KR20050012281A - 대사 표현형 확인 방법 - Google Patents

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KR20050012281A
KR20050012281A KR20047020355A KR20047020355A KR20050012281A KR 20050012281 A KR20050012281 A KR 20050012281A KR 20047020355 A KR20047020355 A KR 20047020355A KR 20047020355 A KR20047020355 A KR 20047020355A KR 20050012281 A KR20050012281 A KR 20050012281A
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에버렛제레미램지
린든존크리스토퍼
니콜슨제레미커크
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화이자 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은, 투여 성분을 투여하기 전에 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터를 수득하고; 투여 성분을 투여한 후에 다수의 개체에 관련된 투여후 데이터를 수득하며; 투여전 데이터의 개체간 변화와 투여후 데이터의 개체간 변화의 상관관계를 밝히고; 관찰된 상관관계에 기초하여 투여 전으로부터 투여 후를 예측하는 모델을 제작함을 포함하는, 시험 성분을 개체에 투여하지 않고서 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 특징짓거나, 또는 투여하지 않고도 대사 표현형에 따라 달라지는 개체의 투여후 반응을 예측하는 모델을 제작하는 방법에 관한 것이다. 이 모델을 사용하여, 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 결정하거나 또는 투여하지 않고도 개체의 투여후 반응을 예측할 수 있다. 관심있는 생화학적 전환 또는 경로를 조사하는 특정 성분을 투여할 때 다수의 개체에 대한 투여전 데이터와 투여후 데이터의 상관관계를 설명하는 모델과 관련하여 투여되지 않은 개체에 대한 데이터를 분석하고; 모델의 소정 기준에 따라, 투여되지 않은 개체의 대사 표현형을 설명하는 수치 척도 또는 분류법을 생성시킴으로써, 이를 달성한다.

Description

대사 표현형 확인 방법{METABOLIC PHENOTYPING}
생화학적 반응
생물체의 전체적인 '대사 표현형'은 그의 대사 특질의 총합으로서, 그의 유전 조성물과 가능한 가장 넓은 의미의 '환경'의 상호작용에 의해 결정된다. 용어 '대사 표현형'은 또한 생물체의 대사 특징의 개별 양상에도 적용될 수 있다.
살아있는 생물체에서는 방대한 수의 생화학적 반응(대사 전환)이 일어나며, 이들 반응중 압도적인 대다수는 효소에 의해 촉진된다.
효소는 생화학적 반응을 촉진시키는 생화학적 촉매로서 작용하는 특수한 단백질이다. 효소 없이는 정상적인 세포 활동에 필요한 반응중 다수가 통상적인 신체 pH 및 체온에서 충분히 빨리 진행되지 못한다. 촉매로서, 효소는 반응 속도를 증가시키지만 반응 후 변화되지 않은 채 회수된다.
효소에 의해 작용을 받는 분자는 '기질'이라 하고, 효소는 특정 기질에 대해 더 큰 특이성을 나타낸다(예를 들어, 글루코즈 옥시다제는 글루코즈를 산화시키지만, 갈락토즈는 산화시키지 않는다). 이러한 특이성은 효소 표면상의 기질-결합 부위에 의해 결정된다. 이 부위는 하나 이상의 기질에 대해 우선적인 결합능을 부여하는 아미노산의 특정 배열이다. 몇몇 효소는 광범위한 기질 특이성을 갖는 반면, 다른 효소는 개별 성분에 대해 특이적이다. 따라서, 예컨대 글루코즈, 만노즈 및 프럭토즈는 모두 헥소키나제에 의해 포스포릴화되지만, 글루코키나제는 글루코즈에 대해 특이적이다.
국제 생화학 및 분자 생물학 연합(The International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB)에서는 다음과 같은 6가지의 주요한 효소 부류를 갖는 효소 분류 시스템을 확립하였다:
1. 옥시도리덕타제
2. 트랜스퍼라제
3. 하이드롤라제
4. 리아제
5. 아이소머라제
6. 리가제
이들 개별적인 부류 각각은 개별적인 효소가 속하는 하위 부류로 더 나뉘어진다. 충분한 세부사항은 현재 전세계적인 웹(http://chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme) 상에서 입수할 수 있다.
예로서, 구아니디노아세테이트 N-메틸 트랜스퍼라제(EC 2.1.1.2)는 S-아데노실-L-메티오닌 및 구아니디노아세테이트의 S-아데노실-L-호모시스테인 및 크레아틴으로의 전환에 촉매 작용을 한다. 이는 메틸 트랜스퍼라제의 예이다.
효소가 촉매 작용을 하는 반응의 속도에 영향을 끼칠 수 있는 인자는 존재하는 기질의 양, 존재하는 생성물의 양, 존재하는 효소의 양 및 각 효소 분자의 활성을 포함한다. 효소 분자의 활성은 그의 고유 활성, 보조 인자 및 보충 기의 존재를 비롯한 다양한 인자에 의해, 또한 알로스테릭(allosteric) 부위에서 결합함으로써 영향을 받을 수 있다. 효소의 양 및 효소 분자당 활성은 둘 다 개체간의 유전자 변화에 의해 영향을 받을 수 있다. 효소의 양 및 분자당 활성이 조합되어 전체적인 효소 활성이 제공되며, 이는 상이한 개체 사이에서 상당히 다를 수 있다. 이러한 변화는 상이한 효소 및 대사 전환의 전체 범위에 독립적으로 영향을 끼칠 수 있으며, 이러한 변화는 각 개체의 상이한 전체 대사 표현형의 발생에 기여하게 된다. 생화학적 전환이 일어나도록 하는데 필요한 임의의 다른 성분의 양의 변화도 대사 표현형에 기여한다. 예를 들어, UDP-글루쿠론산(UDPGA)의 수준 면에서의 개체간 변화에 의해, 약물 글루쿠론산 분해를 수행하는 개체의 능력 변화가 야기될 수 있다.
전형적으로는 효소가 촉매 작용을 하는 반응 면에서 대사 표현형을 고려하지만, 가장 넓은 의미의 대사 표현형은 또한 특정 유형의 개체 내에서 발생되는 비-효소 반응 각각에 관련된 정도를 포함한다. 또한, 개체의 전체적인 대사 표현형은 그 개체 내에 또는 그 개체상에서 살고 있는 다른 생물체(예: 장의 세균)의 성질 및 양에 의해 영향을 받는다. 중요하게는, 개체의 유전자형은 그 개체의 일생 전체에 걸쳐 동일하지만, 개체의 전체적인 대사 표현형은 연령에 따라, 또한 질병, 감염 및 영양 상태 같은 다른 '환경적' 영향에 따라 상당히 변화될 수 있다.
대사 표현형의 변화는 약물 같은 생체 이물의 대사시 개체간 차이를 야기한다. 이러한 대사 차이는 활성 성분(들)에의 노출 정도를 상이하게 할 수 있는 바,투여된 성분에 대해 차이를 나타내는 반응(예컨대, 효능의 정도, 독성의 정도 등)에 기여하는 주요 인자이다. 따라서, 예를 들어, 독성 성분을 비독성 대사산물로 신속하게 대사시키면 신속한 해독이 이루어지는 반면, 독소의 대사가 늦으면 독성 효과를 나타낼 가능성이 높아진다. 반대로, 효험이 있는 성분 또는 약물의 유도체를 빨리 대사시키면 치료 효능이 감소될 수 있다. 투여된 성분에 대한 반응의 차이에 기여하는 다른 인자는 장으로부터의 흡수 면에서 개체간 차이 및 수용체의 민감성 차이를 포함한다. 독성 물질에 대한 감수성 및 반응의 유전적 변화는 문헌[Toxicology Letters (2001) Vol 120, "독성 물질에 대한 감수성 및 반응의 유전적 변화"란 제목의 논문, 잉겔맨-선드버그(Ingelman-Sundberg)(페이지 259-268) 및 밀러(Miller) 등(페이지 269-180)]에서 검토된 바 있다. 인간의 약물 대사에서의 개인간 변화는 문헌["인간의 약물 대사에서의 개인간 변화", 파시피시 및 펠코넨 편집, Taylor & Francis 출판 (2001)]의 주제이다.
체액 및 대사 표현형 변화의 효과
세포내액의 생화학적 조성의 양상은 세포외 조직액 및 결과적으로 그 조직과 접촉하는 순환되는 혈액에 반영된다. 그러므로, 세포액의 생화학적 조성의 변화는 세포외 조직액의 생화학적 조성 및 혈액의 생화학적 조성에 영향을 끼치기 쉽다. 혈액 조성의 변화는 다시 변화된 뇨 조성에 반영될 수 있다. 따라서, 비정상적인 세포 대사 과정은 생체 유체(예: 혈액 및 뇨)의 변화된 조성에 반영될 수 있으며, 결과적으로 이들 유체는 신체 상태에 대한 진단 창구를 제공한다. 이러한 유체에서의 주요한 변화는 흔히 독소(예: 간 또는 신장 독소)가 투여될 때 야기되며, 주요 효소 결핍 같은 내재적인 인자도 이러한 유체로부터 확인될 수 있다. 그러므로, 예를 들어 전통적인 페닐케톤뇨증에서는, 페닐알라닌 하이드록실라제의 결핍으로 인해 페닐알라닌을 티로신으로 전환시키지 못하게 되고, 페닐피루브산, 페닐락트산 및 페닐아세트산의 수준이 증가된 변화된 뇨 조성을 생성시키게 된다(문헌[Textbook of Biochemistry With Clinical Correlation, 제4판, 1997, 데블린 편집, Wiley-Liss 출판] 참조). 이는 유전적으로 결정된 대사 이상의 예이며, 이러한 질환은 "선천성 대사 이상"으로 알려져 있다(예를 들어, 뉴숄름(Newsholme) 및 리치(Leech)의 문헌[1983, Biochemistry for the Medical Sciences, John Wiley and Sons 출판] 참조). 기재된 뇨의 변화를 확인하면 효소 결핍을 확인할 수 있다.
심각한 대사 결핍에 덧붙여, 정상적인 대사 과정을 교란시키고 그 결과 질병을 야기하기에는 불충분한, 대사 표현형에서의 다른 보다 작은 개체간 차이가 존재한다. 그러나, 이러한 차이는 생물체가 엄청난 난국에 처해질 때(예를 들어, 특정 화학적 화합물(예: 약물 성분)이 대량으로 투여될 때) 드러날 수 있다. 또한, 이러한 차이는 환경 오염물질 및 담배 연기 같은 유해한 성분에의 장기간 노출에 수반되는 암 같은 질환에 대한 위험 인자의 변화를 야기할 수 있다.
생물학적 샘플의 NMR 분광분석법
생물 유체의 저분자량 조성물을 연구하는데 핵자기공명(NMR) 분광분석법을 이용하는 것은 이제 잘 알려진 일이다(예를 들어, 니콜슨(Nicholson) 및 윌슨(Wilson)의 문헌[(1989), 생물 유체의 고해상도 양성자 자기 공명 분광분석법,Progress in NMR Spectroscopy, 21, 449-501]; 린던(Lindon) 등의 문헌[(1999), 생체 유체의 NMR 분광분석법, Annual reports on NMR spectroscopy, 38]). NMR용의 높은 자기장의 자석의 출현이 이러한 발전의 한 요인이 되었다. 이들 자석은 기법의 민감도를 크게 개선시켰으며, 저온 프로브(cryoprobe)의 사용으로 추가로 개선되었다. 복잡한 혼합물의 시험에 있어서의 추가적인 이점은 증가된 자기장 강도로 인해 NMR 신호의 분산이 개선되었다(즉, 신호가 더욱 넓게 퍼지고 서로 겹칠 가능성이 줄었다)는 것이다. 현대 NMR 분광분석법의 역량을 크게 개선시킨 다른 인자는 더욱 높은 민감도를 이끌어내는 프로브 디자인의 개선, 측정 동력의 용이한 입수가능성 및 예컨대 수성 샘플에서 물 신호를 선택적으로 억제하기 위한 개선된 연속적인 파동 발생을 포함한다. 유동 프로브의 출현으로 인해, 종래에 높은 정밀도의 깨어지기 쉬운 유리 샘플 관을 사용함과 비교하여 샘플 처리량이 크게 증가될 수 있었다.
생체 유체에 대한 유용성에 덧붙여, 고체 조직의 작은(약 10 내지 20mg) 샘플을 조사하는 데에도 NMR 분광분석법이 유용하게 사용될 수 있다(예를 들어, 모카(Moka) 등의 문헌[(1997), 완전한 신장 조직 샘플의 매직 앵글 스피닝 양성자 핵자기공명 분광분석법, Analytical Communications, 34, 107-109]). 그러나, 이는 매직 앵글 스피닝(Magic Angle Spinning; MAS)으로 알려진 특수한 기법을 필요로 하며, 용액 상태 NMR 분광분석법과 비교하여, MAS-NMR 분광분석법은 시간이 많이 걸리는 절차이다. 자동화된 용액 상태 NMR 분광분석법을 이용하여 1일당 150개 이상의 샘플을 시험할 수 있는 반면, 작동자가 수작업으로 샘플을 바꾸는 MAS-NMR 분광분석법의 경우에는 1일당 10개의 샘플이 전형적이다.
막대한 대다수의 유기 화합물은 분석되는 샘플에 충분한 화합물이 존재하는 한1H NMR 분광분석법에 의해 검출될 수 있는 양성자를 함유한다. 이는, 원칙적으로1H NMR 분광분석법이 유기 화합물에 대한 거의 보편적인 검출 수단임을 의미한다. 특정 샘플 성분으로부터의1H NMR 분광분석 신호의 검출능은 존재하는 성분의 양, 양성자(들)의 유형 및 분자 환경, 및 NMR 실험의 성질에 따라 달라진다. 주요 제한 사항은 하이드록실기의 양성자 같은 교환가능한 양성자가 관찰되지 않을 수 있다는 것이다. 본질적으로, 임의의 특정 유기 화합물의1H NMR 스펙트럼은 그 화합물에 대해 독특하다. 또한, NMR 스펙트럼은 용이하게 해석가능하고 예측가능하여, 한 화합물의 구조적 특징 및 종종 완전한 구조가 그의1H NMR 스펙트럼으로부터 유추될 수 있다.
생체 유체의 통상적인 1차원(1D)1H NMR 스펙트럼에서는, 모든 검출가능한 성분의 개별 스펙트럼이 그들의 상대 농도에 따라 중첩되며, 이는 정량화를 용이하게 한다. 실제로, 뇨 및 혈장 같은 생체 유체의 높은 자기장1H NMR 스펙트럼은 정보가 매우 풍부하며, 1회의 실험으로 매우 많은 수의 저분자량 내지 중간 분자량의 성분을 검출할 수 있다. 지단백 및 고분자량 성분(예: 단백질)도 혈장에 존재하지만, 이들의1H NMR 스펙트럼은 공명하는 핵의 제한된 이동성에 의해 야기되는 신호확대 영향을 받게 된다. 이러한 확대로 인해, 이러한 성분으로부터 또한 이러한 성분에 대해 유도될 수 있는 정보의 양이 감소된다.
생체 유체 NMR 분광분석법의 적용
NMR 분광분석법과 비교하여, 전통적인 임상 화학 분석법은 통상 더욱 정확한 정량화를 제공하고 또한 더욱 우수한 검출 한계를 제공할 수 있다. 반면,1H NMR 분광분석법은 그에 의해 어느 성분이 분석을 필요로 하는지 규정할 필요 없이 1회 실험으로 검출가능한 성분 모두의 수준이 측정된다는 점에서 전통적인 임상 화학에 대해 주요한 이점을 갖는다. 따라서,1H NMR 분광분석법에 의해, 예상치 못한 변화가 관찰될 수 있으며, 기존에 인지되지 못한 성분이 확인될 수 있다. 그러므로,1H NMR 분광분석법은 일상적이지 않은 연구를 위한 동시 다-분석물 검출 수단으로서 큰 효과를 갖고, 신규 생체 마커(biomarker)의 검출에 이상적으로 적합하다.
NMR 분광분석법을 이용하여 투여후 체액을 분석함으로써 독소에 대한 반응을 확인 및 탐지하는 것은 공지되어 있다(예를 들어 홈즈(Holmes) 등의 문헌[(1992) 염화수은(II) 및 2-브로모에탄아민에 의해 유도된 래트의 신장 독성 병변으로부터의 진행 및 회복에 수반되는 생화학적 과정의 NMR 분광분석법 및 패턴 인지 분석, Mol. Pharmacol., 42, 922-930]). 독물학 연구와 관련하여, 생체 유체 NMR 분광분석법은 투여된 성분의 대사산물 및/또는 투여된 성분에 의해 유도되는 내인성 생체 유체 성분의 변화를 검출할 수 있고, 독성 효과를 평가하고 관련 방어 과정(예: 글루쿠론산 분해 및 머캅튜르산 형성)을 확인하는데 이용될 수 있다. 생체 유체 NMR분광분석법은 또한 독성의 메카니즘을 밝히는데 큰 가능성을 갖는다.
NMR 분광분석법을 이용하여 생체 유체 샘플로부터 특정한 선천성 대사 이상을 용이하게 검출할 수 있는 것으로 알려져 있다(예를 들어 물리나(Moolenaar) 등의 문헌[(2003) 선천성 대사 이상 분야에서의 체액의 양성자 핵자기공명 분광분석법, Ann. Clin. Biochem., 40, 1, 16-24]). 또한, 생체 유체의 NMR 분광분석법을 이용하여 다른 질환 증상을 진단하고 치료에 대한 반응을 추적할 수도 있다.
살아있는 시스템의 대사 상태를 모니터링하는 NMR에 기초한 방법의 성공에 따라, 용어 "대사 결정(metabonomics)"이 만들어졌다(니콜슨 등의 문헌[(1999), '대사 결정': 생물의 NMR 분광분석 데이터의 다변량 통계 분석을 통한 병태생리학적 자극에 대한 살아있는 시스템의 대사 반응의 이해, Xenobiotica, 29, 1181-1189]). 대사 결정은 '병태생리학적 자극 또는 유전자 개질에 대한 생체 시스템의 다변수성 대사 반응의 정량적 측정'으로서 정의된다. 대사 결정은 각각 유전자 발현 및 단백질 수준 변화의 검출에 기초한 게놈 결정(genomics) 및 단백질 결정(proteomics) 기법에 대해 상보적이다. 다른 기법과 관련하여 대사 결정의 이점은 대사 결정이 대사에 중요할 수도 중요하지 않을 수도 있는 근원적인 영향보다는 전체적인 대사 결과에 주목한다는 것이다.
패턴 인지
생물학적인(생체 유체 또는 조직-유도된) NMR 스펙트럼 세트로부터 유용한 생화학적 정보를 빼내는 과정을 복잡하게 만드는 인자는 이들의 고도의 복잡성이다. 이들 복잡한 다변수 데이터 세트를 연구하는 효율적인 방법은 컴퓨터에 기초한 패턴 인지 방법을 이용하는 것이다.
패턴 인지(PR)는 데이터 세트에서 패턴을 찾아내거나 또는 다른 공지의 인자와 상호 연관된 데이터 세트의 요소를 찾아내는데 사용될 수 있는 다변량 데이터 분석 방법에 대한 일반적인 용어이다(예를 들어 비비(Beebe) 등의 문헌[1998, Chemometrics, A Practical Guide, John Wiley and Sons, 뉴욕] 등 참조). 여기에 내재된 것은 데이터 세트가 다수의 상이한 대상(이를 위해 다양한 변수를 측정하였음)으로 이루어진다는 가정이다. 이러한 변수가 무엇이든간에, 어쩌다 한번씩 수치가 누락되는 것이 허용될 수는 있지만, 통상 동일한 변수를 데이터 세트의 모든 대상에서 측정하였다. NMR 스펙트럼 세트와 관련하여, 상이한 대상은 상이한 스펙트럼인 한편, 다양한 변수는 일반적으로 전체 스펙트럼 내의 상이한 스펙트럼 창구에 대한 통합이다. PR 방법은 '지도식(supervised)' 또는 '자율식(unsupervised)'으로 편리하게 분류될 수 있으며, 이들 다변량 통계 분석 방법중 몇몇이 아래 부분에 기재되어 있다.
자율식 PR 방법
임의의 다른 독립적인 지식을 참조하지 않고 다변량 데이터 세트에서 집단을 이루는 고유한 패턴을 결정하는데 자율식 PR 방법을 이용한다. 자율식 패턴 인지 방법의 예는 주성분 분석(PCA), 계급 집단 분석(HCA), 및 비선형 맵핑(NLM)을 포함한다.
주성분 분석(PCA)
주성분 분석(PCA)(예를 들어, 샤라프(Sharaf) 등의 문헌[1986,Chemometrics, J. Wiley and Sons, 뉴욕])은 가장 유용하고 용이하게 적용되는 자율식 PR 기법중 하나이다. 주성분(PC)은 적절한 칭량 계수와 출발 변수의 선형 조합으로부터 창출된 잠재 변수이다. 이들 PC의 특성은 다음과 같다: (i) 각 PC는 다른 모든 PC에 대해 수직이고(즉, 서로 관련되지 않고), (ii) 제 1 PC는 데이터 세트(정보 내용물) 변화의 가장 큰 부분을 함유하며, 후속 PC는 상응하게 더 적은 양의 변화를 함유한다.
수학적 용어에서, 데이터 행렬X는X=TP t (여기에서, 윗첨자 't'는 전치 행렬을 의미함)이도록 '등급' 행렬T및 '로딩' 행렬P로 이루어지는 것으로 간주될 수 있다. 데이터 행렬X로부터 공분산 행렬C를 계산한다. 대각 행렬화에 의해 공분산 행렬의 고유값 및 고유 벡터를 결정한다. 고유 벡터 플롯에서 상이한 대상의 좌표(주성분 또는 PC)는 '등급'을 나타내고 등급 행렬T를 포함한다. 고유 벡터 계수는 '로딩'을 나타내고, 로딩 행렬P를 포함하며, PC에 대한 서술자에 기여한다.
임의의 두 주성분 등급의 플롯을 종종 '등급 플롯'이라고 부른다. PC1 대 PC2의 등급 플롯은, 보다 낮은 차수의 PC 플롯이 유용할 수 있음에도 불구하고, 2차원에서 데이터의 최대 정보 함량을 제공한다. 이러한 등급 플롯을 이용하여 데이터 세트에서 내재하는 집단을 가시화시킬 수 있다.
지도식 방법
적절한 경우, 지도식 패턴 인지 방법을 또한 이용하여 다변량 데이터를 분석할 수 있다. 이러한 분석에서, 데이터 세트(X)는 가능한 경우 부류 자격 또는X데이터 세트 외에 있는 하나 이상의 변수의 값 같은 하나 이상의 공지 인자(Y)에 관련된다. 이러한 방법에서는,X및Y데이터의 '다듬기 세트'를 사용하여X데이터로부터 요구되는Y인자(들)를 추정하는 통계학적 '모델'을 구성한다. 이어, 모델의 견실성 및 예측능을 결정하기 위하여 이 모델을 독립적인 데이터(유효화 데이터 세트로서 일컬어짐)로 시험한다. 유효화시킨 후,X데이터만을 입수할 수 있는 샘플에 대해 관련된Y인자를 예측하는데 이 모델을 정당하게 사용할 수 있다.
지도식 패턴 인지 방법의 예는 다음과 같은 것을 포함한다: 부류 분석의 유연한 독립 모델 제작(SIMCA); 부분 최소 제곱 분석(PLS); 선형 식별 분석(LDA); K-최근접 동류 분석(KNN); 인조 신경망(ANN); 개연적인 신경망(PNN); 법칙 유도(RI) 및 베이스(Bayesian) 방법. 예를 들어, SIMCA에 대해서는 월드(Wold)의 문헌[(1976) 해체 주성분 모델에 의한 패턴 인지, Pattern Recog., 8, 127]; PLS에 대해서는 프랭크(Frank) 등의 문헌[(1984) 부분 최소 제곱 방법을 이용하는, 스펙트럼 데이터로부터의 생성물 품질의 예측, J. Chem. Info. Comp., 24, 20]; LDA에 대해서는 닐슨(Nillson)의 문헌[1965, Learning Machines, McGraw-Hill, 뉴욕]; KNN에 대해서는 비비 등의 문헌[1998, Chemometrics, A Practical Guide, John Wiley and Sons, 뉴욕] 등; ANN에 대해서는 앵커(Anker) 및 져스(Jurs)의 문헌[(1992) 인조 신경망에 의한 C-13 핵자기공명 화학적 이동의 예측, Anal. Chem., 64, 1157]; PNN에 대해서는 스펙트(Speckt)의 문헌[(1990) 개연적인 신경망, Neur. Networks, 3, 109]; RI에 대해서는 퀸란(Quinlan)의 문헌[(1986) Induction of decisiontrees, Machine Learning, 1, 81]; 베이스 방법에 대해서는 브레토스트(Bretthorst)의 문헌[1990, 베이스의 확률 이론을 이용한 변수 추정 입문, In: Maximum Entropy and Bayesian Methods, 포기어 편집, Kluwer Academic Publishers, 네덜란드, 53-79] 참조.
부분 최소 제곱법(PLS)
PLS는 앞서 기재된 PCA 방법의 회귀 확장이다. PLS에서는, 데이터 행렬X의 대상간 변화를X-등급T에 의해 기재하며, 회귀된Y-블록에서의 변화는Y-등급U로 기재한다. 본질적으로 PLS는T와U사이의 공분산을 최대화시킨다. PLS 모델의 경우에는,Y변화의 설명에 대한 각X-변수의 영향을 함유하는 PLS 가중치 세트W를 계산한다.Y-블록에 대한 상응하는 가중치 세트는C라고 한다.X-로딩의 행렬P도 계산한다. 해석을 위해, 또한X의 적절한 분해를 수행하기 위해, 이들 로딩을 이용한다.
따라서,X및Y의 PLS 분해는 다음과 같이 기재될 수 있다:
X=TP t +E
Y=TC t +F
위 식에서,E및F는 각각X및Y나머지이고, 윗첨자 't'는 관련 행렬의 전치 행렬을 의미한다.
PLS 회귀 계수B는 다음과 같이 기재된다:
B=W(P t W) -1 C t
이어, 다음 식에 따라Y의 추정치인Y est 를 계산할 수 있다:
Y est =XW(P t W) -1 C t =XB
부분 최소 제곱 식별 분석(PLS-DA)
PLS-DA는 대상의 공지 부류(Y) 사이의 최대 분리를 기재하는 데이터 행렬(X)의 '잠재' 변수를 수득하는 지도식 다변량 방법이다. PLS-DA는 앞서 기재한 PCA 방법의 회귀 확장인 PLS에 기초한다. PCA가 단순히 연구되는 대상을 기재하는 변수 내에 존재하는 최대 변화를 발견하도록 작용하는 반면, PLS-DA는 대상의 공지 부류 사이의 최대 분리를 찾아내도록 작용한다. 부류 정보를 갖는 '모조' 벡터 또는 행렬(Y)에 대한 PLS 회귀에 의해 이를 행한다. 이러한 정보가 데이터에 존재하는 경우, 계산된 PLS 성분을 부류(Y)를 분리시키는X의 변화를 기재하는데 촛점이 맞추어진다. 부류 자격은 실제 모델 제작 전에 공지된다. 모델을 계산 및 유효화시킨 후에는, 공지되지 않은 부류의 대상에 대해 부류 자격을 예측하는데 이를 정당하게 사용할 수 있다.
신경망 대 PLS 및 PLS-DA
PLS 및 PLS-DA 같은 방법은 입력 변수 사이의 선형 회합을 빼내는데 의존하며, 이는 분석을 효력을 상당히 한정할 수 있다. 신경망에 기초한 패턴 인지 기법은 특히 예측되는 인자가 다수의 관련없는 요인에 의해 영향을 받는 경우에 개선된 예측능을 제공할 수 있다. 그럼에도 불구하고, PLS 및 PLS-DA 같은 방법은 종종 충분히 효력이 있으며, 입력 데이터 세트의 어느 양상이 모델 제작에 특히 중요한지에 대해 몇몇 정보를 용이하게 수득할 수 있다는 점에서 비교적 '블랙 박스' 신경막 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. 즉, 신경망 방법에 비해, PLS 및 PLS-DA 모델은 해석 면에서 더욱 명료하다.
PR 방법의 대사 결정 데이터로의 적용
예컨대 복잡한 NMR 분광분석 데이터를 비롯한 대사 결정 데이터의 분석에 패턴 인지 방법을 약간은 성공적으로 적용하였다. 예를 들어, 안쏘니(Anthony) 등의 문헌[(1994) 뇨의 양성자 핵자기공명 스펙트럼으로부터 유래된 대사 데이터에 기초한 신장 독성 부위의 패턴 인지 분류, Mol. Pharmacol., 46, 199-211]; 벡위드-홀(Beckwith-Hall) 등의 문헌[(1998) 3가지 모델의 간 독소의 생화학적 효과에 대한 핵자기공명 분광분석법 및 주성분 분석 연구, Chem. Res. Tox., 11, 260-272]; 가틀랜드(Gartland) 등의 문헌[(1990) 뇨의 고해상도1H NMR 스펙트럼의 패턴 인지 분석, 독물학적 데이터의 분류에 대한 비-선형 맵핑 방법, NMR in Biomedicine, 3, 166-172]; 홈즈 등의 문헌[(1992) 염화수은(II) 및 2-브로모에탄아민에 의해 유도된 래트의 신장 독성 병변으로부터의 진행 및 회복에 수반되는 생화학적 과정의 NMR 분광분석법 및 패턴 인지 분석, Mol. Pharmacol., 42, 922-930]; 홈즈 등의 문헌[(1994) 정상적인 상태 및 병적인 상태의 인간 뇨의1H NMR 스펙트럼을 분석하기 위한 자동 데이터 축소 및 패턴 인지 방법, Anal. Biochem., 220, 284-296] 참조.
데이터 필터링
패턴 인지 방법을 '필터링되지 않은' 데이터에 적용할 수도 있지만, 무관한변화를 제거하기 위하여 데이터를 필터링하는 것이 종종 바람직하다. 이러한 필터링은 관련 변화와 무관한 변화를 구별하기 위하여 약간의 지도를 필요로 한다.
데이터 필터링의 한 방법은 간단히 선택된 스펙트럼 영역을 삭제한 다음 나머지로 작업함을 포함한다. 따라서, 예컨대 물이 억제된 수득된 수성 샘플의1H NMR 스펙트럼에서, 잔류수 신호의 크기는 물 억제의 효율에 따라 변화되며, 이들 무관한 신호를 삭제할 수 있다.
다르게는, 관심있는 변화에 관련되어 있지 않은(즉, 상기 변화에 직교하는) 데이터의 변화를 '직교 필터링'에 의해 제거할 수 있다. 한 가지 바람직한 직교 필터링 방법은 직교 신호 보정(Orthogonal Signal Correction; OSC)으로 편리하게 칭해지며, 이 방법에서는 관심있는 변화에 직교하는 잠재 변수를 제거한다(월드 등의 문헌[(1998) 근적외선 스펙트럼의 직교 신호 보정, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 44, 175-185]).
직교 신호 보정
OSC 방법은Y-벡터에 관련되어 있지 않은 대상 사이의X변화를 기재하는 가장 긴 벡터의 위치를 결정하고 이를 데이터 행렬로부터 제거한다. 생성된 데이터 세트를 이렇게 필터링하여, 무관한 직교 변화보다는 관심있는 특징에 관련된 대상 개체군 내에서의 변화에 패턴 인지를 집중시킬 수 있다. 이 방법을 필요한 만큼 자주 반복할 수는 있지만, '과도한-피팅(over-fitting)'은 피해야 한다.
PLS에서는, 가중치W를 계산하여X와Y사이의 공분산을 최대화시킨다. 대조적으로, OSC에서는, 가중치W를 계산하여X와Y사이의 공분산을 최소화시키도록 계산하는데, 이는Y에 대해 가능한한 가깝게 직교하는 성분을 계산하는 것과 동일하다.Y에 직교하고 따라서 원치 않는 변화를 함유하는 이러한 성분을 스펙트럼 데이터X로부터 제거하여, 관심있는 변화에 집중된 필터링된 예측 행렬을 생성시킬 수 있다.
PCA가 상이한 부류의 분리를 제안한다면, 직교 신호 보정(OSC)은 분리를 최적화시켜 후속 다변량 패턴 인지 분석의 성능을 개선시키고 모델의 예측능을 향상시키도록 사용될 수 있다.
모델 제작 및 예측
PLS, PLS-DA 및 신경망 분석에 내재되어 있는 것은 행태 또는 유형이 공지되어 있는 샘플로부터의 '모델-제작' 또는 '모델 수립' 데이터를 이용하여 예측성의 수학적 '모델'을 제작하는 착상이다.
모델을 계산한 후에는, 모델을 계산하는데 사용되지 않은 공지 행태 또는 유형의 샘플에 대한 데이터를 사용하여 이를 유효화시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 모델의 예측능을 시험할 수 있다. 유효화시킨 다음에는, 미지의 행태 또는 유형의 샘플의 행태 또는 유형(시험 데이터)을 예측하는데 이러한 모델을 정당하게 사용할 수 있다. 분석하기 전에, 시험 데이터를 모델 제작 데이터와 동일한 방식(임의의 필터링 적용 포함)으로 처리해야 한다.
임의의 특정 모델은 이를 공식화하는데 사용된 데이터에만 통용된다. 따라서, 동일한(또는 유사한) 조건하에서 동일한(또는 유사한) 실험 변수를 사용하여,필적할만한 개체로부터 모델 제작 데이터 및 시험 데이터를 모두 수득하는 것이 바람직하다.
표현형 확인을 위한 종래 기술
PCA 같은 자율식 PR 방법에 의해, 대사가 조사되지 않은(즉, 투여되지 않은) 개체로부터의 생체 유체 NMR 스펙트럼 세트 내에서의 변화를 시험할 수 있으며, 일정한 실험 조건하에서 종종 상이한 군이 발견될 수 있다(예컨대, 볼라드(Bollard) 등의 문헌[(2001) 뇨의 (1) HNMR 분광분석법 및 패턴 인지를 이용한, 암컷 래트의 주간 변화 및 발정기에 기인한 생화학적 변화에 대한 연구, Anal. Biochem., 295, 2, 194-202]). 그러나, 이 방법은 대사 전환에 관련된 상이한 군의 중요성에 대해 명확한 정보를 반드시 제공하는 것은 아니다(예를 들어, 바우드-카뮤스(Baud-Camus) 등의 문헌[(2001) 대사 프로브로서의 카페인, 및 자외선 검출 또는 전기 분무 질량 분광분석법과 병행되는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한, N-아세틸화 표현형의 결정, Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 760, 1, 55-63]). 상이한 군을 식별하도록 하는 스펙트럼 특징을 시험함으로써, 분리의 중요성을 해석할 수 있다. 그러나, 이는 중요성의 증거를 제공하지 않는 신뢰성없고 표적화되지 않은 방법이며, 상이한 대사 표현형에 관련된 미묘하고 복잡한 변화를 시험하는 매우 비효율적인 방법이다.
반대로, 표적화된 방법에서는, 시험 성분(예: 아세틸레이터 표현형의 경우 카페인)을 투여하여 개체가 특정 대사 전환을 수행하는 능력을 확립한 후, NMR 분광분석법 또는 다른 기법을 이용하여 생체 유체에서 검출되는 성분의 패턴을 사용하는 것으로 알려져 있다. 달리 말해, 투여후 생체 유체를 사용하여 개체의 대사 표현형을 결정하는데 NMR 분광분석법 및 다른 기법을 이용할 수 있다. 이들 분석에서 관심있는 성분은 통상 변화되지 않은 투여된 성분 및/또는 그의 대사산물이다. 간단하게 하기 위해, 용어 '투여된 화합물의 대사산물'은 이후 투여된 화합물 자체를 포함하는 것으로 간주한다. 종종, 이러한 성분의 비를 관련 대사능의 척도로서 결정한다. 이러한 분석으로부터 적합한 시험 성분의 입수가능성에 따라 대사 전환의 전체 변화에 대해 개체의 능력을 결정할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 한 유형의 전환을 행하는 개체의 능력은 다른 모든 전환에 대한 그의 능력과는 무관할 것으로 예상된다. 그러므로, 다양한 생화학적 전환에 대한 개체의 능력을 연구할 때 다수의 시험 성분이 필요할 것으로 예상된다. 이러한 분석들이 종종 수행되기는 하지만, 인간 또는 동물에게 임의의 성분을 불필요하게 투여하는 것은 안전성 및 윤리적인 견지에서 바람직하지 못하며, 이러한 방법의 광범위한 사용은 불가능하다. 또 다른 곤란함은 시험 성분을 투여할 경우 효소를 유도하게 되어 얼마 후에는 대사 상태를 변화시킨다는 것이다. 그러므로, 예컨대 이러한 표현형 확인은 독성 연구와 관련하여 문제가 될 수 있었다.
본원에 사용되는 용어 생체 마커는 통상 개체 또는 개체 샘플중의 화학적 또는 생화학적 물질 또는 통계학적으로 관련되는 이들 물질의 조합, 또는 특정 생리학적 상태, 질병 또는 독성 과정의 지표이거나 또는 특정 유형의 대사 또는 질병 과정에 대한 소인의 지표이며 또한 임상적 결과와 관련될 수 있는, 그의 존재, 부재 또는 수준과 관련된 의의를 갖는 개체의 생리적 반응을 의미하도록 사용된다.
이러한 생체 마커의 예는 화학적 분자 및 생물학적 분자, 예를 들어 대사 기질, 중간체 또는 생성물, 구조 단백질, 핵산, 수송 단백질 및 수용체 단백질, 면역 단백질, 대사 조절 또는 유전자 조절과 관련된 단백질, 촉매 단백질, 효소 및 이들과 관련된 보조 인자를 포함한다. 생체 마커의 추가적인 예는 또한 생물학적 과정의 활성 정도, 예컨대 유전자 및 단백질 발현 및 세포 신호 경로의 활성 정도를 포함한다.
용어 생체 마커는 또한 전술한 분자 또는 과정의 존재, 부재 또는 수준과 관련되거나 이들의 특징인 임의의 측정가능한 신호, 예를 들어 핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 임의의 다른 화학적 분석 기법(예: 질량 분광분석법(MS), 적외선(IR) 분광분석법, 기체 크로마토그래피(GC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC))에 의해, 또는 이들 기법의 임의의 통합 조합(예: GC-MS)을 이용함으로써 취해진 측정 결과로부터 수득된 신호 또는 신호의 패턴을 일컫는 것으로 생각된다.
샘플과 관련하여 본원에 사용되는 화학적 조성물이란 용어는 샘플을 구성하는 화학적 화합물 및/또는 생화학적 화합물의 조합을 포함한다.
샘플과 관련하여 본원에 사용되는 용어 물리적 변수는 크로마토그래피, 유도화, 분별 및 분리, 결정화, 침강, 스펙트럼 분석, 분자량 분석, 회절, 용해도 분석, 탁도, 굴절률 또는 비저항, 융점 또는 비점 분석 같은 방법에 의해 수득되는 특징적인 물리적 측정치를 포함한다.
발명의 개요
본 발명은 개체의 대사 표현형을 확인하는 방법 및 대사 표현형에 의해 영향을 받는 반응을 예측하고 위험 인자를 결정하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 개체의 생체 유체를 분석함으로써 개체의 대사 표현형을 확인하고 하나 이상의 치료에 대한 개체의 반응을 예측하는 방법을 포함한다.
상기 언급한 바와 같이, 대사 표현형을 확인하기 위한 인정된 방법은 개체에의 투여 및 투여후 생체 유체의 분석에 의존한다. 이로부터 근본적으로 이탈하여, 본 발명은 생체 유체중 투여된 성분의 대사산물의 수준 변화가 이 성분이 투여되기 전 생체 유체의 대사산물 프로파일 변화와 상관되어 있다는 예기치 못한 발견에 기초를 두고 있다. 따라서, 본 발명에 의해, 특정 성분을 투여하기 전에 그 성분에 대한 개체의 반응을 예측할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명에 따라, 시험 성분을 개체에 투여할 필요 없이 개체의 대사 표현형을 결정할 수 있다. 명백하게, 특정 성분이 유해한 반응을 야기할 가능성이 있는 경우에는, 예를 들어 약학 치료시 개체의 반응을 예측할 수 있는 것이 매우 유용하다. 또한, 상기 기재된 이유(안전성, 윤리성 및 효소 유도)로 인해, 임의로 투여할 필요 없이 개체의 대사 표현형을 결정할 수 있는 것이 매우 유리하다. 이러한 근본적으로 다른 신규 방법은 투여전 행태가 투여후 행태에 관련있다는 발견에 대해 매우 표적화된 접근을 제공한다.
따라서, 한 요지에서, 본 발명은 개체에 투여될 수 있는 성분에 대한 개체의 반응(들)을 예측하는 모델을 제작하는 일반적인 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 투여되어야 하는 성분을 대표적인 개체군(이후, 모델 제작 개체군이라고 함)에 투여한다. 관심있는 반응(들)을 임의의 적절한 수단에 의해 모델 제작 개체군의 모든 구성원에서 측정한다. 투여 전에 모델 제작 개체군으로부터 채집된 생체 유체또는 다른 샘플을1H NMR 분광분석법에 의해 또는 다른 적합한 기법(예를 들어, 근적외선 분광분석법, 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분광분석법 또는 기체 크로마토그래피)에 의해 또는 이러한 기법의 조합에 의해 시험한다. 투여전 반응 데이터 및 투여 후 반응 데이터가 함께 모델 제작 데이터를 구성한다. PLS 또는 PLS-DA 같은 화학 측정 패턴 인지(PR) 기법을 모델 제작 데이터에 적용하여 투여전 데이터의 변화와 투여후 반응(들)의 변화의 상관관계를 밝혀낸다. 종종 OSC 같은 데이터 필터링 방법을 PR 전에 사용하여, 관계없는 투여전 데이터의 변화를 제거한다. 모델을 일단 제작 및 유효화시킨 후에는, 동일한 성분에 대한 반응을 예측하고자 하는 경우, 모델 제작 개체군과 유사한 유형의 하나 이상의 시험 개체로부터의 적절한 투여전 데이터와 함께 이 모델을 사용할 수 있다. 통상, 한 성분에 대해 유도된 모델을 밀접하게 관련된 성분에 대해서도 사용할 수 있기는 하지만, 관심있는 각 성분에 대해 새로운 모델이 필요하다.
다른 요지에서, 본 발명은 개체의 대사 표현형의 하나 이상의 요소를 특징짓는 모델을 제작하는 일반적인 방법을 제공한다. 이 방법에서는, 투여되어야 하는 성분 및 그 성분의 양을, 관심있는 특정 대사 전환(들)을 조사하도록 조심스럽게 선택한다. 선택된 성분을 대표적인 개체군(이후, 모델-제작 개체군이라고 함)에 투여한다. 편리한대로1H NMR 분광분석법 또는 다른 적합한 수단에 의해 투여후 생체 유체 또는 다른 샘플에서 관심있는 대사산물을 측정한다. 이 분석으로부터, 관련 대사 전환(들)에 대한 각 개체의 능력을 측정한다. 투여 전에 모델 제작 개체군으로부터 채집된 생체 유체 또는 다른 샘플을1H NMR 분광분석법에 의해 또는 다른 적합한 기법(예를 들어, 근적외선 분광분석법, 고성능 액체 크로마토그래피, 질량 분광분석법 또는 기체 크로마토그래피)에 의해 또는 이러한 기법의 조합에 의해 시험한다. 투여전 '대사능' 측정치 및 투여 후 '대사능' 측정치가 함께 모델 제작 데이터를 구성한다. PLS 또는 PLS-DA 같은 화학 측정 패턴 인지(PR) 기법을 모델 제작 데이터에 적용하여 투여전 데이터의 변화와 투여후 능력 측정치의 변화의 상관관계를 밝혀낸다. 종종 OSC 같은 데이터 필터링 방법을 PR 전에 사용하여, 관계없는 투여전 데이터의 변화를 제거한다. 모델을 일단 제작 및 유효화시킨 후에는, 관련 대사능(들)을 결정하고자 하는 경우, 모델 제작 개체군과 유사한 유형의 하나 이상의 시험 개체로부터의 적절한 투여전 데이터와 함께 이 모델을 사용할 수 있다.
본 발명의 제 1 요지에서는, 시험 성분을 개체에 투여하지 않고서도 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 특징짓거나 또는 투여하지 않고도 대사 표현형에 따라 달라지는 개체의 투여후 반응을 예측하는 모델을 제조하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 투여 성분을 투여하기 전에 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터를 수득하고; 투여 성분을 투여한 후 다수의 개체에 관련된 투여후 데이터를 수득하며; 투여전 데이터의 개체간 변화와 투여후 데이터의 개체간 변화의 상관관계를 밝히고; 관찰된 상관관계에 기초하여 투여 전으로부터 투여 후를 예측하는 모델을 생성시킴을 포함한다.
뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 침, 땀, 눈물, 숨 또는 숨 응축액 같은 생체 유체인 샘플로부터, 또는 식물 조직, 식물 유체 또는 쇄균액(homogenate), 예컨대 정유를 비롯한 식물 추출물 또는 식물 삼출물인 샘플로부터, 또는 인간 또는 동물 조직, 어류 조직 또는 어유, 조직 추출물, 조직 배양액 추출물, 세포 배양액 상청액 또는 추출물인 샘플로부터, 또는 미생물로부터 유래되는 샘플로부터 투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터를 수득할 수 있다. 투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터는 화학적 조성 및/또는 물리적 변수에 관한 데이터를 포함할 수 있다.
예를 들어 데이터 복구를 향상시키거나 샘플 안정성을 개선하기 위하여, 투여전 샘플 또는 개체 및/또는 투여후 샘플 또는 개체를 분석하기 전에 처리할 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 기존 성분의 유도체(들)를 생성시키도록 하나 이상의 화학적 약제로 처리함).
투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터는 핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 질량 분광분석법(MS), 적외선(IR) 분광분석법, 기체 크로마토그래피(GC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 같은 임의의 다른 화학적 분석 기법 또는 이들 기법의 임의의 통합된 조합(예: GC-MS)으로부터 유도될 수 있거나, 또는 이러한 기법을 이용하여 수득된 조성 데이터이다.
투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터는 물리적 데이터 또는 이로부터 유도된 데이터일 수 있다.
바람직하게는, 적절한 성분을 투여함으로써 다수의 생화학적 전환 각각에 대해 표현형 확인 모델을 생성시킨다. 유사하게, 적절한 성분을 투여함으로써 다수의 투여 성분 각각에 대해 반응 예측 모델을 제작할 수 있다.
패턴 인지 전에 기존 변수의 비 및/또는 다른 조합을 취함으로써, 원래의 투여전 데이터 세트를 확장시킬 수 있다. 예를 들어 수득된 데이터의 비(들)를 포함하는 추가의 데이터를 형성시킴으로써 이를 달성할 수 있다.
임의의 특정 성분을 투여한 개체의 군의 경우, 패턴 인지 방법을 이용하여 투여 성분의 가변적인 대사의 패턴 또는 투여 성분에 대한 가변적인 반응의 패턴을 알아낼 수 있다. 지도식 또는 자율식 패턴 인지 방법을 이용하여, 투여후 데이터에서의 관심있는 변화와 상관있는 투여전 데이터의 변화를 알아낼 수 있다.
직교 신호 보정(OSC) 같은 데이터 필터링 방법을 이용하여, 투여후 데이터의 관심있는 변화와 상관없는 투여전 데이터의 변화를 제거할 수 있다.
본 방법을 이용하여 대사 표현형에 대한 정보를 제공하거나 또는 투여에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있는 생체 마커 또는 생체 마커의 조합을 확인할 수 있다.
본 발명의 제 2 요지에서는, 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 결정하는 방법이 제공되며, 이 때 이 방법은 관심있는 생화학적 전환 또는 경로를 조사하는 특정 성분이 투여된 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터 및 투여후 데이터의 상관관계를 설명하는 모델과 관련하여 투여되지 않은 개체와 관련된 데이터를 분석하고; 모델의 소정 기준에 따라 투여되지 않은 개체의 대사 표현형을 설명하는 수치 척도 또는 분류법을 생성시킴을 포함한다.
모델의 소정 기준은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 관계를 정의하는하나 이상의 수학식을 포함하고, 투여전 데이터에 기초하여 개체의 특징을 결정할 수 있으며 제외되는 시험 데이터 확인을 가능케 한다.
뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 침, 땀, 눈물, 숨 또는 숨 응축액 같은 생체 유체인 샘플로부터, 또는 식물 조직, 식물 유체, 식물 쇄균액, 예를 들어 정유를 비롯한 식물 추출물 또는 식물 삼출물인 샘플로부터, 또는 인간 또는 동물 조직, 어류 조직 또는 어유, 조직 추출물, 조직 배양액 추출물, 세포 배양액 상청액 또는 세포 배양액 추출물로부터, 또는 미생물로부터 유래되는 샘플, 또는 데이터 복구 또는 샘플 안정성을 향상시키기 위한 처리 후 상기 샘플 유형중 임의의 하나로부터, 투여되지 않은 개체에 관련된 데이터를 수득할 수 있다.
핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 임의의 다른 기법을 이용하여 또는 이들 기법의 임의의 조합을 사용하여, 개체에 관련된 특징적인 조성 데이터 및/또는 물리적 데이터를 생성시킬 수 있다.
대사 표현형에 의해 좌우되는 위험을 평가하기 위해 및/또는 특수한 건강 모니터링 계획의 사용을 표적화하기 위해 및/또는 사전 주의/예방용 치료의 사용을 표적화시키기 위해 및/또는 대비하기 위한 목적으로 위험의 특징을 결정하기 위해 및/또는 임의의 다른 목적(예: 번식)을 위해 개체를 선택하기 위하여 표현형 확인 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 추가적인 요지에서는, 투여 성분에 대한 개체의 반응을 예측하는 방법이 제공되는데, 이 방법은 특정 투여 성분을 투여한 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터와 투여후 데이터의 상관관계를 특징짓는 모델과 관련하여 투여되지 않은 개체에 대한 데이터를 분석하고; 모델의 소정 기준에 따라, 투여 성분이 투여되어야 하는 투여되지 않은 개체의 반응을 예측하기 위한 수치 예측 또는 분류 예측을 생성시킴을 포함한다.
소정 기준에 따라, 개체가 수용해야 하는 성분의 최대 투여량 또는 최소 투여량 및 개체가 수용해야 하는 투여 성분의 양을 예측할 수 있다. 성분을 개체에 투여해야 하는 빈도 및 개체가 수용해야 하는 성분의 투여 횟수도 예측할 수 있다. 개체에 적절한 조절된 방출 제제를 선택할 수 있다.
핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 임의의 다른 기법을 이용하거나 또는 이들 기법의 임의의 조합을 이용함으로써, 개체에 대한 특징적인 조성 데이터 및/또는 물리적 데이터를 생성시킬 수 있다.
개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 결정하는 방법 또는 투여 성분에 대한 개체의 반응을 예측하는 방법은 이미 확인된 하나 이상의 생체 마커에 대하여 미투여 개체에 관한 데이터를 분석함을 추가로 포함한다. 생체 마커(들)는 하나 이상의 첨가된 약제와 반응하여 색상 변화 같은 가시적인 변화를 만들어낼 수 있다. 바람직하게는, 투여 성분을 투여하기 전에 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터와 투여 성분을 투여한 후 다수의 개체에 관련된 투여후 데이터의 상관관계를 밝혀냄으로써 생체 마커를 선택한다.
이 방법을 이용하여, 실험실용 실험 또는 임상 실험을 위해, 또는 임의의 다른 목적을 위해, 표현형 면에서 동질이거나 유사한 개체의 군을 선택할 수 있다.
생체 유체 또는 조직의 투여전 분석에 기초하여 실험 데이터의 생물학적 변화(이는 표현형 이질성에 의해 야기됨)를 이론적으로 설명하기 위하여 이 방법을 이용할 수 있다.
데이터는 개체 전체로부터 취한 물리적 측정치 및/또는 화학적 측정치에 기초할 수 있다. 이러한 측정치의 예는 혈압, 심박수, 최고 유량, 키, 체중 등이다.
투여후 데이터는 투여전 상태에 대한 변화, 예컨대 혈압을 낮추는 약물로 치료된 인간의 혈압 감소를 기재할 수 있다.
바람직하게는, 특정 모델 및/또는 방법의 한계에 순응하지 않는 시험 데이터를 확인한다.
개체는 동물, 특히 인간, 마우스, 래트, 돼지, 젖소, 황소, 양, 말, 개 또는 토끼, 또는 임의의 가축 또는 스포츠 또는 번식 목적으로 사용되는 임의의 동물(예: 경주마) 같은 포유동물일 수 있다. 다르게는, 개체는 식물, 어류 또는 임의의 다른 수생 생물체 또는 생물학적 조직, 조직 배양액, 세포 추출물 또는 미생물 추출물일 수 있다.
단일 개체로서 생각되는 개체의 군의 대표적이거나 대표적인 것으로 간주되는 샘플로부터 데이터를 수득할 수 있다. 예를 들어, 다수의 유사한 개체(예: 식물)로부터의 샘플을 함께 분쇄하고, 생성된 물질을 사용하여 단일 식물 개체에 관련된 것으로 간주되는 데이터를 수득할 수 있다.
투여되는 성분은 특히 약학 또는 의약 성분, 또는 약학 또는 의약 성분이 될 수 있는 연구 또는 개발중인 성분뿐만 아니라 예컨대 독소, 살충제, 제초제, 식품 또는 사료 성분, 식품 또는 사료 첨가제 및 유체(액체, 기체, 증기 및 연기(예컨대담배 연기)를 비롯한 임의의 종류의 유체)를 포함하는 임의의 성분 또는 성분의 혼합물 또는 배합물일 수 있다.
개체의 수명 또는 그의 임의의 특정 부분 또는 일부를 포함하는 임의의 기간에 걸쳐 예를 들어 주사, 섭식, 음용, 흡입 또는 훈연에 의해, 투여되는 성분을 임의의 매트릭스 또는 매질에서 능동적으로 또는 수동적으로 투여할 수 있으며, 이러한 투여는 환경에의 노출 또는 환경 오염에 의해, 또는 의학, 치과, 수의학 또는 외과 절차에 의해 이루어지는 것을 포함한다.
개체에 시험 성분을 투여하지 않고 개체의 아세틸레이터 표현형을 확인하는데 이 방법을 이용할 수 있다. 또한 또는 다르게는, 성분 투여에 대한 개체의 반응(이는 아세틸레이터 표현형에 따라 달라짐)을 예측하는데 이 방법을 이용할 수 있다.
아이소니아지드-유도된 독성 또는 갈락토스아민-유도된 독성에 대한 개체의 감수성을 예측하는데 이 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 모델을 제작하는 장치에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지에서는, 각각 특정 투여 성분이 투여된 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터와 투여후 데이터의 상관관계의 모델이 되는 하나 이상의 모델; 하나 이상의 모델에 대하여 미투여 개체에 관련된 데이터를 분석함으로써, 이용된 모델(들)에 따라 미투여 개체의 대사 표현형의 하나 이상의 양상을 결정하거나 투여에 대한 그의 반응을 예측하기 위한 프로세서를 포함하는, 반응 예측 및/또는 대사 표현형 확인을 위한 장치가 제공된다.
또한 또는 다르게는, 시험 성분을 개체에 투여하지 않고도 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 특징짓거나, 또는 투여하지 않고도 대사 표현형에 따라 달라지는 개체의 투여후 반응을 예측하는 하나 이상의 모델을 제작하도록 장치를 추가로 조정한다. 즉, 투여 성분을 투여하기 전에 다수의 개체에 관한 투여전 데이터를 수득하고; 투여 성분을 투여한 후 다수의 개체에 관한 투여후 데이터를 수득하며; 투여전 데이터의 개체간 변화와 투여후 데이터의 개체간 변화의 상관관계를 밝혀내고, 관찰된 상관관계에 기초하여 투여 전으로부터 투여 후를 예측하는 모델을 생성시키도록 장치를 조정한다.
바람직하게는, 장치는 NMR 분광분석법, 질량 분광분석법, 적외선 분광분석법 또는 고성능 액체 크로마토그래피 같은 물리적 분석 및/또는 화학적 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 분석 기기 또는 장치를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 특히 기재된 바와 같이 이미 확인된 하나 이상의 생체 마커의 사용에 기초한 반응 예측 또는 대사 표현형 확인을 위해 하나 이상의 생체 마커를 확인하도록 장치를 조정할 수 있다.
본 발명의 추가적인 요지에서는, 시험되는 개체로부터의 샘플을 수용하는 시험 구역을 포함하는, 대사 표현형 확인 또는 투여에 대한 개체의 반응(들) 예측을 위한 장치가 제공되며, 이 때 시험 구역은 샘플중의 하나 이상의 생체 마커와 화학적으로 반응하여 시험 구역의 가시적인 외관 변화를 생성시킬 수 있는 하나 이상의 약제를 포함하고, 상기 생체 마커는 기재된 바와 같이 이미 확인되었으며, 생성된 시험 구역의 가시적인 외관은 대사 표현형의 특징 또는 투여에 대한 반응(들)의 전조이다.
바람직하게는, 이 장치는 개체의 적절한 투여 계획을 밝혀낸다.
장치는 특정 생체 마커에 대해 생성된 항체의 사용에 기초할 수 있다. 예컨대 고체 지지체상에 부동화된 효소를 사용하는 효소-촉매 작용에 의한 반응에 의해, 선택된 생체 마커를 검출 및/또는 정량할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 제작된 하나 이상의 모델을 포함하는 장치에 관한 것이다.
장치는 특정 모델의 한계에 순응하지 않는 시험 데이터를 확인하도록 추가로 조정될 수 있다.
본 발명은 많은 용도를 갖는다:
(1) 교정 치료를 필요로 하지 않는 '건강한' 개체
개체의 대사 특징 결정(표현형 확인)에 의해 다음과 같은 것들이 가능해진다:
- 위험 평가, 예를 들어 특히 특정 표현형에 연관된 방광암.
- 적절한 경우, 즉 위험이 높은 개체에서 특수한 건강 모니터링 계획의 표적화된 채택.
- 적절한 경우, 즉 위험이 높은 개체에서 사전 주의/예방용 치료의 표적화된 사용.
- 대비 목적을 위한, 개체와 관련된 위험 정도의 확인.
- 예를 들어 가축 번식에서 목적하는 특징을 갖는 개체의 선택.
- 실험실용 실험 또는 임상 실험을 위한, 개체의 표현형 면에서 동질한 보다 작은 세트(subset)의 선택.
(2) 약학, 의학, 치과, 수의학 또는 다른 치료가 필요한 개체
개체의 대사 특징 결정(표현형 확인) 및/또는 투여 또는 치료에 대한 개체의 반응 예측에 의해 다음과 같은 것들이 가능해진다:
- 약한 개체에게 약물을 투여하지 않거나 또는 약물 투여량 및/또는 이러한 투여의 반도 및/또는 투여 지속 기간을 감소시킴으로써, 약물 부작용(예를 들어, 혼수상태, 치사)을 피함.
- 약물 치료의 사소한 부작용(예컨대, 구토, 졸음)의 발생 및 심각성의 예측.
- 부작용을 최소화하면서, 신체 내에서 활성 약물 성분의 적절한 수준을 유지함에 기초한 최적 약학 치료(화합물, 투여량, 투여 빈도 및 치료 지속 기간)의 선택.
- 의학, 치과, 수의학 절차 및 성분, 예를 들어 할로테인 같은 마취제에 대한 유해한 반응의 회피.
- 적절한 의학, 치과 또는 수의학 절차 또는 치료의 선택.
(3) 약물 개발 및 허가
투여전 대사 표현형 확인을 수행하고 그에 따라 치료를 손질하는 조건하에, 상이한 개체에서 상이한 효과(예컨대, 효능, 독성)를 갖는 약물이 허가될 수 있다. 이에 따라 다음과 같은 것이 가능해진다:
- 효능 또는 독성에서의 가변적인 반응으로 인한 '손실'(약물 개발 과정 동안의 화합물의 포기)의 감소.
- 효율 또는 독성에서의 문제점이 전체 개체군보다는 특정한 보다 작은 개체 세트로 한정되는 경우, 특정 미승인 약물의 재생/재허가.
약물 개발 연구(예컨대 독성 또는 효능에 대한)와 관련하여, 투여전 대사 표현형 확인에 의해 다음과 같은 것이 가능해진다:
- 상이한 개체간 또는 개체의 상이한 작은 세트간의 표현형 차이에 의해 생기는 가변적인 결과의 해석.
- 요구되는 특정 대사 물질을 갖는 목적하는 시험군의 선택.
(4) 생체 마커 확인
시험 데이터의 분석에 직접 사용하는 대신, 적절한 모델을 사용하여 대사 표현형을 결정하거나 대사 표현형에 의해 결정되는 반응을 예측하는 생체 마커 또는 생체 마커의 조합을 알아낼 수 있다. 관련 생체 마커(들)를 확립하면, 이들 생체 마커에 기초하여 간단화된 분석 방법, 예를 들어 뇨 계심봉 또는 HPLC 방법을 개발할 수 있다. 이는 NMR 분광분석법 같은 복잡한 기법에 대한 의존성을 감소시키고, 예를 들어 지방 실험실, 약국, 병원 또는 의사의 진찰실에서의 원격 시험을 가능케 한다.
이제 첨부 도면을 참조하여 예시함으로써 본 발명을 더욱 상세하게 기재한다.
도 1.1은 갈락토스아민 HCl(GalN HCl로 약칭함)(800mg/kg)을 투여한 후 뇨중 가변적인 갈락토스아민 배출을 보여준다.
도 1.2는 GalN HCl(800mg/kg)을 투여한 후 뇨중 가변적인 N-아세틸화된 화합물 배출을 도시한다.
도 1.3은 반응을 나타낸 개체에서 GalN HCl(800mg/kg)에 의해 유도된 몇몇 뇨 변화를 도시한다.
도 1.4는 갈락토스아민 HCl(800mg/kg)을 투여한 후 뇨중 변화된 히퓨레이트 및 히스티딘 배출을 보여준다.
도 1.5는 갈락토스아민 연구에서 얻어진 -1일(투여전) 뇨 NMR 스펙트럼의 PCA로부터의 PC 1 대 PC 5상의 등급 플롯을 도시한다.
도 1.6은 갈락토스아민 연구에서 얻어진 -1일(투여전) 뇨 NMR 스펙트럼의 PCA로부터의 PC 1 대 PC 5상의 로딩 플롯을 도시한다.
도 2.1은 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트에 아이소니아지드(400mg/kg)를 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집한 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼에서 보여지는 N-아세틸화 대사산물의 상이한 패턴의 예를 도시한다.
도 2.2는 아이소니아지드(200mg/kg)가 투여된 동물로부터 채집한 뇨 샘플의 제1일(투여로부터 0 내지 7시간) NMR 스펙트럼의 N-아세틸 영역(δ 2.23 내지 δ 2.13)의 PCA로부터의 PC 1 대 PC 2상의 등급 플롯을 보여준다.
도 2.3은 아이소니아지드 대사의 2가지 임의적인 초기 경로를 도시한다.
도 3.1은 아이소니아지드(200mg/kg)를 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼에서 비 ('a' 피크 높이/알란토인 피크 높이)의 투여전 예측치를 도시한다.
도 3.2는 도 3.1에 기재된 결과를 생성시킨 PLS 분석에 관계된 회귀 계수를 보여준다.
도 3.3은 아이소니아지드(200mg/kg)를 래트에 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 뇨에서 배출된 대사산물 C의 양의 투여전 예측치를 도시한다.
도 3.4는 아이소니아지드(200mg/kg)를 래트에 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 뇨에서 비 [(분율 C)/(분율 A+B)]의 투여전 예측치를 도시한다.
도 3.5는 도 3.4에 관련된 모델의 내부 유효화를 도시한다.
도 3.6은 외부 시험 세트에 대한 [(분율 C)/(분율 A+B)]의 투여전 예측치를 도시한다.
도 4.1은 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간동안의 N-아세틸화 화합물(δ 약 2.22 내지 약 2.11)의 총 뇨 배출량의 투여전 예측치를 도시한다. (이 변수에 대한 첫번째 모델).
도 4.2는 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간동안 배출된 'MA'의 양의 투여전 예측치를 도시한다. (이 변수에 대한 첫번째 모델).
도 4.3은 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간 동안의 N-아세틸화 화합물(δ 약 2.2 내지 약 2.11)의 총 뇨 배출량의 투여전 예측치를 도시한다.
도 4.4는 도 4.3에 관련된 모델의 내부 유효화를 보여준다.
도 4.5는 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간 동안의 파라세타몰 글루쿠로나이드('G')의 뇨 배출량의 투여전 예측치를 도시한다.
도 4.6은 도 4.5에 관련된 모델의 내부 유효화를 보여준다.
도 4.7은 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간 동안의 'MA'의 뇨 배출량의 투여전 예측치를 도시한다. (이 변수에 대한 두번째 모델).
도 4.8은 도 4.7에 관련된 모델의 내부 유효화를 보여준다.
도 4.9는 도 4.7에 관련된 모델의 외부 유효화를 보여준다.
도 4.10은 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간 동안의 'P'의 뇨 배출량 투여전 예측치를 도시한다.
도 4.11은 도 4.10에 관련된 모델의 내부 유효화를 보여준다.
도 4.12는 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 24시간동안 배출된 'S'의 양에 대해 관찰된 값 대 투여전 예측된 값을 도시한다.
도 4.13은 래트에게 파라세타몰을 투여한 후 수득된 24시간 뇨 샘플의 G/S 비에 대한 관찰된 값 대 투여전 예측된 값을 도시한다.
도 5.1은 남성에게 파라세타몰을 투여한 후 처음 3시간동안 체질량 1kg당 N-아세틸화 화합물(δ 2.210 내지 2.135)의 총 뇨 배출량의 투여전 예측치를 도시한다.
도 5.2는 도 5.1에 관련된 모델의 외부 유효화를 보여준다.
도 5.3은 남성에게 파라세타몰을 투여한 후 처음 3시간동안 체질량 1kg당 뇨에 배출된 파라세타몰 글루쿠로나이드('G')의 양의 투여전 예측치를 도시한다.
도 5.4는 도 3.3에 관련된 모델의 외부 유효화를 도시한다.
도 5.5는 남성에게 파라세타몰을 투여한 후 처음 3시간동안 체질량 1kg당 뇨에 배출된 'P'의 양의 투여전 예측치를 도시한다.
도 5.6은 도 5.5에 관련된 모델의 외부 유효화를 보여준다.
도 5.7은 남성에게 파라세타몰을 투여한 후 처음 6시간동안 체질량 1kg당 N-아세틸화 화합물(δ 2.210 내지 2.135)의 총 뇨 배출량의 투여전 예측치를 도시한다.
도 5.8은 도 5.7에 관련된 모델의 외부 유효화를 도시한다.
모델 제작 절차의 바람직한 특징
1. 모델 제작 개체군.
모델-제작 개체군을 구성하는 개체는 가능한한 시험 개체군을 형성하는 개체를 대표해야 한다. 식사는 생체 유체 조성에 영향을 끼칠 수 있으며, 따라서 개체간 식사 변화는 생체 유체-유도되는 모델과 관련하여 중요할 수 있다. 이상적으로는, 방법이 식사 변화에 의해 영향을 받지 않을 정도로 충분히 견실할 수 있지만, 이는 각 모델에 대한 시험을 필요로 한다. 가변적인 식사의 가능한 효과에 대한 예방책으로서, 특정 모델에 관련된 모든 모델 제작 데이터, 유효화 데이터 및 시험 데이터를 동일한 식사를 하는 개체로부터 수득하는 것이 타당하다. 이는 사람보다도 실험용 동물에서 달성하기가 더욱 용이하다. 실제로, 모든 관련 실험에 표준동물 식사 및 표준 인간 식사가 규정된다면, 이로 인해 광범위한 상이한 모델에 대해 시험 개체의 뇨 샘플을 신속하게 점검할 수 있게 되므로, 유리할 수 있다. 일반적으로, 모델-제작 개체군의 크기가 크면 클수록, 더욱 견실한 모델이 생성된다. 모델을 제작한 후에는, 모델-제작 개체군의 구성원이 아닌 개체의 군을 이용하여 이 모델을 유효화시킬 필요가 있다.
2. 투여
투여되는 성분, 투여 수준, 투여 빈도 및 투여 수단은 용도에 따라 달라진다. 대사 표현형 확인 방법을 생성시키는 것이 목적인 경우에는, 투여되는 성분이 관심있는 전환(들)의 정도를 특징짓는 하나 이상의 대사산물을 제공할 필요가 있다. 이상적으로, 선택된 대사산물은 관심있는 전환(들)에 의해서만 영향을 받고, 다른 것과는 관련이 없다. 따라서, 투여되는 화합물은 화학적으로 일작용성 또는 이작용성인 복잡하지 않은 작은 화합물일 수 있다. 이러한 표현형 확인 모델을 제작하기 위해서는, 선택된 성분의 1회 투여로 충분할 것이나, 대사 면에서 상이한 개별 개체가 식별되도록 하기에 충분히 클 필요는 있다. 반응 예측을 위한 모델을 제작하는 것이 목적인 경우, 투여 계획은 시험 개체에서 반응이 예측되어야 하는 투여 계획과 동일해야 한다.
3. 샘플
a. 투여전 샘플
투여전 샘플(들)은 관련 대사 정보를 함유하도록 선택될 필요가 있다. 필요한 경우, 하나보다 많은 유형의 샘플을 취할 수 있으며, 이들에 함유된 정보를 취합할 수 있다. 바람직하게는, 샘플(들)은 수득하기 용이하고, 샘플 채취 절차(들)는 통증 및 불편을 최소한으로만 야기한다. 투여전 샘플 채취 시간과 투여 시간 사이에 대사 표현형의 변화가 일어날 가능성을 최소화하기 위하여, 가능한한 투여 시간에 근접하여 투여전 샘플을 채취해야 한다.
뇨는 대사 정보가 풍부하게 함유되어 있기 때문에 이상적인 투여전 샘플이고, 특히 인간에서 불편을 거의 또는 전혀 주지 않으면서 이를 채취할 수 있다. 또한, 인간의 경우, 뇨는 본질적으로 요구시에 샘플로 채취될 수 있다. 래트 같은 동물로부터의 뇨 채집은 다소 더 어려우며; 요구될 때 수득될 수 없으며, 래트 같은 보다 작은 동물은 일반적으로 뇨 수집을 위해 특수하게 배치된 개별 우리 내에 수시간동안 가둬두어야 한다.
혈액도 대사 정보를 함유하며, 소량으로는 '콕 찌르기' 방법에 의해 보다 큰 동물 또는 인간으로부터 채취하기가 비교적 용이하다. 그러나, 응혈을 억제하기 위하여 특수한 설비를 제조해야 한다(예를 들어, 리튬 헤파린을 함유하는 혈청 또는 바이알의 사용). 특히 보다 작은 동물로부터 보다 많은 양의 혈액을 수득하기는 더욱 어렵고, 특수한 기법 및 전문 채혈자가 필요할 수 있다. 혈액 샘플 채취 부위 및 개체의 부동화의 용이성에 따라 마취 및/또는 진정이 필요할 수도 있다. 혈장 또는 혈청이 통상적으로 분석되는 두 가지 혈액-유래된 유체이다.
침, 땀, 날숨 또는 날숨 응축액, 눈물 및 모유는 수득하기 용이하고 연구의 성질에 따라 관련 대사 정보를 함유할 수 있는 다른 체액이다.
b. 투여후 샘플
투여후 샘플 유형은 용도에 따라 달라진다. 투여후 샘플은 환자 전체(예: 인간 또는 래트), 또는 상기 a. 부분에서와 같이 이 생물체로부터 유래된 샘플일 수 있다. 필요한 경우, 하나보다 많은 유형의 샘플을 취할 수 있다.
c. 샘플 안정성
세균 또는 다른 수단에 의해 열화될 수 있는 생물 샘플의 안정성을 보장하기 위하여 특수 설비를 사용할 필요가 있다. 상기 언급한 바와 같이, 혈액 또는 혈장의 응고를 방지하기 위하여 특수 설비를 제조할 필요가 있다. 뇨 샘플, 특히 대변 또는 다른 물질로 오염된 뇨는 아지드화나트륨 같은 항균제를 함유하는 바이알 내에 채집하는 것이 최선이다. 아지드화나트륨은1H NMR 분광분석법에 의해 나타나지 않는 이점을 갖는다. 상당한 시간에 걸쳐(즉, 수분이 아니라 수시간동안) 뇨 샘플을 채집하는 경우에는, 얼음 또는 다른 수단에 의해 채집 용기 또는 백을 냉각시키는 것이 최선이다. 일단 채집 및 안정화시킨 후에는, 생물 유체를 모두 즉시 분석하거나 또는 분석할 때까지 강하게 냉동시켜(-20℃ 이하) 저장해야 한다. 바람직하게는, 임의의 '고체' 조직 샘플은 채집 직후 액체 질소로 '즉석' 냉동시킨 다음 분석할 때까지 -80℃에서 저장한다. 가소화제 또는 다른 플라스틱 성분의 누출에 의해 샘플을 오염시키지 않는 채집 및 저장 용기를 선택해야 한다.
4. 샘플 제조
분석하기 전에 몇 가지 샘플 준비 및 처리가 필요할 수 있다. 상이한 작업자가 이용하는 정확한 절차에는 다소간의 변화가 있을 수 있으나,1H NMR 분광분석용 샘플은 전형적으로 다음과 같이 준비된다:
a. 뇨 샘플
뇨 400㎕를 포스페이트 완충액(0.2M Na2HPO4와 0.2M NaH2PO4의 81:19(v/v) 혼합물; pH 7.4) 200㎕와 혼합함으로써, NMR 분석을 위해 뇨 샘플을 전형적으로 준비하며; 뇨가 불충분하게 입수된 경우에는, 최소 200㎕의 뇨를 사용하며 부족분은 정제수로 보충한다. 뇨-완충액 혼합물을 실온에서 10분간 정치시켜 완충작용이 일어나도록 한 다음, 13,000rpm에서 추가로 10분간 원심분리시켜 현탁된 미립자를 제거한다. '투명한' 완충된 뇨 500㎕를 NMR 관으로 옮기고, TSP/D2O 용액 50㎕를 첨가한다. TSP(소듐 3-트라이메틸실릴-[2,2,3,3-2H4]-1-프로피온에이트)는 NMR 실험에 사용되는 화학적 이동 기준 화합물(δ 0)이고, D2O는 NMR 분광분석계의 자기장/주파수를 고정시킨다. TSP/D2O 용액의 농도는 NMR 관에서 0.1mM의 최종 TSP 농도를 제공하도록 하는 농도이다.
b. 혈장 샘플
혈장 150㎕를 염수(10%(v/v) D2O와 90%(v/v) H2O의 혼합물중 0.9%(w/v) NaCl) 350㎕와 혼합함으로써,1H NMR 분석을 위해 혈장 샘플을 전형적으로 준비한다. TSP 같은 화학적 이동 기준 화합물은 샘플중의 단백질에 결합할 가능성 때문에 첨가하지 않는다.
이용되는 분석 기법에 따라, 샘플을 화학적으로 유도화시켜 데이터 복구를 향상시킬 수 있다. 그러므로, 예를 들어 자외선 또는 가시광의 흡수를 모니터링하는 분광분석 검출기에 의해 검출될 수 없는 화합물에 적합한 발색단을 부착시킬 수 있다. 다른 선택사항은 형광 측정(fluorimetric) 분석에 의한 화합물의 검출성을 향상시키기 위하여 형광성 마커를 부착시키는 것이다. 이러한 화학적 유도화에 의해, 이전에 검출될 수 없었던 화합물을 검출될 수 있게 만들 수 있고, 검출 한계를 다른 것보다 개선시킬 수 있다. 또한 화학적 유도화를 이용하여, 상이한 샘플 성분의 크로마토그래피에 의한 분리를 용이하게 할 수 있다. 물리적 처리 및/또는 화학적 처리를 또한 이용하여 분석동안 문제를 일으키는 혈장 단백질 같은 바람직하지 못한 샘플 성분을 제거할 수 있다.
5. 물리적-화학적 분석 기법
a. 투여후 샘플의 분석
측정되는 변수(들) 및 샘플(예: 전체 생물체 또는 생체 유체 유형)의 수 및 성질과 관련하여 분석 기법(들)을 선택할 필요가 있다. 상이한 모델에서 관심을 끄는 광범위한 변수는 광범위한 분석 기기 및 방법이 필요할 수 있음을 의미한다.
용도가 특정 성분을 투여한 후 특정 반응(들), 예를 들어 혈압 변화를 측정하는 것이라면, 가장 적절한 기법(들), 예를 들어 혈압계를 선택해야 한다. 성분의 독성이 관심의 촛점인 경우에는, 예컨대 적절한 키트가 설치된 자동화된 임상 분석기를 사용하여 효소 활성 같은 광범위한 혈장 특질을 측정하는 것이 최선일 수 있다. 다르게는, 조직병리학적 발견을 효과의 유형에 따라 분류할 수 있거나, 또는 심각도에 따라 수치 등급을 매길 수 있다. 목적이 표현형 확인 모델을 제작하는 것이라면, 투여후 분석 기법에 의해 통상 투여된 성분의 하나 이상의 대사산물을 정량 또는 적어도 상대적으로 정량할 필요가 있다.
b. 투여전 샘플의 분석
투여후 샘플에서와 같이, 투여전 샘플에 대한 분석 기법의 선택은 샘플의 성질에 의해 영향을 받지만, 추가로 선택된 투여전 분석 비법은 대사 정보를 밝혀낼 수 있어야 한다. 바람직하게는, 체액 또는 체조직의 분석은 NMR 분광분석법에 의해 또는 간접적인 대사산물 검출 및 정량이 가능한 다른 기법에 의해서 이루어진다. 즉, 선택된 기법은 이상적으로는 특정 대사산물의 분석을 상술할 필요 없이 개별 대사산물을 검출 및 정량한다. 이에 의해, 현재 알려져 있지 않다 하더라도 가장 유용한 대사산물을 모델 내에 사용할 수 있게 된다. 또한, 관심있는 신규 대사산물 마커도 확인할 수 있다. 모델-제작의 경우, 관찰된 대사산물 각각을 확인할 필요는 없으며, 그보다는 분석 기법이 각 샘플의 신뢰성있는 정량적인 확인 수단을 제공해야 한다. 이상적으로는, 선택된 기법을 용이하게 이용할 수 있지만, 비용 및 요구되는 복잡화 수준 때문에 이것이 항상 가능한 것은 아니다. 대부분의 분석 화학 실험실에서 표준 분석 설비인 한 가지 가능한 기법은 예컨대 UV-가시광 분광분석 검출기를 갖는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)이다. 보다 시간이 많이 걸릴 수 있지만, HPLC 기법은 투여전 샘플로부터 요구되는 데이터의 유형을 제공할 수 있다. HPLC용 검출기의 선택은 결정적인 인자이며, 분석 전에 샘플을 화학적으로 유도화시킴으로써 데이터 복구가 용이해질 수 있다. NMR 분광분석법의사용은 임의의 특정 유형의 NMR 실험으로 한정되지는 않는다.
c. 상이한 분석 기기의 가변적인 성능
상이한 분석 장치는 상이하게 작동할 수 있으며, 하나의 설비의 성능은 시간에 따라 변할 수 있다. 이러한 기기의 변화는, OSC 같은 데이터 필터링이 '지도식' PR 분석에서의 그의 효과를 최소화시키도록 도움을 줄 수는 있지만, 성공적인 모델을 제작하기 위해 샘플간의 미묘한 투여전 변화를 특징지어야 할 필요가 있는 경우에 특히 중요할 수 있다. 따라서, 특정 모델을 제작함에 있어서, 하나의 특정 장치를 사용하여 한번에 특정 유형의 측정치를 모두 취하는 것이 이상적이다. 모든 분석을 한번에 수행할 수 없는 경우에는, 상이한 사용 기간 사이에 기기 성능이 크게 변화되지 않도록 할 필요가 있다. 모델-제작 개체군으로부터 측정치를 수득하는데 여러 개 또는 여러 유형의 설비가 사용되는 경우에는, 각각의 기기로부터 유사한 성능을 보장하도록 하기 위해 크로스-체크를 수행할 필요가 있다. 상이한 장치 사이에 상당한 성능 차이가 있는 경우에는, 기기의 해체 또는 재조정을 수행할 필요가 있다.
6. 다변량 PR 분석 전의 데이터 조작
PR 분석 전에 몇몇 데이터 조작을 수행하는 것이 도움이 되거나 필요할 수 있다.
이상적으로는, 화학 측정 분석용 입력 데이터를 생성시키는데 모든 입수가능한 물리적 데이터 및/또는 화학적 데이터를 이용한다. 그러나, 수득되는 데이터의 유형에 따라, 다변량 분석 전에 몇몇 데이터를 한정할 필요가 있을 수 있다. 뇨같은 생체 유체의1H NMR 분광분석 데이터의 경우, 버퍼링에도 불구하고 화학적 이동 눈금 상에서의 피크의 위치 면에서의 pH-유도된 작은 이동을 극복하기 위해 이를 이용하였다. 따라서, 잔류수 신호 같은 특정 영역을 삭제한 후, 각 1D1H NMR 스펙트럼의 나머지를 그의 가로좌표를 따라 연속적인 구획(600MHz 분광분석계의 경우 전형적으로 0.04ppm의 폭)으로 분할하고, 각 구획에 대해 적분치를 수득한다. 이러한 데이터 축소가 요구되는 경우에는, 상이한 데이터 축소 방법을 시도하는 것이 적절하다. 예를 들어, 이전의 시도에 의해 적절한 모델이 생성되지 않았다면, 상이한 스펙트럼 구획 폭의 사용을 권장할만하다. OSC 같은 데이터 필터링 기법을 사용하면, 변수 선택을 도와줌으로써 데이터 축소를 용이하게 할 수 있다.
생체 유체 NMR 데이터를 사용하여, 각 데이터-축소된 스펙트럼을 '정규화'시키는 것이 통상적인 관행이며, 이렇게 하는 여러 가지 방법이 있다. 흔히, 각 NMR 스펙트럼을 정규화 또는 기준화하여, 데이터 세트의 모든 다른 NMR 스펙트럼과 동일한 총 적분치를 제공한다. 또한, 다른 데이터 조작법, 예를 들어 뇨 샘플로부터의1H NMR 데이터를 존재하는 경우 δ 5.4에서의 알란토인 피크에 대해 일정한 적분치로 또는 크레아티닌 피크에 대해 일정한 적분치로 기준화시키는 방법이 도움이 되는 것으로 입증될 수 있다. 인간에서, 뇨 크레아티닌 배출량은 근육량과 관련되어 있고, 이는 다시 체질량과 약간 관련되어 있다. 따라서, 뇨 데이터를 일정한 크레아티닌에 대해 기준화시키면, 체질량에 관련된 배출량 차이를 없애는데 도움이 된다. 또한, 뇨중 대사산물 농도의 측정치를 결정하고, 각 개체에 의해 배출된 뇨의 양을 고려함으로써, 각 개체에 의한 대사산물 배출량을 진정으로 대표하는 데이터 세트를 수득할 수 있음이 분명하다. 대사산물 배출량이 결정되고 체질량 또한 공지되어 있으나 가변적인 경우에는, 뇨 데이터를 체질량 단위당 배출량에 대해 정규화시키는 것이 유용할 수 있다. 또한, 특정 범위 내에 속하는 값을 갖는 변수를 별도의 군으로서 처리하도록 데이터를 '블록(block)'하는 것도 유용할 수 있다.
PCA, PLS 또는 PLS-DA 같은 분석의 특정 제한점은 변수의 비선형 조합이 더욱 도움이 된다는 사실에도 불구하고 이들이 기존 변수의 유용한 선형 조합을 찾는데 의존한다는 점이다. 따라서, 이러한 분석을 수행하기 전에, 기존 변수의 비선형 조합을 첨가함으로써 X 데이터 행렬을 확장시키는 것이 현명하다. 특히, 가끔 상이한 대사산물의 상대적인 양이 중요한 경우에는, 두 변수의 비가 종종 어느 한 변수의 절대값보다 더 중요하고, 비를 고려하는 것이 대사 표현형 확인과 관련하여 특별하게 도움이 될 수 있다. 그러므로, 확장된 X 행렬은 원래의 X 변수와 함께 이들 원래의 변수 모두의 일대일 비(한 변수의 그 자신에 대한 비 제외)를 포함해야 한다. 이러한 방법이 다음 간단한 예에서 예시된다:
원래의 X 행렬;
확장된 X 행렬:
약간 더 복잡한 예에서는, 3개의 최초 X 변수를 확장시켜 6개 변수의 신규 행렬을 생성시킨다:
최초의 3가지 변수 행렬:
확장된 행렬:
2가지 X 변수로부터 하나의 Y 변수를 예측하고자 하는 하기 단순한 PLS-유형의 예에서 이 방법의 이점이 입증된다:
원래의 데이터 행렬:
확장된 행렬:
원래의 행렬에는 Y1을 생성시키는 X1과 X2의 일정한 선형 조합이 없었다. 그러나, 기재된 바와 같이 X 행렬을 확장시킴으로써, 매우 간단한 선형 관계(즉, Y1=2(X1/X2))가 명백해진다.
데이터 세트의 각 변수의 경우, 화학 측정 분석을 수행하기 전에 몇몇 기준화 형태가 통상적으로 요구된다. 전형적인 기준화 방법은 평균-중심화, 단위 변화 기준화 및 파레토(pareto) 기준화를 포함한다.
7. 화학 측정 방법
본 발명의 영역이 특정의 특수 화학 측정 방법의 사용으로 국한되지 않음을 인식하는 것이 중요하다. 투여 전후의 데이터의 상관관계를 확인 및 확립할 수 있는 이러한 임의의 방법을 이용할 수 있다.
PLS 또는 PLS-DA 같은 지도식 패턴 인지(PR) 방법을 통상적으로 이용하여, 표적화된 모델 제작(즉, 투여 전후 데이터의 상관관계)을 달성한다. 이들 지도식 방법 전에 PCA 같은 자율식 PR 방법을 이용함으로써, 투여된 화합물에 대한 반응의 변화를 조사하거나 투여된 화합물의 대사 변화를 조사할 수 있다. 이러한 자율식 분석은 제외되는 데이터를 확인하고 분류 방법을 제작할 것인지 또는 수치 결과 모델을 제작할 것인지의 여부를 결정하는데 도움이 될 수 있다(아래 참조).
때때로, 대사 표현형의 일부 양상의 투여전 식별 또는 반응 예측을 위한 모델을 획득하는 덜 복잡한 방법에서는, 투여전 데이터에 PCA 같은 자율식 방법을 적용하는 것이 적절할 수 있다. 이 방법은 지도식 방법에 비해 미묘한 식별 화합물을 결정하는 능력이 훨씬 적기는 하지만 간단하다는 이점을 갖는다. 이 방법은 투여후 행태에 따라 개별적인 모델 제작 투여전 데이터 지점을 코드(예컨대, 색상 코드)화할 수 있는 능력에 의존한다. 이 방법의 성공 또는 실패는 코드화된 개체군이 투여 전에 식별될 수 있는 용이성에 달려 있다. 일반적으로, 이 자율식 방법은 상이한 반응 군에 대해 비교적 뚜렷한 투여전 식별 화합물이 존재하는 경우에만 적합하다. 식별 화합물이 복잡하고 '숨겨져 있는' 경우에는 이것이 적합하지 못하며, 중요하게는 OSC 같은 데이터 필터링 방법을 이 '자율식' 방법과 함께 사용할 수 없다.
모델 제작에 사용되는 화학 측정 방법(들)은 예견되거나 요구되는 최종 용도에 따라 달라진다. 따라서, PLS-DA 같은 분류 방법은 대사 표현형의 몇몇 양상(예컨대 '빠르거나' '느린' 아세틸화)을 분류하는 방법 또는 투여된 성분에 대한 반응의 유형(예컨대, '유해한 약물 반응' 또는 '유해한 약물 반응 없음')을 예측하기 위한 방법을 달성함이 그 목적일 때 적절할 수 있다. 다르게는, 대사능의 몇몇 양상의 정량적인 척도를 달성하거나 또는 투여된 성분에 대한 일부 반응의 수치 척도를 예측하는 것이 그 목적인 경우, PLS 같은 방법이 적절하다. 용도에 따라 신경망 분석(NNA)이 유용할 수 있으며, NNA는 다수의 독립적인 공급원중 하나로부터 투여전 식별 화합물이 유래될 수 있는 분류 역할에 유리한 것으로 입증되었다. 예를들어, X 데이터가 유형 A 또는 B 또는 C인 경우 반응은 Y1이고, X 데이터가 이러한 유형이 아닌 경우에 반응은 Y2이다. 중요하게는, 신경망 방법에 의해서는 관심있는 식별을 제공하는 투여전 특징을 용이하게 확인할 수 없다. PCA, PLS 및 PLS-DA 같은 방법은 식별가능한 특징의 확인을 용이하게 가능케 하고, 이는 임의의 식별의 과학적 근거를 이해하는데, 또는 동일한 식별을 수행하는데 다른 분석 방법을 유도해야 할 필요가 있는 경우에 중요한 이점을 갖는다.
OSC 같은 데이터 필터링 방법을 종종 이용하여 투여후 데이터중 관심있는 변화에 상관없는 투여전 데이터의 변화를 없앤다. 예를 들어, OSC는 물리적 분석 및/또는 화학적 분석에 사용되는 분석 기기(들)의 임의의 성능 변화의 효과를 최소화시키는데 도움이 될 수 있다.
흔히, 비교적 소수의 제외되는 데이터들을 모델-제작 데이터로부터 배제할 필요가 있는데, 이는 이들 데이터가 몇몇 방식으로 모델 제작에 일치되지 않거나 방해가 되기 때문이며, 제외되는 데이터들을 확인하는데 PCA 등급 플롯 및 DmodX 값을 사용할 수 있다. PLS 모델의 경우, 제외되는 데이터들을 다음 임의의 수단에 의해 정당하게 배제시킬 수 있다:
a) X 등급의 검토(t1/t2).
b) 잔류하는 X의 검토(DmodX).
c) X 및 Y 공간에서의 등급 사이의 상관관계의 검토(예컨대, t1/u1).
d) Y 등급의 검토(예컨대, u1/u2).
e) 잔류하는 Y의 검토(DmodY).
8. 반응 예측 용도
살아있는 생물체에게 투여되는 성분은 흔히 다양한 상이한 대사 전환을 겪게 된다. 그 결과 생성되는 대사산물 각각은 다시 다양한 추가의 전환을 계속 겪게 된다. 따라서, 하나의 최초 화합물의 완전 대사는 상이한 경로와 많은 상이한 효소의 극도로 복잡한 복합 상태를 포함할 수 있다. 결과적으로, 다수의 상이한 표현형 영향이 투여되는 성분에 대한 반응의 성질에 기여할 수 있으며, 이러한 상이한 영향을 모두 다시 재정리하기는 매우 곤란할 수 있다. 그러므로, 반응 예측 용도와 관련하여서는, 상이한 영향을 재정리하지 않고 반응을 직접 예측하는데 본 발명을 이용하는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 수컷 스프라그-돌리 래트에게 갈락토스아민 HCl(800mg/kg)(실시예 1 참조)이 투여될 때 야기되는 매우 가변적인 간 손상 정도(조직 병리학 및 임상 화학 변수에 의해 보여지는 바와 같이)는 원칙적으로 투여전 뇨의 변화와 직접적으로 관련되어, 반응의 결정적 요인인 대사 인자를 알 필요 없이 갈락토스아민 HCl에 대한 감수성을 예측하는 모델을 제공할 수 있다.
B. 모델 유효화 절차의 바람직한 특징
모델 효력의 입증은 모든 유형의 수학적 모델 확인에 매우 중요하다. 모델의 견실성 및 예측능을 유효화시키는 데에는, 모델 제작에 사용되는 데이터와 무관한 유효화 데이터 세트가 필요하다. 모델의 예측능은 유효화 데이터 세트의 모델에 기초한 예측에 수반되는 오차의 크기에 따라 평가된다. 모델의 견실성은 유효화 데이터 세트의 모델에 기초한 예측에 수반되는 오차의 크기와 모델의 예측된 오차의 크기를 비교함으로써 판단할 수 있다. '미지' 샘플의 추후 예측에 신뢰할만한 것으로 생각되는 모델의 경우, 예측능 및 견실성의 두 가지 조건이 충족되어야 한다.
PLS 모델의 경우에는, 다음과 같이 '내부' 및 '외부' 유효화를 수행할 수 있다:
먼저 R2Y 및 Q2Y 값을 결정하고, 둘째로 X 행렬의 상응하는 열에 대한 Y 데이터의 위치의 무작위화(전형적으로는, 20가지의 별도의 열 변경이 수행됨)의 이들 값에 대한 효과를 관찰함으로써, PLS 모델의 '내부' 유효화를 수행할 수 있다. R2Y는 X 데이터로부터 Y 데이터를 설명하는 PLS 모델의 능력의 척도를 제공하며, 이들 데이터는 모두 모델에 포함된다. 그러나, 과도한 피팅에 의해 가짜로 높은 R2Y 값이 수득될 수 있으며, PLS 모델의 객관적인 시험은 그의 예측능이다. Q2Y는 PLS 모델의 예측능의 척도를 제공하며, 데이터의 나머지로부터 유도된 모델을 사용하여 XY 데이터의 상이한 부분이 X로부터의 Y의 예측을 연속적으로 지지하는 교차-유효화 절차에 의해 수득된다. R2Y 및 Q2Y는 둘 다 1의 이론적인 최대값을 갖지만, Q2Y는 통상 R2Y보다 작아야 한다. R2Y 및 Q2Y의 실제 값을 조건으로 하면, R2Y에 근접한 Q2Y의 값이 우수한 예측능을 암시한다. PLS 모델의 내부 유효화의 제 2 단계에서는, Y 데이터의 위치를 무작위화시키며, 원래의 모델이 유효한 경우 R2Y 및 Q2Y값은 둘 다 실질적으로 감소되어야 한다. X 행렬중 상응하는 열에 대해 Y 데이터의 위치를 무작위화시키면 Q2Y가 이상적으로는 0까지 크게 감소되어야 한다. R2Y 값도 Y 데이터의 무작위화시에 실질적으로 감소되어야 하지만, 모델 제작 과정에서는 항상 X 데이터에서 무작위화된 Y 데이터를 예측할 수 있는 뭔가를(심지어는 노이즈를) 찾고자 하기 때문에 반드시 0까지 감소되지는 않는다.
모델-제작 개체군의 일부를 형성하지 않고 그의 Y 값이 대략 모델의 Y 값 범위에 걸쳐있는 동물의 시험 세트를 취함으로써, PLS 모델의 '외부' 유효화를 수행할 수 있다. 유효한 것으로 간주되어야 하는 모델의 경우, 시험 샘플의 예측 오차(우메트릭스(Umetrics) 제품이 SIMCA 소프트웨어에서 이는 RMSEP-예측치의 평균 제곱 오차의 제곱근-로 칭해짐)가 모델 샘플의 추정 오차(우메트릭스의 SIMCA 소프트웨어에서, 이는 RMSEE-추정치의 평균 제곱 오차의 제곱근-로 칭해짐)와 동일한 범위에 있어야 한다.
C. 시험 절차의 바람직한 특징
본 발명의 한 가지 매우 중요한 특징은 특이하거나 과격한 대사 표현형을 갖는 개체의 확인에 관련되어 있다. 이들과 같은 개체는 유해하거나 색다른 약물 반응을 경험하기 특히 쉬울 수 있다. 임의의 모델 제작 실험에 포함될 수 있는 개체의 수에 가해지는 실제적인 제한점을 고려하면, 전체 범위의 대사 표현형에 기초하여 모델을 제작하기가 불가능하며, 진기한 표현형이 포함될 가능성이 없다. 또한, 인종 차이가 표현형 변화의 중요한 원천일 수 있다. 그러나, 시험 단계에서, 모델의 표현형 범위에 따르지 않는 임의의 표현형은 제외되는 것으로 확인될 수 있다는 것이 본 발명의 중요한 특징이다. 예를 들어 PCA 및 PLS 모델의 경우, 이들 제외되는 것들은 모델 평면 방향에서, 또는 PC- 또는 PLS-등급에 의해 설명되는 평면 위에서, 또는 모델 잔류 방향에서 모델까지의 거리(DModX, Y)로 검출된다. 또한, PLS 모델 제작의 경우, 등급 방향에서 제외되는 것들은 X-공간(T), Y-공간(U) 및X와Y의 내부 관계(T/U)에 제공될 수 있다. 제외되는 것으로 확인된 시험 개체에서는, 이들의 대사 표현형이 적절한 신뢰성으로 확인될 수 없거나 또는 대상 성분 투여에 대한 이들의 반응이 적절한 신뢰성으로 예측될 수 없다. 그러므로, 반응 예측 용도에서는, 이렇게 제외되는 개체들에게 성분을 전혀 투여하지 않거나 또는 크게 주의하면서 진행시키지 않는(예컨대 초기의 낮은 투여량으로 진행시키지 않음) 것이 합당하다. 그러므로, 모델 제작 절차의 실제 제한점에도 불구하고, 모델은 모든 시험 개체에 대해 유용한 정보를 제공할 수 있다.
이를테면 개체의 뇨의 단일 NMR 스펙트럼을 다양한 모델과 비교하여, 다양한 치료에 대한 개체의 반응을 예측하거나 또는 개체의 대사 표현형의 몇 가지 양상을 평가할 수 있다. 필요에 따라 또한 필요할 때 사용하기 위하여 NMR 스펙트럼을 전자적으로 저장할 수 있다. 이러한 유형의 방법은, 대사 표현형의 연령-관련 변화를 수용하기 위하여 개체의 일생의 상이한 단계에서의 시험이 필요할 수 있기는 하지만, 필요한 물리적 시험 및/또는 화학적 시험이 양을 감소시킨다.
통상적으로, 한 성분에 대해 유도된 모델을 밀접하게 관련된 성분과 함께 사용할 수는 있지만, 관심있는 성분 각각에 대해 신규의 모델이 필요하다.
본 발명의 각 요지의 바람직한 특징은 다른 요지 각각에 대해 준용된다. 본원에 언급된 종래 기술 문헌은 법률이 허용하는 최대 한도로 인용된다.
실시예 1. 갈락토스아민 하이드로클로라이드 투여에 대한 스프라그-돌리 래트의 가변적인 반응. 투여전 생체 유체 샘플의 NMR 스펙트럼의 단순한 반응-코드화된 PCA의 사용에 기초한 가능한 반응 예측 방법의 예.
프랑스 챨스 리버로부터 연령을 맞춘 젊은 성체 수컷 스프라그 돌리 래트 30마리를 구입하였다. 이들 각각이 건강해 보임을 확인하기 위해 관찰한 다음, 물 및 시판되는 표준 실험실용 식사(프랑스 빌리모이숑-슈르-오르그 소재의 유신 알리멘타시옹 라시오넬(Usine d'Alimentation Rationnelle) 제품인 식사 AO4C)에 자유롭게 접근할 수 있도록 하여 개별 대사 우리에 넣었다. 실험실 온도는 20±2℃로 유지시켰고, 상대 습도는 60±20%로 유지시켰다. 실험실 공기를 1시간에 14회씩 여과하고 바꿔주었다. '12시간 광-12시간 암소' 싸이클을 고정시켜 지켜주었다. 짧은 우리 '적응' 기간 후에 연구를 개시하였다. 샘플 채취 계획은 표 1.1에 기재되어 있다.
투여시(제1일에 개시함), 성장하는 래트는 각각 약 260g이었다. 갈락토스아민(GalN으로 약칭함) HCl(프랑스 시그마(Sigma) 제품)을 생리 식염수에 용해시키고, 200mg/kg 또는 800mg/kg으로 복강내 주사에 의해 투여하였는데, 동물 10마리(101 내지 110번)가 낮은 투여량을 투여받았고, 동물 10마리(201 내지 210번)가 높은 투여량을 투여받았다. 대조용 동물 10마리(1 내지 10번)는 옥수수유를 경구 투여받았다.
각 군 10마리의 래트중 5마리를 제2일에 CO2로 안락사시키고, 나머지는 동일한 방법으로 제8일에 안락사시켰다. 일찍 안락사시킨 래트는 6 내지 10번, 106 내지 110번 및 206 내지 210번이었다. 늦게 안락사시킨 래트는 1 내지 5번, 101 내지 105번 및 201 내지 205번이었다.
항균 보존제로서 아지드화나트륨(물중 아지드화나트륨 10%(w/v) 용액 0.100ml)을 함유하는 빙냉 용기에 하루 7시간동안 투여전 뇨 샘플 및 투여후 뇨 샘플을 채집하였다. 투여하는 날에는 추가로 밤 동안에도 뇨를 채집하였다(투여후 7내지 24시간). 세균, 음식 및 대변 오염을 최소화시키기 위하여 매회 채집하기 전에 뇨 채집 장치를 세정하였다. NMR 분석을 수행할 때까지 뇨 샘플을 강하게 냉동시켰다.
아이소플루레인 마취하에 안와동으로부터 혈액을 채취하였다. 제-3일에, 또한 제2일 또는 제8일에 안락사시키기 직전에, 모든 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 안락사시킨 후, 각 래트로부터 10개의 간 샘플(각 간엽으로부터 2개)을 채취함을 포함하는 샘플 채취 방법으로 각 래트로부터 조직 병리학 시험용 샘플을 채취하였다. 항응고제로서 리튬 헤파린을 함유하는 바이알에 혈액 샘플을 채집하고, 약 -4℃에서 즉시 원심분리시켜 혈장을 분리하였다. AU600 다변수 임상 분석기(올림푸스(Olympus)) 상에서 30℃에서, 각 혈장 샘플의 일부를 특히 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)를 포함하는 광범위한 임상 화학 변수에 대해 분석하였다.
뇨 400㎕를 포스페이트 완충액(0.2M Na2HPO4와 0.2M NaH2PO4의 81:19(v/v) 혼합물; pH 7.4) 200㎕와 혼합함으로써 NMR 분석용 뇨 샘플을 준비하고, 뇨가 충분히 입수되지 못한 경우에는 최소 200㎕의 뇨를 사용하면서 부족분을 정제수로 보충하였다. 뇨-완충액 혼합물을 실온에서 10분간 정치시켜, 완충작용이 일어나도록 한 다음, 13,000rpm에서 추가로 10분간 원심분리시켜 현탁된 미립자를 제거하였다. '투명한' 완충된 뇨 500㎕를 NMR 관으로 옮기고, TSP/D2O 용액 50㎕를 첨가하였다. TSP(소듐 3-트라이메틸실릴-[2,2,3,3-2H4]-1-프로피온에이트)는 NMR 실험에 사용되는 화학적 이동 기준 화합물(δ 0)이고, D2O는 NMR 분광분석계의 자기장/주파수를 고정시켰다. TSP/D2O 용액의 농도는 NMR 관에서 0.1mM의 최종 TSP 농도를 제공하도록 하는 농도이다. 물의 신호의 크기를 감소시키는데 사용되는 NOESYPRESAT 연속 파동(클라리지(Claridge), 1999)을 갖는 브루커(Bruker) AMX 600 MHz NMR 분광분석계 상에서 30℃에서 NMR 분석을 수행하였다. 주요 획득 변수는 다음과 같았다:
분광분석계 주파수: 600MHz
스펙트럼 폭: 약 7200Hz(12ppm)
브루커 파동 프로그램: noesypr1d
시간 도메인에서 데이터 지점의 수: 65536
주사의 수: 64
모조 주사의 수: 4
획득 시간: 약 4.55초
예비 포화 시간: 3초
혼합 시간: 0.1초.
획득 후, 자유 유도 감퇴 신호에 적용되는 기하급수적 증대에 의한 0.3Hz 선-확장의 적용 후 NMR 스펙트럼을 32768 데이터 지점으로 푸리에(Fourier)-전환시켰다. 스펙트럼을 조정하여 NMR 신호 주위에 편평한 기준선을 제공하고, δ 0 내지 TSP 피크의 값을 지정함으로써 화학적 이동 눈금을 설정하였다. 데이터-축소 전에, 직선 기준선 보정 연산을 이용하여 제-1일 스펙트럼 각각의 기준선을 0의 강도로 이동시켰다. 'xwinnmr' 소프트웨어(브루커 게엠베하(Bruker GmbH))를 사용하여 실리콘 그래픽스(Silicon Graphics) 컴퓨터 상에서 이러한 모든 스펙트럼 처리 작업을 수행하였다.
투여후 뇨의 NMR 스펙트럼을 육안으로 조사한 결과, 내인성 대사산물에 대한 갈락토스아민 HCl(800mg/kg)의 효과와 관련하여 큰 동물간 변화가 드러났다(표 1.5 및 도 1.3 및 1.4 참조). 이러한 육안 조사에 기초하여, 동물의 범주를 (i) '반응군' 또는 (ii) '약한 반응군 또는 비-반응군'으로 용이하게 나눌 수 있었다. 또한, 반응군은 약한 반응군/비-반응군보다 투여후 0 내지 24시간의 기간에 걸쳐 그들의 뇨에 훨씬 더 많은 양의 갈락토스아민을 배출한 것으로 밝혀졌으며(도 1.1 및 표 1.6 참조), 이는 갈락토스아민 대사와 그의 독성 간의 관계를 나타낸다.
도 1.1은 3개의 NMR 스펙트럼을 보여준다. 스펙트럼 'a'는 투여한지 0 내지 7시간 후에 201번 동물로부터 채집된 제1일 뇨의 스펙트럼이다. 스펙트럼 'b'는 진짜 GalN HCl로부터 수득된 것이다. 스펙트럼 'c'는 투여한지 0 내지 7시간 후에 203번 동물로부터 채집된 제1일 뇨의 스펙트럼이다. 스펙트럼 'a'와 'c'는 일정한 알란토인(δ 5.4) 피크 높이를 갖도록 기준화되어 있다. GalN은 201번 동물의 뇨에는 분명히 존재하지만, 203번 동물의 뇨에는 존재하지 않는다.
뿐만 아니라, 투여한지 24 내지 31시간 후에 채집된 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼에서는, 반응군이 적어도 크게는 약한 반응군/비-반응군의 스펙트럼에는 없는 특정 N-아세틸 피크의 존재를 보여주였다(도 1.2 참조). 이 피크는 잠정적으로 N-아세틸갈락토스아민으로 지정되었다. 800mg/kg 투여량에 대한 반응의 큰 동물간 변화가 또한 조직 병리학 데이터 및 임상 화학 데이터에도 반영되었다(표 1.2 내지 1.4 참조).
도 1.2는 투여한지 24 내지 31시간 후에 202번 동물(스펙트럼 'a')과 203번 동물(스펙트럼 'b')로부터 채집된 2가지 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼을 도시한다. 스펙트럼은 일정한 크레아티닌으로 기준화된다. N-아세틸갈락토스아민인 것으로 생각되는 N-아세틸화된 화합물이 스펙트럼 'a'에는 명백히 존재하지만 스펙트럼 'b'에는 존재하지 않는다.
이어, 갈락토스아민 하이드로클로라이드(800mg/kg)가 후속 투여되는 동물의 제-1일(투여전) 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼 상에서 PCA를 수행하였다. 206번 동물의 NMR 스펙트럼을 얻기에는 제-1일 뇨가 불충분하였기 때문에 이 데이터 세트는 9개의 스펙트럼으로 구성되었다. PCA를 수행하기 전에, 제-1일 스펙트럼 각각에 대해 'AMIX' 소프트웨어(브루커 게엠베하)를 사용하는 고정된 방식으로 '데이터를 축소'시켰다. 특정 스펙트럼 영역을 배제하였으며, 보유된 영역은 δ 9.0 내지 δ 6.25 및 δ 4.5 내지 δ 2.76 및 δ 2.48 내지 δ 0.5였다. 보유된 영역을 가능한한 0.04ppm 폭의 연속 구획으로 분할하고, 각 스펙트럼의 각 구획에 대해 적분치를 수득하였다. 이어, 데이터-축소된 값을 균일하게 정규화하여, 각 '스펙트럼'에 대해 총 1000의 적분값을 수득하였다. 생성된 데이터 세트를 다변량 통계 분석 소프트웨어 패키지(인포메트릭스(Infometrix) 제품인 'Pirouette')에 로딩하였다. 이어, 각 변수에 대해 평균-중심화 기준화를 이용하여 PCA를 수행하였다. 생성된 등급 플롯을 투여후 행태에 따라 색상-코드화시켰으며, 검사에 의해 PC 1 대 PC 5에 대한 등급 플롯이 반응군과 비-반응군을 분리시키는 것으로 밝혀졌다. 이 플롯 및 상응하는 로딩 플롯은 각각 도 1.5 및 1.6으로 도시된다. 도 1.5를 조사한 결과, 공지 반응군 및 비-반응군과 관련하여 어떤 방식으로 맵핑되었는지에 따라 적절한 투여전 PCA 등급 플롯으로부터 갈락토스아민 HCl(800mg/kg)의 투여에 대한 개별 래트의 반응을 예측할 수 있음이 암시된다. 도 1.6은 어떻게 이러한 분석이 반응군과 비-반응군을 식별할 수 있도록 하는 투여전 특징을 드러내는지를 보여준다.
하기 다양한 도면 및 표는 갈락토스아민 HCl(800mg/kg)에 대한 상이한 래트의 가변적인 반응을 다소 상세하게 기재하고 있으며, PCA를 사용하여 투여 전에 반응군 및 비-반응군을 식별할 수 있는 방법을 보여준다. PLS, PLS-DA 또는 신경망 분석을 이용하는 지도식 PR 방법은 본원에 기재된 자율식 PR 방법보다 반응군 및 비-반응군을 투여 전에 더욱 우수하게 식별할 수 있다.
도 1.3은 202번 동물로부터의 제-1일 및 제+3일 뇨 샘플의 noesypresat NMR 스펙트럼의 일부를 도시한다. 투여전 샘플(스펙트럼 'a')은 투여하기 24 내지 17시간 전에 채집하였다. 투여후 샘플(스펙트럼 'b')은 투여한지 48 내지 55시간 후에 채집하였다. 스펙트럼을 일정한 크레아티닌으로 기준화시킨다. 스펙트럼 'a'와 비교하여, 스펙트럼 'b'는 크레아틴, 베타인, 구아니디노아세트산(GAA) 및 타우린의 증가, 및 트라이메틸아민-N-옥사이드(TMAO) 및 2-옥소글루타레이트의 감소를 나타낸다.
도 1.4는 201번 동물로부터의 제-1일 및 제+3일 뇨 샘플의 noesypresat NMR 스펙트럼의 일부를 도시한다. 투여전 샘플(스펙트럼 'a')은 투여하기 24 내지 17시간 전에 채집하였다. 투여후 샘플(스펙트럼 'b')은 투여한지 48 내지 55시간 후에 채집하였다. 스펙트럼을 일정한 알란토인으로 기준화시킨다. 스펙트럼 'a'와 비교하여, 스펙트럼 'b'는 증가된 히스티딘 배출량 및 감소된 히퓨레이트 배출량을 보여준다.
206번 동물이 강한 반응군인 것을 감안할 때, 206번 동물에 의해 배출된 갈락토스아민의 측정된 양은 예측된 것보다 다소 낮았으며, 이는 방광에 잔류한 뇨 때문일 수 있다. 투여 후 0 내지 24시간에 걸쳐 206번 동물은 3.7ml의 뇨만 배출하였으며, 이는 그 기간동안 임의의 동물에 의해 생성된 뇨중 가장 적은 양이었다. 측정된 뇨 부피가 매우 작을 때에는 대사산물 배출량이 대부분 과소평가될 수 있으며; 이는 방뇨하기에는 불충분한 고도로 농축된 뇨 상당량이 방광에 잔류할 수 있기 때문이다.
도 1.5는 고투여량(800mg/kg) 동물의 제-1일 뇨 샘플 9개에서 입수할 수 있는1H NMR 스펙트럼의 PCA에 의해 수득된 PC 등급 플롯을 도시하며; 206번 동물의 NMR 스펙트럼을 수득하기에는 제-1일 뇨가 불충분하게 입수되었다. 비-반응군(203, 204, 205, 207 및 208번 동물)에 대한 데이터 지점은 다이아몬드를 사용하여코드화되고, 반응군(201, 202, 209, 210번 동물)에 대한 데이터 지점은 가위표를 사용하여 코드화되지만, 207번 동물은 반응군과 비-반응군의 경계선상에 있음에 주목해야 한다. 이 플롯은 갈락토스아민 800mg/kg에 의해 유해하게 영향을 받는 동물과 영향을 받지 않는 동물 사이에 구별될 수 있는 투여전 뇨 스펙트럼의 특징이 있음을 보여준다. 반응군은 비-반응군보다 더 높은 투여전 뇨 크레아틴 수준을 가지며, 반응군중 하나(201번 동물)는 비-반응군보다 더 낮은 투여전 뇨의 2-옥소글루타레이트/크레아티닌 비를 가졌다(도 1.6 참조).
도 1.6의 플롯팅된 지점 각각은 그가 나타내는 0.04ppm 폭의 스펙트럼 구획의 중심을 따라 라벨링된다. 따라서, 예컨대 3.02로 라벨링된 지점은 δ 3.04 내지 δ 3.00ppm의 스펙트럼 구획(또는 변수)을 나타낸다. 관심있는 지점은 PC 1 및 PC 5에 대해 실질적으로 0이 아니도록 기여되는 것을 포함한다. 도 1.5와 1.6을 비교하면, 반응군과 비교하여 비-반응군이 δ 3.02에 중심을 둔 스펙트럼 구획의 적분치에 대해 비교적 더 높은 값을 가짐을 나타낸다. 이 차이는 비-반응군에서의 보다 높은 2-옥소글루타레이트 수준에 기여하는 것으로 보이고, 2-옥소글루타레이트는 또한 δ2.46에 중심을 둔 구획에 기여하는 것으로 보인다. 트라이메틸아민-N-옥사이드가 δ3.26에 중심을 둔 구획에 주요하게 기여하고, 따라서 비-반응군은 높은 뇨중 TMAO 수준을 가질 수 있다. 이에 대해 가능한 설명 한 가지는 비-반응군이 늦은 아세틸레이터라는 것이다.
실시예 2. 래트에서 가변적인 뇨의 아이소니아지드 대사산물 패턴 및 아이소니아지드의 독성과 이들의 관계. 대사능의 개체간 차이의 주요 의의의 예.
프랑스 챨스 리버로부터 연령을 맞춘 젊은 성체 수컷 스프라그 돌리 래트 30마리를 구입하였다. 이들 각각이 건강해 보임을 확인하기 위해 관찰한 다음, 물 및 표준화된 식사(프랑스 빌리모이숑-슈르-오르그 소재의 유신 알리멘타시옹 라시오넬 제품인 식사 AO4C)에 자유롭게 접근할 수 있도록 하여 개별 대사 우리에 넣었다. 실험실 온도는 20±2℃로 유지시켰고, 상대 습도는 60±20%로 유지시켰다. 실험실 공기를 1시간에 14회씩 여과하고 바꿔주었다. '12시간 광-12시간 암소' 싸이클을 고정시켜 지켜주었다. 짧은 우리 '적응' 기간 후 래트가 약 6주령이 되고 약 200g이 되었을 때 연구를 개시하였다.
성장하는 래트가 각각 약 250g이 되었을 때 '제1일'로 지칭된 날에 투여하였다. 아이소니아지드(프랑스 시그마 제품)를 생리 식염수에 용해시키고, 200mg/kg 또는 400mg/kg으로 복강내 주사에 의해 투여하였는데, 동물 10마리(101 내지 110번)가 낮은 투여량을 투여받았고, 동물 10마리(201 내지 210번)가 높은 투여량을 투여받았다. 대조용 동물 10마리(1 내지 10번)에는 염수를 복강내 주사하였다.
항균 보조제로서 아지드화나트륨(물중 아지드화나트륨 10%(w/v) 용액 0.1ml)을 함유하는 빙냉 용기에 하루 7시간동안 투여전 뇨 샘플 및 투여후 뇨 샘플을 채집하였다. 투여후 7 내지 24시간에 걸쳐 추가로 하룻밤동안 뇨를 채집하였다. 세균, 음식 및 대변 오염을 최소화시키기 위하여 매회 채집하기 전에 뇨 채집 장치를 세정하였다. 아지드 용액에 대해 보정하지 않은 상태로 각 뇨 샘플의 최종 부피를 결정하였다. 분석할 때까지 뇨 샘플을 냉동 저장하였다.
안락사시키기 직전에 투여후 혈액 샘플을 채취하고, 안락사시킨 직후에 조직병리학 분석을 위해 샘플을 채취하고자 하였다. 실시예 1에서와 같이, 각 군 10마리의 래트중 5마리를 투여한지 1일 후에 CO2에 의해 안락사시킴으로써 초기 혈액 및 조직 병리학 샘플을 제공하였고; 나머지는 동일한 방법으로 투여한지 7일 후에 안락사시켜 늦은 혈액 및 조직 병리학 샘플을 제공하고자 하였다. 일찍 안락사시킨 래트는 6 내지 10번, 106 내지 110번 및 206 내지 210번인 반면, 늦게 안락사시킨 래트는 1 내지 5번, 101 내지 105번 및 201 내지 205번이 되도록 하는 것이 계획이었다. 그러나, 높은 투여량의 아이소니아지드를 투여받은 군으로부터의 몇몇 동물(204, 205, 207 및 209번)이 예기치 못한 구토를 하였고, 일부는 죽었고 일부는 고통을 없애기 위해 일찍 안락사시켰다. 현저하게는, 비교한 결과, 높은 투여량의 군으로부터의 다른 동물(201 내지 203, 206, 208 및 210번)은 눈에 띄는 질병의 임상적 징후를 나타내지 않았다. NMR 분석할 때까지 뇨 샘플을 강하게 냉동시켰다.
뇨 400㎕를 포스페이트 완충액(0.2M Na2HPO4와 0.2M NaH2PO4의 81:19(v/v) 혼합물) 200㎕와 혼합함으로써 NMR 분석용 뇨 샘플을 준비하고, 뇨가 충분히 입수되지 못한 경우에는 최소 200㎕의 뇨를 사용하면서 부족분을 정제수로 보충하였다. 뇨-완충액 혼합물을 실온에서 10분간 정치시켜, 완충작용이 일어나도록 한 다음, 13,000rpm에서 추가로 10분간 원심분리시켜 현탁된 미립자를 제거하였다. '투명한' 완충된 뇨 500㎕를 NMR 관으로 옮기고, TSP/D2O 용액 50㎕를 첨가하였다. TSP(소듐 3-트라이메틸실릴-[2,2,3,4-2H4]-1-프로피온에이트)는 NMR 실험에 사용되는 화학적 이동 기준 화합물(δ0)이고, D2O는 NMR 분광분석계의 자기장/주파수를 고정시켰다. TSP/D2O 용액의 농도는 NMR 관에서 0.1mM의 최종 TSP 농도를 제공하도록 하는 농도이다. 물의 신호의 크기를 감소시키는데 사용되는 NOESYPRESAT 연속 파동(클라라지, 1999)을 갖는 브루커 AMX 600 MHz NMR 분광분석계 상에서 303K에서 NMR 분석을 수행하였다. 주요 획득 변수는 다음과 같았다:
분광분석계 주파수: 600MHz
스펙트럼 폭: 약 7200Hz(12ppm)
브루커 파동 프로그램: noesypr1d
시간 도메인에서 데이터 지점의 수: 65536
주사의 수: 64
모조 주사의 수: 4
획득 시간: 약 4.55 초
예비 포화 시간: 3초
혼합 시간; 0.1초.
획득 후, 자유 유도 감퇴 신호에 적용되는 기하급수적 증대에 의한 0.3Hz 선-확장의 적용 후 NMR 스펙트럼을 32768 데이터 지점으로 푸리에-전환시켰다. 스펙트럼을 조정하여 NMR 신호 주위에 편평한 기준선을 제공하고, δ 0 내지 TSP 피크의 값을 지정함으로써 화학적 이동 눈금을 설정하였다. 스펙트럼 및 선택된 확장 스펙트럼을 종이에 플롯팅하였다. 다변량 패턴 인지 방법에 의해 스펙트럼 세트를조사하는 경우에는, 직선 기준선 보정 연산을 이용하여 스펙트럼 각각의 기준선을 0의 강도로 이동시켰다. 'xwinnmr' 소프트웨어(브루커 게엠베하)를 사용하여 실리콘 그래픽스 컴퓨터 상에서 이러한 스펙트럼 처리 작업을 수행하였다.
투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 NMR 스펙트럼을 육안으로 조사한 결과, 아이소니아지드로부터 유도되는 것으로 생각되는 특정 대사산물의 패턴에 실질적인 변화가 드러났다. 이러한 변화는 3가지 상이한 N-아세틸화 화합물로부터 유래되는 것으로 생각되는 2ppm 영역에서 특히 뚜렷한 3개의 피크였다. 약 2.22, 2.20 및 2.15ppm에서의 이들 피크는 이후 각각 피크 'a', 'b' 및 'c'로 일컬어지며, 이러한 피크가 발생되도록 하는 화합물은 이후 화합물 'A', 'B' 및 'C'라고 한다. 각 투여량에서, 본질적으로 2개의 상이한 이들 대사산물 패턴 유형이 나타났으며, 유형 1 및 유형 2라고 하는 이들 상이한 패턴의 예가 도 2.1에 도시되어 있다.
아이소니아지드(200mg/kg)를 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 샘플의 데이터-축소된 NMR 스펙트럼의 PCA도 대사 변화를 드러내었다(도 2.2 참조). 이 분석을 수행하기 위하여, 9개의 입수가능한 샘플의 NMR 스펙트럼에 대해 먼저 AMIX 소프트웨어(브루커 게엠베하)를 사용하는 고정된 방식으로 '데이터를 축소'시켰다. δ 2.23 내지 δ 2.13의 N-아세틸 영역을 제외한 모든 스펙트럼 영역을 폐기하였다. 각 스펙트럼의 나머지 부분을 2개의 연속하는 0.05ppm 폭의 구획으로 분할하고, 각 구획에 대해 적분치를 수득하였다. 이어, 데이터-축소된 값을 정규화하여, 각 '스펙트럼'에 대해 총 1000의 적분값을 수득하였다. 생성된 데이터 세트를 다변량 통계 분석 소프트웨어 패키지(인포메트릭스 제품인 'Pirouette')에 로딩하고,각 변수(스펙트럼 구획)에 대해 평균-중심화 기준화를 이용하여 주성분 분석(PCA)을 수행하였다. 단지 2개의 입력 변수만이 존재한 바, 이는 PCA의 사소한 예이지만, 앞서 결정된 바와 같은 N-아세틸 패턴의 두 가지 상이한 유형의 존재를 뒷받침하였다. 유형 1 동물은 101, 103 및 109번 동물이었고, 유형 2 동물은 102, 105, 106, 107, 108 및 110번 동물이었다. 도 2.2에서는, 유형 1 동물의 데이터 지점이 가위표로 표시된 반면, 유형 2 동물의 데이터 지점은 다이아몬드로 표시된다.
아이소니아지드는 인간에서 그의 대사가 N-아세틸레이터 표현형에 의해 영향을 받는 성분의 전통적인 예이고, 이 실시예에서 관찰된 상이한 대사 패턴은 시험군 내에 느린 N-아세틸레이터와 빠른 N-아세틸레이터가 있음을 암시하였다. 아이소니아지드 대사산물 패턴은 다소 투여량-의존적이었지만, 투여량 수준에 관계없이 고정된 피크 높이 비 기준에 기초하여 모든 제1일(0 내지 7시간) 뇨 스펙트럼을 유형 1 패턴 또는 유형 2 패턴을 갖는 것으로 지정할 수 있었다. 현저하게는, 고투여량 수준에서, N-아세틸의 유형 2 패턴을 나타내는 동물만이 특정 독성 반응(이는 신장 기능 상실(증가된 뇨당 및/또는 락테이트에 의해 나타남), 구토 및 사망을 포함함)을 나타내었다(표 2.1 참조).
피크 높이(pk. ht.로 약칭함)는 국부적인 기준선을 감한 후 플롯팅된 스펙트럼으로부터 측정하였다(mm 단위).
N-아세틸 패턴 유형을 결정하기 위한 기준:
200mg/kg 투여량에서는 신장 기능 상실이 검출되지 않았으나, 400mg/kg 투여량에서는 몇몇 동물이 손상된 신장 기능을 나타내었다. 또한, 400mg/kg 투여량에서는, 관찰된 아세틸 패턴의 유형과 신장 기능 상실이 있는지의 여부 사이에 상관관계가 있다. 유형 2 동물만이 글루코즈 및 락테이트의 증가된 뇨중 수준에 의해 입증되는 바와 같이 신장 기능 상실을 나타내었다. 유형 2 아세틸 패턴을 나타내는 동물로서 206번 동물은 뇨중 락테이트와 관련하여 다소 파격적인 행태를 보였다. 그러나, 아세틸 피크 높이 비에 의해 정의되는 유형 2 영역의 극단 가장자리에 이 동물이 속한다는 점에 주목할만하다.
400mg/kg 투여량에서는, 관찰된 아세틸 패턴의 유형과 구토 및 조기 사망이 일어나는지의 여부 사이에 추가적인 관련이 있다. 유형 2의 동물에서만 구토 및 조기 사망이 발생하였다. 또 다시, 206번 동물은 유형 2이지만 조기 사망하지 않았다는 점에서 이례적이었다.
표 2.1은 N-아세틸 패턴에 반영된 몇몇 대사 차이가 아이소니아지드 독성에 결정적인 효과를 가짐을 암시한다. 결정적인 대사 관계는 1) N-아세틸화에 의해 N-아세틸아이소니아지드로 전환되거나 또는 2) 아이소니아지드의 아마이드기의 가수분해에 의해 하이드라진 및 아이소니코틴산으로 전환될 수 있는 아이소니아지드의 초기 전환인 것으로 의심된다.
본 발명자들은 관찰된 구토에 대한 책임이 하이드라진에 있는 것으로 의심하고 있으며, 이 연구에서 독성 반응을 보인 동물들은 특정 N-아세틸레이터 표현형을 갖고(즉, 이들은 비교적 느린 N-아세틸레이터이고) 따라서 비교적 빠른 N-아세틸레이터인 것으로 추정되는 다른 고투여량 동물에서보다 400mg/kg 투여량으로부터 더욱 독성인 하이드라진을 생성시킨 것으로 가정하고 있다. 이 연구에서 관찰된 아이소니아지드(400mg/kg)의 가변적인 효과의 근본적인 인자(들)의 성질을 확인하기 위하여, 피크 'a', 'b'를 나타내는 화합물 'A' 및 'B'를 밝혀내야 한다. 화합물 'C'는 N-아세틸아이소니아지드인 것으로 밝혀졌다.
본 실시예는 널리 공지되어 있는 바와 같이 투여된 성분의 대사산물 패턴을 이용하여 상이한 대사 표현형을 구별할 수 있음을 입증한다. 본 실시예는 또한 PR 방법을 사용함으로써 이들 대사산물 패턴을 검사할 수 있음을 보여준다. 본 실시예는 또한 투여되는 특정 성분에 대한 각 개체의 반응을 결정함에 있어서 대사 표현형의 결정적인 중요성을 입증한다. 다음 실시예에서는, 본 발명에 의해 생물 샘플에서의 투여전 변화와 투여후 대사 행태의 변화를 관련지어 예측가능한 모델을 제공할 수 있음을 보여준다.
실시예 3. 아이소니아지드(200mg/kg)가 후속 투여되는 수컷 스크라그-돌리 래트에서 뇨중 아이소니아지드 대사산물의 양의 투여전 예측. 수치에 의한 투여 전으로부터 투여 후의 예측이 달성될 수 있음을 보여주는 예.
프랑스 챨스 리버로부터 연령을 맞춘 젊은 성체 수컷 스크라그 돌리 래트 75 마리를 구입하였다. 이들이 건강해 보임을 확인하기 위해 선별한 다음, 물 및 표준화된 실험실용 식사(프랑스 빌리모이숑-슈르-오르그 소재의 유신 알리멘타시옹라시오넬 제품인 식사 AO4C)에 자유롭게 접근할 수 있도록 하여 개별 대사 우리에 넣었다. 실험실 온도는 20±2℃로 유지시켰고, 상대 습도는 60±20%로 유지시켰다. 실험실 공기를 1시간에 14회씩 여과하고 바꿔주었다. 고정된 '12시간 광-12시간 암소' 싸이클을 부과하였다. 짧은 우리 '적응' 기간 후 래트가 약 6 주령이되고 약 200g이 되었을 때 연구를 개시하였다. 성장하는 래트가 각각 약 250g이 되었을 때 투여하였다. 아이소니아지드(프랑스 시그마 제품)를 생리 식염수에 용해시키고, 200mg/kg의 복강내 주사에 의해 각 래트에 투여하였다.
항균 보존제로서 아지드화나트륨(물중 아지드화나트륨 10%(w/v) 용액 1.0ml)을 함유하는 빙냉 용기에 개별적인 투여전(투여하기 48 내지 41시간 전) 뇨 샘플 및 투여후(투여한지 0 내지 7시간 후) 뇨 샘플을 채집하였다. 세균, 음식 및 대변 오염을 최소화시키기 위하여 매회 채집하기 전에 뇨 채집 장치를 세정하였다. 아지드 용액에 대해 보정하지 않은 상태로 각 뇨 샘플의 최종 부피를 결정하였다.
뇨 400㎕를 포스페이트 완충액(0.2M Na2HPO4와 0.2M NaH2PO4의 81:19(v/v) 혼합물; pH 7.4) 200㎕와 혼합함으로써 NMR 분석용 뇨 샘플을 준비하고, 뇨가 충분히 입수되지 못한 경우에는 최소 200㎕의 뇨를 사용하면서 부족분을 정제수로 보충하였다. 뇨-완충액 혼합물을 실온에서 10분간 정치시켜, 완충작용이 일어나도록 한 다음, 13,000rpm에서 추가로 10분간 원심분리시켜 현탁된 미립자를 제거하였다. '투명한' 완충된 뇨 500㎕를 NMR 관으로 옮기고, TSP/D2O 용액 50㎕를 첨가하였다. TSP(소듐 3-트라이메틸실릴-[2,2,3,4-2H4]-1-프로피온에이트)는 NMR 실험에 사용되는 화학적 이동 기준 화합물(δ0)이고, D2O는 NMR 분광분석계의 자기장/주파수를 고정시켰다. TSP/D2O 용액의 농도는 NMR 관에서 0.1mM의 최종 TSP 농도를 제공하도록 하는 농도였다.
물의 신호의 크기를 감소시키는데 사용되는 NOESYPRESAT 연속 파동(클라리지, 1999)을 갖는 브루커 600 MHz NMR 분광분석계 상에서 30℃에서 준비된 뇨 샘플의 NMR 분석을 수행하였다. 브루커 DRX 분광분석계를 사용하여 투여후 NMR 데이터를 수득하는 한편, 브루커 AMX 분광분석계를 사용하여 투여전 NMR 데이터를 획득하였다. 주요 획득 변수는 다음과 같았다:
분광분석계 주파수: 600MHz
스펙트럼 폭: 약 7200Hz(12ppm)
브루커 파동 프로그램: noesypr1d
시간 도메인에서 데이터 지점의 수: 65536
주사의 수: 32(투여후 스펙트럼); 64(투여전 스펙트럼)
모조 주사의 수: 4
획득 시간: 약 4.55 초
예비 포화 시간: 3초
혼합 시간: 0.1초.
획득 후, 자유 유도 감퇴 신호에 적용되는 기하급수적 증대에 의한 0.3Hz 선-확장의 적용 후 NMR 스펙트럼을 32768 데이터 지점으로 푸리에-전환시켰다. 스펙트럼을 조정하여 NMR 신호 주위에 편평한 기준선을 제공하고, δ 0 내지 TSP 피크의 값을 지정함으로써 화학적 이동 눈금을 설정하였다. 각각의 투여후 NMR 스펙트럼을 종이에 플롯팅하고, 국부 기준선 보정 후 선택된 피크에 대해 피크 높이를 수작업으로 측정하였다. 높이가 측정된 피크는 δ 5.4의 알란토인 피크, 실시예 2에서와 같이 각각 피크 'a', 'b' 및 'c'로 공지되어 있는 약 δ 2.22, δ 2.20 및 δ 2.15의 세 피크, 및 δ 0의 TSP 피크였다. 다변량 통계 분석을 하기 위해 데이터 축소를 수행하기 전에, 직선 기준선 보정 연산을 이용하여 각 디지털 스펙트럼의 기준선을 0의 강도로 이동시켰다. 'xwinnmr' 소프트웨어(브루커 게엠베하)를 사용하여 실리콘 그래픽스 컴퓨터 상에서 상기 기재된 스펙트럼 처리 작업 및 플롯팅 작업을 수행하였다.
데이터 축소 후, 인포메트릭스 제품인 'Pirouette' 소프트웨어를 사용하여, 투여후 NMR 스펙트럼의 'N-아세틸' 영역(δ 2.3 내지 δ 2.1)의 PCA를 수행하였다. 그러나, 실시예 2의 결과와는 대조적으로, 광범위한 패턴이 데이터 세트에 존재함에도 불구하고 유형 1 및 유형 2 스펙트럼의 뚜렷한 군 형성은 관찰되지 않았다. 이러한 배치 내에서 적합한 자연적인 경계를 확인하기가 불가능했기 때문에, 특정 부류의 조건에 의해서보다는 수치 측정치에 의해서 개별적인 투여후 스펙트럼을 더 잘 설명할 수 있었다. 이는, 다시 부류 예측보다는 수치 예측에 기초하여 투여전 대 투여후 상관관계 분석을 수행하는 것이 더욱 좋다는 의미이다.
뇨 대사산물 배출량의 유용한 측정치를 수득하는데 관련된 몇몇 문제점이 있으며, 결과적으로 투여후 샘플의 상이한 N-아세틸화 화합물의 배출량을 정량화시키는데 두가지 상이한 방법을 이용하였다. 첫 번째 방법은 내인성 뇨 성분인 알란토인에 대하여 대사산물 A, B 및 C(실시예 2에서와 같이 칭함)의 배출량을 정량화시키는 것이었다. 따라서, 각 NMR 스펙트럼의 피크 a, b 및 c의 강도는 δ 5.4의 알란토인 피크에 대한 피크 높이 비로서 기재되었다. 이 목적을 위해 δ 4.05의 크레아티닌 메틸렌 신호도 사용할 수 있었으나, 알란토인 피크가 편리한 내부 기준점이었다. 두번째 방법은 각각의 NMR 샘플에 알려진 일정한 양으로 첨가된 TSP 신호의 크기를 기준으로 하고 각 래트에 의해 생성된 뇨의 부피를 고려하여 성분 A, B 및 C의 절대 배출량을 측정하는 것이었다. 따라서, 예를 들어 수학식 (피크 'c'의 높이/TSP 피크의 높이)*(채집된 뇨의 부피)를 이용하여, 상이한 래트에 의한 화합물 C의 절대 배출량의 상대적인 측정치를 수득하였다. 이 때, 뇨를 입수할 수 없었고 NMR 샘플이 준비되지 못한 138번 동물을 제외하고는, 400㎕의 뇨를 사용하여 일정한 방식으로 투여후 NMR 샘풀을 모두 준비하였기 때문에, 이 측정치는 유효하다. 피크 높이는 mm 단위로 측정하였고, 뇨 부피를 ml 단위로 측정하였다. 이 두 번째 방법의 한계점은 설정된 기간에 걸쳐 동물로부터 채집된 뇨가 그 기간동안 방광을 통과한 뇨를 대표하지 못할 수 있다는 것이며, 매우 적은 양의 뇨가 채집될 때 이러한 배출량 '오차'가 특히 발생될 수 있음을 경험상 알게 되었다. 정량화의 첫번째 방법의 한계점은 이 경우 내인성 기준 화합물인 알란토인이 이전의 경험에 비추어 유용한 기준점임이 분명하지만 이 화합물의 배출량이 고정적이지 않을 수 있다는 것이다.
각각의 투여전 NMR 스펙트럼에 대해 'AMIX' 프로그램(브루커 게엠베하)을 사용하는 일정한 방식으로 '데이터를 축소'시켰다. 특정 스펙트럼 영역(예를 들어, TSP 및 잔류수 신호를 함유하는 영역)을 폐기한 후, 각 스펙트럼의 나머지 부분을 연속하는 0.04ppm 폭의 구획으로 분할하고, 각 구획에 대해 적분치를 수득하였다. 이어, 데이터-축소된 스펙트럼을 정규화하여, 각 '스펙트럼'에 대해 동일한 전체 강도를 부여하였다. 다양한 N-아세틸 대사산물, 즉 'A', 'B' 및 'C'의 투여후 배출량을 예측할 수 있도록 하는 투여전 특징을 발견하기 위해 PLS 분석을 수행하였다. 우메트릭스 제품인 SIMCA 소프트웨어를 사용하여 이들 PLS 분석을 수행하였다.
특정 동물의 경우, 놀랍게도 아이소니아지드(200mg/kg)를 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼에서 δ 5.4의 알란토인 피크의 높이에 대한 피크 'a' 및 'b'의 높이를 투여전 데이터로부터 우수하게 예측할 수 있었다(피크 'a'에 관한 도 3.1 및 3.2 참조). 피크 'a'의 경우를 보면, 알란토인에 대한 그의 피크 높이 비는 NMR 샘플의 (화합물 A의 양/알란토인의 양)의 비의 상대적인 척도를 제공한다. 제1일의 7시간동안의 뇨 채집 시간에 걸쳐 배출된 알란토인이 이 연구의 모든 래트의 경우에 일정한 것으로 추정한다면, 비 (피크 'a'의 높이/알란토인 피크의 높이)는 이 기간동안 상이한 래트에 의해 배출된 화합물 A의 양의 상대적인 척도를 제공한다. 그러므로, 이러한 발견은 적합한 모델을 사용하여 몇몇 래트에 있어서 아이소니아지드(200mg/kg)를 투여한 후 배출된 화합물 A 및 B의 양을 투여전 데이터로부터 예측할 수 있음을 나타낸다.
또한, 제1일에 0 내지 7시간의 뇨 채집 시간동안 3ml보다 많은 뇨를 생성시킨 대부분의 동물의 경우, 투여전 데이터로부터 양 (피크 'c'의 높이/TSP 피크의 높이)*(채집된 뇨의 부피)를 예측할 수 있음을 발견하였다(도 3.3 참조). NMR 샘플 및 그에 수반되는 스펙트럼을 모두 정확하게 동일한 방식으로 준비하고 수득한 점을 고려할 때, 이 양은 각 래트에 의해 배출된 화합물 C의 양의 상대적인 척도이다. 그러므로, 적합한 모델을 사용하여, 투여전 데이터로부터 아이소니아지드(200mg/kg) 투여 후 배출되는 화합물 C의 양을 예측할 수 있다.
도 3.1은 수컷 스프라그-돌리 래트에게 아이소니아지드(200mg/kg)를 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 뇨 샘플의 NMR 스펙트럼에서 (피크 'a'의 높이/알란토인 피크의 높이)의 값을 투여전 뇨의 NMR 스펙트럼 데이터로부터 예측하는 PLS 모델의 모델 제작 데이터 및 유효화 데이터를 보여준다. 모델 제작 데이터의 데이터 지점은 속이 빈 삼각형으로 표시 및 코드화되어 있으며, 유효화 데이터는 검은 삼각형으로 표시 및 코드화되어 있다. 속이 빈 삼각형은 예측용 PLS 모델을 제작하는데 이용된 데이터를 갖는 래트의 관찰 결과 및 예측 결과를 보여준다. 검은 삼각형은 모델-제작 과정으로부터 배제된 데이터를 갖는 11마리 래트(110, 111, 122, 125, 128, 135, 140, 144, 147, 167 및 172번 래트)의 관찰 결과 및 예측 결과를 보여준다. 이 도면을 육안으로 평가한 결과, 유효한 모델이 수득되었고, 투여전 데이터의 분석에 의해 알란토인 수준에 대한 피크 'a'의 배출량 수준을 예측할 수 있음을 나타낸다.
도 3.1의 PLS 분석에 관계된 회귀 계수가 분석에 사용된 각 변수에 대해 도 3.2에 도시되어 있다. 앞서 기재한 바와 같이, 이들 변수는 투여전 스펙트럼의 연속 구획의 적분으로부터 유도되었다. 도 3.2에서는 관련 0.04ppm 폭의 스펙트럼 구획의 중심에서의 화학적 이동에 따라, PLS 분석에 사용된 상이한 변수를 확인한다. 스펙트럼 구획의 회귀 계수의 크기가 -쪽이든 +쪽이든 더 클수록 그 구획의 예측에 대한 기여도가 크다. 예를 들어, δ 3.42에 중심을 둔 투여전 스펙트럼 구획은 A 투여후 농도에 부정적으로 관련되어 있다.
도 3.3은 투여전 뇨의 NMR 스펙트럼 데이터로부터, 스프라그-돌리 래트에 의한 아이소니아지드(200mg/kg) 투여 후의 화합물 C의 배출량을 예측하는 PLS 모델의 모델 제작 및 유효화 데이터를 도시한다. 도 3.3의 데이터 지점은 모델 제작 데이터의 경우 속이 빈 삼각형으로, 유효화 데이터의 경우 검은 삼각형으로 표시 및 코드화되어 있다. 속이 빈 삼각형은 모델을 제작하는데 이용된 데이터를 갖는 다양한 래트의 관찰 결과 및 예측 값을 보여준다. 검은 삼각형은 모델-제작 과정에서 제외된 데이터를 갖는 8마리 래트(105, 108, 115, 116, 121, 142, 157 및 163번 래트)의 관찰 결과 및 예측 결과를 보여준다. 각 동물에 의해 배출된 대사산물 C의 상대적인 양은 (피크 'c'의 높이/TSP 피크의 높이)*(생성된 뇨의 부피)로서 측정되었다. 이 도면을 육안으로 평가한 결과, 유효한 모델이 수득되었음을 나타낸다.
데이터의 추가 분석시에는, 아이소니아지드를 투여한 후 배출된 화합물 A, B 및 C의 정량화를 위해 상이한 방법을 이용하였다. 이 방법에서는, 세 개의 피크 'a', 'b' 및 'c'를 함유하는 δ 2.24 내지 2.12의 영역을 먼저 전체로서 적분하였다. 이어, δ 2.24 내지 2.17(피크 'a' 및 'b' 함유) 및 δ 2.17 내지 2.12(피크 'c' 함유) 영역에 대해 별도의 적분치를 전체 δ2.24 내지 2.12 적분치의 분율로서 수득하여, '분율 A+B' 및 '분율 C'를 제공하였다. 비 [분율 C/(분율 A+B)]를 상기 두 양으로부터 계산하였다. 이 방법의 원리는, 표현형을 식별하는 개별적인 비(양 C/양 A) 및 (양 C/ 양 B)가 단일 비[분율 C/(분율 A+B)]로 유용하게 대체될 수 있음을 인식하면, 적분치가 피크 높이 측정치로부터 수득할 수 있는 것보다 더욱 우수한 상대적인 양의 추정치를 제공할 수 있다는 것이다. 분율 A+B 또는 분율 C를 안다는 것은 비 [양 C/(양 A+양 B)]를 계산할 수 있음을 의미한다. 따라서, 우메트릭스 제품인 SIMCA 소프트웨어를 사용하여, 본 발명자들은 투여전 데이터로부터 분율 A+B, 분율 C 및 [분율 C/(분율 A+B)]를 예측하기 위한 PLS 모델을 제작하고자 시도하였다. 이에 따라, [분율 C/(분율 A+B)]를 성공적으로 예측할 수 있는 세 가지 방법을 제공하게 되었다.
일정한 스펙트럼 구역(특정 스펙트럼 영역을 제외한 후)으로 정규화된 투여 전 NMR 데이터를 사용하여, 본 발명자들은 투여전 데이터로부터 세 가지 양, 즉 분율 A+B, 분율 C 및 비 [분율 C/(분율 A+B)] 각각을 개별적으로 예측하는데 성공적인 PLS 모델이 수득되었음을 발견하였다.
도 3.4는 아이소니아지드(200mg/kg)를 수컷 스프라그-돌리 래트에게 투여한지 0 내지 7시간 후에 채집된 뇨에서 [분율 C/(분율 A+B)]의 관측된 값 및 투여전 예측된 값의 플롯을 도시한다. 도시된 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 상관관계를 검출할 수 있음을 보여준다.
도 3.5는 투여전 데이터와 투여후 [분율 C/(분율 A+B)]의 값 사이에서 관찰되는 상관관계가 무작위적이지 않았음을 보여주는 내부 모델 유효화 분석의 결과를도시한다.
도 3.6은 외부에서 생성된 시험 세트의 [분율 C/(분율 A+B)]의 예측을 도시한다. 이 경우에는, 본 아이소니아지드 연구 데이터를 사용하여 제작된 투여 전으로부터의 투여 후 예측 모델을, 실시예 2에 기재된 아이소니아지드 연구에서 9마리의 저투여량 동물에 대해 얻어지는 결과의 투여 전으로부터의 투여 후 예측 시도에 사용하였다. 예측 세트(검은 원)는 6마리의 유형 2 동물 및 3마리의 유형 1 동물로 이루어졌으며, 결과는 유형 2 시험 동물의 경우 [분율 C/(분율 A+B)]가 성공적으로 예측되었지만, 유형 1 시험 동물의 경우 우수하게 예측되지 못했음을 보여주었다(RMSEE=0.1524; RMSEP(유형 1 및 2)=0.4416; RMSEP(유형 2)=0.2325). 그러나, 모델 제작 데이터(속이 빈 원)를 조사하면, 모델 제작 데이터가 거의 완전히 유형 2 동물로 구성되어 있음을 알 수 있고, 이것이 유형 2 시험 데이터가 유형 1보다 더 우수하게 예측될 수 있었던 이유를 설명할 수 있다. 그러나, 이 모델이 별도의 연구에서 수득된 시험 데이터에 대해 우수한 예측치를 제공하기에 충분히 견실함에 주목하는 것이 중요하다.
추가적으로 연구하여, 실시예 2에서 보는 바와 같이 아이소니아지드(400mg/kg)-유도된 독성에 대한 감수성 또는 비-감수성의 투여전 예측을 수행할 수 있음을 입증할 수 있다. 그러나, 여기에서 수득된 결정적인 결과는 투여전 생체 유체 NMR 스펙트럼으로부터 특정 대사 표현형-결정된 투여후 결과를 예측할 수 있다는 것이다.
실시예 4. 파라세타몰(600mg/kg)이 후속 투여되는 수컷 스프라그-돌리 래트에서 뇨의 파라세타몰 대사산물 양의 투여전 예측. 수치에 의해 투여 전으로부터 투여 후를 예측할 수 있음을 보여주는 예.
연령 및 체중을 맞춘 수컷 스프라그 돌리 래트 75마리를 구입하였다. 투여하기 3일 전에 래트의 평균 체질량은 260.2g(표준 편차: 12.6g)이었고, 투여시 래트는 약 7주령이었다. 물 및 표준 설치류 식사에 자유롭게 접근할 수 있도록 하여 온도-, 습도- 및 광/암소-조절되는 실험실의 개별 우리에 이들을 넣었다. 우리 적응 기간 후 연구를 개시하였다. 메틸셀룰로즈(0.5% w/v) 및 트윈(Tween) 80(0.1% w/v)을 함유하는 수용액중 파라세타몰(600mg/kg)을 래트 65마리에 경구 투여하였다. 래트 10마리는 대조용 세트로서 이용하였고, 투여 비히클만 경구 투여하였다. 각 래트로부터 개별적인 투여전 뇨 샘플 및 투여한지 24시간 후의 뇨 샘플을 채집하여, 보존제로서 고정된 부피의 아지드화나트륨을 함유하는 빙냉 용기에 넣었다. 투여전 뇨 샘플은 투여하기 48 내지 24시간 전에 채집하였다. 투여후 뇨 샘플은 투여한지 0 내지 24시간 후에 채집하였다. 아지드 용액에 대해 아무런 보정도 하지 않고 각 뇨 샘플의 최종 부피를 결정하였다. 고정된 부피의 뇨, pH 완충 용액 및 TSP/D2O 용액의 사용을 포함하는 표준 절차에 따라, 뇨 샘플을 모두 NMR 분석을 위해 준비하였다. 브루커 제품인 'xwinnmr' 및 'iconnmr' 소프트웨어를 사용하여 유동 프로브가 설치된 브루커 NMR 분광분석계 상에서 600MHz에서1H NMR 스펙트럼을 수득하였다. 'noesypr1d' 프로그램을 사용하여 물 억제를 달성하였다. 파라세타몰-투여된 래트의 투여후 스펙트럼은 해상도를 향상시킨 후 약 2.18, 2.165,2.155, 및 2.15ppm에 위치하는 것으로 밝혀진 여분의 N-아세틸 신호를 나타내었다. 이들 신호를 처음에는 각각 파라세타몰 설페이트(이제 'S'라고 함), 파라세타몰 글루쿠로나이드(이제, 'G'라고 함), 파라세타몰로부터 유도된 머캅튜르산(이제, 'MA'라고 함) 및 파라세타몰 자체(이제 'P'라고 함)로 지정하였다. 파라세타몰의 머캅튜르산(MA)은 종종 파라세타몰의 N-아세틸시스테인 공액체로 불린다. 파라세타몰 글루쿠로나이드 및 파라세타몰을 사용하여 스파이킹함으로써 이들의 피크 지정을 확인하였으며, 1.86ppm에 있는 유사한 크기의 피크로부터 MA 아세틸의 지정을 확인하였다. 문헌[베일즈(Bales) 등, (1984) 양성자 NMR 분광분석법에 의해 연구된, 아세트아미노펜 및 그의 대사산물의 뇨중 배출, Clin. Chem., 30, 10, 1631-1636]을 참조한 결과, 파라세타몰의 시스테인 공액체의 N-아세틸 피크가 파라세타몰의 N-아세틸 피크를 덮는 것으로 제안되었지만, 실제로는 시스테인 공액체의 N-아세틸 피크가 머캅튜르산으로부터의 동일한 N-아세틸 피크를 덮을 가능성이 더 큰 것으로 보인다. 이는 MA와 P의 정량화를 불확실하게 하며, 이후 본 발명자들이 MA와 P의 모델 및 데이터를 칭하는 경우에는 측정된 양이 시스테인 공액체로부터 기인된 것을 일부 함유할 수도 있음을 명심해야 한다. 투여후 대조용 샘플의 스펙트럼에는 별다른 간섭이 존재하지 않았다. 화학적 범위 2.22 내지 2.11ppm에 있는 관련 아세틸 신호를 참조함으로써(다른 신호도 사용될 수 있음), 파라세타몰 자체를 비롯한 다양한 파라세타몰-관련 뇨 대사산물의 정량화를 달성하였다. 약 2.22 내지 약 2.11ppm의 N-아세틸 신호 덩어리 전체를 먼저 투여후 스펙트럼의 TSP 신호에 대해 적분하여, 각 NMR 샘플중 N-아세틸화 화합물의 총량의 척도를 제공한다. 투여 후0 내지 24시간의 기간에 각 래트에 의한 N-아세틸화 화합물의 총 배출량의 상대적인 척도를 (총 N-아세틸 적분치/TSP 적분치)*채집된 뇨의 부피(ml 단위)로서 계산하였다. 이어, 가우스 승법(1b -1, gb 0.5)을 이용하여 각 투여후 스펙트럼의 해상도를 향상시키고, 4개의 성분 S, G, MA 및 P로부터의 신호를 서로에 대해 적분하였다. 이들 값을 합한 다음, 각 성분의 양을 전체의 분율로서 계산하였다. N-아세틸 덩어리의 다른 성분이 비교적 미미하기 때문에, 각 동물의 총 아세틸 배출량 값과 S, G, MA 및 P의 이들 분율 값을 합하면, 이 동물에 의해 배출된 각 성분의 양을 추정할 수 있다. S/G 비를 계산하였다. 투여전 스펙트럼을 두 가지 상이한 방법으로 정규화시켰다. 첫 번째 방법에서는, 9.5 내지 0.5ppm의 총 스펙트럼 적분치를, 6.3 내지 4.0ppm 영역(이는 물 억제 절차에 의해 영향을 받는 잔류수 신호 및 유레아로부터의 신호를 함유함)을 제외한 후의 일정한 총 면적으로 조정하였다. 두번째 방법에서는, 투여전 스펙트럼을 각 NMR 샘플에 일정한 양으로 첨가된 TSP에 대해 정규화시켰다. 이어, TSP-정규화된 투여전 스펙트럼 각각을 투여전 채집동안 채집된 뇨의 관련 부피(mm 단위)와 곱하였다. 따라서, 이 두 번째 방법에서는, 투여전 뇨 대사산물 각각의 24시간 배출량의 상대적인 척도가 수득되었다. 화학 측정 분석을 수행하기 전에 TSP 신호를 제외시켰다.
우메트릭스 제품인 SIMAC 소프트웨어를 사용하여 투여 전으로부터 투여 후를 예측하는 PLS 모델을 제작하였다.
도 4.1은 파라세타몰(600mg/kg)이 투여된 래트에 의한 N-아세틸 화합물의 0 내지 24시간 총 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값의 플롯을 도시한다. 나타난결과는 모델 제작 데이터만이고 이 변수에 첫 번째 모델에 관련된 것이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 분명한 상관관계를 보여준다. 모델의 RMSEE 값은 7.98이다.
도 4.2는 파라세타몰(600mg/kg)이 투여된 래트에 의한 0 내지 24시간 MA 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값의 플롯을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이고 이 변수의 첫 번째 모델에 관한 것이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 분명한 상관관계를 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 1.28이다.
도 4.3은 파라세타몰(600mg/kg)이 투여된 래트에 의한 N-아세틸 화합물의 0 내지 24시간 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값의 플롯을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이고 이 변수의 두 번째 모델에 관한 것이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 분명한 상관관계를 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 12.99이다.
도 4.4는 도 4.3에 도시된 투여전 예측치를 생성시킨 모델의 성공적인 내부 유효화를 도시한다. 이 플롯은 도 4.3에 의해 나타난 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 상관관계가 무작위적이 아님을 입증한다. 모델의 외부 유효화도 성공적이며, 12.89의 RMSEP 값을 생성시켰는데, 이는 모델의 RMSEE 값 12.99에 필적하는 것이었다.
도 4.5는 파라세타몰(600mg/kg)이 투여된 래트에 의한 파라세타몰 글루쿠로나이드('G')의 0 내지 24시간 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값의 플롯을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 분명한 상관관계를 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 6.99이다.
도 4.6은 도 4.5에 도시된 투여전 예측치를 생성시킨 모델의 성공적인 내부 유효화를 도시한다. 이 플롯은 도 4.5에 의해 나타난 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 상관관계가 무작위적이 아님을 입증한다. 모델의 외부 유효화도 성공적이며, 7.27의 RMSEP 값을 생성시켰는데, 이는 모델의 RMSEE 값 6.99에 필적하는 것이다.
도 4.7은 파라세타몰(600mg/kg)이 투여된 래트에 의한 0 내지 24시간 'MA' 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값의 플롯을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이고 이 변수의 두번째 모델에 관한 것이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 분명한 상관관계를 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 1.90이다.
도 4.8은 도 4.7에 도시된 투여전 예측치를 생성시킨 모델의 성공적인 내부 유효화를 도시한다. 이 플롯은 도 4.7에 의해 나타난 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 상관관계가 무작위적이 아님을 입증한다. 모델의 외부 유효화도 성공적이며, 1.32의 RMSEP 값을 생성시켰는데, 이는 이 모델의 RMSEE 값 1.90에 필적하는 것이다. 외부 유효화는 도 4.9에 도시되어 있으며, 여기에서 속이 빈 원은 모델-제작 데이터이고, 검은 원은 모델-제작에 실제로 사용되지 않은 시험 데이터이다.
도 4.10은 파라세타몰(600mg/kg)이 투여된 래트에 의한 'P' 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값의 플롯을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이에 상관관계가 있음을 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 3.51이다.
도 4.11은 도 4.10에 도시된 투여전 예측치를 생성시킨 모델의 내부 유효화를 도시한다. 이 플롯은 도 4.10에 의해 나타난 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이의 상관관계가 무작위적이 아님을 입증한다. 모델의 외부 유효화도 성공적이며, 3.30의 RMESP 값을 생성시켰는데, 이는 모델의 RMSEE 값 3.51에 필적하는 것이다.
투여 후 배출된 'S'의 직접적인 투여전 예측치는 수득할 수 없었다. 그러나, N-아세틸화 화합물의 총 배출량 예측치로부터 'G', 'P' 및 'MA' 양의 예측치를 감함으로써, 투여 후 24시간 동안에 각 래트에 의해 배출된 'S'의 양의 투여전 예측치를 생성시킬 수 있었다. 'S'에 대한 이 예측치와 'G'의 적절한 예측치를 합함으로써, 각 래트의 투여후 G/S 비에 대한 투여전 예측치를 수득할 수 있었다. 도 4.12는 배출된 'S'의 양에 대한 관찰된 값 대 예측된 값을 보여준다. 도 4.13은 G/S 비의 관찰된 값 대 예측된 값을 보여준다.
본 연구의 결과는 이 신규 방법이 단순히 아세틸레이터 표현형에 의해 결정되는 반응의 예측에만 국한되는 것이 아님을 보여준다. 본원에 제공된 결과는, 글루쿠론산 분해 및 머캅튜르산 형성의 양 및 상대적인 정도에 대해 투여전 예측을 달성할 수 있으며, 파라세타몰 투여시에도 그러할 수 있음을 나타낸다. 뇨에 배출된 파라세타몰 설페이트의 양의 예측은 그다지 용이하게 달성될 수는 없지만, 수득된 결과는 '차이'에 의해서 이를 예측할 수 있음을 제안하였다. 파라세타몰로부터 유도된 머캅튜르산 MA는 글루타티온과 독성의 반응성 중간체의 공액으로부터 유래되는 것으로 알려져 있어 특수한 독물학적 의의를 갖는다. 글루쿠론산 분해, 설페이트화 및 글루타티온 공액은 제 2 단계 대사의 가장 중요한 전환중 셋이며, 이들 각각은 다양한 외인성 성분에 대해 큰 방어 역할을 한다. 그러므로, 본 데이터는 다수의 외인성 화합물의 대사 및 독성에 대해 환자-특이적 투여전 예측이 가능함을 나타낸다. 보여진 실시예를 고려할 때, 대사 표현형의 광범위한 다른 양상에 대해 투여전 뇨 식별 화합물이 존재함(즉, 대사 표현형의 광범위한 양상에 대해, 또한 이들 양상중 하나 이상에 의해 규제되는 투여 반응에 대해 투여전 예측 모델을 제작할 수 있음)을 믿어야할 이유가 있다.
실시예 5. 파라세타몰(1000mg)이 후속 투여되는 남성에서 뇨중 파라세타몰 대사산물 양의 투여전 예측. 인간에서 수치에 의해 투여 전으로부터 투여 후 예측이 달성될 수 있음을 보여주는 예.
윤리적으로 인가된 임상 실험을 위해 99명의 성인 남성을 모집하였다. 특정 기간동안 어류를 섭취하지 말 것 및 알콜을 음용하지 말 것 등의 몇몇 식사 제한을 규정하였다. 연구에 적격이 되기 위해서는, 시험 전 특정 기간동안 파라세타몰 또는 다른 약물을 섭취하지 않을 필요가 있었다. 각 개체의 체중 및 키를 기록하였다. 시험하는 날, 먼저 각 개체로부터 '갑자기' 방뇨시 중간 부분의 뇨 샘플을 채취하였다. 이어, 각 개체는 고정된 부피의 물로 파라세타몰 BP 500mg 정제 2개를섭취하였다. 투여 후, 각 개체에게 2번의 연속적인 기간, 즉 투여로부터 0 내지 3시간 및 3 내지 6시간 동안에 걸쳐 생성된 뇨를 모두 채취하라고 지시하였다. 이 기간 후, 각 개체에게 그의 방광을 가능한한 완전히 비울 것을 요구하였으며, 각각의 투여후 기간동안 각 개체에 의해 생성된 뇨의 질량을 기록하였다. 뇨 440㎕ 사용을 포함하는 표준 절차에 따라 뇨 샘플을 모두 NMR 분석을 위해 준비하였다. 브루커 제품인 'xwinnmr' 및 'iconnmr' 소프트웨어를 사용하여 브루커 NMR 분광분석계 상에서 600MHz에서1H NMR 스펙트럼을 수득하였다. 'noesypr1d' 프로그램을 사용하여 물 억제를 달성하였다. 투여후 스펙트럼에서, 먼저 2.210 내지 2.135ppm의 N-아세틸 신호를 TSP에 대해 적분하였으며, 각 기간동안 각 개체에 의한 N-아세틸화 화합물의 총 배출량의 척도를 (아세틸 적분치/TSP 적분치)*채집된 뇨의 질량(g 단위)으로서 결정하였다. 이 수학식은 뇨 샘플의 밀도가 거의 일정하다는 가정에 기초한다. 점검으로서, 다수의 대표적인 샘플의 샘플 밀도를 측정하였으며, 이 밀도가 1.00 내지 1.04g/ml의 범위의 속함을 발견하였다. 즉, 밀도가 거의 일정하다는 가정은 합당하다. 이어, FID의 가우스 승법(lb -1, gb 0.5)을 이용하여 투여후 스펙트럼의 해상도를 향상시켰다. 가능하다면, 파라세타몰 설페이트(S), 파라세타몰 글루쿠로나이드(G) 및 변화되지 않은 파라세타몰(P)의 양을 2.210 내지 2.135ppm의 총 적분치의 분율로서 직접 측정하였다. 3 내지 6시간의 채집 동안 배출된 변화되지 않은 파라세타몰(P)의 양의 정확한 측정치를 수득할 수 없었으며, 이 데이터를 사용할 수 없었다. 파라세타몰 머캅튜르산(MA)의 수준은 통상 정확하게 측정될 수 있을 정도로 충분히 높지 않았다. 특정 채집 기간동안 각 개체에 의해 배출된 개별적인 파라세타몰 대사산물(S, G 및 P)의 양은 그 개체 및 그 기간의 N-아세틸화 화합물의 총 배출량(앞서 계산됨)을 2.210 내지 2.135ppm 적분치의 관련 분율과 곱합으로써 계산하였다. 적절한 경우, 2회 채집의 데이터를 합하여 전체 0 내지 6시간의 투여후 기간에 대한 데이터를 제공하였다. 임의의 특정 개체가 투여받은 파라세타몰의 유효 투여량은 그의 체질량에 따라 달라지므로, 전체 N-아세틸, S, G 및 P의 배출 결과를 체질량 데이터와 조합하여, 체질량 1kg당 배출량을 제공하였다. 래트에서의 파라세타몰 연구에서와 같이, 파라세타몰의 시스테인 공액체가 변화되지 않은 파라세타몰의 정량화에 영향을 끼칠 수 있음에 주목해야 한다. 투여전 스펙트럼을 두 가지 상이한 방법으로(특정 영역을 제외한 후 총 스펙트럼 구역에 대해, 또한 일정한 크레아티닌에 대해) 정규화시켰으며, 우메트릭스 제품인 SIMCA 소프트웨어를 사용하여 투여 전으로부터 투여 후 예측의 PLS 모델을 제작하였다.
도 5.1은 파라세타몰(1000mg)이 투여된 남성 지원자의 체질량 1kg당 N-아세틸화 화합물(0 내지 3시간 채집)의 총 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이에 분명한 상관관계가 있음을 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 1.12였다.
도 5.2는 도 5.1의 기본이 되는 모델에 대해 분석된 외부 시험 세트의 체질량 1kg당 N-아세틸화 화합물(0 내지 3시간 채집)의 총 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. RMSEP 값은 0.80이었으며, 이는 모델의 RMSEE 값 1.12에 상당히 필적한다.
도 5.3은 파라세타몰(1000mg)이 투여된 남성 지원자의 체질량 1kg당 파라세타몰 글루쿠로나이트('G')(0 내지 3시간 채집)의 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이에서 상관관계가 발견되었음을 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 0.84였다.
도 5.4는 도 5.3의 기본이 되는 모델에 대해 분석된 외부 시험 세트의 체질량 1kg당 'G'(0 내지 3시간 채집)의 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. RMSEP 값은 0.70이었으며, 이는 모델의 RMSEE 값 0.84에 상당히 필적한다.
도 5.5는 파라세타몰(1000mg)이 투여된 남성 지원자의 체질량 1kg당 'P'(0 내지 3시간 채집)의 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이에 상관관계를 발견하였음을 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 0.185였다.
도 5.6은 도 5.5의 기본이 되는 모델에 대해 분석된 외부 시험 세트의 체질량 1kg당 'P'(0 내지 3시간 채집)의 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. RMSEP 값은 0.170이었으며, 이는 모델의 RMSEE 값 0.185에 상당히 필적한다.
도 5.7은 파라세타몰(1000mg)이 투여된 남성 지원자의 체질량 1kg당 N-아세틸화 화합물(0 내지 6시간 채집)의 총 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. 보여지는 결과는 모델 제작 데이터만이다. 이 플롯은 투여전 데이터와 투여후 데이터 사이에서 뚜렷한 상관관계가 발견되었음을 보여준다. 이 모델의 RMSEE 값은 1.47이었다.
도 5.8은 도 5.5의 기본이 되는 모델에 대해 분석된 외부 시험 세트의 체질량 1kg당 N-아세틸화 화합물(0 내지 6시간 채집)의 총 배출량의 관찰된 값 대 PLS-예측된 값을 도시한다. RMSEP 값은 1.13이었으며, 이는 모델의 RMSEE 값 1.47에 상당히 필적한다.
이 연구의 결과에 의해 이 방법이 래트로부터 인간으로 확장될 수 있다고 하는 원리가 확인된 바, 이 방법을 모든 포유동물에 성공적으로 적용할 수 있을 것으로 예상된다. 특히, 식사가 완전히 통제되지 않은 인간에서도 이 방법이 작용했으며, 이러한 통제까지 실시한다면 개선된 결과가 얻어질 것으로 예측되는 점은 주목할만하다. 여기에 제시된 발견은 샘플 및 데이터의 예비 분석을 나타내고, 개선된 모델을 우수하게 제작할 수 있다. 투여후 샘플과 관련하여 표준 분석 방법(예: UV-가시광 검출과 동시에 이루어지는 HPLC)을 사용하면, 파라세타몰 대사산물의 정량화를 개선시킬 수 있고, 따라서 모델 제작이 용이해질 수 있다. 특히, 이러한 기법의 사용은 본원에 사용된 NMR 방법에 비해 개선된 P 및 MA 정량을 허용한다. 뿐만 아니라, PLS 분석을 수행하기 전에, 투여전 변수(이 경우에는 투여전 NMR 스펙트럼의 폭 0.04ppm 구획임)의 비 및 다른 조합을 고려함으로써, 개선된 모델을 수득할 수 있을 것으로 생각된다.
가설적인 실시예
본 발명의 주된 특징은 투여에 대한 반응을 예측함으로써 적절한 투여 성분 및 치료 계획(예: 약학 치료제, 마취제 등)을 선택할 수 있다는 것이다. 이러한 방법은 독성, 효능 및 부작용 같은 소정 기준에 기초하여 적절한 투여 성분의 확인, 최대 또는 최소 투여량의 확인, 적절한 투여량의 확인, 적절한 투여 빈도, 적절한 투여 횟수 및 적절한 조절-방출 제제의 선택을 가능케 한다. 이러한 방법의 전형적인 제작이 하기 가설적인 실시예에 기재되어 있다. 상기 가설적인 실시예는 소정 시간 내에 특정 유형의 감염을 제거하는 항균 성분의 최소 투여량을 확인함을 포함한다. 따라서, 명기된 감염을 앓는 상이한 모델 제작 개체군을 상이한 수준의 항균제로 치료한다. 소정 시간 내에 어느 개체의 감염도 제거시키지 못한 투여량 수준과 관련된 데이터를 분석에서 제거한다. 다른 데이터 세트 각각에 대해, 감염 제거 기준을 충족시킨 개체의 투여전 특징 및 그렇지 못한 개체의 투여전 특징을 확인하기 위하여 분류 모델을 제작한다. 이들 모델 각각에 대해 개체의 시험 데이터를 분석하여, 그 표현형의 개체에서의 감염 제거에 상응하는 최소 투여량을 밝혀낸다. 이 투여량을 반드시 투여할 필요는 없으며; 이러한 투여는 예를 들어 그러한 투여 수준에서 개체에게 허용불가능한 부작용이 예측되는지의 여부에 달려있다.
본 발명의 다른 특징은 어떤 목적에서든 표현형 면에서 동질인 개체 세트를 선택하는 능력이다. 전형적으로, 대사 표현형의 한 요소, 예컨대 N-아세틸레이터 표현형에 대해 동질인 개체의 군을 선택하는 것이 관건이다. 이 실시예를 위해, N-아세틸화를 조사하는 투여 성분을 사용하여 모델을 제작한다. 이어, 부과된 동질성 기준에 따라 분류 모델을 제작한다. 미지의 N-아세틸레이터 표현형을 갖는개체에 대한 시험 데이터를 모델과 비교하여 조사하고, 그에 따라 개체를 분류한다. 한 부류에 속하는 개체는 투여 성분의 N-아세틸화에 대해 표현형 면에서 동질인 것으로 생각된다.
마찬가지로, 본 발명에 따라, 독성 또는 효능 연구 같은 연구에서 수득된 가변적인 데이터를 이론적으로 설명할 수 있다. 예를 들어, 투여전 표현형 확인을 이용함으로써, 한 군은 신속한 O-메틸레이터인 반면 다른 군은 느린 O-메틸레이터인 점이 밝혀진다면, 한 군에서는 독성을 야기하지만 다른 군에서는 그렇지 않은 투여 계획을 이론적으로 설명할 수 있게 된다. 이러한 발견에 따라, 투여되는 성분의 대사에 대해 고려하게 되고, 가능하게는 독성 대사산물을 생성시키거나 제거하는 결정적인 O-메틸화 단계를 확인할 수 있게 된다.
본 발명의 또 다른 특징은 투여전 샘플중 그의 존재 또는 농도에 의해 가능한 투여 성분에 대한 특정 대사 표현형 또는 특정 반응을 나타내는 투여전 생체 마커 또는 생체 마커 조합의 확인을 용이하게 하는 것이다. 예를 들어, PCA에서는, 관심있는 상이한 부류를 분리시키는 등급 플롯을 상응하는 로딩 플롯과 비교한다. 식별을 가능케 하는 투여전 변수, 및 부류 분리에 대한 이들의 상관관계의 긍정적이거나 부정적인 성질을 확인할 수 있다. 종종, 이들 변수는 특정 화합물에 직접적으로 기인할 수 있다. NMR 분광분석 데이터의 경우, 특정 변수 또는 변수의 조합은 식별 특징을 함유하는 스펙트럼 영역을 나타낸다. 모델 제작 스펙트럼의 그러한 영역을 조사함으로써, 원칙적으로 식별 화합물(들)(또는 "생체 마커")을 확인할 수 있다.
때때로, 보다 더 넓은 개체의 군을 대표하도록 다수의 개체로부터 샘플을 취할 필요가 있다. 예를 들어, 통상적으로는 식물 분야로부터 몇 가지의 식물을 샘플로서 취해야만 하는 경우가 있다. 선택된 식물의 특징을 분석함으로써, 전체 분야에 대한 제초에의 특정 투여량을 선택할 수 있다.

Claims (58)

  1. 투여 성분을 투여하기 전에 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터를 수득하고;
    투여 성분을 투여한 후에 다수의 개체에 관련된 투여후 데이터를 수득하며;
    투여전 데이터의 개체간 변화와 투여후 데이터의 개체간 변화의 상관관계를 밝히고;
    관찰된 상관관계에 기초하여 투여 전으로부터 투여 후를 예측하는 모델을 제작함을 포함하는,
    시험 성분을 개체에 투여하지 않고서 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 특징짓거나, 또는 투여하지 않고도 대사 표현형에 따라 달라지는 개체의 투여후 반응을 예측하는 모델을 제작하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 침, 땀, 눈물, 숨 또는 숨 응축액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체 유체(biofluid)인 샘플로부터 투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터를 수득하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    식물 조직, 식물 유체 또는 쇄균액(homogenate), 정유를 비롯한 식물 추출물 또는 식물 삼출물(exudate)인 샘플로부터 투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터를 수득하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    인간 또는 동물 조직, 어류 조직 또는 어유, 조직 추출물, 조직 배양액 추출물, 세포 배양액 상청액 또는 추출물이거나 미생물로부터 유래되는 샘플로부터 투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터를 수득하는 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터가 화학적 조성 또는 물리적 변수(parameter)에 관한 데이터를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    데이터 복구를 향상시키거나 샘플 안정성을 개선시키기 위하여, 투여전 및/또는 투여후 샘플 또는 개체를 분석하기 전에 처리하는(예를 들어, 하나 이상의 기존 성분의 유도체(들)를 생성시키기 위해 하나 이상의 화학적 시약으로 처리하는) 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
    투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터가 핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 질량 분광분석법(MS), 적외선(IR) 분광분석법, 기체 크로마토그래피(GC) 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 다른 화학적 분석기법을 이용하여, 또는 GC-MS를 비롯한 이러한 기법의 임의의 통합된 조합을 이용하여 수득된 조성 데이터로부터 유도되거나 또는 이들 조성 데이터인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
    투여전 데이터 및/또는 투여후 데이터가 물리적 데이터 또는 이들로부터 유도된 데이터인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    적절한 성분을 투여함으로써, 다수의 생화학적 전환 각각에 대해 표현형 확인 모델을 제작하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서,
    적절한 성분을 투여함으로써, 다수의 투여 성분 각각에 대해 반응 예측 모델을 수립하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서,
    기존 변수의 비 및/또는 기존 변수의 다른 조합을 취함으로써 패턴 인지(pattern recognition) 전에 최초의 투여전 데이터 세트를 확장하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 특정 성분이 투여된 개체의 군에 대해서, 패턴 인지 방법을 사용하여 투여 성분의 가변적인 대사 또는 가변적인 반응의 패턴을 밝히는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 특정 성분이 투여된 개체의 군에 대해서, 자율식(unsupervised) 패턴 인지 방법을 사용하여 투여후 데이터의 관심있는 변화와 상관관계를 갖는 투여전 데이터의 변화를 알아내는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 특정 성분이 투여된 개체의 군에 대해서, 지도식(supervised) 패턴 인지 방법을 사용하여 투여후 데이터의 관심있는 변화와 상관관계를 갖는 투여전 데이터의 변화를 알아내는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항중 어느 한 항에 있어서,
    임의의 특정 성분이 투여된 개체의 군에 대하여, 직교 신호 보정(Orthogonal Signal Correction; OSC) 같은 데이터 필터링 방법을 사용하여 투여후 데이터의 관심있는 변화와 상관관계를 갖지 않는 투여전 데이터의 변화를 제거하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서,
    대사 표현형에 대한 정보를 제공하거나 또는 투여에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있는 생체 마커 또는 생체 마커의 조합을 밝혀내는데 사용되는 방법.
  17. 관심있는 생화학적 전환 또는 경로를 조사하는 특정 성분이 투여된 다수의 개체에 대한 투여전 데이터와 투여후 데이터의 상관관계를 설명하는 모델과 관련하여 투여되지 않은 개체에 대한 데이터를 분석하고;
    모델의 소정 기준에 따라 투여되지 않은 개체의 대사 표현형을 설명하는 수치 척도 또는 분류법을 생성시킴을 포함하는,
    개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 결정하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 침, 땀, 눈물, 숨 또는 숨 응축액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체 유체로부터, 또는 식물 조직, 식물 유체, 식물 쇄균액, 정유를 비롯한 식물 추출물 또는 식물 삼출물로부터, 또는 인간 또는 동물 조직, 어류 조직 또는 어유로부터, 또는 조직 추출물, 조직 배양액 추출물, 세포 배양액 상청액 또는 세포 배양액 추출물로부터, 또는 미생물로부터 유래되는 샘플로부터, 또는 데이터 복구 또는 샘플 안정성을 향상시키기 위해 처리된 후의 상기 샘플 유형중 임의의 하나로부터, 투여되지 않은 개체에 관련된 데이터를 수득하는 방법.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
    핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 임의의 다른 기법을 이용하여, 또는 이들 기법의 임의의 조합을 이용하여, 개체에 관련된 특징적인 조성 데이터 및/또는 물리적 데이터를 생성시킴을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항중 어느 한 항에 있어서,
    대사 표현형에 의해 영향을 받는 위험을 평가하기 위하여 및/또는 특수한 건강 모니터링 계획의 사용을 표적화시키기 위하여 및/또는 사전 주의/예방용 치료의 사용을 표적화시키기 위하여 및/또는 대비 목적으로 위험의 특징을 결정하기 위하여 및/또는 번식을 비롯한 임의의 다른 목적으로 개체를 선택하기 위하여 사용되는 표현형 확인 방법.
  21. 특정 투여 성분이 투여된 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터와 투여후 데이터의 상관관계를 특징짓는 모델과 관련하여 투여되지 않은 환자에 대한 데이터를 분석하고;
    모델의 소정 기준에 따라, 투여 성분이 투여되어야 하는 투여되지 않은 개체의 예측되는 반응에 대한 수치 또는 부류를 예측함을 포함하는,
    투여 성분에 대한 개체의 반응을 예측하는 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    소정 기준에 따라, 개체가 수용해야 하는 성분의 최대 투여량 또는 최소 투여량을 예측할 수 있는 방법.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
    소정 기준에 따라, 개체가 수용해야 하는 투여 성분의 양을 예측할 수 있는 방법.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항중 어느 한 항에 있어서,
    소정 기준에 따라, 개체가 성분을 투여받아야 하는 빈도를 예측할 수 있는 방법.
  25. 제 21 항 내지 제 24 항중 어느 한 항에 있어서,
    소정 기준에 따라, 개체가 수용해야 하는 성분의 투여 횟수를 예측할 수 있는 방법.
  26. 제 21 항 내지 제 25 항중 어느 한 항에 있어서,
    소정 기준에 따라, 개체에 적절한 조절 방출 제제를 선택할 수 있는 방법.
  27. 제 21 항 내지 제 26 항중 어느 한 항에 있어서,
    뇨, 혈액, 혈장, 혈청, 침, 땀, 눈물, 숨 또는 숨 응축액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체 유체로부터, 또는 식물 조직, 식물 유체, 식물 쇄균액, 정유를 비롯한 식물 추출물 또는 식물 삼출물로부터, 또는 인간 또는 동물 조직, 어류 조직 또는 어유로부터, 또는 조직 추출물, 조직 배양액 추출물, 세포 배양액 상청액 또는 세포 배양액 추출물로부터, 또는 미생물로부터 유래되는 샘플로부터, 또는 데이터복구 또는 샘플 안정성을 향상시키기 위해 처리된 후의 상기 샘플 유형중 임의의 하나로부터, 투여되지 않은 개체에 관련된 데이터를 수득하는 방법.
  28. 제 21 항 내지 제 27 항중 어느 한 항에 있어서,
    핵자기공명(NMR) 분광분석법 및/또는 임의의 다른 기법을 이용하여, 또는 이들 기법의 임의의 조합을 이용하여, 개체에 관련된 특징적인 조성 데이터 및/또는 물리적 데이터를 생성시킴을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제 16 항에 기재된 바와 같이 미리 확인된 하나 이상의 생체 마커와 관련하여 투여되지 않은 개체에 대한 데이터를 분석함을 포함하는, 개체의 대사 표현형의 선택된 양상을 결정하거나 또는 투여 성분에 대한 개체의 반응을 예측하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서,
    생체 마커(들)가 하나 이상의 첨가된 시약과 반응하여 색상 변화를 비롯한 가시적인 변화를 생성시키는 방법.
  31. 제 1 항 내지 제 30 항중 어느 한 항에 있어서,
    실험실용 실험 또는 임상 실험을 위하여, 또는 임의의 다른 목적을 위하여, 표현형면에서 동질이거나 유사한 개체의 군을 선택하는데 사용되는 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서,
    생체 유체 또는 조직의 투여전 분석에 기초하여, 표현형 이질성에 의해 야기되는 실험 데이터의 생물학적 변화를 이론적으로 설명하기 위한 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 32 항중 어느 한 항에 있어서,
    데이터가 전체 개체로부터 취한 물리적 측정치 및/또는 화학적 측정치에 기초하는 방법.
  34. 제 1 항 내지 제 33 항중 어느 한 항에 있어서,
    투여후 데이터가 투여전 상태에 대한 변화, 예를 들어 혈압을 낮추는 약물로 치료받는 인간의 혈압 감소를 설명하는 방법.
  35. 제 1 항 내지 제 34 항중 어느 한 항에 있어서,
    특정 모델 및/또는 방법의 한계에 순응하지 않는 시험 데이터를 확인할 수 있는 방법.
  36. 제 1 항 내지 제 35 항중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 동물, 특히 인간, 마우스, 래트, 돼지, 젖소, 황소, 양, 말, 개 또는 토끼, 또는 임의의 가축, 또는 스포츠 또는 번식을 위해 이용되는 경주용 말을 비롯한 임의의 동물로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물인 방법.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 식물, 어류 또는 임의의 다른 수생 생물체인 방법.
  38. 제 1 항 내지 제 37 항중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 생물 조직, 조직 배양액, 세포 배양액 또는 미생물 배양액인 방법.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항중 어느 한 항에 있어서,
    단일 개체로 간주되는 개체의 군을 대표하거나 또는 그러한 군을 대표하도록 취해진 샘플로부터 데이터를 수득하는 방법.
  40. 제 1 항 내지 제 39 항중 어느 한 항에 있어서,
    투여되는 성분이 특히 약학 또는 의약 성분, 또는 약학 또는 의약 성분이 될 수 있는 연구 또는 개발중인 성분 뿐만 아니라, 예를 들어 독소, 살충제, 제초제, 식품 또는 사료 성분, 식품 또는 식품 첨가제 및 액체, 기체, 증기 및 담배 연기 같은 연기를 비롯한 임의의 종류의 유체를 포함하는 임의의 성분 또는 이들 성분의 혼합물 또는 배합물인 방법.
  41. 제 1 항 내지 제 40 항중 어느 한 항에 있어서,
    주사, 섭식, 음용, 흡입 또는 훈연을 비롯한 임의의 수단 또는 경로에 의해, 개체의 수명 또는 그의 임의의 특정 일부 또는 부분을 비롯한 임의의 시간 동안에 걸쳐, 임의의 매트릭스 또는 매질에 능동적으로 또는 수동적으로 성분을 투여하며, 이러한 투여가 환경에의 노출 또는 환경 오염으로부터, 또는 의학, 치과, 수의학 또는 외과 절차로부터 이루어지는 투여를 포함하는 방법.
  42. 제 1 항 내지 제 41 항중 어느 한 항에 있어서,
    시험 성분을 개체에 투여하지 않고서 개체의 아세틸레이터(acetylator) 표현형을 확인하기 위한 방법.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항중 어느 한 항에 있어서,
    성분의 투여에 대한, 아세틸레이터 표현형에 따라 달라지는 개체의 반응을 예측하기 위한 방법.
  44. 제 1 항 내지 제 43 항중 어느 한 항에 있어서,
    아이소니아지드(isoniazid)-유도되는 독성에 대한 개체의 감수성을 예측하기 위한 방법.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항중 어느 한 항에 있어서,
    갈락토스아민(galactosamine)-유도되는 독성에 대한 개체의 감수성을 예측하기 위한 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 43 항중 어느 한 항에 있어서,
    파라세타몰(paracetamol)-유도되는 독성에 대한 개체의 감수성을 예측하기 위한 방법.
  47. 제 1 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 따른 모델을 제작하기 위한 장치.
  48. 각각 특정 투여 성분이 투여된 다수의 개체에 관련된 투여전 데이터와 투여후 데이터의 상관관계 모델이 되는 하나 이상의 모델; 하나 이상의 모델에 대하여 투여되지 않은 개체에 관련된 데이터를 분석함으로써, 이용된 모델(들)에 따라 투여되지 않은 개체의 대사 표현형의 하나 이상의 양상을 결정하거나 투여에 대한 그의 반응을 예측하기 위한 프로세서를 포함하는, 반응을 예측하고/하거나 대사 표현형을 확인하기 위한 장치.
  49. 제 48 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 모델을 제작하기 위해 추가로 조정되는(arranged) 장치.
  50. 제 47 항 내지 제 49 항중 어느 한 항에 있어서,
    NMR 분광분석법, 질량 분광분석법, 적외선 분광분석법 또는 고성능 액체 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 물리적 분석 및/또는 화학적 분석을 수행하기 위한 하나 이상의 분석 기기 또는 장치를 추가로 포함하는 장치.
  51. 제 16 항에 따른 하나 이상의 생체 마커를 확인하기 위한 장치.
  52. 제 1 항 내지 제 51 항중 어느 한 항에 있어서,
    제 16 항 및/또는 제 51 항에 기재되어 있는 바와 같이 이미 확인된 하나 이상의 생체 마커를 사용함에 기초하여 반응을 예측하거나 또는 대사 표현형을 확인하기 위한 장치.
  53. 시험되는 개체로부터의 샘플을 수용하는 시험 구역을 포함하며, 이 때
    상기 시험 구역이 샘플중의 하나 이상의 생체 마커와 화학적으로 반응하여, 시험 구역의 가시적인 외관의 변화를 생성시킬 수 있는 하나 이상의 시약을 포함하고,
    생체 마커가 제 16 항 및/또는 제 51 항에 따라 이미 확인되었으며,
    생성된 시험 구역의 가시적인 외관이 대사 표현형의 특징이거나 또는 투여에 대한 반응(들)의 전조인,
    대사 표현형을 확인하거나 또는 투여에 대한 개체의 반응(들)을 예측하기 위한 장치.
  54. 개체에 적절한 투여 계획을 확인할 수 있는, 제 21 항 내지 제 26 항중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 장치.
  55. 제 47 항 내지 제 54 항중 어느 한 항에 있어서,
    특이적인 생체 마커에 대해 발생된 항체를 사용함에 기초한 장치.
  56. 제 47 항 내지 제 55 항중 어느 한 항에 있어서,
    예컨대 고체 지지체 상에 부동화된 효소를 사용하는 효소-촉매 작용에 의한 반응에 의해, 선택된 생체 마커를 검출 및/또는 정량하는 장치.
  57. 제 1 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제작된 하나 이상의 모델을 포함하는 장치.
  58. 제 47 항 내지 제 57 항중 어느 한 항에 있어서,
    특정 모델의 한계에 순응하지 않는 시험 데이터를 확인하도록 추가로 조정되는 장치.
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