나, 활성산소, 항암치료 및 염증 반응에 의해 발생하는 산화성 스트레스 (oxidative stress)로부터 세포를 방어하는데 이용될 수 있다

Description

닭 퍼옥시레독신 1 단백질 및 그를 코딩하는 핵산분자{Peroxiredoxin 1 of Chicken and Nucleic Acid Molecules Encoding the Same}

본 발명은 닭 유래의 퍼옥시레독신 1 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 닭 유래의 신규한 퍼옥시레독신 1 단백질, 그를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터 및 형질전환체에 관한 것이다.

활성산소 (reactive oxygen species)는 정상적인 대사과정뿐만 아니라 다양한 자극 (예: 약, 독 및 방사선 조사) 등에 의해서 생성되어 여러 생명 기본 물질 (단백질, 핵산 등)에 손상을 준다 (Halliwell et al., Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease; an overview. Meth. Enzymol. 186:1-85(1990); Scandalios, Oxidative stress and defence mechanisms in plants. Free Radicals Biol. Med. 23:471-472(1997)).

활성산소에 의한 손상을 방어하기 위해 모든 호기성 생물에는 수퍼옥사이드 디스뮤타아제 (Superoxide dismutase), 카탈라아제 (catalase), 글루타치온 의존성 퍼옥시다아제 (glutathione-dependent peroxidase)와 같은 항산화성 효소가 존재한다 (Rao et al., Influence of salicylic acid on H₂O₂ production, oxidative stress, and H₂O₂-metabolizing enzymes. Salicylic acid-mediated oxidative damage requires H₂O₂. Plant Physiol. 115(1):137-49(1997)). 또한 대부분의 진핵 생물의 세포에는 치오레독신 (thioredoxin)을 전자 공여체로 이용하여 과산화 수소를 환원시키는 항산화 단백질이 있는데, 이들을 퍼옥시레독신 (peroxiredoxin, 이하 "Prx"라 한다)이라 한다 (Jacobson FS et al., An alkyl hydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium involved in the defense of DNA against oxidative damage. Purification and properties. J Biol Chem. 264(3):1488-96(1989)).

Prx는 2개의 보존적인 시스테인 잔기를 가지는 2-Cys-Prx과 하나의 보존적인 시스테인 잔기를 가지는 1-Cys-Prx로 나뉜다. 2-Cys-Prx는 환원 메카니즘에 따라 단일 단백질로 반응을 진행하는 그룹과 두 단백질이 관여하는 그룹으로 나뉜다 (Chae et al., Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain: alkyl hydroperoxide reductase and thiol specific antioxidant define a large family of antioxidant enzymes. Proc. Nat'l Acad.Sci. USA 91:7017-7021(1994)).

Prx1은 또한 자연적 킬러 강화 인자 (Natural Killer Enhancing Factor: NKEF)로 알려져 있어서 세포성 면역능을 증가시키며 (Sauri H et al., Recombinant natural killer enhancing factor augments natural killer cytotoxicity. J Leukoc Biol. 59(6):925-31(1996)), 세포 내에서 활성산소나 항암치료제 그리고 염증 반응에 의해 발생하는 스트레스로부터 세포를 방어하는 항산화 기능을 가진다 (Shau H et al. Endogenous natural killer enhancing factor-B increases cellular resistance to oxidative stresses. Free Radic Biol Med. 1997;22(3):497-507(1997)).

동물에서의 Prx 유전자에 대한 염기서열 및 아미노산 서열 정보는 사람 (Shau H et al., Cloning and sequence analysis of candidate human natural killer-enhancing factor genes. Immunogenetics. 40(2):129-34(1994)), 생쥐(Ishii.,T. et al., Cloning and characterization of a 23-kDa stress-induced mouse peritoneal macrophage protein J. Biol. Chem. 268(25):18633-18636(1993)) 소 (Leyens, G. et al., Cloning of bovine peroxiredoxins: gene expression in bovine tissues and amino acid sequence comparison with rat, mouse and primate peroxiredoxins. Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Biol. 136(4): 943-955(2003))과 돼지 (Schroder et al. Porcine natural-killer-enhancing factor-B: oligomerisation and identification as a calpain substrate in vitro. Biochim Biophys Acta. 1383(2):279-291(1998))에서 보고되었고, 어류에서는 잉어 (Shin DH et al., Organization of the NKEF gene and its expression in the common carp (Cyprinus carpio). Dev Comp Immunol. 25(7):597-606(2001)), 무지개 송어 (Zhang H et al., Cloning, characterization and genomic structure of the natural killer cell enhancement factor (NKEF)-like gene from homozygous clones of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Dev Comp Immunol. 25(1):25-35(2001))에서 보고되었다.

그러나, 현재까지 닭에서 Prx에 대한 유전자 염기서열이나 아미노산 서열이 보고된 바가 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 닭 유래의 퍼옥시레독신 1에 대한 연구를 수행한 결과, 닭 유래의 퍼옥시레독신 1의 유전자를 규명하고, 이를 기초로 하여 퍼옥시레독신 단백질에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 닭 유래의 항산화능을 갖는 퍼옥시레독신 1 단백질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 닭 유래의 퍼옥시레독신 1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 닭 유래의 퍼옥시레독신 1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 닭 유래의 항산화능을 갖는 퍼옥시레독신 1 (peroxiredoxin 1, 이하 "Prx1"이라 한다) 단백질을 제공한다.

닭의 퍼옥시레독신 1 단백질은 본 발명자들에 의해 최초로 발견 및 규명된 것이다.

본 명세서에서 닭 유래의 Prx1을 언급하면서 사용되는 용어 "단백질"은 닭으로부터 분리 및 정제된 단백질뿐만 아니라, Prx1을 코딩하는 유전자를 이용하여 제조된 재조합 단백질도 포함한다.

본 발명의 퍼옥시레독신 1 단백질은 다음의 특성을 갖는다: (a) 항산화능을 갖음; (b) 활성산소에 의한 DNA의 손상을 방어하는 능력을 갖음; (c) 분자량이 20-27 kDa; (d) 닭 유래; 및 (e) 닭의 난소 조직에서 고발현됨.

하기의 실시예에서 규명된 바와 같이, 본 발명의 Prx1은 닭의 다양한 조직(예: 뇌, 활액낭, 회장부, 심장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 비장, 흉선 및 정소)에서 발현되며, 특히 난소에서 발현율이 높다. 이와 같은 사실은 본 발명의 Prx1이 상기 두 조직에서 생식세포의 증식/분화 과정에서 발생하는 활성산소를 제거하는 중요한 역할을 한다는 것을 보여주는 것이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 Prx1은 서열목록 제 4 서열을 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명의 Prx1 단백질은 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)를 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 Prx1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

가장 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제 3 서열로 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. Prx1을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 Prx1 단백질을 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, p_L ^λ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 Prx1의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 Prx1 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 Prx1 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

본 발명의 Prx1 단백질은 우수한 항산화능을 갖기 때문에, 생체분자들이 활성산소에 의해 손상을 주는 것을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 Prx1 단백질은 Prx1은 세포성 면역능을 증가시키거나, 활성산소, 항암치료 및 염증 반응에 의해 발생하는 산화성 스트레스 (oxidative stress)로부터 세포를 방어하는데 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 닭 Prx1의 cDNA 염기 서열 확보 및 아미노산 서열 분석

한국 재래 닭의 정소 cDNA 라이브러리를 작성하기 위해, 성성숙이 완료된 재래닭으로부터 정소를 적출하였다. 적출된 정소를 1회 세척하여 혈액 성분을 제거하고 50 ㎖ 튜브로 옮긴 다음, 총 RNA를 추출하였다 (Chomczynski P, Sacchi N. Anal Biochem.162(1):156-159.(1987)). 총 RNA로부터 올리고-(dT) 컬럼 (Qiagen Inc., USA0를 이용하여 mRNA를 분리하였다. mRNA를 RNA 역전사 효소 (Stratagene Inc., USA)를 이용하여 1차 cDNA를 합성하고, 크기가 500b 이상인 cDNA를 컬럼 (Stratragene Inc., USA)을 이용하여 분획하였다. 크기가 500b 이상으로 분획된 cDNA를 Stratagene 사 (USA)에서 제공하는 cDNA 라이브러리 제작 키트에서 제공하는 방법에 따라 어댑터를 결합시키고, EcoRI과 XhoI 제한효소 (Stratagene Inc., USA)로 절단한 다음 벡터에 결합시켰다. 결합된 DNA 분자를 람다 패키징 물질 (packaging extract)와 반응시켜 cDNA 라이브러리를 작출하고 호스트 대장균 XL-1 Blue (Stratagene Inc., USA)에 감염하여 증폭하였다.

한국 재래 닭의 정소 cDNA 라이브러리로부터 4,500개의 클론을 임의로 골라 염기서열을 결정하였다. 염기 서열은 ABI 377 (Applied Biosystem Inc, USA)를 이용하여 결정하였다. 얻어진 염기 서열을 BlastP와 tBlastX 분석을 이용하여 상동성 검색을 실시하였다. 상동성 검색 결과, KNC 정소-12A02 및 KNC 정소-15G05 두 클론이 Prx1을 코딩하는 cDNA를 갖는 것으로 분석이 되었다. 상기 두 클론의 cDNA의 염기 서열은 서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열에 기재되어 있다. 이들 클론은 단백질 코딩 지역 이외에 5'과 3'에 각각 비번역 지역 (untranslated region)을 가지고 있다.

서열목록 제 1 서열 및 제 2 서열에 제시된 염기 서열을 미국 베일러 의과대학 웹사이트 (http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/)에서 제공하는 프로그램 (sequence search launcher)를 이용하여 어셈블 (assemble)하여, Prx1을 코딩하는 유전자를 얻고 (참조: 서열목록 제 3 서열), 이를 아미노산 서열 (참조: 서열목록 제 4 서열)로 번역하였다. 본 연구에서 얻어진 염기서열은 900 bp이다.

얻어진 닭 Prx1 cDNA 염기 서열을 아미노산 서열로 바꾸어 이미 알려진 동물들의 아미노산 서열에 대해 정열한 결과 도 1에서 보는 바와 같이 적게는 79%부터 많게는 88%까지 상동성을 나타내었다. 이와 같은 상동성 결과로부터 닭 Prx1 단백질이 다른 동물에서와 같이 항산화 기능을 갖고 있음을 추론할 수 있다.

실시예 2: 재조합 닭 Prx1 단백질의 발현 및 정제

닭 Prx1 단백질의 기능을 조사하기 위해, 대장균에서 발현을 위한 벡터 (pET21b, Novagen Inc., USA)에 재조합 하였다. 우선, 재조합을 위해 DNA 프라이머를 다음과 같이 제작하였다 (Core Bio system Inc., Korea): 정방향 프라이머 chPrx1F1 5'-GGATCCGTCTTCAGGAAAGGCTTTCATTG-5', 역방향 프라이머 chPrx1R1 5'-CTCGAGTTTCTGCTTGGAGAAATACTCTTTG-3'. 주형은 닭의 12개 조직으로부터 얻은 cDNA (Song KD, et al. Expression and functional characterization of recombinant chicken interferon-gamma. Vet Immunol Immunopathol. 58(3-4):321-333.(1997))를 혼합한 cDNA 또는 상기 염기 서열 분석에 이용한 플라스미드를 이용하였다.

PCR은 Perkin Elmer 2700 기기를 사용하였으며, Taq DNA 중합효소 (Roche, USA)를 이용하여 94℃, 30sec; 55℃, 30sec; 및 72℃,30sec; 총 30 사이클을 수행하였다. PCR 산물은 정제 후, BamHI (Takara Biomedical, Japan)과 XhoI 제한효소(Takara Biomedical, Japan)로 절단하여 BamHI과 XhoI으로 절단된 벡터에 삽입하였다. 재조합 클론은 PCR 또는 플라스미드 분리 후에 제한효소 절단으로 확인하였다. 확인된 플라스미드는 BL21(DE3) 대장균 (Novagen Inc., USA)에 전기충격법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988))으로 도입하였다.

재조합 단백질의 생산을 위해 플라스미드가 도입된 대장균을 LB 배지에 접종하고, A₆₀₀= 0.5까지 종야 배양한 후 0.3 mM IPTG (Calbiochem Inc., USA)를 가하여 재조합 단백질의 발현을 유도하였다.

재조합 단백질의 분리 및 정제를 위하여 Mag Pure^TM Hjs bing Magnetic resin (Elpis Biotech Inc., Korea)을 이용하였다. 정제 조건은 공급자의 프로토콜을 따랐다.

도 2는 0.3 mM IPTG 처리에 의해 재조합 Prx1 단백질이 발현되는 것을 보여준다. 도 2에서 볼 수 있듯이, IPTG로 발현을 유도한 시료 ("+")는 약 23 kDa의 Prx1 단백질에 해당하는 밴드를 나타내었다.

한편, 본 발명의 단백질은 C'-말단에 (His)X 6 태그가 붙어 있어 Ni⁺ 컬럼을 이용한 정제 및 항-(His)X6 항체를 이용한 검출이 가능하다. 본 연구에서는 항 (His)x6 항체 (Sigma Aldirich Inc., USA)를 이용하여 웨스턴 블럿 방법 (참조: Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press)으로 재조합 단백질의 발현을 확인하였다 (도 3). 도 3에서 볼 수 있듯이, 약 23 kDa의 Prx1 단백질에 해당하는 밴드가 관찰되었다.

도 4는 Mag Pure^TM Hjs bing Magnetic resin을 이용하여 재조합 단백질을 정제한 것을 보여준다. 도 4에서 확인할 수 있듯이, 용출액 1과 2에서 대부분의 재조합 Prx1 단백질을 분리할 수 있었다.

실시예 3: 재조합 닭 Prx1 단백질의 기능 분석

본 발명의 재조합 닭 Prx1 단백질의 산화에 의한 DNA 손상 방어능을 분석하였다. 기능 분석을 위해 금속-촉매 산화방법 (metal-catalyzed oxidation: MCO, )에 의한 DNA 손상 방지법을 이용하였다. pBLUSRIPT Ⅱ (Stratagene Inc., USA) 1 ㎍, 3 μM FeCl₃ 및 10 mM DTT에 정제된 재조합 닭 Prx1 단백질을 첨가하여 활성 산소에 의한 DNA 손상 방어능을 조사하였다. 반응 후 반응물은 1% 아가로즈젤 (1X TAE)에 전기영동하여 분석하였다.

도 5에서 볼 수 있듯이, 대조군으로 이용된 Prx1이 포함되지 않은 반응물에서는 활성 산소에 의한 DNA 손상에 의해 플라스미드의 컨포메이션이 니크 (nick) 형태로 바뀌지만, 재조합 Prx1 단백질이 포함된 반응물에서는 일부 DNA는 수퍼코일 (supercoil) 형태를 유지하였다. 또한 이런 손상 방어능은 재조합 단백질이 증가하면 방어되는 DNA의 비율이 증가하였다. 이와 같은 결과는 재조합 단백질의 항산화 기능에 의해 활성 산소가 중화되어 DNA 손상이 감소하기 때문이다.

실시예 4: 닭 조직에서의 Prx1 유전자의 발현

닭 조직에서 Prx1 유전자의 발현 여부를 조사하기 위해, 4 주령 화이트레그혼의 12개 조직으로부터 총 RNA를 추출 (Chomczynski P, Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem.162(1):156-159.(1987)) 추출방법이 기재된 논문을 기재하여 주시기 바랍니다)하고, SuperScript Ⅱ (InVitrogen Inc., USA) 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR은 상기 실시예 2의 프라이머를 이용하여 수행하였다. 반응물의 분석은 1.5% 아가로즈젤을 이용하여 분석하였다 (참조: 도 6).

실험 결과, 조사대상의 모든 조직 (뇌, 활액낭, 회장부, 심장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 비장 및 흉선)에서 Prx1 유전자가 발현됨을 확인하였다. 주목할 만한 점은 생식기관인 난소에서 다른 조직에 비해 높은 발현을 나타내었다는 것이다. 이와 같은 사실은 Prx1이 상기 조직에서 생식세포의 증식/분화 과정에서 발생하는 활성산소를 제거하는 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 닭 유래의 신규한 퍼옥시레독신 1 단백질, 그를 코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터 및 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 Prx1 단백질은 우수한 항산화능을 갖기 때문에, 생체분자들이 활성산소에 의해 손상을 주는 것을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 Prx1 단백질은 Prx1은 세포성 면역능을 증가시키거나, 활성산소, 항암치료 및 염증 반응에 의해 발생하는 산화성 스트레스 (oxidative stress)로부터 세포를 방어하는데 이용될 수 있다.

도 1은 닭 및 다른 동물의 퍼옥시레독신 1 (Prx1) 단백질의 아미노산 서열 및 그 상동성을 보여주는 도면.

도 2는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 처리에 의한 재조합 Prx1 단백질의 발현 유도를 보여주는 젤 사진. 도면에서, M은 분자량 마커, "+"는 IPTG에 의한 발현 유도 처리를 한 시료, 및 "-"는 IPTG에 의한 발현 유도 처리를 하지 않은 시료를 각각 나타낸다.

도 3은 본 발명의 Prx1 단백질의 존재를 확인하는 웨스턴 블럿 결과 사진. 도면에서, M은 분자량 마커, "+"는 IPTG에 의한 발현 유도 처리를 한 시료, 및 "-"는 IPTG에 의한 발현 유도 처리를 하지 않은 시료를 각각 나타낸다.

도 4는 본 발명의 Prx1 단백질의 정제 결과를 보여주는 젤 사진. 도면에서, M은 분자량 마커, FLT는 통과액, W는 세척액, E는 용출액을 각각 나타낸다.

도 5는 본 발명의 Prx1 단백질의 산화에 의한 DNA 손상 방어능을 보여주는 젤 사진.

도 6은 RT-PCR을 이용한 닭 조직에서의 Prx1 유전자의 발현 분석 결과를 보여주는 젤 사진. 도면에서, M은 100 bp 레더, 1은 뇌, 2는 활액낭 (bursa), 3은 회장부, 4는 심장, 5는 신장, 6은 간, 7은 폐, 8은 난소, 9는 췌장, 10은 비장 및 11은 흉선을 각각 나타낸다.

<110> Avicore Biotechnology Institute Inc. Seoul National University Industry Foundation <120> Peroxiredoxin 1 of Chicken and Nucleic Acid Molecules Encoding the Same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 810 <212> DNA <213> chicken <400> 1 gcacgaggct ggagtgggga ttgtgccgtg cggggctctt tgtattaaat caagatgtct 60 tcaggaaagg ctttcattgg aaaaccagcc cctgatttta ctgccacagc tgtaatgcca 120 gatgggcaat tcaaagatat caagctctct gactataaag gaaaatatgt tgtgttcttc 180 ttctaccctc tggacttcac ttttgtttgc ccaactgaaa ttattgcgta cagtgacaga 240 gctgatgaat tcaagaaaat taactgtgaa ataattggag cttctgttga ctctcacttc 300 tgtcaccttg cctggatcaa cactcctaag aaacaaggtg gtttgggcac tatgaaaatc 360 ccactggttt ctgacacaaa gcgtgttatt gccaaagact acggagtact taaagaggat 420 gaaggtattg catacagggg tctgttcata attgatgaga aggggatctt gaggcagata 480 acaatcaacg atcttcctgt tggccgttct gttgatgaga ccctcaggct tgtgcaggcc 540 ttccagttta cagataaaca tggagaagtg tgcccagctg gctggaagcc cggcagtgac 600 acaatcaagc ctgatgttca gaaaagcaaa gagtatttct ccaagcagaa ataaactttc 660 attctgagtg gaaagtagta 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Ile Lys Pro Asp Val Gln Lys Ser Lys 180 185 190 Glu Tyr Phe Ser Lys Gln Lys 195

Claims (6)

1. 다음의 특성을 갖는 퍼옥시레독신 1 단백질:

   (a) 항산화능을 갖음;

   (b) 활성산소에 의한 DNA의 손상을 방어하는 능력을 갖음;

   (c) 분자량이 20-27 kDa;

   (d) 닭 유래; 및

   (e) 닭의 난소 조직에서 고발현됨.
2. 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열을 포함하는 닭 유래의 퍼옥시레독신 1 단백질.
3. 상기 제 2 항의 닭 유래의 퍼옥시레독신 1 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 염기 서열은 서열목록 제 3 서열의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 퍼옥시레독신 1 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
5. 상기 제 3 항 또는 제 4 항의 닭 유래의 퍼옥시레독신 1 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
6. 상기 제 5 항의 벡터를 포함하는 형질전환체.