KR20050016634A - 토신 유전자를 암호하는 뉴클레오티드 서열, 토신 단백질및 이를 이용하여 단백질-응집을 치료하는 방법 - Google Patents

토신 유전자를 암호하는 뉴클레오티드 서열, 토신 단백질및 이를 이용하여 단백질-응집을 치료하는 방법

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KR20050016634A
KR20050016634A KR10-2004-7021061A KR20047021061A KR20050016634A KR 20050016634 A KR20050016634 A KR 20050016634A KR 20047021061 A KR20047021061 A KR 20047021061A KR 20050016634 A KR20050016634 A KR 20050016634A
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컬드웰킴에이.
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Abstract

본 발명은 다양한 정도의 토신(torsin) 활성을 보유하는 폴리펩티드 서열 및 이의 일부를 암호화하는 tor-1, tor-2, ooc-5, DYT1, 및 DYT2 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 다양한 정도의 TOR-1, TOR2, OOC-5, TOR-A, 및 TOR-B 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호하는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 스크리닝 및 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 응집을 감소시키는 방법, 단백질 응집에 의해 유발되는 질병을 치료하는 방법, 단백질-응집을 감소시키는 유효 산물을 스크리닝하는 방법, 단백질 응집에 의해 유발되는 질병의 유효 치료제를 스크리닝하는 방법, 및 tor-1, tor-2, ooc-5, DYT1, 및 DYT2 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 토신 활성을 보유하는 폴리펩티드를 포함하는 약제, 치료제 및 키트에 관한 것이다.

Description

토신 유전자를 암호하는 뉴클레오티드 서열, 토신 단백질 및 이를 이용하여 단백질-응집을 치료하는 방법{NUCLEOTIDE SEQUENCES THAT CODE FOR TORSIN GENES, TORSIN PROTEINS, AND METHODS OF USING THE SAME TO TREAT PROTEIN-AGGREGATION}
본 출원은 2002년 6월 24일에 출원된 미국 출원 10/177,104호를 우선권으로 주장한다.
기술 분야
본 발명은 다양한 정도의 토신(torsin) 활성을 보유하는 폴리펩티드 서열 및 이의 일부를 암호화하는 tor-1, tor-2, ooc-5, DYT1, 및 DYT2 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드와, 다양한 정도의 TOR-1, TOR2, OOC-5, TOR-A, 및 TOR-B 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호하는 폴리펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 스크리닝 및 증폭시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 단백질 응집을 감소시키는 방법, 단백질 응집에 의해 유발되는 질병을 치료하는 방법, 단백질-응집을 감소시키는 유효 산물을 스크리닝하는 방법, 단백질 응집에 의해 유발되는 질병의 유효 치료제를 스크리닝하는 방법, 및 tor-1, tor-2, ooc-5, DYT1, 및 DYT2 유전자에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 토신 활성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 약제, 치료제 및 키트에 관한 것이다.
신경세포 손상은 응집 경향이 있는 독성의 단백질에 의해 유발될 수 있다. 또한, 광범위한 신경퇴행성 장애는 그러한 신경세포 손상을 특징으로 한다. 따라서, 이들 신경퇴행성 장애는 단백질 응집의 불가피한 결과이다. 이들 질병을 유발하는 응집 경향이 있는 독성 단백질을 암호화하는 유전자가 확인되었다. 또한, 그러한 유전자의 돌연변이는 이상 프로세싱과 미스폴딩된 단백질의 축적을 초래한다. 미스폴딩된 단백질은 신경세포 함유물 및 플라크와 같은 신경세포 손상을 초래하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 그러한 미스폴딩된 단백질의 감소, 억제 및 개선에 필요한 분자 도구의 확인 및 세포 메카니즘의 이해가 중요하다. 또한, 신경세포 생존에 대한 단백질 응집 효과를 이해하게 되면 이들 장애에 대한 합리적이고 효과적인 치료법을 개발할 수 있을 것이다.
조기-개시 토신 근긴장이상을 비롯한 신경세포 장애는 근육 경련이 조절되지 않는 것을 특징으로 한다. 근긴장이상은 근육 경련이 반복적이고 규칙적이라는 점에서 구별된다(Bressman, SB. 1998. Dystonia. Current Opinion in Neurology. 11:363-372). 필기근육경련에서부터 휠체어에 의존해야 하는 정도에 이르기까지 증상의 경중은 다양할 수 있다. 원발성 근긴장이상이라고도 하는 조기-개시 토신 근긴장이상은 강한 가족성 관계와, 다른 운동 장애에서 발견되는 임의의 신경 퇴행의 부재에 의해 구별된다. 이것은 가장 심각한 형태의 질병으로서, 주로 낮은 침투도(30∼40%)로 유전된다(L. J. Ozelius, et al., Genomics 62, 377 (1999); L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)). 따라서, 근긴장이상은 진단하고 병리적으로 규명하기가 어렵다. 북아메리카에서 300,000명 이상이 근긴장이상의 영향을 받고 있으며, 헌팅톤 및 근위축증보다 더욱 일반적이다. 이 질병은 잘 알려져 있지 않기 때문에 치료가 매우 한정되어 있으며, 선택가능한 방법으로는 근육 수축을 조절하는 보툴리늄 톡신을 주사하거나 수술하는 방법 등이 있다.
토신 근긴장이상에 대한 분자 기초는 아직 밝혀지지 않았다. Ozelius 등은TOR1A(DYT1)라고 하는 원인 유전자를 확인하고, 이를 인간 염색체 9q34로 맵핑하였다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)). TOR1A 유전자는 TOR-A라고 하는 단백질을 생성한다. 조기-개시 토신 근긴장이상 환자의 대부분은 독특한 하나의 코돈 결실을 포함하여, TOR-A의 카르복시 말단에 글루탐산 (GAG) 잔기가 없다. 오기능의 토신 단백질이 생성된다. 특히, 이것이 질병 염색체에서 관찰되는 유일한 변화였다(L. J. Ozelius, et al., Genomics 62, 377 (1999); L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)). 최근 논문에는 카르복시 말단에 18개 염기쌍 또는 6개 아미노산의 추가 결실이 보고된 바 있다. 이것은 GAG 결실 외에 확인된 첫번째 돌연변이이다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)).
TOR1A 유전자를 확인한 최초 논문에서는, 선충 토신 유사 단백질이 개시되었는 데, 이 단백질은 이후에 ooc-5 유전자가 암호화하는 것으로 밝혀졌다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997); S. E. Basham, and L. E. Rose, Dev Biol 215 253 (1999)). TOR-A 단백질은 AAA+/Hsp 100/Clp 패밀리의 단백질에 대한 관계가 먼 유사성(25∼30%)을 보유한다(염색체(L.J.Ozelius, et al., Genomics 62, 377 (1999); Neuwald A F, Aravind L, Spouge JL, Koonin EV. 1999. AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res 9: 27-43). 이들 단백질의 임무는 그 유사성만큼이나 다양하다. 예를 들어, 샤프롱 기능을 수행하고, 단백질 시그널링을 조절하고, 단백질의 정확한 배치를 가능하게 한다. 그러나, 본 발명 이전에는 토신 단백질의 기능이 밝혀지거나 활성이 알려진 바 없었다.
도 1: tor-2 대 DYT1의 폴리뉴클레오티드 서열 정렬.
도 2: tor-2 대 DYT2의 폴리뉴클레오티드 서열 정렬.
도 3: TOR-1, TOR-2, OOC-5, TOR-A, 및 TOR-B의 폴리펩티드 서열 정렬.
도 4a: 19 폴리글루타민 반복부(Q19)의 발현.
도 4b: 82 폴리글루타민 반복부(Q82)의 발현.
도 4c: Q82 및 tor-2의 동시발현.
도 4d: Q82 및 tor-2/Δ368의 동시발현.
도 5: Q82 응집체의 크기.
도 6a: Q82, Q82 + tor-2, 및 Q82 + tor-2/Δ368의 꼬리 사진.
도 6b: Q82, Q82 + tor-2, 및 Q82 + tor-2/Δ368의 근접 사진.
도 7: Q19 응집체 축적 대비 시간의 그래프.
도 8: tor-2-특이적 항체로 염색한 모든 벌레 항체에 의한 면역배치.
도 9: C. 엘레간스(C.elegans)로부터의 전체 단백질 추출물과 액틴 대조군 및 tor-2 항체의 웨스턴 블롯.
도 10a: 82 폴리글루타민 반복부(Q82)의 발현.
도 10b: Q82 및 TOR-2의 동시발현.
도 10c: Q82 및 OOC-5의 동시발현.
도 10d: Q82 및 TOR-A의 동시발현.
도 10e: Q82 및 OOC-5 및 TOR-2의 동시발현.
발명의 상세한 설명
본 발명에 포함되는, 기본적인 기법을 실시하기 위한 수단 및 방법과 정의를 포함하는 분자 생물학 표준 참고서를 참조한다. 예컨대 Sambrook 등의 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001), Current Protocols in Molecular Biology, Ausebel et al (eds.), John Wiley & Sons, New York (2001)] 및 그 내부에 인용된 각종 참조 문헌.
본 명세서 중에 개시된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적절한 방법 및 재료는 본 명세서에 개시되어 있다. 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 그 내부에 언급된 참조 문헌은 그 전문이 참고 인용된다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 것은 아니다. 본 발명은 토신 단백질과 이 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 토신 단백질은 인간에서 발생하는 것으로 알려져 있고, C.엘레간스에서 생기는 것으로 생각된다. 지금까지, 토신 단백질의 기능은 전혀 알려져 있지 않았다. 그러나, 본 발명은 토신 단백질의 하나 이상의 기능이 단백질 응집을 방지하는 것임을 입증하였다. 2개의 인간 토신 단백질, 즉 TOR1A 및 TOR1B가 있으며, C.엘레간스 유래의 3개의 토신 단백질, 즉 TOR-1, TOR-2, 및 OOC-5가 있다.
본 발명의 명세서에서 "분리된" 또는 "정제된"이란 자연 환경으로부터 떨어져 있는 것으로서, 세포 추출물에서 종종 발견되는 기타 오염 단백질, 폴리뉴클레오티드 및/또는 다른 생물학적 물질을 실질적으로 포함하지 않는다는 의미이다.
본 발명의 명세서에서 "폴리뉴클레오티드"란 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미하며, 변형되지 않은 RNA 또는 DNA나 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다.
핵산 서열과 관련하여 "실질적으로 ∼로 구성된"이란, 이하 명세서 및 특허청구범위 중에 제3 염기 축퇴성과 관련된 바와 같은 뉴클레오티드의 치환을 의미할 목적으로 사용된 용어이다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 제3 염기 축퇴성으로 인하여 거의 모든 아미노산은 암호 뉴클레오티드 서열 중에 하나 이상의 트리플릿 코돈에 의해 제시될 수 있다. 또한, 약간의 염기쌍 변화는 암호화된 아민노산 서열의 변화(보존성 치환)를 초래할 수 있지만, 유전자 생성물의 생물학적 활성을 실질적으로 변경할 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 본 명세서에 개시된 바와 같이 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은 그 서열이 약간 변형될 수 있으며(예컨대 트리플릿 코돈에서의 뉴클레오티드 치환), 동일한 아미노산 서열의 각 유전자 생성물을 암호화한다. TOR-2의 아미노산 서열은 서열번호 2로 제시되어 있고, TOR-2 단백질을 암호화하는 게놈 서열은 서열 번호 1에 제시되어 있다. TOR-1의 아미노산 서열은 서열 번호 4로 제시되어 있으며, TOR-1 단백질을 암호화하는 게놈 서열은 서열 번호 3으로 제시되어 있다. OOC-5의 아미노산 서열은 서열 번호 6으로 제시되어 있고, OOC-5 단백질을 암호화하는 게놈 서열은 서열 번호 5로 제시되어 있다. TOR-A의 아미노산 서열은 서열 번호 8로서 제시되어 있고, TOR-A 단백질을 암호화하는 게놈 서열은 서열 번호 7로 제시되어 있다. TOR-B의 아미노산 서열은 서열 번호 10으로 제시되어 있고, TOR-B 단백질을 암호화하는 게놈 서열은 서열 번호 9로 제시되어 있다.
당업자는 인간 이외의 다른 유기체(예를 들어, 진핵세포; 더욱 구체적으로, 포유류(바람직하게는, 고릴라, 붉은털 원숭이 및 침팬지), 설치류, 벌레(바람직하게는, C. 엘레간스), 곤충(바람직하게는, D. 멜라노가스터(D. melanogaster)), 조류, 어류, 효모 및 식물)도 토신 유전자를 포함할 것임을 알 것이다. 본 발명은 상기 개시된 유기체로부터 분리된 토신 핵산 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 분리된 핵산 분자는 또한 화학적으로 합성된 것들을 포함하는 의미이다. 예를 들어, 토신 유전자의 발현 생성물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자를 디자인할 수 있으며, 필요에 따라 적절히 더 작은 단편으로 나눌 수 있다. 핵산 분자에 상응하거나, 또는 분할된 단편 각각에 상응하는 올리고머를 합성할 수 있다. 그러한 합성 올리고뉴클레오티드는 합성하여 제조하거나(Matteucci et al., 1981, J Am. Chem. Soc. 103:3185-3191) 또는 자동화된 DNA 합성기를 사용하여 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 합성하거나, 또는 클로닝하여 유도할 수 있다. 필요에 따라, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 인산화시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 키나제 처리는, 예를 들어 5' 말단에 방사성동위원소(일반적으로 32P)를 결합시켜 특정한 올리고뉴클레오티드를 표지하는 방법을 제공한다. 그 후에, 올리고뉴클레오티드를 어닐링시키고 T4 리가제 등으로 결찰시킬 수 있다.
토신 유전자 또는 기타 다른 유전자를 분리하기 위해서, 유전자 라이브러리를 먼저 설정한다. 유전자 라이브러리의 설정은 일반적으로 알려진 교과서 및 안내서에 개시되어 있다. Winnacker의 교과서: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie [Genes and Clones, An Introduction to Genetic Engineering] (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990), 또는 Sambrook 등의 교과서: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)를 예로서 언급할 수 있다. 공지된 유전자 라이브러리는 Kobara 등 (Cell 50, 495-508 (1987))에 의해 λ벡터에 세팅된 이.콜리 K-12 균주 W3110의 유전자 라이브러리이다.
이.콜리 내에서 유전자 라이브러리를 제조하기 위해서, pBR322 (Bolivar, 1979, Life Sciences, 25, 807-818) 또는 pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268)와 같은 플라스미드를 사용할 수 있다. 적절한 숙주는 특히 균주 DH5αmcr과 같은 제한- 및 재조합-결함성인 이.콜리 균주이며, 이는 Grant 등의 문헌(Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)에 개시된 바 있다.
코스미드 또는 기타 λ벡터의 보조 하에 클로닝된 긴 DNA 단편을 DNA 서열 결정에 적절한 범용 벡터에 클로닝한 다음 서열결정할 수 있으며, 그러한 벡터들은 Sanger 등의 문헌(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977)에 개시되어 있다.
생성된 DNA 서열을 공지된 알고리즘 또는 서열 결정 프로그램, 예컨대 Staden (Nucleic Acids Research 14, 217-232(1986)), Marck (Nucleic Acids Research 16, 1829-1836 (1988)) 또는 Butler의 GCG 프로그램 (Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998))으로 조사할 수 있다.
본 발명의 구성성분인 서열 번호 2, 4, 6, 8 및 10과 관련된 토신 유전자에 대한 신규한 토신 서열을 이러한 방식으로 발견하였다. 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 상기 개시된 방법에 의해 얻은 본 발명의 DNA 서열로부터 추가로 유도하였다. 토신 유전자 생성물의 생성된 아미노산 서열은 서열 번호 2, 4, 6, 8, 및 10에 제시되어 있다.
유전자 코드의 축퇴성에 의해 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9로부터 생성된 암호 DNA 서열도 본 발명을 구성한다. 동일한 방식으로, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9 또는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9의 일부에 하이브리드화하는 DNA 서열은 본 발명을 구성한다. 예컨대 단백질에서 글리신의 알라닌으로의 치환, 아스파르트산의 글루탐산으로의 치환과 같은 보존성 아미노산 치환은 전문가들에게 단백질의 활성에 기본적인 변화를 초래하지 않는, 즉 중성 기능의 "센스 돌연변이"로서 추가로 알려져 있다. 또한, 단백질의 N 및/또는 C 말단에 대한 변화는 실질적으로 손상시킬 수 없거나, 또는 심지어 그 기능을 안정화시킬 수 있다는 것이 또한 알려져 있다. 이러한 상황에 대한 정보는 전문가들이, 특히 Ben-Bassat 등의 문헌(Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), O'Regan 등의 문헌(Gene 77:237-251 (1989)), Sahin-Toth 등의 문헌(Protein Sciences 3:240-247 (1994)), Hochuli 등의 문헌(Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)) 및 공지된 유전학 및 분자 생물학의 교과서에서 확인할 수 있다. 서열 번호 2, 4, 6, 8 및 10으로부터 상응하는 방식을 형성하는 아미노산 서열도 본 발명을 구성한다.
동일한 방식으로, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9, 또는 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열도 본 발명을 구성한다. 마지막으로, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9로부터 생긴 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 DNA 서열도 본 발명은 구성한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 통상적으로 길이가 15개 이상인 뉴클레오티드이다.
당업자는 하이브리드화로 DNA 서열을 확인하는 방법을, 특히 뵈링거 만하임 게엠베하(독일 만하임, 1993)의 안내서 "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" 및 Liebl 등의 문헌 (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991))에서 찾을 수 있다. 하이브리드화는 엄격한 조건, 즉 프로브 및 표적 서열(프로브로 처리된 폴리뉴클레오티드)이 70% 이상 동일한 하나의 하이브리드가 형성되는 조건 하에 실시한다. 세척 단계를 비롯하여 하이브리드화의 엄격도는 완충액 조성, 온도 및 염 농도를 다양하게 하여 영향을 주거나 또는 결정한다. 하이브리드화 반응은 세척 단계와 비교하여 비교적 낮은 엄격도 하에서 실시하는 것이 바람직하다(Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
예를 들면, 약 50∼68℃에서 5 x SSC 완충액을 하이브리드화 반응에 사용할 수 있다. 프로브를 프로브의 서열과의 동일성이 70% 미만인 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화시킬 수 있다. 그러한 하이브리드는 덜 안정하며, 엄격한 조건 하에서 세척하여 제거한다. 예를 들어, 염 농도를 2 x SSC로 낮추고, 경우에 따라 그 후 0.5 x SSC로 낮추어 실현할 수 있으며(The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), 온도는 약 50∼68℃로 정해진다. 경우에 따라서 염 농도를 0.1 x SSC로 낮출 수 있다. 예를 들어 사용된 프로브의 서열과 70% 이상 또는 80% 이상 또는 90% 내지 95% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 단편은 약 1∼2℃씩 50℃에서 68℃로 단계적으로 하이브리드화 온도를 증가시켜 분리할 수 있다. 또한, 하이브리드화에 대한 추가의 설명은 소위 말하는 키트의 형태로 시장에서 입수할 수 있다(예, DIG Easy Hyb, 독일 만하임의 Roche Diagnostics GmbH, 카탈로그 번호 1603558).
당업자가 DNA 서열을 증폭시켜야 하는 경우, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)의 도움을 얻을 수 있으며, 이는 특히 Gait 등의 안내서: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) and in Newton and Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994)에서 찾아볼 수 있다.
"돌연변이"는 딸세포에게 전달되고, 가능하게는 그 후속 세대에게 전달되어 돌연변이 세포 또는 돌연변이 개체를 유발할 수 있는 유전 물질의 임의의 검출가능한 변화이다. 돌연변이 세포의 자손이 다세포 유기체 중 체세포에서만 일어나는 경우, 세포의 돌연변이 점 또는 영역이 생긴다. 유성 생식되는 유기체의 생식선에서의 돌연변이는 생식체에 의해 다음 세대로 전달되어, 체세포 및 생식세포 내에 새로운 돌연변이 상태를 갖는 개체를 유발할 수 있다. 돌연변이는 화학적 또는 물리적 구성, 돌연변이능, 복제, 표현형 기능 또는 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드의 재조합에 영향을 주는 임의의 검출가능한, 비자연적인 변화(또는 이의 조합)일 수 있으며; 뉴클레오티드는 삽입, 결실, 치환, 역전, 또는 역전의 유무 하에 새로운 위치로 전좌될 수 있다. 돌연변이는 자발적으로 일어날 수 있으며, 돌연변이원을 적용하여 실험적으로 유도할 수 있다. 핵산 분자의 돌연변이 변화는 돌연변이로부터 생긴다. 돌연변이 폴리펩티드는 돌연변이 핵산 분자로부터 생길 수 있으며, 야생형(자연 발생적) 폴리펩티드로부터 유래한 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기에서 변형된 폴리펩티드를 말한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "돌연변이"는 근긴장이상 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 임의의 변형을 의미할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 점 돌연변이 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 삽입 및/또는 치환, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 돌연변이는 미스센스 또는 프레임이동 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어 보존되거나 비보존된 돌연변이, 천연 또는 비천연 돌연변이일 수 있다.
단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 "주로 ∼로 구성된"은 이하 명세서 및 특허청구범위에서 단백질 또는 펩티드의 입체 배열이 실질적으로 변경되지 않도록 하는 서열 내에 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환 또는 변형을 의미하기 위해 사용된 용어이다.
"보존적 치환"은 상기 기능에 의해 정의되며, 치환된 아미노산과 실질적으로 동일한 전하, 크기, 친수성 및/또는 방향족성(aromaticity)을 갖는 아미노산의 치환을 포함한다. 당업자들에게 공지된 그러한 치환으로는 글리신-알라닌-발린; 이소루신-루신; 트립토산-티로신; 아스파르트산-글루탐산; 아르기닌-리신; 아스파라긴-글루타민; 및 세린-트레오닌 등이 있다. 단백질 또는 펩티드의 아미노산 서열과 관련한 "변형"은 단백질 또는 펩티드 서열의 배치에 변화를 주지 않아서 생물학적 활성을 변화시키지 않는 하나 이상의 아미노산의 결실로서 기능적으로 정의된다.
용어 "발현 벡터"는 본 발명의 토신 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 선택된 숙주 세포 중에서 발현에 필요한 서열을 제공한다. 본 발명의 재조합 숙주 세포는, 예컨대 재조합 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 생성을 위해서 시험관 내에서 유지될 수 있다. 마찬가지로, 재조합 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분절로 동물 또는 인간을 면역화시켜 생기는 것과 같은, 생체내 숙주 세포일 수 있다. 따라서, 재조합 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주일 수 있으며, 예컨대 이.콜리, 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 기타 효모, 포유류 또는 인간 숙주 세포일 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 전사 프로모터 및 종결인자를 포함하거나, 또는 내인성 프로모터에 인접하여 삽입하기 위해 제공된다. 발현 벡터는 통상적으로 복제 기점과 하나 이상의 선별 마커를 추가로 포함하는 플라스미드이다. 그러나, 대안적으로 발현 벡터는 숙주를 감염시키기 위해 고안된 바이러스 재조합체이거나, 또는 숙주 게놈 내의 바람직한 부위에 통합시키기 위해 고안된 통합 벡터일 수 있다. 다른 발현 벡터의 예는 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 개시되어 있다. 바람직한 구체예에서, 엄격한 조건 하에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드는 토신 활성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 암호화한다.
본 발명의 명세서의 문맥상 "토신 활성"이란 단백질 응집을 감소, 완화, 정지, 개선 및 억제하는 것을 포함한다.
본 발명의 명세서의 문맥상 "토신 유전자"는 토신 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 명세서의 문맥상 "토신 단백질"은 토신 활성을 갖는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.
공통 아미노산은 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 본 발명의 펩티드에 포함될 수 있는 추가의 아미노산에는 L-노르류신; 아미노부티르산; L-호모페닐알라닌; L-노르발린; D-알라닌; D-시스테인; D-아스파르트산; D-글루탐산; D-페닐알라닌; D-히스티딘; D-이소류신; D-리신; D-류신; D-메티오닌; D-아스파라긴; D-프롤린; D-글루타민; D-아르기닌; D-세린; D-트레오닌; D-발린; D-트리톱판; D-티로신; D-오미틴; 아미노이소부티르산; L-에틸글리신; L-t-부틸글리신; 페니실아민; I-나프틸알라닌; 시클로헥실알라닌; 시클로펜틸알라닌; 아미노시클로프로판 카르복실레이트; 아미노노르보르닐카르복실레이트; L-α-메틸알라닌; L-α-메틸시스테인; L-α-메틸아스파르트산; L-α-메틸글루탐산; L-α-메틸페닐알라닌; L α-메틸히스티딘; L-α-메틸이소류신; L-α-메틸리신; L-α-메틸류신; L-α-메틸메티오닌; L-α-메틸아스파라긴; L-α-메틸프롤린; L-α-메틸글루타민; L-α-메틸아르기닌; L-α-메틸세린; L-α-메틸트레오닌; L-α-메틸발린; L-α-메틸트리톱판; L-α-메틸티로신; L-α-메틸오르니틴; L-α-메틸노르류신; 아미노-α-메틸부티르산;. L-α-메틸노르발린; L-α-메틸호모페닐알라닌; L-α-메틸에틸글리신; 메틸-α-아미노부티르산;. 메틸아미노이소부티르산; L-α-메틸-t-부틸글리신; 메틸페니실아민; 메틸-α-나프틸알라닌; 메틸시클로헥실알라닌; 메틸시클로펜틸알라닌; D-α-메틸알라닌; D-α-메틸오르니틴; D-α-메틸시스테인; D-α-메틸아스파르트산; D-α-메틸글루탐산; D-α-메틸페닐알라닌; D-α-메틸히스티딘; D-α-메틸이소류신; D-α-메틸리신; D-α-메틸류신; D-α-메틸메티오닌; D-α-메틸아스파라긴; D-α-메틸프롤린; D-α-메틸글루타민; D-α-메틸아르기닌; D-α-메틸세린; D-α-메틸트레오닌; D-α-메틸발린; D-α-메틸트리톱판; D-α-메틸티로신; L-N-메틸알라닌; L-N-메틸시스테인; L-N-메틸아스파르트산; L-N-메틸글루탐산; L-N-메틸페닐알라닌; L-N-메틸히스티딘; L-N-메틸이소류신; L-N-메틸리신; L-N-메틸류신; L-N-메틸메티오닌; L-N-메틸아스파라긴; N-메틸시클로헥실알라닌; L-N-메틸글루타민; L-N-메틸아르기닌; L-N-메틸세린; L-N-메틸트레오닌; L-N-메틸발린; L-N-메틸트리톱판; L-N-메틸티로신; L-N-메틸오미틴; L-N-메틸노르류신; N-아미노-α-메틸부티르산; L-N-메틸노르발린; L-N-메틸호모페닐알라닌; L-N-메틸에틸글리신; N-메틸-γ-아미노부티르산; N-메틸시클로펜틸알라닌; L-N-메틸-t-부틸글리신; N-메틸페니실아민; N-메틸-a-나프틸알라닌; N-메틸아미노이소부티르산; N-(2-아미노에틸)글리신; D-N-메틸알라닌; D-N-메틸오미틴; D-N-메틸시스테인; D-N-메틸아스파르트산; D-N-메틸글루탐산; D-N-메틸페닐알라닌; D-N-메틸히스티딘; D-N-메틸이소류신; D-N-메틸리신; D-N-메틸류신; D-N-메틸메티오닌; D-N-메틸아스파라긴; D-N-메틸프롤린; D-N-메틸글루타민; D-N-메틸아르기닌; D-N-메틸세린; D-N-메틸트레오닌; D-N-메틸발린; D-N-메틸트리톱판; D-N-메틸티로신; N-메틸글리신; N-(카르복시메틸)글리신; N-(2-카르복시에틸)글리신; N-벤질글리신; N-(이미다졸릴에틸)글리신; N-(1-메틸프로필)글리신; N-(4-아미노부틸)글리신; N-(2-메틸프로필)글리신; N-(2-메틸티오에틸)글리신; N-(히드록시에틸)글리신; N-(카르바밀메틸)글리신; N-(2-카르바밀에틸)글리신; N-(1-메틸에틸)글리신; N-(3-구아니디노프로필)글리신; N-(3-인돌릴에틸)글리신; N-(p-히드록시펜에틸)글리신; N-(1-히드록시에틸)글리신; N-(티오메틸)글리신; N-(3-아미노프로필)글리신; N-시클로프로필글리신; N-시클로부티글리신; N-시클로헥실글리신; N-시클로헵틸글리신; N-시클로옥틸글리신; N-시클로데실글리신; N-시클로운데실글리신; N-시클로도데실글리신; N-(2,2-디페닐에틸)글리신; N-(3,3-디페닐프로필)글리신; N-(N-(2,2-디페닐에틸)카르바밀메틸)글리신; N-(N-(3,3-디페닐프로필)카르바밀메틸)글리신; 및 1-카르복시-1-(2,2-디페닐에틸아미노)시클로프로판 등이 포함된다.
본 발명에 의해 아미노산 서열이 개시되었기 때문에, 본 발명의 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편은, 그 서열을 기준으로 하여 공지된 화학적 합성 방법(예, 액상 합성 방법, 고상 합성 방법 등; Izumiya, N., Kato, T., Aoyagi, H., Waki, M., "Basis and Experiments of Peptide Synthesis", 1985, Maruzen Co., Ltd.)으로 제조할 수 있다. 통상적으로, 약 100개 또는 그 이하의 아미노산으로 된 더 짧은 펩티드 단편에 대해 펩티드 합성을 실시한다.
본 발명의 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상의 보호된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 보호된 아미노산은 공지된 방법에 의해 보호기(들)로 보호된 작용기(들)를 갖는 아미노산이며, 각종 보호된 아미노산이 시판된다.
본 발명의 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편은 글리코실화된 형태 및 비글리코실화된 형태로 제공될 수 있다. 글리코실화된 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 진핵 세포 중 펩티드를 암호화하는 재조합 DNA의 발현을 포함한다. 마찬가지로, 비글리코실화된 펩티드를 얻기 위해서 원핵(예, 박테리아) 세포 내에 펩티드를 암호화하는 재조합 DNA를 발현시키는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 당단백질 상의 탄수화물 부분을 변경하는 이들 및 기타 방법은, 특히 참고 인용된 문헌[Essentials of Glycobiology (1999), Edited By Ajit Varki, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 개시되어 있다.
대안적으로, 본 발명의 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편은, 본 발명의 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편의 아미노산 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 생성하고, 이 뉴클레오티드를 사용하여 유전자 공학 방법으로 TOR-1 및 TOR-2 단백질 또는 이의 단편을 생성함으로써 형성할 수 있다. 아미노산 잔기에 대한 폴리뉴클레오티드 암호 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001]에 개시되어 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 토신 단백질 또는 이의 작용성 유도체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 정제된 폴리펩티드(바람직하게는, 실질적으로 순수한 폴리펩티드)에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 및 10에 개시된 아미노산 서열 또는 이의 돌연변이체 또는 종 변이체, 또는 70% 이상의 동일성, 나아가 80% 이상의 동일성, 또는 심지어 90% 이상의 동일성(바람직하게는, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성, 또는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 유사성), 또는 6개 이상의 인접 아미노산(바람직하게는, 10, 15, 20, 25, 또는 50개 이상의 인접 아미노산)을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 토신 에피토프에 관한 것이다. 이들 폴리펩티드의 에피토프는 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. 면역원성 에피토프는 전체 단백질이 면역원일 때 항체 반응을 유발하는 단백질의 일부이다. 항원성 에피토프는 항체 반응을 유발할 수 있는 단백질의 단편이다. 항원성 에피토프 단편의 선택 방법은 당업계에 공지되어 있다(Sutcliffe et al., 1983, Science. 219:660-666). 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 면역 반응을 일으키는 데 유용하다. 본 발명의 항원성 에피토프-보유 펩티드 및 폴리펩티드는 단백질의 7개 이상의 아미노산(바람직하게는, 9, 10, 12, 15 또는 20개 아미노산)을 포함한다.
토신의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이로 제조할 수 있다. 그러한 변이체의 예로는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 및 10에 제시된 아미노산 서열의 잔기의 삽입 또는 치환, 또는 이로부터의 결실을 포함할 수 있다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합으로 최종 작제물을 얻을 수 있지만, 단 최종 작제물은 목적하는 활성을 보유해야 한다. 아미노산 서열 변이체의 도입 부위는 미리 정해져있지만, 돌연변이 그 자체를 미리 정할 필요는 없다. 예를 들어, 목적하는 활성에 대해 특정 폴리펩티드의 성능을 최적화하기 위해서, 폴리펩티드의 표적 코돈 또는 영역에 무작위 돌연변이유발을 실시할 수 있으며, 발현된 변이체를 목적하는 최적 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA 내의 소정 부위에서 치환 돌연변이시키는 방법, 예컨대 위치 특이적 돌연변이유발법이 공지되어 있다.
이에 따른 토신 변이체는 초기에 제조된 단백질의 변이체 또는 비변이체 형태를 암호화하는 DNA의 위치 특이적 돌연변이유발법으로 제조하는 것이 바람직하다. 부위 특이적 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 토신 변형체를 형성한다. 일반적으로, 부위 특이적 돌연변이유발 방법이 당업계에 공지되어 있다(Adelman et al., 1983, DNA 2:183; Ausubel, et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998)).
아미노산 서열 결실은 일반적으로 약 1∼30 잔기, 더욱 바람직하게는 1∼10 잔기이다. 아미노산 서열 삽입체는 하나의 또는 복수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입뿐 아니라, 하나의 잔기 내지 실질적으로 비제한된 길이의 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합체를 포함한다. 서열내 삽입체(즉, 완전 토신 서열 내의 삽입체)는 일반적으로 약 1∼10 잔기, 더욱 바람직하게는 1∼5 잔기일 수 있다.
제3 그룹의 변이체는 토신 분자에서의 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 하나의 잔기가 제거되고, 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된 것이다.
기능적 또는 면역학적 정체성의 실질적인 변화는 덜 보존적인 치환을 선택하여, 즉 a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조, 예컨대 병풍형 또는 나선형 배치, b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 c) 측쇄의 부피를 유지하는 데 있어서의 영향이 유의적으로 상이한 잔기를 선택하여 만든다. 일반적으로 예상되는 치환은 a) 글리신 및/또는 프롤린이 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 결실 또는 삽입된 것; b) 친수성 잔기, 예컨대 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예컨대 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐 대신에 치환된 것; c) 시스테인 잔기가 또 다른 잔기 대신에 치환된 것; d) 양전하 측쇄를 갖는 잔기, 예컨대 리실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음전하를 갖는 잔기, 예컨대 글루타밀 또는 아스파틸 대신에 치환된 것; 또는 e) 부피가 큰 측쇄를 갖는 잔기, 즉 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예컨대 글리신 대신에 치환된 것이다.
일부 결실, 삽입 및 치환은 토신의 특징적인 라디칼 변화를 생성할 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 결실, 삽입 또는 치환의 정확한 효과를 미리 예측하는 것이 어렵지만, 당업자는 그 효과를 생화학 및 생체내 스크리닝 분석으로 평가할 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, 변이체는 통상적으로 천연 토신을 암호화하는 핵산의 부위 특이적 돌연변이유발, 세포 배양물 내 변이체 핵산의 발현, 및 경우에 따라 예를 들어 (하나 이상의 면역 에피토프에의 결합에 의해 변이체를 흡수하는) 컬럼 상에서의 면역친화도 흡착에 의한 세포 배양물로부터의 정제로 만들어진다. 세포 배양 용해물 또는 정제된 토신 변이체의 활성은, 목적하는 특성에 대한 적절한 스크리닝 분석법으로 스크리닝한다. 예를 들어, 토신 분자의 면역학적 특성의 변화, 예컨대 주어진 항체에 대한 친화도는 경쟁적 유형의 면역분석으로 측정할 수 있다. 면역조절 활성의 변화는 적절한 분석으로 측정할 수 있다. 산화환원 또는 열안정성, 효소 활성, 소수성, 단백질 분해에 대한 감수성 또는 캐리어와의 응집 경향이나 다량체로의 응집 경향과 같은 단백질 성질 변형은 당업자들에게 공지된 방법으로 분석한다.
당업계에 알려진 각종 방법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 일 구체예에서, 자연적으로 펩티드를 생성하는 조직 또는 세포로부터 폴리펩티드를 정제한다. 대안적으로, 상기 개시된 분리된 핵산 단편을 사용하여 임의의 유기체 중에서 토신 단백질을 발현할 수 있다. 본 발명의 샘플은 세포, 단백질 추출물 또는 세포의 막 추출물, 또는 생물학적 유체를 포함한다. 샘플은 분석 형식, 검출 방법 및 샘플로서 사용된 조직, 세포 또는 추출물의 특성에 따라 달라질 것이다.
임의의 유기체는, 공급원 유기체가 자연적으로 그러한 펩티드를 포함하는 한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 공급원으로서 사용할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "공급원 유기체"란 폴리펩티드가 발현되어 최종적으로 분리되는 유기체와 무관하게, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 유도된 본래 유기체를 의미한다.
당업자는 천연 오염물이 없는 폴리펩티드를 얻기 위해서 단백질을 분리하기 위한 기존 방법을 따라 수월하게 실시할 수 있다. 이들 방법의 예로는 면역크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 비-크로마토그래피 분리 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 구체예에서, 정제 절차는 비이온 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 다수의 이온 교환 수지, 예를 들어 모노Q, 세파로스-Q, 마크로-프렙Q, AG1-X2, 또는 HQ를 사용할 수 있다. 적절한 크기 배제 수지의 예는 Superdex 200, Superose 12, 및 Sephycryl 200을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 각종 pH 범위에서 0.01∼2.0 M 범위의 농도로 염화칼륨 또는 염화나트륨 수용액을 사용하여 용출을 실시할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 엄격한 하이브리드화 조건 및 세척 조건 하에 토신 핵산에 하이브리드화하는 상기 개시된 핵산 분자 또는 적어도 이의 단편을 포함하는 샘플 중에서 토신 핵산의 존재를 특이적으로 검출하기 위한 핵산 프로브에 관한 것이다.
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 토신 RNA 또는 DNA에 우선적으로 하이브리드화하는 10∼1000 뉴클레오티드(바람직하게는, 10∼500, 10∼100, 10∼50, 10∼35, 20∼1000, 20∼500, 20∼100, 20∼50, 또는 20∼35)로 구성된 분리된 핵산 프로브에 관한 것으로서, 상기 핵산 프로브는, 토신 폴리펩티드(예컨대, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 및 10에 제시된 것들)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 상기 뉴클레오티드 서열 중 임의의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열; 및 전술한 바와 같은 임의의 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상에 대해 90% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드(바람직하게는, 15, 18, 20, 25 또는 30)로 구성된 뉴클레오티드 서열이거나, 또는 이에 상보적이다.
핵산 프로브는 본 발명의 또 다른 핵산 분자를 얻기 위해서 일반적인 하이브리드화 방법에 의해 적절한 염색체 또는 cDNA 라이브러리를 탐침하는 데 사용될 수 있다. 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리는 당업계에 인지되어 있는 방법에 따라서 적절한 세포로부터 제조할 수 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., 1989, In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
대안적으로, 화학적 합성을 실시하여 토신 아미노산 서열의 N-말단 및 C-말단 부분에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 프로브를 얻는다. 따라서, 합성된 핵산 프로브는, 본 발명의 단편을 얻기 위해 적절한 염색체, cDNA 또는 세포주 라이브러리를 사용하여 알려진 PCR 방법에 따라서 실시된 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에서 프라이머로서 사용할 수 있다(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, edited by Michael et al., Academic Press, 1990).
방사성표지화, 형광 표지화, 바이오틴-아비딘 표지화, 화학발광 등과 같은 표준 표지화 방법으로 검출하기 위해 본 발명의 하이브리드화 프로브를 표지할 수 있다. 하이브리드화 후에, 공지된 방법을 사용하여 프로브를 가시화할 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브는 RNA와 DNA 프로브를 포함하며, 그러한 프로브는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 형성할 수 있다.
상기 개시된 방법의 일 구체예에서, 핵산 프로브를 고체 지지체 상에 고정한다. 그러한 고체 지지체의 비제한적인 예로는 폴리카르보네이트와 같은 플라스틱, 아가로스 및 세파로스와 같은 복합 탄수화물, 및 폴리아크릴아미드 및 라텍스 비드와 같은 아크릴 수지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 핵산 프로브를 그러한 고체 지지체에 커플링시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 핵산 프로빙 방법에 적절한 테스트 샘플은, 예컨대 세포 또는 세포의 핵산 추출물, 또는 생물학적 유체를 포함한다. 개시된 방법에 사용된 샘플은 분석 형식, 검출 방법과, 분석에 사용된 조직, 세포 또는 추출물의 특성에 따라 달라질 것이다. 세포의 핵산 추출물을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이용된 방법에 적합한 샘플을 얻기 위해서 용이하게 적용시킬 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 하이브리드화가 일어나도록 하는 특이적 하이브리드화 조건 하에 상기 개시된 핵산 프로브와 샘플을 접촉시키고, 핵산 분자에 결합된 프로브의 존재를 검출함으로써 샘플내 토신 핵산의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 상기 개시된 바와 같이 당업계에 공지된 방법에 따라 핵산 프로브를 선택할 수 있다. 테스트하고자 하는 샘플은 인간 조직으로부터의 RNA 또는 DNA 샘플을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 토신 핵산의 존재를 샘플 중에서 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 상기 개시된 핵산 프로브가 내부에 배치되어 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 키트는 하이브리드화된 핵산 프로브의 존재를 검출할 수 있는 시약 및/또는 세척 시약을 포함하는 또 다른 용기를 추가로 구비한다. 검출 시약의 예로는 방사성표지된 프로브, 효소 프로브(호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제), 및 친화도 표지된 프로브(바이오틴, 아비딘 또는 스트렙타비딘)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세히 설명하면, 구획화된 키트는 시약이 별도의 용기 내에 포함된 임의의 키트를 포함한다. 그러한 용기는 작은 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이로 된 스트립을 포함한다. 그러한 용기는, 샘플과 시약이 서로 오염되지 않고 각 용기의 용액 또는 시약을 하나의 구획으로부터 또 다른 구획으로 정량적 방식으로 첨가할 수 있도록 하나의 구획으로부터 또 다른 구획으로 시약을 효율적으로 전달할 수 있다. 그러한 용기는 테스트 샘플을 수용하는 용기, 분석에 사용되는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 용기, 세척 시약을 포함하는 용기(예, 포스페이트 완충 염수, 트리스 완충액 등) 및 하이브리드화된 프로브, 결합된 항체, 증폭된 생성물 등을 검출하는 데 사용되는 시약을 포함하는 용기를 포함한다.
당업자라면, 본 발명에 개시된 핵산 프로브를 당업계에 공지되어 있는 확립된 키트 형식 중 하나 내에 쉽게 도입할 수 있음을 알 것이다.
일 구체예에서, 본 발명은 5'→3', 숙주 세포 내에서 전사를 개시하는 데 효과적인 프로모터 및 상기 개시된 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 벡터와 상기 개시된 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 세포에서 기능성인 전사 조절 영역, 상기 개시된 폴리펩티드에 상응하는 아미노산 서열을 암호화하는 RNA 서열에 상보적인 서열 및 세포에서 기능하는 전사 종결 영역을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 개시된 분자는 분리 및/또는 정제된 DNA 분자이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 개시된 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 비인간 유기체에 관한 것이다.
또 다른 구체예에서, 펩티드는 펩티드를 발현하도록 변경된 세포로부터 정제한다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 유전자 조작을 통해 보통 세포가 생성하지 않거나 또는 일반적으로 세포가 낮은 수준으로 생성하는 단백질을 생성하도록 한 경우에, 세포는 "목적하는 펩티드를 발현하도록 변형되었다"라고 한다. 당업자는, 게놈, cDNA 또는 합성 서열을 원핵 또는 진핵 세포로 도입 및 발현하기 위한 절차를 쉽게 적용할 수 있다.
DNA와 같은 핵산 분자는, 전사 및 번역 조절 정보를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 그러한 서열이 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 "작동가능하게 결합된" 경우 폴리펩티드를 "발현할 수 있다"라고 한다. 작동가능한 결합이란, 조절 DNA 서열 및 발현하고자 하는 DNA 서열이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 결합을 의미한다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 유기체별로 다를 수 있지만, 일반적으로 프로모터 영역을 포함하며, 이 영역은 예컨대 원핵 세포에서는 RNA 전사 개시를 유도하는 프로모터뿐 아니라 RNA로 전사될 때 번역 개시 신호를 보내는 DNA 서열을 포함한다. 그러한 영역은 보통 전사 및 번역의 개시와 관련된 5' 비암호 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다.
필요에 따라, 토신 암호 서열에 대한 3' 비암호 영역은 상기 개시된 방법으로 얻을 수 있다. 종결 시그널 및 폴리아데닐화 시그널과 같은 전사 종결 조절 서열의 경우에 이 영역이 유지될 수 있다. 따라서, 토신 유전자를 암호화하는 DNA 서열에 자연적으로 연속되는 3' 영역을 보유시킴으로써, 전사 종결 시그널을 제공한다. 전사 종결 시그널은 발현 숙주 세포에서 기능하지 않는 경우, 숙주 서열로부터 유도된 기능성 3' 영역을 치환할 수 있다.
2개의 DNA 서열(예, 프로모터 영역 서열 및 토신 암호 서열)은, 2개의 DNA 서열 사이의 결합 특성이 (1) 프레임이동 돌연변이의 도입을 일으키지 않거나, (2) 토신 암호 서열의 전사를 유도하는 프로모터 영역의 능력을 저해하지 않거나, 또는 (3) 프로모터에 의해 전사하고자 하는 토신 암호 서열의 능력을 저해하지 않는 경우 작동가능하게 결합되었다고 할 수 있다.
본 발명은 원핵 또는 진핵 세포에서의 토신 암호 서열(또는 이의 기능성 유도체)의 발현을 포함한다. 원핵 숙주는, 일반적으로 재조합 단백질의 생성을 위한 가장 효과적이고 편리한 숙주이다. 원핵 숙주로서 각종 E.콜리 종이 가장 빈번하게 제공되지만, 바실러스, 스트렙토마이시스, 슈도모나스, 살모넬라, 세라티아 등과 같은 박테리아 패밀리에 속하는 것들과 같은 기타 박테리아 균주를 비롯하여 기타 미생물 균주를 사용할 수 있다. 원핵세포계에서, 숙주와 적합한 종으로부터 유도된 복제 부위와 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다. 적절한 플라스미드 벡터의 예는 pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119 등이 있으며; 적절한 파지 또는 박테리오파지 벡터로는 .람다.gt10, .람다.gt11 등이 있다. 진핵세포 발현계의 경우, 적절한 바이러스 벡터로는 pMAM-neo, pKRC 등이 있다. 바람직하게는, 선택된 본 발명의 벡터는 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있는 능력을 갖는다.
원핵 세포에서 토신을 발현하기 위해서, 토신 암호 서열을 기능성 원핵세포 프로모터에 작동가능하게 결합시킬 필요가 있다. 그러한 프로모터는 구성성, 또는 더욱 바람직하게는 조절성(예, 유도성 또는 활성화성(derepressible)))일 수 있다. 구성성 프로모터의 예는 박테리오파지.람다 프로모터, 베타-락타마제 유전자의 bla 프로모터 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터 등이 있다. 유도성 원핵 프로모터의 예로는 박테리오파지.람다의 주요 우측 및 좌측 프로모터 (P.sub.L and P.sub.R), E. 콜리의 trp, recA, lacZ lacI, 및 gal 프로모터, B. 서브틸리스(B. subtilis)의 .알파.아밀라제(Ulmanen et al., 1985, J. Bacteriol. 162:176-182) 및 .제타.-28-특이적 프로모터(Gilman et al., 1984, Gene sequence 32:11-20), B. 서브틸리스의 박테리오파지의 프로모터(Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., N.Y. (1982)), 및 스트렙토마이시스 프로모터(Ward, et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478) 등이 있다.
원핵 세포에서의 적절한 발현을 위해서는 유전자 서열-암호 서열의 상류의 리보좀 결합 부위가 존재해야 한다(Gold et al., 1981, Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404).
조절 서열, 발현 벡터, 형질전환 방법 등의 선택은 유전자를 발현하는 데 사용된 숙주 세포의 종류에 따라 달라진다. 용어 "형질전환체" 또는 "형질전환된 세포"는 전달 회수와 무관하게 1차 대상 세포 및 이로부터 유도된 배양물을 포함한다. 모든 자손은, 고의의 돌연변이 또는 의도하지 않은 돌연변이로 인하여 DNA 함량이 정확하게 동일하지 않을 수 있다. 그러나, 정의된 바와 같이, 돌연변이 자손은 본래 형질전화된 세포와 동일한 기능을 갖는다.
숙주 세포가 주목하는 토신 펩티드의 발현에 사용하기 적절하기만 하다면, 본 발명의 발현계에 사용할 수 있는 숙주 세포가 엄격하게 제한되는 것은 아니다. 적절한 숙주는 진핵 세포를 포함한다. 바람직한 진핵 숙주 세포는, 예를 들어 생체내 또는 조직 배양물의 효모, 진균류, 곤충 세포, 포유류 세포를 포함한다. 바람직한 포유류 세포는 HeLa 세포, VERO 또는 CHO-K1과 같은 섬유아세포 기원의 세포, 또는 림포이드 기원의 세포 및 이의 유도체를 포함한다.
또한, 식물 세포도 숙주로서 이용하능하며, 식물 세포에 적합한 조절 서열, 예컨대 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 및 19S, 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널 서열이 이용가능하다.
또 다른 바람직한 숙주는 곤충 세포, 예컨대 드로솝필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 유충이다. 곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 드로소필라 알콜 데히드로게나제 프로모터를 사용할 수 있다(Rubin, 1988, Science. 240:1453-1459). 대안적으로, 바큘로바이러스 벡터를 조작하여 곤충 세포 내에서 다량의 토신 단백질을 발현할 수 있다(Jasny, 1987, Science. 238:1653; Miller et al., In: Genetic Engineering (1986), Setlow, J. K., et al., Eds., Plenum, Vol. 8, pp. 277-297).
숙주 세포의 또 다른 예는 C.엘레간스이다. C.엘레간스 내에서의 발현 조절의 예는 RNA 간섭(interference) (RNAi)를 포함한다. Fire 등은 발현하고자 하는 유전자와 유사한 C.엘레간스 폴리뉴클레오티드를 공급하여 유전자 발현을 약화시킬 수 있다고 언급한 바 있다. 이 문헌에는 RNAi를 통해 유전자 발현을 조절하는 여러가지 방법을 개시한 참조 문헌이 언급되어 있다(예컨대, 미국 특허 6,355,415호, 6,326,193호, 6,278,039호, 6,274,630호, 6,266,560호, 6,255,071호, 6,190,867호, 6,025,192호, 5,837,503호, 5,726,299호, 5,714,323호, 5,693,781호, 5,616,459호, 5,565,333호, 5,418,149호, 5,198,346호, 5,096,815호, 및 5,015,573).
상이한 숙주 세포는 단백질의 번역 및 번역 후 진행 및 변형 (예컨대, 글리코실화 및 절단)을 위한 성질 및 특정 메카니즘을 가진다. 발현되는 외인성 단백질의 목적하는 변형을 보장하기 위해 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.
글리코겐 분해성 효소(glycolytic enzyme)를 코딩하고 활발히 발현되는 유전자 서열로부터 프로모터 및 종료 성분을 도입하는 임의의 일련의 효모 유전자 발현 시스템이 사용될 수 있다. 글루코스가 풍부한 배지에서 효모가 성장할 때 이들 효소는 다량으로 생산된다. 공지의 글리코겐 분해성 유전자 서열은 또한 매우 효율적인 전사 조절 시그날을 제공할 수 있다.
효모는 번역 후 펩티드 변형을 수행할 수 있는 원핵생물에 비해 실질적인 장점을 제공한다. 효모에서 목적하는 단백질의 생성을 위해 사용될 수 있는 강력한 프로모터 서열 및 높은 복제수의 플라스미드를 사용하는 다수의 재조합 DNA 전략이 존재한다. 효모는 클로닝된 포유동물의 유전자 생성물 상에서 리더 서열을 인식하고 그리고 리더 서열을 포함하는 펩티드 (즉, 프리-펩티드)를 분비한다.
포유동물 숙주의 경우, 몇가지 가능한 벡터 시스템이 토신(torsin)의 발현에 유용할 수 있다. 광범위한 전사 및 번역 조절 서열이 숙주의 성질에 좌우되어 사용될 수 있다. 전사 및 번역 조절 시그날은 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 시미안 바이러스, 등과 같은 바이러스 공급원으로부터 유도될 수 있으며, 이 경우 조절 시그날은 높은 수준의 발현을 갖는 특정 유전자와 관련된다. 대안적으로, 포유동물의 발현 생성물로부터 프로모터, 예컨대 액틴, 콜라겐, 미요신, 등이 사용될 수 있다. 전사 개시 조절 시그날은 억제 또는 활성화를 허용하도록 선택될 수 있으며, 따라서 그 유전자 서열의 발현은 조절될 수 있다. 관심 있는 조절 시그날은 온도-감작성이며, 이는 온도를 다양화시킴으로써, 발현이 억제될 수 있거나 또는 개시될 수 있도록, 또는 화학적 (예컨대 대사체) 조절의 대상이 되게 하기 위한 것이다.
진핵생물 숙주에서 토신의 발현은 진핵생물성 조절 영역의 사용을 필요로 한다. 그런 영역은, 일반적으로, RNA 합성의 직접적인 개시에 충분한 프로모터 영역을 포함한다. 바람직한 진핵세포성 프로모터는, 예컨대, 마우스 메탈로티오네인 I 유전자 서열의 포로모터 (Hamer, et al., 1982, J. Mol. Appi. Gen. 1:273-288); 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터 (McKnight, 1982, Cell. 31:355-365); SV40 초기 프로모터 (Benoist, et al., 1981, Nature. 290:304-310); 효모 gal4 유전자 프로모터 (Johnston, et al., 1982, Proc. Nat. Acad Sci. USA 79:6971-6975; Silver, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:595 1 5955) 및 CMV 매개-초기 유전자 프로모터 (Thomsen, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:659-663)를 포함한다.
널리 알려진 바와 같이, 진핵생물의 mRNA의 번역은 메티오닌을 암호화하는 코돈에서 개시된다. 이런 이유로, 진핵생물성 프로모터와 토신 코딩 서열 사이의 결합은 메티오닌을 암호화할 수 있는 임의의 간섭 코돈 (즉, AUG)을 포함하지 않는다는 것을 증명하는 것이 바람직할 수 있다. 그런 코돈의 존재는 융합 단백질의 생성 (만약 AUG 코돈이 토신 코딩 서열과 동일한 리딩 프레임에 있다면) 또는 프레임-전이 돌연변이 유도 (만약 AUG 코돈이 토신 코딩 서열과 동일한 리딩 프레임에 있지 않다면)를 초래한다.
토신 핵산 분자 및 실시가능하게 연결된 프로모터가 비-복제 DNA (또는 RNA) 분자로서 수여체 원핵생물 또는 진핵생물 내로 도입될 수 있으며, 이는 선형 분자일 수 있거나 또는, 더 바람직하게는, 밀접한 공유 원형 분자일 수 있다. 그런 분자는 자가 복제가 불가능하기 때문에, 유전자의 발현이 도입되는 서열의 일시적인 발현을 통해 발생할 수 있다. 대안적으로, 숙주 염색체 내로 도입되는 DNA 서열의 삽입을 통해 영구적인 발현이 발생할 수 있다.
하나의 구체예에서, 숙주 세포 염색체 내로 목적하는 유전자 서열의 삽입이 가능한 벡터가 사용된다. 안전하게 삽입된 그들의 염색체 내로 도입되는 DNA를 갖는 세포는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 선택을 하용하는 1 또는 그 이상의 마커에 기초하여 선택될 수 있다. 그런 마커는, 예컨대, 영양요구성 숙주에 대한 독립영양, 또는 예컨대, 항생제 또는 구리와 같은 중금속 중독에 대한 항생제 내성을 제공할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자 서열은 발현되는 DNA 유전자의 벡터 상에 포함될 수 있거나, 또는 공-형질감염에 의해 소형 세포 내로 도입될 수 있다. mRNA의 최적의 합성을 위해 추가 성분이 또한 필요할 수 있다. 이들 성분은 스플라이스 시그날, 뿐 아니라 전사 프로모터, 인핸서 시그날 서열, 및 종료 시그날을 포함할 수 있다. 그런 성분을 도입시키는 cDNA 발현 벡터는 기재되어 있다 (Okayama, 1983, Molec. Cell Biol. 3:280).
바람직한 구체예에서, 도입된 핵산 분자는 수여체 숙주에 자가복제가 가능한 플라스미드 또는 바이러스성 벡터 내로 도입될 것이다. 임의의 광범위한 벡터가 이 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정 플라스미드 또는 바이러스성 벡터를 선택하는데 있어 중요한 팩터는 다음과 같은 사항을 포함한다: 벡터를 포함하는 수여체 세포가 벡터를 함유하지 않는 그들 수여체 세포로부터 인식되거나 선택될 수 있는 용이성; 숙주 세포에 존재하는 목적하는 벡터의 복제 수; 및 상이한 종의 숙주 세포 사이, 즉, 포유동물 세포와 박테리아 사이에서 벡터의 "셔틀(shuttle)" 가능성. 바람직한 원핵생물성 벡터는 대장균(E. coli)에서 복제가 가능한 그런 플라스미드를 포함한다 (예컨대, pBR322, Co1E1, pSC101, pACYC 184, 및 파이VX). 그런 플라스미드는 본 기술 분야에서 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다 (Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., 1989, In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). B. 서브틸리스 유도 플라스미드는 pC194, pC221, pT127, 등을 포함한다 (Gryczan, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), pp. 307-329). 적절한 스트렙토마이세스 플라스미드는 pIJ101 (Kendall, et al., 1987, J. Bacteriol. 169:4177-4183), 및 파이C31과 같은 스트렙토마이세스 박테리오파지 (Chater, et al., In: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54)를 포함한다. 슈도모나스 플라스미드는 이미 기재되어 있다 (John, et al., 1986, Rev. Infect. Dis. 8:693-704; Izaki, 1978, Jpn. J Bacteriol. 33:729-742).
바람직한 진핵생물성 플라스미드는, 예컨대, BPV, 백시니아, SV40, 2μ 서클 등, 또는 그들의 유도체를 포함한다. 그런 플라스미드는 본 기술 분야에서 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다 (Botstein, et al., 1982, Miami Wntr. Symp. 19:265-274; Broach, In: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 445-470 (1981); Broach, 1982, Cell. 28:203-204; Bollon, et al, 1980, J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48; Maniatis, In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, pp. 563-608 (1980)).
일단 벡터 또는 핵산 분자 함유 구조물이 발현을 위해 제조되었으며, DNA 구조물이 임의의 다양한 적절한 수단, 즉, 형질전환, 형질감염, 지방세포감염(lipofection), 접합, 원형질체 융합, 전기천공, 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 마이크로 주사, 등에 의해 적절한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터의 도입 이후, 수여체 세포가 벡터 함유 세포의 선택을 허용하는 선택 배지에서 성장한다. 클로닝된 유전자의 발현은 토신의 생성을 초래한다. 이는 형질 전환된 세포 자체에서, 또는 이어서 이들 세포가 분화되도록 유도하여 발생될 수 있다 (예컨대, 브로모데옥시우라실을 신경모세포종 세포 등에 투여함으로써).
다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 바와 같이 토신 폴리펩티드에 특이적으로 또는 그들의 토신 폴리펩티드 결합 단편에 특이적으로 결합 친화력을 갖는 항체에 관한 것이다. 만약 그것이 비-토신 폴리펩티드에 결합하지 않는다면 항체는 토신 폴리펩티드 또는 그들의 결합 단편에 특이적으로 결합한다. 선택적으로 토신에 결합하는 것들은, 토신 함유 조직에서 바뀐 토신 발현의 분석을 포함할 수 있는 방법에 사용되기 위하여 선택될 수 있지만, 이것 만으로 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 토신 단백질은 항체의 생성과 같은 다양한 과정 및 방법에, 약학적 조성물을 확인하는데 사용되기 위해, 그리고 DNA/단백질 상호작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 토신 펩티드는 항체 또는 하이브리도마를 제조하는데 사용될 수 있다. 본 기술 분야에서 당업자는, 만약 항체를 원한다면, 그런 펩티드가 본원에 기재된 바와 같이 생성될 것이며 그리고 면역원으로 사용된다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 뿐 아니라 이들 항체의 단편을 포함한다. 본 발명은 단일 체인 항체를 더 포함한다. 분자의 이디오타입(idiotype)을 포함하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예컨대, 그런 단편은 다음과 같은 것을 포함하지만 이것 만으로 제한하는 것은 아니다: F(ab')2 단편; Fab' 단편, Fab 단편, 및 Fv 단편.
본 발명의 특별한 관심은 재조합 또는 다른 기술에 의해 인간, 또는 "인간화된" (즉, 인간에게 비-면역원성) 것에서 생성되는 토신에 대한 항체이다. 인간화된 항체는, 예컨대 항체의 면역원성 분획을 대응하는, 그렇지만 비-면역원성 분획 (즉, 키메릭 항체, (Robinson, R. R., et al., International Patent Publication PCT/US86/02269; Akira, K., et al., European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison, S. L., et al., European Patent Application 173,494; Neuberger, M. S., et al., PCT Application WO 86/01533; Cabilly, S., et al., European Patent Application 125,023; Better, M., et al, 1988, Science. 240:1041-1043; Liu, A. Y., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84:3439-3443; Liu, A. Y., et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun, L. K., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura, Y., et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood, C. R., et al., 1985, Nature. 314:446-449); Shaw, et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559) 및 "인간화된" 키메릭 항체 (Morrison, S. L., 1985, Science. 229:1202-1207; Oi, V. T., et al., 1986, BioTechniques 4:214))로 대체함으로써 제조될 수 있다. 적절한 "인간화된" 항체는 CDR 또는 CEA 치환에 의해 대안적으로 생성될 수 있다 (Jones, P. T., et al., 1986, Nature. 321:552-525; Verhoeyan, et al., 1988, Science. 239:1534; Beidler, C. B., et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060).
다른 구체예에서, 본 발명은 전술한 모노클로날 항체를 제조해 내는 하이브리도마에 관한 것이다. 하이브리도마는 특정 모노클로날 항체를 분비해 낼 수 있는 불멸화된 세포주이다.
일반적으로, 모노클로날 항체 및 하이브리도마를 제조하는 기술은 본 기술 분야에서 공지되어 있다 (Campbell, "Monoclona Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology," Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1984); St. Groth, et al., 1980, J. Immunol. Methods. 35:1-21).
본 발명의 방법은 토신 단백질 또는 그들의 일부와 반응성인 항체를 이용한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 토신 단백질 또는 그들의 일부 또는 단편과 특이적으로 결합한다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있으며, 용어 항체는 폴리클로날 및 모노클로날 항체, 및 그들의 작용성 단편을 포함하는 것으로 해석된다. 용어 폴리클로날 및 모노클로날은 항체 제조의 동종성의 정도를 의미하는 것이며, 특정 제조 방법으로 한정하는 것으로 의도되어서는 안된다.
항체를 생성해 내는 것으로 알려진 임의의 동물 (마우스, 토끼 등)들은 선택된 폴리펩티드로 면역화될 수 있다. 면역화 방법은 본 기술 분야에서 공지되어 있다. 그런 방법은 폴리펩티드의 피하 또는 복강 주사를 포함한다. 본 기술 분야에서 당업자는 면역화에 사용되는 폴리펩티드의 양이 면역화되는 동물, 폴리펩티드의 항원성 및 주사부위에 기초하여 다양할 것이라는 것을 인식할 것이다.
폴리펩티드는 펩티드 항원성을 증가시키기 위해 변형될 수 있거나 또는 어쥬반트 중에서 투여될 수 있다. 폴리펩티드의 항원성을 증가시키는 방법은 본 기술 분야에서 공지되어 있다. 그런 과정은 이종성 단백질 (예컨대 글로불린 또는 β-칼락토시다제)과 항원의 커플링 또는 면역화되는 동안 어쥬반트의 포합을 통한 커플링을 포함한다.
모노클로날 항체를 위해, 면역화된 동물의 비장 세포를 제거하였으며, 골수종 세포와 융합시켰으며, 그리고 모노클로날 항체가 하이브리도마 세포를 제조하게 되도록 방치하였다.
본 기술 분야에서 공지된 다수의 방법 중 임의의 하나가, 목적하는 특성을 갖는 항체를 생성시키는 하이브리도마 세포를 인식하는데 사용될 수 있다. 이들은 ELISA 분석에 의한 하이브리도마의 스크리닝, 웨스턴 블랏 분석, 또는 방사선 면역 분석을 포함한다 (Lutz, et al., 1988, Exp. Cell Res. 175:109-124).
본 기술 분야에서 공지된 방법을 사용하여 목적하는 항체를 분비하는 하이브리도마가 클로닝되고 클래스 및 서브클래스가 결정된다 (Campbell, In: Monoclonal Antibody Technology. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, supra (1984)).
폴리클로날 항체를 위해, 항체 함유 면역혈청이 면역화된 동물로부터 분리되고 전술한 방법 중 하나를 사용하여 목적하는 특이성을 갖는 항체의 존재에 대해 스크리닝된다.
본 발명의 다른 구체예에서, 전술한 항체가 검출될 수 있도록 라벨링된다. 방사선 동위원소, 친화력 라벨링 항체 (예컨대 바이오틴, 아비딘, 등), 효소 라벨링 (예컨대 호오스 래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 등) 형광 라벨링 (예컨대 FITC 또는 로다빈 등), 상자성 원자 등의 사용을 통해 항체가 검출될 수 있게끔 라벨링될 수 있다. 그런 라벨링을 수반하기 위한 과정은 본 기술 분야에서 공지되어 있다 (Stemberger, et al., 1970, J. Histochem. Cytochem. 18:315; Bayer, et al., 1979, Meth. Enzym. 62:308; Engval, et al., 1972, Immunol. 109:129; Goding, 1976, J. Immunol. Meth. 13:215). 본 발명의 라벨링된 항체는 특정 펩티드를 발현하는 세포 또는 조직을 확인하는데 있어 시험관내, 생체내, 및 인시투(in situ) 분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서 전술한 항체가 고형 지지체 상에서 고정화되었다. 그런 고형 지지체의 예는 폴리카르보네이트와 같은 플라스틱, 아가로스 및 세파로스와 같은 복합 탄수화물, 폴리아크릴아미드 및 라텍스 비드와 같은 아크릴계 수지를 포함한다. 그런 고형 지지체에 항체를 커플링하기 위한 기술은 본 기술 분야에서 공지되어 있다 (Weir, et al., In: "Handbook of Experimental Immunology," 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby, et al., 1974, Meth. Enzym. Vol. 34. Academic Press, N.Y.). 본 발명의 부동화된 항체는 시험관내, 생체내, 및 인시투 분석 뿐 아니라 면역크로마토그래피에서 사용될 수 있다.
게다가, 본 기술 분야에서 당업자는 합리적으로 디자인된 안티펩티드 펩티드들을 생성하기 위하여 특정 펩티드 서열에 결합할 수 있는 펩티드를 생성시키는 항체에 관하여 앞서 개시된 현재 유용한 과정들, 뿐 아니라 기술들, 방법 및 키트를 용이하게 적용할 수 있다 (Hurby, et al., In: "Application of Synthetic Peptides: Antisense Peptides," In Synthetic Peptides, A User's Guide, W. H. Freeman, N.Y., pp. 289-307 (1992); Kaspczak, et al., 1989, Biochemistry 28:9230-9238).
안티-펩티드 펩티드들은 두가지 경향 중 하나로 생성될 수 있다. 먼저, 안티-펩티드 펩티드들은 토신 펩티드 서열에서 발견되는 염기성 아미노산 잔기를 산성 잔기로 대체시킴으로써 생성될 수 있으며, 소수성 및 하전되지 않은 극성 군은 유지된다. 예컨대, 라이신, 아르기닌, 및/또는 히스티딘 잔기가 아스파르트산 또는 글루탐산으로 대체되고 그리고 글루탐산 잔기가 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 시료 중에 토신 폴리펩티드를 검출하는 방법에 관한 것이며, 면역복합체가 형성되는 조건 하에서, 시료를 전술한 항체 (또는 단백질)과 접촉시키는 것, 그리고 폴리펩티드에 결합된 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 상세히는, 그 방법은 테스트 시료를 1 또는 그 이상의 본 발명의 항체와 배양하는 것 그리고 항체가 테스트 시료에 결합되었는지 여부를 분석하는 것을 포함한다. 시료 중에 정상 수준에 비해 변화된 토신의 수준은 특정 질병을 지시할 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 시료 중에 토신 항체를 검출하는 방법에 관한 것이며: 면역착물이 형성되는 그런 조건 하에서, 시료를 전술한 토신 단백질과 접촉시키는 것, 그리고 항체에 결합된 단백질 또는 단백질에 결합된 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 상세히는, 그 방법은 테스트 시료를 1 또는 그 이상의 본 발명의 항체와 배양하는 것 그리고 항체가 테스트 시료에 결합되었는지 여부를 분석하는 것을 포함한다.
항체와 테스트 시료를 배양하기 위한 조건은 다양하다. 배양 조건은 분석에 사용되는 포맷, 사용되는 검출 방법, 및 분석에 사용되는 항체의 유형 및 성질에 좌우된다. 본 기술 분야에서 당업자는, 통상 유용한 면역학적 분석 포맷 (예컨대 방사선 면역 분석법, 효소-결합 면역흡수 분석법, 확산 기초 Ouchterlony, 또는 로켓 면역 형광 분석법) 중 임의의 하나가 본 발명의 항체를 사용하는데 용이하게 적용될 수 있다는 것을 인식할 것이다 (Chard, In: An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1986); Bullock, et al., In: Techniques in Immunocytochemistry, Academic Press, Orlando, Fla. Vol. 1(1982), Vol. 2(1983), Vol. 3(1985); Tijssen, In: Practice and Theory of enzyme Immunoassays: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, The Netherlands (1985)).
본 발명의 면역학적 분석 테스트 시료는 세포, 단백질 또는 세포의 막 추출물, 또는 혈액, 혈청, 혈장, 또는 뇨(尿)와 같은 생체 유체를 포함한다. 전술한 방법에 사용되는 테스트 시료는 분석 포맷, 검출 방법의 성질 및 분석되는 시료로서 사용되는 조직, 세포 또는 추출물에 근거하여 다양할 것이다. 세포의 단백질 추추물 또는 막 추출물을 제조하는 방법은 본 기술 분야에서 공지되어 있으며 그리고 사용되는 시스템과 더불어 가능한 시료를 얻기 위하여 용이하게 적용될 수 있다.
청구된 발명은 근긴장이상 단백질을 측정할 수 있는 몇가지 적절한 분석법을 사용한다. 적절한 분석법은 면역학적 방법, 예컨대 방사선 면역 분석벅, 효소-결합 면역흡수 분석법 (ELISA), 및 화학발광 분석법을 포함한다. 이제까지 또는 이후에 개발되는 임의의 공지된 방법이 본 발명을 수행하고 그리고 토신 단백질을 측정하는데 사용될 수 있다.
몇가지 바람직한 구체예에서, 면역학적 기술은 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체, 및 그들의 혼합물을 포함하는 항-근긴장이상 단백질 항체 (즉, 1 또는 그 이상의 항체)를 수단으로 하여 토신 단백질 수준을 검출한다. 예컨대, 이들 면역학적 기술은 폴리클로날 및/또는 모노클로날 항체의 혼합물, 예컨대 마우스의 모노클로날과 토끼의 폴리클로날의 칵테일을 사용할 수 있다.
본 기술 분야에서 당업자는 적절한 면역원에 대한 안티-토신 항체, 예컨대 분리된 및/또는 재조합 토신 단백질 또는 그들의 일부 또는 단편 (합성 펩티드와 같은 합성 분자 포함)을 발생하게 할 수 있다. 하나의 구체예에서, 분리된 및/또는 재조합 토신 단백질 또는 일부 또는 그들의 단편 (예컨대, 펩티드)에 대해 또는 재조합 근긴장이상 단백질을 발현하는 숙주세포에 대해 항체가 발생한다. 게다가, 재조합 토신 단백질을 발현하는 세포, 예컨대 형질감염된 세포는, 면역원으로써 또는 토신 단백질에 결합하는 항체의 스크리닝에 사용될 수 있다.
임의의 적절한 기술로 면역화된 항원을 제조할 수 있고 그리고 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성해낼 수 있다. 종래의 기술은 이들 다양한 방법을 포함한다 (Kohler, et al., 1975, Nature. 256:495-497; Kohler, et al., 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519; Milstein, et al., 1977, Nature. 266:550-552; Koprowski, et al., U.S. Pat. No.: 4,172,124; Harlow, et al., In: 항체: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)). 일반적으로, SP2/0과 같은 불멸 또는 골수종 세포주와 항체 생성 세포와의 적절한 융합은 하이브리도마를 생성해 낼 수 있다. 관심있는 항원으로 면역화된 동물들은, 바람직하게는 비장 또는 임파절로부터 항체-생성 세포를 제공한다. 선택적 배양 조건은 항체 생성 하이브리도마 세포를 분리해내는 반면, ELISA, RIA 및 웨스턴 블랏팅과 같이 제대로 확립된 기술로 인식된 분석법을 발생시키는 희석 기술은 목적하는 특이성을 갖는 세포를 생성해내는 항체를 선택하는데 사용될 수 있는 것을 제한한다.
다른 적절한 방법은 필수적인 특이성을 갖는 항체를 생성해내거나 또는 분리할 수 있다. 다른 방법들의 예는 라이브러리로부터 재조합 항체를 선택하는 것 또는 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성해낼 수 있는 마우스와 같은 유전자 도입 동물의 면역화에 좌우되는 것을 포함한다 (Jakobovits, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits, et al., 1993, Nature. 362:255-258; Lonbert, et al., U.S. Pat. No.: 5,545,806; Surani, et al., U.S. Pat. No.: 5,545,807).
본 방법에 따라, 분석법은 생물 시료 중에서 토신 단백질의 레벨 또는 농도를 측정할 수 있다. 토신 단백질의 양을 결정하는데 있어, 분석법은, 항체와 토신 단백질 사이에서 착물이 형성되기에 적절한 조건 하에서, 테스트되는 시료와 토신 단백질에 대한 특이성을 갖는 항체를 조합시키는 것, 그리고 착물의 형성을 (직접 또는 간접적으로) 검출하거나 또는 측정하는 것을 포함한다. 특정 시료 (예컨대, 혈액 전체, 조질 추출물, 혈청) 및 선택된 분석 포맷에 적절한 방법에 의해 시료가 얻어질 수 있으며 제조될 수 있다. 예컨대, 전체 혈액 수집에 적절한 방법은 정맥 천자(venipuncture) 또는 내재하는 정맥 라인으로부터 혈액을 얻는 것이다. 혈액을 수집하기 위한 컨테이너는 CACD-A, 헤파린, 또는 EDTA와 같은 항-응고제를 함유할 수 있다. 시료와 항체를 조합하는 방법, 및 착물 형성을 검출하는 방법은 또한 분석 포맷과 양립할 수 있는 것으로 선택된다. 방사선활성, 형광 또는 화학발광과 같은 적절한 라벨이 직접 검출될 수 있으며; 또는 효소 라벨 및 바이오틴 및 콜로이드성 골드와 같은 다른 항원성이거나 또는 특이적 결합 파트너와 같은 라벨을 사용하여 간접적으로 검출된다. 그런 라벨의 예는 플루오레세인과 같은 형광 라벨, 로다민, CY5, APC, 루시퍼라제와 같은 화학 발광 라벨, 32p, 125I, 131I와 같은 방사성 동위원소 라벨, 호오스 래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소 라벨, 및 알칼리성 포스파타제, 0-갈락토시다제, 바이오틴, 아비딘, 스핀 라벨 등을 포함한다. 착물 중에 항체의 검출은 또한 나중에 검출되는 제2항체로 면역학적으로 행해질 수 있다. 종래의 방법 또는 다른 적절한 방법으로 직접적으로 또는 간접적으로 항체를 라벨링한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 토신 단백질의 존재 또는 부재를 진단하기 위한; 또는 전술한 검출 방법을 수행하는데 필요한 모든 시약을 함유하는 포유동물에서 근긴장이상를 일으키기 위한 키트가 제공된다.
예컨대, 그 키트는 전술한 항체를 포함하는 첫번째 컨테이너 수단, 및 항체의 결합 파트너와 라벨을 포함하는 컨쥬게이트를 함유하는 두번째 컨테이너 수단을 포함할 수 있다.
그 키트는 또한 전술한 단백질을 포함하는 첫번째 컨테이너 수단, 및 바람직하게는 단백질의 결합 파트너와 라벨을 포함하는 컨쥬게이트를 함유하는 두번째 컨테이너 수단을 포함할 수 있다. 더 구체적으로, 진단 키트는, 강력하게 감염된 동물 또는 인간의 혈청 중에 항체를 검출하기 위한 전술한 토신 단백질을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 키트는 1 또는 그 이상의 세척 시약 및 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 시약을 포함하는 1 또는 그 이상의 다른 컨테이너를 더 포함한다. 검출 시약의 예는, 라벨링된 2차 항체, 또는 대안적으로, 만약 1차 항체가 라벨링되었다면, 그 라벨링된 항체와 반응할 수 있는 발색단, 효소, 또는 항체 결합 시약을 포함하지만 이것 만으로 한정하는 것은 아니다. 구획된 키트는 전술한 바와 같이 핵산 프로브 키트일 수 있다. 그 키트는, 예컨대, RIA 키트 또는 ELISA 키트일 수 있다.
본 기술 분야에서 당업자는 본 발명에 기재된 항체가 본 기술 분야에사 공지된 확립된 키트 포맷 중 하나 내로 용이하게 도입될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
비록 이하의 설명은 구체적으로 인간 환자를 대상으로 하는 것이지만, 그 기술은 또한 토신 단백질을 발현하는 임의의 동물에 또한 적용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본원에서 정의되는 용어 "포유동물"은 임의의 척추 동물을 의미하며, 그들의 2세에게 젖을 먹이는 단공류, 유대동물 및 태반성 동물, 및 살아있는 2세를 낳거나 (eutherian 또는 태반성 동물) 또는 알을 낳는 (metatherian 또는 비태반성 동물) 것을 포함한다. 포유동물 종의 예는 영장류 (예컨대, 인간, 원숭이, 침팬지, 비비(baboons)), 설치류 (예컨대, 래트, 마우스, 기니아 피그, 햄스터) 및 반추동물 (예컨대, 소, 말)을 포함한다.
본 발명의 진단 및 스크리닝 방법은 유전자에 있어서 돌연변이의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 여기서 유전자의 돌연변이는 인간에게 신경계 질환을 초래하는 것이다. 예컨대, 본 발명의 진단 및 스크리닝 방법은, 가족력상 토신에 기초한 발현 레벨의 변화와 관련된 질환의 발병의 위험이 있는 것으로 의심이 되는 인간 환자, 또는 토신-관련 질환을 진단하는 것이 목적인 환자에 있어서, 신경계 유전자 중에 돌연변이 또는 폴리모피즘의 존재 또는 부재를 진단하는데 특히 유용하다.
바람직하게는, 핵산 진단은 초기-발병 전신성 근긴장이상; 후기-발병 전신성 근긴장이상; 또는 임의의 형태의 유전자적, 환경적, 원발성 또는 속발성 근긴장이상와 같은 다양한 형태의 염전(torsion) 근긴장이상의 상이한 진단의 수단으로서 사용된다. 이 정보는 이후 유전자 카운셀링 및 개별 치료 전략과 관련되는 환자의 분류에 사용된다.
본 발명에 따라, 그런 스크리닝이 필요한 개체의 증상-전 스크리닝은 이제 본 발명의 토신 단백질을 암호화하는 DNA를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 스크리닝 방법은, 출생 전 진단을 포함하여, 개인에 대한 결실의 존재 또는 이상 토신 유전자의 증상-전 진단, 및 따라서 그런 개체에서 토신-관련 질환이 발병하게 되거나 또는 이미 발병된 가능성과 관련된 소견을 허용한다. 이는, 예컨대, 토신-관련 질환의 가족력이 있는 개체로부터 치환되거나 또는 결실된 토신 유전자의 담체를 확인하는데 특히 가치있다. 적절한 시간 간격을 최대화하는데 있어 초기 진단이 또한 바람직하다.
증상의 개시에 앞서 유전자 담체의 확인은 증상의 개시를 촉발하는 유전자적 및 환경적 팩터의 평가를 허용한다. 유전자적 팩터를 바꾸는 것은 토신 단백질에서 폴리모피즘 변이 (구체적으로, 토신 단백질) 또는 단백질과 관련되거나 또는 연관된 돌연변이를 포함할 수 있으며; 환경적 팩터를 바꾸는 것은 과사용 또는 외상에 의해 초래되는 것과 같은 취약한 신경에 의해 도움을 받는 신체의 일부에 대한 감각의 과부하; 높은 체온; 또는 독성 시약에 대한 노출을 포함한다 (Gasser, T., et al., 1996, Mov Disord. 11:163 -166).
스크리닝의 진단 방법의 하나의 예에서, 체액을 함유하는 테스트 시료 (예컨대, 혈액, 타액, 양수) 또는 조직 (예컨대, 신경계, 융모성 융모) 시료가 그런 개체로부터 채취되고 그리고 (1) "정상" 토신 유전자의 존재 또는 부재; (2) 토신 mRNA의 존재 또는 부재 및/또는 (3) 토신 단백질의 존재 또는 부재에 대해 스크리닝된다. 정상 인간 유전자는, RFLP, PCR, 서던 블랏팅, 노던 블랏팅 및 핵산 서열 분석을 포함하여, 본 발명에서 교시한 토신 서열 (또는 그들의 작용성 단편)에 대해 제조된 DNA 프로브를 이용하여, 예컨대, 환자 DNA에 대비된 "정상"에서 제한 소화 패턴의 검출을 기초로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 하나의 구체예에서 토신 서열은 하나의 토신 서열이다 (SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 및 9). 다른 구체예에서 3가지 뉴클레오티드의 존재 또는 부재는 각각, 염전 근긴장이상의 네가티브 또는 파지티브 진단을 나타낸다. 유사하게, 토신 mRNA는 유사한 프로브를 사용하여 토신-관련 질환을 발병시킬 위험이 없는 인간 집단에서 발견되는 것으로서 정상 토신 mRNA (a) 레벨 및/또는 (b) 크기를 특징으로 할 수 있으며 비교될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 핵산이 "정상" 토신 유전자의 존재 또는 부재를 측정하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 핵산은 DNA (예컨대, cDNA 또는 게놈 DNA) 또는 RNA일 수 있다.
최종적으로, 토신 단백질은 토신 활성에 대한 생물학적 분석을 사용하여 또는 면역학적 분석 및 토신 항체를 사용하여 (a) 검출될 수 있고 그리고/또는 (b) 정량화될 수 있다. 토신 단백질을 분석할 때, 그것의 속도 면에서 면역힉적 분석이 바람직하다. 본 발명의 하나의 구체예에서 토신 단백질 서열 (SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 및 10) 또는 단백질이 SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 및 9에 의해 암호화된다. (1) 이상 토신 DNA 크기 패턴, 및/또는 (2) 이상 토신 mRNA 크기 또는 레벨 및/또는 (3) 이상 토신 단백질 레벨이 환자가 토신-관련 질환을 발병시킬 위험이 있다는 것을 지시하게 된다.
근긴장이상 장애와 관련된 돌연변이는 tor-2와 같은 근긴장이상 유전자에서 임의의 돌연변이를 포함한다. 그 돌연변이는 tor-2 유전자의 코딩 또는 비-코딩 영역에서 1 이상의 뉴클레오티드에서 결실 또는 부가일 수 있으며 이는 결과적으로 단일 아미노산의 변경 또는 프레임 전이 돌연변이를 초래하게 된다.
근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 진단하는 하나의 방법에서, 서던 분석과 같은 혼성화 방법이 사용된다 (Ausubel, et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998)). 본 발명에 사용하기에 적절한 테스트 시료는 핵산, 즉 DNA 또는 RNA를 함유하는 임의의 시료이다. 예컨대, 게놈 DNA의 테스트 시료는 근긴장이상 장애를 가질 것으로 (또는 결실을 운반하는 것으로) 의심이 되는 사람으로부터 얻는다. 테스트 시료는 체액 또는 조직 시료와 같이 제놈 DNA를 함유하는 임의의 공급원으로부터 얻을 수 있다. 하나의 구체예에서, DNA의 테스트 시료가 혈액, 타액, 정액, 질 분비물, 뇌척수액 및 양수 시료와 같은 체액으로부터 얻어진다. 다른 구체예에서, DNA의 테스트 시료는 융모성 융모, 신경 조직, 상피 조직, 근육 조직 및 결합 조직과 같은 조직으로부터 얻어진다. DNA는 표준 기술-인식 프로토콜을 사용하여 테스트 시료로부터 분리될 수 있다 (Breakefield, X. O., et al., 1986, J. Neurogenetics. 3:159-175). 돌연변이가 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재와 관련되는지 여부를 결정하는데 있어 DNA 시료가 시험된다. 돌연변이 또는 폴리모피즘의 존재 또는 부재는, 게놈 DNA에서 핵산 프로브에 대한 tor-2 유전자와 같은 신경계 유전자와의 혼성화에 의해 지시된다. 핵산 프로브는 신경계 유전자의 뉴클레오티드 서열이다. 부가적으로 또는 대안적으로, 그런 프로브에 의해 암호화되는 RNA는 또한 혼성화에 의한 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 진단하는데 사용될 수 있으며, 혼성화 시료는 tor-2와 같은 근긴장이상 유전자를 함유하는 테스트 시료를 핵산 프로브와 접촉시킴으로써 형성된다. 관심있는 근긴장이상 유전자에 대한 핵산 프로브의 특이적 혼성화를 허용하기에 충분한 조건 하에서 혼성화 시료가 유지된다. 혼성화는 앞서 설명한 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 만약 유전자 중에 결실이 제한 부위의 생성 또는 제거를 초래한다면, 제한 소화에 의한 결실 분석이 tor-2 유전자와 같은 근긴장이상 유전자의 결실을 검출하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 게놈 DNA를 함유하는 테스트 시료가 인간으로부터 얻어진다. 적절한 제한 효소를 갖는 게놈 DNA를 소화시킨 이후, DNA 단편이 표준 방법을 사용하여 분리되고, 토신 유전자 또는 cDNA에 특이적인 프로브와 접촉된다. DNA 단편의 소화 패턴은 근긴장이상 장애와 관련된 돌연변이의 존재 또는 부재를 지시한다. 대안적으로, 폴리머라제 체인 반응 (PCR)이, 인간으로부터 얻은 게놈 DNA의 테스트 시료에서 tor-2와 같은 관심있는 근긴장이상 유전자 (그리고, 만약 필요하다면, 플랭킹(flanking) 서열)를 증폭하는데 사용될 수 있다. 제한 소화에 의한 직접 돌연변이 분석법 또는 뉴클레오티드 시퀸싱이 이후 수행되었다. 대응하는 DNA 단편의 소화 패턴은 근긴장이상 장애와 관련된 돌연변이의 존재 또는 부재를 지시한다.
대립유전자(allele)-특이적 올리고뉴클레오티드가, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 인간으로부터 얻은 핵산 시료의 PCR 증폭에 의해 특정 질환과 관련된 결실 또는 폴리모피즘을 검출함으로써 신경계 질환의 존재 또는 부재를 검출하는데 또한 사용될 수 있다. "대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드" (본원에서는 또한 "대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브"로 언급됨)는 대략 10-300 염기쌍의 올리고뉴클레오티드이며, 3개의 뉴클레오티드의 결실과 같이 특정 돌연변이를 함유하는 tor-2와 같은 근긴장이상 유전자 (또는 유전자 단편)과 특이적으로 혼성화된다. 특정 돌연변이, 예컨대, tor-2 유전자에 대해 특이적인 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다 (Ausubel, et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998)).
염전 근긴장이상, 또는 임의의 다른 신경계 질환과 관련된 tor-2 유전자에서 돌연변이를 확인하는데 있어 인간으로부터 DNA의 시료를 얻는다. tor-2 유전자의 전체 또는 단편, 및 그것의 플랭킹 서열을 증폭하는데 있어 PCR이 사용될 수 있다. PCR 프라이머는 신경계 유전자의 임의의 서열을 포함한다. 증폭된 신경계 유전자, 예컨대 tor-2 유전자 (또는 유전자의 단편)를 함유하는 PCR 생성물은 표준 방법을 사용하는 젤 전기영동에 의해 분리되고 (Ausubel, et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1998)), 그리고 형광 라벨된 프라이머가 사용될 때 형광 이미지화와 같은 기술-인식 확립 기술을 사용하여 단편을 인식하게 된다. 신경계 유전자에서 돌연변이 또는 폴리모피즘의 존재 또는 부재를 지시하는 특정 DNA 단편의 존재 또는 부재가 검출된다. 예컨대, 특정 분자 크기의 두 대립유전자의 존재는 염전 근긴장이상의 부재를 지시하며; 이들 대립유전자 중 하나의 부재는 염전 근긴장이상를 지시한다. 인간으로부터 얻어지고 본원에 기재된 방법에 의해 평가되는 시료는 특정 신경계 질환의 특징인 특정 돌연변이 또는 폴리모피즘을 함유하고 그리고 함유하지 않는 표준 시료에 비교될 것이다.
목적한다면, 양수검사, 융모성 융모 샘플링 (CVS), 및 태아검사경을 포함하는, 태아의 세포를 얻기 위한 임의의 공지된 방법을 사용하여, 출생전 진단이 수행될 수 있다. 만약 정상 토신 유전자를 소유하는 염색체의 일부가 이형접합성 상태로 존재하는지 결정하기 위해, 태아 염색체 분석이 사용될 수 있다. 토신-관련 질병의 치료 방법에서는 그런 치료가 필요한 환자에 대해, 그런 유전자에 의해 제공되는 토신 단백질의 발현을 허용하는 방식 및 양으로, 그런 환자를 치료하기에 충분한 시간 및 양으로, 작용성 토신 DNA가 그런 환자의 세포에 제공될 수 있다. 세포로부터 유전자 또는 단백질 결실이 필요한 인간 환자에 대해 그런 운반을 제공하는데 있어 많은 벡터 시스템이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예컨대, 레트로바이러스 시스템, 특히 변형된 레트로바이러스 시스템 및 특히 헤르페스 심플렉스 바이러스 시스템이 사용될 수 있다 (Breakefield, X. O., et al., 1991, New Biologist. 3:203-218; Huang, Q., et al., 1992, Experimental Neurology. 115:303-316; WO93/03743; WO90/09441). 작용성 토신 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 운반은 본 발명의 결실 또는 돌연변이된 토신 유전자를 효과적으로 대체하게 된다. 본 발명의 다른 구체예에서, 토신 유전자가 세포 중에 재조합 유전자로서 발현되며, 따라서 그 세포들은 포유동물, 바람직하게는 유전자 치료가 필요한 인간에게 이식될 수 있다. 유전자 치료를 개인에게 제공하기 위해, 토신 유전자의 전부 또는 일부를 암호화하는 유전자 서열이 벡터 내로 삽입되고 그리고 숙주 세포 내로 도입된다. 유전자 치료에 적합할 수 있는 질환의 예는, 신경퇴행성 질병 또는 질환, 원발성 근긴장이상 (바람직하게는, 전신성 근긴장이상 및 염전 근긴장이상)를 포함하지만 이것 만으로 한정하는 것은 아니다.
유전자 치료 방법은 본 발명의 토신 코딩 서열을 환자에게 전이시키는데 사용될 수 있다 (Chattedee and Wong, 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 218:61-73; Zhang, 1996, J. Mol. Med. 74:191-204; Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf, 1995, J. Hematotherapy. 4:551-561; Shaughnessy, et al., 1996, Seminars in Oncology. 23:159-171; Dunbar, 1996, Annu. Rev. Med. 47:11-20).
유전자 치료에 사용될 수 있는 벡터의 예는, 불완전 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 다른 바이러스성 벡터를 포함하지만 이것만으로 한정하는 것은 아니다 (Mulligan, R. C., 1993, Science. 260:926-932). 유전자를 운반하는 벡터가 세포 내로 도입될 수 있는 수단은, 마이크로 주사법, 전기천공, 형질도입, 또는 DEAE-덱스트란을 사용하는 형질감염, 지방세포 감염, 인산 칼슘 또는 본 기술 분야에서 공지된 다른 방법을 포함하지만 이것 만으로 한정하는 것은 아니다 (Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., 1989, In: Molecular Cloning. A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).
토신의 활성을 방해하거나 또는 증강시키는 토신의 효능제 및 길항제의 활성은 토신을 함유하는 세포로 평가될 수 있다. 길항제 또는 효능제로서 작용할 수 있는 시약의 존재 하에서, 세포에서 토신 활성에 대한 분석법이 토신 단백질의 작용성을 측정하는데 사용될 수 있으며, 따라서, 토신의 활성을 방해하거나 또는 증강시키는 시약이 확인된다.
분석법으로 스크리닝되는 시약은, 펩티드, 탄수화물, 비타민 유도체, 또는 다른 약학적 시약일 수 있지만 이것 만으로 한정하는 것은 아니다. 이들 시약은 무작위로, 합리적인 선택에 의해 또는, 예컨대, 단백질 또는 리간드 모델링 기술 (바람직하게는, 컴퓨터 모델링)을 사용하는 디자인에 의해 선택될 수 있으며 스크리닝될 수 있다.
무작위 스크리닝에서, 펩티드, 탄수화물, 약학적 시약 등과 같은 시약이 무작위로 선택되며 그리고 토신 단백질에 결합하는 그들의 능력 또는 토신 단백질의 활성을 자극/억제하는 그들의 능력에 대해 분석된다.
대안적으로, 시약은 합리적으로 선택될 수 있거나 또는 디자인될 수 있다. 본원에서 사용된 것으로서, 그 시약이 토신 단백질의 구조에 근거하여 선택될 때, 그 시약이 "합리적으로 선택되거나 또는 디자인된다"고 한다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 토신의 활성을 자극하거나 또는 억제하는 길항제 또는 효능제에 대한 스크리닝 방법에 관한 것이며, 그 방법은 토신을 발현하는 세포를 테스트되는 시약과 함께 배양하는 것; 그리고 토신의 ATP 결합에 영향을 미치는 시약을 측정함으로써 토신 단백질의 활성에 대해 세포를 분석하는 것을 포함한다. 토신의 기능성 형태를 발현하고 그리고 토신 활성이 측정될 수 있는 한, 임의의 세포가 상기 분석법에 사용될 수 있다. 바람직한 발현 세포는 진핵생물성 세포 또는 유기체이다. 그런 세포는 토신을 암호화하는 DNA 서열을 함유하도록 본 기술 분야에서 공지된 종래의 방법을 사용하여 변형될 수 있다. 대안적으로, 본 기술 분야에서 당업자는 토신 단백질을 암호화하는 mRNA를 세포 내로 직접 도입할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 돌연변이체 토신 단백질의 발현을 방해할 수 있는 약제 (예컨대, 약물)을 스크리닝 하는 것에 관한 것이다. 바람직하게는, 본원에 기재된 벡터 기술을 사용하여 신경계 배양물이 토신 단백질의 돌연변이형의 과발현에 사용된다. 신경계 형태학 및 단백질 분포의 변화가 평가되며 그리고 정량화 수단이 사용된다. 이후 이런 생물 분석이 표현형을 개선시킬 수 있는 약물에 대한 스크린으로써 사용된다. 토신 리간드 (전술한 바와 같은 길항제 및 효능제 포함)를 사용하여 본 발명은 세포에서 토신 단백질의 활성을 조절하는 방법을 더 제공한다. 일반적으로, 토신의 활성을 억제하거나 또는 자극하는 것으로 확인되었던 시약 (길항제 및 효능제)이 제제화될 수 있으며 따라서 그 시약이 생체내에서 토신 단백질을 발현하는 세포와 접촉하게 된다. 그런 세포와 그런 시약의 접촉은 결과적으로 토신 단백질의 활성에 대한 생체내 조절을 초래한다. 제제 장벽 또는 독성 장벽이 존재하지 않는 한, 전술한 분석법에서 확인된 시약은 생체내에서 사용하기에 효과적이 될 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 토신 또는 토신 리간드 (토신 길항제 및 효능제 포함)를 동물 (바람직하게는, 포유동물 (구체적으로, 인간))에게 그 동물의 토신 레벨을 바꾸도록 영향을 미치기에 충분한 양으로 투여하는 방법에 관한 것이다. 투여된 토신 또는 토신 리간드는 특이적으로 토신 관련 기능에 영향을 미친다. 게다가, 토신은 뇌 조직에서 발현되기 때문에, 토신 또는 토신 리간드의 투여는 뇌에서 토신 레벨을 바꾸는데 사용될 수 있다.
본 기술 분야에서 당업자는 임의의 특정 치료 프로토콜에 따라 투여되는 양이 용이하게 결정될 수 있다는 것을 받아들일 것이다. 투약량은 원하지 않는 교차-반응, 과민성 반응 등과 같은 부작용을 일으킬 만큼 크지 않다. 일반적으로, 투약량은, 환자의 연령, 질병, 성별 및 질병의 정도, 개개 의사에 의해 조정되는 반대 지시, 만약 있다면, 다른 그런 변수에 따라 다양할 것이다. 면역 자극을 제공하기 위해 본 발명에 사용되는 투약량은 약 0.1 ㎍ 내지 약 500 ㎍을 포함하며, 이는 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 5.0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 및 450 ㎍을 포함하며, 그들 사이의 모든 범위 및 부분범위를 포함한다. 이와 같은 양은 1회 투약으로써 투여될 수 있거나 또는 이어지는 증폭(booster) 투약을 포함하는 식이요법에 따라 투여될 수 있으며, 그럼으로써 효과적으로 되고, 예컨대, 본 발명의 조성물은 1회 또는 며칠, 수주, 수개월 및/또는 수년의 기간의 과정에 걸쳐 연속적으로 투여될 수 있다.
또한, 주사가능 제제와 같은 제형 (용액, 현탁액, 에멀션, 필요할 때 용해되는 고형 등), 정제, 캅셀, 과립, 분말, 액체, 리포좀 봉입체(inclusions), 연고, 겔, 외용 분말, 스프레이, 흡입용 분말, 안약, 안연고, 좌약, 페서리(pessaries), 등이 투여 방법에 좌우되어 적절히 사용될 수 있으며, 그리고 본 발명의 펩티드가 그에 맞게 제제화될 수 있다. 약학적 제제는 일반적으로 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, Chapter 25.2 of Comprehensive Medicinal Chemistry, Volume 5, Editor Hansch et al, Pergamon Press 1990에 기재되어 있다.
토신 또는 토신 리간드는 1회 주사(injection) 또는 시간에 걸쳐 점진적인 관류(perfusion)에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 그것은 정맥내로, 복강내로, 근육내로, 또는 피하로 투여될 수 있다.
비경구적 투여용 제제는 무균 또는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀션을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 에틸 올리에이트와 같은 주사 가능 유기 에스테르이다. 수성 담체는, 식염액과 완충된 매질을 포함하는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 비이클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이트화 링거, 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비이클은 유체 및 영양제 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기초로 하는 것, 등을 포함한다. 예컨대, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 다른 첨가제가 존재할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Science, 16th ed., Eds.: Osol, A., Ed., Mack, Easton Pa. (1980)).
다른 구체예에서, 본 발명은 토신 관련 활성을 바꾸기에 충분한 양의 토신 또는 토신 리간드, 및 약학적 허용 희석제, 담체, 또는 부형제를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 적절한 농도 및 단위 투약량 크기는 전술한 바와 같이 본 기술 분야에서 당업자에 의해 용이하게 결정된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Eds.: Osol, A., Ed., Mack, Easton Pa. (1980); WO 91/19008).
본 발명에 사용될 수 있는 약학적 허용 담체는, 의약 분야에 흔히 사용되는 부형제, 결합제, 윤활제, 착색제, 붕해제, 완충제, 등장화제, 보존제, 마취제, 등을 포함하지만 이것 만으로 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서 인간 이외의 동물은 이식유전자에 의한 중단 또는 내인성 유전자(들)의 변형을 갖는 임의의 동물 (넉아웃(knock-out) 동물) 및/또는 게놈 내로 인간 토신을 직접 발현하는 1 또는 그 이상의 이식유전자가 도입된 것을 포함한다.
그런 인간 이외의 동물은 설치류와 같은 척추동물, 인간 이외의 영장류, 양, 재, 소, 양서류, 파충류, 등을 포함한다. 바람직한 인간 이외의 동물은 selected 인간 이외의 동물 중 포유동물 종으로부터 선택되며, 가장 바람직하게는, 래트와 마우스를 포함하는 설치류 과(family)로부터 선택되며, 가장 바람직한 것은 마우스이다.
본 발명의 트랜스게닉 동물은 비자연적인 수단 (즉, 인간의 조작에 의해)에 의해, 동물에서 자연적으로 발생하지 않는 1 또는 그 이상의 유전자, 예컨대, 외인성 유전자, 유전자적으로 조작된 내인성 유전자, 등을 도입받은 동물이다. 비-자연적으로 도입되는 유전자, 이식 유전자로 알려진 것은, 그 구조상 그리고/또는 이식유전자에 의해 수여된 염색체 자리에서 동물에서 자연적으로 발견되지 않는 것으로서 그 동물과 동일하거나 또는 상이한 종으로부터 유래할 수 있다.
이식유전자는 외인성 DNA 서열, 즉, 숙주 동물의 게놈에서 정상적으로 발견되지 않는 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 이식유전자는, 그들이 유전자 발현의 생체내 정상 패턴을 바꾸기 위해, 또는 그 유전자에 의해 암호화되는 내인성 유전자의 생물학적 활성을 바꾸거나 또는 제거하기 위하여 시험관내에서 재배열되었거나 또는 돌연변이화되었다는 측면에서 비정상적인 내인성 DNA 서열을 포함할 수 있다 (Watson, J. D., et al., In: Recombinant DNA, 2d Ed., W. H. Freeman & Co., New York (1992), pg. 255-272; Gordon, J. W., 1989, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229; Jaenisch, R., 1989, Science. 240:1468-1474; Rossant, J., 1990, Neuron. 2:323-334).
본발명의 이식유전자성 인간 이외의 동물은 인간 이외의 동물의 생식세포주(germline) 내로 이식유전자를 도입함으로써 생성된다. 다양한 발달 단계에서 수정란의 타겟 세포가 본 발명의 이식유전자를 도입하는데 사용된다. 수정란의 타겟 세포(들)의 발달 단계에 좌우되어 상이한 방법이 사용된다. 동물의 게놈 내로 본 발명의 수행 방식으로 이식유전자를 도입하기 위해 접합자(zygote)의 마이크로 주사법이 바람직한 방법이다. 접합자, 전핵 융합 또는 연속적인 세포 분열을 행하지 않는 수정된 난자가 이식유전자성 DNA 서열의 마이크로 주사법에 대한 바람직한 타겟 세포이다. 수컷 마우스의 전핵은 그 크기가 대략 20 마이크로미터 직경에 달하며, 이식유전자성 DNA 서열을 함유하는 용액 1-2 pL의 재현성있는 주입을 하용한다는 특징이 있다. 이식유전자를 도입하기 위해 접합자를 사용하는 것은, 대부분 경우에서, 첫번째 세포 분열 이전에 주입된 이식유전자 DNA 서열이 숙주 동물의 게놈 내로 도입된다는 장점을 가진다 (Brinster, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4438-4442). 결과적으로, 제조된 트랜스게닉 동물 (창시자 동물)의 모든 세포는 특정 유전자 자리에 도입된 이식유전자를, 이식유전자성 대립유전자라고 언급되는 것으로서, 안전하게 운반한다. 이식유전자성 대립유전자는 멘델의 유전법칙을 설명해준다: 이식유전자 동물과 비-이식유전자 동물의 교차로부터 유래된 자손의 반이 이식유전자성 대립유전자를 물려받게 되며, 이는 멘델의 불규칙 유전법칙(random assortment)과 일치한다.
바이러스 삽입이 또한 본 발명의 이식유전자를 동물 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 발생하고 있는 수정란이 포배낭(blastocyst)으로 알려진 발생 스테이지로 시험관내에서 배양된다. 이 시기에, 할구가 적절한 레트로바이러스로 감염될 수 있다 (Jaenisch, R., 1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-1264). 할구의 감염은 zona pellucida의 효소 제거에 의해 증강된다 (Hogan, et al., In: Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1986)). 이식유전자는 바이러스성 벡터를 경유하여 도입되며 이는 통상적으로 복제-손상이지만 그런 바이러스 서열에 연결된 이식유전자성 DNA 서열을 포함하는 바이러스-관련 DNA 서열을, 숙주 동물의 게놈 내로 삽입하기에 충분하도록 유지된다 (Jahner, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6927-6931; van der Putten, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152). 형질감염은 이식유전자-함유 바이러스성 벡터를 발생시키는 세포의 단일 층 상에서 할구를 배양시킴으로써 용이하고 효율적으로 얻어진다 (van der Putten, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-6152; Stewart, et al., 1987, EMBO J. 6:383-388). 대안적으로, 감염은 분할강(blastocoele)과 같은 후기 스테이지에서 수행될 수 있다 (Jahner, D., et al., 1982, Nature. 298:623-628). 임의의 이벤트에서, 바이러스 삽입에 의헤 제조된 대부분의 이식유전자성 창시자 동물은 이식유전자성 대립유전자에 대한 모자이크가 될 것이다; 즉, 이식유전자성 창시자 동물을 형성하는 모든 세포의 단지 부분세트 내로 이식유전자가 도입된다. 게다가, 장래에 자손의 발생을 격리시키는 다중 이식유전자성 대립유전자를 발생시키면서, 다중 바이러스 삽입 이벤트가 단일 창시자 동물에서 발생할 수 있다. 이 방법에 의해 생식세포주 세포 내로 이식유전자의 도입이 가능하지만 아마도 낮은 빈도로 발생한다 (Jahner, D., et al., 1982, Nature. 298:623-628). 그렇지만, 일단 이식유전자가 이 방법에 의해 생식세포주 세포 내로 도입되었다면, 자손이 생성될 수 있으며, 이식유전자성 대립유전자가 동물의 모든 세포, 즉, 체세포 및 생식세포주 세포 둘 다에 존재한다.
배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포가 또한 본 발명의 이식유전자를 동물 내로 도입하기 위한 타겟 세포로서 작용할 수 있다. ES 세포는 시험관내에서 배양된 이식 이전 수정란으로부터 얻어진다 (Evans, M. J., et al., 1981, Nature. 292:154-156; Bradley, M. O., et al., 1984, Nature. 309:255-258; Gossler, et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065-9069; Robertson, E. J., et al., 1986, Nature. 322:445-448; Robertson, E. J., In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical, Approach, Ed.: Robertson, E. J., IRL Press, Oxford (1987), pg. 71-112). ES 세포는, 상업상 구입할 수 있으며 (예컨대, Genome Systems, Inc., St. Louis, Mo.으로부터), 확립된 방법에 의해 1 또는 그 이상의 이식유전자로 형질전환될 수 있다 (Lovell-Badge, R. H., In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Ed.: Robertson, E. J., IRL Press, Oxford (1987), pg. 153-182). ES 세포가 수정란을 콜로니화하고 그리고 만들어진 동물의 생식세포주에 기여한 이후, 형질전이된 ES 세포는 동물 포배낭과 조합될 수 있으며, 이는 2 또는 그 이상의 동물로부터 유도되는 세포로 구성된 키메라이다 (Jaenisch, R., 1988, Science. 240:1468-1474; Bradley, A., In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, Ed.: Robertson, E. J., IRL Press, Oxford (1987), pg. 113-151). 다시 말하면, 일단 이식유전자가 이 방법에 의해 생식세포주 세포 내로 도입되었다면, 자손이 발생할 수 있으며, 이식유전자성 대립유전자가 동물의 모든 세포, 즉, 체세포 및 생식세포주 세포 둘 다에 존재한다.
그것이 발생한다고 해도, 이식유전자의 초기 도입은 비-멘델 이벤트이다. 그렇지만, 본 발명의 이식유전자는 안정하게 생식세포주 세포 내로 삽입될 수 있으며 멘델 좌위(Mendelian loci)로써 트랜스게닉 동물의 자손에 반영된다. 다른 이식유전자 기술은 모자이크 이식유전자 동물을 초래하며, 여기서 몇몇 세포들은 이식 유전자를 운반하고 나머지 세포들은 그러하지 아니하다. 생식세포주 세포가 이식유전자를 운반하지 않는 모자이크 이식유전자 동물에서, 자손에 대한 이식유전자의 전달은 발생하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 모자이크 이식유전자 동물은 이식유전자와 관련된 표현형을 설명하는 것이 가능하다.
인간 질병에 대한 동물 모델을 제공하기 위해 이식유전자가 인간 이외의 동물 내로 도입될 수 있다. 그런 동물 모델을 만들어낼 수 있는 이식유전자는, 예컨대, 인간의 유전자적인 질병에서 대사에 대한 신생아의 오류와 관련된 돌연변이 유전자 생성물을 암호화하는 이식유전자 및 인간 병원균 (즉, 박테리아, 바이러스, 또는 다른 병원성 미생물; Leder, et al., U.S. Pat. No. 5,175,383; Kindt, et al., U.S. Pat. No. 5,183,949; Small, et al., 1986, Cell. 46:13-18; Hooper, et al., 1987, Nature. 326:292-295; Stacey, et al., 1988, Nature. 332:131-136; Windle, et al., 1990, Nature. 343:665-669; Katz, et al., 1993, Cell. 74:1089-1100)에 대한 감수성을 수여하는데 필요한 인간 팩터를 암호화하는 이식유전자를 포함한다. 유전자이식으로 도입된 돌연변이는 대립유전자를 무효화("넉-아웃") 시키도록 성장할 수 있으며, 여기서 선택가능한 및/또는 검출가능한 마커를 암호화하는 DNA 서열이 인간 이외의 동물에서 정상적으로 내인성인 유전자 서열에 대해 치환된다. 결과적으로 질병에 걸리기 십거나, 또는 여기서 이식유전자가 질병을 유발하게 되는 이식유전자성 인간 이외의 동물은, 그 질병을 유도하는 조성물을 확인하기 위해 그리고 그 질병을 유도하는 것으로 공지되었거나 또는 추측되는 강력한 병원성 조성물을 평가하기 위해 (Bems, A. J. M., U.S. Pat. No. 5,174,986), 또는 그 질병을 치료하거나 또는 그것의 증상을 경감시키는데 사용될 수 있는 조성물을 평가하기 위해 (Scott, et al., WO 94/12627) 사용될 수 있다.
본 발명의 이식유전자를 물려받은 자손은, 본 발명의 이식유전자의 서열에 대응하는 특유의 서열을 포함하거나 또는 암호화하는 생물분자의 존재에 대하여 물려받은 이식유전자를 갖지 않는 리터 메이트(litter mates)로부터 그 자손으로부터 유전자 물질을 분석함으로써 구분된다. 예컨대, 본 발명의 이식유전자의 선택가능한 마커에 의해 단독으로 암호화된 폴리펩티드를 함유하는 생물 유체는 그 폴리펩티드의 존재에 대해 면역분석될 수 있다. 이식유전자 자손을 확인하는 더 간단하고 믿을 수 있는 수단은, 동물의 말단, 예컨대, 꼬리로부터 조직시료를 얻는 것, 그리고 그들의 선택가능한 마커와 같이 본 발명의 이식 유전자의 단독 일부 또는 일부의 DNA 서열에 대응하는 핵산 서열의 존재에 대해 시료를 분석하는 것을 포함한다. 그런 핵산 서열의 존재는, 예컨대, 이식유전자의 단독 부분에 대응하는 DNA 서열을 이용한 서던 블랏 분석, 기질로써 시료 중에 DNA 서열을 사용하는 PCR 반응의 생성물의 분석 및 이식유전자의 DNA 서열로부터 유도된 올리고뉴클레오티드, 등에 의해 측정될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 HSV-1 앰플리콘 및 하나 이상의 전술한 토신 핵산 분자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
몇 가지 특징은 HSV-1을 벡터 개발을 위한 이상적인 후보로 만든다: (i) HSV-1은 본질적으로 범(汎)친화성이며, 뉴런 및 간세포와 같은 분열 및 비분열 세포 둘 다를 감염시킬 수 있으며; (ii) HSV-1 게놈은 적어도 약간의 전사 활성을 보유한 상태로 장기간 동안 뉴런에서 잔존할 수 있으며; (iii) HSV-1 게놈은 75개 이상의 유전자를 암호화하는데, 그 중 38개 유전자는 세포 배양시에 바이러스 복제를 위해 없어도 되는(비필수) 유전자이다(Ward, P. L. and Roizinan, B., 1994, Trends Genet. 10:267-274). 이는 게놈의 상당 부분을 소정의 하나 이상의 치료 유전자를 비롯한 외래 DNA로 치환할 수 있는 기회를 제공한다.
재조합 HSV-1 벡터를 작제하기 위한 기법은 십년 이상 전에 개발되었다(Mocarski, E. S., et al., 1980, Cell. 22:243-255; Post, L. E. and Reizman, B., 1981, Cell. 25:2227-2232; Roizman, B. and F. J. Jenkins, 1985, Science. 229:1208-1214). 원형 HSV-1/HSV-2 재조합 백신을 생성하는 것을 목표로 하여, HSV-1 게놈을 특정 도메인에서 결실시켜 신경독성에 관여하는 몇몇 좌, 예컨대 바이러스 티미딘 키나제 유전자를 제거하고, 단순 허피스 2형(HSV-2) 당단백질 D, G 및 I를 암호화하는 DNA 단편의 삽입을 위한 공간을 생성하였다(Meignier, B., et al., 1988, J. Inf. Dis. 158:602-614). 현재, 재조합 허피스 바이러스 벡터는 신경퇴행성 질환 및 뇌 종양의 유전자 치료를 위한 수 많은 프로토콜에서 중요하게 평가되고 있다(Breakefield, X. O., et al, In: Cancer Gene Therapeutics, (1995), pp. 41-56; Glorioso, J. C., et al., "Herpes simplex virus as a gene-delivery vector for the central nervous system," In: Viral vectors: Gene therapy and neuroscience applications, Eds.: Kaplitt, M. G. and Loewy, A. D., Academic Press, NY (1995), pp. 1-23).
HSV-1 벡터의 제2형, 이른바 HSV-1 "앰플리콘" 벡터의 개발은 자연 발생 결함 HSV-1 게놈의 특성 분석에 기초한 것이었다(Frenkel, N., et al., 1976, J. Virol. 20:527-531). 앰플리콘은 3 가지 유형의 유전 요소를 보유한다: (i) DNA 복제의 이. 콜라이 기점 및 항생제 내성 유전자를 포함하여 박테리아 내에서의 플라스미드 DNA의 증폭을 위한 원핵 서열; (ii) 복제 및 헬퍼 바이러스 기능 존재 하에 포유동물 세포에서 HSV-1 입자로의 패키징을 지지하기 위한 ori 및 pac 시그널을 포함하여 HSV-1 유래의 서열; 및 (iii) 소정의(Ho, D. Y., 1994, Meth. Cell. Biol. 43:191-210) 결함 바이러스의 하나 이상의 유전자를 갖는 전사 단위 및 앰플리콘 시스템의 개발(Viral vectors: Gene therapy and neuroscience applications, Eds.: Kaplitt, M. G., and Loewy, A. D., Academic Press, NY (1995), pp. 25-42).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 토신 핵산 분자를 뉴런으로 전달하기 위해 전술한 앰플리콘 벡터를 사용하는 용도에 관한 것이다. HSV-1은 이를 CNS로의 유전자 전달 벡터로서 사용하는 것을 촉진하는 몇 가지 생물학적 특성을 보유한다. 그 특성은 다음을 포함한다: (i) 큰 형질전환 유전자 용량(이론적으로는 150 kb까지), (ii) 생체내 CNS에 대한 향성, (iii) 분열 세포뿐 아니라 비분열 세포에서의 핵 위치화, (iv) 조직 배양에서의 넓은 숙주 세포 범위, (v) 일련의 신경 약화 및 복제 비적격성 돌연변이의 유용성 및 (vi) 비교적 높은 바이러스 역가를 생성할 수 있는 가능성.
CNS에 대한 HSV-1 유래 벡터 시스템의 또 다른 중요한 특성은 이러한 비리온이 축색돌기를 따라 역 수송될 수 있는 능력이다. 세포 막과 융합된 후 바이러스 캡시드 및 관련 외피 단백질은 세포질로 방출된다. 이러한 캡시드는 미소관을 따라 세포 핵으로의 에너지 의존적 역 수송을 매개하는 다이네인 복합체와 결합한다(Topp, K. S., et al, 1994, J. Neurosci. 14:318-325). lacZ 유전자를 발현하는 복제 비적격 재조합 및 앰플리콘 HSV-1 벡터는 주사 후 벡터의 위치화 및 확산을 결정하는 데 사용되었다. 미상핵, 치아 이랑 및 소뇌 피질을 포함하는 다수의 부위로의 1회 주사 후에, 베타-갈락토시다제 양성 세포의 분포를 측정하였다(Chiocca, E. A., et al., 1990, N. Biol. 2:739-746; Fink, D. J., et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Huang, Q., et al., 1992, Exp. Neurol. 115:303-316; Wood, M., et al., 1994, Exp. Neurol. 130:127-140). 뉴런 및 신경교는 주사 부위에서 형질도입되었고, 활성은 주요 주사 부위에 있는 세포와 구심성 연결을 하는 멀리 떨어진 2차적인 뇌 영역의 뉴런에서도 검출되었다. 2차적인 부위로의 역 수송은 신경해부학적 경로에 선택적이며, 이는 바이러스 캡시드의 트랜스-시냅스 이동을 제시하는 것이다. 앰플리콘 벡터의 역 수송은 흑색질 치밀부와 청반 둘 다에 선조체 주사 후에 입증된 바 있다(Jin, B. K., et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7:2015-2024). HSV-1이 구심성 경로에서 뉴런으로 역 수송에 의해 이동하는 능력은 이들 벡터에 의한 유전자의 전달이 원래의 주사 부위를 넘어서 신경해부학적으로 중요한 다른 영역으로 확산될 수 있음을 제시한다.
뉴런으로의 앰플리콘 매개 유전자 전달의 최초 보고서는 배양시 1차 세포를 사용하였다(Geller, A. I. and Breakefield, X. O. 1988, Science 241:1667-1669). 앰플리콘 벡터는, 신경 생리학, 예를 들어 신경 세포의 형태 및 성장에 대한 GAP43의 발현 또는 저친화성 신경 성장 인자(NGF) 수용체의 영향을 연구하기 위해 사용되었다(Neve, R. L., et al., 1991, Mol. Neurobiol. 5:131-141; Battleman, D., et al., 1993, J. Neurosci. 13:941-951). 앰플리콘은 해마 절편 배양에서 빠르고 안정한 형질전환 유전자 발현을 유도할 수 있고(Bahr, B., et al., 1994, Mol. Brain Res. 26:277-285), 이는 카이네이트 수용체 매개 독성(Bergold, P. J., et al., 1993, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:6165-6169) 및 뉴런의 글루코스 수송체 매개 보호(Ho, D. Y., et al., 1995, J. Neurochem. 65:842-850) 둘 다를 모델링하는 데 사용되었다. 생체내에서, 앰플리콘은 상이한 CNS 질환 모델에서 다수의 후보 치료 유전자를 전달하는 데 사용되었다. 예를 들어, 글루코스 수송체의 발현은 발작 유도 모델에서 뉴런을 보호하고(Ho, D. Y., et al., 1995, J. Neurochem. 65:842-850; Lawrence, M. S., et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7247-7251; Lawrence, M. S., et al., 1996, Blood Flow Metab. 16:181-185), bcl-2는 국소 빈혈로부터 뉴런을 구제하며(Linnik, M. D., et al., 1995, Stroke 26:1670-1674), TH의 발현은 파킨슨병 래트에서 행동 변화를 매개한다(During, M. J., et al., 1994, Science 266:1399-1403). 따라서, 앰플리콘은 CNS에서 다수의 형질전환 유전자의 기능적 발현에 효과적인 것으로 입증되었다. 최근 앰플리콘은 마우스 체세포 모자이크를 생성하는 데 사용되었으며, 이때 숙주 유전자의 발현은 공간적 및 발생적으로 조절된 방식으로 활성화된다. 형질전환 마우스는 loxP 부위에 측접한 프로모터와 전사체 사이의 불활성화 삽입 엘리먼트를 포함하는 생식선 전달 NGF 유전자를 사용하여 조작하였다. 앰플리콘 벡터에 의한 cre 리콤비나제의 체세포 전달은 이러한 동물들에서 NGF의 발현을 성공적으로 활성화하였다(Brooks, A. I., et al., 1997, Nat. Biotech. 15:57-62). 발달 단계의 다양한 시점에서 특이적 세포에서 유전자를 발현시키는 능력은, 특히 생식선 결실("넉아웃")이 조건적 치사 돌연변이가 되는 유전자에 대해 광범위하게 사용될 것이다.
전통적으로, 형질도입 후 형질전환 유전자 발현의 안정성 및 헬퍼 바이러스의 세포 변성 효과는 CNS의 세포로의 앰플리콘 매개 유전자 전달의 제한적 특징이었다. 최근의 진보는 이러한 제약을 상당히 해결하였다. 몇 가지 프로모터 인자, 예컨대 프리프로엔케팔린 및 티로신 히드록실라제는 상류 조절 서열이 포함될 경우 앰플리콘 벡터로부터의 장기간 형질전환 유전자의 발현을 유도할 수 있다(Kaplitt, M. G., et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8979-8983; Jin, B. K., et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7:2015-2024). 부위 유도 방식으로 잠재적으로 통합될 수 있거나(Johnston, K. M., et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8:359-370), 안정한 복제 에피좀을 형성하는(Wang, S. and Vos, J., 1996, J. Virol. 70:8422-8430) 비-HSV 유전 인자를 함유하는 하이브리드 앰플리콘의 개발은 도입된 형질전환 유전자를 매우 안정한 구조로 유지하여야 한다. 마지막으로, 오염 헬퍼 바이러스(Fraefel, C., et al., 1996, J. Virol. 70:7190-7197)가 없는 패키징 시스템의 개발은 배양시 및 생체내에서 앰플리콘 벡터의 세포 변성 효과를 크게 감소시켰다. 조작이 용이한 플라스미드 기초 앰플리콘 및 헬퍼 바이러스가 없는 패키징 시스템은 HSV-1의 생물학적 이점을 보유하나 바이러스 기초 유전자 치료와 관련된 위험성을 감소시킨 실질적인 합성 벡터의 작제를 가능하게 한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 간세포로 토신 핵산 분자를 전달하기 위해 전술한 앰플리콘 벡터를 사용하는 용도에 관한 것이다. 상기 섹션에서 기술한 바와 같이, HSV-I 앰플리콘 벡터는 신경계 세포로의 유전자 전달에 대하여 광범위하게 평가되었다. 그러나, 앰플리콘 벡터는 또한 간 등의 다른 조직으로의 유전자 전달을 위한 효율적인 수단이 될 수 있다. 특정 유전성 간 질환은 효소/단백질 치환 또는 간 이식에 의해 치료될 수 있다. 그러나, 단백질 주입은 결함을 일시적으로 복구할 뿐이며, 다수의 세포내 단백질에 대해서는 효과적이지 않다. 간 이식은 공여자 장기 입수 가능성 및 환자의 일생 동안 면역억제가 필요하다는 제약이 있다. 따라서, 간으로의 유전자 전달에 대한 요구가 매우 크고, 따라서 아데노바이러스 벡터(Stratford-Perricaudet, L. D., et al., 1990, Hum. Gene Ther. 1:241-256; Jaffe, A. H., et al., 1992, Nat. Genet. 1:372-378; Li, Q., et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4:403-409; Herz, J. and Gerard, R. D., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816), 레트로바이러스 벡터(Hafenrichter, D. G., et al., 1994, Blood 84:3394-3404), 배큘로바이러스 벡터(Boyce, F. M. and Bucher, N. R. L., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:2348-2352; Sandig, V., et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7:1937-1945) 및 HSV-1계 벡터(Miyanohara, A., et al., 1992, New Biologist 4:238-246; Lu, B., et al., 1995, Hepatology 21:752-759; Fong, Y., et al., 1995, Hepatology 22:723-729; Tung, C., et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7:2217-2224)를 비롯하여 다양한 바이러스 벡터 시스템이 세포 배양 및 실험 동물에서 간세포로의 유전자 이식에 대해 평가되었다. 재조합 HSV-1 벡터는 감염된 마우스 간에서 B형 간염 바이러스 표면 항원(HBsAG), 이. 콜라이 베타-갈락토시다제 및 개 인자 IX-CFM을 발현시키는 데 사용된 바 있다(Miyanohara, A., et al., 1992, New Biologist 4:238-246). 바이러스 저장액을 간 실질로 직접 주사하거나 또는 문맥을 통해 적용하였다. 어느 경로에 의해서든지 유전자 전달이 매우 효율적이었으며, 그 결과 순환계에 높은 수준의 HB SAG 또는 CFIX가 형성되었으며, 다수의 베타-갈락토시다제 양성 간세포가 생성되었다. 검출 가능한 유전자 발현은 일시적이었으나 상당수의 벡터 게놈은 유전자 전달 후 2개월까지 지속되는 것으로 입증되었다. 장기간 유전자 발현의 효율은 형질전환 유전자의 발현을 유도하기 위하여 HCMV IE1 프로모터를 HSV-1 LAT 프로모터로 대체함으로써 다소 증기시킬 수 있었다.
본 발명의 범위에서 "단백질 응집"이란 폴리펩티드 중 어느 하나가 탈용매화 상태로 존재하도록 적어도 두 폴리펩티드가 서로 접촉하는 현상을 포함한다. 이는 또한 폴리펩티드의 고유의 기능적 활성의 손실을 포함할 수 있다.
본 발명의 범위에서 "탈용매화"란 폴리펩티드가 용액 중에 존재하는 것이 아닌 상태이다.
본 발명의 범위에서 "치료"란 감소, 억제, 완화 또는 예방을 포함한다. 바람직하게는, 단백질 응집, 단백질 응집으로 인한 세포 기능 장애 및 단백질 응집 관련 질환이 치료될 수 있다.
본 발명의 범위에서 "단백질 응집 관련 질환"이란 임의의 질환, 장애 및/또는 고통을 포함하며, 단백질 응집 관련 질환은 신경퇴행성 장애를 포함한다.
"신경퇴행성 장애"는 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 헌팅턴병, 전두측두엽 치매 및 운동 신경 질환이다. 이러한 질환들은 모두 두드러진 공통적인 특징, 즉 비정상적 단백질의 응집 및 침착을 공유한다(표 1). 형질전환 동물 모델에서의 돌연변이 단백질의 발현은 이러한 질환의 특징을 반복한다(A. Aguzzi and A. J. Raeber, Brain Pathol. 8, 695 (1998)). 뉴런은 돌연변이 또는 폴딩이 잘못된 단백질의 독성 효과에 특히 취약하다. 이러한 신경퇴행성 장애의 공통적인 특징은, 원치 않는 잠재적 유해 단백질을 제거하기 위한 정상 세포 메카니즘의 이해에 기초하여 병렬적인 치료적 접근을 제시한다. 아래에서는 그러한 질환, 이들의 세포 기능부전 및 지금까지 알려진 응집되는 개개의 단백질의 구체적인 예에 대한 상세한 설명이 제시된다.
정확한 폴딩은 단백질이 가능하지만 부정확한 배좌의 배열로부터 하나의 특정한 구조를 취하도록 요구한다. 폴리펩티드가 이들의 적절한 구조를 채택하지 못하는 것은 세포 기능 및 생존성을 위협하는 주된 요인이다. 그 결과, 폴딩이 잘못된 단백질의 유해 효과로부터 세포를 보호가기 위해 퇴고 시스템이 진화되어 왔다. 폴딩이 잘못된 단백질에 대한 최전선 방어는 분자 샤페론으로서, 이것은 합성 초기 폴리펩티드가 리보솜으로부터 빠져 나옴에 따라 이들과 회합하여 정확한 폴딩을 촉진하고 유해 상호작용을 방지한다(J. P. Taylor, et al., Science 296, 1991 (2002)).
단백질 응집에 의해 유발된 신경퇴행성 장애의 특징
질환 단백질 침착 독성 단백질 질환 유전자 위험 인자
알츠하이머병 세포외 플라크세포내 엉킴 αβtau APP프레세닐린 1프레세닐린 2 apoE4대립유전자
파킨슨병 루이(Lewy) 바디 알파-시뉴클레인 알파-시뉴클레인파킨 UCHL1 tau 연관
프리온병 프리온 플라크 PrPsc PRNP 프리온 코돈 129에서의동질접합성
폴리글루타민질환 핵 및 세포질봉입체 폴리글루타민함유 단백질 CAG 반복 서열 확장을 갖는 9 가지의상이한 유전자
타우병 세포질 tau tau tau 연관
가족성 근위축성 측삭 경화증 엉킨 부니나(Bunina) 바디 SOD1 SOD1
알츠하이머병은 가장 흔한 신경퇴행성 질환으로서, 미국인 약 2백만이 이 질환의 환자이다. 이 질환은 두 가지의 병변이 존재하는 것이 특징이다: 주로 β-아밀로이드(A) 펩티드로 이루어진 세포외 병변인 플라크, 및 주로 세포골격 단백질 tau로 이루어진 세포내 병변인 엉킴. 이 질환은 주로 노년기에 발생하지만, 알츠하이머병이 중년의 상염색체 우성 질환으로서 유전되는 가족이 있다. 3 가지 유전자가 이러한 형태의 질환에 관여한다: A 펩티드를 암호화하는 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전자(A. M. Goate, et al., Nature 349, 704 (1991)); 및 경막 단백질을 암호화하는 프레세닐린 단백질 유전자(PS1 및 PS2)(R. Sherrington, et al., Nature 375, 754 (1995); E. Levy-Lahad, et al., Science 269, 973 (1995)).
APP의 대사는 다양한 A 종을 생성하는데, 주로 40-아미노산 펩티드 A1-40을 생성하며, 소량의 42-아미노산 펩티드 A1-42를 생성한다. 후자 형태의 펩티드는 아밀로이드 침착물을 형성하는 경향이 더 크다. 3 가지의 모든 병원성 유전자 내 돌연변이는 APP의 프로세싱을 변화시켜 더 많은 A의 아밀로이드 생성성 종이 생성되게 한다(D. Scheuner, et al., Nature Med. 2, 864 (1996)). 프레세닐린의 정확한 기능은 아직 논쟁의 대상이 되고 있지만, 유전자 제거 실험에 의하면 프레세닐린은 A의 COOH-말단 절단에 깊이 관여하고 있고(B. De Strooper, et al., Nature 391, 387 (1998)), APP 프로세싱에 대한 프레세닐린 돌연변이의 영향에 대한 단순한 해석은, 이들이 APP를 프로세싱하는 복합체의 기능의 불완전한 손실을 초래한다는 것이다(L. M. Refolo, et al., J. Neurochem. 73, 2383 (1999); M. S. Wolfe et al., Nature 398, 513 (1999)).
이러한 발견의 의미는, A 침착의 과정이 알츠하이머 발병의 개시에 깊이 연관되어 있고, 질환의 다른 모든 특징들, 즉 엉킴과 세포 및 시냅스 손실은 이러한 개시에 부차적이라는 것이며; 이것이 알츠하이머병에 대한 아밀로이드 캐스캐이드 가설이다(J. A. Hardy and G. A. Higgins, Science 286, 184 (1992)). 이 가설이 정확하다면, A 침착을 촉진하는 다른 유전적 또는 환경적 요인이 이 질환에 대한 소인이 될 수 있으며, 이러한 침착을 방지하는 치료법을 찾는 것이 합리적인 치료 방법이 될 것이다. 전형적인 후발성 알츠하이머병에 대한 위험을 증가시키는 것으로 확인된 유일한 유전자는 아포지단백질 E4 대립유전자이며(E. H. Corder, et al., Science 261, 921 (1993)), 아포지단백질 E 유전자 넉아웃은 A 침착을 방지하는 것으로 확인되었고(K. R. Bales, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 15233 (1999)), 이는 아밀로이드 캐스캐이드 가설과 일치하는 것이다. 알츠하이머병의 원인이 되는 다른 유전자는 탐색중에 있으며, 이 유전자들 역시 A 대사의 변화에 의해 작용할 가능성이 큰 것으로 보인다(A. Myers, et al., Science 290, 2304 (2000); N. Ertekin-Taner, et al., Science 290, 303 (2000)).
이러한 발견은 A 대사가 치료 대상이 되는 주요 경로임을 제시하며, 플라크 병변을 발달시키는 형질전환 마우스를 사용하여 이러한 분야에서 커다란 진전이 있었다(D. Schenk, et al., Nature 400, 173 (1999)). A를 사용하여 이러한 형질전환 마우스를 면역화한 결과 병변이 감소되었고 거동 테스트에서 수행력이 우수하였으며, 이는 A 유도 치료법이 임상적으로 적합할 수 있다는 증거를 제시한다(D. Morgan, et al., Nature 408, 982 (2000)). 면역화가 실용적인 치료 방법이 아닌 것으로 판명될 수도 있으나, 이러한 동물 연구의 결과는 중요한 원리의 증거가 되었다. 그러나, 이러한 연구에 사용된 APP 형질전환 마우스는 엉킴 또는 세포 손실을 나타내지 않는다는 것에 주목해야 하며, 이러한 전략을 더 새롭고 더 완전한 질환 모델에서 재시험하는 것이 중요할 것이다(J. Lewis, et al., Science 293, 1487 (2001)).
파킨슨병은 미국 인구의 약 50만이 걸린 질환으로서, 종래에는 비유전성 질환으로 간주되었다. 그러나, 최근 데이터에 의하면 유전적 요인이 그 병인에 관여한다는 증거가 증가하고 있다. 두 가지 유전자가 파킨슨병에 관련되어 있음은 분명하다: α-시뉴클레인(PARK1) (M. H. Polymeropoulos, et al., Science 276, 2045 (1997)) 및 파킨(PARK2) (T. Kitada, et al., Nature 392, 605 (1998)). 제3의 유비퀴틴 COOH-말단 히드롤라제(PARK5) (E. Leroy, et al., Nature 395, 451 (1998); D. M. Maraganore, et al., Neurology 53, 1858 (1999))가 관여한다는 증거도 있으며, 적어도 5개의 다른 연관 좌(PARK 3, 4, 6, 7, 및 8)가 존재하고, 이는 이 질환에 기여하는 유전자가 더 존재함을 암시한다(M. Farrer, et al., Hum. Mol. Genet. 8, 81 (1999); . T. Gasser, et al., Nature Genet. 18, 262 (1998); E. M. Valente, et al., Am. J. Hum. Genet. 68, 895 (2001); C. M. Van Duijn, et al., Am. J. Hum. Genet. 69, 629 (2001); A. Hicks et al., Am. J. Hum. Genet. 69 (suppl.), 200 (2001); M. Funayama, et al., Ann. Neurol. 51, 296 (2002)). 파킨슨병의 병리학적 특징은 α-시뉴클레인으로 이루어진 세포질 봉입체인 루이 바디의 도파민성 뉴런 내의 침착이다. 알츠하이머병에 대한 연구가 제시됨에 따라, 다수의 유전자가 단일 질환에 영향을 줄 경우, 그러한 유전자들은 병원성 생화학적 경로를 정의할 수 있다. 이러한 경로가 파킨슨병에 존재할 수 있다는 것은 아직 분명하지 않다. 그것이 단백질 분해에 관여하는 경로가 될 수 있다는 개념(E. Leroy, et al., Nature 395, 451 (1998))은 파킨(parkin)이 유비퀴틴-단백질 리가제이고(H. Shimura, et al., Nature Genet. 25, 302 (2001)), 파킨과 α-시뉴클레인이 상호작용할 수 있다(H. Shimura, et al., Science 293, 263 (2001))는 관찰을 가지고 근거를 마련하였다. 적어도 한 환자에서는, 파킨의 돌연변이가 산발성 파킨슨병에서 관찰되는 것과 같은 루이 바디 형성을 유도하였다(M. Farrer, et al., Ann. Neurol. 50, 293 (2001)). 파킨과 α-시뉴클레인의 상호작용은 신필린-1에 의해 매개될 수 있다(K. K. Chung, et al., Nature Med. 7, 1144 (2001)). 파킨에 대한 병리학적으로 관련이 있는 다른 기질은 파엘(Pael)의 비폴된 형태이며, 이것은 파킨 돌연변이 환자의 뇌에 축적되는 것으로 확인된다(Y. Imai, et al., Cell 105, 891 (2001)). 단백질 분해가 파킨슨병의 주요 발병 경로라면, 추가의 파킨슨병 좌가 이와 같은 경로에서 다른 단백질을 코딩할 수 있음을 예측할 수 있다. 도파민성 뉴런은 다른 뉴런보다 질환 과정에 더 민감한데, 그 이유는 이들 뉴런은 도파민 대사에 의해 유도되는 산화성 스트레스를 통해 더 많은 단백질 손상을 지속하기 때문이다. 그러나 현재 파킨슨병의 분자적 기초에 관한 연구는 다른 신경퇴행성 질환에 대한 연구에 비해 덜 진전되었고, 추가 유전자가 발견됨에 따라 다른 발병 메카니즘이 확인될 수 있다.
가장 흔한 인간 프리온병은 산발성 크로이츠펠트-야콥병(CJD)이다. 가족성 CJD, 게르스트만-슈트라우슬러-샤인커병 및 치사성 가족성 불면증을 비롯한 유전적 형태는 빈도가 더 낮다(S. B. Prusiner, N. Engl. J. Med. 344, 1516 (2001)). 프리온병은 그 전파성에 의해 다른 신경퇴행성 질환과 구별된다. 상기한 질환들은 공통적인 분자적 병인을 공유하지만, 프리온병은 그 임상적 증후, 예를 들어 치매, 정신적 교란, 운동 장애, 운동 실조증 및 불면증에 있어서 큰 차이를 보인다. 프리온병의 병인은 다양한 정도의 해면질 형태 액포 형성, 신경교증 및 뉴런 손실을 나타낸다. 프리온병의 한 가지 일관적인 병리학적 특징은, 염색체 20번의 짧은 팔 상의 단일 유전자에 의해 코딩되는 프리온 단백질(PrP)에 대해 면역양성인 아밀로이드 물질의 축적이다.
현재 수 많은 증거가 프리온이 PrP의 비정상적 동형체로 이루어져 있다는 논쟁을 지지한다(J. Collinge, Annu. Rev. Neurosci. 24, 519 (2001)). 구조 분석 결과는 정상적인 세포형 PrP(PrPC라 칭함)가 β-플리티드 시트 함량은 거의 없고 α-나선형이 풍부한 가용성 단백질임을 나타낸다. 이와는 대조적으로, 감염된 개체의 뇌로부터 추출된 PrP(PrPSc라 칭함)는 고도로 응집되어 있으며, 세제에 불용성이다. PrPSc는 나선형이 덜 풍부하며, β-플리티드 시트 함량이 더 많다. PrPC 및 PrPSc에 대한 폴리펩티드 사슬은 아미노산 조성이 동일하며, 다만 그 3차원적 배좌에 있어서만 다르다.
PrP가 천연 상태(PrPC) 및 일련의 추가 배좌 사이를 변동하며, 그 중 하나 또는 한 세트는 자체 회합하여 폴딩이 잘못된 PrP 단량체로 이루어진 안정한 초분자적 구조를 생성할 수 있다는 것이 제시되었다(J. Collinge, Annu. Rev. Neurosci. 24, 519 (2001)). 따라서, PrPSc는 PrPC의 PrPSc로의 전환을 촉진하는 주형으로서 작용할 수 있다. 병원성 자가 증폭 전환 반응의 개시는 프리온 접종 후에 β-시트 풍부 PrP의 "시드"에 노출시켜 유도할 수 있으며, 따라서 전파성의 원인이 될 수 있다. 전환 반응은 또한 "단백질 X"로 명명되는 추가적인 종 특이적 인자에 의존할 수 있다(K. Kaneko, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 10069 (1997)). 또는, PrPSc의 응집 및 침착은 산발적 사례를 초래하는 확률론적으로 드문 배좌 변화의 결과일 수 있다. 유전성 프리온병은 PrPC를 PrPSc 구조로 기울어지게 하는 병원성 돌연변이의 결과일 가능성이 있다.
헌팅턴병, 케네디병, 시상핵-적핵-창백핵-시상밑핵 위축 및 척수소뇌증의 6 가지 형태를 비롯하여 적어도 9 가지의 유전성 신경학적 질환은 트리뉴클레오티드(CAG) 반복 서열의 확장에 의해 유발된다(H. Y. Zoghbi and H. T. Orr, Annu. Rev. Neurosci. 23, 217 (2000); K. Nakamura, et al., Hum. Mol. Genet. 10, 1441 (2001)). 이러한 질환은 전형적으로 치사성인 신경계의 점진적인 퇴행과 관련된 모든 성인 발병성 질환이다. 이러한 질환의 원인이 되는 유전자는 기능적으로 무관한 것으로 보인다. 공지된 유일한 공통적 특징은 각 유전자의 코딩 영역 내의 CAG 트리뉴클레오티드 반복 서열이며, 이로 인하여 질환 단백질 내에 폴리글루타민 트랙이 생성된다. 정상적인 집단에서는, 폴리글루타민 트랙의 길이가 다형성이며, 일반적으로 약 10∼36개의 연속적인 글루타민 잔기이다. 그러나 이와 같은 각 질환에서는, 정상 범위를 벗어난 폴리글루타민 트랙의 확장이 성인 발병성의 진행 속도가 느린 신경퇴행을 초래한다. 더 긴 확장은 조발성의 보다 심각한 질환과 상관성이 있다.
이러한 질환들은 확장된 폴리글루타민 트랙과 관련된 독성으로부터 발생되는 공통적인 분자적 병인을 공유한다. 현재 지식에 의하면, 확장된 폴리글루타민은 질환 단백질이 뉴런에 대해 독성인 기능을 우세하게 획득하도록 하는 것이 분명하다. 각 폴리글루타민 질환은 상이한 패턴의 신경퇴행을 특징으로 하며, 따라서 상이한 임상적 증후를 특징으로 한다. 이러한 질환에 있어서 상이한 뉴런 집단의 선택적 취약성은 충분히 이해되고 있지 않지만, 각 질환 유전자의 발현 패턴 및 질환 유전자 생성물의 정상적 기능 및 상호작용과 관련이 있는 것으로 생각된다. 개별적 질환 유전자의 부분적 기능 손실은 질환을 유발하는 데에는 충분하지 않지만 뉴런 취약성에 기여할 수 있다(I. Dragatsis, M. S. Levine, S. Zeitlin, Nature Genet. 26, 300 (2000); C. Zuccato et al. Science 293, 493 (2001)).
수 년전, 확장된 폴리글루타민은 폴리글루타민 질환의 동물 모델 및 이러한 질환이 있는 환자의 중추 신경계에서 뉴런의 핵내 봉입체를 형성하는 것으로 파악되었다(C. A. Ross, Neuron 19, 1147 (1997)). 이러한 봉입체는 다른 단백질과 결합된 불용성의 응집된 폴리글루타민 함유 단편의 축적물로 구성된다. 긴 폴리글루타민 트랙을 갖는 단백질은 폴딩이 잘못되고 "극성 지퍼"로 불리는 역평행 가닥으로 응집된다는 것이 제시되었다(M. F. Perutz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 5355 (1994)). 실험 시스템에서 응집을 위한 문턱값 폴리글루타민 길이와 인간 질환을 야기하는 CAG 반복 서열 길이 간의 상관성은 확장된 폴리글루타민의 자가 회합 또는 응집이 기능의 독성 획득의 토대가 된다는 주장을 지지한다. 몇몇 실험 시스템에서는 확장된 폴리글루타민의 독성이 가시적인 봉입체의 형성으로부터 분리되었지만, 불용성의 분자적 응입체의 형성은 독성의 일관적인 특징인 것으로 보인다(S. Sisodia, Cell 95, 1 (1998); I. A. Klement, et al., Cell 95, 41 (1998); F. Saudou, S. Finkbeiner, D. Devys, M. E. Greenberg, Cell 95, 55 (1998); P. J. Muchowski, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 727 (2002)). 폴리글루타민 질환에서 응집과 독성 간에 관찰된 상관성은 비정상적 단백질의 침착을 특징으로 하는 다른 신경퇴행성 질환과의 연계를 시사한다.
Tau는 오랫동안 인간의 신경퇴행성 질환에서 원인이 되는 역할을 하는 것으로 추측되었으며, 이러한 관점은 필라멘트성 tau 봉입체가 픽(Pick)병, 피질 기저핵 변성증(CBD), 진행성 핵상 마비(PSP) 및 근위축성 측삭 경화증-파킨슨병 치매 복합을 비롯하여 광범위한 산발성 장애의 주된 신경병리학적 특징이라는 관찰에 의해 지지되었다. 이러한 질환군은 총체적으로 "tau 병증"(tauopathies)이라 칭한다(V. M-Y. Lee, M. Goedert, J. Q. Trojanowski, Annu. Rev. Neurosci. 24, 1121 (2001)). 필라멘트성 tau 침착은 알츠하이머병 및 프리온병이 있는 환자의 뇌에서서도 흔히 관찰된다. tau 단백질은 저분자량의 미소관 회합 단백질이며, 이 단백질은 중추 신경계와 말초 신경계의 축색돌기에 풍부하다. 17번 염색체 상의 단일 유전자에 의해 암호화되는 다중 tau 동형체는 선택적 스플라이상에 의해 생성된다. tau를 암호화하는 유전자 내의 다중 돌연변이가 전두측두엽 치매 및 파킨슨병(FTDP-17)과 관련이 있다는 것은 tau의 비정상적 형태가 신경퇴행성 질환에 기여할 수 있다는 강력한 증거를 제시하였다(L. A. Reed, Z. K. Wszolek, M. Hutton, Neurobiol. Aging 22, 89 (2001)). 뿐만 아니라, tau 유전자와 관련된 다형성은 산발성 CBD, PSP 및 파킨슨병의 위험 인자인 것으로 생각된다(E. R. Martin, et al., J. Am. Med. Assoc. 286, 2245 (2001); N. Cole and T. Siddique, Semin. Neurol. 19, 407 (1999)). 최근에 입증된 증거는, 신경퇴행성 질환과 관련된 tau 비정상성이 tau 스플라이싱을 손상시키고, 미소섬유 형성을 촉진하며, 대체로 tau 응집체의 침착을 촉진한다는 것을 시사한다.
근위축성 측삭 경화증(ALS)은 상부 운동 신경 및 하부 운동 신경의 진행성 신경퇴행성 질환이다. ALS 사례의 약 10%는 유전된다. 나머지는 산발성 사례인 것으로 생각된다(N. Cole and T. Siddique, Semin. Neurol. 19, 407 (1999)). 유전되는 사례 중에서 약 20%는 수퍼옥시드 디스뮤타제 1(SOD1)을 암호화하는 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기된다. 70 가지 이상의 상이한 병원성 SOD1 돌연변이가 소개되었다. 열성이 될 수도 우성이 될 수도 있는, 90번 위치에서 알라닌의 발린으로의 치환을 제외하면 이들 모두는 우성이다. 신경병리학적으로 ALS는 운동 뉴런의 변성 및 손실과 신경교증을 특징으로 한다. 세포내 봉입체는 퇴행하는 뉴런 및 신경교에서 관찰된다(L. P. Rowland and N. A. Shneider, N. Engl. J. Med. 344, 1688 (2001)). 가족성 ALS는 신경병리학적으로, 루이 바디 유사 히알린 봉입체 및 주로 돌연변이 SOD1으로 이루어진 성상세포 히알린 봉입체를 특징으로 한다.
SOD1은 독성 수퍼옥시드 라디칼을 과산화수소 및 산소로 전환시키는 것을 촉매하는 구리 의존성 효소이다. SOD1의 항산화 기능에 손상을 주는 돌연변이는 수퍼옥시드 라디칼의 독성 축적을 초래할 수 있다. 그러나 가족성 ALS에 대한 기능 손실 메카니즘은, 운동 뉴런 퇴행이 SOD1 발현이 제거된 형질전환 마우스에서 관찰된다는 점에서 가능성이 없어 보인다. 게다가, 형질전환 마우스에서의 돌연변이 SOD1의 과발현은 증가된 SOD1 활성에도 불구하고 운동 뉴런 질환을 유발한다. 이는 돌연변이 단백질에 의한 기능의 유해성 획득에 대한 역할을 지지하며, 상염색체 우성 유전과 일치한다. 운동 뉴런 퇴행에 기여하는 돌연변이 SOD1에 대한 산화촉진 효과가 제안되었다. 그러나 이는, SOD1에서 구리를 제거하고 효소 활성을 제거하는 SOD1에 대한 특이적인 구리 샤페론의 제거가 돌연변이 SOD1 형질전환 마우스에서 운동 뉴런 퇴행에 아무런 영향을 주지 못한다는 점(J. R. Subramaniam, et al., Nature Neurosci. 5, 301 (2002))에서 가능성이 없어 보인다. 보다 최근에는, 돌연변이 SOD1의 응집체 축적의 가능한 유해 효과로 관심이 전환되었다. 응집이 발병 원인과 관련이 있다는 개념은 돌연변이 SOD1 매개 질환의 마우스 모델이 운동 뉴런에서 두드러진 세포내 봉입체를 특징으로 하고, 어떤 경우에는 운동 뉴런을 둘러 싸고 있는 성상세포 내에서도 세포내 봉입체가 나타난다는 관찰에 의해 지지된다(D. W. Cleveland and J. Liu, Nature Med. 6, 1320 (2000)). ALS의 산발성 사례에서 다양한 봉입체가 제시되었지만, 이러한 봉입체 내의 SOD1의 침착에 대한 증거는 부족한 상황이며, 응집이 산발성 ALS의 발병에 기여한다는 확실한 증거는 없다.
비이상적인 단백질이 어떻게 신경퇴행성 질병을 유도할 수 있는지는 명확하지 않다. 돌연변이 또는 오폴딩된 응집 경향성 단백질의 독성 메카니즘을 결정하는 것은 이들 각각의 질병에 대해 해결되지 않은 가장 중요한 연구 대상이다. 상이한 질병은 궁극적으로 상이한 메카니즘을 보유함에도 불구하고, 통상적인 치료법에 대한 방향을 제시할 수 있는 통상적인 주제가 제시되고 있다.
독성에 대한 제안된 메카니즘은 비이상적인 단백질(A. McCampbell and K. H. Fischbeck, Nature Med. 7, 528 (2001); J. S. Steffan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6763 (2000); F. C. Nucifora, et al., Science 291, 2423 (2001)), UPS (4)의 억제, 카스파제 및 아폽토시스의 부적합한 유도(M. P. Mattson, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 1, 120 (2000)) 및 축색돌기 수송 및 시냅스 완전성 유지와 같은 뉴런 특이성 기능의 통합에 의한 억제(D. W. Cleveland, Neuron 24, 515 (1999); P. F. Chapman, et al., Nature Neurosci. 2, 271 (1999))에 의한 결정 인자의 제거를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이 폴리글루타민-함유 단백질은 CREB-결합 단백질 및 다른 단백질 아세틸라제에 결합하여 이를 감손시킨다(A. McCampbell and K. H. Fischbeck, Nature Med. 7, 528 (2001); J. S. Steffan, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6763 (2000); F. C. Nucifora, et al., Science 291, 2423 (2001)). 이것이 폴리글루타민 독성에 기여할 수 있는 것은 디아세틸라제 억제제가 독성 효과를 완화시킬 수 있다는 발견에 의해 지지된다(A. McCampbell, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 15179 (2001); J. S. Steffan, et al., Nature 413, 739 (2001)). 최근 밝혀진 사실들은 다음과 같다: 돌연변이 폴리글루타민은 프로테아좀 활성을 방해할 수 있다(N. F. Bence, R. M. Sampat, R. R. Kopito, Science 292, 1552 (2001)); 세포 생존성을 유지하는 데 있어서 프로테아좀의 중요한 역할은 상기 돌연변이 단백질의 효과가 뉴런 이상 및 사멸을 매개하는 데 중요할 수 있음을 나타낸다. 카스파제 활성화 및 아폽토시스는 폴리글루타민 질병, ALS 및 알츠하이머병의 세포 배양 모델에서 잘 밝혀져 있으며(M. P. Mattson, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 1, 120 (2000)), 폴리글루타민 질병 및 ALS에서 아폽토시스의 역할은 트랜스게닉 마우스 모델에서 카스파제 억제의 효과를 완화시킴으로써 나타난다(D. W. Cleveland, Neuron 24, 515 (1999)). 환자의 검시 샘플에서 아폽토시스를 밝히는 것은 매우 어려운데, 그 이유는 아마도 인간에서 이들 질병의 장기간에 걸친 진행 및 느린 진화 때문이거나, 상이한 세포 사멸 경로가 관련될 수 있기 때문이다(S. Sperandio, I. de Belle, D. E. Bredesen, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14376 (2000)). 신경필라멘트 변화 및 축삭돌기 수송에서의 결합이 ALS에서 발생하며(D. W. Cleveland, Neuron 24, 515 (1999)), 초기 시냅스 병리학은 알츠하이머병의 트랜스게닉 모델에서 확인되었다(P. F. Chapman, et al., Nature Neurosci. 2, 271 (1999)). 고려되는 다른 메카니즘은 흥분독성, 미토콘드리아 기능이상, 산화성 스트레스 및 미세아교세포 염증 반응을 포함한다. 실제로, 신경퇴행성 질병에서 돌연변이 또는 오폴딩된 단백질의 직접적인 효과로부터 하류로 독성의 메카니즘이 갈라지는 것으로 생각된다.
신경퇴행성 질병에서 독성 단백질의 역할에 대한 이들 고찰은 이성적인 치료법을 제안한다. 먼저, 독성 단백질 발현의 차단 또는 독성 단백질 분해의 가속화는 효과적인 치료법일 수 있다. 트랜스게닉 마우스에서 돌연변이 폴리글루타민의 발현을 감소시키는 것은 표현형을 역전시킬 수 있으며(A. Yamamoto, J. J. Lucas, R. Hen, Cell 101, 57 (2000)), β-아밀로이드의 면역-매개된 제거는 알츠하이머병의 동물 모델에서 유사한 잇점을 보유한다(D. Morgan, et al., Nature 408, 982 (2000)). 독성 단백질의 단편은 전장 단백질 보다 더 병원성일 수 있으며, 특이적인 세포성 국부화는 독성을 증강시킬 수 있기 때문에, 단백질 분해 과정 및 세포내 수송의 차단은 이성적인 치료법이다. 다른 치료법은 응집하는 단백질의 경향을 억제하는 것(자신의 단백질 또는 다른 단백질을 이용함), 오폴딩된 단백질의 독성 효과에 대해 보호하는 열 충격 단백질의 상향 조절 및 뉴런 아폽토시스의 촉발과 같은 하류 효과의 차단을 포함한다. 열 충격 단백질의 과다발현은 돌연변이 폴리글루타민 및 돌연변이 α-시누클레인 둘 다의 독성을 감소시킬 수 있으며(J. M. Warrick, et al., Nature Genet. 23, 425 (1999); P. K. Auluck, et al., Science 295, 865 (2002)), 카스파제 억제는 폴리글루타민 및 돌연변이 SOD 둘 다의 독성을 감소시킬 수 있는데(V. O. Ona, et al., Nature 399, 263 (1999); M. W. Li, et al., Science 288, 335 (2000)), 이는 이러한 유형의 치료 방법이 다수의 신경퇴행성 질병에 교차 적용할 수 있음을 의미한다. 현재, 신경퇴행성 질병을 일으키는 독성 단백질의 발현을 차단하거나 또는 이의 프로세싱 및 응집을 변경시키거나 뉴런 기능 및 생존에 대한 이들 단백질의 유해 효과를 완화시키는 제제를 확인하기 위한 약학 스크린의 개발이 진행중에 있다.
염전 근긴장이상(torsion dystonia)에 대한 분자적 기초는 불명확하다. Ozelius 등은 TOR1A라 칭하는 원인 유전자를 동정하였으며, 이를 인간 염색체 9q34에 지도화하였다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)). 상기 TOR1A 유전자는 TOR-A라 칭하는 단백질을 암호화한다. 초기 발병 염전 근긴장이상을 가진 다수의 환자는 한 코돈의 독특한 결실을 보유하는데, 그 결과 TOR-A의 카르복시 말단에서 글루탐산(GAG) 잔기의 상실을 초래한다. 오기능성 토신 단백질(torsin protein)이 생성된다. 분명히, 이는 질병 염색체 상에서 관찰된 유일한 변화였다(L. J. Ozelius, et al., Genomics 62, 377 (1999); L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)). 최근 문헌에는 카르복시 말단에 18개의 염기쌍 또는 6개의 아미노산의 추가 결실이 보고되어 있다. 이는 GAG 결실 이외에 확인된 최초의 볼연변이이다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)).
카노합디티스 엘레간스(Caenohabditis elegans)에서, 인간 TOR1A 유전자에 대해 최고의 아미노산 서열 동일성을 보유하는 상동체는 tor-2 유전자 생성물이다. 또한, 상기 선충류는 tor-1이라 칭하는 제2 토신 유전자eh 함유한다. TOR1A 유전자를 동정한 원래 논문에서, 선충류 토신형 단백질이 기재되어 있었으며, 이후 ooc-5 유전자를 암호화하는 것으로 확인되었다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997), S. E. Basham, and L. E. Rose, Dev Biol 215 253 (1999)). 세개의 씨. 엘레간스 토신 유전자는 서로 높은 서열 동일성을 공유한다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997)).
tor-1 및 tor-2 유전자는 씨. 엘레간스의 염색체 IV 상에서 서로 옆에 위치하고 있으며, 동일한 방향으로 배향되어 있다. 이들 두개의 유전자는 단지 348개의 염기 쌍에 의해 분리되어 있다. 이는 아마도 이들 유전자가 함께 위치하여 오페론 유닛을 형성하는 것을 암시한다(Blumenthal, T. 1998. Gene clusters and polycistronic transcription in eukaryotes. Bioessays 6: 480-487). 흥미롭게도, 인간도 2개의 토신 유전자인 TOR1A 및 TOR1B를 보유하는데, 이는 토신 A 및 토신 B 단백질을 생성한다. 이들 두개의 단백질은 70% 서열 유사성을 보유한다(L. J. Ozelius, et al., Genomics 62, 377 (1999)). 또한, 상기 인간 유전자는 동일한 염색체(9q34) 상에 존재하나, 반대로 배향되어 있다(L. J. Ozelius, et al., Nature Genetics 17, 40 (1997); Ozelius L J, Hewett J W, Page C E, Bressman S B, Kramer P L, Shalish C, de Leon D, Brin M F, Raymond D, Jacoby D, Penney J, Fahn S, Gusella J F, Risch N J, Breakefield X O. 1998. The gene(DYT1) for early-onset torsion dystonia encodes a novel protein related to the Clp protease/heat shock family. Advances in Neurology. 78:93-105).
TOR-A 단백질은 단백질의 AAA+/Hsp 100/Clp 패밀리에 대해 현저한 유사성(25∼30%)을 공유한다(L. J. Ozelius, et al., Genomics 62, 377 (1999); Neuwald A F, Aravind L, Spouge J L, Koonin E V. 1999). AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes. Genome Res 9: 27-43). 이 패밀리의 구성원은 다른 기능의 ATPase이며, 노출된 표면에 대한 결합에 의해 단백질 응집을 방해하고, 손상된 기질의 수복을 조절한다(Schirmer E C, glover J R, Singer M A, Lindquist S. 1996. Hsp 100/Clp proteins: a common mechanism explains diverse functions. Trends Biochem Sci 21:289-296). 열 충격 단백질은 샤프롱 기능과 관련된 몇몇 상이한 활성을 보유한다. 이들은 단백질의 오폴딩을 예방하고, 단백질 신호전달을 조절하며, 단백질의 올바른 국부화를 가능하게 한다. 열충격 단백질은 세포내의 다른 단백질이 응집체를 올바르게 폴딩되지 않는 경우 활성화되는 것으로 생각된다. 열 충격 단백질 활성화가 일어나지 않으면, 오폴딩된 단백질은 응집체를 형성하는 경향이 있다. 이는 단백질 응집체가 형성되는 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅톤병과 같은 질병의 가능한 원인을 제시할 수 있다.
최근, Hsp 40 및 Hsp 70 열 충격 패밀리가 폴리글루타민 응집의 예방에 관련되어 있음이 밝혀졌다(Chai Y, Koppenhafer S L, Bonini N M, and Paulson H L. 1999. Analysis of the Role of Heat Shock Protein (Hsp) Molecular Chaperones in Polyglutamine Disease. The Journal of Neuroscience. 19(23):10338-10347). 마카오-죠셉 병이라고도 칭하는 폴리글루타민 신경퇴행성 질병인 척수소뇌 운동실조 3 및 그의 관련 질병이 유발하는 단백질 아탁신 3을 조사함에 있어서, 연구자들은 세포에 대한 응집체의 결과 및 폴리글루타민 응집체에 대한 샤프롱의 효과에 대해 연구하였다. 그들의 실험은 Hsp 40 및 Hsp 70이 폴리글루타민 응집체에 대한 세포의 반응의 일부분으로서 사용됨을 확인하였다. 이들 샤프롱(chaperone)은 응집체의 독성 효과를 감소시킬 수 있다. 돌연변이 아탁신-3의 존재는 세포내에서 스트레스 반응을 유도하며, 샤프롱 Hsp 70을 활성시킨다. 따라서, 세포는 이상으로서 폴리글루타민 단백질을 나타내며, 이들 응집체의 억제를 돕기 위해 그의 샤프롱을 수집한다.
아마도 토신 단백질이 샤프롱 기능을 보유한다는 추가의 암시는 최근에 발견되었는데, 이는 토신 A가 세포내 막에 국부화된다는 발견에 기초한다(Kustedjo K, Bracey M H, Cravatt B F. Torsin A and Its Torsin Dystonia-associated Mutant Forms Are Lumenal Glycoproteins That Exhibit Distinct Subcellular Localizations. 2000. J of Biol Chem 275:27933-27939). 면역형광법을 이용하여, TOR-A는 ER 체류성 단백질 BiP와 함께 높은 동시 국부화를 보유하는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, 근긴장이상 환자에서 확인된 바와 같이 글루탐산 잔기가 결여된 TOR-A의 돌연변이형은 BiP 면역반응성이 없는 대형 응집체형 형성물 내에 존재한다(Kustedjo K, Bracey M H, Cravatt B F. Torsin A and Its Torsin Dystonia-associated Mutant Forms Are Lumenal Glycoproteins That Exhibit Distinct Subcellular Localizations. 2000. J of Biol Chem 275:27933-27939). 이는 토신 A가 글리코실화되고, ER 단백질의 특징이며, PDI, ER 마커와 함께 동시 국부화됨을 밝힌 다른 보고들을 지지한다. 또한, 돌연변이 TOR-A는 대형 세포질 봉입체를 형성하는 것으로 확인되었다(Hewett J, Gonzalez-Agosti C, Slater D, Ziefer P, Li S, Bergeron D, Jacoby D J, Ozelius L J, Ramesh V, and Breakefield X O. 2000. Mutant torsin A, responsible for early-onset torsion dystonia, forms membrane inclusions in cultured neural cells. Human Molecular Genetics 9: 1403-1413).
본 발명의 추가의 구체예는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 나노입자 내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 범위 내의 나노입자는 미시적인 특성을 나타내는 입자의 응집체 뿐만 아니라 단일 분자 수준의 입자를 포함하는 의미이다. 나노입자를 사용하는 방법 및 제조하는 방법은 미국 특허 6,395,253, 6,387,329, 6,383,500, 6,361,944, 6,350,515, 6,333,051, 6,323,989, 6,316,029, 6,312,731, 6,306,610, 6,288,040, 6,272,262, 6,268,222, 6,265,546, 6,262,129, 6,262,032, 6,248,724, 6,217,912, 6,217,901, 6,217,864, 6,214,560, 6,187,559, 6,180,415, 6,159,445, 6,149,868, 6,121,005, 6,086,881, 6,007,845, 6,002,817, 5,985,353, 5,981,467, 5,962,566, 5,925,564, 5,904,936, 5,856,435, 5,792,751, 5,789,375, 5,770,580, 5,756,264, 5,705,585, 5,702,727 및 5,686,113에서 확인할 수 있다.
본 발명의 추가 구체예는 마이크로어레이에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 마이크로어레이 내에 혼입될 수 있다. 본 발명의 범위에 속하는 마이크로어레이는 단일 분자 수준의 입자 뿐만 아니라 미시적 특성을 나타내는 입자의 응집체를 포함하는 의미이다. 상기 나노입자를 이용하는 방법 및 제조하는 방법은 미국 특허 6,004,755에서 확인할 수 있다.
이하, 본 발명은 후술하는 실시예에 의해 더 상세히 설명한다.
발명의 개요
본 발명은 근긴장이상, 근긴장이상 유전자, 암호화된 단백질 및 근긴장이상 장애를 초래하는 근긴장이상 유전자에서의 돌연변이에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 토신 단백질, 바람직하게는 TOR-2를 암호화하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 토신 단백질 내에 함유된 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 샘플 내에 토신 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 존재 및 핵산에서의 돌연변이를 특이적으로 검출하기 위한 핵산 프로브를 제공한다.
또, 본 발명은 샘플 내에 토신 단백질을 암호화하는 핵산에서의 돌연변이의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 샘플 내에 토신 단백질을 암호화하는 핵산에서의 돌연변이의 존재를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 5'→3', 숙주 세포에서 전사를 개시하는 데 효과적인 프로모터 및 상기 개시한 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벡터와 상기 개시한 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 특정 화합물의 존재 하에 단백질 응집량과 그 화합물의 부재 하에 단백질 응집량을 비교하여 단백질 응집을 감소, 억제, 개선 또는 예방하는 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 하나 이상의 토신 단백질의 존재 하에 실시한다. 토신 단백질을 돌연변이시킬 수 있다.
본 발명은 또한 상기 개시된 폴리펩티드에 해당하는 아미노산 서열을 암호화하는 RNA 서열에 상보적인 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
또, 본 발명은 상기 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 개시된 재조합 핵산 분자를 포함하는 비인간 유기체를 제공한다.
또한, 본 발명은 토신 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 특이적인 결합 친화도를 갖는 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 샘플 내의 토신 단백질 또는 폴리펩티드를 검출하는 방법을 제공한다.
또, 본 발명은 샘플 내의 토신 단백질 또는 폴리펩티드의 양을 측정하는 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 토신 단백질 또는 폴리펩티드에 대한 특이적 결합 친화도를 갖는 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 모노클로날 항체의 결합 파트너와 표지를 포함하는 접합체를 함유하는 제1 용기 수단을 포함하는 진단 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 개시한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 제공한다.
본 발명은 인간의 근긴장이상, 특히 토신 근긴장이상의 진단 방법을 추가로 제공한다. 바람직하게는 근긴장이상의 존재 또는 부재를 진단하고; 인간에서 근긴장이상을 형성할 가능성 또는 이를 형성할 소인을 예측하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 근긴장이상은 토신 근긴장이상일 수 있다. 인간으로부터 얻은 생물학적 샘플을 진단 방법에 사용할 수 있다. 혈액, 타액, 정액, 질 분비물, 뇌척수액 및 양막체액 샘플과 같은 체액 샘플일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 생물학적 샘플은 융모막 융모, 신경세포, 상피세포, 근육 및 결합 조직 샘플과 같은 조직 샘플일 수 있다. 체액 샘플과 조직 샘플에서, 핵산이 샘플내에 존재한다.
근긴장이상 유전자는 tor-1, tor-2, ooc-5, DYT1, 및 DYT2 유전자 및 이의 일부(서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9)일 수 있다. 일 구체예에서, 결실 돌연변이와 같이 유전자를 돌연변이시킬 수 있다. 대안적으로, 돌연변이는 미스센스 또는 프레임 이동 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 검출하고자 하는 돌연변이가 결실 돌연변이인 경우, 이 영역에 3개의 뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출한다.
또한, 본 발명은 근긴장이상 장애가 근긴장이상 유전자의 하나 이상의 돌연변이를 특징으로 하는 인간의 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 근긴장이상 유전자를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 폴리머라제 연쇄 반응(이하, PCR)을 실시하여 인간으로부터 얻은 테스트 샘플을 평가한다. 핵산 샘플의 PCR 증폭 후에, 증폭된 핵산 단편을 분리하고 근긴장이상 유전자의 대립유전자 및 tor-2 유전자의 돌연변이를 검출한다. 예를 들어, tor-2 유전자의 돌연변이는 토신 근긴장이상의 존재를 나타내는 것인 반면에, 돌연변이 결여는 음성 진단을 나타내는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 인간으로부터 얻은 생물학적 샘플을 근긴장이상 유전자에 대한 핵산 프로브와 접촉시키는 단계; 하이브리드화하기에 적절한 조건 하에 생물학적 샘플과 핵산 프로브를 유지하는 단계; 생물학적 샘플과 핵산 프로브 사이의 하이브리드화를 검출하는 단계; 및 근긴장이상 장애를 포함하거나 포함하지 않는 대조군 샘플과 인간으로부터 얻은 하이브리드화 시그널을 비교하는 단계를 포함하는, 인간의 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이다. 하이브리드화는 서열 번호 1, 3, 5, 7 및 9와 같은 근긴장이상 유전자의 핵산 단편으로 실시한다. 핵산 프로브는 (예컨대 형광, 방사성, 효소, 바이오틴 표지로) 표지할 수 있다.
또한, 본 발명은 한 사람이 근긴장이상 장애의 영향을 받을 가능성 여부를 예측하는 방법을 포함하는 데, 이 방법은 인간으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 생물학적 샘플과 핵산 프로브를 접촉시키는 단계; 생물학적 샘플과 핵산 프로브를 하이브리드화에 적당한 조건 하에 유지하는 단계; 및 생물학적 샘플과 핵산 프로브 사이의 하이브리드화를 검출하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 근긴장이상 유전자(예, 서열 번호 1, 3, 5, 7, 및 9)를 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 PCR을 실시하는 단계; 및 근긴장이상 유전자의 증폭된 DNA 단편에서의 돌연변이를 검출하는 단계[근긴장이상 유전자의 돌연변이는 토신 근긴장이상의 존재 또는 부재의 지표임]를 더 포함한다. 예를 들어, 양성 진단을 나타내는 뉴클레오티드의 결실, 또는 음성 진단을 나타내는 뉴클레오티드의 존재를 하이브리드화로 검출할 수 있다.
또한, 본 발명은 인간의 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 검출하는 방법으로서, 인간으로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 및 인간에서 유래한 체액, 조직 또는 둘다를 포함하는 생물학적 샘플에서 근긴장이상 단백질의 레벨을 평가하는 단계를 포함한다. 근긴장이상 단백질에 특이적인 하나 이상의 항체와 샘플을 접촉시키고, 근긴장이상 단백질의 레벨을 검출하여 근긴장이상 단백질의 수준 또는 농도를 결정한다. 근긴장이상 단백질 수준의 변경은 진단의 지표이다. 이 방법에 사용된 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, (예컨대, 형광, 바이오틴, 콜로이드성 금, 효소로) 검출가능하게 표지할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 근긴장이상 단백질의 수준 또는 농도를 평가하는 방법은 항체와 근긴장이상 단백질의 복합체 또는 근긴장이상 단백질에 특이적인 제2 항체와 샘플을 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 인간에서 근긴장이상 장애의 존재 또는 부재를 진단하기 위한 키트를 제공하는 데, 이 키트는 인간으로부터 얻은 샘플 중에서 근긴장이상 유전자, 예컨대 DYT1 또는 근긴장이상 단백질, 예컨대 TOR-A의 돌연변이를 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 토신 근긴장이상을 검출하기 위한 하나 이상의 시약은 근긴장이상 단백질의 존재 또는 부재를 검출하기 위해서 효소 결합형 면역흡착 분석 또는 방사성면역분석을 실시하는 데 사용된다. 또 다른 구체예에서, 키트는 PCR, 하이브리드화 또는 서열계 분석 또는 이의 임의의 조합을 실시하여 토신 근긴장이상을 검출하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다.
또한, 본 발명의 방법으로 TOR-A와 같은 근긴장이상 단백질을 암호화하는 DYT1과 같은 근긴장이상 유전자의 돌연변이를 진단할 수 있을 것으로 생각되는 데, 인간에 대한 근긴장이상 유전자의 돌연변이를 토신 근긴장이상의 영향을 받지 않은 인간의 어버이, 토신 근긴장이상에 의해 영향을 받은 인간의 어버이 및 토신 근긴장이상에 의해 영향을 받은 인간의 형제에 대한 근긴장이상 유전자의 돌연변이와 비교한다.
본 발명은 토신 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 토신 단백질의 전체 또는 일부를 비롯하여 치료제로서 사용하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 임상적 신경세포 질병을 매개하거나, 또는 각각 증가된 취약성(예, 유전적 소인)을 다른 신경세포 질병에 부여하는 돌연변이 또는 다형태를 확인하기 위한 프라이머 및 프로브로서 유용한 핵산 서열을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 유전자의 신경해부학적 발현과 일치하는(예컨대 상호관련된) 포유류의 명백한 임상적 증상을 일으키는 특정 표현형을 부여하는 데 연관된 다른 신경세포 유전자의 돌연변이 또는 다형태를 검출하는 데 개시된 프로브 및 프라이머를 사용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 신경세포 질병에서의 TOR-1, TOR-2, ooc-5, TOR-A 또는 TOR-B의 역할을 확인할 수 있으며, 그러한 신경세포 질병의 비제한적인 예로는 도파민 매개의 질병, 운동 장애, 신경퇴행성 질병, 신경발생 질병 및 신경정신 질병 등이 있다.
특정 구체예는 도파민 매개 질병 또는 신경 세포 질병을 초래하는 돌연변이 또는 다형태를 포함하는 유전자의 확인 방법을 제공한다. 그러한 질병의 예는 표 1에 제시되어 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 신경세포 질병에 대한 감수성 증가를 부여하는 신경세포 유전자의 돌연변이 또는 다형태를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 토신 단백질의 부재 하에 단백질 응집 수준과 비교하여 토신 단백질의 존재 하에 단백질 응집을 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 토신 단백질을 돌연변이시킬 수 있다. 이 방법은 단백질 응집을 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 추가의 화합물의 존재 하에 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질 응집 결과 세포 기능부전을 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법은 단백질 응집 결과 세포 기능부전을 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 추가의 화합물의 존재 하에 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질-응집 관련 질병을 치료, 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 단백질-응집 관련 질병의 예는 표 1에 제시되어 있다. 이 방법은 단백질-응집 관련 질병의 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 추가 화합물의 존재 하에 실시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 단백질-응집 관련 질병의 증상을 치료, 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 단백질-응집 관련 질병의 예는 표 1에 제시되어 있다. 이 방법은 단백질-응집 관련 질병의 감소, 정지, 완화, 개선 또는 예방하는 추가 화합물의 존재 하에 실시할 수 있다.
방법 및 재료
플라스미드 작제물
tor-2 cDNA는 하기 프라이머를 이용하는 RT-PCR을 이용하여 전체 연충 mRNA로부터 분리하였다: 프라이머 1 (5'-AACGCGTCGACAATGAAAAAGTTCGCTGAAAAATGGTTTCTATTG 3') (서열 번호 11) 및 프라이머 2 (5' AAGGCCTTCACAACTCATCATTAAACTCTTTCTTCG) (서열 번호 12). 개략적으로, 전체 DNA는 TriReagent(Molecular Research Center)를 이용하는 씨. 엘레간스의 혼합 군집으로부터의 분리, 이어서 PolyATtract mRNA Isolation System III(Promega)를 이용하는 mRNA 분리 및 RT-PCR을 위한 Superscript First-Strand Synthesis System(Life Technologies)를 이용하는 cDNA 합성에 의해 분리하였다. 예상된 ORF(WormBase Y37AlB.13)의 확인은 서열결정을 통해 수행하였다. tor-2 cDNA의 돌연변이형은 PCR-매개된 부위-지정 돌연변이유발법을 이용하여 생성하였다. tor-2의 Δ368 돌연변이형을 얻기 위해, PCR의 초기 라운드는 프라이머 1 및 프라이머 3 (5' GGGAAAAATTCAAGATCAAGAACTCTTTGCATG 3') (서열 번호 13)을 이용하여 수행하여 약 1 kb cDNA(아미노산 1∼367에 상응함)를 생성하였다. 동시에, 약 200 bp 단편(아미노산 369∼412에 상응함)은 프라이머 2 및 프라이머 4(5' CATGCAAAGAGTTCTTGATCTTGAATTTTTCCC) (서열 번호 14)를 이용하여 증폭시켰다. 이어서, 상기 2개의 단편은 합하고, 프라이머 1 및 2를 이용하여 증폭시켜 완전한 cDNA를 재구성하였다. 또한, tor-2의 ΔNDEL 형은 하기 프라이머를 이용하는 PCR를 이용하여 생성하였다. 프라이머 5 (5' CTAGCTAGCATGAAAAAGTTCGCTGAAAAATGG 3') (서열 번호 15) 및 말단 NDEL 아미노산(서열 번호 16)을 암호화하는 DNA가 결여된 프라이머 6(5' GGGGTACCTCAAAACTCTTTCTTCGAATTGAGTG 3') (서열 번호 17)를 이용하였다. tor-2의 돌연변이형은 서열결정을 통해 확인하였다. 모든 tor-2 cDNA는 효소 Nhe I 및 Kpn I을 이용하여 벡터 pPD30.38 내로 서브클로닝하였다(Fire, A, Harrison, S W, Dixon, D. 1990. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene 93:189-198.).
플라스미드 unc-54::Q19-GFP 및 unc-54::Q82-GFP는 노스웨스턴 유니버시티의 Dr. Rick Morimoto로부터 무상으로 제공받았다(Satyal, S, Schmidt, E, Kitagaya, K, Sondheimer, N, Lindquist, S T, Kramer, J, Morimoto, R. 2000, Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA 97:5750-5755.).
씨. 엘레간스 프로토콜
선충은 표준 절차를 이용하여 유지하였다(Brenner, S. 1974. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77:71-94). 폴리글루타민-GFP 융합체를 암호화하는 플라스미드와 토신 작제물의 혼합물은 rol-6 마커 유전자와 함께 초기-성체 자웅동체의 생식선에 동시 주입하였다. 주입 혼합물은 pPD30.38-Q82-GFP 또는 pPD30.38-Q19-GFP, pRF4 (rol-6[su1006] 우성 마커) 및 pPD30.38-tor-2, pPD30.38-Δ368 tor-2 또는 pPD30.38-ΔNDELtor-2를 함유하였으며, 주입은 표준 미세주입 절차에 따라 수행하였다(Mello C C, Kramer J M, Stinchcomb D, Ambros V. 1991. Efficient gene transfer in C. elegans: Extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J 10: 3959-3970 1992). 플라스미드 DNA의 각각의 조합에 있어서, 염색체외 어레이를 발현하는 연충 계통을 얻었다. 어레이의 안정한 전달후, 게놈 내로의 통합은 코발트 60으로부터 3500∼4000 rad를 이용하는 감마 조사를 이용하여 수행하였다(Inoue, T, Thomas, J. 2000. Targets of TGF-signaling in Caenorhabditis elegans dauer formation. Develop. Biol. 217:192-204). 안정한 통합 계통은 모든 작제물에 대해 얻었다.
형광 현미경
연충들은 Endow GFP HYQ 및 텍사스 레드 HYQ 필터(Chroma, Inc.)가 장착된 Nikon Eclipse E800 외형광 현미경을 이용하여 조사하였다. 이미지는 Spot RT CCD 카메라(Diagnostic Instruments, Inc.)로 포착하였다. MetaMorph Software (Universal Imaging, Inc.)를 이용하여 이미지의 의사착색, 이미지 중첩 및 응집체 크기 정량화를 수행하였다. 응집체 크기 및 양의 통계학적 분석은 소프트웨어 Statistica를 이용하여 수행하였다.
결과
씨. 엘레간스 TOR-2를 암호화하는 cDNA의 분리 및 부위-지정 돌연변이유발법
몇몇 실험 계통의 중요한 원천으로서, 씨. 엘레간스 tor-2 유전자에 대해 예상된 전장 암호화 영역에 상응하는 cDNA를 분리하였다. 예상된 오픈 리딩 프레임을 확인하고, 양 스트렌드의 DNA 서열결정에 의해 완전히 올바른가 확인하였다. 모든 엑손 및 인트론 경계도 또한 비교하였다. 이는 중요한데, 그 이유는 이 유전자에 의해 암호화된 TOR-2 단백질은 씨. 엘레간스의 다른 토신에서 확인되지 않은 독특한 N-말단 부분을 함유하기 때문이다(도 1 내지 3). 1.3 kb tor-2 cDNA는 412 아미노산의 예상된 단백질을 암호화한다. 거의 정확한 분자량(49 kd)의 cDNA로부터 유래한 단일 단백질은 TOR-2 특이적인 펩티드 항혈청에 의해 씨. 엘레간스 추출물에서 인식되었다. tor-2 cDNA는 체벽 근육 세포에서 발현된 씨. 엘레간스 unc-54 프로모터 요소의 조절 하에 pPD30.38 벡터 내로 서브클로닝하였다(Fire, A, Harrison, S W, Dixon, D. 1990. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene 93:189-198; Satyal, S, Schmidt, E, Kitagaya, K, Sondheimer, N, Lindquist, S T, Kramer, J, Morimoto, R. 2000). 또한, tor-2 cDNA의 2개의 변형물은 TOR-2 단백질의 초기 구조-작용 분석을 위해 생성하였다. 이들 변형된 cDNA 둘 다는 pPD30.38 내로 서브클로닝하였다. 부위-지정 돌연변이유발법을 이용하여, 인간에서 원발성 염전 근긴장이상을 유발하는 우성 네가티브 단백질의 발현을 모방하도록 구성된 cDNA를 생성하였다(Ozelius L J, Hewett J W, Page C E, Bressman S B, Kramer P L, Shalish C, de Leon D, Brin M F, Raymond D, Corey D P, Fahn S, Risch N J, Buckler A J, Gusella J F, Breakefield X O. 1997. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nature Genetics 17: 40-48.). 이는 세린을 암호화하는 아미노산 368에서 코돈이 결여된 돌연변이 tor-2 cDNA로 구성된다. 인간에서, TOR1A에서 상응하는 아미노산 결실은 글루탐산이다. 세린 및 글루탐산 둘 다 극성 아미노산이다. 또한, TOR-2 단백질에서 4개의 가장 C 말단 아미노산(NDEL)이 결실된 tor-2 cDNA를 생성하였다. NDEL 서열은 추정 ER-체류 신호이다(자료는 나타내지 않음).
TOR-2의 동시 발현은 폴리글루타민 반복부 유도된 단백질 응집을 억제한다
Satyal 및 동역자들(2000)은 특성이 잘 규명된 unc-54 프로모터를 이용하여 씨. 엘레간스의 체벽 근육 세포에서 이소적으로 발현된 GFP에 융합된 폴리글루타민-반복부의 인공 응집체를 생성하였다. GFP 수용체 단백질의 응집은 폴리글루타민 트랙의 길이에 의존한다. 예를 들어, GFP에 대한 19 글루타민(Q19) 융합체의 체벽 발현은 보통 일정하게 분포된 세포질에서의 변화를 반영하지 않으며 GFP 국부화를 확산시키지 않는다(도 4a). 그러나, GFP에 융합된 82 글루타민(Q82)의 트랙은 GFP 국부화에서 현저한 변화를 초래하는데, 이때 불연속 응집체는 모든 동물에서 명백하게 확실하였다(도 4b).
적합한 벡터(unc-54::tor-2 cDNA) 내로의 도입 및 안정한 트랜스게닉 동물의 선택 후에, 동일하게 높은 수준의 구성적 프로모터의 조절 하에 TOR-2 단백질의 동시발현은 Q82-GFP를 함유하는 동물에서 GFP-함유 응집체의 수를 현저하게 감소시켰다(도 4c). 실제로, 확산성 체벽 근육 형광은 이들 다수의 동물에서도 다시 나타났다. Q19와 함께 TOR-2의 동시발현은 GFP의 정상적인 세포질 분포를 변경시키지 않았으며, 따라서 응집을 유도하지 않는 것으로 생각된다. 대조적으로, 상기 단백질의 C 말단에서 아미노산의 부위 지정 결실(Δ368)을 함유하는 TOR-2와 함께 Q82-GFP의 동시발현은 이들 동물에서 체벽 형광을 복원할 수 없는 것으로 나타났다(도 4d). 흥미롭게도, Q19와 함께 TOR-2Δ368의 동시발현은 Q19-GFP 동물에서 확인된 것과 다르게 GFP의 일반적인 세포질 국부화를 변경시키지 않았다.
여러가지 작제물들 사이에는 Q82-GFP 응집체 사이에 통계학적으로 현저한 차이기 있었다. Q82, Q82 + TOR-2 및 Q82 + TOR-2Δ368 동물 30마리 각각의 평균 응집체의 크기를 기록하였다. Q82 동물로부터 유래한 응집체의 평균 크기는 Q82 + TOR-2의 1.6 ㎛와 비교하여 2.7 ㎛였다(도 5). 이 차이는 페어-와이즈 t-테스트를 이용하여 확인한 결과 매우 유의적이었다(p<0.001). 또한, Q82 및 Q82 + TOR-2Δ368 사이의 차이 또한 유의적이었는데(p<0.001), 응집체의 크기는 Q82 + TOR-2Δ368의 경우 4.8 ㎛이었다(Q82의 경우 2.7 ㎛와 비교됨). 이들 차이는 도 6a 및 6b에서 확인할 수 있는 바와 같이 포토마이크로그래프를 이용하여 용이하게 관찰하였다.
또한, 응집체 크기 변이율의 양은 트랜스게닉 작제물 사이에서 달랐다. 응집체 크기가 다음 카테고리, 즉 0∼3 ㎛, 3∼5 ㎛, 5∼9 ㎛ 및 9∼26 ㎛로 분류하는 경우, Q82 동물로부터 유래한 응집체는 각각 63%, 25%, 9% 및 3% 분포를 나타냈다(표 2). Q82 및 TOR02를 동시발현하는 동물은 응집체 크기의 훨씬 더 작은 변이율을 나타냈는데, 응집체의 90%는 가장 작은 크기의 군에 속하였으며, 응집체의 단지 7% 및 3%가 각각 3∼5 ㎛ 카테고리 및 5∼9 ㎛에 속하였다. 반대로, Q82 및 TOR-2Δ368을 동시 발현하는 동물로부터 유래한 응집체는 더 큰 정도의 변이율을 나타냈는데, 16%의 응집체가 5∼9 ㎛ 카테고리 및 9∼26 ㎛에 속하였다.
[표 2]
Q82 응집체 크기의 가변성 응집체는 각각 상이한 처리에 대한 크기에 따라 그룹화하였다. 백분율은 각각의 처리에 대해 응집체의 총수를 기준하여 계산하였다.
응집체의 크기(㎛) Q82 Q82 + TOR-2 Q82 + TOR-2/Δ368
0∼3 63% 90% 48%
3∼5 25% 7% 20%
5∼9 9% 3% 16%
9∼26 3% 16%
Q82-GFP 균주와 관련된 일반화된 성장 결함이 존재한다. 이 균주는 야생형 동물과 비교하여 감소된 성장 속도(특정 시점에서의 유충 단계에 의해 판단함)를 나타낸다(Satyal, S, Schmidt, E, Kitagaya, K, Sondheimer, N, Lindquist, S T, Kramer, J, Morimoto, R. 2000. Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA 97:5750-5755). 야생형 토신 및 돌연변이 토신 둘 다 Q82-GFP로 동시발현시켜 토신 단백질이 상기 명백한 항상성 부하를 경감시키는지 여부를 결정하였다(도 4a 내지 4d). 야생형 tor-2와 함께 동시발현은 Q82-GFP 동물과 관련된 성장 억제에 대해 명백한 효과를 보유하지 않았다. 그러나, tor-2Δ368 동시발현은 성장 억제 효과를 현저히 악화시켜 모충이 알을 낳고 48시간이 경과한 후 상기 동물들의 71%가 Q82-GFP 동물의 46%와 비교하여 발생의 L1/L2 단계에 여전히 존재하게 하였다. Q19와 함께 또는 야생형 tor-2와 함께 tor-2Δ368 동시발현 어느 것도 동물의 성장 속도를 변화시키지 않았다(참조: 표 3).
[표 3]
성장 분석
성체는 설정된 시간 동안 알을 낳도록 하고, 이어서 플레이트에서 제거하였다. 후대는 애벌레 단계에 따라 성체를 제거하고 48시간 후에 계수하였다.
L1/L2 L3 L4/성체 총
N2 2(0.5%) 78(20%) 309(79%) 389
Q19 2(14%) 184(63%) 68(23%) 292
Q82 134(46%) 149(51%) 7(3%) 290
Q19/tor-2 99(18%) 395(73%) 46(9%) 540
Q82/tor-2 122(42%) 140(48%) 27(10%) 289
Q19/Δ368 44(19.2%) 159(69.4%) 26(11.4%) 229
Q82/Δ368 98(71%) 40(29%) 1(0.007%) 139
다른 토신 유전자의 동시 발현은 폴리글루타민 반복부-유도된 단백질 응집을 억제한다
실험은 상기한 Q82 + tor-2 동시발현에 따라 수행하였으나, tor-2는 ooc-5 및 TOR-A로 대체하였다. 즉, Q82 + ooc-5 및 Q82 + TOR-2 실험을 수행하였다. 또한, Q82는 ooc-5 및 tor-2와 동시발현시켰다(즉, Q82 + tor-2 + ooc-5). 도 10c 내지 10e는 tor-2 단독과 같이 Q82와 함께 ooc-5, TOR-A 및 tor-2 각각의 발현은 Q82 발현의 더 확산성 패턴 및 Q82 응집체의 감소를 초래하였다. 또한, OOC-5와 함께 TOR-2의 발현은 Q82 응집체의 크기에서 명백히 강화된 감소를 나타냈다. 아마도, 이는 이러한 토신 단백질이 복합체 내에 적어도 부분적으로 존재하는 것을 암시하는 것이다.
시간 경과에 따른 폴리글루타민 응집체 축적
Q19-GFP 동물은 성체기에 도달하는 경우 작은 응집체를 보유하였으며, 응집체는 동물이 노화됨에 따라 크기가 증가하였다. 구체적으로, Q19-GFP, Q19-GFP+TOR-2 또는 Q19-GFP+TOR-2 Δ368을 암호화하는 성체 연충은 7일 동안 매일 분석하였으며, 응집체 크기를 평가하였다(도 7). Q19-GFP를 발현하는 연충의 성체기 1일째의 평균 응집체 크기는 7.5 ㎛였으며, 2일째는 7.9 ㎛였다. 3일째에 응집체의 크기는 8.9 ㎛로 증가하였으며, 4일째에는 8.5 ㎛로 감소하였다. 평균 크기는 5일, 6일 및 7일째에는 약간 요동하였으나, 평균 8.2 ㎛를 유지하였다. TOR-2를 동시발현하는 연충은 현저히 더 작은 응집체를 보유하는 것으로 확인되었다. 1일째에, 응집체의 평균 크기는 4.8 ㎛였다. 응집체의 크기는 시간에 따라 감소되었으며, 4일째에는 평균 크기가 3.0 ㎛로 안정화되었으며, 6일째의 평균 크기는 3.8 ㎛였다. TOR-2Δ368을 동시 주입한 응집체는 매일 그 크기가 증가하였다. 분석 첫째날에 평균 응집체 크기는 10.3 ㎛였으며; 4일째에는 12.8 ㎛였으며; 분석 최종일에 응집체의 평균 크기는 15.0 ㎛였다. 통계학적 분석 결과 시간 경과에 따른 현저한 차이는 없었다. 그러나, 처리 결과의 차이는 존재하였으며, 이들 차이는 시간 경과에 따라 지속되었다. TOR-2 단백질 처리한 것들은 더 작은 평균 응집체 크기(3.9 ㎛)를 보유하였으며, Q82에 대한 응집체 크기(평균 8.2 ㎛)와 비교하여 지속적으로 더 작았다. 돌연변이 토신 단백질은 평균 12.8 ㎛였으며, 야생형 토신 단백질 및 Q82 둘 다와 달랐다.
TOR-2 항체 및 SDS-PAGE
전체 연충 단백질 추출물의 SDS-PAGE 및 후속 웨스턴 블롯을 수행하고, 블롯은 TOR-2 항체로 염색하였다(도 8). TOR-2 단백질의 수준은 야생형 N2 연충, Q19 및 Q82 연충에서 최소인 것으로 확인되었다. Q19/TOR-2, Q82/TOR-2, Q19+TOR-2/Δ368 및 Q82 + TOR-2/Δ368의 TOR-2 단백질 수준은 N2, Q19 및 Q82 보다 더 높은 것으로 확인되었다. 그러나, 야생형 및 돌연변이 토신의 4개의 구성물의 수준은 균등하였다. 액틴 조절을 사용하였으며, 사용한 모든 연충에 대해 균등한 것으로 결정되었다.
항체 염색
TOR-2 항체로 염색한 전체 연충은 연충 전체를 통해 확산 염색을 나타냈다(도 9). 그러나, 토신 국부화의 더 높은 수준은 Q82 연충 내에서 응집체를 완전히 둘러싸는 조밀한 고리 내에서 확인되었다.
논의
초기 발병 염전 근긴장이상은 TOR-A의 카르복시 말단에서 글루탐산 잔기의 상실을 초래하는 우성 돌연변이에 의해 유발된다. 다수의 근긴장이상은 이러한 결실을 나타내며; 이는 이 영역이 상기 단백질의 올바른 작용을 위해 결정적임을 의미한다. 최근에 밝혀진 바에 따르면, AAA+ 패밀리의 구성원은 6원 올리고머 고리를 형성한다. 이 고리 구조는 다른 단백질과의 회합에 사용된다. Ozelius 등(1997)은 글루탐산 결실의 이러한 부위는 TOR-A가 고리를 형성하는 경우, 고리 구조의 결정적인 성분일 수 있다는 가설을 세웠다. 이 아미노산의 상실은 TOR-A와 주변 단백질의 관계에 영향을 미칠 수 있다(Ozelius L J, Hewett J W, Page C E, Bressman S B, Kramer P L, Shalish C, de Leon D, Brin M F, Raymond D, Corey D P, Fahn S, Risch N J, Buckler A J, Gusella J F, Breakefield X O. 1997. The early-onset torsion dystonia gene (DYT1) encodes an ATP-binding protein. Nature Genetics 17: 40-48).
시험관내 분석을 이용하여 폴리글루타민 응집체에 대한 토신의 효과를 조사하였다. Q82와 함께 TOR-2의 동시발현은 체벽 근육 세포내 응집체의 형성을 감소시킨다. Q82 + TOR-2의 항체 국부화 연구는 TOR-2 단백질이 조밀한 도우넛형 양식의 응집체를 둘러싸는 것으로 생각된다. 이는 흥미로운데, 그 이유는 이러한 사실이 이들 단백질이 어떻게 응집체와 상호작용할 수 있는지에 대한 첫번째 암시를 우리에게 제공하기 때문이다.
내세포성 봉입체내 응집체의 형성 및 이들의 존재는 다수의 신경퇴행성 질병의 특징이다. 모든 세포는 오폴딩된 단백질 또는 손상된 단백질을 처리하는 시스템을 보유한다. 이 시스템은 유비퀴틴-프로테아좀 경로(UPS)라 칭한다. 이 시스템은 유비퀴틴으로 분해되는 단백질을 "태깅"함으로써 작동한다. 따라서, 단백질은 분해를 위한 표적이 된다. 그러나, 최근의 보고에 따르면 이 경로는 단백질 응집체의 존재에 의해 방해된다(Bence et al., 2001). 응집체의 형성을 유도하는 것으로 공지된 2개의 단백질을 발현시킴으로써, Bence 등은 UPS를 완전히 억제할 수 있었다. 이는 세포가 제거할 수 없는 유비퀴틴으로 태깅된 단백질의 축적을 초래한다. 이러한 축적 및 그 외외의 오폴딩된 단백질은 세포 사멸을 초래한다(Bence N F, Sampat R M, Kopito R R. Impairment of the Ubiquitin-Proteasome System by Protein Aggregation. Science 292:1552-1555).
Johnston 등(1998)은 어그리섬(aggresome)이라 칭하는 프로테아좀 시스템과는 상이한 구조를 기술하였다(Johnston J A, Ward C L, Kopito R R. Aggresomes: A Cellular Response to Misfolded Proteins. 1998. J of Cell Biology 143(7): 1883-1898). Kopito 등(2000)에 의한 관련 연구에서, 그들은 "세포성 분해불량"으로서 응집된 단백질을 제거할 수 없는 세포의 무능력을 기술한다(Kopito R R, Sitia R. Aggresomes and Russell Bodies. 2000. EMBO Reports 1(3): 225-231). 그들의 이론은 어그리섬이 상기 "세포성 분해불량"에 반응한다는 것이다. 단백질 응집체를 파괴할 수 있는 세포의 능력이 억제되는 경우, 어그리섬이 형성된다. 어그리섬의 형성은 세포 스트레스의 결과이다. 이는 구조적으로 매우 조직화되어 있다. 그러나, 어그리섬은 단지 미세소관 조직화 중심(MTOC, microtubule organizing center)에서만 형성된다. 미세소관(MT)은 응집된 단백질 또는 오폴딩된 단백질을 분해를 위해 어그리섬으로 수송하는데 사용된다. 또한, 중간 필라멘트도 필요하며, 어그리섬의 지지성 프레임웍을 형성하기 위해 특정 방식으로 재배열된다. 어그리섬은 분해를 위한 많은 양의 프로테아좀, 유비퀴틴 및 분자 샤프롱을 함유한다. 흥미롭게도, 다수의 퇴행성 질병에서 확인되는 봉입체는 다양한 양의 어그러섬에서 확인되는 것과 동일한 성분을 함유한다. 이들 봉입체는 질병 유발 단백질 응집체를 함유한다. 따라서, "세포성 분해불량"과 질병간에는 명백한 관계가 존재한다(Johnston J A, Ward C L, Kopito R R. Aggresomes: A Cellular Response to Misfolded Proteins. 1998. J of Cell Biology 143(7): 1883-1898; Kopito R R, Sitia R. Aggresomes and Russell Bodies. 2000. EMBO Reports 1(3): 225-231).
항체 국부화 및 TOR-2가 응집체를 감소시킬 수 있고, 부분 체벽 염색을 복원할 수 있다는 사실에 기초하여, 아마도 TOR-2가 유비퀴틴-프로테아좀 경로 및/또는 ER-관련된 분해에 관련되어 있음을 고려하는 것은 흥미로운 일이다. Q82와 함께 돌연변이 tor-2, TOR-2/Δ368의 동시발현은 야생형 TOR-2에서 확인되는 바와 같이 부분 확산 체벽 염색을 복원시킬 수 없고, 실제로 응집체를 악화시키는 것으로 보인다. 이는 상기 유전자의 이 부분인 올바른 작용을 위해 필수적이라는 이론을 지지한다. ER 국부화 신호, KDEL에 대한 상동성을 보유하는 tor-2의 NDEL 영역의 결실은 TOR-2/Δ368에서 확인할 수 있는 바와 같이, 응집체를 악화시키지 않는다(자료는 나타내지 않음). NDEL의 결실이 있는 경우, TOR-2는 아마도 ER 내에 유지되지 않으며, 세포질내로 자유롭게 될 것이다. 아마도, 이는 더 높은 농도로 존재하며, 응집체와 더 양호하게 상호작용할 것이다. 또한, 성장 분석 데이타는 "글루탐산 영역"이 성장을 위해 결정적임을 암시하는데, 그 이유는 이들 연충의 71%가 Q82 연충의 46%와 비교하여 알을 낳고 48시간후 L1/L2 단계에서 유지되기 때문이다.
상기 데이타는 분자 샤프롱으로서 TOR-2에 대한 역할을 지지한다. 또한, 상기 데이타는 TOR-A 및 ooc-5도 또한 분자 샤프롱임을 지지한다. 이는 토신 단백질의 하나 이상의 활성이 샤프롱 활성임을 나타내는 첫번째의 명백한 증거이다. 또한, 이들 토신 단백질은 생체 내에서 Q82 단백질 응집의 양을 명백히 감소시킨다.
TOR-A는 파킨슨병 환자의 레위(Lewy) 체 내에서 α-시누클레인과 동시국부화된다. 알파-시누클레인은 이들 봉입체 내에서 오폴딩된다. 토신은 단백질의 올바른 폴딩을 돕거나, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 오폴딩된 단백질의 분해를 돕는다. 항체 국부화가 응집체 주변의 조밀한 고리로서 토신 단백질을 나타낸다는 사실은 분해 역활 이상을 암시하는 것이다. 이는 Q82와 동시발현시 부분 체벽 염색을 복원시킬 수 있었는데, 이는 응집체가 제거되었음을 의미하는 것이다. 응집체가 여전히 존재함에도 불구하고, 이들은 Q82 단독과 비교시 더 작았다.
Q19 노화 분석 연구를 통해, 응집체는 시간이 경과함에 따라 악화되는 것으로 확인되었다. 이는 헌팅톤병과 같은 다수의 질병에서 사실로 확인되었으며, 헌팅톤병 환자는 시간 경과에 따라 악화되었다. 이 모델은 약물 요법을 위해 고려될 수 있다. TOR-2는 응집체를 감소시킬 수 있다. 또한, 이 모델은 TOR-2가 응집체의 크기를 기준 수준 및 안정한 수준으로 유지하면서, TOR-2/Δ368과 함께 동시발현된 응집체가 시간 경과에 따라 더 크게 성장하는 것을 확인하였다. 희망적이게도, TOR-2는 치료제로서 사용할 수 있다. 이는 징후를 완전히 경감시키지는 않지만, 시간 경과에 따라 환자의 상태를 악화시키는 대신에 환자의 상태를 안정한 수준으로 유지할 수 있다. 아마도, 증강된 효과는 TOR-1의 동시발현과 함께 관찰될 수 있는데, 그 이유는 이들이 복합체로 기능할 수 있기 때문이다.
어그리섬 이론과 조합된 데이타는 다수의 질병, 예를 들어 근긴장이상이 응집된 단백질에 대항하는 세포의 무능력의 결과인 것으로 제안되었다. 이들 세포 응집체는 다른 단백질에 영향을 미치며, 실제로 캐스케이드형 효과를 유발시킨다. 이는 해면체형 뇌질환와 같은 프리온 질병 이면의 메카니즘으로 생각된다. TOR-2Δ368 + Q82의 응집체 크기가 Q82 단독의 크기 보다 크다는 것은 돌연변이형이 다른 단백질의 오폴딩 및 응집체 형성의 출발점으로 기여할 수 있음을 의미한다. TOR-2는 세포 내에서 다차원 역할을 수행하며, 광범위하게 발현되는 것으로 생각된다.
본 발명에 대한 다수의 변형 및 변이는 상기 교시한 내용에 견주어 가능한 것들이다. 따라서, 이는 후술하는 특허청구의 범위내에 포함되며, 본 발명은 본원에 구체적으로 개시한 것과 다르게 실시할 수도 있다.
본원에 기재한 모든 특허 및 인용 문헌은 본 발명의 주제 및 관련 구체예에 관련된 것들이며, 전적으로 참고로 인용한 것임을 밝혀둔다.
SEQUENCE LISTING <110> CALDWELL, GUY CALDWELL, KIM <120> Use of Torsin Proteins to Ameliorate Protein Aggregation <130> 224040US23 <140> 10/177,104 <141> 2002-06-24 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1483 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 1 atgaaaaagt tcgctgaaaa atggtttcta ttgaaattta aattctatgt tcaatgtttc 60 tttatcttca aatttcgtta tcagtgcatc aatctatttt tcggtgtgat ttctcatgga 120 tattttgatg ttagcaagaa tacgcagata acaagcgaca tcttctgttc catttcattt 180 tcctttactt ctcacttgtc aaatattttg ttttattctg aaagaaagat gcaatttttt 240 aaatatatta ttttcgttat cattcttaat caattagtcg tcgatgtcca cagcttatca 300 atgccaatgt ttttaaaatg tttattttac acttgctgcg gtgaaacgga tatattcaat 360 tatcatggtg agtagcaata ttttaagaaa ttcagtcaaa attcagaaca ccatgcaaat 420 tgtttctaat gtaaaacaca gctatataca aattttgagt tgtgctccgt gataaggagc 480 atttttcgca cttttttttt tgatactttt gaaagaaaaa ccgtttattt tttaaatatt 540 tttctaaact ttacatttca gcgttataca aagatttcga taataaaatt ttcgggcagc 600 acttgatggc agaatctgta gttcattcaa tcaaatctca ttggcacaat gagcattctc 660 agaagccgct agttctctca tttcacggcg gaaccggcac tggaaagaat tatgtgactg 720 aaattattgt gaacaatact tatcggtaac ttttcattgc ttaaaatttt tttgagaaac 780 aagtttatgt tttagaagtg gaatgcacag cccatttgtg aattatttcg ttgcaacaaa 840 taattttccg aataaaaagt atattgagga ttataaattg gaactgaaag atcaacttat 900 aagatcggcc cgaagatgtc agcgatctat ttttatattt gatgagacgg ataagctaca 960 aagtgaattg attcaagtga tcaaaccatt tcttgattat tatccggcgg tctttggagt 1020 ggactttcgg aaaactatct tcatttttct aagcaacaaa gggagcaaag aaattgctaa 1080 tatcgcatta gaacatcatg aaaatggtaa aataagatca caactcgagt tgaagcattt 1140 tgaacgaaca ctgatgcttt ctgcattcaa tgaagaaggt ggtcttcgta acactgatat 1200 gatctctaat caacttattg atcattttat accatttctt cccttatcta agttctacgt 1260 ttcccagtgc attcaagtac atcttcgaaa acgcggaaga catgatttgg caaaggatgg 1320 agaattcatg caaagagttc ttgattctct tgaatttttc cctgaatcta gcaaaatatt 1380 ttcctcgtca ggatgtaaac gtgtgaatgc aaagactgat ctcgaaattt ccaagatggg 1440 attctcactc aattcgaaga aagagtttaa tgatgagttg tga 1483 <210> 2 <211> 412 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 2 Met Lys Lys Phe Ala Glu Lys Trp Phe Leu Leu Lys Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Val Gln Cys Phe Phe Ile Phe Lys Phe Arg Tyr Gln Cys Ile Asn Leu 20 25 30 Phe Phe Gly Val Ile Ser His Gly Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asn Thr 35 40 45 Gln Ile Thr Ser Asp Ile Phe Cys Ser Ile Ser Phe Ser Phe Thr Ser 50 55 60 His Leu Ser Asn Ile Leu Phe Tyr Ser Glu Arg Lys Met Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Ile Phe Val Ile Ile Leu Asn Gln Leu Val Val Asp Val 85 90 95 His Ser Leu Ser Met Pro Met Phe Leu Lys Cys Leu Phe Tyr Thr Cys 100 105 110 Cys Gly Glu Thr Asp Ile Phe Asn Tyr His Ala Leu Tyr Lys Asp Phe 115 120 125 Asp Asn Lys Ile Phe Gly Gln His Leu Met Ala Glu Ser Val Val His 130 135 140 Ser Ile Lys Ser His Trp His Asn Glu His Ser Gln Lys Pro Leu Val 145 150 155 160 Leu Ser Phe His Gly Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Val Thr Glu 165 170 175 Ile Ile Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Gly Met His Ser Pro Phe Val 180 185 190 Asn Tyr Phe Val Ala Thr Asn Asn Phe Pro Asn Lys Lys Tyr Ile Glu 195 200 205 Asp Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gln Leu Ile Arg Ser Ala Arg Arg 210 215 220 Cys Gln Arg Ser Ile Phe Ile Phe Asp Glu Thr Asp Lys Leu Gln Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Gln Val Ile Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Tyr Pro Ala Val 245 250 255 Phe Gly Val Asp Phe Arg Lys Thr Ile Phe Ile Phe Leu Ser Asn Lys 260 265 270 Gly Ser Lys Glu Ile Ala Asn Ile Ala Leu Glu His His Glu Asn Gly 275 280 285 Lys Ile Arg Ser Gln Leu Glu Leu Lys His Phe Glu Arg Thr Leu Met 290 295 300 Leu Ser Ala Phe Asn Glu Glu Gly Gly Leu Arg Asn Thr Asp Met Ile 305 310 315 320 Ser Asn Gln Leu Ile Asp His Phe Ile Pro Phe Leu Pro Leu Ser Lys 325 330 335 Phe Tyr Val Ser Gln Cys Ile Gln Val His Leu Arg Lys Arg Gly Arg 340 345 350 His Asp Leu Ala Lys Asp Gly Glu Phe Met Gln Arg Val Leu Asp Ser 355 360 365 Leu Glu Phe Phe Pro Glu Ser Ser Lys Ile Phe Ser Ser Ser Gly Cys 370 375 380 Lys Arg Val Asn Ala Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ser Lys Met Gly Phe 385 390 395 400 Ser Leu Asn Ser Lys Lys 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tttgagaaac 780 aagtttatgt tttagaagtg gaatgcacag cccatttgtg aattatttcg ttgcaacaaa 840 taattttccg aataaaaagt atattgagga ttataaattg gaactgaaag atcaacttat 900 aagatcggcc cgaagatgtc agcgatctat ttttatattt gatgagacgg ataagctaca 960 aagtgaattg attcaagtga tcaaaccatt tcttgattat tatccggcgg tctttggagt 1020 ggactttcgg aaaactatct tcatttttct aagcaacaaa gggagcaaag aaattgctaa 1080 tatcgcatta gaacatcatg aaaatggtaa aataagatca caactcgagt tgaagcattt 1140 tgaacgaaca ctgatgcttt ctgcattcaa tgaagaaggt ggtcttcgta acactgatat 1200 gatctctaat caacttattg atcattttat accatttctt cccttatcta agttctacgt 1260 ttcccagtgc attcaagtac atcttcgaaa acgcggaaga catgatttgg caaaggatgg 1320 agaattcatg caaagagttc ttgattctct tgaatttttc cctgaatcta gcaaaatatt 1380 ttcctcgtca ggatgtaaac gtgtgaatgc aaagactgat ctcgaaattt ccaagatggg 1440 attctcactc aattcgaaga aagagtttaa tgatgagttg tga 1483 <210> 4 <211> 412 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 4 Met Lys Lys Phe Ala Glu Lys Trp Phe Leu Leu Lys Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Val Gln Cys Phe Phe Ile Phe Lys Phe Arg Tyr Gln Cys Ile Asn Leu 20 25 30 Phe Phe Gly Val Ile Ser His Gly Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asn Thr 35 40 45 Gln Ile Thr Ser Asp Ile Phe Cys Ser Ile Ser Phe Ser Phe Thr Ser 50 55 60 His Leu Ser Asn Ile Leu Phe Tyr Ser Glu Arg Lys Met Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Ile Phe Val Ile Ile Leu Asn Gln Leu Val Val Asp Val 85 90 95 His Ser Leu Ser Met Pro Met Phe Leu Lys Cys Leu Phe Tyr Thr Cys 100 105 110 Cys Gly Glu Thr Asp Ile Phe Asn Tyr His Ala Leu Tyr Lys Asp Phe 115 120 125 Asp Asn Lys Ile Phe Gly Gln His Leu Met Ala Glu Ser Val Val His 130 135 140 Ser Ile Lys Ser His Trp His Asn Glu His Ser Gln Lys Pro Leu Val 145 150 155 160 Leu Ser Phe His Gly Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Val Thr Glu 165 170 175 Ile Ile Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Gly Met His Ser Pro Phe Val 180 185 190 Asn Tyr Phe Val Ala Thr Asn Asn Phe Pro Asn Lys Lys Tyr Ile Glu 195 200 205 Asp Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gln Leu Ile Arg Ser Ala Arg Arg 210 215 220 Cys Gln Arg Ser Ile Phe Ile Phe Asp Glu Thr Asp Lys Leu Gln Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Gln Val Ile Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Tyr Pro Ala Val 245 250 255 Phe Gly Val Asp Phe Arg Lys Thr Ile Phe Ile Phe Leu Ser Asn Lys 260 265 270 Gly Ser Lys Glu Ile Ala Asn Ile Ala Leu Glu His His Glu Asn Gly 275 280 285 Lys Ile Arg Ser Gln Leu Glu Leu Lys His Phe Glu Arg Thr Leu Met 290 295 300 Leu Ser Ala Phe Asn Glu Glu Gly Gly Leu Arg Asn Thr Asp Met Ile 305 310 315 320 Ser Asn Gln Leu Ile Asp His Phe Ile Pro Phe Leu Pro Leu Ser Lys 325 330 335 Phe Tyr Val Ser Gln Cys Ile Gln Val His Leu Arg Lys Arg Gly Arg 340 345 350 His Asp Leu Ala Lys Asp Gly Glu Phe Met Gln Arg Val Leu Asp Ser 355 360 365 Leu Glu Phe Phe Pro Glu Ser Ser Lys Ile Phe Ser Ser Ser Gly Cys 370 375 380 Lys Arg Val Asn Ala Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ser Lys Met Gly Phe 385 390 395 400 Ser Leu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Asn Asp Glu Leu 405 410 <210> 5 <211> 1483 <212> DNA <213> Caenorhabditis elegans <400> 5 atgaaaaagt tcgctgaaaa atggtttcta ttgaaattta aattctatgt tcaatgtttc 60 tttatcttca aatttcgtta tcagtgcatc aatctatttt tcggtgtgat ttctcatgga 120 tattttgatg ttagcaagaa tacgcagata acaagcgaca tcttctgttc catttcattt 180 tcctttactt ctcacttgtc aaatattttg ttttattctg aaagaaagat gcaatttttt 240 aaatatatta ttttcgttat cattcttaat caattagtcg tcgatgtcca cagcttatca 300 atgccaatgt ttttaaaatg tttattttac acttgctgcg gtgaaacgga tatattcaat 360 tatcatggtg agtagcaata ttttaagaaa ttcagtcaaa attcagaaca ccatgcaaat 420 tgtttctaat gtaaaacaca gctatataca aattttgagt tgtgctccgt gataaggagc 480 atttttcgca cttttttttt tgatactttt gaaagaaaaa ccgtttattt tttaaatatt 540 tttctaaact ttacatttca gcgttataca aagatttcga taataaaatt ttcgggcagc 600 acttgatggc agaatctgta gttcattcaa tcaaatctca ttggcacaat gagcattctc 660 agaagccgct agttctctca tttcacggcg gaaccggcac tggaaagaat tatgtgactg 720 aaattattgt gaacaatact tatcggtaac ttttcattgc ttaaaatttt tttgagaaac 780 aagtttatgt tttagaagtg gaatgcacag cccatttgtg aattatttcg ttgcaacaaa 840 taattttccg aataaaaagt atattgagga ttataaattg gaactgaaag atcaacttat 900 aagatcggcc cgaagatgtc agcgatctat ttttatattt gatgagacgg ataagctaca 960 aagtgaattg attcaagtga tcaaaccatt tcttgattat tatccggcgg tctttggagt 1020 ggactttcgg aaaactatct tcatttttct aagcaacaaa gggagcaaag aaattgctaa 1080 tatcgcatta gaacatcatg aaaatggtaa aataagatca caactcgagt tgaagcattt 1140 tgaacgaaca ctgatgcttt ctgcattcaa tgaagaaggt ggtcttcgta acactgatat 1200 gatctctaat caacttattg atcattttat accatttctt cccttatcta agttctacgt 1260 ttcccagtgc attcaagtac atcttcgaaa acgcggaaga catgatttgg caaaggatgg 1320 agaattcatg caaagagttc ttgattctct tgaatttttc cctgaatcta gcaaaatatt 1380 ttcctcgtca ggatgtaaac gtgtgaatgc aaagactgat ctcgaaattt ccaagatggg 1440 attctcactc aattcgaaga aagagtttaa tgatgagttg tga 1483 <210> 6 <211> 412 <212> PRT <213> Caenorhabditis elegans <400> 6 Met Lys Lys Phe Ala Glu Lys Trp Phe Leu Leu Lys Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Val Gln Cys Phe Phe Ile Phe Lys Phe Arg Tyr Gln Cys Ile Asn Leu 20 25 30 Phe Phe Gly Val Ile Ser His Gly Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asn Thr 35 40 45 Gln Ile Thr Ser Asp Ile Phe Cys Ser Ile Ser Phe Ser Phe Thr Ser 50 55 60 His Leu Ser Asn Ile Leu Phe Tyr Ser Glu Arg Lys Met Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Ile Phe Val Ile Ile Leu Asn Gln Leu Val Val Asp Val 85 90 95 His Ser Leu Ser Met Pro Met Phe Leu Lys Cys Leu Phe Tyr Thr Cys 100 105 110 Cys Gly Glu Thr Asp Ile Phe Asn Tyr His Ala Leu Tyr Lys Asp Phe 115 120 125 Asp Asn Lys Ile Phe Gly Gln His Leu Met Ala Glu Ser Val Val His 130 135 140 Ser Ile Lys Ser His Trp His Asn Glu His Ser Gln Lys Pro Leu Val 145 150 155 160 Leu Ser Phe His Gly Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Val Thr Glu 165 170 175 Ile Ile Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Gly Met His Ser Pro Phe Val 180 185 190 Asn Tyr Phe Val Ala Thr Asn Asn Phe Pro Asn Lys Lys Tyr Ile Glu 195 200 205 Asp Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gln Leu Ile Arg Ser Ala Arg Arg 210 215 220 Cys Gln Arg Ser Ile Phe Ile Phe Asp Glu Thr Asp Lys Leu Gln Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Gln Val Ile Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Tyr Pro Ala Val 245 250 255 Phe Gly Val Asp Phe Arg Lys Thr Ile Phe Ile Phe Leu Ser Asn Lys 260 265 270 Gly Ser Lys Glu Ile Ala Asn Ile Ala Leu Glu His His Glu Asn Gly 275 280 285 Lys Ile Arg Ser Gln Leu Glu Leu Lys His Phe Glu Arg Thr Leu Met 290 295 300 Leu Ser Ala Phe Asn Glu Glu Gly Gly Leu Arg Asn Thr Asp Met Ile 305 310 315 320 Ser Asn Gln Leu Ile Asp His Phe Ile Pro Phe Leu Pro Leu Ser Lys 325 330 335 Phe Tyr Val Ser Gln Cys Ile Gln Val His Leu Arg Lys Arg Gly Arg 340 345 350 His Asp Leu Ala Lys Asp Gly Glu Phe Met Gln Arg Val Leu Asp Ser 355 360 365 Leu Glu Phe Phe Pro Glu Ser Ser Lys Ile Phe Ser Ser Ser Gly Cys 370 375 380 Lys Arg Val Asn Ala Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ser Lys Met Gly Phe 385 390 395 400 Ser Leu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Asn Asp Glu Leu 405 410 <210> 7 <211> 1483 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgaaaaagt tcgctgaaaa atggtttcta ttgaaattta aattctatgt tcaatgtttc 60 tttatcttca aatttcgtta tcagtgcatc aatctatttt tcggtgtgat ttctcatgga 120 tattttgatg ttagcaagaa tacgcagata acaagcgaca tcttctgttc catttcattt 180 tcctttactt ctcacttgtc aaatattttg ttttattctg aaagaaagat gcaatttttt 240 aaatatatta ttttcgttat cattcttaat caattagtcg tcgatgtcca cagcttatca 300 atgccaatgt ttttaaaatg tttattttac acttgctgcg gtgaaacgga tatattcaat 360 tatcatggtg agtagcaata ttttaagaaa ttcagtcaaa attcagaaca ccatgcaaat 420 tgtttctaat gtaaaacaca gctatataca aattttgagt tgtgctccgt gataaggagc 480 atttttcgca cttttttttt tgatactttt gaaagaaaaa ccgtttattt tttaaatatt 540 tttctaaact ttacatttca gcgttataca aagatttcga taataaaatt ttcgggcagc 600 acttgatggc agaatctgta gttcattcaa tcaaatctca ttggcacaat gagcattctc 660 agaagccgct agttctctca tttcacggcg gaaccggcac tggaaagaat tatgtgactg 720 aaattattgt gaacaatact tatcggtaac ttttcattgc ttaaaatttt tttgagaaac 780 aagtttatgt tttagaagtg gaatgcacag cccatttgtg aattatttcg ttgcaacaaa 840 taattttccg aataaaaagt atattgagga ttataaattg gaactgaaag atcaacttat 900 aagatcggcc cgaagatgtc agcgatctat ttttatattt gatgagacgg ataagctaca 960 aagtgaattg attcaagtga tcaaaccatt tcttgattat tatccggcgg tctttggagt 1020 ggactttcgg aaaactatct tcatttttct aagcaacaaa gggagcaaag aaattgctaa 1080 tatcgcatta gaacatcatg aaaatggtaa aataagatca caactcgagt tgaagcattt 1140 tgaacgaaca ctgatgcttt ctgcattcaa tgaagaaggt ggtcttcgta acactgatat 1200 gatctctaat caacttattg atcattttat accatttctt cccttatcta agttctacgt 1260 ttcccagtgc attcaagtac atcttcgaaa acgcggaaga catgatttgg caaaggatgg 1320 agaattcatg caaagagttc ttgattctct tgaatttttc cctgaatcta gcaaaatatt 1380 ttcctcgtca ggatgtaaac gtgtgaatgc aaagactgat ctcgaaattt ccaagatggg 1440 attctcactc aattcgaaga aagagtttaa tgatgagttg tga 1483 <210> 8 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Lys Lys Phe Ala Glu Lys Trp Phe Leu Leu Lys Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Val Gln Cys Phe Phe Ile Phe Lys Phe Arg Tyr Gln Cys Ile Asn Leu 20 25 30 Phe Phe Gly Val Ile Ser His Gly Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asn Thr 35 40 45 Gln Ile Thr Ser Asp Ile Phe Cys Ser Ile Ser Phe Ser Phe Thr Ser 50 55 60 His Leu Ser Asn Ile Leu Phe Tyr Ser Glu Arg Lys Met Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Ile Phe Val Ile Ile Leu Asn Gln Leu Val Val Asp Val 85 90 95 His Ser Leu Ser Met Pro Met Phe Leu Lys Cys Leu Phe Tyr Thr Cys 100 105 110 Cys Gly Glu Thr Asp Ile Phe Asn Tyr His Ala Leu Tyr Lys Asp Phe 115 120 125 Asp Asn Lys Ile Phe Gly Gln His Leu Met Ala Glu Ser Val Val His 130 135 140 Ser Ile Lys Ser His Trp His Asn Glu His Ser Gln Lys Pro Leu Val 145 150 155 160 Leu Ser Phe His Gly Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Val Thr Glu 165 170 175 Ile Ile Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Gly Met His Ser Pro Phe Val 180 185 190 Asn Tyr Phe Val Ala Thr Asn Asn Phe Pro Asn Lys Lys Tyr Ile Glu 195 200 205 Asp Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gln Leu Ile Arg Ser Ala Arg Arg 210 215 220 Cys Gln Arg Ser Ile Phe Ile Phe Asp Glu Thr Asp Lys Leu Gln Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Gln Val Ile Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Tyr Pro Ala Val 245 250 255 Phe Gly Val Asp Phe Arg Lys Thr Ile Phe Ile Phe Leu Ser Asn Lys 260 265 270 Gly Ser Lys Glu Ile Ala Asn Ile Ala Leu Glu His His Glu Asn Gly 275 280 285 Lys Ile Arg Ser Gln Leu Glu Leu Lys His Phe Glu Arg Thr Leu Met 290 295 300 Leu Ser Ala Phe Asn Glu Glu Gly Gly Leu Arg Asn Thr Asp Met Ile 305 310 315 320 Ser Asn Gln Leu Ile Asp His Phe Ile Pro Phe Leu Pro Leu Ser Lys 325 330 335 Phe Tyr Val Ser Gln Cys Ile Gln Val His Leu Arg Lys Arg Gly Arg 340 345 350 His Asp Leu Ala Lys Asp Gly Glu Phe Met Gln Arg Val Leu Asp Ser 355 360 365 Leu Glu Phe Phe Pro Glu Ser Ser Lys Ile Phe Ser Ser Ser Gly Cys 370 375 380 Lys Arg Val Asn Ala Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ser Lys Met Gly Phe 385 390 395 400 Ser Leu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Asn Asp Glu Leu 405 410 <210> 9 <211> 1483 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgaaaaagt tcgctgaaaa atggtttcta ttgaaattta aattctatgt tcaatgtttc 60 tttatcttca aatttcgtta tcagtgcatc aatctatttt tcggtgtgat ttctcatgga 120 tattttgatg ttagcaagaa tacgcagata acaagcgaca tcttctgttc catttcattt 180 tcctttactt ctcacttgtc aaatattttg ttttattctg aaagaaagat gcaatttttt 240 aaatatatta ttttcgttat cattcttaat caattagtcg tcgatgtcca cagcttatca 300 atgccaatgt ttttaaaatg tttattttac acttgctgcg gtgaaacgga tatattcaat 360 tatcatggtg agtagcaata ttttaagaaa ttcagtcaaa attcagaaca ccatgcaaat 420 tgtttctaat gtaaaacaca gctatataca aattttgagt tgtgctccgt gataaggagc 480 atttttcgca cttttttttt tgatactttt gaaagaaaaa ccgtttattt tttaaatatt 540 tttctaaact ttacatttca gcgttataca aagatttcga taataaaatt ttcgggcagc 600 acttgatggc agaatctgta gttcattcaa tcaaatctca ttggcacaat gagcattctc 660 agaagccgct agttctctca tttcacggcg gaaccggcac tggaaagaat tatgtgactg 720 aaattattgt gaacaatact tatcggtaac ttttcattgc ttaaaatttt tttgagaaac 780 aagtttatgt tttagaagtg gaatgcacag cccatttgtg aattatttcg ttgcaacaaa 840 taattttccg aataaaaagt atattgagga ttataaattg gaactgaaag atcaacttat 900 aagatcggcc cgaagatgtc agcgatctat ttttatattt gatgagacgg ataagctaca 960 aagtgaattg attcaagtga tcaaaccatt tcttgattat tatccggcgg tctttggagt 1020 ggactttcgg aaaactatct tcatttttct aagcaacaaa gggagcaaag aaattgctaa 1080 tatcgcatta gaacatcatg aaaatggtaa aataagatca caactcgagt tgaagcattt 1140 tgaacgaaca ctgatgcttt ctgcattcaa tgaagaaggt ggtcttcgta acactgatat 1200 gatctctaat caacttattg atcattttat accatttctt cccttatcta agttctacgt 1260 ttcccagtgc attcaagtac atcttcgaaa acgcggaaga catgatttgg caaaggatgg 1320 agaattcatg caaagagttc ttgattctct tgaatttttc cctgaatcta gcaaaatatt 1380 ttcctcgtca ggatgtaaac gtgtgaatgc aaagactgat ctcgaaattt ccaagatggg 1440 attctcactc aattcgaaga aagagtttaa tgatgagttg tga 1483 <210> 10 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Lys Lys Phe Ala Glu Lys Trp Phe Leu Leu Lys Phe Lys Phe Tyr 1 5 10 15 Val Gln Cys Phe Phe Ile Phe Lys Phe Arg Tyr Gln Cys Ile Asn Leu 20 25 30 Phe Phe Gly Val Ile Ser His Gly Tyr Phe Asp Val Ser Lys Asn Thr 35 40 45 Gln Ile Thr Ser Asp Ile Phe Cys Ser Ile Ser Phe Ser Phe Thr Ser 50 55 60 His Leu Ser Asn Ile Leu Phe Tyr Ser Glu Arg Lys Met Gln Phe Phe 65 70 75 80 Lys Tyr Ile Ile Phe Val Ile Ile Leu Asn Gln Leu Val Val Asp Val 85 90 95 His Ser Leu Ser Met Pro Met Phe Leu Lys Cys Leu Phe Tyr Thr Cys 100 105 110 Cys Gly Glu Thr Asp Ile Phe Asn Tyr His Ala Leu Tyr Lys Asp Phe 115 120 125 Asp Asn Lys Ile Phe Gly Gln His Leu Met Ala Glu Ser Val Val His 130 135 140 Ser Ile Lys Ser His Trp His Asn Glu His Ser Gln Lys Pro Leu Val 145 150 155 160 Leu Ser Phe His Gly Gly Thr Gly Thr Gly Lys Asn Tyr Val Thr Glu 165 170 175 Ile Ile Val Asn Asn Thr Tyr Arg Ser Gly Met His Ser Pro Phe Val 180 185 190 Asn Tyr Phe Val Ala Thr Asn Asn Phe Pro Asn Lys Lys Tyr Ile Glu 195 200 205 Asp Tyr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gln Leu Ile Arg Ser Ala Arg Arg 210 215 220 Cys Gln Arg Ser Ile Phe Ile Phe Asp Glu Thr Asp Lys Leu Gln Ser 225 230 235 240 Glu Leu Ile Gln Val Ile Lys Pro Phe Leu Asp Tyr Tyr Pro Ala Val 245 250 255 Phe Gly Val Asp Phe Arg Lys Thr Ile Phe Ile Phe Leu Ser Asn Lys 260 265 270 Gly Ser Lys Glu Ile Ala Asn Ile Ala Leu Glu His His Glu Asn Gly 275 280 285 Lys Ile Arg Ser Gln Leu Glu Leu Lys His Phe Glu Arg Thr Leu Met 290 295 300 Leu Ser Ala Phe Asn Glu Glu Gly Gly Leu Arg Asn Thr Asp Met Ile 305 310 315 320 Ser Asn Gln Leu Ile Asp His Phe Ile Pro Phe Leu Pro Leu Ser Lys 325 330 335 Phe Tyr Val Ser Gln Cys Ile Gln Val His Leu Arg Lys Arg Gly Arg 340 345 350 His Asp Leu Ala Lys Asp Gly Glu Phe Met Gln Arg Val Leu Asp Ser 355 360 365 Leu Glu Phe Phe Pro Glu Ser Ser Lys Ile Phe Ser Ser Ser Gly Cys 370 375 380 Lys Arg Val Asn Ala Lys Thr Asp Leu Glu Ile Ser Lys Met Gly Phe 385 390 395 400 Ser Leu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Asn Asp Glu Leu 405 410

Claims (61)

  1. 서열 번호 1 또는 서열 번호 3을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  3. 제1항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  4. 토신(torsin) 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건 하에 일정 기간 동안 제3항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 토신 폴리펩티드의 제조 방법.
  5. 제1항의 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  6. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이.
  7. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자.
  8. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스게닉 동물.
  9. 제1항의 폴리뉴클레오티드와 90% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항의 폴리뉴클레오티드와 80% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항의 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제11항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  14. 토신 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건 하에 일정 기간 동안 제13항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 토신 폴리펩티드의 제조 방법.
  15. 제11항의 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  16. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이.
  17. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자.
  18. 제11항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스게닉 동물.
  19. 0.1 X SSC 및 0.1% SDS를 포함하는 완충액의 존재 하에 65℃에서 토신 활성을 보유하는 제11항의 분리된 폴리뉴클레오티드 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체의 15개 이상의 뉴클레오티드에 하이브리드화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  20. 토신 활성을 보유하고 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대한 상동성이 70% 이상인 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법으로서,
    (a) 제11항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 하이브리드화시키는 단계;
    (b) 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 폴리펩티드를 형성하는 단계;
    (c) 폴리펩티드의 토신 활성의 존재 또는 부재를 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  21. 토신 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법으로서, 토신 활성을 보유하는 제11항의 폴리뉴클레오티드 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  22. 토신 활성을 보유하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법으로서, 토신 활성을 보유하는 제11항의 폴리뉴클레오티드 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드, 또는 이의 상보체의 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  23. 단백질 응집 감소를 필요로 하는 인간 또는 동물에게 제11항의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 생체내 또는 시험관내 단백질 응집의 감소 방법.
  24. 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 제11항의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병의 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 폴리글루타민병, 타우병(Tauopathy), 헌팅톤병, 근긴장이상 및 가족성 근위축 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택하는 것인 방법.
  26. 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병 증상의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 제11항의 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병 증상의 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 폴리글루타민병, 타우병, 헌팅톤병, 근긴장이상 및 가족성 근위축 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택하는 것인 방법.
  28. 서열 번호 2 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  29. 제28항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  30. 제28항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포.
  31. 토신 폴리펩티드의 발현에 적절한 조건 하에 일정 기간 동안 제30항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 토신 폴리펩티드의 제조 방법.
  32. 제28항의 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  33. 제28항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이.
  34. 제28항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 나노입자.
  35. 제28항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스게닉 동물.
  36. 서열 번호 2 또는 서열 번호 4를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  37. 제36항의 분리된 폴리펩티드와 결합하는 분리된 항체.
  38. 제36항의 폴리펩티드와 90% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  39. 제36항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 트랜스게닉 동물.
  40. 제38항의 분리된 폴리펩티드와 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  41. 제36항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 마이크로어레이.
  42. 제36항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 나노입자.
  43. 제36항의 폴리펩티드와 80% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  44. 제36항의 폴리펩티드와 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
  45. 제44항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 트랜스게닉 동물.
  46. 제44항의 분리된 폴리펩티드와 하나 이상의 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  47. 제44항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 마이크로어레이.
  48. 제44항의 분리된 폴리펩티드를 포함하는 나노입자.
  49. 제44항의 분리된 폴리펩티드와 결합하는 분리된 항체.
  50. 단백질 응집 감소가 필요한 인간 또는 동물에게 제44항의 분리된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 단백질 응집을 감소시키는 방법.
  51. 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 제44항의 분리된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병의 치료 방법.
  52. 제51항에 있어서, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 폴리글루타민병, 타우병, 헌팅톤병, 근긴장이상 및 가족성 근위축 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택하는 것인 방법.
  53. 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병 증상의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 제44항의 분리된 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병 증상의 치료 방법.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 폴리글루타민병, 타우병, 헌팅톤병, 근긴장이상 및 가족성 근위축 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택하는 것인 방법.
  55. 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 분리된 폴리펩티드의 유기체 중에서의 발현을 조절하는 방법으로서, 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 서열 번호 7 또는 서열 번호 9와 70% 이상 동일한 핵산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 상기 유기체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 하나 이상의 분리된 폴리펩티드를 C.엘레간스(C.elegans)에게 투여하는 것인 방법.
  57. 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 단백질 응집 감소가 필요한 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 단백질 응집을 감소시키는 방법.
  58. 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 단백질-응집 관련 질병의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병의 치료 방법.
  59. 제58항에 있어서, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 폴리글루타민병, 타우병, 헌팅톤병, 근긴장이상 및 가족성 근위축 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택하는 것인 방법.
  60. 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8 또는 서열 번호 10과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 단백질-응집 관련 질병 증상의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병 증상의 치료 방법.
  61. 제60항에 있어서, 하나 이상의 단백질-응집 관련 질병은 알츠하이머병, 파킨슨병, 프리온병, 폴리글루타민병, 타우병, 헌팅톤병, 근긴장이상 및 가족성 근위축 측삭 경화증으로 구성된 군에서 선택하는 것인 방법.
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