KR20050026505A - 생체이물 제거의 조절을 결정하는 방법 - Google Patents

생체이물 제거의 조절을 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 사이토크롬 P450 발현 및/또는 약물 수송 단백질을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 기초하여 생체이물 제거에 영향을 주는 리간드를 동정하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

생체이물 제거의 조절을 결정하는 방법{METHOD FOR DETERMINING THE REGULATION OF XENOBIOTIC REMOVAL}
본 출원은 2002년 7월 24일에 출원된 미국 가출원 제60/398,023호, 및 2002년 9월 27일에 출원된 제60/413,866호 및 제60/413,843호의 우선권 주장 출원이며, 이들 전적으로 본원에 참고로 인용한 것이다.
본 발명은 사이토크롬 P450 발현 및/또는 약물 수송 단백질을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 기초하여, 생체이물 제거에 영향을 주는 리간드를 동정하는 방법에 관한 것이다.
많은 약물이 옥시도리덕타제의 사이토크롬 P450 패밀리에 의해 대사된다. 이들 효소의 발현은 부분적으로 핵 수용체와 같은 수용체에 의해 조절된다.
약물 또는 스테로이드 대사물과 같은 생체이물은 관련 수용체와의 상호작용을 통하여 사이토크롬 P450 효소의 발현을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 프레그난 X 수용체(PXR 또는 SXR)는 사이토크롬 P450 CYP3A4 모노옥시게나제 및 생체이물의 독성 제거 및 제거에 관련된 다른 유전자들의 전사를 자극하는 것으로 보고되었으며(Goodwin et al., Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.42:1-23(2002)); 아릴 탄화수소 수용체(Ah 또는 XRE)는 흡연과 바베큐된 음식물에 함유된 유도물질로부터 P450의 CYP1A 및 CYP1B 패밀리를 활성화시키는 것으로 보고되었으며; 구성적인 안드로스탄 수용체(CAR)는 생체이물 유도물질에 의해 P450의 CYP2A와 CYP2B 패밀리를 활성화시키며; 그리고 PPAR-알파는 항-리피디미드 피브레이트의 처방 부류에 의해 P450의 CYP4A 패밀리를 활성화시키는 것으로 보고된다. 예를 들어, Tredger et al., Hospital Pharmacist, 9, 167-173 (2002) 및 그 인용 문헌을 참고한다.
약물은 또한 약물 소거 또는 신체로부터의 약물 유출을 조절하는 단백질의 발현을 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 프레그난 X 수용체(SXR)로도 알려진, 스테로이드 및 생체이물 수용체(SXR)는, 단백질 P-당단백질(ABCB1)을 암호하는 유전자 MDR1의 발현을 활성화시켜 약물 유출을 조절하는 것으로 보고되었다 (Schuetz & Strom, Nat.Med. 7:536-537 및 그 인용 문헌, Synold et al., Nat.Med.7:584-590).
따라서, 약물은 상기 약물의 활성을 제한하거나 다른 약물의 대사를 변화시키는 대사 효소의 발현을 변화시켜, 바람직하지 않으며 위험한 약물-약물 상호작용을 생성할 수 있다. 또한, 생체이물의 효율은 약물 유출 경로의 발현의 활성화에 의해 제한될 수 있다. 생체이물 대사 효소 또는 약물 소거를 일으키는 단백질의 발현 수준에 대한 효과를 예측하는 것은 유전자 조절의 종간 차이로 인해 현재로서는 어렵다.
핵 수용체는 생식, 성장 분화, 지질 및 당 항상성을 비롯한 세포 기능을 조절하는 전사 인자의 수퍼패밀리의 구성원이다. 그들의 기능은 다양한 리간드 세트(생체이물, 호르몬, 지질 및 기타 공지 및 미발견 리간드)에 의해 조절된다. 현재로서는 48개의 핵 수용체가 확인되었으며, 이중 28개는 리간드가 알려져 있으며, 나머지는 희귀물(orphan)로 분류된다. 수용체의 생물학은 복잡하고 조직 특이적이며(Shang & Brown, Science 295:2465-2468 (2002)), 작용의 분자 기작은 보조-조절인자로 불리는 부가적 단백질들의 우선적 보충의 작용으로 보이며, 이들 보조-조절인자는 리간드 비의존 또는 의존 방식으로 이들 수용체의 기능을 조절한다. 적절한 보조-조절인자의 보충은 유전자 전사 또는 억제를 일으킬 수 있다.
시그널 전달 및 유전자 발현의 중심 주제는 단백질-단백질 모듈 도메인의 구성적 또는 유도성 상호작용이다. 이들 상호작용을 강화할 수 있는 리간드를 알면 생물학적 사건들의 분자 기작의 특성 및 질병 치료를 위한 치료적 접근의 개발에 대한 정보를 제공할 것이다. 리간드 동정을 위한 기존의 방법은 성가시며 기능이 알려지지 않은 단백질의 경우에는 특히 제한적이다.
판베라(Panvera) 사는 에스트로젠 수용체 서브타입 베타를 위한 안타고니스트 리간드로부터 아고니스트를 구별하기 위한 시약을 제공하며, 보조-활성인자 단백질의 우선적 보충에 대한 자료를 공개하였다. 예를 들어, Bolger et al., Environmental Health Perspectives 106:1-7(1998) 및 샌디에고에서의 희귀 수용체 미팅(2002.6)에서 발표된 판베라 사의 발표 자료를 참고한다. 그들의 시약은 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 기초한 분석에 이용된다.
FRET에 기초한, 다른 핵 수용체(ER-α, ERR 및 PPAR 패밀리)를 위한 유사한 분석에 대한 문헌들이 있다. 예를 들어, Zhou et al., Molecular Endocrinology 12:1594-1604(1998) 및 Coward et al., 98:8880-8884(2001) 참고한다. 비아코어(Biacore) 기법을 이용하여 유사한 실험들이 이루어졌다. 예를 들어, Cheskis et al., J.Biological Chemistry 11384-11391(1997) 및 Wong et al., Biochemistry 40:6756-6765(2001)을 참고한다.
결과 판독이 유전자 발현인 세포 분석이 존재한다. 예를 들어, Camp et al., Diabetes 49:539-547(2001) 및 Kraichely et al., Endocrinology, 141:3534-3545, (2000)을 참고한다. 예를 들어, 카로-바이오사는 핵 호르몬 수용체를 위한 안타고니스트 리간드로부터 아고니스트를 구별하기 위한 배열 민감성 펩티드 프로브를 포함하는 유전자 발현 판독 분석법을 개발하였다. 예를 들어, Paige et al., PNAS 96:3999-4004(1999) 및 샌디에고에서의 희귀 수용체 미팅(2002.6)에서 발표된 카로-바이오사의 발표 자료를 참고한다.
Greenfield et al., Biochemistry 40:6446-6652(2001)은 에스트라디올의 존재하에서 ER-α수용체의 열적 안정화를 보고한다. 하지만, 상기 문헌은 ER-α수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트로서 분자의 동정을 교시하지 않는다.
전술한 당분야의 기술은 몇 가지 단점이 있다. 예를 들어, 핵 수용체의 분석, 유전자 발현 판독 분석 및 세포계 분석에서는, 동정된 리간드 또는 보조-조절인자가 시그널 전달 또는 유전자 활성화/억제 분석 결과를 생산할 수 있는 다른 단백질을 통해서가 아니라 관심 수용체와 직접 상호작용함을 확실히 하기 위하여 카운터-스크리닝이 필요하다. 또한, 세포 판독 기법은 약한 리간드를 동정하는 데 있어서 민감성이 부족하며(일반적으로 1 μM을 초과하는 친화도의 화합물은 드물게 동정됨), 우수한 세포 투과성 프로파일을 갖는 화합물에만 적용가능하다. 다른 시판되는 시험관내 분석법은 경쟁적 치환 분석을 확립하기 위해 리간드에 대한 지식이 필요하거나 그들을 FRET 계 보조-조절인자 분석을 확실히 하기 위한 도구로서 이용해야 한다.
약물 대사 효소의 발현을 조절하는 수용체에 대한 효과 및 생체 이물 대사에 대한 리간드의 결과적 효과, 및 약물 유출의 발현을 조절하는 수용체에 대한 그들의 효과에 대해 리간드를 신속하게 고효율로 동정하는 것을 용이하게 하는 정확하고 믿을만한 기법이 필요하다.
한 구체예에서, 본 발명은 약물 선도화합물(lead)에 의한 약물-대사 효소 활성에 대한 효과를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 수용체 조절 사이토크롬 P450 발현의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하고, 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 상기 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 선도화합물 및 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성의 추가 변화는 상기 약물 선도화합물이 약물-대사 효소의 활성을 증가시키는지 여부를 나타낸다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하고, 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 상기 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계를 포함한다. 약물 선도화합물과 보조-조절인자의 존재하에서의 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동은 상기 약물 선도화합물이 약물-대사 효소의 활성을 증가시키는지 여부를 나타낸다.
다른 구체예에서, 상기 방법은 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 수용체의 안정성을 변화시키고 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자는 생체이물 대사의 아고니스트로 동정된다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자는 생체이물 대사의 아고니스트로 동정된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 수용체의 안정성을 변화시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정된다. 본 발명의 다양한 구체예는 생체이물 대사의 비-아고니스트를 동정하는 다른 방법을 제공한다. 상기 방법은 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정된다.
본 발명의 다양한 구체예는 (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 다수의 분자들 중 하나 이상을 스크리닝하며, 이때 수용체의 안정성을 변화시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계; 및 (b) 수용체의 안정성을 변화시키는 단계 (a)로부터의 분자를, 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 스크리닝하며, 이때 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자를 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예는 (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 다수 분자 중 하나 이상을 스크리닝하며, 이때 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계; 및 (b) 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 단계 (a)로부터의 분자를 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 스크리닝하며, 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하며 이때 수용체의 안정성을 변화시키고 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자는 약물 소거의 아고니스트로 동정되는 것을 포함하는 약물 소거의 아고니스트를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하며, 이때 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자는 약물 소거의 아고니스트로 동정되는 것을 포함하는 약물 소거의 아고니스트를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부 구체예는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 상기 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 선도화합물과 상기 하나 이상의 보조-조절인자중의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성의 추가 변화가 상기 선도화합물이 약물 유출의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타내는 것인, 선도화합물의 약물 유출의 활성에 대한 효과를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 구체예는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 상기 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 약물 선도화합물과 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동은 약물 선도화합물이 약물 유출의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타내는 것인, 약물 선도화합물의 약물 유출의 활성에 대한 효과를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예는 SXR 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 분자와 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성의 추가 변화는 상기 분자가 생체이물 대사 및/또는 약물 소거의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 나타내는, 생체이물 대사 및/또는 약물 소거에 대한 분자의 효과를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일반적인 구체예는 SXR 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 분자와 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동은 상기 분자가 생체이물 대사 및/또는 약물 소거의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 나타내는, 생체이물 대사 및/또는 약물 소거에 대한 분자의 효과를 결정하는 다른 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 특징 및 효과는 첨부된 도면을 참고로 하여 보다 상세히 설명된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 보조-활성인자의 존재하에서 아고니스트 리간드의 동정을 위해 예상되는 실험 결과를 예시한다.
도 2는 보조-활성인자의 존재하에서 안타고니스트 리간드의 동정을 위해 예상되는 실험 결과를 예시한다.
도 3은 SXR과 상호작용 할 때 리간드가 아고니스트 반응을 유도할 통계적 확률을 예시한다.
발명의 상세한 설명
하기하는 설명에서, 생화학 및 약리학 분야의 당업자에게 공지된 다양한 개념 및 방법론을 참고할 것이다. 그러한 공지의 개념 및 방법론을 개시하는 문헌 및 다른 자료는 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.
본 발명의 방법의 한 가지 효과는 유전자 발현 판독 및 세포계 분석이나 상기 분석을 확립하기 위한 공지의 리간드의 이용이 필요하지 않다는 것이다. 그러한 직접적인 방식으로 정보를 생성하는 능력은 원하는 특성을 갖는 약물의 발견을 가능하게 한다.
하나의 단일화 분석에서 분리된 및/또는 정제된 단백질 및 펩티드의 사용에 의해, 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 데 관련되는 리간드를 동정하고 생물학적 반응을 예측할 수 있다. 리간드를 동정할 수 있을 뿐만 아니라, 표적 단백질에 대한 고유 친화도 또한 계산될 수 있으며 이것을 이용하여 생물학적 활성에 상관지을 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해, 약물 후보와 같은 분자를 스크리닝하여 그들이 약물의 활성을 제한하거나 다른 약물의 대사를 변화시키는 대사 효소의 발현을 변화시켜, 바람직하지 않고 위험한 약물-약물 상호작용을 생성하는 지 여부; 또는 그들이 약물 소거의 기작에 어떻게 영향을 주는지를 결정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 데이터는, 단백질과 같은 수용체의 용융 온도의 변화가 거대분자와 리간드의 관심 단백질에의 결합 에너지의 열역학적 연결의 직접적인 결과이므로, 카운터 스크리닝을 필요로 하지 않는다. 또한, 수용체에의 리간드의 친화도는 더욱 민감하며(pM 내지 mM의 친화도가 측정됨) 상기 방법은 약한 세포 투과성을 갖는 화합물에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 구체예에서, 약물 후보 또는 선도화합물과 같은 분자의, 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 분자에 기초한, 약물 대사 효소 활성 및 생체 이물 대사에 대한 효과의 측정을 위한 방법이 제공된다. 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 후보 또는 선도화합물을 비롯한 분자는 수용체와 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 수용체의 안정성이 더 변화되는 지 여부는 상기 분자가 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부에 대한 표시이다. 이 정보에 기초하여, 약물-대사 효소 활성에 대한 효과 및 따라서 리간드의 생체 이물 대사에 대한 효과를 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 열적 변화에 기인한 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 풀림에 기초하여 약물 선도화합물과 같은 분자들의, 약물 대사 효소 활성 및 한 생체이물 대사에 대한 효과를 측정하는 방법이 제공된다. 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자는 수용체 및 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 상기 수용체의 열풀림 곡선이 더 이동되는 지 여부는 상기 분자가 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부에 대한 표시이다. 이 정보에 기초하여, 리간드의 약물-대사 효소 활성에 대한 효과 및 따라서 생체 이물 대사에 대한 효과를 측정할 수 있다.
용어 "수용체"는 펩티드, 단백질, 핵산, 및 다른 수용체를 포함한다. 이 용어는 효소 및 효소가 아닌 단백질 둘다를 포함한다. 상기 용어는 단량체 및 다량체 단백질을 포함한다. 다량체 단백질은 동종다량체 또는 이종다량체일 수 있다. 상기 용어는 올리고뉴클레오티드와 같은 두개 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함한다. 핵산은 단일쇄, 이중쇄 또는 삼중쇄일 수 있다. 상기 용어는 합성 올리고뉴클레오티드, 재조합 DNA 분자의 일부, 또는 염색체 DNA의 일부인 핵산을 포함한다.
용어 "수용체"는 또한 접힘, 코일링 또는 꼬임을 통해 이차, 삼차, 또는 사차 구조를 획득할 수 있는 펩티드, 단백질 및 기타 수용체의 일부를 포함한다.
상기 수용체는 보조인자, 보조효소, 보철기, 지질, 올리고당, 또는 인산기를 포함하며 이에 한정되지 않는 치환체로 치환될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 이용된 수용체는 보조-조절인자-의존성이다. "보조-조절인자-의존성"이란 상기 수용체가 하나 이상의 리간드에 결합할 수 있으며 하나 이상의 보조-조절인자에 결합할 수 있음을 의미한다. 또한, 리간드 의존성 기능이든 또는 비의존성 기능이든, 상기 수용체의 활성은 적어도 부분적으로 보조-조절인자에 의존한다. 보조-조절인자 의존성 수용체는 핵 수용체를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
핵 수용체, 및 거기에 관련된 보조-조절인자의 역할은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Aranda and Pascual, Physiological Review 81:1269-1304(2001); Collingwood et al., Journal of Molecular Endocrinology 23:255-275(1999); 및 Robyr et al., Molecular Endocrinology 23:329-347(2000); 및 Lee et al., Cellular and Molecular Life Sciences 58:289-297(2001)을 참고한다. 상기 문헌들은 참고로 전체가 본원에 통합된다.
또한, 보조-조절인자 의존성 수용체는 곤충을 포함하며 이에 한정되지 않는 무척추동물뿐만 아니라, 사람을 포함하며 이에 한정되지 않는 척추동물 종을 포함한다.
예시적으로, 곤충은 수백 개의 핵 수용체를 함유하며, 이를 위한 리간드는 아고니스트 또는 안타고니스트로 동정될 수 있다. 척추동물, 선충류, 및 절지 동물에 존재하는 핵 수용체에 대해서는 Laudet, J.Molecular Endocrinology 19:207-226(1997) 및 Maglich et al., Genome Biology 2:1-7(2001)을 참고하며, 상기 문헌은 참고로 전체가 본원에 통합된다.
보다 구체적으로, 본 발명의 구체예에서, 용어 "수용체"는 스테로이드 X 수용체(SXR)을 포함하며 이에 한정되지 않는, P450 발현을 조절하는 수용체를 말한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 용어 "수용체"는 PXR과 SXR을 포함하며 이에 한정되지 않는, 약물 수송 단백질 발현을 조절하는 수용체를 말한다.
용어 "단백질"은 전길이 또는 폴리펩티드 단편을 포함한다. 상기 용어 "펩티드"는 단백질 단편, 합성 또는 펩티드 라이브러리에서 유래된 것들을 말한다. 여기서 사용될 때, 용어 "단백질"과 "폴리펩티드"는 동의어이다.
용어 "보조-조절인자"는 DNA와 RNA와 같은 핵산, 및 리간드 의존성 또는 비의존성 방식으로 수용체를 조절하는 펩티드를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의 구조의 화학적 화합물을 말한다. 상기 용어는 천연, 합성 및 가상 분자를 말한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 리간드 의존적 또는 비의존적 방식으로 수용체를 조절하는 천연 또는 합성의 펩티드 또는 폴리펩티드/단백질을 말한다. 상기 용어는 천연 서열로부터 또는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 상기 펩티드는 천연 단백질의 단편일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 보조-활성인자 및 보조-억제인자를 말하며, 더욱 구체적으로는 본 발명의 구체예에서는 사이토크롬 P450 효소 또는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 보조-활성인자 및 보조-억제인자를 말한다.
용어 "보조-활성인자"는 수용체에 결합하여 수용체의 활성화 또는 활성 증가를 야기하는 분자를 말한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 용어는 유전자 전사를 유도하기 위하여 또는 시그널링 기능(예, 시그널 전달)을 유도하기 위하여 수용체에 결합하는 분자를 말한다.
용어 "보조-억제인자"는 수용체에 결합하여 수용체의 탈활성화 또는 수용체 활성 감소를 야기하는 분자를 말한다. 본 발명의 구체예에서, 상기 용어는 수용체에 결합하여 유전자 전사를 억제하거나 시그널링 기능(예, 시그널 전달)을 억제하는 분자를 말한다.
용어 "아고니스트"는 수용체에 결합하여 수용체에 결합하기 위한 보조-활성인자를 유도하거나 보충하는 분자를 말한다. 본 발명의 구체예에서, 용어 "아고니스트"는 핵 수용체에 결합하며 보조-활성인자를 보충하는 분자를 말한다. 이들 구체예에서, 상기 용어는 보다 구체적으로는 보조-활성인자와의 직접적인 상호작용을 증진시키는, 핵 수용체의 배열 변화를 유도함으로써 유전자 발현을 변화시키는 분자를 말한다. 일부 구체예에서, 아고니스트는 보조-활성인자 의존성 수용체의 강한 유도물질이다. 다른 구체예에서, 아고니스트는 보조-조절인자 의존성 수용체의 부분적인 아고니스트이고 약한 유도물질이다.
용어 "안타고니스트"는 수용체에 결합하며 수용체에 결합하기 위한 보조-억제인자를 유도하거나 보충하는 분자를 말한다. 본 발명의 구체예에서, 용어 "안타고니스트"는 핵 수용체에 결합하며 보조-억제인자를 보충하는 분자를 말한다. 이들 구체예에서, 상기 용어는 보다 구체적으로 보조-억제인자와의 직접적인 상호작용을 증진시키는, 핵 수용체의 배열 변화를 유도함으로써 유전자 발현을 변화시키는 분자를 말한다. 일부 구체예에서, 안타고니스트는 보조-조절인자 의존성 수용체의 비유도물질 또는 비-아고니스트이다.
용어 "분자"는 보조-조절인자와 같은 추가 화합물의 존재 또는 부재하에서 수용체에 대한 결합에 대해 테스트되는 화합물을 말한다. 이 용어는 DNA 및 RNA와 같은 핵산, 및 펩티드를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의 구조의 화학적 화합물을 포함한다. 상기 용어는 천연, 합성 및 가상 분자를 말한다. 상기 용어는 배합물 또는 조합 라이브러리내의 화합물을 포함한다. 상기 용어는 또한 약물 선도화합물 또는 약물 후보를 포함한다. 상기 용어 "분자"와 "리간드"는 동의어이다.
용어 "다수 분자", "다수 화합물", 또는 "다수 용기"는 두개 이상의 분자, 화합물 또는 용기를 말한다.
"열풀림 곡선"은 온도의 함수로서 단백질 또는 핵산의 풀림과 관련된 물리적 변화의 곡선이다.
용어 "결합하다" 및 "결합"은 둘 이상의 분자 간의 상호 작용을 말한다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 리간드와 수용체, 또는 보조-조절인자와 수용체, 또는 리간드, 수용체 및 보조-조절인자 사이의 비공유적인 결합과 같은 상호작용을 말한다.
용어 "안정성의 변화"는 임의의 리간드의 부재하에서 표적 단백질에서 일정한 정도의 물리적 변화를 야기하는 데 필요한 압력의 양, 열의 양, 세제의 농도, 또는 변성제의 농도에 비교한, 하나 이상의 리간드에 의해 결합된 표적 단백질에서 동일한 정도의 물리적 변화를 야기하는 데 필요한 압력의 양, 열의 양, 세제의 농도, 또는 변성제의 농도의 변화를 말한다. 안정성의 변화는 안정성의 증가 또는 감소로 나타낼 수 있다. 리간드에 의한 수용체의 안정성의 변화는 리간드가 수용체에 결합함을 나타낸다.
용어 "안정성의 추가 변화"는 수용체의 안정성을 변화시키는 것으로 알려진 분자 및 하나 이상의 추가 분자의 존재하에서 수용체의 안정성의 부가적인 변화를 말한다. 보다 구체적으로, 상기 하나 이상의 부가적인 분자는 보조-조절인자일 수 있다.
용어 "풀림"은 아미노산 측쇄, 이차, 삼차, 또는 사차 단백질 구조의 결정 상태와 같은 구조의 손실을 말한다. 단백질과 같은 수용체는 변성제(예, 우레아, 구아니디늄 하이드로클로라이드, 또는 구아니디늄 티오석시네이트), 세제를 이용한 처리, 압력을 이용한 수용체의 처리, 수용체의 가열, 또는 다른 적절한 변화에 의해 풀리도록 야기될 수 있다.
용어 "물리적 변화"는 빛 또는 열 형태의 에너지의 방출, 빛 또는 열 형태의 에너지의 흡수, 혼탁도의 변화 및 빛의 극성 특성의 변화를 포함한다. 구체적으로, 상기 용어는 적외선 분광법, 형광 방출, 형광 에너지 전달, 자외선 또는 가시 광선의 흡수, 빛의 극성화 특성의 변화, 형광 방출의 극성화 특성의 변화, 시간에 따른 형광 변화의 속도 변화(즉, 형광 반감기), 형광 비등방성의 변화, 형광 공명 에너지 전달의 변화, 혼탁도의 변화, 및 효소 활성의 변화를 비롯한 분광법에 의해 측정되는 변화를 말한다. 바람직하게는, 상기 용어는 형광을, 더욱 바람직하게는 형광 방출을 말한다. 형광 방출은 단백질에 고유하거나 또는 형광 리포터 분자에 의한 것일 수 있다. 단백질 풀림을 모니터하기 위한 형광 기법의 이용은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Eftink, M.R., Biophysical J.66:482-501(1994).
"풀림 곡선"은 온도, 변성제 농도, 및 압력과 같은 매개변수의 함수로서 단백질의 풀림과 관련된 물리적 변화의 곡선이다.
용어 "열적 안정성의 변화"는 임의의 리간드의 부재하에서 표적 단백질의 일정한 정도의 물리적 변화를 야기하는 데 필요한 열 에너지의 양에 비교한, 하나 이상의 리간드에 의해 결합된 표적 단백질에서 동일한 정도의 물리적 변화를 야기하는 데 필요한 열 에너지의 양의 변화를 말한다. 열적 안정성의 변화는 열적 안정성의 증가 또는 감소로 나타내질 수 있다. 리간드에 의한 수용체의 열적 안정성의 변화는 리간드가 단백질에 결합함을 나타낸다.
용어 "열풀림 곡선의 이동"은 리간드 부재하에서 단백질의 열풀림 곡선에 비하여, 리간드에 결합된 수용체의 열풀림 곡선의 이동을 말한다.
용어 "열풀림 곡선의 추가 이동"은 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 것으로 알려진 분자와 하나 이상의 추가 분자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선의 부가적인 이동을 말한다. 보다 구체적으로, 하나 이상의 추가 분자는 보조-조절인자일 수 있다.
용어 "수용체와 접촉"은 광범위하게, 결합에 대해 스크리닝될 분자를 가진 용액내에 표적 단백질을 두는 것을 의미한다. 다소 협소하게는, 접촉은 수용체 및 결합에 대해 스크리닝될 분자의 용액의 회전, 소용돌이, 흔들림 또는 진동을 말한다. 보다 구체적으로, 접촉은 결합에 대해 테스트될 분자와 수용체의 혼합을 말한다. 혼합은 예를 들어 피펫 팁을 통한 빨아올림과 배출의 반복에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 접촉은 표적 단백질 및 결합에 대해 테스트될 분자 사이의 결합의 평형화를 말한다. 접촉은 용기내에서, 또는 수용체 및 스크리닝될 분자가 용기내에 놓여지기 전에 발생할 수 있다.
용어 "용기"는 수용체 및 결합에 대해 테스트될 분자가 놓여질 수 있는 임의의 그릇 또는 챔버를 말한다. 용어 "용기"는 반응 튜브(예, 테스트 튜브, 마이크로튜브, 바이알, 큐벳 등)를 포함한다. 본 발명의 구체예에서, 용어 "용기"는 다가웰 마이크로플레이트 또는 미세적정 플레이트내의 웰을 말한다.
본 발명의 구체예에서, 수용체에 결합하는 분자는 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체에 결합하는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 용어 "스크리닝"은 일반적으로 변성되거나 풀릴 수 있는 수용체에 결합하는 그들의 능력에 대해 분자 또는 화합물을 테스트하는 것을 말한다. 스크리닝 과정은 풀림 분석에서 단백질에 대한 결합에 대해 분자를 테스트하는 반복적, 또는 되풀이 과정일 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예에서, 상기 화합물은 P450 발현의 강한 유도물질이다. 다른 구체예에서, 강한 유도물질의 결합 친화도는 약 5 μM 미만, 또는 약 4.5 μM, 또는 약 4 μM, 또는 약 3.5 μM, 또는 약 3 μM, 또는 약 2.5 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 1.5 μM, 또는 약 1 μM이며 강한 유도물질의 아고니스트 상태의 통계적 확률은 약 0.8 내지 약 1.0이다. 또 다른 구체예에서, 강한 유도물질의 통계적 확률은 약 0.8 이상, 또는 약 0.85 이상, 또는 약 0.9 이상, 또는 약 0.95 이상, 또는 약 1.0 이상이다.
다른 구체예에서, 상기 화합물은 P450 발현의 약한 유도물질이다. 다른 구체예에서, 약한 유도물질의 결합 친화도는 약 5 μM 미만, 또는 약 4.5 μM, 또는 약 4 μM, 또는 약 3.5 μM, 또는 약 3 μM, 또는 약 2.5 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 1.5 μM, 또는 약 1 μM이며 약한 유도물질의 아고니스트 상태의 통계적 확률은 약 0.4 내지 약 0.8이다. 다른 구체예에서, 약한 유도물질의 통계적 확률은 약 0.4와 0.5 사이, 또는 약 0.5와 약 0.6 사이, 또는 약 0.6과 약 0.7 사이, 또는 약 0.7과 약 0.8 사이이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 화합물은 P450 발현의 비유도물질이다. 다른 구체예에서, 비유도물질의 결합 친화도는 약 5 μM 미만, 또는 약 4.5 μM, 또는 약 4 μM, 또는 약 3.5 μM, 또는 약 3 μM, 또는 약 2.5 μM, 또는 약 2 μM, 또는 약 1.5 μM, 또는 약 1 μM이며 비유도물질의 아고니스트 상태의 통계적 확률은 약 0.0 내지 약 0.4이다. 다른 구체예에서, 비유도물질의 통계적 확률은 약 0.05 미만, 또는 약 0.1 미만, 또는 약 0.15 미만, 또는 약 0.2 미만, 또는 약 0.25 미만, 또는 약 0.3 미만, 또는 약 0.35 미만, 또는 약 0.4 미만이다. 일부 구체예에서, 약한 유도물질은 비활성으로 보인다.
다른 구체예에서, 상기 화합물은 P450 발현의 약한 유도물질이다. 다양한 구체예에서, 약한 유도물질은 약 5 μM을 초과하는 결합 친화도를 가지며, 약 0.4와 약 1.0 사이, 또는 약 0.4와 약 0.5 사이, 또는 약 0.5와 약 0.6 사이, 또는 약 0.6과 약 0.7 사이, 또는 약 0.7과 약 0.8 사이, 또는 약 0.8과 약 0.9 사이, 또는 약 0.9와 약 1.0 사이의 아고니스트 상태의 확률을 가진다.
또 다른 구체예에서, 상기 화합물은 P450 발현에 대해 비활성인 것으로 보인다. 다양한 구체예에서, 비유도물질은 약 5 μM을 초과하는 결합 친화도 및 약 0.4 미만, 또는 약 0.35 미만, 또는 약 0.3 미만, 또는 약 0.25 미만, 또는 약 0.2 미만, 또는 약 0.15 미만, 또는 약 0.1 미만, 또는 약 0.5 미만의 아고니스트 상태의 확률을 갖는다.
전술한 바대로, 본 발명의 다양한 구체예에 따라, 약물-대사 효소 활성 및 생체이물 대사에 대한, 약물 선도화합물과 같은 분자의 효과는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성의 변화에 기초하여 동정될 수 있다. 상기 수용체의 안정성을 변화시키는 분자는 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다.
한 구체예에서, 스크리닝을 실시하기 위하여, 수용체의 안정성을 변화시키는 하나 이상의 분자(예, 한 세트)를 다수의 용기 각각에서 하나 이상의 보조-조절인자 및 수용체와 접촉시킬 수 있다. 이어서 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 표적 단백질이 풀리도록 야기할 수 있다. 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정할 수 있다. 용기 각각에 대한 수용체의 풀림 곡선을 이어서 얻을 수 있다. 풀림 곡선 각각을 (1) 다른 풀림 곡선 각각 및/또는 (2) (i) 상기 세트로부터의 분자들중 어느 하나 및/또는 (ii) 보조-조절인자의 부재하에서의 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교할 수 있다.
생성된 데이터에 기초하여, 스크리닝된 분자가 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 추가로 변화시키는지를 결정하고, 따라서 상기 분자가 생체이물 대사의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 동정할 수 있다. 수용체의 안정성의 추가 변화는 수용체의 풀림 곡선의 추가 변화에 의해 표시된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약물-대사 효소 활성 및 따라서 생체이물 대사에 대한 약물 선도화합물과 같은 분자의 효과는, 열적 안정성을 변화시키는, 더욱 구체적으로는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자를 분석함으로써 동정될 수 있다. 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자는 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 스크리닝은 수용체를, 다수의 용기 각각에서 하나 이상의 보조-조절인자와 함께, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 리간드 하나 이상(예, 한 세트)과 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 다수의 용기를 가열하고, 수용체의 열풀림 곡선과 관련된 물리적 변화를 온도의 함수로서 용기 각각에 대하여 측정할 수 있다. 온도의 함수로서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 생성할 수 있다. 생성되는 열풀림 곡선을 (1) 다른 풀림 곡선 각각 및/또는 (2) (i) 상기 세트로부터의 분자들중 어느 하나 및/또는 (ii) 보조-조절인자의 부재하에서 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교할 수 있다.
스크리닝 방법의 구체예에서, 상기 용기는 온도 범위에 걸쳐, 간격을 두고 가열될 수 있다. 다수의 용기를 동시에 가열할 수도 있다. 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 각 가열 간격 후 측정할 수 있다. 이 방법의 다른 구체예에서, 용기는 연속적인 방식으로 가열될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성함에 있어, 열풀림 곡선은 각 용기내의 수용체에 대해 온도 함수로서 플롯할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 열풀림 곡선의 비교는 각 풀림 곡선의 중간점 온도, Tm을 비교함으로써 이루어질 수 있다. "중간점 온도, Tm"은 열풀림 곡선의 온도 중간점이다. Tm은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다. 예를 들어, Weber, P.C. et al., J.Am.Chem.Soc. 116:2717-2724(1994); 및 Clegg, R.M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90:2994-2998(1993)을 참고한다.
예를 들어, 각 열풀림 곡선의 Tm을 확인하고, (1) 다른 풀림 곡선 및/또는 (2) (i) 상기 세트로부터의 분자들중 어느 하나 및/또는 (ii) 보조-조절인자의 부재하에서 수용체에 대한 열풀림 곡선에 대해 얻어진 Tm과 비교할 수 있다.
다르게는 또는 부가적으로는, 전체 열풀림 곡선은 컴퓨터 분석 도구를 이용하여 다른 전체 열풀림 곡선에 유사하게 비교될 수 있다. 예를 들어, 각각의 전체 열풀림 곡선은 (1) 다른 풀림 곡선 및/또는 (2) (i) 상기 세트로부터의 분자들중 어느 하나 및/또는 (ii) 보조-조절인자의 부재하에서 수용체를 위한 열풀림 곡선에 비교될 수 있다.
생성된 데이터에 기초하여, 스크리닝된 분자 중 어느 것이 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는지를 결정하고, 따라서 상기 분자가 생체이물 대사의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 동정할 수 있다.
분자가 수용체의 열풀림 곡선을 이동 및/또는 더 이동시키는지 여부를 결정하는 데 관련되는 본 발명의 방법은, 단백질분해에 대한 민감성, 단백질에 의한 표면 결합, 단백질에 의한 항체 결합, 단백질의 분자 샤페론 결합, 고정된 리간드에의 차등 결합, 및 단백질 응집의 분석과 같은, 분자가 수용체의 열풀림 곡선을 이동 및/또는 더 이동시키는지를 결정하는 것에 관련되지 않는 방법과는 구별된다. 그러한 분석은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,585,277호와 제5,679,582호를 참고한다. 미국 특허 제5,585,277호와 제5,679,582호에 개시된 이들 접근법은 결합에 대해 테스트되는 분자의 존재 및 부재하에서 단백질의 접힘 및/또는 풀림의 정도를 비교하는 것에 관련된다. 이들 접근법은 수용체에 결합하는 분자가 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 지 여부를 결정하는 것에 관련되지 않는다.
전술한 대로, 수용체의 안정성을 변화시키는 분자는 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 수용체의 안정성을 변화시키는 것으로 알려진 분자는, 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자를 비롯한, 수용체를 위한 동정된 보조-조절인자 패널에 대해 스크리닝될 수 있다. 편의상, 수용체의 안정성을 변화시키는 것으로 알려진 분자는 분자들의 "세트"로 불린다.
수용체의 안정성이, 수용체와 상기 세트로부터의 분자 단독에 비하여, 상기 세트로부터의 분자와 수용체의 보조-활성인자의 존재하에서 더 변화된다면, 이것은 상기 세트로부터의 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 아고니스트임을 나타내는 것이다. 이 방식으로, 상기 분자는 약물-대사 효소 활성에 대한 효과를 증가시키고/시키거나 그렇지 않으면 생체이물 대사의 아고니스트일 수 있음이 결정될 수 있다.
수용체의 안정성이, 수용체와 상기 세트로부터의 분자 단독에 비하여, 상기 세트로부터의 분자와 수용체의 보조-억제인자의 존재하에서 더 변화된다면, 이것은 상기 세트로부터의 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 안타고니스트임을 나타내는 것이다. 이 방식으로, 상기 분자는 약물-대사 효소 활성에 대한 효과를 감소시키고/시키거나 그렇지 않으면 생체이물 대사의 안타고니스트일 수 있음이 결정될 수 있다.
유사하게, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자는 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 것으로 알려진 분자는 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자를 비롯한, 수용체를 위한 동정된 보조-조절인자 패널에 대하여 스크리닝될 수 있다. 편의상, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 것으로 알려진 분자는 분자의 "세트"로 불린다.
만일 수용체의 열풀림 곡선이, 수용체와 상기 세트로부터의 분자 단독에 비하여, 상기 세트로부터의 분자와 수용체의 보조-활성인자의 존재하에서 더 이동된다면, 이것은 상기 세트로부터의 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 아고니스트임을 나타내는 것이다. 이 방식으로, 상기 분자는 약물-대사 효소 활성에 대한 효과를 증가시키고/시키거나 그렇지 않으면 생체이물 대사의 아고니스트일 수 있음이 결정될 수 있다.
만일 수용체의 열풀림 곡선이, 수용체와 상기 세트로부터의 분자 단독에 비하여, 상기 세트로부터의 분자와 수용체의 보조-억제인자의 존재하에서 더 이동된다면, 이것은 상기 세트로부터의 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 안타고니스트임을 나타내는 것이다. 이 방식으로, 상기 분자는 약물-대사 효소 활성에 대한 효과를 감소시키고/시키거나 그렇지 않으면 생체이물 대사의 안타고니스트일 수 있음이 결정될 수 있다.
본 발명은 또한 안정성의 추가 변화의 부족 및/또는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 풀림 곡선의 추가 이동의 부족에 기초하여 생체이물 대사의 아고니스트 또는 안타고니스트를 동정하는 방법을 제공한다.
"수용체의 안정성의 추가 변화의 부족" 또는 "수용체의 안정성의 추가 변화 없음"은, 상기 세트로부터의 분자와 보조-조절인자 둘다의 존재하에서 (수용체와 상기 세트로부터의 분자와 비교할 때) 수용체의 안정성의 추가 변화가 미미하거나 없음을 의미한다.
"수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동의 부족" 또는 "수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동 없음"이란, 상기 세트로부터의 분자와 보조-조절인자의 존재하에서 (수용체와 상기 세트로부터의 분자와 비교할 때) 수용체의 열풀림 곡선의 이동의 추가 변화가 미미하거나 없음을 의미한다.
본 발명의 구체예에서, 생체이물 대사의 안타고니스트는 보조-활성인자의 존재하에서 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성의 추가 변화의 부족 및/또는 열풀림 곡선의 추가 이동의 부족에 기초하여 동정될 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 생체이물 대사의 아고니스트는 보조-억제인자의 존재하에서 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성의 추가 변화의 부족 및/또는 열풀림 곡선의 이동의 부족에 기초하여 동정될 수 있다.
생체이물 대사의 안타고니스트는 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 그들의 능력에 대해, 수용체의 안정성을 변화시키는 분자의 세트 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 데 대한 그들의 효과에 대해 상기 세트로부터의 분자를 스크리닝하는 방법은 전술된다. 상기 세트의 분자와 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성이 더 변화되지 않는다면, 이것은 상기 세트의 그러한 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안타고니스트임을 나타내는 것이다. 이 방식으로, 상기 분자는 생체이물 대사의 안타고니스트로 결정될 수 있다.
안타고니스트는 또한 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자의 세트 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해 세트의 하나 이상의 분자를 스크리닝하는 방법은 전술된다. 상기 세트의 분자와 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동이 없다면, 이것은 상기 세트의 그러한 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안타고니스트임을 나타내는 것이며, 따라서 상기 분자는 생체이물 대사의 안타고니스트로 결정될 수 있다.
생체이물 대사의 아고니스트는 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 그들의 능력에 대해, 수용체의 안정성을 변화시키는 분자의 세트 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 데 대한 그들의 효과에 대해 상기 세트로부터의 분자를 스크리닝하는 방법은 전술된다. 상기 세트의 분자와 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 안정성이 더 변화되지 않는다면, 이것은 상기 세트의 그러한 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 아고니스트임을 나타내는 것이다. 이 방식으로, 상기 분자는 생체이물 대사의 아고니스트로 결정된다.
아고니스트는 또한 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자의 세트 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해 세트의 하나 이상의 분자를 스크리닝하는 방법은 전술된다. 상기 세트의 분자와 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동이 없다면, 이것은 상기 세트의 그러한 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 아고니스트이며, 따라서 상기 분자는 생체이물 대사의 아고니스트임을 나타내는 것이다.
본 발명의 다른 구체예는 생체이물 대사의 비아고니스트를 동정하는 방법을 포함한다. "비아고니스트"란 약물 후보 또는 약물 선도화합물과 같은 분자가 보조-조절인자의 존재하에서 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체에 대한 안타고니스트이거나 또는 수용체에 전혀 결합하지 않는 것이며, 따라서 약물-대사 효소의 발현을 증가시키지 않는 것을 의미한다.
예를 들어, 생체이물 대사의 비아고니스트는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 만일 상기 분자가 수용체의 안정성을 변화시키지 않는다면, 상기 분자는 생체이물 대사의 비아고니스트로 동정될 수 있다.
다른 구체예에서, 생체이물 대사의 비아고니스트는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 만일 상기 분자가 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키지 않으면, 상기 분자는 생체이물 대사의 비아고니스트로 동정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 생체이물 대사의 비아고니스트는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 다수 분자 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 수용체의 안정성을 변화시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비아고니스트로 동정된다. 수용체의 안정성을 변화시키는 분자는 하나 이상의 보조-억제 인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자는 생체이물 대사의 비아고니스트로 동정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 생체이물 대사의 비아고니스트는 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 그들의 능력에 대해 다수 분자 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비아고니스트로 동정된다. 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자는 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 보조-억제인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자는 생체이물 대사의 비아고니스트로 동정될 수 있다.
수용체의 안정성을 변화시키고/시키거나 열풀림 곡선을 이동시키는 것으로 알려진 분자를 제공하고, 수용체의 안정성을 더 변화시키고/시키거나 열풀림 곡선을 더 이동시키는 그들의 능력에 대해 그러한 분자를 스크리닝하는 것에 기초하여, 생체이물 대사의 아고니스트와 안타고니스트를 동정하는 방법들이 전술되었다. 본 발명은 또한 생체이물 대사의 아고니스트 또는 안타고니스트로서 그러한 분자를 동정하는 것과 함께 그러한 분자를 제공하는 방법을 포함한다. 그러한 방법은 수용체에 결합하는 리간드가 알려지지 않은 희귀 수용체를 위한 리간드를 동정하는 데 특히 유용하다.
상기 수용체의 안정성을 변화시키고/시키거나 열풀림 곡선을 이동시키는 분자(편의상 "세트"로 불림)는 다수의 상이한 분자들을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들어, 수용체의 안정성을 변화시키는 분자는 수용체의 안정성을 변화시키는 그들의 능력에 대해 상이한 분자 다수 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 유사하게, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 분자는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 상이한 분자 다수 중 하나 이상을 스크리닝함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 스크리닝될 수 있는 분자의 수는 약 1000개 내지 백만개 범위이다.
아고니스트 또는 안타고니스트를 동정하기 위해 전술한 스크리닝 방법과 유사한 방법에 의해 수용체의 안정성을 변화시키는 그들의 능력에 대해 분자를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 수용체를 다수 용기 각각에서 다수의 상이한 분자 중 하나 이상과 접촉시킬 수 있다. 다수 용기 각각의 수용체를 처리하여 풀리도록 한다. 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정할 수 있다. 용기 각각을 위한 수용체의 풀림 곡선을 생성할 수 있다. 이들 풀림 곡선 각각을 (1) 다른 풀림 곡선 각각 및/또는 (2) 다수의 상이한 분자 중 임의 분자가 없을 때 상기 수용체의 풀림 곡선에 비교할 수 있다.
생성된 데이터에 기초하여, 스크리닝된 분자 중 임의 분자가 수용체의 안정성을 변화시키는 지 여부를 결정할 수 있다. 수용체의 안정성의 변화는 수용체의 풀림 곡선의 변화에 의해 나타내진다. 만일 분자가 수용체의 안정성을 변화시키면, 그것이 보조-조절인자의 존재하에서 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트인지를 동정하기 위해 전술한 방법에 의해 스크리닝할 수 있다.
유사하게, 분자는 아고니스트 또는 안타고니스트를 동정하기 위한 스크리닝 방법과 유사한 방법에 의해 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 그들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 상기 수용체는 다수 용기 각각에서 다수의 상이한 분자 중 하나 이상과 접촉될 수 있다. 상기 용기는 가열될 수 있으며, 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 용기 각각에서 측정할 수 있다. 수용체를 위한 열풀림 곡선은 용기 각각에 대해 온도의 함수로서 생성될 수 있다.
열풀림 곡선은 (1) 다른 풀림 곡선 각각 및/또는 (2) 다수의 상이한 분자 중 임의 분자가 없을 때 상기 수용체의 풀림 곡선에 비교할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 각 열풀림 곡선의 Tm은 확인되고, (1) 다른 풀림 곡선 및/또는 (2) 다수의 분자 중 임의 분자가 없을 때 상기 수용체의 열풀림 곡선에 대해 얻어진 Tm에 비교될 수 있다. 다르게는, 각각의 전체 열풀림 곡선을 (1) 다른 풀림 곡선 및/또는 (2) 다수의 상이한 분자 중 임의 분자가 없을 때 상기 수용체의 열풀림 곡선에 비교할 수 있다.
생성된 데이터에 기초하여, 스크리닝된 분자 중 임의 분자가 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 지 여부를 결정할 수 있다. 만일 분자가 수용체의 열풀림 곡선을 변화시키면, 그것이 보조-조절인자의 존재하에서 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 아고니스트 또는 안타고니스트인지를 동정하기 위해 전술한 방법에 의해 스크리닝할 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 마이크로플레이트 열이동 분석은 리간드를 동정하고 그러한 리간드를 생체이물 대사의 아고니스트 또는 안타고니스트로 동정하기 위해 특히 유용한 수단이다. 마이크로플레이트 열이동 분석은 표적 수용체의 열적 안정성에 대한 하나 이상의 분자의 효과를 분석하기 위한 직접적이고 정량적인 기법이다.
마이크로플레이트 열이동 분석의 이론, 개념 및 적용, 및 마이크로플레이트 열이동 분석을 실시하는 데 유용한 장치는 미국 특허 제6,020,141호, 제6,036,920호, 제6,291,191호, 제6,268,218호, 제6,232,085호, 제6,268,158호, 제6,214,293호, 제6,291,192호 및 제6,303,322호에 개시되며, 이들은 그 전체가 참고로 본원에 통합된다. 이들 문헌에서 개시된 마이크로플레이트 열이동 분석은 전술한 스크리닝 방법을 실시하기 위해 이용될 수 있다.
상기 마이크로플레이트 열이동 분석은 리간드 결합 친화도의 열동력학적 판독결과를 제공한다. 상기 분석은 각각의 기능적으로 활성인 수용체가 각 수용체에 특징적이며 그 안정화 에너지를 나타내는 온도에서 협동적으로 용융하는 매우 조직화된 구조라는 사실에 기초한다. 분자가 수용체에 결합할 경우, 상기 수용체는 리간드 결합 친화도에 비례하는 양만큼 안정화되어 중간점 온도를 더 높은 온도로 이동시킨다.
열이동 분석은 결합을 모니터링하는 것을 돕기 위한 방사성 표지된 화합물 또는 형광 또는 기타 염색소성 표지를 필요로 하지 않으므로 이 분석을 이용하는 것은 여러 잇점이 있다. 상기 분석은 모두는 아니더라도 많은 약물 표적 생물분자에 고유한 일반적인 물리적 화학적 과정인 생물 분자의 열풀림을 이용한다. 일반적인 적용성은 이 분석의 중요한 특성으로서, 이는 새로운 치료 수용체 단백질이 이용가능해질 때마다 새로운 분석법을 개발할 필요가 없기 때문이다.
또한, Tm과 리간드 결합 친화도의 비례성으로 인해, 열이동 분석을 이용하여, 10 μM 내지 1 nM 범위의 리간드 결합 친화도를 단일 웰 실험에서 측정할 수 있다. 따라서, 열이동 분석은 수용체 단독 및/또는 보조-조절인자의 존재하에서의 리간드 결합 친화도를 정량적으로 검출하는 데 이용될 수 있다.
또한, 열이동 분석은 리간드와 수용체 및 리간드, 수용체 및 보조-조절인자 사이의 Tm의 변화를 기초로 한 정량적 기준에서 아고니스트와 안타고니스트의 동정에 이용될 수 있다. 마이크로플레이트 열이동 분석은 단일 수용체에서의 다수 리간드 결합 사건을 수용체의 용융 온도의 증액적 또는 부가적 증가로서 측정하는 데 이용될 수 있다.
본 발명은 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 핵 수용체와 같은 핵 수용체에서 리간드의 동정 및 아고니스트 또는 안타고니스트로서 그러한 리간드의 동정에서 특히 유용하다.
예를 들어, 본 발명은 에스트로겐 수용체 패밀리의 두 서브타입인 ER-α와 ER-β의 리간드 결합 도메인과 상호작용하는 리간드를 동정하기 위해 이용될 수 있다. 이들 도메인은 두 개의 공지된 결합 부위를 함유하며, 하나는 에스트로겐 유사 화합물을 위한 부위이고 다른 하나는 보조-조절인자 단백질을 위한 부위이다. 본 발명은 에스트로젠 수용체와 상호작용하는 리간드를 동정하기 위해 이용될 수 있다. 이들 리간드는 리간드의 고유의 친화도에 비례하는 수용체의 안정성의 관찰된 증가를 생산한다.
핵 수용체 및 보조-조절인자 단백질의 리간드 결합 도메인은 에스케리치아 콜리에서 표준 재조합 방법을 이용하여 발현될 수 있다. 보조-조절인자 펩티드는 표준 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 관심의 정제 단백질의 용융 온도는 작은 분자 리간드의 부재 및 존재하에서 마이크로플레이트 열이동 분석에 의해 결정될 수 있다.
관심의 수용체를 안정화시키는 분자가 제공된다. 그러한 작은 분자는 전술한 대로 마이크로플레이트 열이동 분석에서의 스크리닝에 의해 얻어질 수 있다. 스크리닝에서 작은 분자의 수는 약 천개 내지 백만개 범위일 수 있다. 작은 분자는 천연 또는 합성일 수 있다.
일단 한 세트의 작은 분자가 관심 단백질을 안정화시키는 것으로 확인되면, 이들 분자를 단백질 또는 펩티드 단편과 같은 보조-조절인자 패널에 대하여 스크리닝하여 단백질의 열적 안정성에 대한 그들의 효과를 측정할 수 있다. 만일 상승적 효과가 관찰되면, 상기 화합물은 아고니스트 또는 안타고니스트로 분류될 수 있다. 평형 상수는 리간드와 보조-조절인자 둘다에 대해 계산되며, 생물학적 반응에 관련될 수 있다.
약물 유출/약물 소거의 조절의 결정
약물 선도화합물과 같은 분자에 의한 생체이물 대사 및 약물-대사 효소 활성의 아고니스트와 비아고니스트(안타고니스트 포함)의 동정 및 결정을 위한 방법이 개시되어 왔다. 전술한 스크리닝 방법과 개념은 모두 약물 유출 또는 약물 소거의 조절을 결정하는 데에 동등하게 적용가능하며, 그렇게 적용가능한 것을 목적으로 한다. 하기의 개시는 상기 방법의 예시이지만, 아고니스트 및 비아고니스트(안타고니스트 포함)의 상기의 설명 및 개념 및 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 핵 수용체에 대한 효과(및 생체이물 대사에 대한 결과적인 효과)는 약물 수송 단백질을 조절하는(약물 유출 또는 소거에 영향을 줌) 수용체에 대한 효과로 전달가능함이 이해되어야 한다.
약물 유출/약물 소거의 개념은 Schuetz & Strom, Nat.Med. 7:536-537 및 Synold et al., Nat.Med. 7:584-590에 개시된다. 이들 문헌은 그 전체가 참고로 통합된다.
예를 들어, 본 발명은 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대하여 분자를 스크리닝함으로써 약물 소거의 아고니스트를 동정하기 위해 이용될 수 있다. 수용체의 안정성을 변화시키고 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자는 약물 소거의 아고니스트로 동정될 수 있다.
또한, 약물 소거의 아고니스트는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대하여 분자를 스크리닝함으로써 결정될 수 있다. 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 보조-활성인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자는 약물 소거의 아고니스트로 동정될 수 있다.
약물 선도화합물의 약물 유출의 활성에 대한 효과는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 약물 선도화합물을 스크리닝함으로써 결정될 수 있다. 약물 선도화합물과 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 안정성의 추가 변화가 있는 지 여부는 상기 약물 선도화합물이 약물 유출의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타낸다.
또한, 약물 선도화합물의 약물 유출의 활성에 대한 효과는 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 상기 약물 선도화합물을 스크리닝함으로써 결정될 수 있다. 약물 선도화합물 및 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동이 있는 지 여부는 상기 약물 선도화합물이 약물 유출의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타낸다.
또한, 생체이물 대사 및/또는 약물 소거에 대한 분자의 효과는 본 발명을 이용하여 결정될 수 있다. SXR 수용체가 사이토크롬 P450 발현과 약물 수송 단백질을 조절함으로써 약물 이화작용을 조절함이 보고되었다. 본 발명 방법은 SXR 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-조절인자 존재시 수용체의 안정성을 더 변화시키는 그 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함한다. 상기 분자 및 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 하나의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성의 추가 변화는 상기 분자가 생체이물 대사 및/또는 약물 소거의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 나타낸다.
생체이물 대사 및/또는 약물 소거에 대한 분자의 효과는 또한 SXR 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝함으로써 결정될 수 있다. 상기 분자 및 보조-조절인자의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동은 상기 분자가 생체이물 대사 및/또는 약물 소거의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 나타낸다.
사이토크롬 P450 발현과 약물 수송 단백질을 조절하는 수용체의 리간드 결합 도메인, 이 도메인과 상호작용하는 리간드 및 보조-조절인자가 개시됨에도 불구하고, 본 발명은 추가의 조절인자의 존재하에서 그리고 마지막으로는 DNA의 존재하에서의 전길이 단백질로 연장될 수 있다.
또한, 이들 연구는 단백질-단백질 상호작용에 한정되지 않을 뿐만 아니라, 관심 단백질과 우선적으로 상호작용하는 단백질 도메인을 나타내는 짧은 선형 서열을 나타내는 펩티드와 단백질의 상호작용을 위해 이용될 수 있다.
본 발명을 일반적으로 설명하였으므로, 본 발명은 하기의 구체적인 실시예를 참고하여 더욱 쉽게 이해될 것이며, 하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 여기에 포함되며 달리 특정되지 않으면 제한을 의도하지 않는다.
핵 수용체를 위한 실험 결과
보조-활성인자의 존재하에서 아고니스트 반응 대 안타고니스트 반응에 대해 예상되는 실험 결과는 도 1과 2에 나타난다. 아고니스트 리간드의 경우 및 보조-활성인자 단백질/펩티드의 존재하에서, 예측은 수용체의 안정성 증가(도 1)인 한편, 안타고니스트의 경우, 추가의 안정화는 관찰되지 않을 것이다(도 2).
실시예 1
표 1은 보조-활성인자 단백질 SRC-3의 존재하에서; 보조-활성인자 SRC-1 및 SRC-3의 서열로부터 유래된 2 개의 보조-활성인자 펩티드 SRC1-NR2와 SRC3-NR2의 존재하에서; 및 보조-억제인자 NCoR-1로부터 유래된 보조-억제인자 펩티드 NCoR-1의 존재하에서 4 개의 공지 아고니스트와 3 개의 공지 안타고니스트 패널의 연구에 대해 ER-α와 ER-β에 대해 얻어진 데이터의 요약이다.
모든 실험에서 ER-α와 ER-β의 농도는 8 μM이고, 리간드 농도는 20 μM이고, SRC-3는 11 μM이고, 보조-조절인자 펩티드 SRC1-NR2, SRC3-NR2, 및 NCoR-1은 100 μM이었다. 실험은 25 mM 인산염 pH 8.0, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 25 μM 다폭실 설폰아미드 염료의 존재하에서(Molecular Probes, Inc.,Eugene, OR에서 판매) 실시되었다.
최종 농도의 2배의 2 ㎕ 리간드 용액을 마이크로피펫을 이용하여 384 웰 흑색 벽 그레이너 플레이트내로 분배하였다. 이어서, 단백질 염료 용액 2 ㎕를 384 웰 플레이트내의 리간드 용액의 상부에 분배하였다. 플레이트를 회전시켜 단백질-염료와 리간드 용액의 혼합을 확실히 하고 이어서 1 ㎕ 의 실리콘 오일을 덮어서 샘플 가열동안 증발을 방지하였다. Thermofluor 장치(미국 특허 제6,202,141호, 제6,036,920호, 제6,291,191호, 제6,268,218호, 제6,232,085호, 제6,268,158호, 제6,214,293호, 제6,291,192호 및 제6,303,322호 참고)에서 데이터를 수집하고 비선형 최소 제곱 피팅 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 하기에 열거된 결과는 네번의 실험의 평균이다. 보조-조절인자를 위한 값은 수용체-리간드 △Tm 값으로부터 Tm 안정화의 변화를 나타낸다.
리간드와 보조-활성인자 단백질 SRC-1과 SRC-3의 존재하에서 ER-α의 관찰된△Tm 안정화
SRC-3 SRC1-1 NR2 SRC3-NR2 NCoR1-NR1
ER-α 0.0 1.5 0.8 0.9 0.0
에스트라디올 14.8 3.8 4.9 4.3 0.0
에스트론 7.7 3.5 3.0 2.3 -0.3
17-α-에틸렌-E2 15.5 4.5 4.5 3.9 -0.1
2-메톡시-E2 3.5 5.3 5.5 4.3 -0.7
타목시펜 8.5 1.1 -0.5 0.0 0.1
4-OH-타목시펜 17.7 0.2 0.2 0.7 0.1
ICI-182780 13.9 0.5 0.2 0.2 -0.6
ER-β 0.0 0.9 0.7 0.9 -0.4
에스트라디올 17.5 1.7 3.4 3.5 0.0
에스트론 11.3 1.6 3.8 3.7 -0.3
17-α-에틸렌-E2 15.3 2.6 2.6 2.6 -0.7
2-메톡시-E2 2.9 2.5 4.4 4.4 -0.7
타목시펜 9.8 1.3 0.2 0.4 0.4
4-OH-타목시펜 18.2 1.2 0.2 0.8 0.3
ICI-182780 16.7 0.9 0.4 0.6 0.3
상기 결과로부터, 에스트로겐-형 화합물의 존재하에서 보조-활성인자 단백질/펩티드의 존재하에서의 카운터-스크리닝으로부터, 두 수용체 모두에 대해 추가 안정화가 관찰되었다. 따라서, 이들 화합물은 문헌과 일치하게 아고니스트처럼 작용한다. 타목시펜과 ICI 화합물은 공지된 안타고니스트이며 이들은 보조-활성인자를 보충하는 능력이 없다. 이것 또한 문헌과 일치한다.
실시예 2
표 2는 보조-활성인자 SRC-1의 서열에서 유래한 보조-활성인자 펩티드 SRC1-NR2의 존재하에서; 그리고 보조-억제인자 NCoR-1에서 유래한 보조-억제인자 펩티드 NCoR-1의 존재하에서 공지의 스테로이드와 약물 리간드 패널의 연구에 대해 SXR에 대해 얻어진 데이터의 요약이다.
모든 실험에서 SXR의 농도는 6 μM이었으며, 리간드 농도는 50 μM이었으며, 보조-조절인자 펩티드 SRC1-NR2 및 NCoR-1은 100 μM이었다. 실험은 25 mM HEPES pH 7.9, 200 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 25 μM 다폭실 설폰아미드 염료의 존재하에서(Molecular Probes, Inc.,Eugene, OR에서 판매) 실시되었다.
최종 농도의 2배의 2 ㎕ 리간드 용액을 마이크로피펫을 이용하여 384 웰 흑색 벽 그레이너 플레이트내로 분배하였다. 이어서, 단백질 염료 용액 2 ㎕를 384 웰 플레이트내의 리간드 용액의 상부에 분배하였다. 플레이트를 회전시켜 단백질-염료와 리간드 용액의 혼합을 확실히 하고 이어서 1 ㎕ 의 실리콘 오일을 덮어서 샘플 가열동안 증발을 방지하였다. Thermofluor 장치(미국 특허 제6,202,141호, 제6,036,920호, 제6,291,191호, 제6,268,218호, 제6,232,085호, 제6,268,158호, 제6,214,293호, 제6,291,192호 및 제6,303,322호 참고)에서 데이터를 수집하고 비선형 최소 제곱 피팅 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 하기에 열거된 결과는 네번의 실험의 평균이다. 보조-조절인자를 위한 값은 수용체-리간드 △Tm 값으로부터 Tm 안정화의 변화를 나타낸다. 예를 들어, Hugh D.Young, Statistical Treatment of Experimental Data (1962); White, Robert S.,Statistics (1989); Pitman, Jim, Probabaility(1993); 및 Brown, Byron W.,Statistics, A Biomedical Inroduction (1977)를 참고한다.
리간드와 보조-활성인자 펩티드 SRC1-NR2 및 보조-억제인자 펩티드 NCoR-1의 존재하에서 SXR의 관찰된 안정화
리간드 ΔTm 리간드 ΔΔTm SRC1-NR2 ΔΔTm NcoR1-NR2
리간드 없음 - 2.9 6.7
택솔 1.3 2.5 4.7
콜티손 1.8 2.9 3.6
4-안드로스텐 4.3 2.9 3.6
하이드로콜티손 1.6 3.3 3.7
안드로스테론 3.3 3.5 3.8
17-α-하이드록시프로게스테론 1 3.3 3.5
클로피브레이트 1.3 3.3 3.4
에스트라디올 2.3 3.9 2.3
리토콜산 2.4 2.9 1.4
로바스타틴 6.3 3.0 1.2
콜티코스테론 5.0 2.7 0.5
11-α-하이드록시-프로게스테론 6.3 4.6 1.0
도 3은 주어진 리간드를 위한 보조-조절인자 펩티드의 존재하에서 수용체의 안정성의 관찰된 변화로부터 유래된 친화도으로부터 계산된, 활성화된 배열로 수용체가 있을 통계적 확률의 계산치를 예시한다(△△Tm 값은 표 2로부터 온다).
표 2와 도 3으로부터 하기를 결론지을 수 있다:
a) 모든 생체이물 리간드와 스테로이드는 보조-활성인자와 보조-억제인자 펩티드의 보충에 다르게 영향을 준다.
b) 모든 리간드는 택솔을 제외하고는 보조-활성인자 펩티드를 더욱 효과적으로 보충한다(SRC1-NR2를 위한 △△Tm 값은 표 2로부터 온다).
c) 리간드 없는 수용체보다 더 효율적으로 보조-억제인자 펩티드를 보충하는 화합물은 없다(NCoR1-NR1을 위한 △△Tm 값은 표 2로부터 온다).
SXR 리간드를 위한 계산된 친화도 및 공지의 약리학적 반응에 대한 아고니스트 상태의 통계적 확률의 관계
리간드 Ka 리간드(nM) 확률 아고니스트 배수 활성화 EC50(nM)
택솔 23000 0.18 5000
콜티손 13000 0.37 활성화 없음
4-안드로스텐 2000 0.38
하이드로콜티손 17000 0.44
안드로스테론 4100 0.45
17-α-하이드록시프로게스테론 33000 0.47 1.5 배
클로피브레이트 23000 0.49
에스트라디올 8700 0.76 3-배
리토콜산 8300 0.8 9000
로바스타틴 550 0.85 5-배
콜티코스테론 1320 0.93 12 배
11-α-하이드록시-프로게스테론 550 0.96
컬럼 4와 5로부터의 데이터는 Ekins & Erickson, Drug Metabolism and Disposition, 30, 96-99, 2003 및 그안의 참고문헌으로부터 얻어졌다.
표 3의 데이터로부터 하기를 결론짓는다:
a) 시험된 모든 리간드는 SXR의 기본적인 생물학적 상태를 동요시킬 것이다.
b) 아고니스트 상태의 확률은 문헌으로부터의 화합물의 서브세트를 위해 보고된 배수 활성화에 상관된다.
c) P450의 유도에 대한 이들 화합물의 생물학적 효과는 수용체에 대한 상기 화합물의 친화도 및 수용체가 보조-활성인자와 보조-억제인자를 구별하는 능력 둘다에 의존할 것이다.
따라서 수용체에 대한 높은 친화도(약 5 μM 이하의 결합 친화도) 및 아고니스트 상태의 높은 확률(아고니스트 상태의 통계적 확률이 약 0.8 내지 약 1.0)을 갖는 화합물은 P450 발현의 강한 유도물질일 것이며, 중간 아고니스트 확률(약 0.4 내지 약 0.8의 아고니스트 상태의 통계적 확률)은 P450의 약한 유도물질로 나타날 것이며, 낮은 아고니스트 확률을 갖는 것들(아고니스트 상태의 통계적 확률이 약 0.0 내지 약 0.4)은 비활성으로 나타날 것이다. 한편, 아고니스트 상태의 높은 또는 중간 확률(약 0.4 내지 약 1.0의 아고니스트 상태의 통계적 확률)을 갖는 약하게 상호작용하는 화합물(약 5 μM 이상의 결합 친화도)은 P450 발현의 약한 유도물질로 나타날 것이며, 아고니스트 상태의 낮은 확률(약 0.0 내지 약 0.4의 아고니스트 상태의 통계적 확률)을 갖는 것은 비활성으로 나타날 것이다.
실시예 1에서 상기에 나타난 결과는 핵 수용체 ER-α와 ER-β의 아고니스트와 안타고니스트를 동정하기 위하여 본 발명이 어떻게 이용될 수 있는지를 보여준다. 실시예 2로부터의 결과는 SXR의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 리간드를 스크리닝함으로써 약물-대사 효소/생체이물 대사 또는 약물 소거에 대한 그들의 효과에 대해 약물 후보 또는 약물 선도화합물과 같은 분자를 동정하기 위해 본 발명이 어떻게 이용될 수 있는지를 보여준다. 동일한 방식으로, 본 발명은 사이토크롬 P450 발현 또는 약물 수송 단백질을 각각 조절하는 핵 수용체인 Ah/XRE, CAR 및 PPAR-α 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 리간드를 스크리닝함으로써 약물-대사 효소/생체이물 대사 또는 약물 소거에 대한 그들의 효과에 대해 약물 후보 또는 선도화합물과 같은 분자를 동정하기 위해 이용될 수 있다.
미국 특허 제6,202,141호, 제6,036,920호, 제6,291,191호, 제6,268,218호, 제6,232,085호, 제6,268,158호, 제6,214,293호, 제6,291,192호 및 제6,303,322호(Thermofluor(등록상표))에 개시된 열이동 분석은 사이토크롬 P450 발현 또는 약물 수송 단백질의 조절에 관여하는 핵 수용체에의 스테로이드 또는 생체이물 결합에 수반되는 용융 온도의 변화를 측정할 수 있다. 열이동 분석은 이어서 리간드가 결합한 핵 수용체에의 보조활성인자 또는 보조억제인자 단백질의 결합 도메인의 결합의 추가 효과를 결정할 수 있다.
시스템에 대한 생체이물의 효과는 하기와 같이 이루어질 수 있다: 먼저, 여러 테스트 시약을 사이토크롬 P450 발현 또는 약물 수송 단백질을 조절하는 핵 수용체에 결합하고 그 용융 온도를 변화시키는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 이어서, 보조활성인자와 보조억제인자 단백질의 결합 도메인이 상기 복합체의 용융 온도를 더 이동시키는 능력을 테스트할 수 있다(펩티드 단편이 치환될 수 있음). 효과의 패턴에 기초하여, 약물 대사 효소 또는 약물 유출의 발현 수준에서의 변화를 예측할 수 있다.
보조활성인자 단백질이 상기 복합체의 열적 안정성에 첨가되면, 생체이물은 P450 효소 또는 약물 수송 단백질의 발현을 각각 자극하는 아고니스트로 예측된다. 만일 보조억제인자 도메인이 이중 복합체에 결합하면, 생체이물은 각각 P450 발현 또는 약물 수송 단백질의 안타고니스트로 예측된다. 만일 생체이물이 핵 수용체에 결합하지 않으면, 상기 화합물은 P450 효소 또는 약물 수송 단백질의 발현에 각각 영향을 주지 않는 것으로 예측될 것이다. 따라서, 열이동 분석은 약물 후보 또는 생체이물에 의해 야기된 약물의 소거 또는 약물 대사 효소의 수준의 변화를 예측하기 위해 이용될 수 있다.
Schuetz & Strom, Nat.Med.7:536-537 및 Synold et al., Nat.Med.7:584-590은 SXR(PXR로도 알려짐)이 생체이물 대사를 조절하며, 또한 단백질 P-당단백질을 암호하는 유전자 MDR1의 발현을 활성화시킴으로써 약물 유출을 조절함을 보고한다.
전술한 방법에 의해, 생체이물이 생체이물 대사 및/또는 약물 유출에 대해 어떤 효과를 갖는 지를 결정하기 위해, 보조-활성인자 및 보조-억제인자 단백질의 존재하에서 수용체의 열풀림 곡선에 대한 생체이물의 효과를 결정하기 위하여 SXR, Ah/XRE, CAR 및 PPAR-α 수용체를 스크리닝할 수 있다.
상기에서 언급된 모든 문헌과 특허는 참고로 그 전체가 여기에 통합된다. 또한, 본 출원에서 단수는 단수와 복수, 즉 하나 또는 그 이상을 포함하는 것이다.
발명이 명확히 이해되도록 하기 위하여 본 발명을 상세히 설명하였지만, 당업자는 본 개시를 읽음으로써 본 발명의 범위와 첨부된 청구항으로부터 벗어남없이 형태 및 상세 사항에 변화가 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (70)

  1. (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대하여 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 상기 약물 선도화합물 및 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서의 상기 수용체의 안정성의 추가 변화가 상기 약물 선도화합물이 약물-대사 효소의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타내는, 약물-대사 효소의 활성에 대한 약물 선도화합물의 효과를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계가 상기 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 다수의 상이한 분자 중 하나 이상을 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 다수의 상이한 분자 중 하나 이상의 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450을 조절하는 상기 수용체와 하나 이상의 분자를 다수의 용기 각각에서 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) 상기 다수 분자중 임의 분자의 부재하에서의 상기 표적 분자에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 다수 분자 중 임의 분자가 상기 수용체의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 변화는 상기 풀림 곡선의 변화로 나타내지는 단계.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 약물 선도화합물을 다수의 용기 각각에서 상기 보조-조절인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1)상기 약물 선도화합물 및/또는 (2) 상기 보조-조절인자의 부재하에서의 상기 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 약물 선도화합물이 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  5. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조-조절인자가 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 비-아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 비-아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  10. (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대하여 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 상기 약물 선도화합물 및 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서의 상기 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동이 상기 약물 선도화합물이 약물-대사 효소의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타내는, 약물-대사 효소의 활성에 대한 약물 선도화합물의 효과를 결정하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계가 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 다수의 상이한 분자 중 하나 이상을 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 다수의 상이한 분자 중 하나 이상의 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450의 발현을 조절하는 상기 수용체와 하나 이상의 분자를 다수의 용기 각각에서 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선; 및/또는 (ii) 상기 다수 분자중 임의 분자의 부재하에서의 상기 표적 분자를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 다수 분자 중 임의 분자가 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는지 여부를 결정하는 단계.
  13. 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 약물 선도화합물을 다수의 용기 각각에서 상기 보조-조절인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1)상기 약물 선도화합물 및/또는 (2) 상기 보조-조절인자의 부재하에서의 상기 수용체를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 약물 선도화합물이 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는지 여부를 결정하는 단계.
  14. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조-조절인자가 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자를 포함하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 비-아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 비-아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  19. 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 수용체의 안정성을 변화시키고 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자가 생체이물 대사의 아고니스트로 동정되는, 생체이물 대사의 아고니스트를 동정하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 분자를 다수의 용기 각각에서 상기 보조-활성인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1) 상기 분자 및/또는 (2) 상기 보조-활성인자의 부재하에서의 상기 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  21. 제19항에 있어서, 상기 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  22. 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자가 생체이물 대사의 아고니스트로 동정되는, 생체이물 대사의 아고니스트를 동정하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 분자를 다수의 용기 각각에서 상기 보조-활성인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1) 상기 분자 및/또는 (2) 상기 보조-활성인자의 부재하에서의 상기 수용체를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  24. 제22항에 있어서, 상기 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  25. 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 수용체의 안정성을 변화시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는, 생체이물 대사의 비-아고니스트를 동정하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450을 조절하는 상기 수용체와 하나 이상의 분자를 다수의 용기 각각에서 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) 상기 다수 분자중 임의 분자의 부재하에서의 상기 표적 분자에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  27. 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는, 생체이물 대사의 비-아고니스트를 동정하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450을 조절하는 상기 수용체와 하나 이상의 분자를 다수의 용기 각각에서 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) 상기 다수 분자중 임의 분자의 부재하에서의 상기 표적 분자를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 열풀림 곡선을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계.
  29. 하기의 단계를 포함하는 생체이물 대사의 비-아고니스트를 동정하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 다수 분자 중 하나 이상을 스크리닝하며, 이때 상기 수용체의 안정성을 변화시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 상기 수용체의 안정성을 변화시키는 단계 (a)로부터의 분자를 스크리닝하며, 이때 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계.
  30. (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 다수 분자 중 하나 이상을 스크리닝하는 단계로서, 이때 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키지 않는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 단계 (a)로부터의 분자를 스크리닝하는 단계로서, 이때 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자는 생체이물 대사의 비-아고니스트로 동정되는 단계
    를 포함하는 생체이물 대사의 비-아고니스트를 동정하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 스크리닝 단계 (b)가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 분자를 다수의 용기 각각에서 상기 보조-활성인자 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1) 상기 분자 및/또는 (2) 상기 보조-활성인자의 부재하에서의 상기 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  32. 제30항에 있어서, 상기 비-아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  33. 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 분자가 약물 소거의 아고니스트로 동정되는, 약물 소거의 아고니스트를 동정하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 분자를 다수의 용기 각각에서 상기 보조-활성인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1) 상기 분자 및/또는 (2) 상기 보조-활성인자의 부재하에서의 상기 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  35. 제33항에 있어서, 상기 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  36. 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 분자가 약물 소거의 아고니스트로 동정되는, 약물 소거의 아고니스트를 동정하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 분자를 다수의 용기 각각에서 상기 보조-활성인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1) 상기 분자 및/또는 (2) 상기 보조-활성인자의 부재하에서의 상기 수용체를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 분자가 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는지 여부를 결정하는 단계.
  38. 제36항에 있어서, 상기 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  39. 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계, 및 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대하여 상기 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계를 포함하며, 상기 약물 선도화합물 및 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서의 상기 수용체의 안정성의 추가 변화가 상기 약물 선도화합물이 약물 유출의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타내는, 약물 유출의 활성에 대한 약물 선도화합물의 효과를 결정하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 수용체의 안정성을 변화시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계가 다수의 상이한 분자 중 하나 이상을 상기 수용체의 안정성을 변화시키는 능력에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 다수의 상이한 분자 중 하나 이상의 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450의 발현을 조절하는 상기 수용체와 하나 이상의 분자를 다수의 용기 각각에서 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) 상기 다수 분자중 임의 분자의 부재하에서의 상기 표적 분자에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 다수 분자 중 임의 분자가 상기 수용체의 안정성을 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 변화는 상기 풀림 곡선의 변화로 나타내지는 단계.
  42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 약물 선도화합물을 다수의 용기 각각에서 상기 보조-조절인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 처리하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 풀림 곡선 각각을 (i) 다른 풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1)상기 약물 선도화합물 및/또는 (2) 상기 보조-조절인자의 부재하에서의 상기 수용체에 대한 풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 약물 선도화합물이 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하는 단계로서, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화로 나타내지는 단계.
  43. 제39항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조-조절인자가 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자를 포함하는 방법.
  44. 제39항에 있어서, 상기 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  46. 제39항에 있어서, 상기 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 비-아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 비-아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  48. (a) 약물 수송 단백질의 발현을 조절하는 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계; 및
    (b) 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대하여 상기 약물 선도화합물을 스크리닝하는 단계
    를 포함하며, 상기 약물 선도화합물 및 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서의 상기 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동이 상기 약물 선도화합물이 약물 유출의 활성을 증가시키는 지 여부를 나타내는, 약물 유출의 활성에 대한 약물 선도화합물의 효과를 결정하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 약물 선도화합물을 제공하는 단계가 다수의 상이한 분자 중 하나 이상을 상기 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키는 능력에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 다수의 상이한 분자 중 하나 이상의 스크리닝 단계가 하기 단계를 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450을 조절하는 상기 수용체와 하나 이상의 분자를 다수의 용기 각각에서 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) 상기 다수 분자중 임의 분자의 부재하에서의 상기 표적 분자를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 다수 분자 중 임의 분자가 열풀림 곡선을 이동시키는지 여부를 결정하는 단계.
  51. 제48항 또는 제50항에 있어서, 상기 스크리닝 단계가 하기 단계를 더 포함하는 방법:
    (a) 사이토크롬 P450 발현을 조절하는 상기 수용체와 상기 약물 선도화합물을 다수의 용기 각각에서 상기 보조-조절인자 중 하나 이상과 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 다수의 용기 각각 내의 상기 수용체를 가열하여 상기 수용체가 풀리도록 하는 단계;
    (c) 상기 용기 각각에서 상기 수용체의 열풀림과 관련된 물리적 변화를 측정하는 단계;
    (d) 상기 용기 각각에 대해 상기 수용체에 대한 열풀림 곡선을 생성하는 단계;
    (e) 단계 (d)의 상기 열풀림 곡선 각각을 (i) 다른 열풀림 곡선 각각; 및/또는 (ii) (1)상기 약물 선도화합물 및/또는 (2) 상기 보조-조절인자의 부재하에서의 상기 수용체를 위한 열풀림 곡선과 비교하는 단계; 및
    (f) 상기 약물 선도화합물이 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는지 여부를 결정하며, 이때 안정성의 추가 변화는 상기 풀림 곡선의 추가 변화에 의해 나타내지는 단계.
  52. 제48항에 있어서, 상기 하나 이상의 보조-조절인자가 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자를 포함하는 방법.
  53. 제48항에 있어서, 상기 분자가 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  55. 제48항에 있어서, 상기 분자가 보조-억제인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시켜 보조-활성인자의 존재하에서 상기 수용체의 비-아고니스트로서 상기 리간드를 동정하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 비-아고니스트가 부분 아고니스트인 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체가 SXR 또는 PXR인 방법.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용체가 Ah, XRE, CAR, 또는 PPAR-α인 방법.
  59. SXR 수용체의 안정성을 변화시키고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성을 더 변화시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 분자와 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 안정성의 추가 변화는 상기 분자가 생체이물 대사 및/또는 약물 소거의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 나타내는, 생체이물 대사 및/또는 약물 소거에 대한 분자의 효과를 결정하는 방법.
  60. SXR 수용체의 열풀림 곡선을 이동시키고 하나 이상의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선을 더 이동시키는 능력에 대해 분자를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이때 상기 분자와 상기 하나 이상의 보조-조절인자 중의 보조-조절인자의 존재하에서 상기 수용체의 열풀림 곡선의 추가 이동이 상기 분자가 생체이물 대사 및/또는 약물 소거의 아고니스트 또는 안타고니스트인지 여부를 나타내는, 생체이물 대사 및/또는 약물 소거에 대한 분자의 효과를 결정하는 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 보조-조절인자가 보조-활성인자 및/또는 보조-억제인자인 방법.
  62. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 보조-조절인자 의존성 수용체를 위한 아고니스트가 강한 유도물질(inducer)인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 강한 유도물질이 11-α-하이드록시프로게스테론인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 강한 유도물질이 약 5 μM 미만의 결합 친화도 및 약 0.8 내지 약 1.0의 아고니스트 상태의 통계적 확률을 갖는 방법.
  65. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 보조-조절인자 의존성 수용체의 부분 아고니스트가 약한 유도물질인 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 약한 유도물질이 약 5 μM 미만의 결합 친화도 및 약 0.4 내지 약 0.8의 아고니스트 상태의 통계적 확률을 갖는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 약한 유도물질이 약 5 μM 이상의 결합 친화도 및 약 0.4 내지 약 1.0의 아고니스트 상태의 통계적 확률을 갖는 방법.
  68. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 보조-조절인자 의존성 수용체의 아고니스트가 비-유도물질인 방법.
  69. 제제제제서, 상기 비-유도물질이 약 5 μM 미만의 결합 친화도 및 약 0.4 미만의 아고니스트 상태의 통계적 확률을 갖는 방법.
  70. 제65항에 있어서, 상기 비-유도물질이 약 5 μM 이상의 결합 친화도 및 약 0.4 미만의 아고니스트 상태의 통계적 확률을 갖는 방법.
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