KR20050028278A - Nadph-p450 옥시도리덕타제 유전자와의 동시발현에 의한재조합 시토크롬 p450 효소들의 단백질 발현 증가 - Google Patents

Nadph-p450 옥시도리덕타제 유전자와의 동시발현에 의한재조합 시토크롬 p450 효소들의 단백질 발현 증가 Download PDF

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Abstract

본 발명은 NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자와 시토크롬 P450 유전자의 동시 발현(co-expression)을 이용하여 시토크롬 P450 효소들의 합성을 단백질 수준에서 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 시토크롬 P450 유전자의 발현 방법은 활성 재조합 시토크롬 P450 효소를 대장균, 효모, 동물세포를 숙주로 이용하여 대량 생산에 이용될 수 있다.

Description

NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자와의 동시발현에 의한 재조합 시토크롬 P450 효소들의 단백질 발현 증가{Increase of protein expression of recombinant cytochrome P450 enzymes by co-expression with gene encoding NADPH-P450 oxidoreductase}
본 발명은 재조합 시토크롬 P450 효소들의 발현에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 NADPH-P450 옥시도리덕타제를 시토크롬 P450 효소와 동시에 발현시켜 시토크롬 P450 효소의 발현 양을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
시토크롬 P450 효소들은 포유동물의 간 세포의 소포체(endoplasmic reticulum)나 미토콘드리아(mitochondria)에 존재하면서, 약품 및 천연물질 등의 외래 화합물 (Xenobiotics)을 주로 산화시키는 헴-티올레이트(heme-thiolate) 단백질인데, 체내에서 생성된 화합물, 예를 들면, 스테로이드, 에이코사노이드(eicosanoids), 알칼로이드(alkaloids), 지용성 비타민 등을 산화시키기도 한다(참조: Guengerich, F.P (1991) J. Biol. Chem. 266, 10019-10022: Poeter, T.D. and Coon, M.J. (1991) J. Biol. Chem. 266, 13469-13472).
P450 효소들은 체내에서의 해독작용체계에 중요한 역할을 수행한다. 이 효소들이 해독작용을 수행하는 물질들 중에서 잘 알려져 있는 물질들은, 담배연기나 불에 그을린 고기에서 발견되는 벤조피렌 (benzo(a)pyrene), 절연물질로 사용되는 폴리염화비페닐(polychlorinated biphenyls, PCBs), 쓰레기 소각과정에서 발생되는 다이옥신 (dioxin, TCDD) 등이다.
NADPH-P450 옥시도리덕타제는 NADPH를 산화시켜 얻은 전자를 시토크롬 P450 효소에 전달하여 P450 효소의 외래 물질 산화를 도와주는 역할을 담당한다. 따라서 이 두 효소는 세포 내에서 하나의 전자 전달 체계를 형성한다.
시토크롬 P450 효소들은 포유동물이나 식물 등에서 클로닝되어 대장균, 효모, 동물세포 등을 숙주 세포로 하여 재조합 단백질(recombinant protein)의 형태로 발현 및 정제되어 사용되고 있다.
이러한 배경하에서, P450 효소들이 옥시도리덕타제 유전자와의 동시 발현을 통하여 그의 합성이 단백질 수준에서 촉진됨을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 시토크롬 P450 효소들의 단백질 합성 및 또는 활성 증가 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 포유동물 및 식물 유래 P450 효소들을 유전자 재조합 단백질의 형태로 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다.
P450 효소들을 클로닝하기 위하여 사람 및 또는 랫드 유래 간 세포의 cDNA 라이브러리로부터 폴리머라제 반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 P450 유전자 조각들을 증폭, 분리하였다. 같은 방법으로 NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자도 클로닝하였다.
이때, 폴리머라제 반응을 통한 클로닝을 위해 사용한 올리고 뉴클레오티드의 염기 서열은 각각 다음과 같다.
1A2 이소타입
N 말단 primer sequence: 5-ATGGCTCTGTTATTAGCAGTTTTTCTGTTC-3
C 말단 primer sequence: 5'-AAGCTTTCAATGGTGATGGTGATGATTGAT-3
3A4 이소타입
N 말단 primer sequence: 5'-ATGGCTCTGTTATTACCAGTTTTTCTGGTG-3
C 말단 primer sequence: 5'-AAGCTTGTCCACGATATCTTAGTGGTGGTG-3
NADHP-P450 옥시도리덕타제
N 말단 primer sequence: 5'-AAGCTTCCGGTCTAGAAATAATTTTGTTTA-3
C 말단 primer sequence는 5'-AAGCTTCTAGCTCCACACGTCCAGGGAGTA-3
P450 효소와 옥시도리덕타제 보효소(co-enzyme)를 동시에 재조합 단백질 형태로 발현시키기 위하여 그림(도1)과 같은 방법으로 플라스미드 벡터(plasmid vector)를 구성하였다: P4501A2 단백질 발현 벡터로 구성된 플라스미드에 클로닝된 옥시도리덕타제 유전자를 삽입하였다.
전체 DNA 서열 중에서 첫 전사 개시(ATG)에서부터 전사 종결(TGA)까지 하나의 오픈 리딩 프레임(one-open reading frame)을 포함하고 있다. 사람 유래 P450 효소의 경우 3A4 이소타입은 1509 bp, 1A2는 1548 bp, 2E1은 1479 bp 및 NADPH-P450 옥시도리덕타제는 1872 bp를 갖는다.
대장균을 숙주세포로 이용하는 전체 발현 벡터의 구성은 다음과 같다. 유전자의 전사(transcription)를 위해서 두 개의 연속된 tac 프로모터(promoter)를 가지며 두 개의 유전자발현을 위해 각각 유전자의 5' 위치에 리보좀 결합 부위(ribosomal binding site)을 삽입하였다. 또한 항생제 엠피실린에 저항성을 갖도록 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 삽입하였다.
이때 대조군으로 사용된 P450 유전자는 대장균 내에서의 효과적인 단백질 발현을 위하여 N-말단 일부를 변형하였다(참조: Iwata, H. et al., (1998) Biochem. Pharmacol. 55, 1315-1325).
대장균 발현 균주로는 DH5αF'IQ 세포를 사용하였으며 칼슘이온 처리 및 또는 Hanahan방법(참조: Hanahan, D. (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580)으로 숙주세포의 형질 전환을 유도하였다.
P450 효소의 단백질 수준에서 발현을 관찰하기 위하여 자유 상태의 헴 대비 일산화탄소가 결합된 헴(Fe2+-CO versus Fe2+) 사이의 흡광도 변화를 측정하였다 (Omura, T. and Sato, R. (1964) J. Biol. Chem. 239, 2370-2378).
세포 추출액의 총 단백질 양을 Bradford 방법(참조: Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-254)으로 결정하였다.
아울러, P450 효소들에 대한 폴리클로날 항체를 제작하고 면역 블롯(Immunoblot)을 분석하여 P450 효소들의 합성 유도를 단백질 수준에서 알아보았다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다.
이들 실시예는 오직 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 국한되지 않는다는 것은 해당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
[P4501A2 이소타입의 단백질 발현에 대한 NADPH-P450 옥시도리덕타제의 영향]
앞서 기술한 바와 같이 사람 유래 P4501A2와 NADPH-P450 옥시도리덕타제를 하나의 대장균 발현 벡터로 구성하고 대장균 DH5αF'IQ 균주에 형질 전환을 유도하였다. 형질 전환된 균주를 엠피실린 항생제가 포함된 LB plate에서 선별한 후, Terrific broth 배지에 접종하고 37도씨에서 600 nm에서 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 그런 다음 단백질의 발현을 위하여 IPTG를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하고 20시간 더 배양하였다..
4시간 간격으로 세포를 일정량 채취하여 원심 분리로 배지 성분을 제거하고 Fe2+-CO와 Fe2+의 분광도 차이를 결정하였다.
표 1. 세포 배양 경과시간에 따른 P450 단백질의 합성
상기 표 1은 Fe 2+ -CO와 Fe 2+ 의 분광도 차이에 의해 결정된 P450 단백질의 양을 나타낸다.
괄호의 수치는 NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자와 P450 효소 유전자와의 동시 발현에 의한 P450 단백질 양을 나타낸다.
NADPH-P450 리덕타제 유전자가 없는 대조군과 비교하여 단백질 발현 경과 시간에 따라 P4501A2 효소의 합성이 증가됨을 알 수 있다. 대조군의 경우 12시간을 전후하여 단백질 합성이 최대였으며 16시간까지 유사한 발현 양을 보였다. 옥시도리덕타제와 같이 동시 발현을 시킨 경우, 대조군과 비교하여 시간 경과에 따른 단백질 합성량의 변화는 16시간까지 지속적으로 증가하였으며 절대적인 양은 16시간의 경우 대조군과 비교하여 약 1.8배 증가하였다.
도 2는 항-P4501A2 항체로 면역블롯한 결과를 나타낸다. Fe2+-CO와 Fe2+의 분광도 및 효소활성의 차이와 마찬가지로 옥시도리덕타제 유전자에 의해 P4501A2 단백질의 합성이 증가되었음을 알 수 있다.
따라서, 상기 도 2와 표 2의 결과로부터 옥시도리덕타제 유전자와의 동시 발현에 의해 P450 효소의 단백질 합성이 P450 효소만을 발현시킨 대조군에 비해 크게 증가하는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 2]
[P4503A4 이소타입의 단백질 발현에 대한 NADPH-P450 옥시도리덕타제의 영향]
모든 실험 조건과 방법은 P4501A2의 경우에서 기술한 바와 동일하다.
상기 표 1에서 보듯이, 옥시도리덕타제 유전자에 의해 P4503A4 효소의 단백질 합성이 약 1.9배 증가하였다.
[실시예 3]
[P4502E1 이소타입의 단백질 발현에 대한 NADPH-P450 옥시도리덕타제의 영향]
모든 실험 조건과 방법은 P4501A2의 경우에서 기술한 바와 동일하다.
상기 표 1에서 보듯이, 옥시도리덕타제 유전자에 의해 P4502E1 효소의 단백질 합성이 약 1.6배 증가하였다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자와의 동시 발현에 의한 P450 효소들의 단백질 합성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 포유동물 및 또한 식물 유래 시토크롬 P450 효소들의 재조합 단백질을 대량 생산에 이용될 수 있다.
제1도는 P4501A2 이소타입 효소와 NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자의 동시 발현을 위한 플라스미드 벡터 구성 방법을 나타내는 그림이다.
제2도는 항 P4501A2 항체를 이용하여 면역블롯 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

Claims (5)

  1. NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자를 유효인자로 포함하는 시토크롬 P450 효소들의 단백질 합성 증가 방법
  2. 제 1항에 있어서, 시토크롬 P450 효소들과 NADPH-P450 옥시도리덕타제는 사람 및 또는 랫드 유래 유전자임을 특징으로 하는 P450 단백질 합성 증가 방법.
  3. 제 1항의 시토크롬 P450 효소의 단백질 합성 증가 방법에 있어 옥시도리덕타제 유전자와 P450 유전자의 동시 발현(co-expression)을 포함하는 P450 단백질 합성 증가 방법
  4. 제 2항에 있어서, NADPH-P450 옥시도리덕타제 유전자와 P450 효소 유전자는 하나의 오픈리딩 프레임으로 구성됨을 특징으로 하는 P450 단백질 합성 증가 방법.
  5. 제 2항에 있어서, NADPH-P450 옥시도리덕타제는 발현되는 시토크롬 P450 효소들의 단백질 양을 증가시키는 것을 특징으로 하는 P450 단백질 합성 증가 방법.
KR1020030065446A 2003-09-18 2003-09-18 Nadph-p450 옥시도리덕타제 유전자와의 동시발현에 의한재조합 시토크롬 p450 효소들의 단백질 발현 증가 KR20050028278A (ko)

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