KR20050024361A - 아르기닌 결핍에 의한 인간 악성 종양의 치료제 및 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 환자에서 적당한 아르기닌 결핍(Adequate Arginine Depletion)을 유지할 수 있을 정도로 충분히 높은 효소 활성과 안정성을 갖는 분리되고 실질적으로 정제된 재조합 인간 아르기네이즈를 제공한다. 또한, 본 발명은 변형된 본 발명의 효소를 함유하는 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 사용하는 질병의 치료 방법을 제공한다.

Description

아르기닌 결핍에 의한 인간 악성 종양의 치료제 및 치료 방법{PHARMACEUTICAL PREPARATION AND METHOD OF TREATMENT OF HUMAN MALIGNANCIES WITH ARGININE DEPRIVATION}

본 발명은 아르기네이즈(arginase)를 함유하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 환자의 아르기닌 농도를 감소시킬 수 있는 약학 조성물 및 이의 인간 악성 종양 치료를 위한 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

아르기네이즈 I [EC 3.5. 3.1; L-아르기닌 아미디노하이드로라아제 (L-arginine amidinohydrolase)]는 아르기닌을 오르니틴과 요소(urea)로 변환시키는 요소 회로에서의 요소 형성의 최종 단계를 촉매하는 중요한 포유류 간 효소이다. 아르기네이즈를 고함량으로 포함하는 래트의 간 추출물이 우연히 종양 세포 배양 배지에 첨가되었을 때 생체외(in vitro)적으로 항 종양 특성을 갖는다는 것을 발견하였다 (Burton 등, 1967, Cytolytic action of corticosteroids on thymus and lymphoma cells in vitro. Can J. Biochem. 45, 289-297). 후속 실험에 의하여, 효소의 항 종양 특성이 상기 배양 배지의 필수적인 아미노산인 아르기닌의 결핍에 기인한다는 것이 밝혀졌다. 아르기닌의 농도가 8 μM 보다 낮은 경우, 암 세포에서 회복 불가능한 세포 사멸이 일어났다 (Storr & Burton, 1974, The effects of 아르기닌 deficiency on lymphoma cells. Br. J. Cancer 30,50-59).

아르기닌의 보다 새로운 측면은, 신경 전달 물질, 평활근 이완제 및 혈관 확장제(vasodilator)로서 작용하는 효과적인 신호 전달(signalling) 분자인 질소 산화물 (NO)의 합성을 위한 직접적인 전구체로의 역할에 초점이 맞추어 졌다. NO의 생합성은 질소 산화물 신타아제 (nitric oxide synthase, NOS)에 의하여 촉매되는 Ca⁺⁺, NADPH 의존성 반응을 수반한다. 아르기닌의 또 다른 알려진 역할은, 오르니틴을 거쳐서, 세포 증식 및 성장을 포함하는 다양한 생리적 과정에 관여하는 폴리아민, 스페르미딘(spermidine) 및 스페르민(spermine)의 전구체로서 작용하는 것이다 (Wu & Morris, 1998, 아르기닌 metabolism: nitric oxide and beyond. Biochem. J. 336,1-17).

아르기닌은 또한 질소 산화물 신타아제 (NOS)를 포함하는 몇 가지 중요한 효소의 기질로서 사용된다. NOS의 종류에는 nNOS, eNOS 및 iNOS의 세 가지 종류가 있는데, 이들은 모두 아르기닌을 질소 산화물과 시트룰린으로 변환시킨다. NO에 의해서 유발되는 안면 홍조 (facial flushes)는 뉴런형 NOS인 nNOS를 통하여 매개된다. 유도성 NOS인 iNOS는 대식 세포(macrophages)에 의하여 생산되며, 패혈증(septicaemia) 동안에 아르기닌으로부터 이와 같이 생산된 NO는 내독소성(endotoxic) 쇼크에서의 혈관 확장을 유발한다. 내피성(endothelial) NOS인 eNOS는 혈관 내피 세포에 의하여 생산된다. 이는 아르기닌을 NO로 변환시키고, cGMP 메카니즘을 통하여 내피 표면에서의 혈소판의 탈응집(de-aggregation)을 유발한다. 국부적 내피층(endotherial lining)에서 eNOS로부터 생산된 NO는 약 5 초 정도의 반감기 및 약 2 마이크론 정도의 확산 거리를 갖는다.

이들 효소의 생산은 각각 12번, 17번 및 7번 염색체에서 코딩되는 상이한 NOS 유전자들((NOS1, NOS2, NOS3)에 의하여 조절된다. 이들 유전자들은 엑손의 크기 및 스플라이스 정션(junction)에 있어서 매우 유사한 유전자 구조를 공유한다.

최근, 영국 스코틀랜드의 한 연구 단체가 생체외에서의 아르기닌 고갈의 항종양 활성을 확인하였다 [Scott 등, 2000, Single amino acid (arginine) deprivation: rapid and selective death of cultured transformed and malignanat cells. Br. J. Cancer 83, 800-810; Wheatley 등, 2000, Single amino acid (arginine) restriction: Growth and Death of cultured HeLa and Human Diploid Fibroblasts. Cellular Physiol. Biochem.10, 37-55]. 유방암, 결장 직장암, 폐암, 전립선암 및 난소암과 같은 일반적인 암을 포함하는 테스트된 24 개의 상이한 종양 세포주 중에서, 모두가 아르기닌 고갈 5일 이내에 사멸하였다. 상기 단체는, 유세포 분석법(flow-cytometry)을 사용하여, 정상 세포주가 어떠한 뚜렷한 손상 없이 세포 주기의 G0기에서 최대 수 주일동안 정지된 상태(quiescence)에 들어간다는 것을 보여줄 수 있었다. 그러나, 종양 세포는 G1기의 "R" 점을 통과하여 아르기닌이 결핍된 S기로 진입한다. 비대체적(irreplaceable)인 아미노산인 아르기닌이 없는 경우, 단백질 합성이 혼란된다. 일부 세포주는 아포토시스(apoptosis)로 사멸하는 것으로 나타났다. 보다 흥미로운 것은, 반복되는 고갈에 의하여 발현되는 "내성" 없이 종양 사멸을 일으킬 수 있다는 것이다 [Lamb 등, 2000, Single amino acid (arginine) deprivation induces Gl arrest associated with inhibition of Cdk4 expression in cultured human diploid fibroblasts. Experimental Cell Research 225, 238-249].

이와 같은 유력한 생체외 데이터에도 불구하고, 아르기닌 고갈을 이용하여 생체내(in vivo)에서 암을 치료하려는 시도는 성공적이지 않았다. 원래 스토르 단체는 복막내 간 추출물을 사용하여 종양을 앓고 있는 래트의 치료를 시도하였으나, 성공하지 못했다 (Storr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency on lymphoma cells. Br. J. Cancer 30,50-59). 현재, 정상적인 생리 조건하에서, 혈장 아르기닌 농도가 근육을 주요 조절자로 하여 정상 범위 (100 - 120 μM) 사이를 유지하고, 이는 실제 다른 아미노산의 농도에서도 또한 마찬가지인 것으로 알려져 있다. 아미노산 결핍에도 불구하고, 세포내 단백질 파괴 경로가 활성화되어 프로테아좀 및 리소좀에서 아미노산이 상기 회로로 방출된다 (Malumbres &Barbacid, 2001, To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer. Nature Reviews, 1,222-231). 이러한 아미노산 항상성 메카니즘은 다양한 아미노산의 농도를 일정한 범위로 유지시킨다. 따라서, 다양한 물리적 방법 또는 아르기닌 퇴화 효소를 사용하여 아르기닌을 고갈시키려는 이전의 시도는 체내 아미노산 항상성 메카니즘 때문에 실패한 것이다.

체내 자연적인 항상성 경향과 관련된 문제점을 극복하기 위하여, Tepic 등은 미국 특허 제6,261,557호에서 체내 근육이 고갈된 아르기닌을 보충하는 것을 방지하기 위하여 아르기닌 분해 효소를 인슐린과 같은 단백질 파괴 억제제와 조합하여 사용하는 암 치료 조성물 및 치료 방법을 개시하였다.

인슐린이 단백질 파괴 억제제로서 작용할 수 있지만, 이는 또한, 인체에 대하여, 환자의 혈당 수치가 협소한 정상 범위 내에서 정확하게 유지되지 않는 경우 치명적인 문제를 야기할 수 있는 광범위한 생리학적 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명의 목적은 암 치료를 위한 개선된 방법 및 조성물을 개발하는 것이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명의 한 측면은 80 내지 100 %의 순도를 갖는 실질적으로 순수한 분리된 재조합 인간 아르기네이즈 I[이하, 기재의 편의상 다른 언급이 없는 한 "아르기네이즈(Arginase)"라 함]을 제공하는 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 아르기네이즈는 90 내지 100%의 순도를 갖는다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따른 아르기네이즈는 적어도 99% 이상의 순도를 갖는다. 하기하는 실시예에 있어서, 상기 아르기네이즈는 SDS-PAGE 분리 후의 농도 측정 트레이싱(densitometry tracing)에 기초하여 99.9% 이상의 순도를 갖는다.

다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 아르기네이즈는 환자에서 적어도 3일 동안 "적절한 아르기닌 결핍 (adequate arginine deprivation)" (이하, "AAD"라 함)을 유지하기에 충분히 높은 효소 활성과 안정성을 갖도록 변형된다. 바람직한 변형 방법 중 하나는 6 개의 히스티딘의 아미노 말단 표지(amino-terminal tag)이다. 다른 바람직한 변형은 효소의 안정성을 증가시키고 환자에 의하여 거기에 일리사이팅된(illicited) 면역 반응성을 최소화시키는 PEG화(pegylation)이다. 하기하는 실시예에 있어서, 상기 아르기네이즈는 적어도 3일의 혈장 반감기과 적어도 약 250 I.U./mg의 특이적 활성을 갖는다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서 (a) 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고; (b) 상기 단백질의 발현을 위한 재조합 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주를 구축하고; (c) 유가식(fed-batch) 발효를 이용하여 상기 재조합 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 발효시키고; (d) 상기 재조합 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)를 열충격(heat-shocking)시켜서 상기 재조합 단백질의 발현을 촉진시키고; (e) 상기 발효 산물로부터 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에 있어서, 프로파아지(prophage)를 재조합 균주로서 사용한다. 인간 재조합 아르기네이즈의 클로닝과 발현을 위하여 발효의 유가식법 및 상기한 프로파아지를 사용하여, 하기의 실시예 3에서 보여지는 바와 같이, 아르기네이즈의 수율 및 생산성이 모두 5 배 이상 개선되고, 파장 600 nm (OD)에서의 최대 광학 밀도가 4 배 이상 증가된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 발효 단계를 재조합 단백질을 생산하기 위하여 일정한 비율로 늘일 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 발효를 명확하게 정의된 영양 배지인 180-320 g/L 글루코오스, 2-4 g/L MgS0₄·7H₂0, 45-80 g/L 트립톤, 7-12 g/L K₂HP0₄ 및 3-6 g/L KH₂P0₄ 를 사용하여 수행한다. 명확하게 정의된 배지를 사용함으로써, 바람직하지 않은 물질이 재조합 단백질과 함께 정제되는 것을 방지되고, 상기 방법이 약학적 등급의 재조합 물질의 생산하기에 효과적이고 안전하게 된다.

또 다른 구체예에 있어서, 아미노 말단에서 6 개의 추가적인 히스티딘을 코딩하는 추가적인 코딩 부위를 갖는 인간 아르기네이즈 유전자가 제공되며, 그 정제 방법은 킬레이팅 크로마토그래피 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 아르기네이즈 효소를 PEG화에 의하여 추가적으로 변형시켜 안정성을 개선시킨다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 아르기네이즈를 함유하는 약학 조성물이 제공된다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 아르기네이즈는 환자에서 적어도 3일 동안 AAD를 유지하기에 충분히 높은 효소 활성과 안정성을 갖는다. 가장 바람직한 구체예에 있어서, 상기 아르기네이즈를 PEG화에 의하여 추가적으로 변형시켜 안정성을 개선시키고 면역 반응성을 최소화시킨다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 아르기네이즈를 사용하여 추가적으로 제형화된(formulated) 약학 조성물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 환자에게 본 발명의 제형화된 약학 조성물을 투여하여 다른 단백질 파괴 억제제를 투여할 필요 없이 적어도 3일 동안 환자의 아르기닌 농도를 수준을 10 μM 이하로 유지시키는 것을 포함하는 질병의 치료 방법이 제공된다. 한 바람직한 구체예에 있어서, 비당뇨병 환자에게는 외부적으로 인슐린을 투여하지 않는다.

또한, 본 발명의 가장 바람직한 치료 방법은 환자의 혈액 내의 혈소판 수치 (50,000x10⁹ 이상을 유지하는 것이 바람직함) 및 프로트롬빈 시간 (정상의 2 배를 넘지 않도록 유지되는 것이 정상임)를 모니터링하는 것을 수반한다. 이들 혈소판 수치 및 프로트롬빈 시간이 여기에 도달하는 한 질소 산화물 발생원을 외부적으로 투여하지 않는다.

본 발명의 상기 측면의 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, PEG화된 아르기네이즈는 단주입(short infusion)으로서 주입되며, 단주입 내 3,000 내지 5,000 I.U./kg으로 30 분 이상 수행된다. 아르기닌 농도 및 아르기네이즈 활성을 아르기네이즈 주입 전과 그 후 매일 측정한다. AAD가 2일째에 달성되지 않으면, 다음번 아르기네이즈 주입량을 치료 의사의 판단하에서 정한다. AAD의 최대 내성 지속 기간(tolerated duration)을 혈압이 통제하에 있고 (치료 의사의가 적절하다고 생각하는 바에 따라서 약물 투여를 수반하거나 수반하지 않고), 혈소판 수치가 50,000x10⁹ 이상이고, 프로트롬빈 시간이 정상의 2 배보다 적은 동안의 기간으로서 정의된다. 아르기닌 농도에 따라서, 완전 혈구 측정 (complete blood count, CBC) 및 프로트롬빈 시간 (PT)을 매일 측정한다. 치료 동안 적어도 일주일에 두번 이상 간 화학(liver chemistry)을 모니터링한다.

하기하는 발명의 상세한 설명에 제시되는 실험 데이터는 아르기네이즈가, 충분히 효과적인 형태로 주어지는 경우, 악성 종양의 치료에 유용하다는 것을 보여준다. 재조합 인간 아르기네이즈 I이 본 명세서에 사용되는 아르기네이즈의 특정 구체예 중 하나지만, 본 발명에 있어서 다른 형태의 아르기네이즈 및/또는 다른 기원의 아르기네이즈를 사용할 수 있다는 것이 분명하다.

도 1은 pAB101의 플라스미드 지도를 보여주는 것이다. 상기 플라스미드는 아르기네이즈(arg)를 코딩하는 유전자를 운반하며, 대장균(E. coli)에서만 복제하고 바실러스 서브티리스 (B. subtilis)에서는 복제하지 않는다.

도 2a, 2b 및 2c는 뉴클레오타이드 서열 및 이로부터 유래하는 인간 아르기네이즈 I의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 2a는 플라스미드 pAB101의 EcoRI/MunI에서 XbaI 부위까지의 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: 1)을 보여준다. 뉴클레오타이드 (nt) 1-6, EcoRI/MunI 부위; nt 481-486, 프로모터 1의 -35 부위; nt 504-509, 프로모터 1의 -10 부위; nt 544-549, 프로모터 2의 -35 부위; nt 566-571, 프로모터 2의 -10 부위; nt 600-605, 리보좀 결합 부위; nt 614-616, 개시 코돈; nt 632-637, NdeI 부위; nt 1601-1603, 종료 코돈; nt 1997-2002, XbaI 부위.

도 2b는 변형된 인간 아르기네이즈의 코딩 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: 2) 및 이에 대응하는 코딩된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 3)을 나타낸 것이다. 도 2a의 뉴클레오타이드 614-1603는 상기 변형된 아르기네이즈의 아미노산 서열의 코딩 부위이다. N-말단에서의 6 x His (SEQ ID NO: 4) 표지가 밑줄로 표시되어 있다. 번역 종료 코돈은 별표로 표시되어 있다.

도 2c는 정상 인간 아르기네이즈 I의 코딩 뉴클레오타이드 서열 (SEQ ID NO: 8) 및 이에 대응하는 코딩된 아미노산 서열 (SEQ ID NO: 9)을 나타낸 것이다.

도 3은 아르기네이즈를 발현하는 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 프로파아지 구조의 개략도이다.

도 4a 및 4b는 재조합 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 균주 LLC101에 의한 2 리터 발효기(fermentor)에서의 발효의 시간적 추이 (time-course)를 보여주는 것이다. 도 4a는 회분식 발효로부터 얻어진 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 유가식 발효로부터 얻어진 결과를 나타낸 것이다.

도 5a 및 5b는 온도, 교반 속도, pH 및 용존 산소 수치와 같은 매개 변수의 변화를 보여주는 발효의 히스토리 플롯 (history plots)을 나타낸 것이다. 도 5a는 회분식 발효의 히스토리 플롯을 나타낸 것이다. 도 5b는 유가식 발효의 히스토리 플롯을 나타낸 것이다.

도 6a 및 6b는 1차 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼에 의한 열 충격 3 시간후의 인간 아르기네이즈의 생화학적 정제 결과를 나타낸 것이다. 도 6a는 FPLC 러닝 매개 변수 (running parameters) 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 6b는 컬럼으로부터 수집한 분획 11 내지 31 각각 5 ㎕의 SDS-PAGE (12%) 분석을 보여주는 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.

도 7a 및 7b는 2차 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼에 의한 열충격 3 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 7a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 7b는 컬럼으로부터 수집한 분획 9 내지 39 각각 1 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석을 나타낸 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.

도 8a 및 8b는 1차 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼에 의한 열충격 6 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 8a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 8b는 컬럼으로부터 수집한 분획 10 내지 32 각각 2.5 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석을 나타낸 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.

도 9a 및 9b는 2차 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼에 의한 열충격 6 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 9a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 9b는 컬럼으로부터 수집한 분획 8 내지 E6 각각 2 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석을 나타낸 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.

도 10은 고 세포 밀도에서 열충격을 수행하였을 때의 박테리아 세포 성장의 시간적 추이(time-course)를 보여주는 것이다. 열충격은 배양물 밀도 (OD_600nm)가 약 25일 때 8 시간에서 수행하였다.

도 11은 고 세포 밀도에서 열충격을 수행할 때의 유가식 발효의 히스토리 플롯이다. 상기 플롯은 온도, 교반 속도, pH 및 용존 산소 수치와 같은 매개 변수의 변화를 보여준다.

도 12a 및 12b는 1차 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼에 의한 열충격 (OD25의 고세포 밀도에서 수행) 6 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 12a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 12b는 컬럼으로부터 수집한 분획 16 내지 45 각각 5 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400. 레인 "미가공(crude)": 컬럼에 로딩하기 전 미가공 세포 추출물 5 ㎕.

도 13a 및 13b는 2차 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼에 의한 열충격 (OD25의 고 세포 밀도에서 수행) 6 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 13a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 13b는 컬럼으로부터 수집한 분획 7 내지 34 각각 5 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400. 레인 "미가공(crude)": 컬럼에 로딩하기 전 미가공 세포 추출물 5 ㎕.

도 14a 및 14b는 1차 5-ml HiTrap SP FF 컬럼에 의한 열충격 (OD25의 고 세포 밀도에서 수행) 6 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 12a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 14b는 컬럼으로부터 수집한 분획 A11 내지 B7 각각 5 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.

도 15a 및 15b는 2차 5-ml HiTrap SP FF 컬럼에 의한 열충격 (OD25의 고 세포 밀도에서 수행) 6 시간 후의 인간 아르기네이즈의 정제 결과를 나태낸 것이다. 도 15a는 FPLC 러닝 매개 변수 및 단백질 용리 양상을 나타낸 것이다. 도 15b는 컬럼으로부터 수집한 분획 A6 내지 B12 각각 5 ㎕의 SDS-PAGE (12 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 단백질 겔을 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하고 탈색하여 단백질 밴드를 나타내었다. 레인 M: 저 분자량 마커 (각 밴드당 1 ㎍; Bio-Rad), MW (Daltons): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.

도 16a 및 16b는 아르기네이즈와 PEG를 1:50(아르기네이즈:PEG)의 몰비로 사용하여 mPEG-SPA (MW 5,000)로 변형시킨 인간 아르기네이즈의 SDS-PAGE (15 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 도 16a는 반응을 얼음 상에서 수행하였을 때의 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 저급(low-range) 단백질 마커; 레인 2: PEG를 첨가하지 않은 아르기네이즈 (5.35 ㎍) (대조군); 레인 3: 반응 1 시간 후; 레인 4: 반응 0.5 시간 후; 레인 5: 반응 2 시간 후; 레인 6: 반응 3 시간 후; 레인 7: 반응 4 시간 후; 레인 8: 반응 5 시간 후; 레인 9: 반응 23 시간 후. 도 16b는 반응을 상온에서 수행할 때의 결과를 보여주는 것이다. 레인 1: 저급 단백질 마커; 레인 2: PEG를 첨가하지 않은 아르기네이즈 (5.35 ㎍) (대조군); 레인 3: 반응 1 시간 후; 레인 4: 반응 0.5 시간 후; 레인 5: 반응 2 시간 후; 레인 6: 반응 3 시간 후; 레인 7: 반응 4 시간 후; 레인 8: 반응 5 시간 후; 레인 9: 반응 23 시간 후.

도 17a 및 17b는 아르기네이즈와 PEG를 1:20(아르기네이즈:PEG)의 몰비로 사용하여 mPEG-SPA (MW 5,000)로 변형시킨 인간 아르기네이즈의 SDS-PAGE (15 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 도 17a는 반응을 얼음 상에서 수행하였을 때의 결과를 나타낸 것이다. 레인 1: 저급 단백질 마커; 레인 2: PEG를 첨가하지 않은 아르기네이즈 (5.35 ㎍) (대조군); 레인 3: 반응 1 시간 후; 레인 4: 반응 0.5 시간 후; 레인 5: 반응 2 시간 후; 레인 6: 반응 3 시간 후; 레인 7: 반응 4 시간 후; 레인 8: 반응 5 시간 후; 레인 9: 반응 23 시간 후. 도 17b는 반응을 상온에서 수행할 때의 결과를 보여주는 것이다. 레인 1: 저급 단백질 마커; 레인 2: PEG를 첨가하지 않은 아르기네이즈 (5.35 ㎍) (대조군); 레인 3: 반응 1 시간 후; 레인 4: 반응 0.5 시간 후; 레인 5: 반응 2 시간 후; 레인 6: 반응 3 시간 후; 레인 7: 반응 4 시간 후; 레인 8: 반응 5 시간 후; 레인 9: 반응 23 시간 후.

도 18a는 mPEG-CC (MW 5,000)로 변형시킨 인간 아르기네이즈의 SDS-PAGE (15 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 반응을 얼음 상에서 수행하였다. 레인 1: 저급 단백질 마커; 레인 2: 레인 2: PEG를 첨가하지 않은 아르기네이즈 (5.35 ㎍) (대조군); 레인 3: 아르기네이즈와 PEG를 1:50 (아르기네이즈:PEG)의 몰비로 반응시키고 2 시간 후; 레인 4: 비어있음; 레인 5: 아르기네이즈와 PEG를 1:50 (아르기네이즈:PEG)의 몰비로 반응시키고 23 시간 후; 레인 6: 아르기네이즈와 PEG를 1:20 (아르기네이즈:PEG)의 몰비로 반응시키고 2 시간 후; 레인 7: 아르기네이즈와 PEG를 1:20 (아르기네이즈:PEG)의 몰비로 반응시키고 5 시간 후; 레인8 :아르기네이즈와 PEG를 1:20 (아르기네이즈:PEG)의 몰비로 반응시키고 23 시간 후.

도 18b는 높은 활성 및 안정성을 갖는 천연 아르기네이즈 및 PEG화된 아르기네이즈의 SDS-PAGE (12 %) 분석 결과를 보여주는 것이다. 레인 1: 저급 단백질 마커 (Bio-rad); 레인 2: 천연 아르기네이즈 (1 ㎍) ; 레인 3: PEG화된 아르기네이즈 (1 ㎍) ; 레인 4: 한외 투석 (ultra-dialysis) 후 PEG화된 아르기네이즈 (1.5 ㎍).

도 19a 및 19b는 분리된 재조합 인간 아르기네이즈 순도 측정 결과를 보여주는 것이다. 도 19a에서 레인 1은 Ikemoto 등 (Ikemoto 등, 1990, Biochem. J. 270,697-703)에 의하여 개시된 방법으로 얻어진 정제된 E. coli 발현 재조합 인간 아르기네이즈 5 ㎍이다. 레인 2는 상기 문헌에 기재된 방법으로 얻어진 정제된 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis) 발현 재조합 인간 아르기네이즈 5 ㎍이다. 도 19b는 Lumi-imager^TM (Roche Molecular Biochemicals)의 Lumianalyst 32 프로그램을 사용하여 도 19a에 나타난 단백질 밴드의 밀도를 분석한 결과를 보여주는 것이다. 상단 패널: 도 19a의 레인 1에서 얻은 결과. 하단 패널: 도 19a의 레인 2에서 얻은 결과.

도 20은 인간 혈장에서의 PEG화된 아르기네이즈의 생체내 안정성을 보여주는 다이아그램이다.

도 21 및 도 22는 실시예8A에 기재된 방법에 의하여 얻어진 PEG화된 아르기네이즈의 생체내 반감기 측정 결과를 보여주는 것이다. 도 21은 실시예 9A에 기재된 활성 시험을 이용하여 본 발명에 따라서 생산된 PEG화된 아르기네이즈의 생체내 활성을 보여주는 것이다.

도 22는 PEG화된 아르기네이즈의 제1 반감기 및 제2 반감기가 결정되는 플롯을 나타낸 것이다.

도 23은 상이한 분량 (500 I.U., 1000 I.U., 1500 I.U., 및 3000 I.U.)의 PEG화된 재조합 인간 아르기네이즈를 복막내 투여한 4 개 군의 실험용 래트에서의 아르기닌 고갈을 비교하여 보여주는 것이다.

도 24는 Hep3B 세포의 이식에 의하여 유도된 종양을 갖는 2 개 군의 누드 마우스 간의 종양의 생존율, 평균 종양 크기 및 종양 성장률을 비교하여 나타낸 것이다. 하나의 군은 500 I.U. 분량의 아르기네이즈로 복막내 처리한 것이고, 다른 하나는 대조군으로 아르기네이즈로 처리하지 않은 것이다.

도 25a 및 25b는 PLC/PRF/5 세포의 이식에 의하여 유도된 종양을 갖는 2 개 군의 누드 마우스 간의 평균 종양 크기 및 종양 무게를 비교하여 나타낸 것이다. 하나의 군은 500 I.U. 분량의 아르기네이즈로 복막내 처리한 것이고, 다른 하나는 대조군으로서 아르기네이즈로 처리하지 않은 것이다.

도 26a 및 26b는 HuH-7 세포의 이식에 의하여 유도된 종양을 갖는 2 개 군의 누드 마우스 간의 평균 종양 크기 및 종양 무게를 비교하여 나타낸 것이다. 하나의 군은 500 I.U. 분량의 아르기네이즈로 복막내 처리한 것이고, 다른 하나는 대조군으로서 아르기네이즈로 처리하지 않은 것이다.

도 27a 및 27b는 MCF-7 세포의 이식에 의하여 유도된 종양을 갖는 2 개 군의 누드 마우스 간의 평균 종양 크기를 비교하여 나타낸 것이다. 하나의 군은 500 I.U. 분량의 아르기네이즈로 복막내 처리한 것이고, 다른 하나는 대조군으로서 아르기네이즈로 처리하지 않은 것이다.

도 28 및 도 29는 각각 실시예 12에 기재된 치료 동안의 환자의 생체내 아르기닌 농도 및 CEA 수준을 보여주는 것이다.

상기 인용된 모든 참고 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 발명의 수행을 하기하는 비제한적 실시예에서 예시하였다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구의 범위에 의해서만 정의되며, 상기 청구의 범위는 실시예의 내용 또는 범위에 의하여 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "PEG화된 아르기네이즈(pegylated Arginase)"란 용어는 PEG화에 의하여 변형되어 효소의 안정성이 증가되고 면역 반응성이 최소화된 본 발명의 아르기네이즈 I을 의미하는 것으로 사용된다.

본 발명에 있어서, "실질적으로 동일한"이란 구절은, DNA의 뉴클레오타이드 서열, RNA의 리보뉴클레오타이드 서열 또는 단백질의 아미노산 서열 중 어느 것과 관련되어 사용되든 간에, 여기에 기재된 실제 서열과 약간의 중요하지 않은 서열 변이를 갖는 서열을 의미하는 것으로 사용된다. 실질적으로 동일한 서열을 갖는 종은 기재된 서열과 동등한 것으로 간주되며, 그 자체로 첨부된 청구의 범위의 범위 내에 포함된다. 이와 관련하여, "약간의 중요하지 않은 서열 변이"는 본 명세서에 기재 및/또는 청구된 DNA, RNA 또는 단백질과 실질적으로 동일한 서열이 본 명세서에 기재 및/또는 청구된 서열과 기능적으로 동등하다는 것을 의미한다. 기능적으로 동등한 서열은 실질적으로 동일한 방식으로 작용하여 본 명세서에 기재되고 청구된 핵산 및 아미노산 조성과 실질적으로 동일한 조성을 생산할 것이다. 특히, 기능적으로 동등한 DNAs는 본 명세서에 기재된 단백질과 동일한 단백질 또는 비극성 잔기로 다른 비극성 잔기를 치환하거나, 하전된 잔기로 이와 유사하게 하전된 잔기를 치환하는 것과 같은 보존적 아미노산 변이를 갖는 단백질을 코딩한다. 이러한 변이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 단백질의 3차 구조를 실질적으로 변화시키지 않는다고 인식되는 변이를 포함한다. "충분히 높은 효소 활성"이란 용어는 적어도 250 I.U./mg, 바람직하게는 적어도 300-350 I.U./mg, 보다 바람직하게는 적어도 500 I.U./mg에 대한 재조합 인간 아르기네이즈의 효소 특이적 활성을 의미한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 아르기네이즈는 500 내지 600 I.U./mg의 특이적 활성을 갖는다. "안정성(stability)"이란 용어는 아르기네이즈의 생체외 안정성을 의미한다. 보다 바람직하게, 상기 안정성은 생체내 안정성을 의미한다. 효소 활성의 감소율은 분리되고 정제된 재조합 인간 아르기네이즈의 혈장 안정성에 반비례한다. 이러한 인간 아르기네이즈의 혈장 내 반감기를 계산한다.

본 명에서에 있어서, "적당한 아르기닌 결핍 (adequate arginine deprivation" (AAD)은 10 μM 이하의 생체내 아르기닌 농도를 의미하는 것으로 사용된다. "질병(disease)"은 모든 병리학적 증상을 의미하며, 간 질환 및 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "반감기(half-life)" (1/2-life)는 생체외에서의 인간 혈장 내 아르기네이즈의 농도가 반으로 줄어드는데 소요되는 시간을 의미한다. 2001년 초반에, 간암(hepatocellular carcinoma, HCC)의 자발적 일시 완화의 3 가지 사례가 본 발명자 중 1인에 의하여 관찰되었다. 3 명의 환자 모두 결과적 복막출혈(haemoperitoneum)과 함께 HCC의 자발적 파열을 가졌다. 한 사례에서, 혈장 아르기닌이 3 μM 정도로 낮은 농도로 존재하고 복수액(ascitic fluid)에서의 아르기닌 농도는 7 μM인 것으로 나타났다. 이 환자들 모두에서 약제를 사용하는 어떠한 치료도 받지 않고 파열된 간 손상 후 알파-태아 단백질(AFP)의 정상화로 간 종양의 자발적 완화가 나타났다. 한 환자에서는 6 개월 이상 HCC의 완화가 나타났다. 본 발명에 있어서, 이러한 연장된 완화가 파열된 간으로부터 복막으로의 자발적이고 지속적인 내인적 아르기네이즈 방출에 의한 아르기닌 고갈에 의하여 유발된다고 생각된다. 따라서, 본 발명자들은 연장된 아르기닌 고갈이 HCC의 완화로 이끄는 요인이라고 추측하였다.

그리고 나서, 본 발명의 발명자는 내인성 간 아르기네이즈가 간경유 동맥 색전(transhepatic arterial embolisation) 후 간으로부터 방출되어 전신 아르기닌 결핍을 일으킨다는 것을 보여주기 위하여 일련의 실험을 설계하였다. 이러한 내용을 미국 가명세서 출원 제60/351816로 출원하였으며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함되어 있다. 본 발명자에 의하여 설계된 실험에 있어서, 적절하고 측정 가능한 양의 내인성 간 아르기네이즈가 일시적 간 관류 결손을 유발하는 겔 폼(gel foam) 및 리피돌(lipiodol)을 사용하는 간 동맥 색전 후 절제 불가능한 전이성 HCC를 갖는 환자의 체순환으로 방출되는 것으로 나타났다. 저아미노산혈증 (hypoaminoacidemia) 상태를 유도하기 위하여 많은 양의 인슐린 주입을 치료 요법에 포함시켰다. 치료받은 일련의 6 사례의 HCC에 있어서, 4 사례에서 간암의 간 이외의 완화가 나타났으며, 이는 상기 치료 효과가 전신적임을 암시하는 것이다. 한 환자는 간질환과 간 이외의 질병 [복강 선증(celiac adenopathy)]에서 CT 및 PET 방사선학 모두에 있어서 지속적인 완전한 완화를 나타내었다. 이 환자의 AFP 수치는 3 주일 이내에 정상으로 떨어졌으며, 4 개월동안 지속되었다. 4 개월에서의 인터벌 CT에 의하여 간 또는 간 이외에 있어서 어떠한 명확한 종양도 발견되지 않았다. 다른 3 명의 환자는 모두 색전 후 4 주일째의 PET 스캔 상에서 간 이외의 질병 (한 명은 폐, 다른 한 명은 장간막/복막후방/뼈, 다른 한 명은 복막 후방 선증)의 완화를 나타내었다. 이들의 아르기네이즈 활성 및 아르기닌 농도 시험 상에서, 이들 모두가 2 시간 내지 2 일동안 지속되는 기간 동안 적당한 아르기닌 고갈을 나타내었다. 사실, AAD의 지속 기간은 간 및 간 이외 모두에서 종양 완화의 정도 및 지속 기간과 큰 상관 관계를 갖는다.

간경유 동맥 색전술이 많은 양의 인슐린 주입과 함께 수행되었지만, 이어서 본 발명자들은, 본 발명에 있어서, 인슐린의 투여 필요성이 근육으로부터의 모든 단백질 분해가 아르기닌 결핍에 대한 보상 효과를 갖고 치료가 효과없게 하도록 불충분한 아르기네이즈 활성을 환자의 시스템내로 방출시킬 수 있다는 사실에 기인한다는 것을 파악하게 되었다. 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 치료를 개선하고 아르기닌 결핍 치료와 병행되는 인슐린 투여의 필요성을 제거하기 위하여, 아르기네이즈 활성이 근육에서의 모든 단백질 분해를 방해하기 위하여 환자의 시스템 내에 충분히 많은 양으로 존재하여야 한다는 것을 인식하였다. 따라서, 본 발명에 있어서, 본 발명자들은 많은 양의 인슐린을 투여할 필요 없이 환자에서 10 μM 이하의 "적당한 아르기닌 결핍" (이하, "AAD"라 칭함)을 유지하기에 충분히 높은 효소 활성 및 안정성을 갖는 아르기네이즈 효소를 생산하도록 설계하였다. 따라서, 내인성 아르기네이즈를 증가시키는 것 외에도, 높은 안정성과 활성을 갖는 본 발명에 따른 아르기네이즈는 환자에게 바람직하지 않은 부작용을 갖는 단백질 분해 저해제의 투여 없이 AAD가 달성되도록 하는 추가적인 이점을 제공한다.

전신적 아르기닌 고갈은 질소 산화물 부족과 관련된 바람직하지 않은 부작용을 발생시킬 수 있다. 이들은 세포 분열의 일시적 정지와 관련된 초기 응고 인자의 고갈 및 NO 부족에 버금가는 저혈소판증(thrombocytopenia), 혈소판 응집 및 혈관 내피에 대한 NO의 혈관 확장 효과의 부재에 기인하는 고혈압을 포함한다. 그러나, 본 발명자는 질소 산화물 녹아웃 마우스에 있어서, 상기 동물이 혈압이 높지 않고, 정상 혈소판 수치를 가지며 정상 생활이 예상된다는 것을 인지하였다. 따라서, 본 발명의 다른 측면 및 저혈소판증을 갖는 환자에 있어서, 혈소판 수치가 50,000 x 10⁹ 보다 충분히 낮은 동안에 어떠한 외부로 나타나는 출혈 경향도 보이지 않았다. 혈전 경향을 보이는 환자에 있어서, 치료는 프로트롬빈 시간을 최대 2 x 정상 동안 연장시키는 것을 수반한다.

하기하는 상세한 실시예는 본 발명에 따른 고도로 안정적이고 활성적인 아르기네이즈의 제조 및 사용 방법을 보여준다. 실시예 1은 인간 아르기네이즈 I 유전자를 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) LLC101의 재조합 균주의 구조를 설명한다. 이어서, 재조합 B. subtilis의 발효에 대한 두 개의 실시예가 후속한다. 재조합 LLC101 세포의 초기 발효 실험에 있어서, 2-L 발효기에서 회분식 발효 및 유가식(fed-batch) 발효를 수행하였다. 회분식 조건하에서는 충분히 높은 세포 밀도가 달성되지 않는 것으로 나타났다. 본 발명에서 제시된 유가식 조건하에서만 세포 밀도가 10 OD (광학 밀도) 이상으로 증가된다. 이러한 실험 및 결과를 실시예 2A 및 2B에 나타내었다. 두 발효법의 비교는 실시예 3에 나타나 있다. 따라서, 분리되고 정제된 재조합 인간 아르기네이즈의 생산을 위하여 유가식 발효법을 선택하였다. 유가식 발효는 100-L 발효기에서 스케일 업(scaled up) 되었다. 상기 실험 및 결과를 실시예 2C에 나타내었다.

LLC101 균주는 50 ℃의 열충격에서 아르기네이즈의 발현을 유발시키는 열 민감성 균주이다. 초기 최적화 시험에 있어서, 다양한 세포 밀도에서 열충격 실험을 수행하여 최고의 아르기네이즈가 생산되는 최적 조건을 얻었다. 실시예 5 및 실시예 6에 두 개의 상이한 OD (600 nm에서의 광학 밀도) 12.8 및 25에서의 열충격을 갖는 두 개의 상이한 유가식 발효 런에 의하여 얻어진 아르기네이즈의 정제 과정 및 정제된 아르기네이즈의 수율이 기재되어 있다. 상기 실험 데이터는 모든 열충격을 LLC101의 대수 증식기 동안 적용하였지만, 예컨대 12.8 OD와 같이 낮은 세포 밀도에서 열충격을 도입함으로써 보다 양호한 결과를 얻을 수 있다는 것을 보여주었다.

또한, 열충격 후 수확 시간을 변화시키면서 열충격 후 아르기네이즈의 최대 발현을 위한 조건을 최적화하였다. 실시예 4는 유가식 발효 공정을 이용하고 열충격 3 시간 후 세포를 수확하여 얻은 결과를 나타내었다.

실시예 5는 12.8 OD의 세포 밀도에서의 열충격 6 시간 후의 아르기네이즈의 정제를 설명한다. 실시예 6는 25 OD의 고 세포 밀도에서의 열충격 6 시간 후의 아르기네이즈의 정제를 설명한다. 실시예 7은 다양한 수확 및 정제 조건 하에서의 아르기네이즈의 수율을 비교하는 데이터의 비교를 보여준다. 이러한 데이터는 12.8의 낮은 세포 밀도에서 열충격 6 시간 후 수확한 세포가 162 mg/L의 높은 수율로 아르기네이즈를 생산하였음을 보여준다. 상기 아르기네이즈는 안정성을 개선시키기 위하여 변형되었다. 실시예 8A는 가교제로서 염화 시아누르(cyanuric chloride, cc)를 사용하고 아르기네이즈와 PEG의 몰비를 1:40 (아르기네이즈:PEG)로 하여 아르기네이즈를 PEG화시키는 하나의 프로토콜을 보여준다. 실시예 8B는 다른 프로토콜을 설명하고 있으며, 이 때 매우 낮은 비율의 가교제가 효소를 포함하는 반응 혼합물에 첨가된다. cc와 프로피온산의 숙신이미드 (succinimide of propionic acid, SPA) 모두를 가교제로서 시험하였다. 실험 결과는 SPA를 사용하는 실시예 8B에 기재된 방법이 실시예 9 및 실시예 10에 기재된 바와 같이 약 255 I.U./mg의 특이적 활성 및 3 일의 반감기를 갖는 PEG화된 아르기네이즈를 제공한다는 것을 보여준다. 실시예 8C는 특이적 활성이 약 592 I.U./mg인 고도의 활성을 갖는 PEG화된 아르기네이즈의 제조 방법을 기재한다.

전술된 방법을 사용하여, 고도로 안정되고 활성적인 아르기네이즈를 제조하였다. 이는, 근육에 의한 모든 아르기닌 보충이 전신적인 아르기네이즈에 의하여 신속하게 제거되기 때문에, 단백질 분해 억제제의 상당한 사용없이 환자의 치료가 가능하도록 충분히 높은 활성과 안정성을 갖는다. 따라서, 많은 양의 인슐린을 외부적으로 투여하지 않고 10 μM 이하의 적당한 아르기닌 결핍을 달성할 수 있다. 본 발명에 따른 아르기네이즈를 사용하는 다양한 치료 프로토콜이 실시예 11에 개지되어 있다. 실시예 12는 아르기네이즈를 투여한 환자의 임상 데이터를 보여주는 것으로, 실시예 11에 기재된 치료 프로토콜을 보다 지지한다.

실시예 13 및 실시예 14는 본 발명에 따른 아르기네이즈의 안전 투여량 및 용량 반응을 조사하는 2 동물 연구이다. 실시예 15 내지 실시예 18은 다른 일련의 누드 마우스에 대한 동물 연구로서 변형된 아르기네이즈의 투여에 의하여 유도되는 아르기닌 고갈에 대한 상이한 인간 암세포에 의하여 유도되는 종양 반응을 조사하기 위한 것이다.

실시예 1: 재조합 균주 LLC101의 제조

(a) 인간 아르기네이즈 I을 코딩하는 유전자의 분리

인간 아르기네이즈 I의 유전자 서열은 1987년 공표된 바 있고, 그로부터 프라이머가 고안되었다. Expand High Fidelity PCR System Kit (Roche)를 이용하여 인간의 아르기나제를 코딩하는 유전자를 분리하기 위해 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)을 수행하였다. 프라이머 Arg1 (5'-CCAAACCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATA-3') (SEQ ID NO: 5)와 Arg2 (5'-CCAAACTCTAGAATCACATTTTTTGAATGACATGGACAC-3') (SEQ ID NO: 6)을 각각 Genset Singapore Biotechnology Pte Ltd.로부터 구매하였다. 두가지 프라이머 모두 용융 온도가 72℃로 동일하다. 프라이머 Arg1은 NdeI 제한효소 인식부위 (밑줄 표시)를 함유하고 프라이머 Arg2는 XbaI 인식부위 (밑줄 표시)를 함유한다. 이들 두가지 프라이머 (각각 최종 농도 300nM)를 0.2-ml 마이크로튜브 내의 인간의 간 5'-스트렛치 플러스 cDNA 라이브러리 (Clontech) 5μl에 첨가하였다. DNA 폴리머라제 (2.6 유닛, 0.75μl), 네가지 데옥시리보뉴클레오타이드 (각각 4μl; 최종 농도는 각각 200μM)와 반응 완충액 (5μl) 및 dH₂O (17.75 μl)도 첨가하였다. 다음 조건을 이용하여 PCR을 수행하였다: 예비 PCR (94℃, 5분), PCR 사이클 25회 (94℃. 1분: 57℃, 1분; 72℃, 1분), 후 PCR (72℃, 7분). PCR 산물 (5μl)을 0.8% 아가로스 겔 상에서 분석하자 1.4 kb의 단일 밴드가 관찰되었다. 이 DNA 단편은 아르기나제를 코딩하는 유전자를 함유한다.

(b) 플라스미드 pSG1113의 분리

플라스미드 pSG703 (Thornewell, S.J. 외, 1993, Gene, 133, 47-53)의 유도체인 플라스미드 pSG1113을, 제조자 지침에 따라 Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega)을 이용함으로써, PSG1113을 함유하는 E. coli DH5α 클론으로부터 분리하였다. B. subtilis에서는 복제되지 않고 E. coli에서만 복제되는 이 플라스미드를 아르기네이즈 유전자의 서브클로닝용 벡터로서 이용하였다.

(c) 1.4 kb PCR 산물을 플라스미드 pSG1113 내로 서브클로닝시켜 플라스미드 pAB101을 제조한다

상기 프로토콜을 이용하여 제조된 PCR 산물을, 6 mM Tris-HCl (pH 7.9), 6 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 mM DTT로 이루어진 반응 배지 중에서 37℃에서 1.5시간 동안 엔도뉴클레아제 제한효소인 NdeI 및 XbaI (Promega)로 처리하였다. 처리 종결 후, 반응 혼합물을 아가로스 겔 (0.8%) 전기영동시키고, Qiaex II Gel Extraction Kit (Qiagen)을 이용해서 1.4 kb DNA 단편을 겔로부터 회수하였다. 이와 별도로, 플라스미드 pSG1113을 같은 날 같은 제한효소 엔도뉴클레아제들로 처리하였다. 처리 종결 후, 반응 혼합물을 아가로스 겔 (0.8%) 전기영동시켜, 약 3.5 kb 크기의 DNA 단편을 겔로부터 회수하였다. 이 DNA 단편을 T4 DNA 라이게이즈를 이용해서 상기한 1.4kb DNA 단편에 연결시켰다. 통상적인 칼슘법 (Sambrook, J. 외, Molecular Cloning, A Labortory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Prss, New York, 1989)에 따라, 이 라이게이션 혼합물을 이용하여 E. coli XLI-Blue를 형질전환시키고, 100μg/ml 암피실린을 함유하는 영양 한천 플레이트에 도말하였다. 제한효소 분석에 의해, 콜로니들을, 적절한 삽입물을 갖는 플라스미드가 있는지 여부에 대해 스크리닝하였다. 제조된 플라스미드를 pAB101이라 명명하였다 (도 1). ORI는 E. coli의 복제 오리진을, bla는 암피실린 내성 마커 유전자를 나타낸다. 아르기네이즈를 코딩하는 유전자의 동일성을 확인하기 위해 프라이머 Arg1 (SEQ ID NO: 5), Arg2 (SEQ ID NO: 6) 및 Arg 6 (5'-CTCTGGCCATGCCAGGGTCCACCC-3') (SEQ ID NO: 7)를 이용하여 DNA 서열분석을 하였다 (도 2).

(d) 신규한 재조합 B. subtilis 프로파지 균주 LLC101의 제조

Wizard Plus Minipreps DNA Purification System (Promega)를 이용하여 pAB101을 함유하는 클론으로부터 플라스미드 pAB101을 추출 및 정제하였다. 플라스미드 pAB101 내에서 (도 1), 아르기네이즈 유전자 (arg)를 0.6 kb MunI-NdeIφ105 파지 DNA 단편 ("φ105"로 표시됨)과 cat 유전자로 플랭킹시켰다 (도 1 및 도 3). 공지 방법 (Anagnostopoulos C. 및 Spizizen J., 1961, J. Bacteriol. 81, 741-746)에 따라, 이 플라스미드 DNA (1μg)를 이용하여 B. subtilis 1A304(φ105MU331)을 형질전환시켰다. B. subtilis 균주 1A304 (φ105MU331)는 J. Errington(Torhnewell, S. 외, 1993, Gene 133, 47-53)으로부터 수득하였다. 이 균주는 Thornewell, S. 외, 1993, Gene 133, 47-53, 및 Baillie, L.W.J. 외 1998, FEMS Microbiol. Letters 163, 43-47 (그 내용 전체가 본 발명에 인코포레이션됨)의 공개 내용에 따라 제조되었다. Cm^R 마커에 대한 선별이 가능하게끔 B. subtilis 균주 1A 304 (φ105MU331) 내로 플라스미드 pAB101(도 3에서 선형 표시)을 형질전환시키고, 형질전환체를 Er^S 표현형에 대해 스크리닝하였다. 이러한 형질전환체는 도 3에 도시된 바와 같이, 아르기네이즈 유전자 (arg)의 전사가 강력한 파지 프로모터에 의해 제어되는, 이중교차 이벤트 (doule-crossover event)로부터 생성된 것이다 (Leung 및 Erington, 1995, Gene 154, 1-6). 굵은 선은 프로파지 게놈을, 파선은 B. subtilis 염색체를, 가는 선은 플라스미드 DNA를 나타낸다. 유전자들은 도 3에서 전사 및 번역 방향을 가리키는 빗금친 화살표로서 표시하였다. 상동성 대역은 수직 파선으로 감싸진 부분이고 상동성 재조합 이벤트는 'X'로 표시하였다.

클로람페니콜 (5μg/ml)를 함유하는 한천 플레이트 상에 형질전환 세포주 600 μl를 도말하여 이로부터 52개의 클로람페니콜 내성 (Cm^R) 콜로니를 얻었다. 이드르 콜로닐 가운데 10개를 무작위 선별해서 에리쓰로마이신 (20μg/ml)를 함유하는 한천 플레이트 상에 스트리킹하자, 이들 중 한 콜로니는 생육되지 않았다. 이는 이 콜로니가 에리쓰로마이신 민감성 (Er^S)임을 가리키는 것이다. 이렇게 분리된 클로람페니콜 내성이나 에리쓰로마이신 민감성인 콜로니를 LLC101로 명명하였다. 이 새롭게 제작된 프로파지 균주의 염색체 중에는, 동종 재조합 프로세스 중의 이중교차 이벤트에 의해, 에리쓰로마이신 내성 유전자 (ermC)가 아르기네이즈 유전자 (arg)에 의해 대체되어 있다. 0.6kb MunI-NdeIφ 파지 DNA 단편 ("φ105"로 표시됨)과 cat 유전자는 재조합을 위한 동정 서열을 제공해준다. 이러한 방식으로, B. subtilis 1A304 (φ105MU331)의 프로파지 DNA 중의 발현 부위에 아르기네이즈 유전자를 표적화시켜 아르기네이즈 유전자를 강력한 열유도성(thermoinducible) 프로모터의 제어 하에 두도록 하였다 (Leung, Y.C. 및 Erringto, J., 1995, Gene 154, 1-6).

B. subtilis LLC101 세포의 발효

실시예 2A: 2리터 들이 발효조에서의 회분식 발효

클로람페니콜 5 mg/L이 보강된 영양 한천 (소고기 추출물 1 g/L, 펩톤 10 g/L, NaCl 5g/L 및 한천 20 g/L) 플레이트 상에 B. subtilis LLC 101 균주를 유지시켰다. 회분식 (batch) 및 유가식 (fed-batch) 발효를 위한 접종물을 준비하기 위해, 상기한 균주의 콜로니 몇개를 갓 제조한 영양 한천 아가 플레이트로부터 2개의 1L 들이 플라스크 (각각 글루코스 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 구연산나트륨 1 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, K₂HPO₄ 1.5 g/L, 및 (NH ₄)₂SO₃ 3 g/L을 함유하는 발효 배지를 80ml씩 함유함)로 옮겼다. 박테리아 세포 배양체는 37℃, pH 7.0에서 250 r.p.m.으로 회전하는 오비탈 쉐이커 상에서 배양하였다. 약 9-11 시간의 생육 시간 무렵 OD_600nm가 5.5-6.0에 도달할 무렵 배양을 종결시켰다. 이어서 160 ml 배양 브로쓰를 1440-ml 발효배지 (글루코스 5 g/L, 트립톤 10 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 구연산나트륨 1 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, K₂HPO₄ 1.5 g/L, 및 (NH ₄)₂SO₄ 3g/L)를 함유하는 2L들이 발효조 내로 주입하였다. 37℃에서 회분식 발효를 수행하였다. 수산화ㅏ트륨과 염산을 첨가함으로써 pH를 7.0으로 조절하였다. 교반 속도를 조정함으로써, 용존 산소 농도는 20% 포화공기로 조절하였다. 배양 밀도 (OD_600nm)가 약 3.9가 된 3.25시에 열충격을 가하였다. 열충격 동안, 발효조 온도는 37℃에서 50℃로 증가하였고 그 직후 37℃로 냉각되었다. 완전한 가열 및 냉각 사이클에는 대략 0.5 시간이 거렸다. 배양물의 OD는 열충격 후 3.5시에 최대치인 약 6.4 에 달하였다. 열충격 6시간 후 아르기네이즈의 분리 및 정제를 위해 세포를 수확하였다. 상기한 균주는 열충격 6시간 후 발효 배지 1L당 활성 인간 아르기네이즈를 약 30 mg의 양으로 생산하였다. 발효의 시간 경과양상을 도 4A에 도시하였다. 온도, 교반 속도, pH 및 용존 산소값과 같은 변수 변화를 나타내는 이 회분식 발효의 히스토리 플롯을 도 5A에 도시하였다.

실시예 2B: 2 리터 들이 발효조에서의 유가식 발효

37℃, pH 7.0 및 용존 산소 20% 공기 포화도에서 유가식 발효를 수행하였다. 접종 단계는 실시예 2A에 설명된 회분식 발효의 경우와 유사하였다. 초기, 배양 배지는 실시예 2A에서 설명된 회분식 발효에서 사용된 것과 동일한 것으로 하였다. 주입 배지는 200 g/L 글루코스, 2.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 50g/L 트립톤, 7.5 g/L K₂ HPO₄ 및 3.75 g/L KH₂O₄를 함유하였다. 배지 주입 속도는 pH-스탯 제어 전략에 따라 조절하였다. 이 전략에서는, 주입 속도를 글루코스 결핍에 의해 야기되는 pH 상승을 상쇄하도록 조절하였다. 이 조절 전략은 글루모스 농도가 약 4.5-h 발효 시간에서 극히 낮은 레벨까지 저하되었을 때 최초로 수행하였다. pH>7.1이면, 4 ml의 주입 배지를 발효조에 도입하였다. 글루코스 첨가 직후, pH 값은 7.1 미만으로 급격히 감소하게 된다. 대략 10분 후, 첨가된 글루코스가 박테리아 세포에 의해 완전히 소비되면 pH 값은 7.1보다 큰 값으로 상승하게 되며, 이는 주입 배지 4 ml를 발효조에 더 첨가해야 할 시점임을 가리키는 것이다. 배양 밀도 (OD_600nm)가 12.0과 13.0 사이가 되었을 때인 제 5-6시에 열 충격을 수행하였다. 열충격 동안, 발효조의 온도는 37℃에서 50℃로 상승된 다음 즉시 37℃로 냉각된다. 완전한 가열 및 냉각 사이클에는 약 0.5시간이 소요된다. 아르기네이즈의 분리 및 정제를 위해 열충격 3시간 및 6시간 후에 세포들을 수확하였다. 상기한 균주는 활성 인간 아르기네이즈를 열충격 6시간 후 발효 배지 1L 당 적어도 약 162mg의 양으로 생산하였다. 시간에 따른 발효경과를 도 4B에 도시하였다. 온도, 교반 속도, pH 및 용존 산소값과 같은 변수들의 변화를 보여주는 이 유가식 발효의 히스토리 플롯을 도 5B에 나타내었다.

실시예 2C: 100 리터 들이 발효조에서의 유가식 발효

유가식 발효를 100 리터 들이 발효조로 스케일업시켰다. 37℃, pH 7.0 및 용존 산소 20% 공기 포화도에서 유가식 발효를 수행하였다. 10% 접종물을 사용하였다. 초기, 배양 배지는 실시예 2A에서 설명된 회분식 발효에서 사용된 것과 동일한 것으로 하였다. 주입 배지는 300 g/L 글루코스, 3.75 g/L MgSO₄·7H₂O, 75g/L 트립톤, 11.25 g/L K₂HPO₄ 및 5.625 g/L KH₂O₄를 함유하였다. 배지 주입 속도는 실시예 2B에 설명된 유가식 발효에서 사용된 것과 유사한 pH-스탯 제어 전략에 따라 조절하였다. 배양 밀도 (OD_600nm)가 11.5와 12.5 사이가 되었을 때인 대략 7.5시 째에 열 충격을 수행하였다. 열충격 동안, 발효조의 온도는 37℃에서 50℃로 상승되며, 50℃에서 7초간 유지된 다음 즉시 37℃로 냉각된다. 완전한 가열 및 냉각 사이클에는 약 0.5시간이 소요된다. 아르기네이즈의 분리 및 정제를 위해 열충격 2시간 및 4시간 후에 세포들을 수확하였다. 상기한 균주는 열충격 2시간과 4시간 후 발효 배지 1L 당 활성 인간 아르기네이즈를 각각 적어도 약 74 mg과 124 mg의 양으로 생산하였다. 이들 데이타는 100리터 들이 발효조에서 열충격으로부터 2시간 후에 세포를 수확하는 것보다, 열충격으로부터 4시간 후에 세포를 수확하는 경우 아르기네이즈 수율이 더 높다는 것을 보여준다.

실시예 3: 회분식 발효과 유가식 발효의 비교

다음 표 1은 회분식 발효와 유가식 발효의 결과를 비교한 것이다. 비교 결과는 유가식 발효가 배양 OD, 아르기네이즈 수율 및 생산성 측면에서 회분식 공정보다 훨씬 더 우수함을 증명해준다.

	회분식 발효	유가식 발효
열충격 개시 시점의 OD	3.9	12.8
얻어진 최대 OD	6.0	26.8
아르기네이즈 수율 (mg/L)	30	162
아르기네이즈 생산성 (mg/L-h)	2.5	13.5

실시예 4: 낮은 세포밀도에서의 유가식 발효 후 열충격 3시간 후의 아르기네이즈 정제

실시예 2B에 설명된 바와 같이 2리터 들이 발효조에서 유가식 발효를 수행하였다. 유가식 발효의 세포 밀도를 30분 또는 60분 간격으로 모니터링하고 배양 온도는 배양 OD가 12.8에 도달했을 때 발효 개시 5.5 시간 째에 열충격을 위해 50℃로 상승시켰다 (도 4B 및 도 5B 참조).

열충격으로부터 3시간 후에 수집한 세포 배양체 (470 ml)를 4℃에서 20분간 5,000 rpm에서 원심분리시켜 세포를 펠릿화시켰다. 세포의 습중량은 15.1g 이었다. 배양 상등액을 폐기하고 세포 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 이 세포들은 이 온도에서 며칠동안은 안정하다. 세포내 단백질을 추출하기 위해, 세포 펠릿을 140 ml의 가용화 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1M NaCl, 5 mM MnSO₄, 라이소자임 (75μg/ml)]에 재현탁시켰다. 30℃에서 15분간 인큐베이션시킨 후, 혼합물을 8회 초음파 처리하였다. 이 초음파 처리는 매회 10초간 지속되며 (따라서 총 80초간), Soniprep 150 Apparatus (MSE)를 이용하여 2분 간격으로 수행하였다. 약 500 유닛의 데옥시리보뉴클리에이즈 I (Sigma D 4527)을 첨가하고 이 혼합물을 37℃에서 10분간 인큐베이션시켜 염색체 DNA를 절단시켰다. 10,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후, 조질의 단백질 추출물을 함유하는 상등액을 아르기네이즈 활성 존재여부에 대해 검사하고 SDS-PAGE 분석하였다 (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685).

5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼 (Pharmacia)을 컬럼 5개 용량 기준으로 dH₂O 중 0.1M NiCl₂로 평형화시켰다. 조질의 단백질 추출물 (140ml)을 컬럼에 로딩시켰다. 다음 조건 하에서 15개 컬럼 용량 당 5 ml/min의 유속으로 선형 구배 (0-100%)를 갖도록 용출시켰다: 완충액 A= 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]; 완충액 B = 0.5M 이미다졸을 함유하는 출발 완충액. 용출 프로파일을 도 6A에 나타내었으며 단백질 겔은 도 6B에 도시하였다. 분획 13-20을 수집하여 (16ml) 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]으로 10배 희석하였다. 이것을 두번째 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼 (Pharmacia)에 로딩시켜 상기와 동일한 공정을 반복하였다. 용출 프로파일을 도 7A에 나타내고 단백질 겔은 도 7B에 도시하였다. 아르기네이즈를 함유하는 분획 12-30을 수집하여 (38 ml), 다음 조건에 따라 50-ml HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (Pharmacia)을 이용하여 염을 제거하였다: 유속 = 10 ml/min, 완충액 = 10mM Tris-HCl (pH 7.4) 및 용출 길이 = 1.5 컬럼 부피. Bradford (Bradford, M.M. 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 470 ml 세포 배양체로부터 총 56.32mg의 아르기네이즈가 정제되었다. 정제된 아르기네이즈의 수율은 119.8 mg/l 세포 배양체 또는 3.73 mg/g 세포습중량인 것으로 평가되었다.

실시예 5: 낮은 세포밀도에서의 유가식 발효 후 열충격 6시간 후의 아르기네이즈 정제

실시예 4에 설명된 바와 같이 2리터 들이 발효조에서 유가식 발효를 수행하였다. OD 12.8에서 열충격으로부터 6시간 후에 수집한 세포 배양체 (650 ml)를 4℃에서 20분간 5,000 rpm에서 원심분리시켜 세포를 펠릿화시켰다. 세포의 습중량은 24g 이었다. 배양 상등액을 폐기하고 세포 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 이 세포들은 이 온도에서 며칠동안은 안정하다. 세포내 단백질을 추출하기 위해, 세포 펠릿을 140 ml의 가용화 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1M NaCl, 5 mM MnSO₄, 라이소자임 (75μg/ml)]에 재현탁시켰다. 30℃에서 15분간 인큐베이션시킨 후, 혼합물을 8회 초음파 처리하였다. 이 초음파 처리는 매회 10초간 지속되며 (따라서 총 80초간), Soniprep 150 Apparatus (MSE)를 이용하여 2분 간격으로 수행하였다. 약 500 유닛의 데옥시리보뉴클리에이즈 I (Sigma D 4527)을 첨가하고 이 혼합물을 37℃에서 10분간 인큐베이션시켜 염색체 DNA를 절단시켰다. 10,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후, 조질의 단백질 추출물을 함유하는 상등액을 아르기네이즈 활성 존재여부에 대해 검사하고 SDS-PAGE 분석하였다 (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685).

5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼 (Pharmacia)을 컬럼 5개 용량 기준으로 dH₂O 중 0.1M NiCl₂로 평형화시켰다. 조질의 단백질 추출물 (140ml)을 컬럼에 로딩시켰다. 다음 조건 하에서 15개 컬럼 용량 당 5 ml/min의 유속으로 선형 구배 (0-100%)를 갖도록 용출시켰다: 완충액 A= 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]; 완충액 B = 0.5M 이미다졸을 함유하는 출발 완충액. 용출 프로파일을 도 8A에 나타내었으며 단백질 겔은 도 8B에 도시하였다. 분획 13-24를 수집하여 (24ml) 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]으로 10배 희석하였다. 이것을 두번째 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼 (Pharmacia)에 로딩시켜 상기와 동일한 공정을 반복하였다. 용출 프로파일을 도 9A에 나타내고 단백질 겔은 도 9B에 도시하였다. 아르기네이즈를 함유하는 분획 12-24를 수집하여 (26 ml), 다음 조건에 따라 50-ml HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (Pharmacia)을 이용하여 염을 제거하였다: 유속 = 10 ml/min, 완충액 = 10mM Tris-HCl (pH 7.4) 및 용출 길이= 1.5 컬럼 부피. Bradford (Bradford, M.M. 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 650 ml 세포 배양체로부터 총 85.73mg의 아르기네이즈가 정제되었다. 정제된 아르기네이즈의 수율은 132 mg/l 세포 배양체 또는 3.57 mg/g 세포습중량인 것으로 평가되었다.

실시예 6: 높은 세포밀도에서의 열충격 6시간 후의 아르기네이즈 정제

이 특정 유가식 발효에 있어서는, 배양 밀도 (OD_600nm)가 약 25였을 때인 7시간 째에 열충격을 수행한 것을 제외하고 상기와 유사한 공정을 수행하였다. 열충격 동안, 발효조의 온도는 37℃에서 50℃로 상승했다가 즉시 37℃로 냉각되었다. 완전한 가열 및 냉각 사이클에는 약 0.5시간이 소요되었다. 열충격 6시간 후에 아르기네이즈의 분리 및 정제를 위해 세포 배양체 일부 (760 ml)를 수확하였다. 이 발효공정에 있어서의 박테리아 세포 배양의 시간 경과를 도 10에 도시하였다. 온도, 교반 속도, pH 및 용존 산소값과 같은 변수들의 변화를 나타내는 이 유가식 발효의 히스토리 플롯을 도 11에 나타내었다.

열충격으로부터 6시간 후에 수집한 세포 배양체 (760 ml)를 4℃에서 20분간 5,000 rpm에서 원심분리시켜 세포를 펠릿화시켰다. 세포의 습중량은 32g 이었다. 배양 상등액을 폐기하고 세포 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 이 세포들은 이 온도에서 며칠동안은 안정하다. 세포내 단백질을 추출하기 위해, 세포 펠릿을 280 ml의 가용화 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1M NaCl, 5 mM MnSO₄, 라이소자임 (75μg/ml)]에 재현탁시켰다. 30℃에서 15분간 인큐베이션시킨 후, 혼합물을 8회 초음파 처리하였다. 이 초음파 처리는 매회 10초간 지속되며 (따라서 총 80초간), Soniprep 150 Apparatus (MSE)를 이용하여 2분 간격으로 수행하였다. 약 500 유닛의 데옥시리보뉴클리에이즈 I (Sigma D 4527)을 첨가하고 이 혼합물을 37℃에서 10분간 인큐베이션시켜 염색체 DNA를 절단시켰다. 10,000 rpm, 4℃에서 20분간 원심분리한 후, 조질의 단백질 추출물을 함유하는 상등액을 아르기네이즈 활성 존재여부에 대해 검사하고 SDS-PAGE 분석하였다 (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685).

5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼 (Pharmacia)을 컬럼 5개 용량 기준으로 dH₂O 중 0.1M NiCl₂로 평형화시켰다. 조질의 단백질 추출물 (280ml)을 컬럼에 로딩시켰다. 다음 조건 하에서 15개 컬럼 용량 당 5 ml/min의 유속으로 선형 구배 (0-100%)를 갖도록 용출시켰다: 완충액 A= 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]; 완충액 B = 0.5M 이미다졸을 함유하는 출발 완충액. 용출 프로파일을 도 12A에 나타내었으며 단백질 겔은 도 12B에 도시하였다. 분획 17-31을 수집하여 (30 ml) 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]으로 10배 희석하였다. 이것을 두번째 5-ml HiTrap 킬레이팅 컬럼 (Pharmacia)에 로딩시켜 상기와 동일한 공정을 반복하였다. 용출 프로파일을 도 13A에 나타내고 단백질 겔은 도 13B에 도시하였다. 아르기네이즈를 함유하는 분획 10-20을 수집하여 (22 ml), 다음 조건에 따라 50-ml HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (Pharmacia)을 이용하여 염을 제거하였다: 유속 = 10 ml/min, 완충액 = 10mM Tris-HCl (pH 7.4) 및 용출 길이= 1.5 컬럼 부피. 이어서 샘플을 1-ml HiTrap SP FF 컬럼 (Pharmacia)에 로딩시켰다. 용출은 다음 조건에 따라 수행하였다: 유속 = 1 ml/min, 완충액 A = 10mM Tria-HCl (pH 7.4), 완충액 B = 1M NaCl을 함유하는 10mM Tris-HCl (pH 7.4), 선형 구배 (0-100%), 용출 길이 = 30 컬럼 부피. 용출 프로파일을 도 14A에 도시하고 단백질 겔은 도 14B에 나타내었다. 분획 A12-B7을 수집하여 (7 ml) 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]으로 10배 희석하였다. 이 샘플을 두번째 1-ml HiTrap SP FF 컬럼 (Pharmacia)에 로딩하여, 세그먼트화 구배를 갖는 용출을 수행한 것을 제외하고, 상기와 동일한 공정을 반복하였다. 용출 프로파일을 도 15A에 나타내고 단백질 겔은 도 15B에 도시하였다. 분획 A7-B12를 수집하여 (7ml) 50ml HiPrep 26/10 탈염 컬럼 (Pharmacia)를 이용하여 상기와 같이 탈염시켰다. Bradford (Bradford, M.M. 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 760 ml 세포 배양체로부터 총 41.61mg의 아르기네이즈가 정제되었다. 정제된 아르기네이즈의 수율은 55.5 mg/l 세포 배양체 또는 1.3 mg/g 세포습중량인 것으로 평가되었다.

실시예 7: 다양한 조건 하에서 수확 및 정제된 아르기네이즈의 수율 비교

다음 표 2에는 여러가지 수확 및 정제 조건 하에서 생산된아르기네이즈의 수율을 비교하였다. 이 데이타들은 12.8이라는 낮은 세포 밀도에서 열충격 6시간 후 수확하는 것이 정제 후 132 mg/L이라는 더 높은 아르기네이즈 수율을 나타냄을 보여준다.

유가식 발효	아르기네이즈 수율 (mg/L)
	열충격한지 3시간 후에 수확	열충격한지 6시간 후에 수확
OD 12.8에서의 열충격	120	132
OD 25에서의 열충격	-	55.5

실시예 8A: 시아누릭 클로라이드(CC) 활성화된 메톡시폴리에틸렌 글라이콜을 이용한 PEG화 효소의 제조

50 mg의 아르기네이즈를 최종 농도가 2.5 mg/ml가 되도록 20 ml PBS 완충용액 (pH 7.4)에 용해시켰다. 아르기네이즈의 열 활성화는 60℃에서 10분간 수행하였다. 활성화 후, 효소 온도를 실온으로 되돌렸다. 1g 시아누릭 클로라이드 활성화된 메톡시폴리에틸렌 글라이콜 (mPEG-CC) (MW=5000, Sigma)을 1:140의 몰비율로 아르기네이즈에 첨가하였다. 자성 교반 막대를 이용하여 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 모두 용해될 때까지 이 혼합물을 교반하였다.

PEG가 모두 용해되면, 0.1N NaOH를 이용하여 PEG-아르기네이즈 혼합물의 pH를 9.0으로 조정하고, NaOH를 부가로 더 첨가함으로써 다음 30분 동안 pH를 9.0으로 유지시켰다. 0.1N HCl을 첨가함으로써 pH를 다시 7.2로 조정함으로써 PEG화를 중지하였다.

Hemoflow F40S 모세관 투석기 (Fresenius Medical Care, Germany)를 사용하여 4℃, pH 7.4에서 PBS 완충 용액 2-3 리터에 대해 PEG화된 아르기네이즈를 투석하였다. 투석 후, PEG화된 아르기네이즈를 회수하고 최종 농도를 재조정하였다.

PEG화된 아르기네이즈를 0.2μm 필터를 통해 멸균 용기 내로 여과하고 4℃에서 보관하였다. 인간 환자에 있어서의 이 효소의 ½-수명 (반감기)는 약 6시간 인 것으로 검사되었다 (도 21 참조).

실시예 8B: 낮은 PEG 비율로 CC 또는 SPA를 이용하여 B. subtilis에서 발현된 아르기네이즈의 제조

PEG화(pegylation)는 1970년대 Davis, Abunchowski와 그의 동료들에 의해 최초로 개발되었다 (Davis, F.F. 외, 1978, Enzyme Eng. 4, 169-173). 약물 조성을 변형시키는 것과 대조적으로, 치료제 단백질에 폴리(에틸렌 글라이콜) PEG 부분을 화학적으로 부착시키는 것 ("PEG화"로 알려진 공정)은 중요한 약물 특성을 개선시킬 수도 있는 새로운 시도였다 (Harris, J.M. 외, 2001, Clin. Pharmacokinet. 40, 539-551).

1979년 Savoca 등은 커플링제로서 2,4,6-트리클로로-s-트리아진 (시아뉴릭 클로라이드)를 이용하여 소의 간의 아르기네이즈에 5,000 달톤의 메톡시폴리에틸렌 글라이콜 (mPEG)을 공유적으로 부착시켰다 (Savoca, K.V. 외, 1979, Biochimica et Biophysica Acta 578, 47-53). 이 컨쥬게이트 (PEG-아르기네이즈)는 본래긔 효소 활성을 경우 65%만 유지하였다. 이들은 마우스에 있어서 PEG-아르기네이즈의 혈류 수명 (blood-circulating life)이 소의 아르기네이즈보다 연장되었다고 보고하였다. 주입된 소의 아르기네이즈의 반감기는 1시간 미만이었던 것에 비해, PEG-효소의 반감기는 12시간 이었다. 이들의 데이타는 또한 PEG에 의해 변형된 소의 아르기네이즈가 마우스 테스트시, 비면역원성이고 비항원이었음을 지적하고 있다.

재조합 인간 아르기네이즈 (1.068mg)를 얼음온도 또는 실온에서 125mM 보레이트 완충용액 (pH 8.3)에 용해시켰다. 활성화 mPEG, mPEG 프로피온산의 석신이미드 (mPEG-SPA; MW 5,000; Shearwater Corporation) 또는 시아뉴릭 클로라이드로 활성화된 mPEG (mPEG-CC; MW 5,000; Sigma)를 아르기네이즈:PEG의 몰비율이 1:50 또는 1:20이 되도록 상기 용액에 첨가하였다. 이것은 두 단계로 실시하였다. 첫 단계에서는, PEG의 절반을 조금씩 아르기네이즈 용액에 첨가하여 얼음위에서 30분간 가볍게 혼합하여 pH가 권장 범위인 8.0-8.5 범위를 이탈하는 것을 방지하였다. 이어서 나머지 절반의 PEG를 상기 용액에 첨가하고 0.5-23시간 동안 가볍게 추가로 혼합하였다. 이 혼합물을 컷-오프값이 10,000 미만인 투석막을 이용해서 4℃에서 적어도 3회 dH₂O를 갈아주면서 dH₂O에 대해 투석하였다. mPEG-SPA와 mPEG-CC 두가지 모두 변형 부위로서 단백질의 N-말단과 라이신의 아미노기를 이용한다.

아르기네이즈:PEG 몰 비율을 1:50으로 해서 mPEG-SPA (MW 5,000)으로 실온 또는 얼음상에서 아르기네이즈를 변형시킨 경우, 효소 분자 대부분은 반응 1시간 후에 변형되었다 (도 16). 샘플은 반응 23시간 후에도 동일한 것으로 나타났다. 아르기네이즈 분자에 다양한 수의 PEG 분자를 부착시켜 분자량이 성이한 분자들을 생성시켜 ㅆ다. 기대한 대로, 보다 낮은 몰 비율인 1:20으로 PEG화 반응을 수행하자, 비PEG화 형태의 아르기네이즈의 비율이 더 높았다 (도 17). 그러나, 아르기네이즈:PEG의 두가지 몰비율 모두에서, 얼음 대신 실온을 이용하고 반응 시간을 더 길게 하는 것은 PEG화의 정도에 영향을 미치지는 않는 것으로 나타났다. mPEG-SPA (MW 5,000)으로 몰 비율 1:50으로 1시간 반응시킨 경우, 아르기네이즈는 본래의 효소 활성의 72-76%나 유지하였으며 (하기 표 3 참조), 이는 소의 아르기네이즈의 경우 보고된 것보다 훨씬 높은 것이다 (65%; Savoca, K.V. 외, 1979, Biochimica et Biopysica Acta 578, 47-53).

아르기네이즈:PEG 몰 비율을 1:50으로 해서 mPEG-CC(MW 5,000)으로 얼음상에서 아르기네이즈를 변형시킨 경우, 반응은 상당히 느렸으며 PEG화를 완료하는데 23시간이 걸렸다 (도 18A). 뿐만 아니라, 효소 분자의 대부분은 매우 큰 분자량의 좁은 스펙트럼으로 변했다. 도 18A에 도시된 바와 같이, 보다 낮은 몰비율인 1:20이었을 때보다, 반응은 훨씬 느렸다.

실시예 8C: 고활성 PEG화 아르기네이즈의 제조

15 리터 들이 B. Braun Biostat C 스테인레스강 발효조에서 실시예 4에 설명된 바와 같이 유가식 발효를 수행하였다. OD 12-13에서 열충격 4.5 시간 후에 수집한 세포 배양체 (8.4 L)를 4℃에서 5,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 세포를 펠릿화시켰다. 배양 상등액을 폐기하고 세포 펠릿을 -80℃에서 보관하였다. 이 세포들은 이 온도에서 며칠동안은 안정하다. 세포내 단백질을 추출하기 위해, 세포 펠릿을 1250 ml의 가용화 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1M NaCl, 5 mM MnSO₄, 라이소자임 (75μg/ml)]에 재현탁시켰다. 30℃에서 20분간 인큐베이션시킨 후, 혼합물을 12회 초음파 처리하였다. 이 초음파 처리는 매회 10초간 지속되며 (따라서 총 120초간), Soniprep 150 Apparatus (MSE)를 이용하여 2분 간격으로 수행하였다. 약 5000 유닛의 데옥시리보뉴클리에이즈 I (Sigma D 4527)을 첨가하고 이 혼합물을 37℃에서 15분간 인큐베이션시켜 염색체 DNA를 절단시켰다. 4℃에서 각각 30분간 9,000 rpm에서 2회 원심분리한 후, 조질의 단백질 추출물을 함유하는 상등액을 아르기네이즈 활성 존재여부에 대해 검사하고 SDS-PAGE 분석하였다 (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680-685).

조질의 단백질 (1195 ml)을 여과하여, 한 부분 당 597.5 ml씩 두부분으로 나누었다. 각 부분을 130ml 들이 Ni-NTA 수퍼플로우 (Qiogen) 컬럼 (Pharmacia)에 로딩시켰다. 다음 조건 하에서 15개 컬럼 용량 당 5 ml/min의 유속으로 선형 구배 (0-100%)를 갖도록 용출시켰다: 완충액 A= 출발 완충액 [0.02M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 7.4), 0.5M NaCl]; 완충액 B = 0.5M 이미다졸을 함유하는 출발 완충액. 순수한 아르기네이즈를 함유하는 분획을 수집하여 Pellicon XS 장치 (폴리에테르-설폰 막 컷오프 값 = 8kDa)와 실험실 규모의 탄젠트 플로우 여과시스템 (Millipore)를 이용하여 PBS 완충액, pH 7.4fh 4℃에서 35 ml/min으로 완충액을 교환하였다. Bradford (Bradford, M.M. 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254)에 따라 단백질 농도를 측정하였다. 8.4L 세포 배양체로부터 총 788 mg의 아르기네이즈가 정제되었다. 정제된 아르기네이즈의 수율은 94 mg/l 세포 배양체였다. 측정된 비활성(specific activity)은 518 I.U./mg으로 높았다.

PBS 완충액에서 높은 비활성을 갖는 PEG화 아르기네이즈가 제조되었다. 정제된 아르기네이즈 (비활성 = 518 I.U./ml)를 PEG화 수행에 앞서 PBS 완충액에 넣었다. mPEG-SPA, MW 5,000 (5.82)를 1L 들이 비이커 중 555 ml의 정제된 아르기네이즈 (813.64 mg, 1.466 mg/ml) 용액에 천천히 첨가한 다음 실온에서 2시간 40분 동안 교반하였다 (아르기네이즈: mPEG-SPA의 몰 비율 = 1:50). 이어서 F50(S) 모세관 투석기 (Fresenius Medical Care)를 이용하여 15L의 PBS 완충액에 대해 초투석에 의해 혼합물을 집중 투석하여 인코포레이션되지 않은 PEG를 모두 제거하였다. mPEG-SPA은 라이신의 아미노기와 단백질의 N-말단을 변형 부위로서 이용한다. PEG화 아르기네이즈의 측정된 비활성은 592 I.U./mg이나 될 정도로 높았다. 천연 및 PEG화 아르기네이즈의 SDS-PAGE 분석 결과를 도 18B에 도시하였다. PEG화 아르기네이즈는 실온에서 3주일 이상 1 mg/ml로 PBS 완충액 중에서 보관시 아르기네이즈 활성과 단백질 농도 측면에서 매우 안정하였다. 1 mg/ml로 PBS 완충액 중 4℃에서 보관되었을 경우에는, 비활성의 감소 없이 적어도 6개월간 안정하다.

상이한 몰비율 및 온도에서 여러가지 활성화 PEG로 PEG화된 경우 아르기네이즈의 활성%)
PEG화 반응에 허락된 시간 (h)	아르기네이즈의 활성(%)(아르기네이즈:mPEG-SPA 비율 1:20으로 실온에서 PEG화)	아르기네이즈의 활성(%) (아르기네이즈:mPEG-SPA 비율 1:20으로 얼음 상에서 PEG화)	아르기네이즈의 활성(%) (아르기네이즈:mPEG-SPA 비율 1:50으로 실온에서 PEG화)	아르기네이즈의 활성(%) (아르기네이즈:mPEG-SPA 비율 1:50으로 얼음 상에서 PEG화)	아르기네이즈의 활성(%) (아르기네이즈:mPEG-CC 비율 1:20으로 얼음 상에서 PEG화)	아르기네이즈의 활성(%) (아르기네이즈:mPEG-CC 비율 1:50으로 얼음 상에서 PEG화)
0	100	100	100	100	100	100
1	83	76	76	72	ND	ND
2	79	76	72	68	68	64
5	83	74	74	72	65	65
23	75	72	72	64	66	66

ND: 측정되지 않음

아르기네이즈의 100% 활성은 33 I.U./mg 단백질에 해당함.

실시예 9A: 실시예 8A로부터 얻어진 아르기네이즈의 생체내 반감기(½-life) 측정

PEG화 아르기네이즈를 환자에게 주입하였다. EDTA 중 3ml 혈액 샘플을 매일 환자로부터 채취하였다. 생체외(ex-vivo) 효소 반응을 방지하기 위해 용융 얼음 상에서 4℃까지 튜브를 예비냉각시켰다. 이어서 혈액을 14000 rpm에서 2분간 즉시 스핀 다운시켜 적혈구를 제거하였다. 1.5 ml 상등액 (혈장)을 피펫으로 꺼내어 새로운 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 이어서 혈장을 37℃에서 30분간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 아르기닌을 100 μM 농도로 기질로서 첨가하였다. 효소 반응은 37℃에서 0분, 10분, 30분, 60분간 수행하였다. 각각의 시간 간격마다, 300 μl의 반응 샘플을 취하여 300 μl의 10% 트리클로로아세트산이 함유된 새로운 에펜도르프 튜브에 옮김으로써 반응을 중단시켰다. 샘플을 채취해서 최대속도 (14000 rpm)로 10분간 회전시켰다. 상등액을 피펫으로 취해서 0.45 μm 필터로 여과하였다. 마지막으로, 상이한 시간 간격의 샘플을 아미노산 분석기 (Hitachi, L8800)로 분석하였다. 결과를 도 21에 도시하였다.

PEG화 아르기네이즈의 회분식 2개를 연구기간 중 실시예 8A에 설명된 바와 같이 준비하였다. PEG화 아르기네이즈의 제1회분식는 아르기네이즈:PEG 몰 비율 = 1:140으로 준비하였다. PEG화 아르기네이즈의 제2회분식는 아르기네이즈:PEG 몰 비율 = 1:70으로 준비하였다. 이들 두개의 회분식를 준비하는데 이용된 PEG화 프로토콜 및 조건은 동일하였다 (실시예 8A 참조).

제 0시에, PEG화 아르기네이즈의 제1회분식 50 mg을 주입하였다. 12시간 후, PEG화 아르기네이즈의 제1회분식를 50mg 더 주입하였다. 아르기네이즈 제3차 주입은 제24시간 째에 행하였으며 여기서는 PEG화 아르기네이즈의 제1회분식 50mg을 더 사용하였다.

제26시부터 제72시까지, PEG화 아르기네이즈의 제1회분식를 간헐적 주입 (50 mg/투여)하는 대신, 연속 주입 (100 mg/일)시켰다. 제72시부터 제144시까지는, 100 mg/일의 속도로 PEG화 아르기네이즈의 제2회분식를 연속 주입하였다. 연속적인 아르기네이즈의 주입을 제144시에 중단하고, 이 시점에서 시작된 반감기를 측정하였다. 반감기 측정 결과를 도 22에 도시하였다. 도 22에서 제0시는 도 21에서 제 144시에 해당한다.

얻어진 결과는 아르기네이즈의 활성 반감기가 두개의 상(phase)로 구분될 수 있음을 가리킨다. PEG화 효소의 제1반감기는 약 6시간 이었다. 상대활성이 100%에서 50%로 감소되는데 약 6시간이 걸렸다 (도 22 참조). 그러나, 제2반감기 약 21일이었다. 즉 상대활성이 50%에서 25%로 감소되는데 약 21이 소요되었다. 이러한 이중 반감기 효과는 PEG화에서 mPEG-CC를 더 많은 양으로 사용하고 특이적 주입 프로토콜을 사용하는 등 여러가지 변수에 기인하는 것일 수 있다.

실시예 9B: 인간의 혈장에서의 방법을 사용한 PEG화 아르기네이즈의 생체외 반감기 측정

정제된 아르기네이즈 (1mg)을 얼음 상에서 125 mM 보레이트 완충액 (pH 8.3) 1 ml에 용해시켰다. 활성화 PEG (mPEG-SPA, MW 5,000) (7.14 mg)을 아르기네이즈:PEG의 몰 비율 = 1:50으로 단백질 용액에 서서히 첨가하였다. 실시예 8B에 설명된 방법에 따라 이 혼합물을 얼음 상에서 2.5 시간 동안 교반하였다.

1 mg/ml 농도의 PEG화 아르기네이즈 (305.6 μl)를 인간 혈장 (1ml)에 첨가하자 PEG화 아르기네이즈의 최종 농도는 0.24 mg/ml였다. 이 혼합물을 에펜도르프 튜브에 20개 분주액으로 나누고 (에펜도르프 튜브 한개 마다 65 μl 혼합물), 37℃에서 인큐베이션시켰다. 아르기네이즈 활성을 테스트하는데 각각의 에펜도르프 튜브로부터의 혼합물 1-2 μl씩을 사용하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다. 반감기는 약 3일인 것으로 측정되었다. 상대 활성이 100%에서 50%로 감소되는데 약 3일이 걸렸다. 이것은 도 20의 곡선을 이용하여 측정된 것이다.

실시예 10: B. subtilis-발현된 인간의 아르기네이즈 및 PEG화, 분리 및 정제된 재조합 인간 아르기네이즈의 특징화

(a) SDS-PAGE 및 루미-조영에 의한 아르기네이즈의 순도 측정

Ikemoto 등 (Ikemoto 등, 1990, Biochem. J. 270, 697-703)에 의해 설명된 방법으로 얻어진, 정제된 E. coli-발현된 아르기네이즈를 본 발명에서 설명된 방법으로 얻어진 정제된 B. subtilis-발현된 재조합 인간 아르기네이즈와 비교하였다 (도 19A 및 19B). 도 19A에 도시된 총 단백질 밴드의 밀도를 Lumi-imager^TM (Roche Molecular Biochemicals)의 Lumianalyst 32 프로그램과 비교하자 본 발명에서 개발된 프로세스가 99.9% 이상의 순도를 갖는 아르기네이즈를 생산하는 것으로 나타났다 (도 19B). 그러나, 80-100% 순도 사이의 아르기네이즈 역시 약학적 조성물을 제조하는데 활성 성분으로 이용가능하다. 바람직한 구체예에서는, 80-100% 순도의 재조합 아르기네이즈를 사용한다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 아르기네이즈는 루미-조영을 수반하는 SDS-PAGE를 이용할 때 90-100%이다.

(b) 커플링 반응에 의한 비활성의 측정

아르기네이즈에 의한 L-아르기닌으로부터의 우레아 방출 속도를 우레아제, L-글루타메이트 데하이드로게네이즈 및 NADPH를 함유하는 시스템으로 모니터링하였다 (Ozer, N., 1985, Biochem. Med. 33, 367-371). 마스터 믹스를 제조하기 위해, 0.605g Tris, 0.0731g α-케토글루타레이트 및 0.4355g 아르기닌을 40 ml dH₂O에 용해시켰다. 1M HCl로 pH를 8.5로 조정한 다음 이 혼합물에 우레아제 0.067g을 첨가하였다. 0.0335 g의 글루타메이트 데하이드로게네이즈와 0.0125 g의 NADPH를 첨가하기 전에 pH를 8.3으로 재조정하였다. dH₂O를 이용하여 최종 부피를 50 ml가 되도록 조정하여 마스터 믹스를 얻었다. 피펫을 이용해서 이 마스터 믹스 (1ml)를 석영 큐벳에 옮겼다. 아르기네이즈 활성 측정을 위해, 1-5 μg의 아르기네이즈를 첨가하고 340 nm에서의 흡광도 (A₃₄₀) 감소가 30℃에서 1-3분간 이어졌다. 아르기네이즈 1 I.U.는 주어진 조건 하에서 1분간 우레아 1 μmol을 방출하는 효소량으로 정의된다. 본 발명의 정제된 재조합 인간 아르기네이즈의 비활성은 518 I.U./mg 단백질인 것으로 산출되었으며, 이것은 정제된 인간 적혈구 아르기네이즈에 대해 보고된 값(204 I.U./mg 단백질; Ikemoto 외, 1989, Ann. Clin. Biochem. 26, 547-553) 및 E.coli-발현된 분리 및 정제된 재조합 인간 아르기네이즈 (389 I.U./mg 단백질; Ikemoto 외, 1990, Biochem. J. 270, 697-703) 보다 훨씬 더 높은 것이다.

mPEG-SPA (MW 5,000)을 이용해서, 몰 비율 1:50으로 2시간 40분간 반응시킨 경우 PEG화 아르기네이즈는 최초의 효소 활성을 114%나 유지하였다 (실시예 8C 참조). 이것은 PEG화 인간 아르기네이즈의 비활성이 592 I.U./mg임을 의미한다.

mPEG-CC (MW 5,000)을 이용한, PEG화 인간 아르기네이즈는 최초의 효소 활성을 64-68% 유지하였으며 (표 3), 이것은 PEG화된 소의 아르기네이즈의 경우와 유사한 것이다 (Savoca, K.V. 외, 1979, Biochimica et Biophysica Acta 578, 47-53).

(c) 전기분무 LC/MS에 의한 천연 아르기네이즈의 구조적 특징화

도 2B에 도시된 아미노산 서열에 따른, B. subtilis-발현 및 정제된 재조합 인간 아르기네이즈는 이론적 분자량이 35,647 Da이고 329개의 아미노산 잔기를 함유한다. 천연 아르기네이즈의 동시적인 HPLC/UV 및 질량 스펙트럼분석 결과 분자량이 35,634 Da인 것으로 나타났다. 천연 아르기네이즈의 관찰된 분자량은, 6xHis-태그된 인간 아르기네이즈의 예상된 아미노산 서열 (도 2B)로부터 유추된 이론적 분자량인 35,647 Da와 잘 일치하는 것으로 나타났다. 순도는 LC/MS에 기초한 HPLC/UV로는 98%, 215 nm 상대적 반응에서의 HPLC/UV 검측에 기초한 LC/MS로는 100%였다.

(d) 겔 여과 크로마토그래피에 의한 천연 아르기네이즈 및 PEG화 아르기네이즈의 구조적 특징화

PBS 완충액 중 약 2.8 mg/ml의 단백질 농도에서 HiLoad 16/60 수퍼덱스 겔 여과 컬럼 (Pharmacia)에서의 겔 여과 크로마토그래피 연구 결과, 천연 아르기네이즈의 분자량은 약 78 kDa이고 PEG화 아르기네이즈(실시예 8C에서 제조된)의 분자량은 약 688 kDa인 것으로 밝혀졌다. 모노머 아르기네이즈의 분자량이 약 36 kDa이므로, 이 결과는 천연 아르기네이즈가 PBS 완충액 중에서 다이머로서 존재함을 시사하는 것이다.

(e) 2차 구조 연구

원형 이색성 (CD: circular dichroism)을 이용하여 JASCO 모델 J810 CD 스펙트로미터로 정제된 아르기네이즈의 2차 구조를 분석하였다. 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 중 동일 단백질 농도에서 천연 아르기네이즈의 CD 스펙트럼은 195 nm에서 240 nm까지 스캐닝시 PEG화 아르기네이즈 (실시예 8C에 따라 제조됨)의 그것과 매우 유사한 것으로 밝혀졌으며, 이는 아르기네이즈의 천연 형태와 PEG화 형태가 거의 동일한 2차 구조를 가짐을 가리키는 것이다.

(f) pI점 측정

Bio-Rad Model 111 미니 IEF 셀을 이용하여, 천연 아르기네이즈 (실시예 8C에 따라 제조함)의 등전점 (pI)을 측정하여 9.0으로 나타났으며 이는 문헌(Christopher 및 Wayne, 1996, Comp. Bioehm. Physiol. 114ㅠ, 107-132)에 나타난 공표값인 9.1과 일치하는 것이다.

(g) 기능적 특징화 및 운동학적 특성의 측정

아르기네이즈 활성 측정을 위해 Ikemoto 등 (1990, Bioehm. J. 270, 697-703)에 의해 보고된 방법을 이용하자, 천연 아르기네이즈는 K_m이 1.9±0.7 mM, V_max는 518 μmol 우레아 min^-1 mM^-1, k_cat는 2.0±0.5 s^-1, k_cat/K_m은 1.3±0.4 mM^-1s^-1인 것으로 나타났다. 정제된 아르기네이즈의 K_m 값은 문헌 (Carvajal, N. 외, 1999) 상의 인간의 간 아르기네이즈의 값 (2.6 mM)과 유사한 것으로 나타났다. 뿐만 아니라, 천연 아르기네이즈의 최대 활성을 얻기 위해서는 약 1mM의 Mn²⁺ 이온과 30-50℃의 온도가 필요하다.

PEG화 아르기네이즈는 K_m이 2.9±0.3 mM이고, V_max는 360 μmol 우레아 min^-1 mM^-1였다 . PEG화 아르기네이즈의 K_m 값은 천연 아르기네이즈의 그것과 유사한데, 이는 아르기닌에 대한 결합 친화도가 PEG화 후에도 유지됨을 시사하는 것이다. 또한, PEG화 아르기네이즈의 최대 활성을 얻기 위해서는 약 1mM의 Mn²⁺ 이온과 40-50℃의 온도 및 pH 10의 조건이 필요하다.

PEG화 전후의 아르기네이즈의 기능적 특성은 유사하며, 이는 mPEG-SPA 분자의 아르기네이즈에 대한 공유적 부착이 그의 특성을 전체적으로 개선시켰음을 가리키는 것이다.

실시예 11: 외래적으로 투여된 아르기네이즈를 이용한 치료 프로토콜

아르기닌 레벨, 아르기닌 활성, 완전한 혈액 사진 및 완전 응혈 프로파일을 얻기 위해 치료전기간 동안 매일 환자로부터 혈액을 채취하였다. 신장 기능과 간 기능은 적어도 하루 걸러, 그리고 필요하다면 더 자주 측정하였다.

아르기네이즈 주입 개시 후 1시간 동안 15분 마다 바이털 사인 (BP, 펄스, 호흡률, 옥시미터 판독값)을 측정하고 안정해질 때까지는 매시간 측정하였다. 그 후에는 담당 의사에 재량에 따라 측정하였다.

아르기네이즈 주입 20분 전, 아르기네이즈를 매번 새로 주입하기 전에 또는담당 치료의의 재량에 따라, 예비처치로서 디페네라민 10 mg 정맥 주사 및 하이드로코르티손 100 mg을 정맥 주사하였다.

제1일에 아르기네이즈를 30분간 주입한다. 그 후, 아르기네이즈를 적어도 8주일 동안 매주마다 주입하였다. 이것은 항종양 활성이 관찰되는 경우 계속할 수 있다.

실시예 12: 외래적으로 투여된 아르기네이즈를 이용한 치료 프로토콜의 예시

모든 표준적 치료가 실패로 돌아간, 심각한 폐 전이를 수반한 전이 신장 육종을 앓고 있는 54세의 중국인 여성을 2001년 8월 초에 PEG화된 재조합 아르기네이즈를 이용해서 치료하였다. 환자의 주요 증상은 기침, 식욕저하 및 변비였다. 환자의 암 마커 CEA는 1100 U/ml였다. 치료에 앞서, PEG화된 재조합 아르기네이즈를 이용한 치료 동의를 얻었다.

치료적 방법학

850 mg의 동결건조된 재조합 아르기네이즈 I을 투여하였다. PBS에 약물을 재조성시킨 다음 PEG화시켰다. PEG화된 이 효소는 활성을 완전히 나타내는 것으로 밝혀졌다.

결과

도 28 및 도 29에 결과를 나타내었다. 도 28은 5일간 아르기닌이 1-5μM 사이로 만족할만하게 고갈되었음을 보여준다 (도 21도 참조). 도 29는 CEA 레벨이 4주 동안 1100에서 800으로 감소하였음을 보여준다.

1) 화학요법과 달리 이 치료법은 골수 억압 효과나 탈모증상을 일으키지 않았다.

2) 이 방법은 잘 통제된 방식으로 아르기닌을 결핍시켜, 5일의 소망 기간 동안 아르기닌 레벨을 치료범위 (1-8μM) 내로 유지시켰으며, 이 생체외 데이터는 최적의 종양 사멸효과를 시사하는 것이다.

3) 이렇다할 심각한 부작용도 없었고 환자는 경미한 두통을 일으켰을 뿐 이 두통조차 이 치료에 직접적으로 기인한 것이 아닐 수도 있다.

4) 이 질병의 생화학적 및 방사능학적 회복이 치료 후 관찰되었으며 즉, CEA는 30%까지 감소되었고 흉부 X선상으로 상부 대역의 환부가 소거되었다.

실시예 13: 아르기네이즈를 이용한 실험실 래트에 있어서의 아르기닌의 생체내 결핍

이 실시예에서는 4 그룹의 래트 (각 그룹당 2마리, 한마리는 수컷, 또 한마리는 암컷)에게 실시예 8C에서 수득된 아르기네이즈를 다양한 양으로 제0일에 투여하였다. 재조합 인간 아르기네이즈를 복강 주사하기에 앞서 제0일에 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 이어서 제1일부터 제6일까지 2일마다 채혈하였다.

도 23에 도시된 바와 같이, 검측불가능한 아르기닌 레벨이 모든 그룹에서 달성되었으며 단지 아르기닌 결핍 1일 후에 500 I.U.로 투여량 의존적인 것으로 나타났다. 1000 I.U. 투여시 (아침에 500 I.U. 투여하고 오후에 또 500 I.U. 투여), 완전한 아르기닌 결핍까지 4일이 걸렸다. 1500 I.U.를 단일 투여한 경우, 6-일 아르기닌 결핍되었다. 이 투여량을 3000 I.U.로 배가시키자, 완전한 아르기닌 고갈에 걸리는 기간은 더 이상 연장되지 않은 것으로 나타났다.

따라서, PEG화 아르기네이즈를 1500 I.U 복강 투여하는 것이 6일 동안 검출불가능한 아르기닌 레벨로 아르기닌 결핍에 대한 최적 투여량인 것으로 나타났다.

실시예 14: 제1일부터 제5일까지 정상적인 래트와 아르기네이즈에 의해 유발된 제로 아르기네이즈 레벨을 갖는 래트 간의 혈액 성분 레벨의 변화 비교

아르기네이즈 투여 전 제0일에 5마리 래트로 된 그룹으로부터 심장 동맥 혈액 샘플을 채취하였다. 제0일의 샘플을 미처리 대조군으로 하였다. 총 단백질 레벨, 알부민 레벨, 글로불린 레벨, SGOT/AST 레벨, SGPT/ALT 레벨, 헤모글로빈 레벨, 피브리노겐 A.P.T.T./초, 프로트롬빈/초, 백혈구 수(WBC) 및 혈소판수를 Pathlab Medical Laboratory Ltd. (2층, Floor Henan Building, 90-92, Jaffe Road, Wanchai, Hong Kong 소재)에 의뢰하여 측정하였다. 이어서, 래트에게 아르기네이즈 1500 I.U.를 1회 복강주사하였다. 모든 래트에 있어서 제로 아르기닌 레벨이 달성되었다. 제1일부터 제5일까지, 매일 래트를 한마리씩 희생시켜 심장내 동맥 혈액 샘플을 채취하여 Pathlab Medical Laboratory에서 측정하였다. 그 결과 모든 단백질은 PathLab Medical Laboratory에 의해 인용된 정상 범위 내인 것으로 나타났다.

실시예 15: Hep3B 종양-산생 누드 마우스에 있어서 아르기닌 결핍에 대한 반응

인간의 간암 세포종 (Hep3B2.1-7)을 6마리의 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 피하 접종하여 종양 성장을 유발하였다. 무작위적으로 고른 세마리에게, 실시예 8C에 설명된 방법에 따라 얻어진 PEG화 아르기네이즈 500 I.U.를 1주일에 한번 복강 투여하고, 다른 세마리에게는 아르기네이즈 치료를 하지 않음으로서 대조군으로 삼았다. 간암이 이식된 마우스들은 이틀에 한번 고형 종양의 성장을 디지털 캘리퍼 측정에 의해 현시적으로 (in situ) 관찰하여 다음 공식에 따라 종양 크기를 산출하였다.

종양 크기 (mm) = 두가지 수직 직경과 한가지 대각선 직경의 평균값

각 그룹에서 죽은 마우스의 수 역시 일별 기준으로 기록하였다.

도 24에 도시된 바와 같이, 대조군에서 1일당 종양의 크기 증가율은 실험한지 최초 20일 동안 PEG화 아르기네이즈로 처리된 그룹에서의 증가율의 약 6배에 달했다. 대조군의 2마리는 24일 이내에 죽었지만 PEG화된 아르기네이즈로 치료된 마우스들은 적어도 75일간 생존하였다.

실시예 16: PLC/PRF/5 종양-산생 누드 마우스에 있어서 아르기닌 결핍에 대한 반응

이 실시예에서는, 10마리의 BALB/c 누드 마우스의 등에 인간 간암종(PLC/PRF/5)의 고형 종양을 피하이식하여 종양 성장을 유발하였다. 무작위적으로 고른 5마리의 마우스에게 실시예 8C에 설명된 방법에 따라 얻어진 PEG화 아르기네이즈 500 I.U.를 1주일에 한번 복강 투여하고, 다른 다섯마리에게는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 200 μl 투여함으로써 대조군으로 삼았다. 간암이 이식된 마우스들은 이틀에 한번 고형 종양의 성장을 디지털 캘리퍼 측정에 의해 현시적으로 (in situ) 관찰하여 종양 크기와 질량을 측정하였다.

종양 크기는 실시예 15에 설명된 바와 같이 측정하고 종양 질량은 다음 공식에 따라 산출하였다:

종양 질량 (mg) = 길이 x 폭²/2 (비중을 1.0g/cm³으로 상정함)

(여기서 길이는 최장 수직 직경이고 폭은 최단 수직 직경임)

도 25에 도시된 바와 같이, 실험한지 최초 39일간, 1일 동안의 종양 크기 증가율은 대조군에서는 약 6.5 mm/일이고 PEG화된 아르기네이즈로 처치된 그룹에서의 종양의 크기 증가율은 약 5.3 mm/일인 것으로 나타났다. 도 25B에 도시된 바와 같이, 1일 동안의 종양의 질량 증가율은 처리군에 비해 대조군이 약 1.8배 더 높았다.

실시예 17: HuH-7 종양-산생 누드 마우스에 있어서 아르기닌 결핍에 대한 반응

이 실시예에서는, 10마리의 BALB/c 누드 마우스의 등에 인간 간암종(HuH-7)의 고형 종양을 피하이식하여 종양 성장을 유발하였다. 무작위적으로 고른 5마리의 마우스에게 실시예 8C에 설명된 방법에 따라 얻어진 PEG화 아르기네이즈 500 I.U.를 1주일에 한번 복강 투여하고, 다른 다섯마리에게는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 200 μl 투여함으로써 대조군으로 삼았다. 간암이 이식된 마우스들은 이틀에 한번 고형 종양의 성장을 디지털 캘리퍼 측정에 의해 현시적으로 (in situ) 관찰하여 실시예 15 및 16에 설명된 바와 같이 종양 크기와 질량을 측정하였다.

도 26에 도시된 바와 같이, 실험한지 최초 18일간, 1일 동안의 종양 크기 증가율은 대조군에서는 약 6.0 mm/일이고 PEG화된 아르기네이즈로 처치된 그룹에서의 종양의 크기 증가율은 약 5.6 mm/일인 것으로 나타났다. 도 26B에 도시된 바와 같이, 1일 동안의 종양의 질량 증가율은 처리군에 비해 대조군이 약 1.4배 더 높았다.

실시예 18: MCF-7 종양 산생 누드 마우스에 있어서 아르기닌 결핍에 대한 반응

이 실시예에서는, 4마리의 BALB/c 누드 마우스의 오른쪽 옆구리에 인간 유방암종 세포주 (MCF-7)을 피하접종하여 종양 성장을 유발하였다. 무작위적으로 고른 3마리의 마우스에게 실시예 8C에 설명된 방법에 따라 얻어진 PEG화 아르기네이즈 500 I.U.를 1주일에 한번 복강 투여하고, 나머지 1마리에게는 아르기네이즈 처치를 하지 않고 대조군으로 삼았다. 유방암종 세포가 이식된 마우스들은 이틀에 한번 고형 종양의 성장을 디지털 캘리퍼 측정에 의해 현시적으로 (in situ) 관찰하여 실시예 15에 설명된 바와 같이 종양 크기를 측정하였다.

도 27에 도시된 바와 같이, PEG화 아르기네이즈로 처치된 마우스들에 있어서는 접종된 종양이 실험 20일 이내에 사라졌다.

본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서, 문맥상 명백히 달리 언급되지 않는 한 단수형 "a", "and" 및 "the"에는 복수형도 포괄되는 것이다. 따라서, 예컨대 "약학적 제제 (a pharmaceutical preparation)"이라는 표현은 여러가지 제제들의 혼합물도 포괄하는 것이고, "치료방법 (the method of treatment)"라는 표현은 당업자에게 알려진 동등한 단계와 방법을 포괄하는 것이다.

달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술용어와 과학용어는 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는 것으로 한다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 여하한 방법과 재료를 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용할 수 있으나, 바람직한 방법과 재료는 여기에 설명된 바와 같다. 본 명세서에서 언급된 모든 출판문헌은 관련 인용문헌의 특정 정보를 설명 및 개시하기 위해 본 명세서에 참조적으로 인코포레이션된다. 이제까지 완전히 설명되었으므로, 본 발명은 그 범위 내에서의 여하한 변형이든 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 모든 변형 역시 본 발명의 범위에 속하는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 포큘레이션은 고체, 용액, 에멀젼, 분산제, 미셀, 리포좀,등의 형태로 사용가능하며, 여기서 얻어진 포뮬레이션은 활성 성분으로서 본 발명을 실시하는데 있어 한가지 이상의 변형된 인간 아르기네이즈를, 장내 또는 비경구 투여에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제와의 혼합물로서 함유한다. 활성 성분들은 대개, 예컨대 정제, 펠릿, 캡슐, 좌약, 용액, 에멀젼, 현탁제, 및 기타 제제르 고체, 반고체 또는 액체 형태로 제조하는데 사용하기에 적합한 기타의 여하한 유형에 적합한, 비독성의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 조성되는 아르기네이즈일 수 있다. 하나 이상의 아르기네이즈의 활성 성분을 표적 프로세스, 증상 또는 질환에서 소망되는 효과를 얻는데 충분한 양으로 약학적 포뮬레이션에 포함시킨다.

본 명세서에서 상정된 활성 성분들을 함유하는 약학적 포뮬레이션은 예컨대 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁제, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐 또는 시럽이나 엘릭시르제와 같은 경구용도에 적합한 형태일 수 있다. 경구 용도로 의도된 포뮬레이션은 약학적 포뮬레이션 제조와 관련하여 해당 기술분야에 널리 알려진 어떤 방법으로든 제조가능하다. 정제는 코팅되지 않을수도 있고, 공지 기술에 따라, 위장관 내에서의 분해와 흡수를 지연시켜 장기간 동안 지속적인 활성을 제공하도록 하기 위해 코팅될 수도 있다. 이들은 또한 조절적 방출을 위해 삼투압 치료 정제를 형성하도록 코팅될 수도 있다.

몇몇 경우에 있어서, 경구용도를 위한 포뮬레이션은 경질 젤라틴 캡슐 형태일 수 있으며 여기서 활성 성분은 예컨대 칼슘 카보네이트, 칼슘 포스페이트, 카올린 등과 같은 불활성 고체 희석제와 혼합된다. 이들은 또한 활성 성분이 물 또는 예컨대 피넛유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 같은 유성 매질과 혼합된 연질 젤라틴 캡슐 형태일 수도 있다.

약학적 포뮬레이션은 또한 멸균 주사용액 또는 현탁액 형태일 수도 있다. 이 현탁액은 적절한 분산제 또는 습윤제와 현탁제를 이용하여 공지 방법에 따라 조성될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 예컨대 1,4-부탄디올 중의 용액처럼 비독성 경구용으로 적합한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용액 또는 현탁제일 수 있다. 용매 또는 현탁용 매질로는 멸균, 비휘발성유 (fixed oil)가 편리하게 이용된다. 이 목적을 위해 합성 모노글리세라이드나 디글리세라이드, 지방산 (올레산 포함), 참기름, 코코넛유, 피넛유, 면실유와 같은 자연발생적 식물성유, 예컨대 에틸 올리에이트 등과 같은 합성 지방 비히클을 비롯하여 여하한 비휘발성유도 모두 사용가능하다. 완충액, 덱스트로서 용액 방부제, 항산화제 등도 필요에 따라 가용성 효소를 용해하기 위한 용질로서 인코포레이션되거 사용가능하다.

약학적 포뮬레이션은 또한 다른 화학치료제와 함께 부가치료에 사용될 수 있다.

특허청구범위에서, SEQ ID NO. 9에 도시된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 아르기네이즈라 함은, 그 서열이 SEQ ID No. 9에 도시된 것과 적어도 30% 상동적임을 의미하거나 또는 본 명세서에 설명된 아르기네이즈 활성 분석에 의할 경우, SEQ ID No. 9의 효소와 그것과 실질적으로 유사한 효소 간의 효소 활성에 있어서 유의적인 차이가 없음을 의미하는 것이다. 정제를 용이하게 하기 위해 6개의 히스티딘이 제공되며 그의 아미노 말단에 제공된 부가적인 메티오닌기는 번역을 개시시킨다. 당업자에게는 다른 정제 형태도 이용가능함과, 따라서, "실질적으로 유사한" 아르기네이즈가 SEQ ID No. 3의 MHHHHHH 서열과 여하한 상동성을 가질 필요는 없다는 것이 자명할 것이다. 몇몇 박테리아 균주는, SEQ ID No. 9와 적어도 40%의 상동성을 가질 수 있다. 몇몇 포유류의 아르기네이즈는 SEQ ID No. 9와 70%의 상동성을 가질 수 있다.

<110> BIO-CANCER TREATMENT INTERNATIONAL LIMITED CHENG, Ning M LEUNG, Yun C LO, Wai H <120> PHARMACEUTICAL PREAPRATION AND METHOD PF TREATMENT OF HUMAN MALIGNANCIES WITH ARGININE DEPRIVATION <130> SDR/25706 <150> PCT/GB 03/02665 <151> 2003-06-20 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2002 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gaattgtacg tcaaagagat gaagcagaaa aacgtcgtcg agaagaagct gaacgacaaa 60 aagtgaaatg cgagggaagt ccaagaaatg gtgattatga gggtgtctat ttcaccaaaa 120 acggagaata tttattggaa ttaagagtct ctgggactgc tcttgtaaat gctccttgta 180 atttaaagga tattgacata acgaaatggt tgtgtaaaac agggagatta tatcttgata 240 aggttaagaa atttgaaata gttactattc tttcccatga cgtagaaaat caaaagatta 300 taacagaatg ggagtcactc cccagagagg ctttacccga acaatttgat tcataagaac 360 taattagtag cgctttccaa tggaggcgct tttttatttg ggtagttgca taccactaaa 420 gatgttcagg tgcacatgag cattggagga aaggaacgct ttagggggaa gggaaacctt 480 taaacagtct taatccccct tgattttatg ttctctgtaa actgcgtccg gtaaatctca 540 ggatagacaa tcggcggtta acggcttgag 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Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu 20 25 30 gaa ggc cct aca gta ttg aga aag gct ggt ctg ctt gag aaa ctt aaa 144 Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys 35 40 45 gaa caa gag tgt gat gtg aag gat tat ggg gac ctg ccc ttt gct gac 192 Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp 50 55 60 atc cct aat gac agt ccc ttt caa att gtg aag aat cca agg tct gtg 240 Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val 65 70 75 80 gga aaa gca agc gag cag ctg gct ggc aag gtg gca caa gtc aag aag 288 Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Gln Val Lys Lys 85 90 95 aac gga aga atc agc ctg gtg ctg ggc gga gac cac agt ttg gca att 336 Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile 100 105 110 gga agc atc tct ggc cat gcc agg gtc cac cct gat ctt gga gtc atc 384 Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile 115 120 125 tgg gtg gat gct cac act gat atc aac act cca ctg aca acc aca agt 432 Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser 130 135 140 gga aac ttg cat gga caa cct gta tct ttc ctc ctg aag gaa cta aaa 480 Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys 145 150 155 160 gga aag att ccc gat gtg cca gga ttc tcc tgg gtg act ccc tgt ata 528 Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile 165 170 175 tct gcc aag gat att gtg tat att ggc ttg aga gac gtg gac cct ggg 576 Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly 180 185 190 gaa cac tac att ttg aaa act cta ggc att aaa tac ttt tca atg act 624 Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr 195 200 205 gaa gtg gac aga cta gga att ggc aag gtg atg gaa gaa aca ctc agc 672 Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser 210 215 220 tat cta cta gga aga aag aaa agg cca att cat cta agt ttt gat gtt 720 Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val 225 230 235 240 gac gga ctg gac cca tct ttc aca cca gct act ggc aca cca gtc gtg 768 Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val 245 250 255 gga ggt ctg aca tac aga gaa ggt ctc tac atc aca gaa gaa atc tac 816 Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr 260 265 270 aaa aca ggg cta ctc tca gga tta gat ata atg gaa gtg aac cca tcc 864 Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser 275 280 285 ctg ggg aag aca cca gaa gaa gta act cga aca gtg aac aca gca gtt 912 Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val 290 295 300 gca ata acc ttg gct tgt ttc gga ctt gct cgg gag ggt aat cac aag 960 Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys 305 310 315 320 cct att gac tac ctt aac cca cct aag taa 990 Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys 325 <210> 3 <211> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met His His His His His His Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly 1 5 10 15 Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu 20 25 30 Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys 35 40 45 Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp 50 55 60 Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val 65 70 75 80 Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu Ala Gly Lys Val Ala Gln Val Lys Lys 85 90 95 Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile 100 105 110 Gly Ser Ile Ser Gly His Ala Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile 115 120 125 Trp Val Asp Ala His Thr Asp Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser 130 135 140 Gly Asn Leu His Gly Gln Pro Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys 145 150 155 160 Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile 165 170 175 Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly 180 185 190 Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr 195 200 205 Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser 210 215 220 Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val 225 230 235 240 Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val 245 250 255 Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr 260 265 270 Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser 275 280 285 Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val 290 295 300 Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys 305 310 315 320 Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro Pro Lys 325 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His Tag <400> 4 Met His His His His His His 1 5 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33) <223> PCR primer <400> 5 ccaaaccata tgagcgccaa gtccagaacc ata 33 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> PCR primer <400> 6 ccaaactcta gaatcacatt ttttgaatga catggacac 39 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> sequencing primer <400> 7 ctctggccat gccagggtcc accc 24 <210> 8 <211> 969 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(966) <400> 8 atg agc gcc aag tcc aga acc ata ggg att att gga gct cct ttc tca 48 Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser 1 5 10 15 aag gga cag cca cga gga ggg gtg gaa gaa ggc cct aca gta ttg aga 96 Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg 20 25 30 aag gct ggt ctg ctt gag aaa ctt aaa gaa caa gag tgt gat gtg aag 144 Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys 35 40 45 gat tat ggg gac ctg ccc ttt gct gac atc cct aat gac agt ccc ttt 192 Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe 50 55 60 caa att gtg aag aat cca agg tct gtg gga aaa gca agc gag cag ctg 240 Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu 65 70 75 80 gct ggc aag gtg gca caa gtc aag aag aac gga aga atc agc ctg gtg 288 Ala Gly Lys Val Ala Gln Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val 85 90 95 ctg ggc gga gac cac agt ttg gca att gga agc atc tct ggc cat gcc 336 Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala 100 105 110 agg gtc cac cct gat ctt gga gtc atc tgg gtg gat gct cac act gat 384 Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp 115 120 125 atc aac act cca ctg aca acc aca agt gga aac ttg cat gga caa cct 432 Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro 130 135 140 gta tct ttc ctc ctg aag gaa cta aaa gga aag att ccc gat gtg cca 480 Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro 145 150 155 160 gga ttc tcc tgg gtg act ccc tgt ata tct gcc aag gat att gtg tat 528 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr 165 170 175 att ggc ttg aga gac gtg gac cct ggg gaa cac tac att ttg aaa act 576 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr 180 185 190 cta ggc att aaa tac ttt tca atg act gaa gtg gac aga cta gga att 624 Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile 195 200 205 ggc aag gtg atg gaa gaa aca ctc agc tat cta cta gga aga aag aaa 672 Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys 210 215 220 agg cca att cat cta agt ttt gat gtt gac gga ctg gac cca tct ttc 720 Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe 225 230 235 240 aca cca gct act ggc aca cca gtc gtg gga ggt ctg aca tac aga gaa 768 Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu 245 250 255 ggt ctc tac atc aca gaa gaa atc tac aaa aca ggg cta ctc tca gga 816 Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly 260 265 270 tta gat ata atg gaa gtg aac cca tcc ctg ggg aag aca cca gaa gaa 864 Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu 275 280 285 gta act cga aca gtg aac aca gca gtt gca ata acc ttg gct tgt ttc 912 Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe 290 295 300 gga ctt gct cgg gag ggt aat cac aag cct att gac tac ctt aac cca 960 Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro 305 310 315 320 cct aag taa 969 Pro Lys <210> 9 <211> 322 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ser Ala Lys Ser Arg Thr Ile Gly Ile Ile Gly Ala Pro Phe Ser 1 5 10 15 Lys Gly Gln Pro Arg Gly Gly Val Glu Glu Gly Pro Thr Val Leu Arg 20 25 30 Lys Ala Gly Leu Leu Glu Lys Leu Lys Glu Gln Glu Cys Asp Val Lys 35 40 45 Asp Tyr Gly Asp Leu Pro Phe Ala Asp Ile Pro Asn Asp Ser Pro Phe 50 55 60 Gln Ile Val Lys Asn Pro Arg Ser Val Gly Lys Ala Ser Glu Gln Leu 65 70 75 80 Ala Gly Lys Val Ala Gln Val Lys Lys Asn Gly Arg Ile Ser Leu Val 85 90 95 Leu Gly Gly Asp His Ser Leu Ala Ile Gly Ser Ile Ser Gly His Ala 100 105 110 Arg Val His Pro Asp Leu Gly Val Ile Trp Val Asp Ala His Thr Asp 115 120 125 Ile Asn Thr Pro Leu Thr Thr Thr Ser Gly Asn Leu His Gly Gln Pro 130 135 140 Val Ser Phe Leu Leu Lys Glu Leu Lys Gly Lys Ile Pro Asp Val Pro 145 150 155 160 Gly Phe Ser Trp Val Thr Pro Cys Ile Ser Ala Lys Asp Ile Val Tyr 165 170 175 Ile Gly Leu Arg Asp Val Asp Pro Gly Glu His Tyr Ile Leu Lys Thr 180 185 190 Leu Gly Ile Lys Tyr Phe Ser Met Thr Glu Val Asp Arg Leu Gly Ile 195 200 205 Gly Lys Val Met Glu Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Leu Gly Arg Lys Lys 210 215 220 Arg Pro Ile His Leu Ser Phe Asp Val Asp Gly Leu Asp Pro Ser Phe 225 230 235 240 Thr Pro Ala Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Gly Leu Thr Tyr Arg Glu 245 250 255 Gly Leu Tyr Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Lys Thr Gly Leu Leu Ser Gly 260 265 270 Leu Asp Ile Met Glu Val Asn Pro Ser Leu Gly Lys Thr Pro Glu Glu 275 280 285 Val Thr Arg Thr Val Asn Thr Ala Val Ala Ile Thr Leu Ala Cys Phe 290 295 300 Gly Leu Ala Arg Glu Gly Asn His Lys Pro Ile Asp Tyr Leu Asn Pro 305 310 315 320 Pro Lys

Claims (27)

1. 도 2c에 나타낸 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고 80 내지 100 %의 순도를 갖는 분리된 재조합 인간 아르기네이즈 I.
2. 제1항에 있어서, 아미노 말단에 6 개의 히스티딘이 추가로 부착되어 있는 재조합 인간 아르기네이즈 I.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 250 I.U./mg 이상의 특이적 활성을 갖는 재조합 인간 아르기네이즈 I.
4. 제3항에 있어서, 500 내지 600 I.U./mg의 특이적 활성을 갖는 재조합 인간 아르기네이즈 I.
5. 제4항에 있어서, 약 3일 이상의 생체외(in vitro) 혈장 반감기를 갖도록 하는 변형을 포함하는 재조합 인간 아르기네이즈 I.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 90 % 이상의 순도를 갖는 재조합 인간 아르기네이즈 I.
7. 제5항에 있어서, 상기 변형이 PEG화(pegylation)인 재조합 인간 아르기네이즈 I.
8. 제7항에 있어서, 상기 PEG화가 결합제를 사용하여 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티가 상기 아르기네이즈에 공유적으로 부착되어서 생기는 것인 재조합 인간 아르기네이즈 I.
9. 제8항에 있어서, 상기 결합제가 2,4,6-트리클로로-s-트리아진(염화 시아누르, CC) 및 숙신이미드 프로피온산 (SPA)으로 이루어진 군 중에서 선택된 것인 재조합 인간 아르기네이즈 I.
10. 재조합 단백질의 제조 방법으로서,

    (a) 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고;

    (b) 상기 단백질의 발현을 위한 재조합 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 구축하고;

    (c) 유가식(fed-batch) 발효를 이용하여 상기 재조합 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 발효시키고;

    (d) 상기 재조합 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세포에 열충격을 가하여 상기 재조합 단백질의 발현을 촉진하고;

    (e) 상기 발효 산물로부터 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는 제조 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 프로파아지인 제조 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 단백질이 인간 아르기네이즈 I인 제조 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 인간 아르기네이즈 I이 아미노산 말단에 결합된 6 개의 히스티딘을 갖고 상기 정제 단계가 킬레이팅 컬럼에서의 친화성 크로마토그래피를 포함하는 것인 제조 방법.
14. 제12항에 있어서, 상기 발효 단계를 180-320 g/L 글루코오스, 2-4 g/L MgS0₄·7H₂0, 45-80 g/L 트립톤, 7-12 g/L K₂HP0₄ 및 3-6 g/L KH₂ P0₄를 필수 성분으로 하여 이루어진 영양 배지를 사용하여 수행하는 제조 방법.
15. 분리되고 실직적으로 정제된 아르기네이즈를 함유하는 약학 조성물.
16. 제15항에 있어서, 상기 재조합 인간 아르기네이즈가 인간 아르기네이즈 I인 약학 조성물.
17. 제15항에 있어서, 상기 재조합 인간 아르기네이즈가 아미노 말단에 6 개의 히스티딘이 추가적으로 부착되어 있는 인간 아르기네이즈 I인 약학 조성물.
18. 제15항에 있어서, 상기 조성물이 약학적으로 허용 가능한 담체 내에서 추가적으로 제형화된 것인 약학 조성물.
19. 제15항에 있어서, 상기 약학 조성물의 제형이 경구적 사용, 멸균 주사 용액용 또는 멸균 주사 현탁액에 적합한 형태인 약학 조성물.
20. 제16항에 있어서, 상기 재조합 아르기네이즈 I이 250 I.U./mg 이상의 특이적 효소 활성을 갖는 것인 약학 조성물.
21. 제20항에 있어서, 상기 재조합 인간 아르기네이즈 I이 500 내지 600 I.U./mg의 특이적 효소 활성을 갖는 것인 약학 조성물.

    [청구항 21]

    제16항에 있어서, 상기 재조합 인간 아르기네이즈 I이 환자 혈장 내에서 약 3일 이상의 반감기를 갖는 것인 약학 조성물.
22. 제21항에 있어서, 상기 재조합 인간 아르기네이즈 I이 환자 혈장 내에서 약 1일 이상의 반감기를 갖는 것인 약학 조성물.
23. 약제 제조에 있어서의 제1항의 인간 아르기네이즈 I의 용도.
24. 제23항에 있어서, 상기 약제가 인간 악성 종양의 치료를 위하여 사용되는 것인 용도.
25. 제24항에 있어서, 상기 인간 악성 종양이 간 종양, 유방암, 결장암 또는 직장암인 용도.
26. 재조합 인간 아르기네이즈를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 인간 악성 종양의 치료 방법.
27. 환자의 생리학적 아르기닌 농도를 3일 이상 동안 10 μM 이하로 낮추는 약학 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 인간 악성 종양의 치료 방법.