KR20050010055A - 단클론 항체 ｐａｍ4 및 췌장암의 진단 및 치료를 위한이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일원자가 및 다원자가의 단일특이성 항체 및 일원자가 및 다원자가의 멀티특이성 항체에 관한 것이다. 상기 항체의 바람직한 예로서 상기 항체는 하나 또는 그 이상의 동일한 결합 부위를 가지며, 상기 각 결합 부위는 표적 항원 또는 표적 항원의 에피토프와 결합한다. 또 다른 바람직한 예로서 상기 항체는 둘 또는 그 이상의 결합 부위를 가지며, 이들 결합 부위는 표적 항원의 다른 에피토프 또는 다른 표적 항원에 대하여 친화력을 가지거나 또는 표적 항원 및 헵텐에 대한 친화력을 가진다. 또한 본 발명은 숙주에서 상기 기능성 항체를 발현하기 위하여 사용하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 보다 상세하게 살펴보면, 본 발명은 종양 관련 항체(tumor-associated antibody)로서 제작된 PAM4에 관한 것이다. 또한 본 발명은 키메라 PAM4 항체 및 진단 및 치료에서의 상기 항체의 용도에 관한 것이다.

Description

단클론항체 ＰＡＭ4 및 췌장암의 진단 및 치료를 위한 이들의 용도{Monoclonal antibody PAM4 and its use for diagnosis and therapy of pancreatic cancer}

췌장은 인체에서 글루코오스를 에너지로 전환하는 것을 돕는 인슐린 및 인체에서 음식 소화를 돕는 효소를 생산한다. 췌장암은 췌장의 악성 성장으로서, 주로 췌장관의 세포에서 발생한다. 상기 질병은 아홉 번째로 가장 흔한 암 형태이지만, 남자와 여자에게 각각 네 번째 및 다섯 번째로 암 사망의 주된 원인이 된다. 췌장암은 3% 미만이 5년 생존율을 나타내어 대부분이 항상 치명적이다.

췌장암의 가장 흔한 증상은 황달, 복통 및 체중 감소 등을 들 수 있으며, 다른 출현 인자들과 함께 실질적으로 특별한 것은 아니다. 따라서, 종양 성장의 초기 단계에서 췌장암을 진단하는 것이 대개 어렵고, 상당한 의혹 및 광범위한 진단용 정밀검사, 종종 시험적 수술(exploratory surgery)을 포함하는 상황을 필요로 한다. 내시경초음파검사(endoscopic ultrasonography) 및 컴퓨터단층촬영(computed tomography, CT)은 현재 췌장암 진단을 위하여 이용할 수 있는 비침입성 방법 중 가장 좋은 것이다. 그러나, 병소의 췌장염으로부터 췌장암의 분화뿐만 아니라 작은 종양의 확실한 검출은 힘들다. 공교롭게도, 환자의 대다수가 현재 종양이 이미 주변 기관을 침입하여 막낭의 외부로 연장되고 및/또는 광범위하게 전이된 말기 단계에서 진단되고 있다. Goldet al., Crit. Rev. Oncology/Hematology, 39:147-54(2001). 상기 질병은 뒤늦은 검출이 일반적이고, "조기" 췌장암 진단은 임상적 상황(clinical setting)에서 드문 일이다.

현재 췌장암을 위해 사용할 수 있는 치료 방법은 병을 치유 또는 실질적으로 개선된 생존 시간에 도달하지 못하고 있다. 수술 절제만이 생존의 기회를 제공하는 유일한 방법이다. 그러나, 종양 적하(tumor burden)로 인해 환자의 10-25% 만이 "근치적 절제(curative resection)"를 위한 대상이 된다. 절제 치료를 경험하는 이들 환자들에게서, 5년의 생존율은 평균적으로 대략 10% 정도로 아직 미흡하다.

췌장암 및 질병의 적절한 단계의 조기 검출 및 진단은 생존을 증가시키는 잇점을 제공한다. 많은 실험실에서 생체검사 표본 내의 지표 기질의 검출뿐만 아니라 종양 관련 지표가 혈류로 방출되는 것을 기초로 하는 진단 방법의 개발이 진행되고 있다. 췌장암을 위한 가장 좋은 종양 관련 지표는 CA19.9 검출을 위한 면역분석법이 되어 왔다. 증강된 레벨의 상기 시알릴레이트화(sialylated) Le^a에피토프 구조는 췌장암 환자의 70%에서 발견되었지만, 조사된 병소의 췌장염 표본의 어디에서도 발견되지 않았다. 그러나, CA19.9 레벨은 많은 수의 다른 악성종양 및 유리한 조건에서도 증가되는 것이 발견되었으며, 이로 인해 현재는 진단을 위해 사용될 수 없다. 그러나, 상기 분석은 수술 후 CA19.9 혈청수준에서 계속적으로 증가하여 나쁜 예후(Poor Prognosis)를 나타내고 있는 지를 감시하는데 사용된다. 많은 다른 단클론 항체(MAbs)들이 성장의 변화 단계에서 진단을 위한 면역분석법으로 보고되고 있다. 이들은 DUPAN2, SPAN1, B72.3, Ia3 및 여러 가지 항-CEA 항체 등을 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

인간이 제조하는 항체(Man-made antibodies), 특히 단클론 항체 및 제작된 항체 또는 항체 단편은 암, 자가면역질환, 감염성 질환, 염증성 질환 및 심혈관 질환(Cardiovascular disease)을 포함하는 다른 여러 가지 인간 질환 뿐만 아니라 췌장암의 검출 및 치료에서 폭넓게 조사되고 가치를 보여준다[Filpula and McGuire,Exp. Opin. Ther. Patents(1999) 9: 231-245]. 항체 또는 항체 유도 제제의 임상적 사용은 특이적 질병과 관련된 특이적 표적화된 항원에 결합하는 이들의 능력에 이차적으로 의존한다. 선발성은 특히 진단용 또는 치료용 제제가 인체의 정상조직에 유독한 경우의 인간 질병의 검출 및 치료 단계 동안에 위치를 표적하는 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 억제제, 올리고뉴클레오타이드, 성장인자, 방사성핵종, 신생혈관 억제제, 또는 금속과 같은 진단용 또는 치료용 제제를 운반하기 위하여 중요하다. 방사성라벨된 항체는 난소암, 결장암 및 림프종을 포함하는 다수의 암에서 일부가 성공적으로 사용된다. 또한 이 기술은 췌장암에서도 이용할 수 있음이 판명될 것이다. 그러나, 항-CEA 항체 및 B72.3 이외의 적용은 매우 적은 임상적 정보만 존재한다.

상기 항체 시스템의 잠재적 한계는 Goldenberg,The American Journal of Medicine, 94: 298-299 (1993)에 기재되어 있다. 검출 및 치료 기술에서 중요한 매개변수는 주입되는 표적 세포가 존재하는 부위에 특이적으로 위치하는 복용량 및 흡수율이며, 즉, 방사성활성에 특이적으로 결합한 항체의 농도 비율은 주변의 정상 조직에 존재한다. 항체가 혈류에 주입되는 경우, 대사되고 분비되어 많은 구획을 통과하여 지나간다. 항체는 인체의 나머지를 통과하여 지나는 동안 표적 세포 항원에 위치하여 결합할 수 있어야 한다. 항원 표적을 조절하는 인자는 위치, 크기, 항원 농도, 항원 접근성, 병리학적 조직의 세포 조성 및 표적하는 항체의 약물 생체 반응학을 포함한다. 항체에 의해 종양 표적화에 특이적으로 영향을 주는 다른 인자는 종양 및 다른 조직 모두에서 표적 항원의 발현 및 방사성라벨된 항체의 느린 혈액 제거로 인해 발생하는 골수 독성을 포함한다. 표적화된 종양에 의해 공생하는 표적 항체의 양은 종양의 혈관신생, 종양의 항체 침투 방벽 및 종양내 압력에 의해 영향을 받는다. 간, 신장 또는 골수와 같은 비표적 기관에 의한 비특이적 흡수는 골수의 조사가 종종 복용량-한정 독성을 야기하여 방사성면역치료법(radioimmunotherapy)에 대한 기술의 또 다른 잠재적 한계가 된다.

직접 표적화로 알려진 표적 부위에서 제제를 운반하기 위한 접근으로 제안된 하나는 진단용 또는 치료용 방사성 동위원소를 운반하는 항체와 특이 항원을 표적하도록 설계하는 기술이다. 종양의 배경에서 직접 표적화하는 접근은 그들의 항원을 통해 표적 종양을 인지하는 방사성 라벨된 항-종양 일특이성(monospecific) 항체를 사용한다. 이 기술은 환자에게 라벨된 일특이성 항체를 주입하는 단계 및 진단적 또는 치료적 이점을 가지도록 표적 종양에 위치하는 항체를 허용하는 단계를 포함한다. 결합하지 않은 항체는 인체에서 제거된다. 이러한 접근은 부가적 포유동물 질병을 진단 또는 치료하는데 이용된다.

"친화력 증강 시스템(Affinity Enhancement System; AES)"으로 알려진 또 다른 방법은 진단용 또는 치료용 방사성 동위원소를 운반하는 항체에 의해 종양을 표적화하는 결점을 극복하기 위하여 설계된 기술이다[미국특허 제5,256,395호(1993), Barbetet al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 14: 153-166(1999)]. AES는 방사성 라벨된 이원자가 헵텐 및 표적 종양과 방사성활성의 헵텐을 모두 인지하는 항-종양/항-헵텐 양특이성 항체가 사용된다. 또한 고원자가의 헵텐과 고특이성(higher specificity)의 항체가 이 방법에서 사용된다. 상기 기술은 환자에게항체를 주입하는 단계 및 표적 종양에 상기 항체가 위치하는 단계를 포함한다. 혈류로부터 결합하지 않은 항체를 제거하는 시간을 충분히 한 후, 방사성 라벨된 헵텐이 투여된다. 상기 헵텐은 진단적 또는 치료적 잇점을 얻기 위하여 표적 세포 부위에 위치하는 항체-항원 복합체에 결합하고, 반면에 결합하지 않은 헵텐은 인체에서 신속히 제거된다. Barbet은 후자가 종양 표면에 결합하는 경우 이원자가 헵텐이 양특이성 항체와 교차결합할 수 있다는 가능성을 제시하고 있다. 결과적으로, 방사성 라벨된 복합체는 보다 안정하고 오랜 기간 동안 종양에서 머무른다. 이 시스템은 포유동물의 질병을 진단 또는 치료하는데 이용될 수 있다.

직접 표적화 시스템에서 사용하는 다원자가, 일특이성 항체의 제조 및 친화력 증강 시스템에서 사용되는 다원자, 멀티특이성 항체의 제조에 대한 기술의 필요성이 대두되고 있다. 특히, 표적화된 항체에서 증가된 흡수, 혈액내 농도의 감소 및 독성 제약으로부터 정상 조직과 세포를 최적 보호하는 췌장암을 위한 유용한 진단 방법으로 수행하는 항체에 대한 필요성이 대두되고 있다.

본 발명은 일원자가 및 다원자가의 단일특이성 항체 및 일원자가 및 다원자가의 멀티특이성 항체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PAM4로 제작된 MUC1 항원 특이적 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 키메라화된 PAM4 항체 및 그 단편, 및 진단 및 치료에서의 상기 항체 및 그 단편의 용도에 관한 것이다.

하나의 구현예에서, 본 발명에 의한 항체는 하나 또는 그 이상의 동일한 결합 부위를 가지며, 여기에서 각각의 결합 부위는 표적 항원 또는 표적 항원의 에피토프에 대한 친화력을 가진다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 의한 항체는 동일한 또는 다른 표적 항원, 또는 동일한 또는 다른 표적항원의 에피토프에 대한 친화력을 가지는 둘 또는 그 이상의 결합 부위, 또는 표적 항원에 대한 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 헵텐에 대한 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위를 가질 수 있다. 또한 본 발명은 숙주에서 상기에 기재된 항체들을 발현하기 위하여 사용하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

도 1은 뮤린 PAM4의 클론된 V 유전자 및 추정된 아미노산 서열을 보여준다. 도 1A는 PAM4 Vk의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. 도 1B는 PAM4 VH의 DNA 및 아미노산 서열을 보여준다. DNA 서열과 일치하여 인코드되는 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 아래에 하나의 알파벳 코드로 표시되어 있다. 뉴클레오타이드 서열의 번호는 오른쪽 측면에 있다. CDR 영역에서 아미노산 잔기는 굵게 밑줄친 것이다. Kabat의 Ig 분자 번호는 상기 아미노산 잔기 번호에 의해 보여지는 아미노산 잔기를 위해 사용된다. 알파벳에 의해 번호화된 아미노산 잔기는 Kabat의 번호표에 의해 정의된 삽입 잔기이다. 상기 삽입 잔기는 선행된 잔기로서 동일한 앞의 숫자를 가진다. 예를 들면, 도 1B에 도시된 잔기 82, 82A, 82B 및 82C는 각각 82, A, B 및 C를 가리킨다.

도 2는 Sp2/0 세포에서 발현되는 키메라 PAM4(cPAM4) 중쇄 및 경쇄 변이부의 아미노산 서열을 보여준다. 도 2A는 cPAM4 Vk의 아미노산 서열을 보여준다. 도 2B는 cPAM4 VH의 아미노산 서열을 보여준다. 키메라 PAM4 VH 및 Vk의 또 다른 변이부는 각각 도 2C 및 2D에서 나타내고 있다. 아미노산 차이는 PAM4 변이부를 발현하기 위하여 사용되는 벡터에서 나타나는 서열로 인한 것이다. 상기 서열은 하나의 알파벳 코드로 기재되어 있다. CDR 영역에서 아미노산 잔기는 굵게 밑줄친 것이다. 아미노산의 번호는 상기 도 1과 같은 방법으로 표시되어 있다.

도 3은 뮤린 PAM4(마름모로 표시)와 비교하여 키메라화된 PAM4 항체, 즉 cPAM4(폐쇄된 사각형으로 표시)의 결합 활성을 보여준다. 상기 결과는 항원에 결합하는¹³¹I-mPAM4와 경쟁하는 경우 cPAM4 항체 및 mPAM4의 결합 활성을 비교한 것이다. 키메라 항체는 한 종에서 유래된 항체의 상보적 결정 영역(CDRs)을 포함하는 가변 도메인을 함유하는 재조합 단백질이며, 반면에 상기 항체 분자의 특정 도메인은 인간 항체에서 유래된다.

항체 자체 치료

키메라화된 PAM4 항체 자체 또는 이의 단편, 또는 PAM4 융합단백질 또는 이의 단백질의 치료학적으로 효과적인 양은 약학적으로 수용가능한 첨가제(excipient)에서 산출될 수 있다. 또한, 키메라화된 PAM4 항체 자체 및 이의 단편들의 유효성은 하나이상의 다른 항체 자체, 하나이상의 키메라화된 PAM4 항체의 이뮤노컨쥬게이트(immunoconjugate), 동시에 또는 연속적으로 투여하거나 전기의 복용법에 따라 투여하여 PAM4 항체 또는 이의 단편과 약물, 독소, 면역조절자(Immunomodulator), 호르몬, 호르몬 길항제(antagonist), 효소, 효소억제제, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 치료방사성핵종, 혈관형성 저해제 (angiogenesis inhibitor) 등을 포함한 치료성제제의 하나이상과 컨쥬게이트된 것을 상기 항체에 보충함으로써 향상시킬 수 있다. PAM4 항체 자체 및 이의 단편을 보충할 수 있는 항체 자체는 항체 자체의 선택의 제암성(antitumor) 효과를 상승하도록 강화할 수 있는 동일한 종양형태 또는 면역조절자 세포(예를 들어, CD40⁺세포)에 대해 영향을 미칠 수 있다.

한 실시형태에서 bcl-2 발현을 억제하는 안티센스(antisense) 분자와 같은 올리고뉴클레오티드는 전체가 인용예로 포함되는 미국특허 5,734,033호에 기재되어 있으며, 상기 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 항체 융합단백질 또는 이뮤노컨쥬게이트의 치료성제제 부분을 형성하거나 컨쥬게이트될 수 있다. 선택적으로 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 PAM4 항체 자체 또는 컨쥬게이트된 PAM4 항체 또는 이의 단편을 동시적으로 또는 연속적으로 투여할 수 있다. 바람직한 실시형태에서 올리고뉴클레이오티드는 암유전자(Oncogene) 또는 bcl-2와 같은 B-세포 악성의 암유전자 생성물에 바람직하게 영향을 미치는 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.

PAM4 이뮤노컨쥬게이트

또한, 본 발명은 치료용 또는 진단용으로 적어도 하나의 치료성 및/또는 진단성/검출성 제제에 컨쥬게이트된 키메라화 PAM4 항체 및 이의 단편의 용도를 고안한다. 면역요법(immunotherapy)에서 목적은 비-표적화 조직에 노출을 최소화도록 표적세포에 방사능, 독소 또는 약물의 세포독성(cytotoxic) 약물을 전달하는 것이다. 본 발명의 PAM4 항체는 췌장암(Pancreatic tumor)을 진단하고 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 항체, 항체 융합단백질, 및 이의 단편들은 하나 이상의 치료성 또는 진단성/검출성 제제와 컨쥬게이트될 수 있다. 일반적으로 치료성 또는 진단성/검출성 제제의 하나는 각각의 항체, 융합단백질 또는 이의 단편에 부착되지만, 하나이상의 치료성 제제 및/또는 진단성/검출성 제제는 동일한 항체 또는 항체단편에부착될 수 있다. Fc 부분이 없다면(예를들어, 이뮤노컨쥬게이트의 항체성분으로 사용되는 항체가 항체단편일 경우), 항체 또는 항체단편의 전체 길이의 경쇄 가변부위로 탄수화물이 도입될 가능성이 있다. 예를들어, 전체가 인용예로 포함되는 Leunget al., J. Immunol. 154:5919(1995); Hansenet al., 미국특허 제5,443,953(1995), Leunget al., 미국특허 제6,254,868호를 보라. 변형된(engineered) 탄수화물 부분은 치료성 또는 진단성/검출성 제제에 부착되어 사용된다.

항체 탄수화물 부분에 의하여 항체 성분에 펩타이드를 컨쥬게이트하는 방법은 단업계에서 공지된 기술이다. 예를들어, 전체가 인용예로 포함되는 Shihet al., Int. J. Cancer 41:832 (1988); Shihet al., 미국특허 제5,057,313호를 보라. 일반적은 방법은 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체성분을 적어도 하나의 자유 아민 기능기를 갖고 다수의 펩티드에 얹어 있는 수송 고분자(carrier polymer)와 반응하는 것을 포함한다. 상기 반응은 이차아민으로 환원하여 안정될 수 있는 초기 시프염기(Schiff base) 결합에서 최종 컨쥬게이트를 형성한다.

본 발명의 항체 융합단백질 및 이의 단편은 2개 이상의 항체 또는 이의 단편으로 이루어지고, 상기 융합단백질을 구성하는 각각의 항체는 적어도 하나의 치료성 제제 및/또는 진단성/검출성 제제를 포함할 수 있다. 예를들어, 항체 융합단백질은 하나의 항체(2개의 항원결합부위) 및 항체단편, 2개의 항체단편, 또는 2개의 항체로 이루어질 수 있다. 항체 융합단백질은 적어도 하나의 진단성/검출성 및/또는 치료성 제제와 컨쥬게이트될 수 있다.

따라서, 항체융합 단백질의 하나이상의 항체 또는 이의 단편은 부착된 하나이상의 치료성 및/또는 진단성/검출성 제제를 가질 수 있다. 게다가, 치료성 제제는 동일한 것이 필요하지 않고 상이한 치료성 제제, 예를들어 동일한 융합단백질에 약물 및 방사성동위원소(radioisotope)가 부착될 수 있다. 특히, IgG는¹³¹I로 방사성라벨화될 수 있고 약물에 부착될 수 있다.¹³¹I는 IgG의 티로신(tyrosine)으로 배합될 수 있으며, 약물은 IgG 리신(lysine)의 엡실론(epsilon) 아미노기에 부착될 수 있다. 또한, 치료성 및 진단성/검출성 제제 모두 환원된 SH기 및 탄수화물 측쇄(side chain)에 부착될 수 있다.

진단성 및 치료성 반응물의 광범위한 종류는 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있거나 유리하게 발명의 항체, 예를들어 약물, 독소, 면역조절자, 호르몬, 호르몬 길항제(antagonist), 효소, 올리고뉴클레오티드, 효소 억제제, 치료방사성핵종, 혈관형성 저해제(angiogenesis inhibitor) 등에 컨쥬게이트될 수 있다. 여기서 언급된 치료성 제제는 상기에서 기재된 항체 자체와 분리적으로 투여하는데 유용한 제제이다. 예를들어, 치료성 제제는 유사분열억제제(vinca alkaloid), 안트라사이클린계(anthracycline), 에피도필로톡신(epidophyllotoxins), 탁산(taxan), 대사길항물질(antimetabolite), 알킬레이트제, 항생제(Antibiotics), COX-2 억제제, SN-38, 세포분열 저지성물질(antimitotics), 암세포의 혈광형성억제제(antiangiogenic) 및 세포사멸제(apoptotic agent)를 포함하고, 특히 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 탁솔(taxol), CPT-11, 켐토데칸(camptothecans), 및 항암성제제의 다른 분류 및 이와는 다른 형태를 포함한다. 동시적으로 또는 연속적으로 투여하거나 이뮤노컨쥬게이트 및 항체 융합단백질의 제조에 유용한 암 화학요법약물은 질소머스타드(nitrogen mustard), 젬시타빈(gemcitabine), 알킬 설포네이트, 니트로스 우레아(nitrosurea), 트리아젠(triazene), 엽산 유사체(folic acid analog), COX-2 억제제, 피리미딘(pyrimidine) 유사체, 푸린(purine) 유사체, 플레티님 배합체(platinim coordination complex), 호르몬 등을 포함한다. 적절한 화학요법 제제는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19th Ed.(Mack Publising Co., 1995), 및 GOODMAN AND GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed.(MacMillan Publising Co., 1985)에 기재되어 있다. 실험적 약물과 같은 기타 적절한 화학요법제제는 당업계에서 공지된 것이다.

한 실시형태에서 bcl-2발현을 억제하는 안티센 분자와 같은 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 항체 융합단백질 또는 이뮤노컨쥬게이트의 치료성 제제부분을 형성하거나 컨쥬게이트될 수 있다. 선택적으로 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 PAM4 항체 자체 또는 컨쥬게이트된 PAM4 항체 또는 항체 단편은 동시적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 암유전자 또는 bcl-2와 같은 B-세포 종양의 암유전자 생성물에 영향을 미치는 안티센 올리고뉴클레오티드이다.

한 실시형태에서 본 발명의 키메라화 PAM4 항체 및 이의 단편들은 젬시타빈(gemcitabine)과 컨쥬게이트된다. 다른 실시형태에서 젬시타빈은 본 발명의 자체또는 컨쥬게이트된 키메라화 PAM4 항체의 전, 후 또는 동시에 주어질 수 있다. 바람직하게 컨쥬게이트된 키메라화 PAM4 항체 또는 항체 단편이 방사성핵종에 컨쥬게이트된다.

독소는 동물, 식물 또는 미생물 기원이 될 수 있다. 또한, 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin)와 같은 독소는 본 발명의 PAM4 및 cPAM4 항체의 이뮤노컨쥬게이트의 치료성 제제 부분을 형성하거나 복합화될 수 있다. 컨쥬게이트 또는 다른 융합단백질의 제조에 적절하게 적용되는 기타 독소들은 리신(ricin), 아브린(abrin), 리보뉴클레아제(ribonuclease, RNase), DNase I, 포도상균 장독성(staphylococcal enterotoxin)-A, 포크위드 항 바이러스(pokeweed antiviral) 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테린(diphtherin) 독소, 슈도모나스 외독소, 슈도모나스 내독소를 함유한다. 예를들어, Pastan etal., Cell 47 : 641 (1986), 및 Goldenberg, CA-ACancer Journalfor Clinicians 44 : 43 (1994)를 보라. 본 발명에서 사용에 적절한 부가적인 독소는 당업계에서 공지된 것이며, 전체적으로 예가 되는 미국특허 제 6,077,499호에 공개된다.

또한, 시토킨과 같은 면역조절자는 PAM4 및 cPAM4의 치료성 제제 부분을 형성하거나 컨쥬게이트되거나, 본 발명의 키메라화 PAM4 항체 또는 이의 단편, PAM4 융합단백질 또는 이의 단편에 비컨쥬게이되도록 처리할 수 있다. PAM4 융합단백질 또는 이의 단편은 상이한 항원과 결합되는 하나이상의 항체 또는 이의 단편으로 이루어질 수 있다. 예를들어, 융합단백질은 면역조절성 세포 또는 인자와 마찬가지로 PAM4 항원에 결합될 수 있다. 선택적으로 대상은 자체 PAM4 항체, 융합단백질 또는이의 단편을 받을 수 있으며, 자체 PAM4 항체의 투여 전, 동시 또는 후에 처리될 수 있는 시토킨을 별개로 처리할 수 있다. 여기서 사용되는 "면역조절자"은 시토킨, 줄기세포 성장인자, 종양괴사 인자와 같은 림포톡신, 및 인터루킨(인커루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 및 IL-21), 콜로니 자극인자(granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) 및 granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)), 인터페론(interferons)(인터페론-α,β, 및 γ), SI 인자로 제작된 줄기세포 성장인자, 에리트로포이에틴(erythropoietin) 및 트롬보포이에틴과 같은 조혈성(hematopoietic) 인자들을 포함한다. 적절한 면역조절자 부분의 구체적인 예는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, interferon-γ, TNF-α 등을 포함한다.

선택적으로 본 발명의 항체 및 단편은 효소에 항체를 결합함으로써 검출가능하게 라벨화될 수 있다. 항체-효소 컨쥬게이트가 적절한 기질의 존재하에서 배양될 경우, 효소 부분이 기질과 반응하여 예를들어 분광학적(Spectrophotometric), 형광학적 또는 시각적 수단으로 관측될 수 있는 화학적 부분을 생산한다. 검출가능하게 라벨 항체에 사용될 수 있는 효소의 구체적인 예로는 탈수소효소(malate dehydrogenase), 포도상구균 핵산(staphylococcal nuclease), 델타-V-스테로이드 이성질화효소(delta-V-steroid isomerase), 효모알콜 탈수소효소(yeast alcohol dehydrogenase), α-글리세로포스페이트 탈수소효소(glycerophosphate dehydrogenase), 트리오제 포스페이트 이성질화효소(triose phosphate isomerase), 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알카린 포스페이트(alkalinephosphatase), 아스파라기나아제(asparaginase), 글루코스산화효소(glucose oxidase), β-갈락토시다아제(galactosidase), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 우레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 글르코스-6-포스페이트 탈수소효소(phosphate dehydrogenase), 글루코아밀라아제(glucoamylase) 및 아세틸클로린에스테라아제(acetylcholinesterase)을 포함한다.

치료성 또는 진단성/검출성 제제는 이황화물 결합 형성을 통하여 환원 항체 성분의 경첩부위(hinge region)에서 부착될 수 있다. 선택적으로, 상기 제제는 N-석시닐3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP)과 같은 이종이기능성(heterobifuctional) 가교기를 사용하여 항체 성분에 부착할 수 있다(Yu et al., Int.R Cancer 56 : 244 (1994). 상기 컨쥬게이션의 일반적인 방법은 당업계에 공지된 것이다. 예를들어, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis etal.,"Modification of Antibodies by ChemicalMethods,"in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birchet al. (eds. ), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et aL (eds. ), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995)을 보라. 선택적으로, 치료성 또는 진단성/검출성 제제는 항체의 Fc 부위에서 탄수화물 부위을 통하여 접합될 수 있다. 탄수화물기는 티올기에 결합된 동일한 제제의 부하를 증가시키는데 사용될 수 있거나, 탄수화물 부분은 상이한 펩티드를 결합하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 표적화할 수 있는 구조는 질병 조직을 검출하는데 유용한 하나이상의 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 특히 유용한 진단성 방사성핵종은 특별히 한정되는 것은 아니지만,¹¹⁰In,¹¹¹In,¹⁷⁷Lu,¹⁸F,⁵²Fe,⁶²Cu,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁸⁶Y,⁹⁰Y,⁸⁹Zr,^94mTc,⁹⁴Tc,^99mTc,¹²⁰I,¹²³I,¹²⁴I,¹²⁵I,¹³¹I,^154-158Gd,³²P,¹¹C,¹³N,¹⁵O,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,⁵¹Mn,^52mMn,⁵⁵Co,⁷²As,⁷⁵Br,⁷⁶Br,^82mRb,⁸³Sr, 또는 다른 감마-, 베타- 또는 양전자-방출체를 포함하고, 바람직하게는 20~4,000keV, 더 바람직하게는 25~4,000keV, 더욱더 바람직하게는 25~1,000keV, 특히 더 바람직하게는 70~700keV 범위의 붕괴에너지를 갖는다. 유용한 양전자-방출 방사성핵종의 전체 붕괴에너지는 바람직하게 〈2,000keV, 더 바라직하게는 1,000keV이하, 더 바람직하게는 〈700keV이다. 감마선 검출을 이용하는 진단성/검출성 제제로 유용한 방사성핵종은 특별히 한정되지 않지만,⁵¹Cr,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga,⁷⁵Se,⁹⁷Ru,^99mTc,¹¹¹In,^114mIn,¹²³I,¹²⁵I,¹³¹I,¹⁶⁹Yb,¹⁹⁷Hg 및²⁰¹Tl을 포함한다. 유용한 감마선 방출 방사성핵종의 붕괴에너지는 바람직하게 20~2,000keV, 더 바람직하게는 60~600keV, 특히 바람직하게는 10~300keV이다.

본 발명의 방법에서 표적화할 수 있는 구조는 질병 조직을 치료하는데 유용한 하나이상의 방사성 동위원소를 포함할 수 있다. 특히 유용한 치료성 방사성핵종은 특별히 한정되는 것은 아니지만,¹¹¹In,¹⁷⁷Lu,²¹²Bi,²¹³Bi,²¹¹At,⁶²Cu,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁹⁰Y,¹²⁵I,¹³¹I,³²P,³³P,⁴⁷Sc,¹¹¹Ag,⁶⁷Ga,¹⁴²Pr,¹⁵³Sm,¹⁶¹Tb,¹⁶⁶Dy,¹⁶⁶Ho,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁸⁹Re,²¹²Pb,²²³Ra,²²⁵Ac,⁵⁹Fe,⁷⁵Se,⁷⁷As,⁸⁹Sr,⁹⁹Mo,¹⁰⁵Rh,¹⁰⁹Pd,¹⁴³Pr,¹⁴⁹Pm,¹⁶⁹Er,¹⁹⁴Ir,¹⁹⁸Au,¹⁹⁹Au 및²¹¹Pb를 포함한다. 치료성 방사성핵종은 바람직하게 20~6,000keV의 붕괴에너지, 바람직하게 60~200keV의 오제방출(Auger emitter), 100~2,500keV의 베타(beta)방출, 및 4,000~6,000keV의 알파방출를 갖는다. 유용한 베타-입자-방출 핵종의 최대 붕괴에너지는 바람직하게는 20~5,000keV, 더 바람직하게는 100~4,000keV, 특히 더 바람직하게는 500~2,500keV이다. 또한, 바람직하게는 오제 방출입자로 적절하게 붕괴하는 방사성핵종이다. 예를들어, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m, 및 Ir-192이다. 유용한 베타-입자-방출 핵종의 붕괴에너지는 〈1,000keV, 더 바람직하게는 〈100keV, 특히 더 바람직하게는 〈70keV이다. 또한, 바람직하게는 알파입자의 생성으로 적절하게 붕괴하는 방사성핵종이다. 상기의 방사성핵종은 특별히 한정되는 것은 아니지만, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, 및 Fm-255을 포함한다. 유용한 알파-입자-방출 방사성핵종의 붕괴에너지는 바람직하게는 2,000~10,000keV, 더 바람직하게는 3,000~8,000keV, 특히 더 바람직하게는 4,000~7,000keV이다.

예를들어 61.5시간의 반감기 및 베타입자및 감마선의 풍부한 공급으로 방사선면역치료법(radioimmunotherapy)에 방사성 동위원소로 가망있는 하나이상으로 것으로 고려되는⁶⁷Cu는 킬레이트화제(chelating agent), p-브로모아세트아미도-벤질-테트라에틸아민테르라아세트산(TETA;p-bromoacetamido-benzyl-tetraethylamine tetra acetic acid)를 사용하여 PAM4 항체에 컨쥬게이트될 수 있다. 선택적으로 에너지 베타입자를 방출하는⁹⁰Y는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA; diethylenetriaminepentaacetic acid)을 사용하여 PAM4 항체, 융합단백질 또는 이의 단편에 결합될 수 있다.

잠잭적 방사성동위원소는¹¹C,¹³N,¹⁵O,⁷⁵Br,¹⁹⁸Au,²²⁴Ac,¹²⁶I,¹³³I,⁷⁷Br,^113mIn,⁹⁵Ru,⁹⁷Ru,¹⁰³Ru,¹⁰⁵Ru,¹⁰⁷Hg,²⁰³Hg,^121mTe,^122mTe,^125mTe,¹⁶⁵Tm,¹⁶⁷Tm,¹⁶⁸Tm,¹⁹⁷Pt,¹⁰⁹Pd,¹⁰⁵Rh,¹⁴²Pr,¹⁴³Pr,¹⁶¹Tb,¹⁶⁶Ho,¹⁹⁹Au,⁵⁷Co,⁵⁸Co,⁵¹Cr,⁵⁹Fe,⁷⁵Se,²⁰¹Tl,²²⁵Ac,⁷⁶Br,¹⁶⁹Yb 등을 포함한다.

다른 실시형태에서 방사선감작인자(radiosensitizer)는 본 발명의 자체 또는 컨쥬게이트된 PAM4 항체 또는 항체 단편과 조합하여 사용될 수 있다. 방사선감작인자의 첨가는 방사성라벨화된 항체 또는 항체단편을 단독으로 처리할때와 비교하여 향상된 유효성을 가져올 수 있다. 방사성감작인자는 전체가 인용예가 되는 D.M. Goldberg(ed.) CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press(1995)에 기재되어 있다.

열중성자활성(thermal neutron activation) 치료에 보론 가량(addend)-부하(loaded) 수송체를 갖는 본 발명의 PAM4 항체 또는 이의 단편, 또는 PAM4 항체 융합단백질 또는 이의 단편은 유사한 방법으로 영향을 미칠것이다. 그러나, 중성자 조사를 수행하기 전에 비-표적화된 PAM4 이뮤노컨쥬게이트가 제거될 때까지 기다리는 것이 유리하다. 제거는 PAM4 항체에 결합된 항체를 사용하여 가속화될 수 있다. 상기의 일반적인 원리의 기재는 미국특허 제4,624,846호를 보라. 예를들어, 카르보란(carborane)과 같은 보론 가량물은 PAM4 항체에 부착될 수 있다. 카르보란은 당업계에서 공지된 것과 같이 팬던트(pendant) 측쇄에 카르복실기와 제조될 수 있다. 아미노덱스트란과 같이 수송체에 카르보란의 부착은 카르보란의 카르복실기를 활성하고 수송체의 아민을 축합함으로써 얻을 수 있다. 다음, 컨쥬게이트 중간체는 PAM4 항체에 컨쥬게이트된다. PAM4 항체 컨쥬게이트의 처리 후, 보론 가량물은 열중성자 조사로 활성화되고, α-방출으로 붕괴하는 방사성활성 원소로 변형되어 높은 독성의 단범위 효과를 얻을 수 있다.

게다가, 본 발명은 대상에 암을 진단하는 방법을 포함한다. 진단은 약학적으로 적절한 첨가제로 나타내는 진단성 컨쥬게이트를 진단적으로 효율적인 양을 투여하고, 상기 라벨을 검출함으로써 수행될 수 있다. PAM4 항체, 융합단백질 및 이이 단편은 진단성/검출성 제제에 컨쥬게이트될 수 있거나, 진단성/검출성제제의 투여 전, 동시 또는 후에 진단성/검출성 제제에 비컨쥬게이트된 것을 투여될 수 있다. 진단성/검출성 제제로 사용될 수 있는 방사성 제제는 상기에 기재되었다. 적절한 비-방사성 진단성/검출성 제제는 자기공명 영상, X-선, 컴퓨터단층촬영(computedtomography), 또는 초음파에 적절한 조영제이다. 예를들어, 자기영상 제제는 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체를 포함하는 금속-킬레이트 조합과 복합체화된 망간, 철 및 가돌리늄(Gadolinium) 등과 같은 비-방사능 금속을 포함한다. 전체적으로 예가 되는 미국출원 제 09/921,290호를 보라.

MRI 조영제와 같은 조영제를 본 발명에서 고안하며 예를들면, 본 발명에서 가돌리늄 이온, 란타늄 이온, 디스프로슘(dysprosium) 이온, 철이온, 망간이온 또는 기타 유사라벨, CT 조영제, 및 초음파 조영제가 사용에 적절하다.

본 발명에 적절한 상자성 이온은 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(samarium) (Ⅲ), 이테르븀(ytterbium) (Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나디움(Ⅱ), 테르븀(terbium) (Ⅲ), 디스프로슘(dysprosium) (Ⅲ), 홀뮴(holmium) 및 에르븀(erbium)을 포함하며, 가돌리늄이 특히 바람직하다.

X-선 영상과 같은 다른 상황에서 유용한 이온은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 란타늄(Ⅲ), 금(Ⅲ), 납(Ⅱ) 및 특히 비스무스(Ⅲ)를 포함한다. 형광성 라벨은 로다민(rhodamine), 플루오레세인(fluorescein) 및 레노그라핀(renographin)을 포함한다. 로다민 및 플루오레세인은 종종 이소티오시아네이트 중간체에 의해 연결되기도 한다.

또한, 금속은 자기공명 영상화 기법을 포함하여 진단성/검출성 제제에 유용하다. 상기 금속들은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 가돌리늄, 망간, 철, 크롬, 구리, 코발트, 니켈, 디스프로슘, 레늄(rhenium), 유로피움, 테르븀(terbium), 홀뮴, 및 네오디뮴(neodymium)을 포함한다. 항체성분을 방사성 금속 또는 상자성 이온과 부하하기 위해, 이온을 결합하는데 킬레이트기의 다수와 부착된 긴 꼬리를 갖는 반응물과 반응하는 것이 필요할 수도 있다. 상기의 꼬리는 폴리리신, 폴라사카라이드와 같은 고분자, 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA; diethylenetriaminepentaacetic acid), 포르피린(porphyrin), 폴리아민, 크라운에테르, 비스-티오세미카르바존(thiosemicarbazone), 폴리옥심(polyoximes)과 같은 킬레이트기와 결합될 수 있는 펜텐트기를 갖고 상기 목적에 유용하다고 알려진 기를 갖는 유도화되거나 유도될 수 있는 고리일 수 있다. 킬레이트는 표준화학을 사용하여 PAM4 항체, 융합단백질 또는 이의 단편에 결합된다. 킬레이트는 정상적으로 면역반응성의 최소 손실과 최소 집합체 및/또는 내부 교차연결로 분자에 결합을 형성할 수 있는 기에 의해 항체에 연결된다. 항체에 킬레이트를 컨쥬게이트하는 예외적인 방법 및 반응물은 1989년 4월 25일에 등록된 미국특허 4,824,659호(명칭 "항체 컨쥬게이트")에 기재되어 있다. 특히 유용한 금속-킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 이의 모노메틸 및 시클로헥실 유사체를 포함하고, 진단성 동위원소와 20~2,000ke의 일반적인 에너지 범위에서 사용된다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방사성 금속과 복합화될 경우, 같은 킬레이트는 본 발명의 항체와 사용될 때 MRI에 유용하다. NOTA, DOTA, 및 TETA와 같은 거대고리(macrocyclic) 킬레이트는 금속 및 방사성 금속의 종류와 사용되고, 바람직하게는 갈륨, 이트륨(yttrium) 및 구리의 방사성핵종과 각각 사용된다. 상기 금속-킬레이트 복합체는 대상의 금속에 고리크기를 맞춤으로써 매우 안정하게 제조될 수 있다.RAIT에²²³Ra와 같은 핵종과 안정하게 결합하는데 유용한 거대고리 폴리에테르류와 같은 고리형 킬레이트는 본 발명에 의해 성취된다.

비투과성(radiopaque) 및 조영 물질은 X-선 및 컴퓨터단층촬영을 향상하는데 유용하며, 요오드 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물, 탈륨(thallium) 화합물 등을 포함한다. 특정 화합물은 바륨, 디아트리조에이트(diatrizoate), 에티오디즈 오일(ethiodized oil), 구연산갈륨(gallium citrate), 아이오카민산(iocarmic acid), 아이오세타민산(iocetamic acid), 요오다미드(Iodamide), 요오디파미드(iodipamide), 요오독사민산(iodoxamic acid), 아이오글라미드(iogulamide), 아이오헥솔(iohexol), 아이오파미돌(iopamidol), 아이오파노산(iopanoic acid), 아이오프로세민산(ioprocemic acid), 아이오세파민산(iosefamic acid), 요오세린산(ioseric acid), 요오술라미드 메글루민(iosulamide meglumine), 요오세메트산(iosemetic acid), 이오타술(iotasul), 이오테트르산(iotetric acid), 이오탈라민산(iothalamic acid), 이오트록시산(iotroxic acid), 이오자글르산(ioxagalic acid), 이옥소트리조산(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리자마이드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리돈(propylidone) 및 탈로스 클로라이드(thallous chloride)를 포함한다.

또한, 본 발명의 항체, 융합단백질 및 이의 단편들은 형광화합물로 라벨화될 수 있다. 형광적으로 라벨화된 MAb의 존재는 적절한 빛 파장에 항체를 노출시키고, 결과 형광을 검출함으로써 결정된다. 형광 라베링 화합물은 플루오레세인(fluorescein) 이소시아네이트, 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 남조소(phycocyanin), 알로피코사이아닌(allophycocyanin), o-프탈알데하이드 및 플루오르스카민(fluorescamine)을 포함한다. 형광적으로 라벨화된 항체는 특히 유세포검사 분석(flow cytometry analysis)에 유용하다.

선택적으로 본 발명의 항체, 융합단백질 및 이의 단편은 화학발광 화합물에 항체를 결합함으로써 측정가능하게 라벨화될 수 있다. 화학발광태그 MAb의 존재는 화학반응의 과정동안 나타나는 발광의 존재를 관측함으로써 결정된다. 화학발광 라벨링 화합물의 예는 루미놀, 이소루미놀, 방향족 아크리디늄(acridinium) 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함한다.

유사하게, 생물발광 화합물은 본 발명의 항체 및 이의 단편을 라벨화하는데 사용될 수 있다. 생물발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효율성을 증가시키는 생물적 시스템에서 발견되는 화학발광의 형태이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 측정함으로써 결정된다. 라벨링에 유용한 생물발광 화합물은 발광소, 루시페라제(luciferase) 및 에퀘린(aequorin)을 포함한다.

따라서, 대상에 종양을 진단하는 방법은 자체 PAM4 MAb 또는 이의 단편, 또는 자체 항체 융합단백질 또는 이의 단편으로 이루어진 성분으로 대상의 시편(유체, 조직 또는 세포)을 생체밖 진단분성을 수행하는 단계로 이루어진다. 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 세포 또는 조직에서 PAM4의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 바람직하게 진단되는 종양은 암이다. 더 바람직하게는 암은 췌장암이다.

게다가, DTPA, DOTA, TETA, 또는 NOTA, 또는 적절한 펩티드와 같은 킬레이트는 형광분자와 같은 검출 라벨 또는 중금속 또는 방사선핵종과 같은 세포독성제제에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를들면, 치료적으로 유용한 이뮤노컨쥬게이트는 항체융합단백질에 광활성제제 또는 염료를 접합함으로써 얻을 수 있다. 형광색소와 같은 형광조성 및 다른 색원체(chromogen), 또는 가시광선에 민감한 포르피린과 같은 염료들은 병변에 적절한 빛을 도입함으로써 병변을 검출하고 치료하는데 사용되어 왔다. 치료에서, 이는 광방사, 광치료, 또는 광활성치료법(photodynamic therapy)로 지칭되어 왔다(Jori etal. (eds. ), PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES (Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22: 430 (1986) ). 게다가, 단클론 항체들은 광치료를 수행하는데 광활성 염색과 결합되어 왔다. Mewet al., J. Immunol. 130 : 1473 (1983);idem., CancerRes. 45 :4380 (1985);Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 8744 (1986);idem., Photochem.Photobiol. 46 : 83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin.BioL Res. 288 : 471 (1989); Tatsuta etal., LasersSurg. Med. 9 : 422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67 : 2529 (1991). 그러나, 상기의 종래 연구들은 내시경수술 적용의 사용, 특히 항체 단편 또는 서브단편을 사용하는 것을 포함하지 않았다. 따라서, 본 발명은 광활성제제 또는 염료로 이루어진 이뮤노컨쥬게이트의 치료적 용도를 고안한다.

치료목적에서 본 발명의 PAM4 항체 및 이의 단편들은 치료적으로 효과적인 양으로 환자에게 투여된다. 투여 함량이 생리학적으로 중요하다면 항체는 "치료적으로 효과적인 함량"에서 처리된다고 한다. 이의 존재가 수령환자의 생리학에서 관측변화를 초래한다면, 제제는 생리학적으로 중요하다.

진단성/검출성 제제는 분자 또는 원자이며, 이는 항체 부분에 컨쥬게이트되어 투여될 수 있으며, 즉 항체 또는 항체 단편, 또는 서브단편, 융합단백질 및 이의 단편이 질병관련 항원을 함유하는 세포에 위치함으로써 질병을 진단/검출하는데 유용하다. 유용한 진단성/검출성 제제는 특별히 한정되지 않지만, 자기공명 영상(MRI)에 방사성동위원소, 염료(비오틴(biotin)-스트렙타비딘(streptavidin) 복합체), 비투과성 물질(요오드, 바륨, 갈륨 및 탈륨 화합물 등), 조영제, 형광화합물 또는 분자 및 증가제(상자성 이온)을 포함한다. 미국특허 제6,331,175호에는 MRI 기술 및 MRI 증가제에 컨쥬게이트된 항체의 제조법이 기재되어 있다. 바람직하게, 진단성/검출성 제제는 핵영상(nuclear imaging), 내시경적 및 혈관내 검출, 자기공명 영상 또는 초음파에서 사용되는 증가제, X-선 및 컴퓨터 단층촬영의 비투과성 및 조영제, 및 내시경 형광법을 포함한 형광투시법에서의 형광화합물을 포함한다. 항체에 컨쥬게이트되거나 이특이성, 예비표적화방법에서 사용되는 형광성 및 방사성제제는 감마-, 베타-, 및 양전자방출과 함께 악성종양과 같은 질병 조직 또는 세포의 덩어리와 결합된 표적화된 항원의 내시경적, 외과수술적 또는 혈관대 검출에 유용하며, Goldenberg 미국특허 제5,716,595호, 제6,096,289호 및 미국출원 제09/348,818호에 기재되어 있다. 내시경 적용은 결장(colon)과 같이 내시경이 가능한 구조에 퍼져있을 때 사용될 수 있다. 양전자 방출 단층 촬영(positron emission tomography)에 유용한 방상성핵종은 특별히 한정되는 것은 아니지만, F-18, Mn-51, Mn-52m, Fe-52, Co-55, Cu-62, Cu-64, Ga-68, As-72, Br-75, Br-76, Rb-82m, Sr-83, Y-86, Zr-89, Tc-94m, In-110, I-120 및 I-124을 포함한다. 유용한 양전자방출 방사성핵종의 전체 붕괴에너지는 바람직하게 〈2,000keV, 더 바람직하게는 1,000keV이하, 특히 더 바람직하게는 〈700keV이다. 감마선 검출을 이용하는 진단성/검출성 제제로서 유용한 방사성핵종은 특별히 한정되는 것은 아니지만, Cr-51, Co-57, Co-58, Fe-59, Cu-67, Ga-67, Se-75, Ru-97, Tc-99m, In-111, In-114m, I-123, I-125, I-131, Yb-169, Hg-197, 및 Tl-201을 포함한다. 유용한 감마선 방출 방사성핵종의 붕괴에너지는 바람직하게 20~2000keV, 더 바람직하게는 60~600keV, 특히 더 바람직하게는 100~300keV이다.

생체밖 진단

본 발명은 PAM4 항원의 존재하에서 생체밖 생물학 시료를 스크린하기 위해, PAM4 융합단백질 및 이의 단편을 포함하여 PAM4 항체를 사용하는 것을 고안한다. 상기 면역분석에서, PAM4 항체, 융합단백젤 또는 이의 단백질은 하기에서 기재하는 바와 같이 액상에서 사용되거나 고상 운반체에 결합되어 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서 PAM4 항체 또는 이의 단편은 키메라화된다. 특히 더 바람직하게는, PAM4 융합단백질은 키메라화된 PAM4 항체로 이루어진다.

생물학적 시료가 PAM4 항원을 함유하는지를 결정하는 스크린 방법 중 한 예는 방사성면역분석(RIA)이다. 예를들어, RIA의 한 형태에서 시험의 물질을 방사선라벨화된 PAM4 항원의 존재하에서 PAM4 항원 MAb와 혼합한다. 상기 방법에서 시험 물질의 농도는 MAb에 결합된 라벨화된 PAM4 항원의 함량에 따라 반비례할 것이며,자유 라벨화된 PAM4 항원의 함량에 직접적으로 관련될 것이다. 다른 적절한 스크린 방법은 당업자들에게 명백할 것이다.

선택적으로, 생체밖 분석은 PAM4 항체, 융합단백질 또는 이의 단백질은 고상 운반체에 결합되는 동안 수행될 수 있다. 예를들어, MAb는 폴리머-코티드(coated) 비드, 플레이트 또는 튜브와 같은 비용해성 지지체에 MAb를 결합하기 위해 아미노덱스트란과 같은 폴리머에 부착할 수 있다.

기타 적절한 생체밖 분석은 당업계의 당업자들에게 명백할 것이다. 기타 분석조건과 마찬가지로 검출가능하게 라벨화된 PAM4 항체 및 PAM4 항원의 특이 농도, 배양농도 및 배양시간은 시료에서 PAM4 항원의 농도, 시료특성 등의 다양한 인자에 따라 변화할 수 있다. 시료 PAM4 항체의 결합활성은 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 당업자들은 일상적인 실험을 도입하여 각 결정에서 효과적이고 최적의 분석조건을 결정할 것이다.

세척, 교반, 흔듬, 여과 등의 기타 과정들은 특정상황에서 관습적으로 또는 필요에 따라 분석에 첨가될 수 있다.

생물학 시료에서 PAM4 항원의 존재는 효소결합 면역흡착분석법(ELISA)을 사용하여 결정될 수 있다. 직접적인 경합 ELISA에서, 깨끗하거나 준 순수한 항원 제조는 시험화된 유액 또는 세포성 추출액에서 불용해되는 고체 지지체에 달려 있으며, 검출가능하게 라벨화된 용해성 항체의 양은 고상 항원 및 라벨화된 항체사이에서 형성되는 두 복합체의 검출 및/또는 정량을 수행하는데 부가된다.

반대로, "two-site ELISA" 또는 "sandwich assay"으로 알려져 있는 이중결정ELISA는 소량 항원이 요구되고, 분석은 항원의 과도한 정제를 요구하지 않는다. 따라서, 이중결정(double-determinant) ELISA는 임상학적 시료에서 항원의 검출에 직접적인 경합 ELISA에 바람직하다. 예를들어, 생검시편에서c-myc발암 단백(oncoprotein)의 정량에 이중결정 ELISA의 사용을 보라. Fieldet al., Oncogene 4.-1463 (1989); Spandidos etal.,AntiCancer Res. 9. 821 (1989).

이중결정 ELISA에서, 비라벨화된 MAb 또는 항체단편("포착항체"(capture antibody))는 고체 지지체에 결합되고, 시험 시료는 포착항체와 접촉되고, 검출가능하게 라벨화된 용해성 항체(또는 항체단편)의 양은 포착항체, 항원 및 라벨화된 항체사이에 형성된 3급 복합체의 검출 및/또는 정량이 가능하도록 부가된다. 항체 단편은 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab 등과 같은 항체의 부분이다. 본 문맥에서 항체 단편은 PAM4 항원의 에피토프에 결합하는 PAM4 MAb의 부분이다. 또한, "항체단편" 용어는 복합체를 형성하는 특이 항원에 결합함으써 항체와 같이 행동하는 합성적 또는 유전적 변형단백질을 포함한다. 예를들면, 항체 단편은 경쇄 가변부위로 이루어진 분리된 단편, 중쇄 및 경쇄 가변부위로 이루어진 Fv 단편, 및 경쇄 및 중쇄 가변부분이 펩티드 링커에 의해 결합되는 재조합 단쇄 폴리펩티드 분자를 포함한다. 항체융합단백질은 같거가 상이한 특이성으로 적어도 2개 이상의 단사슬(single chain) 항체 또는 항체단편이 연결된 항원결합 분자를 조합적으로 생산된다. 융합단백질은 단 항체성분, 상이한 항체성분의 다가 또는 다특이성 조합 또는 같은 항체의 다수로 이루어진다. 또한, 융합단백질은 진단성/검출성 및/또는 치료성 제제와 컨쥬게이트된 항체 또는 항체단편으로 이루어진다. 용어 PAM4 항체는 키메라화된 및 쥐과 항체, 이의 항체단편, 이뮤노컨쥬게이트 및 이의 단편, 및 항체 융합단백질 및 이의 단편을 포함한다.

이중결정 ELISA의 수행방법은 공지된 것이다. 예를들어, Field etal., supra, Spandidos etal., supra, and Moore etal.,"Twin-Site ELISAsfor fos and myc Oncoproteins Using the AMPAK System, "in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 273-281 (The Humana Press, Inc. 1992)을 보라.

이중결정 ELISA에서 용해성 항체 또는 이의 단편은 포착항체에 의해 인지되는 에피토프와 구별되는 PAM4 에피토프와 결합해야만 한다. 이중결정 ELISA은 생검시료에서 PAM4 항원이 존재하는지를 확인하는데 시행될 수 있다. 선택적으로, 분석은 체액의 임상학적 시료에서 존재하는 PAM4 항원의 함량을 정량하는데 사용될 수 있다. 정량분석은 정제된 PAM4 항원의 희석액을 함유함으로써 시행될 수 있다.

또한, 본 발명의 PAM4 MAbs, 융합단백질 및 이의 단편은 분석키트의 제조에 적합하다. 상기 키트는 바이알, 튜브 등의 하나이상의 담체수단에서 각 담체에서 받은 구별되는 담체수단으로 이루어지고, 상기 담체는 면역분석의 구별된 원소로 이루어 담체수단을 의미한다.

예를들어, 고상 지지체에 면역화된 포착 항체를 함유하는 담체수단, 및 용액에 검출가능하게 라벨화된 항체를 함유하는 담체수단일 수 있다. 게다가, 담체수단은 PAM4 항원의 연속 희석액으로 이루어진 표준용액을 함유할 수 있다. PAM4 항원의 표준용액은 가로에 PAM4 항원농도 및 세로에 검출신호로된 표준곡선을 제조하는데 사용될 수 있다. PAM4 항원을 함유하는 시로료부터 얻어진 결과는 생물학적 시료에서 PAM4 항원농도가 되는 점이 삽입될 수 있다.

또한, 본 발명의 PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단편은 조직학적 시료로부터 제조된 조직시편에서 PAM4 항원의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 검출자체는 검사조직에서 PAM4 항원의 존재를 결정하고, PAM4 항원의 분포를 결정하는데 사용될 수 있다. 검출자체는 조직시편을 냉각하기 위해 측정가능하게 라벨화된 PAM4 항체를 적용함으로써 수행될 수 있다. 연구는 PAM4 항원이 파라핀-엠비디드(embedded) 시편에서 보존됨을 나타낸다. 검출자체의 일반적인 기술은 당업가에게 공지된 것이다. 예를들어, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application, "in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk (ed. ) (IRL Press 1987), and Coligan at pages 5.8. 1-5.8. 8.

PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단편은 방사선동위원소, 효소, 올리고뉴클레오티드, 형광라벨, , 염료, 색원체(chromagen), 화학발광 라벨, 생물발광 라벨 또는 상자성 라벨과 같은 적절한 표식부분으로 측정가능하게 라벨화할 수 있다. 검출가능하게 라벨화된 PAM4 항체를 만들고 검출하는 방법은 당업계에 공지된 기술이고, 하기에서 보다 설명한다.

표식 부분은 감마카운터 또는 섬광(scintillation) 카운터의 사용과 같은 수단 또는 오토라이오그래피(autoradiography)에 의해 검출될 수 있는 방사성동위원소일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 진단성 컨쥬게이트는 감마, 베타 또는 양성자 방출 동위원소이다. 본 발명에서 표식부분은 미리결정된 조건하에서 신호를생성하는 분자를 언급한다. 표식부분의 예로는 방사선동위원소, 효소, 형광라벨, 화학발광 라벨, 생물발광 라벨 및 상자성 라벨을 포함한다. 여기에서 사용된 것과 같이, 진단성 또는 치료성 제제는 진단 및 치료용으로 유용한 컨쥬게이트를 생산하는 항체부분에 접합된 분자 또는 원자이다. 진단성 또는 치료성 제제의 예는 약물, 독소, 면역조절제, 사이토킨, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오티드, 효소억제제, 동위원소, 기타 항체, 킬레이터, 염료, 색원체, 붕소화합물 및 표식 부분을 포함한다.

본 발명에서 도입될 수 있는 기타 적절한 라벨은 당업자에게 공지된 것이다. PAM4 항체에 표식 부분의 결합은 공지된 표준기술을 사용하여 시행될 수 있다. 전형적인 방법론은 Kennedyetal., Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976), Schurset al., Clin. Chim. Acta 81 : 1 (1977), Shih etal., Int'l J. Cancer 46: 1101 (1990).

상기의 생체밖 및 자체 검출방법은 진단 또는 병리학적 조건의 스테이징을 도와주는데 사용될 수 있다. 예를들어, 상기 방법은 췌장암과 같은 PAM4 항원을 발현하는 종양을 검출하는데 사용될 수 있다.

생체내 진단

또한, 본 발명은 생체내 진단에 PAM4 항체의 사용을 고안한다. 방사선라벨화된 MAb와 진단영상의 방법은 공지된 것이다. 예를들어, 항체는 감마 방출 방사성동위원소로 라벨화되고 환자에 도입된다. 감마 카메라는 감마-방출 방사성동위원소의 위치 및 분포를 검출하는데 사용된다. 예를들어, Srivastava (ed. ), RADIOLABELEDMONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edition, Gennaro etal. (eds. ), pp. 624-652 (Mack Publishing Co. , 1990), and Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies, "in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto etal. (eds. ) (Chapman & Hall 1993)을 보라.

진단성 영상에서 방사성동위원소는 매개 기능기를 사용하여 PAM4 항체에 직접적 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 유용한 매개 기능기는 에틸렌디아민테트라아세트산 및 디에틸렌트리아민펜타아세트산과 같은 킬레이터를 포함한다. 예를들어, Shih etal., supra, and U. S. patent No. 5, 057, 313을 보라.

환자에 전달되는 방사성 약물은 최소 반감기, 체내에서 최소 머무름, 검출 및 정확한 측정을 하는 동위원소의 최소정량의 최상 조합으로 동위원소의 선택을 통해 가능한 낮은 수준에서 유지된다. PAM4 항체에 결할될 수 있고 진단성 영상에 적절한 방사성동위원소의 예는^99mTc 및¹¹¹In이다.

또한, PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단백질은 생체내 진단의 목적으로 상자성 이온 및 방사성 조영젱의 종류로 라벨화될 수 있다. 자기공명 영상에 특별히 유용한 조영제는 가돌리늄, 망간, 디스프로슘, 란타늄 또는 철이온으로 이루어진다. 부가적인 제제로는 크롬, 구리, 코발트, 니켈, 레늄(rhenium), 유로피움, 테르븀(terbium), 홀뮴, 및 네오디뮴(neodymium)을 포함한다. 또한, PAM4 항체 및 이의단편은 초음파 조영제/증가제와 컨쥬게이트될 수 있다. 예를들어, 초음파 조영제는 키메라화된 PAM4 IgG 또는 이의 단편으로 이루어진 리포좀이다. 또한, 바람직하게 초음파 조영제는 가스충전된 리포좀이다.

관련된 혈관에서 이특이성 항체는 조영제에 접합될 수 있다. 예를들어, 이특이성 항체는 초음파영상에 사용되는 하나이상의 영상 증가제로 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 조영제는 리포좀이다. 바람직하게, 리포좀은 리포좀의 외 표면에 공유적으로 부착된 이가 DTPA-펩티드로 이루어진다. 더 바람직하게는, 리포좀은 가스 충전된다.

약학적으로 적절한 첨가제

치료적용에서 PAM4 항체의 반응존속을 조절하는데 부가적 약학적 방법이 도입될 수 있다. 조절방출 조제는 PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단편을 복합화하거나 흡수하는 고분자의 사용으로 제조될 수 있다. 예를들어, 생체 적합성 고분자(biocompatible polymer)는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 및 스테아르산 이합체 및 세바식산(Sebacic Acid)의 폴리안하이드라이드(polyanhydride) 공중합체의 매트릭스를 포함한다. Sherwood et al., BiolTechnology 10: 1446 (1992). 상기 매트릭스로부터 PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단편의 방출속도는 PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단편의 분자량, 매트릭스내 PAM4 항체의 함량 및 분산입자의 크기에 의존한다. Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163(1989) ; Sherwood etal., supra. 기타 고체약물들은 Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGEFORMS AND DELIVERRY SYSTEM, 5th Edition(Lea & Febiger 1990) 및 Gennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th ed. (1990)에 기재된다.

대상에 전달되는 키메라화된 PAM4 항체 및 이의 단편은 이뮤노컨쥬게이트, 융합단백질 또는 이의 단편의 단독으로 이루어질 수 있거나, 하나 이상의 약학적으로 적절한 첨가제, 하나 이상의 부가적인 성분 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 이뮤노컨쥬게이트, 항체 자체 및 이의 단편은 약학적으로 유용한 조성을 제조하는 공지된 방법으로 형성될 수 있으며, 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체 자체는 약학적으로 적절한 첨가제와 혼합하여 조합된다. 무균 포스페이트-완충용액 살린은 약학적으로 적절한 첨가제의 한 예이다. 기타 적절한 첨가제는 당업계에 공지된 것이다. 예를들어, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition (Lea & Febiger 1990), and Gennaro (ed. ), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), 및 이의 교정본을 보라.

본 발명의 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체 자체는 순간주사(Bolus Injection) 및 연속 주입으로 정맥 투여에 할 수 있다. 주입 형성은 부가된 첨가제와 엠플 또는 다약물 담체에서 단위 약물형태로 나타날 수 있다. 조성은 오일 도는 수용성 약물에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼 등의 형태로 취급될 수 있으며, 현탁, 안정화 및/또는 분산제제와 같은 포뮬레이토리(formulatory) 제제를 함유한다. 선택적으로, 활성성분은 사용전에 무균 발열성 없는 물(sterile pyrogen-free water)와 같은 적절한 매개와 분말형태에 있을 수 있다.

이뮤노컨쥬게이트, 항체 자체 및 이의 단편은 포유류에 피하적으로 또는 기타 비경구적 방법으로 투여할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, PAM4 항체 또는 이의 단편은 약물당 20~2000㎎ 단백질의 양으로 투여된다. 게다가, 투여는 연속 주입 또는 단 또는 다 순간주사로 될 수 있다. 일반적으로, 인간에 투여된 이뮤노컨쥬게이트, 융합단백질 또는 항체 자체는 환자의 나이, 몸무게, 신장, 성, 일반적인 의학조건, 및 전기의 의학기록과 같은 인자에 따라 변화될 것이다. 전형적으로, 저 또는 고 투여가 환경적 지시로써 처리되지만, 단 순가주입으로 약 1㎎/㎏~20㎎/㎏의 범위에서 이뮤노컨쥬게이트, 항체융합단백질, 또는 항체 자체의 투여로 수령을 제공하는 것이 바람직하다. 상기 투여는 예를들어 4~10주에 한번, 바람직하게는 8주에 한번, 더 바람직하게는 4주에 한번으로 필요에 따라 반복될 수 있다. 또한, 여러 달 동안 격주와 같이 덜 빈번하게 주입될 수 있다. 투여는 약물 및 스케줄의 적절한 조절로 다양한 비경구적 방법으로 주어질 수 있다.

본 발명의 PAM4 항체, 융합단백질, 및 이의 단편은 약학적으로 유용한 조성을 제조하는 공지의 방법에 따라 형성될 수 있으며, PAM4 항체, 융합단백질 및 이의 단편은 약학적으로 수용가능한 담체와 혼합물에 조합된다. 처리가 수령 환자에 의해 참을 수 있다면, 조성은 약학적으로 수용가능한 담체가 된다. 무균 포스페이트-완충 살린(Sterile phosphate-buffered saline)은 약학적으로 수용가능한 담체의 한 예이다. 기타 적절한 담체는 당업계에서 공지된 것이다. 예를들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Ed. (1990)을 보라.

치료의 목적으로 이뮤노컨쥬게이트 또는 항체자체는 치료적으로 효과적인 함량에서 포유류에 처리된다. 본 발명에서 적절한 대상은 비인간 동물 대상이 고안되지만, 일상적으로 인간이다. 항체 제조는 투여된 함량이 생리학적으로 중요하다면, "치료적으로 효과적인 함량"에서 투여된다. 제제는 수령 포유류의 생리학에서 검출가능한 변화를 초래한다면, 생리학적으로 중요하다.

발명의 요약

본 발명은 MUC1의 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치하는 도메인에 결합하는 항체, 융합 단백질 및 이들의 단편에 관한 것이다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 항체, 융합 단백질 및 이들의 단편은 PAM4 항체이다. 본 발명에 의한 상기 PAM4 항체, 융합 단백질 및 이들의 단편은 췌장암의 뮤신(mucin)으로 면역 및/또는 선발되어 유도된다. 따라서, 본 발명에 의한 상기 PAM4 항체, 융합 단백질 및 이들의 단편은 췌장암 세포와 관련된 항원에 결합하는 것이 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 상기 PAM4 항체 및 그 단편은 키메라화되고 또는 PAM4 융합 단백질은 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함한다. 또한 바람직하게는 상기 PAM4 항체, 융합 단백질 및 이들의 단편은 적어도 하나 이상의 치료용 및/또는 진단용 제제와 접합될 수 있다.

뮤린 PAM4 항체 또는 그 단편 및 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편은 뮤린 PAM4 단클론 항체(이하 "MAb"라 한다)의 상보성 결정 영역(이하 "CDRs"라 한다) 및 구조 영역(이하 "FR"이라 한다) 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 특정부를 포함한다. 여기에서, 키메라화된 PAM4 MAb의 경쇄 변이부의 CDRs는 아미노산 서열 SASSSVSSSYLY를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 STSNLAS를 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 HQWNRYPYT를 포함하는 CDR3을 포함하며; 및 키메라화된 PAM4 MAb의 중쇄 변이부의 CDRs는 아미노산 서열 SYVLH를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 YINPYNDGTQYNEKFKG를 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 GFGGSYGFAY를 포함하는 CDR3을 포함한다. 가장 바람직하게는, 키메라화된 PAM4 항체 및 그 단편은 도 1A에 도시된 PAM4 Vκ 뉴클레오타이드 서열 및 도 1B에 도시된 PAM4 VH 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예는 항체 또는 상기 항체 중 어느 하나의 단편, 융합 단백질 또는 본 발명에 의한 그 단편을 포함하는 항체 구성 성분을 포함하는 암세포 표적화 진단용 면역접합체에 관한 것이며, 여기에서, 항체, 융합 단백질 또는이들의 단편은 적어도 하나 이상의 진단용/검출용 제제와 결합된다.

바람직하게는, 상기 진단용/검출용 제제는 방사성핵종, 조영제(contrast agent) 및 광활성 진단용/검출용 제제를 포함하는 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 진단용/검출용 제제는 20-4,000keV 사이의 에너지를 가지는 방사성핵종이거나, 또는¹¹⁰In,¹¹¹In,¹⁷⁷Lu,¹⁸F,⁵²Fe,⁶²Cu,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁸⁶Y,⁹⁰Y,⁸⁹Zr,^94mTc,⁹⁴Tc,^99mTc,¹²⁰I,¹²³I,¹²⁴I,¹²⁵I,¹³¹I,^154-158Gd,³²P,¹¹C,¹³N,¹⁵O,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,⁵¹Mn,^52mMn,⁵⁵Co,⁷²As,⁷⁵Br,⁷⁶Br,^82mRb,⁸³Sr 또는 감마-, 베타- 또는 양전자 방사체(positron emitters)로 이루어진 군에서 선택된 방사성핵종이다. 또한 상기 진단용/검출용 제제는 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나듐(Ⅱ), 테르븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ) 및 에르븀(Ⅲ)을 포함하는 금속과 같은 상자성 이온(paramagnetic ion); 또는 바륨, 디아트리조에이트(diatrizoate), 에티오다이즈화 오일(ethiodized oil), 갈륨 구연산염, 아이오카르믹산(iocarmic acid), 아이오세타민산(iocetamic acid), 아이오다미드(iodamide), 아이오디파미드(iodipamide), 아오독사민산(iodoxamic acid), 아이오굴아미드(iogulamide), 아이오헥솔(iohexol), 아이오파미돌(iopamidol), 아이오파논산(iopanoic acid), 아이오프로세민산(ioprocemic acid), 아이오세파민산(iosefamic acid), 아이오세린산(ioseric acid), 아이오설파미드 메글루민(iosulamide meglumine), 아이오세메틱산(iosemetic acid), 아이오타술(iotasul), 아이온테트릭산(iotetric acid), 아이오트라믹산(iothalamic acid), 아이오트록식산(iotroxic acid), 아이옥사글릭산(ioxaglic acid), 아이옥소트리조익산(ioxotrizoic acid), 아이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리즈아미드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리오돈(propyliodone) 및 탈로우스 클로라이드(thallous chloride)와 같은 방사선 불투과성 물질(radioopaque material)이 바람직하다.

또한, 상기 진단용/검출용 제제는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 피포시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin), o-프트알데히드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine)을 포함하는 군에서 선택된 형광 라벨링 화합물; 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향족 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄염 및 옥살레이트 에스테르를 포함하는 군에서 선택된 화학적-발광성(chemi-luminescent) 라벨링 화합물; 또는 루시페린(luciferin), 루시퍼라아제(luciferase) 및 에퀴오린(aequorin)을 포함하는 군에서 선택된 자연발광 화합물이 바람직하다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 의한 상기 진단용 면역접합체는 수술 중, 내시경 검사 또는 혈관내 종양 진단에 사용된다.

본 발명의 또 다른 구현예는 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 구성성분을 포함하는 암세포 표적화 치료용 면역접합체에 관한 것이며, 여기에서, 상기 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편은 적어도 하나 이상의 치료용 제제와 결합된다.

상기 치료용 제제는 방사성핵종, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 효소 억제제, 광활성 치료용 제제, 세포독성 제제, 혈관신생 억제제 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

하나의 구현예에서, 상기 치료용 제제는 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 상기 올리고뉴클레오타이드는 bcl-2 및 p53과 같은 암유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 등이 될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 치료용 제제는 약물 또는 독소와 같은 세포독성 제제이다. 또한 상기 약물은 질소겨자, 에틸렌이민 유도체들, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아(nitrosoureas), 겜시타빈(gamcitabine), 트리아젠(triazenes), 엽산 유사체, 안트라사이클린(anthracyclines), 탁산(taxanes), COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 효소 억제제, 에피포도필로톡신 (epipodophyllotoxin), 백금 동등 복합체(platinum coordination complex), 빈카 알카로이드(vinca alkaloids), 치환된 우레아메틸 히드라진 유도체, 부신피질 반응 억제제, 호르몬 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), SN-38, 캄프토테신(camptothecins), 독소루비신(doxorubicins) 및 이들의 유사체, 항대사물질, 알킬레이팅 제제, 유사분열억제제, 신생혈관억제제, 자가사멸 제제, 메토트렉세이트(methotrexate), CPT-11 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 치료용 제제는 리신(ricin), 알파 독소, 사포린, 리보뉴클레아제(RNase), DNase Ⅰ,스타필로코커스의 장독소-A, 미국자리공 항바이러스 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테린 독소,슈도모나스의 외독소 및슈도모나스의 내독소로 이루어진 군에서 선택된 독소; 사이토카인, 줄기 세포 성장 인자, 림프독소, 조혈 인자(造血因子, Hematopoietic Factor), 콜로니 자극 인자(CSF), 인터페론(IFN), 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 면역조절제;³²P,³³P,⁴⁷Sc,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga,⁸⁶Y,⁹⁰Y,¹¹¹Ag,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I,¹⁴²Pr,¹⁵³Sm,¹⁶¹Tb,¹⁶⁶Dy,¹⁶⁶Ho,¹⁷⁷Lu,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁸⁹Re,²¹²Pb,²¹²Bi,²¹³Bi,²¹¹At,²²³Ra,²²⁵Ac 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 방사성핵종; 또는 색원체(chromogens) 및 염료(dyes)로 이루어진 군에서 선택된 광활성 치료용 제제이다.

보다 바람직하게는 상기 치료용 제제는 말레이트 가수분해효소, 스타필로코커스의 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이성질화 효소, 효소 알콜 가수분해효소, α-글리세로포스페이트 가수분해효소, 트리오스(triose) 포스페이트 이성질화 효소, 고추냉이로부터 분리한 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP), 알카라인 포스파타아제, 아스파라기나아제(asparaginase), 글로코오스 옥시다아제, β-갈락토시다아제, 리보뉴클리아제, 우레아제(urease), 카탈라아제(catalase), 글루코오스-6-포스페이트 가수분해효소, 글로코아밀라아제(glucoamylase) 및 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase)를 포함하는 군에서 선택된 효소이다.

본 발명은 PAM4 표적 항원에 대한 친화력을 가지는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 헵텐 분자에 대한 친화력을 가지는 하나 또는 그 이상의 헵텐 결합 부위를포함하는 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 그 단편은 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편이다. 또한 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 이들의 단편은 진단용/검출용 및/또는 치료용 제제를 더 포함하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명에서는 PAM4 표적 항원에 대한 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위 및 하기와 같은 군에서 선택된 표적가능한 구조체/접합체에 대한 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 양특이성 항체 또는 그 단편에 관하여 기재한다:

DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH₂(IMP 271);

DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH₂(IMP 277);

DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH₂(IMP 288);

DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH₂(IMP 0281); 및

DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH₂(IMP 284),

상기 구조체/접합체는 적어도 하나 이상의 진단용 및/또는 치료용 제제를 운반하는 특성을 가진다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 표적 가능한 구조체는 2003년 6월 13일 미국에 가출원된 "D-아미노산 펩타이드"(McBride)라는 제목의 대리인 관리번호 018733/1206호에 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 둘 이상의 PAM4 MAbs 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 이들의 단편에 관한 것이며, 여기에서 상기 MAbs 또는 그 단편은 본 발명에 의한 항체 및 그 단편 중 어느 하나를 포함한다. 또한 상기 융합 단백질 또는 그 단편은 본 발명에 의한 항체 및 그 단편 중 어느 하나의 적어도 하나 이상의 첫 번째 PAM4 MAb 또는 그 단편 및 본 발명에 의한 항체 및 그 단편 이외의 MAb 또는 그 단편인 적어도 하나 이상의 두 번째 MAb 또는 그 단편을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 두 번째 MAb는 암종 관련 항체이고, CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, Lewis 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체 및 CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈관신생인자(예를들면, VEGF), 인슐린류 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자의 산물 및 HER2/neu에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명에 의한 항체 융합 단백질 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 진단용 및/또는 치료용 제제를 더 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 하기와 같이 이루어진 군에서 선택된 MAb 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 서열에 관한 것이다:

(a) 본 발명에 기재된 항체 중 어느 하나의 PAM4 항체 또는 그 단편;

(b) 상기 (a)에 기재된 적어도 둘 이상의 MAbs 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편;

(c) 본 발명에 의한 PAM4 항체 또는 그 단편의 상기 MAb 또는 그 단편을 포함하는 적어도 하나 이상의 첫 번째 PAM4 MAb 또는 그 단편 및 본 발명에 의한 항체 또는 그 단편 중 어느 하나 이외의 MAb 또는 그 단편인 적어도 하나 이상의 두 번째 MAb 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편; 및

(d) 본 발명에 의한 PAM4 항체 또는 그 단편 중 어느 하나의 상기 MAb 또는 그 단편을 포함하는 적어도 하나 이상의 첫 번째 MAb 또는 그 단편 및 본 발명에 의한 항체 또는 그 단편 중 어느 하나 이외의 MAb 또는 그 단편인 적어도 하나 이상의 두 번째 MAb 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편으로, 여기에서 두 번째 MAb는 암종 관련 항체이다. 상기 암종 관련 항체는 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, Lewis 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체 및 CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈관신생인자(예를들면, VEGF), 인슐린류 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자의 산물 및 HER2/neu에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 구현예에는 (ⅰ) 적어도 하나 이상의 진단용/검출용 및/또는 치료용 제제에 접합된 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 (ⅱ) 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 진단용 또는 치료용 접합체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;를 포함하는 표적에 진단용 또는 치료용 제제 또는 이들의 조합을 운반하는 방법에 관한것이다. 바람직하게는, 상기 진단용/검출용 제제가 방사성핵종, 조영제 및 광활성 진단용/검출용 제제로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 상기 치료용 제제가 세포독성 제제, 약물, 독소, 사이토카인, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장 인자, 방사성핵종 및 금속으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

또한 본 발명은 (a) PAM4 항원에 대한 친화력을 가지고 하나 또는 그 이상의 헵텐 결합 부위를 포함하는 본 발명에 의한 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 항체 또는 그 단편을 환자에게 투여하는 단계; (b) 환자의 혈류에서 비-항체의 양을 제거하기 위하여 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 (c) 항체의 결합 부위에 결합하는 진단용/검출용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 포함하는 운반 물질을 상기 환자에게 투여하는 단계;를 포함하는 진단용/검출용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 운반하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 운반 분자가 하나 이상의 항체 결합 부위에 결합한다. 보다 바람직하게는, 상기 진단용/검출용 제제 또는 치료용 제제가 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 억제제, 성장 인자, 방사성핵종, 올리고뉴클레오타이드 및 금속으로 이루어진 군에서 선택된 것이다.

하나의 구현예에서, 미국특허 제5,734,033호(Reed)에 기재된 bcl-2 발현을 억제하는 안티센스 분자(본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다)와 같은 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 면역접합체 또는 항체 융합 단백질에 결합되거나 또는 치료용 제제의 일부를 생성할 수 있다. 선택적으로, 상기 올리고뉴클레오타이드는 본 발명에 의한 PAM4 항체와 동시에 또는 연속해서 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 bcl-2와 같은 B-세포 악성종양의 암 유전자 또는 암유전자 생성물에 대하여 직접 작용하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.

본 발명은 (a) PAM4 항원에 대한 친화력을 가지고 하나 또는 그 이상의 헵텐 결합 부위를 포함하는 본 발명에 의한 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 항체 또는 그 단편을 환자에게 투여하는 단계; (b) 환자의 혈류에서 비-항체의 양을 제거하기 위하여 충분한 시간을 기다리는 단계; 및 (c) 항체의 결합 부위에 결합하는 진단용/검출용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 포함하는 운반 물질을 상기 환자에게 투여하는 단계;를 포함하는 암을 진단하는 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서 암은 췌장암이다. 또한 바람직하게는, 상기 방법은 질병 조직의 수술 중 동정, 질병 조직의 내시경 조사 동정 또는 질병 조직의 혈관내 동정을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 (a) 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 항체 또는 그 단편의 치료학적인 유효량을 환자에게 투여하는 단계, 여기에서 상기 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 치료용 제제와 접합되며; 및 (b) 약제학적으로 적합한 부형제에 상기 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 제형화하는 단계;를 포함하여 환자의 악성종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나가아닌 두 번째 MAb 또는 그 단편을 더 포함한다. 보다 바람직하게는 두 번째 MAb 또는 그 단편은 MAb 자체 또는 그 단편이다. 또한 두 번째 MAb 또는 그 단편은 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, Lewis 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체 및 CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈관신생인자(예를들면, VEGF), 인슐린류 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자의 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군에서 선택된 것이 바람직하다.

본 발명은 (a) 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 항체 또는 그 단편의 진단학적인 유효량을 환자에게 투여하는 단계, 여기에서 상기 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 진단용/검출용 제제와 접합되며; 및 (b) 약제학적으로 적합한 부형제에 상기 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 제형화하는 단계;를 포함하여 환자의 악성종양을 진단하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 또 다른 구현예에서 (ⅰ) 본 발명에 의한 항체 자체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나의 PAM4 MAb 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편을 포함하는 조성물의 치료학적인 유효량을 환자에게 투여하는 단계; 및 (ⅱ) 약제학적으로 적합한 부형제에 상기 PAM4 MAb 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 제형화하는 단계;를 포함하여환자의 암 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 방법은 본 발명에 의한 항체 자체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 하나가 아닌 두 번째 항체 자체 또는 그 단편을 더 포함한다. 예를 들면, 상기 두 번째 항체 또는 그 단편은 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, Lewis 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체 및 CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈관신생인자(예를들면, VEGF), 인슐린류 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자의 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한 본 발명은 (ⅰ) 본 발명에 의한 항체 자체, 융합 단백질 또는 그 단편 중 어느 하나의 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 이용하여 환자의 표본으로 생체밖에서 진단 분석하는 단계를 포함하는 환자의 악성종양을 진단하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 악성종양이 암이다. 보다 바람직하게는 상기 암이 췌장암이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 (A) PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 암(arm) 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 다른 암을 포함하는 양특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계, 여기에서 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 상기 하나의 암은 cPAM4 항체 또는 그 단편이며; 및 (B) 하기와 같은 물질로 이루어진 군에서 선택된 표적가능한 접합체를 투여하는 단계;를 포함하여 환자의 PAM4 항원을 발현하는 질병 조직을 수술 중 동정하는 방법에 관한 것이다:

(ⅰ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

(ⅱ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

(ⅲ) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH₂;

(ⅳ)

; 및

(ⅴ)

.

또한 본 발명은 (A) PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 암(arm) 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 다른 암을 포함하는 양특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계, 여기에서 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 상기 하나의 암은 cPAM4 항체 또는 그 단편이며; 및 (B) 하기와 같은 물질로 이루어진 군에서 선택된 표적가능한 접합체를 투여하는 단계;를 포함하여 환자의 PAM4 항원을 발현하는 질병 조직을 내시경 검사에서 동정하는 방법에 관한 것이다:

(ⅰ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

(ⅱ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

(ⅲ) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH₂;

(ⅳ)

; 및

(ⅴ)

본 발명은 (A) PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 암(arm) 및 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 다른 암을 포함하는 양특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계, 여기에서 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 상기 하나의 암은 cPAM4 항체 또는 그 단편이며; 및 (B) 하기와 같은 물질로 이루어진 군에서 선택된 표적가능한 접합체를 투여하는 단계;를 포함하여 환자의 PAM4 항원을 발현하는 질병 조직을 혈관내에서 동정하는 방법에 관한 것이다:

(ⅰ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH₂(SEQ ID NO:3);

(ⅱ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂(SEQ ID NO:2);

(ⅲ) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH₂(SEQ ID NO:4);

(ⅳ)

; 및

(ⅴ)

또 다른 구현예는 내시경 검사, 혈관내에 도관, 또는 수술 과정에서 병변을 검출하는 방법에 관한 것으로서, 하기 과정을 포함한다: (a) 양특이성 항체 F(ab)₂또는 그 F(ab')₂단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 테트라바디(tetrabody)를 이용하여 환자에게 주입하는 단계, 여기에서 상기 양특이성 항체 또는 그 단편, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디는 PAM4 항원에 특이적으로 결합하는 첫 번째 항체 결합 부위를 가지고, 헵텐에 특이적으로 결합하는 두 번째 항체 결합 부위를 가지며, 표적 부위에 부착하는 항체 단편을 허용하는 것이고; (b) 양특이성 단편이 주입 24 시간 이내에 혈액순환에서 대부분 제거되지 않는 경우에 갈락토실레이트화된 항-유전자형(anti-idiotype) 제거제를 사용하여, 표적 부위에 신속히 위치하고 신장을 통해 제거하는 이원자가 라벨된 헵텐을 주입하여 비표적화된 항체 단편을 선택적으로 제거하는 단계; 및 (c) 첫 번째 주입 48시간 이내에 검출수단으로 표적 부위에서 부착된 라벨의 증가 수준의 근접 범위(close-range) 검출을 통해 헵텐의 존재를 검출하고 상기 과정을 유도하는 단계로서, 여기에서 상기 검출은 조영제 또는 공제 제제(subtraction agent)를 사용하지 않고 수행된다.

수술 중, 혈관내 또는 내시경 검사 과정에서 근접 범위 병변 검출을 위한 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) cPAM4 면역접합체 또는 그 단편의 유효량을 비경구적으로 환자에게 주입하는 단계; (b) 주입후 48시간 이내에 절차를 유도하는 단계; (c) 상기 라벨된 항체 또는 그 단편의 존재를 검출하기 위한 검출 수단으로 근접 범위에서 환자의 발병된 내부를 스캐닝하는 단계; 및 (d) 검출수단으로 이러한 부위에서 라벨된 항체 또는 그 단편이 증가된 수준에서 검출하여 상기 라벨된 항체 또는 그 단편의 부위를 파악하는 단계, 이 또한 본 발명의 범주에 속한다.

개괄

만약 다른 특정함이 없다면, "하나"는 "하나 또는 그 이상"을 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "PAM4 항체"는 뮤린 및 키메라화된 PAM4 항체를 포함한다.

본 발명은 췌장암의 진단, 검출, 연출 및 치료를 위하여 사용되는 단클론 항체인 PAM4에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 PAM4 항체 및 그 단편은 키메라화된다. 상기 뮤린 PAM4(mPAM4) 항체는 면역원으로서 이종이식된 RIP-1 인간 췌장암종에서 유래된 췌장암 뮤신을 사용하여 개발된 MUC1 항체이다. Goldet al., Int. J. Cancer,57: 204-210(1994). mPAM4 항체는 표적 췌장암 항원의 유일한 신규 에피토프를 인지한다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 면역조직화학적 염색 연구는 PAM4 MAb가 정상 인간 조직에 제한적으로 결합하여 흉부, 췌장 및 다른 암세포에 의해 발현되는 MUC1 항원의 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치하는 도메인에 결합하는 것을 보여준다. 본 발명에 의한 PAM4 항체는 췌장암과 비교적 특이적이며, 따라서 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다. 바람직한 구현예에서, PAM4 항체 및 그 단편은 키메라화된다. 상기 PAM4 항체는 췌장암과 연관되고 췌장염과는 관련되지 않는 항원에 의해 주로 발현되는 표적 에피토프와 반응한다. 동물 모델에서 방사성 라벨된 PAM4 MAb를 사용하는 위치 및 치료 연구는 종양 표적화 및 치료 효능을 증명해 준다.

본 발명에 의한 PAM4 항체는 MUC1의 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치하는 도메인인 PAM4 항원에 결합하고, 항원은 많은 기관 및 종양 유형에 의해 생산된다. 본 발명에 의한 바람직한 PAM4 항체는 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다. 실시예 2에 기재된 PAM4 MAb와 같은 PAM4 MAb의 연구는 항체가 임상적진단 및 치료의 적용을 위한 후보가 되는 여러 가지 중요한 특성을 보여준다. PAM4 항원은 진단 및 치료를 위한 유용한 표적을 제공하기 때문에, 비-PAM 항체(CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, aLe^a및 Lewis 항원들)에 의해 인지되는 에피토프로부터 식별되는 췌장암 항원의 에피토프를 인지하는 MAb를 획득하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 PAM4 항체와 조합 또는 결합되는데 이용하는 적절한 항체는 예를 들면, 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)와 관련된 것, 콜론-특이적 항원-p(CSAp), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, B72.3, Le(y), HER1/neu, EGFR, 혈관신생 인자(예를 들면, VEGF), 인슐린류 성장 인자(IGF), 테나신, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자 생성물 및 Epstein et al.,가 출원한 특허(미국특허 제6,071,491호, 제6,017,514호, 제5,019,368호 및 제5,882,626호)에 기재된 종양 괴사 기질에 대한 항체를 포함한다. 이러한 항체는 상보적인 현재 PAM4 항체 면역검출 및 면역치료 방법에서 사용될 수 있다. 또한 치료의 적용에서, 종양 세포에 대한 작동체 세포 기능에 포함된 면역조절제에 대한 길항제 또는 작용제인 항체가 PAM4 항체 단독과의 조합 또는 CD40에 대한 항체와 같은 다른 종양-관련된 항체들과의 조합으로 사용될 수 있다. Todryket al., Immunol Methods,248: 139-147 (2001); Turneret al., J. Immunol, 166: 89-94 (2001). 또한 지표 또는 암유전자의 생성물, 또는 VEGF와 같은 혈관신생 인자에 대한 항체에 대한 항체로 사용된다. VEGF 항체는 Thorpeet al., 미국특허 제6,342,221호, 제5,965,132호 및 제6,004,554호에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다.

더욱이, 또 다른 PAM4-류 항체의 유용성은 임상적 샘플에서 PAM4 항원을 검출하기 위하여 사용되는 이중 결정인자(double-determinant) 효소결합면역흡수분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)의 개발에 필수적이다. ELISA 시험은 실시예 5에 기재되어 있다.

본 발명에서는 MUC1 도메인의 아미노 말단과 아미노 말단과 도입부 사이에 위치하는 에피토프에 결합하고, 진단용 및 치료용 방법에서 이용될 수 있는 뮤린 및 키메라 항체 및 이들의 단편이 기재되어 있다. 바람직한 구현예에서, PAM4 항체는 키메라화된다. 본 명세서에 개시된 키메라 항체는 바람직하게는 설치류 항체와 같이 한 종에서 유래된 항체의 상보적 결정 영역을 포함하는 가변 도메인을 함유하는 반면에, 항체 분자의 특정 도메인이 인간 항체에서 유래된 것인 재조합 단백질이다. 수의학의 적용을 위해서는, 키메라 항체의 특정 도메인은 다른 종의 것에서 유래될 수 있다. 비-인간의 단클론 항체는 외부 단백질로 인간 숙주에 의해 인지되고 반복된 주입이 유해한 과민 반응(hypersensitivity reactions)을 유도할 수 있기 때문에, 뮤린 PAM4 항체 또는 그 단편의 키메라화는 환자가 경험할 수 있는 면역반응의 악영향(adverse immune response)을 줄일 수 있다. 뮤린을 기초로 한 단클론 항체를 위하여, 인간 항-마우스 항체(Human Anti-Mouse Antibody, HAMA) 반응으로 자주 실시된다.

본 발명에 의한 항체 및 그 단편은 인간 췌장의 종양에서 조(crude) 뮤신 제조에 대응하여 생산되는 것이 바람직하다. 혈관과 관련하여, PAM4 항체는 PAM4 항원의 실질적으로 순수한 제조를 통해 얻어질 수 있다. 실질적으로 순수한 단백질은 실질적으로 단백질과 결합되어 있는 오염된 세포 구성성분에서 본질적으로 제거한 단백질이다.

용어정의

이어지는 설명에서, 많은 수의 용어들이 사용되었고, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 상기 용어들을 아래와 같이 정의하였다.

본 발명에 기재된 "항체"는 온-길이(자연적으로 발생하거나 또는 정상 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 생성된 것이다) 면역글로불린 분자(IgG 항체 등) 또는 면역글로불린 분자의 면역적인 활성(특이적으로 결합) 부분, 이러한 항체의 단편을 말한다.

"항체 단편"은 F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv 및 scFv와 같은 항체의 일부이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 온전한 항체에 의해 인지되는 동일 항원과 결합한다. 예를 들면, 항-CD20 단클론항체 단편은 CD20의 에피토프에 결합한다. 또한 용어 "항체 단편"은 복합체를 생성하기 위하여 특이 항원과 결합하여 항체와 같은 역할을 하는 어떤 합성적 또는 유전적으로 제조한 단백질을 포함한다. 예를 들면, 항체 단편은 중쇄 및 경쇄의 변이부를 구성하는 "Fv" 단편; 경쇄 및 중쇄 변이부가 펩티드 연결기("scFv 단백질")에 의해 연결되는 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자; 및 과변이부(hypervariable region)에 흡사한 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인지부와 같이 변이부를 구성하는 분리 단편을 포함한다.

"항체 자체"는 일반적으로 치료용 또는 진단용/검출용 제제에 접합되지 않는 항체를 말한다. 그러나, 진단용/검출용 또는 치료용 제제에 접합되지 않는 항체 단편 역시 될 수 있다. 항체 분자의 Fc 부분이 상보적 고착 및 ADCC(항체 의존 세포 독성) 등의 작동체 기능을 제공하기 때문에, 항체 자체가 세포를 용해하는 활성으로 대사한다. 그러나, Fc 부분은 세포 자가사멸과 같은 다른 대사작용으로 인한 치료적 기능을 요구하지 않는다. 항체 자체는 키메라, 인간화된 또는 인간 항체와 같은 특정한 재조합 항체뿐만 아니라, 다클론 및 단클론항체를 모두 포함한다.

"키메라 항체"는 하나의 종에서 유래되는 항체, 바람직하게는 설치류 항체의 상보적으로 결정되는 영역(complementarity determining regions; CDRs)을 포함하는 변이 도메인을 가지는 재조합 단백질이다. 반면에 항체 분자의 일정한 도메인은 인간 항체로부터 유래된다. 수의사가 이용할 경우, 키메라 항체의 일정한 도멘인은 고양이 또는 개와 같은 다른 종으로부터 유래된 것이 될 수 있다.

"인간화된 항체"는 하나의 종에서 유래된 항체의 CDRs(설치류 항체를 예로 들면)는 설치류 항체의 중쇄 및 경쇄로부터 인간의 중쇄 및 경쇄 변이 도메인으로 전달되는 재조합 단백질이다. 항체 분자의 일정한 도메인은 인간 항체의 것으로부터 유도된다.

"인간 항체"는 항원성 콜라겐과 반응하는 특이 인간 항체를 제조하기 위해 "제작"된 형질전환 마우스로부터 획득한 항체이다. 이러한 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 자리의 성분은 내생적인 중쇄 및 경쇄 자리의 표적화된 분열을 가지는 배아줄기 세포주로부터 유도된 마우스의 세포주로 도입된다. 상기 형질전환 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있으며, 인간 항체를 분비하는 하이브리도마를 제조하는데 사용할 수 있다. 형질전환 마우스로부터 인간 항체를 획득하는 방법은 Greenet al., Nature Genet.7: 13 (1994), Lonberget al., Nature368: 856 (1994), 및 Tayloret al., Int. Immun.6:579 (1994)에 기재되어 있다. 또한 온전한 인간 항체는 파지 전시 기술(phage display technology) 및 유전자 또는 염색체 형질감염 방법 등 당업계에 알려진 방법에 의해 제작된다. 생체 밖에서 비면역화된 도너(donor)에서 유래하는 면역글로불린 변이 도메인 유전자로부터 인간 항체 및 그 단편을 제조하는 방법은 McCaffertyet al., Nature348: 552-553 (1990)를 참고한다. 상기 기술에서, 항체 변이 도메인 유전자는 필라멘트 박테리오파지의 주요한 또는 부수적 외피단백질(coat protein) 유전자에 프레임내에서 클론화되고, 파지 입자의 표면에서 기능성 항체 단편으로 전시된다. 필라멘트 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 복사본을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 이러한 특성을 보이는 항체를 인코딩하는 유전자의 선택으로 인한 것이다. 이런 방법으로 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 전시는 전체 구성의 다양성으로 수행될 수 있으며, Johnson and Chiswell,Current Opinion in Structural Biology3: 5564-571 (1993)에 개시되어 있다.

또한 인간 항체는 생체 밖에서 B 세포를 활성화함으로써 생성된다. 미국특허등록 제5,567,610호 및 제5,229,275호에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합하여 수록하였다.

"치료용 제제"는 항체 또는 항체 단편 또는 하부단편과 같은 항체의 부분과 개별적으로, 동시에 또는 순차적으로 투여되거나 또는 항체의 부분에 접합되는 분자 또는 원자이며, 질병을 치료하는데 이용된다. 치료용 조성물의 예로는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클라아제, 호르몬, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성 제제 또는 염료 및 방사성핵종을 포함한다.

"진단용/검출용 제제"는 항체 또는 항체 단편 또는 하부단편과 같은 항체의 부분에 접합하여 투여되는 분자 또는 원자이며, 항원을 함유하는 세포에 위치하여 질병을 진단하는데 이용된다. 진단용/검출용 제제로는 방사성 동위원소, 염료(바이오틴-스트렙타비딘(streptavidin) 복합체), 조영제, 형광 화합물 또는 분자 및 자기공명영상(Magnetic resonance imaging, MRI)을 위한 증강제(파라마그네틱 이온 등)를 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 아니다. 미국특허 제6,331,175호에는 MRI 기술 및 MRI 증강제와 접합된 항체의 제조방법이 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다. 바람직하게는 상기 진단용/검출용 제제는 방사성 동위원소, 자기공명영상에 이용되는 증강제 및 형광 화합물로 이루어진 군에서 선택된다. 항체 화합물을 방사성 금속 또는 파라마그네틱 이온과 제공하기 위하여, 이온결합 킬레이팅기 다수에 부착하는 긴 꼬리를 가지는 시약과 반응하는데 필요하다. 이러한 꼬리는 폴리리신, 다당류, 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA), 포르피린, 폴리아민, 왕관형 에테르(crown ether), 비스-티오세미카르바존(bis-thiosemicarbazones), 폴리옥심(polyoximes) 및 이러한 용도로 통상적으로 사용되는 알려진 그룹과 같은 킬레이팅기에 결합될 수 있는 곁가지(pendant group)를 가지는 다른 유도된 사슬 또는 유도될 수 있는 사슬 등의 폴리머가 될 수 있다. 킬레이트는 표준 화학반응을 이용하여 펩티드 항원과 커플된다. 상기 킬레이트는 일반적으로 면역반응성의 최소 손실 및 최소 집합체 및/또는 내부의 교차 결합을 가지는 분자와의 결합을 생성할 수 있는 그룹으로 인해 항체와 결합한다. 항체에 킬레이트를 접하는 다른, 보다 특별한 방법 및 시약은 1989년 4월 25일 등록된 미국특허등록 제4,824,659호(Hawthorne, "항체 접합체")에 개시되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고문헌으로 통합하여 수록하였다. 특히 본 발명에서 사용하는 금속 킬레이트 조합은 2-벤질-DTPA 및 이들의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함하고, 방사능 영상용¹²⁵I,¹³¹I,¹²³I,¹²⁴I,⁶²Cu,⁶⁴Cu,¹⁸F,¹¹¹In,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,^99mTc,^94mTc,¹¹C,¹³N,¹⁵O,⁷⁶Br와 같이 60-4,000 keV의 일반적 에너지 범위에서 진단용 동위원소와 함께 사용된다. MRI에서 사용되는 망간, 철 및 가돌리늄 등의 비방사성 금속으로 복합체화되는 동일한 킬레이트는 본 발명에 의한 항체와 함께 사용된다. NOTA, DOTA 및 TETA와 같은 거대고리 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성 금속과 함께 사용되고, 가장 바람직하게는 각각 갈륨, 이트륨 및 구리와 함께 사용된다. 이러한 금속 길레이트 화합물은 해당 금속에 고리 크기가 맞추어져서 매우 안정하게 제조된다. 거대고리 폴리에테르와 같은 다른 고리형 킬레이트는 본 발명의 범주에 속하는 RAIT를 위한²²³Ra와 같이 핵종에 안정하게 결합하는데 중요하다.

"면역접합체"는 치료용 또는 진단용/검출용 제제를 가지는 항체 구성성분의접합체이다. 진단용/검출용 제제는 방사성 또는 비방사성 라벨, 조영제(자기공명영상, 전산화 단층촬영술(Computed Tomography) 또는 초음파 등)을 포함하고, 상기 방사성 라벨은 감마-, 베타-, 알파-, 오거 전자(Auger electron-) 또는 양성자 방출 동위원소를 들 수 있다.

"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 일반적으로, 유전자 발현은 경쟁적 또는 유도적 프로모터, 조직 특이적 조절인자 및 증강제를 포함하는 일정한 조절 요소의 조절하에 수행된다. 이러한 유전자는 "실시가능하게 연결되는" 조절 요소가 된다.

"재조합 숙주"는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 가지는 원핵세포 또는 진핵세포가 될 수 있다. 또한 상기 용어는 세균, 효모 및 포유동물과 같은 원핵세포 또는 진핵세포뿐만 아니라, 염색체, 숙주세포의 게놈 또는 숙주세포의 세포 내에 복제된 유전자(들)를 가지도록 일반적으로 제작된 형질전환 동물을 포함한다. 적당한 포유동물 숙주세포는 SP2/0 세포 및 NS0 세포와 같은 골수종 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary, CHO) 세포, 하이브리도마 세포주 및 항체를 발현하는데 사용되는 다른 포유동물 숙주 세포를 포함한다. 또한 본 발명에서 MAbs 및 다른 융합 단백질을 발현하기 위하여 CHO, COS, Vero, Hela, BHK 및 SP2 세포주와 같은 통상적인 포유동물 세포주에 비교하여 2-200배 이상의 재조합 단백질을 생산하는 PER.C6 인간세포주를 사용하였으며, 이는 국제공개특허 제WO 0063403 A2호에 개시되어 있다. 변형된 면역 시스템을 가지는 특이적 형질전환 동물은 온전한 인간 항체를 제조하는데 특히 유용하다.

본 발명에서 사용한 용어 "항체 융합 단백질"은 같은 또는 다른 종인 둘 이상의 같은 또는 다른 단일사슬 항체 또는 항체 단편 부분이 연결되도록 재조합하여 제조한 항원 결합 분자를 말한다. 융합 단백질의 원자가는 일원자가, 이원자가, 삼원자가 또는 사원자가와 같이, 융합 단백질이 단일 항원 또는 에피토프에 결합하는 결합 암(arm) 또는 부위의 수를 나타낸다. 항체 융합 단백질의 다원자가는 하원에 결합하는 다수의 상호작용의 이점을 가지고, 항원에 결합하려는 욕구를 증가시킨다. 특이성은 일특이성, 양특이성, 삼특이성, 멀티특이성과 같이, 항체 융합 단백질이 항원 또는 에피토프와 결합할 수 있는 수를 의미한다. 이들 정의에 사용하는 IgG 등의 천연 항체는 두 개의 결합 암(arm)을 가지고 있기 때문에 이원자가이지만, 하나의 에피토프와 결합하기 때문에 단일특이성이다. 단일특이성, 다원자가 융합 단백질은 에프토프를 위한 하나 이상의 결합 부위를 가지지만, 하나의 에피토프에만 결합하는 것으로, 동일한 항원과 작용하는 두 개의 결합 부위를 가지는 디아바디(diabody)가 여기에 속한다. 융합 단백질은 단일 항체 구성성분, 다른 항체 구성성분의 다원자가 또는 멀티특이성 조합 또는 같은 항체 구성성분의 멀티플 복제물을 포함한다. 상기 융합 단백질은 항체 또는 항체 단편 및 치료용 제제를 부가적으로 포함한다. 상기 융합 단백질에 적절한 치료용 제제로는 면역조절제("항체-면역조절제 융합 단백질") 및 독소("항체-독소 융합 단백질")을 포함한다. 바람직한 독소는 리보뉴클라아제(RNase), 바람직하게는 재조합 RNase를 포함한다.

"멀티특이성 항체"는 같은 항원, 또는 헵텐 및/또는 항원 또는 에피토프에서 두 개의 다른 항원, 두 개의 다른 에피토프와 같이 다른 구조를 가지는 적어도 두개 이상의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 하나의 특이성은 B 세포, T 세포 골수종-, 플라즈마- 및 비만세포(mast-cell) 항원 또는 에피토프에 관여한다. 또 다른 특이성은 B-세포의 CD20, CD19, CD21, CD23, CD46, CD80, HLA-DR, CD74 및 CD22와 같이 동일한 세포 유형에서 다른 항원에 작용한다. 멀티특이성, 다원자가 항체는 하나 이상의 결합 부위를 가지는 구조물이며, 상기 결합 부위는 다른 특이성을 가진다. 예를 들면, 디아바디는 하나의 결합 부위가 하나의 항원과 반응하고, 다른 결합 부위가 다른 항원과 반응한다.

"양특이성 항체"는 다른 구조를 가지는 두 개의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체이다. 양특이성 항체(bsAb) 및 양특이성 항체 단편(bsFab)은 B 세포, T 세포 골수종-, 플라즈마- 및 비만세포(mast-cell) 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 암(arm) 및 치료용 또는 진단용 제제를 생산하는 표적가능한 접합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나 이상의 다른 암(arm)을 가진다. 다양한 양특이성 융합 단백질은 분자공학(molecular engineering)을 이용하여 제조될 수 있다. 하나의 형태에서, 양특이성 융합 단백질은 하나의 항원과 결합하는 단일 결합 부위를 가지는 scFv 및 두 번째 항원과 결합하는 단일 결합 부위를 가지는 Fab 단편과 같은 것들로 이루어지는 일원자가이다. 또 다른 형태에서, 양특이성 융합 단백질은 하나의 항원에 결합하는 결합 부위를 가지는 IgG 및 두 번째 항원에 결합하는 두 개의 결합 부위를 가지는 두 개의 scFv로 이루어진 이원자가이다.

키메라화된 PAM4 항체의 제조

특이적 항원에 대한 단클론 항체는 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, Kohler and Milstein,Nature 256: 495 (1975), 및 Coliganet al.,(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL, 1, pages 2.5.1-2.6.7(John Wiley & Sons 1991)(이하 "Coligan"이라 한다) 참조. 간략하게, PAM MAbs는 PAM 항원을 포함하는 조성물과 함께 마우스에 주입하고, 혈청 샘플을 제거하여 항체 생산의 존재를 확인하여, 골수종 세포와 B-림프세포를 융합하여 하이브리도마를 제조하고, 상기 하이브리도마를 클로닝하여 PAM4 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선발하고, 하이브리도마를 배양하여 PAM4 항체를 분리하여 얻어질 수 있다. 본 발명에 의한 PAM4 항체는 MUC1의 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치되는 도메인인 PAM4항원에 결합한다. 본 발명에 의한 상기 PAM4 항체는 우선적으로 췌장암 세포에 결합한다.

면역원에 대한 항체의 초기 분비 이후, 상기 항체는 서열화되고 순차적으로 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 뮤린 항체 및 항체 단편의 키메라화는 당업계에 알려진 기술로 수행된다. 키메라화된 단클론 항체에서 유래된 항체 구성성분의 용도는 뮤린 특정부의 면역원성과 관련된 잠재적 문제를 감소시킨다.

뮤린 면역글로불린 변이부를 클로닝하기 위한 일반적인 기술은 Orlandiet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA86: 3833(1989)의 공개에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다. 일반적으로, PAM4 항체의 Vκ(가변 경쇄) 및 V_H(가변 중쇄) 서열은 RT-PCR, 5'-RACE 및 cDNA 라이브러리 스캐닝과 같은 여러 가지 분자 클로닝 절차에 의해 얻어질 수 있다. 특히 MAb PAM4의 V_H및 Vκ 유전자는 RT-PCR에 의한 하이브르도마 세포를 PCR 증폭하여 클론하였고, 이들의 서열은 DNA 서열화에 의해 결정되었다. 이들의 신빙성을 확인하기 위하여, 클론된 V_L및 V_H유전자는 Orlandiet al.,(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 86: 3833(1989))에 기재된 키메라 Ab와 같이 세포 배양에서 발현될 수 있으며, 본 명세서에서 참고자료로 통합 수록하였다.

항체는 일반적으로 세포 배양 배지로부터 하기와 같이 분리될 수 있다.

이입세포(移入細胞; transfectoma) 배양은 무혈청 배지에 적응시킨다. 키메라화된 항체의 제조를 위하여, 세포는 HSFM을 사용하는 롤러 병(roller bottle)에서 500ml 배양액에서 배양된다. 배양액을 원심분리한 후 상층액을 0.2μ 막을 통해 여과한다. 여과된 배지를 단백질 A 칼럼(1×3㎝)을 통해 1ml/min의 유속으로 통과시킨다. 그런 다음 상기 수지를 약 10 컬럼 부피의 PBS로 세척하고 단백질 A가 결합된 항체는 10mM EDTA를 함유하는 0.1M 글리신 완충액(pH 3.5)으로 컬럼에서 용리된다. 1.0ml의 분획을 3M 트리스(Tris, pH 3.5) 10㎕를 함유하는 튜브에 수집하고 단백질 농도는 280/260nm 흡광도에서 결정된다. 피크 분획은 괴어 있고, PBS에 대하여 투석되며, 상기 항체는 Centricon 30(Amicon, Beverly, MA)으로 농축된다. 상기 항체 농도는 ELISA에 의해 결정되고, 그 전에 항체의 농도가 PBS를 이용하여 약 1mg/ml로 조절된다. 소듐 아지드(sodium azide) 0.01%(w/w)는 방부제로 샘플에 편리하게 첨가된다.

바람직한 구현예에서, 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편은 뮤린 PAM4 MAb의 상보성 결정 영역(이하 "CDRs"라 한다) 및 구조 영역(이하 "FR"이라 한다) 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 특정부를 포함한다. 여기에서, 키메라화된 PAM4 MAb의 경쇄 변이부의 CDRs는 아미노산 서열 SASSSVSSSYLY를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 STSNLAS를 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 HQWNRYPYT를 포함하는 CDR3을 포함하며; 및 키메라화된 PAM4 MAb의 중쇄 변이부의 CDRs는 아미노산 서열 SYVLH를 포함하는 CDR1; 아미노산 서열 YINPYNDGTQYNEKFKG를 포함하는 CDR2; 및 아미노산 서열 GFGGSYGFAY를 포함하는 CDR3을 포함한다. PAM4 MAbs는 여러 가지로 잘 확립된 기술에 의해 하이브리도마 배양액으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기술은 단백질-A 세파로오스(Sepharose)를 이용하는 친화성 크로마트그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래를 포함한다. 예를 들면 Coligan의 페이지 2.7.1-2.7.12 및 페이지 2.9.1-2.9.3 참조. 또한 Baineset al., "Purification of Immunoglobulin G(IgG)", im METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10 페이지 79-104(The Humana Press, Inc. 1992) 참조.

PAM4 MAbs는 당업계에 잘 알려진 통상적인 여러 가지 기술에 의해 특정화될 수 있다. 예를 들면, PAM4 항원에 결합하는 PAM4 MAb의 결합력은 간접적 효소 면역분석, 유세포측정 분석(flow cytometry analysis) 또는 웨스턴 분석을 이용하여 확인될 수 있다.

PAM4 항체 단편의 제조

본 발명에서는 PAM4 항체 단편을 이용한다. 특이적 에피토프를 인지하는 항체 단편은 당업계에 알려진 기술로 제조될 수 있다. 상기 항체 단편은 F(ab')₂, Fab', Fab, Fv, sFv 등의 항체의 항원 결합 부분이다. 예를 들면, F(ab')₂단편은 항체 분자의 펩신 소화로 인해 생성될 수 있으며, Fab' 단편은 F(ab')₂의 이황화물 결합을 환원시켜 생성될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, Goldenberg, 미국특허 제4,036,945호 및 제4,331,647호 및 그 안의 포함된 참고자료에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 상기 특허들의 전체를 참고자료로 통합 수록하였다. 또한 Nisonoffet al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230(1960); Porter,Biochem. J.73: 119(1959), Edelmanet al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, 페이지 422(Academic Press 1967) 및 Coligan의 페이지 2.8.1-2.8.10 및 2.10-2.10.4 참조. 선택적으로, Fab'발현 라이브러리는 요구되는 특이성을 가지는 모노클로날 Fab' 단편의 빠르고 쉽게 동정하여 제조된다(Huseet al., 1989,Science, 246: 1274-1281). 본 발명에서는 항체 및 항체 단편을 포함한다.

단일 사슬 Fv 분자(scFv)는 V_L도메인 및 V_H도메인을 포함한다. V_L및 V_H도메인은 표적 결합 부위를 생성하기 위해 연결된다. 이들 두 도메인은 펩티드 연결기(L)에 의해 공유결합으로 연결된다. scFv 분자는 V_L도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분이면 V_L-L-V_H로 표시되고, V_H도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분이면 V_H-L-V_L로표시된다. scFv 분자를 제조하고 적당한 펩티드 연결기를 제작하는 방법은 미국특허등록 제4,704,692호 및 제4,946,778호, R. Raag 및 M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80(1995) 및 R.E. Bird 및 B.W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Region", TIBTECH, Vol 9:132-137(1991). 본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다.

항체 단편은 온길이 항체를 단백질 가수분해 또는E. coli또는 상기 단편을 코딩하는 DNA의 또 다른 숙주에서 발현하여 제조할 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 온길이 항체를 펩신 또는 파파인 소화하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 F(ab')₂로 표시되는 대략 100Kd 단편을 생성하도록 펩신과 항체를 효소분해하여 제조할 수 있다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 더 분해할 수 있으며, 임의로 설피드릴(sulfhydryl)기를 위한 차단기가 다이설파이드 결합을 분해하여 대략 50Kd Fab' 일원자가 단편을 제조한다. 선택적으로, 파파인을 사용하는 효소 분해는 두 개의 일원자가 Fab 단편 및 하나의 Fc 단편을 직접 제조한다. 이러한 방법은 Goldenberg에 의한 미국특허 제4,036,946호 및 제4,331,647호에 기재되어 있으며, 본 발명에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다. Nisonoffet al., Arch Biochem. Biophys.89: 230(1960); Porter,Biochem. J.73: 119(1959), Edelmanet al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, 페이지 422(Academic Press 1967), 및 Coligan 의 페이지 2.8.1-2.8.10 및 2.10.-2.10.4.

항체 단편의 또 다른 형태는 단일 상보적으로 결정하는 영역(CDR)을 코딩하는 펩티드이다. CDR은 항체와 결합하고 변이부의 잔여부분 보다 더 많은 가변적인 에피토프에 구조적으로 상보적인 항체의 변이부의 단편이다. 따라서, CDR을 때때로 고도 변이부(hypervariable regions)라고 일컫는다. 변이부는 CDRs를 포함한다. CDR 펩티드는 대상 항체의 CDR을 인코딩하는 구조 유전자에 의해 제조할 수 있다. 이러한 유전자는 항체 생성 세포의 RNA로부터 변이부를 합성하는 중합효소연쇄반응을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, Larricket al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology2: 106(1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritteret al.(eds.), 페이지 166-179(Cambridge University Press 1995); 및 Wardet al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies", in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birchet al., (eds.), 페이지 137-185(Wiley-Liss, Inc. 1995) 참조.

일원자가 경쇄-중쇄 단편을 생성하기 위하여 중쇄를 분리하는 것과 같이 항체를 분해하는 다른 방법은 단편을 분해하거나, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술을 사용할 수 있으며, 상기 단편은 항체 상호작용에 의하여 인지된 항원에 결합한다.

키메라화된 PAM4 항체 융합 단백질의 제조

본 발명에 의한 항체 융합 단백질은 기능기들 사이에서 글루카르알데히드 결합으로부터 보다 특이적인 결합으로 배치되는 다양한 통상적인 방법에 의해 제조될수 있다. 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 포함하는 항체 및/또는 항체 단편은 바람직하게는 또 다른 하나에 직접 또는 항체 또는 단편 표면의 아민, 카르복실, 페닐, 티올 또는 히드록실기와 같은 하나 또는 그 이상의 기능기를 통한 연결기 부분을 통해 공유결합으로 결합되어 있다. 글루타르알데히드에 첨가되는 다양한 통상적인 연결기로는 디이소시아네이트(diisocyanates), 디이소티오시아네이트(diiosothiocyanates), 비스(히드록시숙신이미드) 에스테르(bis(hydroxysuccinimide) esters), 카보디이미드(carbodiimides), 말레이미드히드록시숙신이미드 에스테르(maleimidehydroxysuccinimide esters) 등이 사용될 수 있다.

키메라화된 PAM4 융합 단백질을 제조하는 간단한 방법은 글루타르알데히드의 존재하에 항체 또는 단편을 혼합하는 것이다. 초기 쉬프 염기(Schiff base) 연결기는 이차 아민에서 수소화붕소(borohydride) 환원에 의해 안정화될 수 있다. 디이소티오시아네이트 또는 카보디이미드는 글루타르알데히드 대신에 부위-비특이적 연결기로 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 항체 융합 단백질은 하나의 키메라화된 PAM4 MAb 또는 그 단편을 포함하고, 여기에서 MAb는 MUC1 항원의 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치되는 도메인에 결합한다. 이러한 융합 단백질 및 그 단편은 우선적으로 췌장암 세포에 결합한다. 상기 일원자가, 일특이성 MAb는 항원을 직접 표적하는데 이용되고, 상기 MAb는 치료용 제제, 진단용/검출용 제제 또는 이들의 조합에 부착되고, 상기 단백질은 이를 필요로 하는 환자에게 직접 투여된다. 본 발명에 의한 PAM4 항체 융합 단백질 및 그 단편은 대신에 적어도 둘 이상의 키메라화된 PAM4 MAbs 또는 그 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 적어도 둘 이상의 MAbs 또는 그 단편은 PAM4 항원의 독특한 에피토프에 결합한다. 예를 들면, MAbs는 PAM4 항원에 대하여 다원자가이면서 일특이성인 항원 특이적 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 제조할 수 있다. 둘 또는 그 이상의 scFv 분자의 비공유 결합은 기능성 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 생성할 수 있다. 일특이성 디아바디는 동일한 scFv의 동종이합체(homodimer)이며, 각각의 scFv는 동일한 항체의 짧은 연결기로 결합되는 항체로부터 선택된 V_H도메인을 포함한다. 디아바디는 두 개의 scFvs의 비공유 결합에 의해 생성되는 이원자가 이합체이며, 두 개의 Fv 결합 부위를 가진다. 트리아바디는 세 개의 scFvs의 삼원자가 삼합체(trimer)를 생성하여 얻어지며, 세 개의 결합 부위를 가지고, 테트라바디는 네 개의 scFvs의 사원자가 사합체(tetramer)이며, 네 개의 결합 부위를 가진다. 각각의 일특이성 디아바디는 V_H1-연결기-V_L1를 포함하는 재조합 유전자 구조체를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 제조된다. Holligeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448; Atwellet al.,Molecular Immunology33: 1301-1302(1996); Holligeret al.,Nature Biotechnology15: 632-631(1997); Helfrichet al.,Int. J. Cancer76: 232-239(1998); Kipriyanovet al.,Int. J. Cancer77: 763-772(1998); Holigeret al.,Cancer Research59: 2909-2916(1999) 참조. scFv를 구성하는 방법은 미국특허 제4,946,778호(1990) 및 제5,132,405호(1992)에 개시되어 있다. 상기에서 언급한 다원자가, 일특이성의 scFv 기초 제제를 제조하는 방법은 미국특허 제5,837,242호(1998) 및 제5,844,094호(1998) 및 국제특허 제WO 98/44001호(1998)에 기재되어 있다. 다원자가, 일특이성 항체 융합 단백질은 동일한 항원 또는 개별적 항원에 위치될 수 있는 에피토프의 둘 또는 그 이상의 동일한 유형에 결합한다. 증가된 원자가는 부가적 상호작용, 증가된 친화력 및 장기간의 잔류 시간을 허용한다. 이들 항체 융합 단백질은 직접적 표적화 시스템에서 이용될 수 있으며, 여기에서 상기 항체 융합 단백질은 치료용 제제, 진단용/검출용 제제 또는 이들의 조합에 접합되고, 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.

본 발명의 바람직한 구현예는 PAM4 표적 에피토프에 대한 친화력을 가지는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 췌장암 항원과 결합하는 하나 또는 그 이상의 부가적 에피토프를 포함하는 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 그 단편에 관한 것이다. 이러한 융합 단백질은 적어도 둘 이상의 다른 에피토프에 결합하기 때문에 멀티특이성이고, 동일한 또는 다른 항원에서 존재할 수 있다. 예를 들면, 상기 융합 단백질은 하나의 PAM4 항원 에피토프에 대한 친화력을 가지는 첫 번째 결합 부위 및 TAG-72 또는 CEA와 같은 또 다른 표적 항원에 대한 친화력을 가지는 두 번째 결합 부위, 이와 같이 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 실시예는 CA19.9 MAb(또는 그 단편) 및 PAM4 MAb(또는 그 단편)을 포함할 수 있는 양특이성 PAM4 항체 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 융합 단백질은 MUC1의 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치되는 도메인뿐만 아니라 CA19.9에 대한 친화력을 가질 수 있다. 또한 본 발명은 적어도 둘 이상의 다른 PAM4 항원 에피토프에 대한 친화력을 가지는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 융합 단백질에 관한것이다.

본 발명에 의한 항체 융합 단백질 또는 그 단편은 직접적인 표적화 시스템에서 이용될 수 있으며, 여기에서 상기 항체 융합 단백질은 치료용 제제, 진단용/검출용 제제 또는 이들의 조합에 접합되고, 이를 필요로 하는 환자에게 투여된다.

본 발명에 의한 또 다른 바람직한 구현예는 PAM4 표적 에피토프에 대한 친화력을 가지는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 헵텐 분자에 대한 친화력을 가지는 적어도 하나 이상의 헵텐 결합 부위를 포함하는 다원자가, 멀티특이성 항체 및 그 단편에 관한 것이다. 예를 들면, 양특이성 PAM4 항체 융합 단백질은 679 MAb(또는 그 단편) 및 PAM4 MAb(또는 그 단편)을 포함할 수 있다. 상기 단클론항체 679는 트리-펩티드 부분인 히스타민 숙시닐 글리실(HSG)을 함유하는 분자에 높은 친화력으로 결합한다. 이러한 양특이성 PAM4 항체 융합 단백질은 상술한 바와 같이 679에서 F(ab')₂단편을 획득하여 제조될 수 있다. 679 F(ab')₂단편의 내부사슬 이황화물 다리결합은 시스틴(cystine)으로 완만하게 환원되고, 경쇄-중쇄 연결기가 무효화되는 것을 주의하여 Fab'-SH 단편을 생성한다. 상기 SH 기(들)는 비스-말레이미드 연결기(1,1'-(메틸렌디-4,1-페닐렌)비스-말레미드)의 초과로 인해 활성화된다. 상기 PAM MAb는 Fab'-SH로 전환된 다음 활성화된 MR23 Fab'-SH 단편과 반응하여 양특이성 PAM4 항체 융합 단백질을 생성한다. 이러한 양특이성 항체 융합 단백질은 친화력 증강 시스템에서 이용될 수 있으며, 여기에서 표적 항원은 상기 융합 단백질에 의해 예비표적화되고, 이어서 예비표적화에 의해 생성된 항체-항원 복합체에 결합하는 진단용 또는 치료용 제제에 의해 표적화된다.

양특이성 항체는 예를 들면, 이황화물 분해 및 전체 IgG 또는 바람직하게는 F(ab')₂단편, 하나 이상의 하이브리도마의 융합의 혼합물의 개선, 하나 이상의 특이성을 가지는 항체를 제조하는 폴리오마(polyoma)를 생성하는 하나 이상의 하이브리도마의 융합 및 유전 공학에 의해 여러 가지 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 양특이성 항체 융합 단백질은 다른 항체의 환원 분해를 초래하는 Fab' 단편의 산화 분해에 의해 제조된다. 이는 펩신 소화에 의해 두 개의 다른 항체를 제조하는 두 개의 다른 F(ab')₂단편을 혼합하여, 각각의 본래 에피토프에 특이적인 Fab' 부분을 가지는 양특이성 항체 융합 단백질을 포함하는 F(ab')₂단편 혼합물을 제조하도록 Fab' 단편의 혼합물을 생성하기 위한 환원 분해하고 이황화물 연결기의 산화 개선을 통해 편리하게 수행된다. 항체 융합 단백질의 일반적인 기술은 Nisonoffet al., Arch Biochem. Biophys.93: 470 (1961), Hammerlinget al., J. Exp. Med.128: 1461 (1967) 및 미국특허 제4,331,647호에 기재되어 있다. 본 발명은 적어도 하나 이상의 첫 번째 PAM4 MAb 또는 그 단편 및 본 발명에 의한 PAM4 MAb 또는 그 단편 이외의 적어도 하나 이상의 두 번째 MAb 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 및 그 단편에 관한 것이다.

보다 선택적 연결기는 말레이미드히드록시숙신이미드 에스테르와 같은 이종이작용성(heterobifunctional) 연결기를 사용하여 완성할 수 있다. 항체 또는 단편을 이용한 에스테르 반응은 항체 또는 단편 표면의 아민기를 유도할 수 있으며, 그런 다음 상기 유도체는 자유 설피드릴기(sulfhydryl groups)(또는 설프드릴기가 Traut의 시약에 의해 큰 단편 또는 온전한 항체에 첨가된다)를 가지는 항체 Fab 단편과 반응하게 된다. 이러한 연결기는 동일한 항체내의 가교결합 기(group)와 유사하지 않고, 연결기의 선택성을 향상시킨다.

항체 또는 단편이 항원 결합 부위에서 멀리 떨어진 부위에 결합하는데 유리하다. 이는 상술한 바와 같이 내부사슬 설피드릴기가 분해된 연결기에 의해 수행될 수 있다. 또 다른 방법은 적어도 하나 이상의 자유 아민 기능을 가지는 또 다른 항체와 함께 산화된 탄수화물 부분을 가지는 항체를 반응하는 것을 포함한다. 이는 초기 쉬프 염기(mime) 연결기가 수소화붕소의 환원에 의해 이차 아민이 환원되어 바람직하게 안정화됨으로써 최종 요소를 생성한 결과이다. 이러한 부위-특이적 연결기는 미국특허 제4,671,958호(작은 분자에 대하여) 및 미국특허 제4,699,784호(많은 가량에 대하여)에 개시되어 있으며, 참고자료로 통합 수록하였다.

다특이성(polyspecific) PAM4 항체 융합 단백질은 PAM4 항원 결합 부분을 양특이성 키메라화된 PAM4 항체 융합 단백질에 첨가하여 획득할 수 있다. 예를 들면, 양특이성 항체 융합 단백질은 2-이미노티올란(2-iminothiolane)과 반응시킴으로써 양특이성 융합 단백질을 세 번째 PAM4 MAb 또는 그 단편과 결합시키기 위하여 상기에 기재된 비스-말레이미드 활성화 과정을 이용하여 하나 또는 그 이상의 설피드릴기를 도입한다. 항체 융합 단백질을 제조하는 이들 기술은 당업계에 잘 알려진 것이다. 예를 들면, 미국특허 제4,925,648호 참조, 본 명세서에서 전체를 참고자료로 통합 수록하였다.

길이가 12개 아미노산 잔기 이상의 연결기(예를 들면, 15- 또는 18개 잔기 연결기)를 가지는 ScFv는 동일한 사슬의 V_H및 V_L도메인 사이의 상호작용을 허용하고, 일반적으로 단량체, 이합체(디아바디) 및 적은 양의 고질량 다중결합체(multimer)의 혼합물을 생성한다(Korttet al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157). 그러나, 5개 이하의 아미노산 잔기의 연결기를 가지는 ScFvs는 동일 사슬의 V_H및 V_L도메인의 분자내 쌍을 방해하고, 다른 사슬의 V_H및 V_L도메인과 쌍을 이루도록 한다. 3- 및 12-잔기 사이의 연결기는 우수한 이합체를 생성한다(Atwellet al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604). 0 및 2 잔기 사이의 연결기를 가지는 경우, 삼합체(트리아바디), 사합체(테트라바디) 또는 높은 수준의 올리고머 구조의 scFvs가 생성된다; 그러나, 올리고머화의 정확한 패턴은 연결기 길이에 부가하여 V-도메인의 배향(orientation) 및 조성물에 의존하여 나타난다. 예를 들면, 항-뉴라미니다아제(anti-neuraminidase) 항체 NC10의 scFv는 0-잔기 연결기를 가지는 우수한 삼합체(V_H에서 V_L의 배향) 또는 사합체(V_L에서 V_H의 배향)를 생성하였다(Dolezalet al., Protein Engineering (2000) 13:656-574). 1- 및 2-잔기 연결기를 가지는 NC10으로부터 scFv를 구성하기 위하여, V_H에서 V_L의 배향은 우수한 디아바디를 생성하였고(Atwellet al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604); 대조적으로, V_L에서 V_H의 배향은 사합체, 삼합체, 이합체 및 고질량 다중결합체의 혼합물을 생성하였다(Dolezalet al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574). V_H에서 V_L의 배향에서 항-CD19 항체 HD37로부터 scFvs를 구성하기 위하여, 0-잔기 연결기가 독점적으로 삼합체를 생성하였고, 1-잔기 연결기가 독점적으로 사합체를 생성하였다(Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168).

발현 벡터 및 숙주 세포

발현 벡터는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 일반적으로, 유전자 발현은 구조성 또는 유도성 프로모터, 조직-특이적 조절 인자 및 촉진인자를 포함하는 특정 조절 요소의 조건하에 발생한다. 이러한 유전자는 상기 "조작 가능하게 연결된" 조절 요소가 된다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열이다. 구조 유전자는 메신저 RNA(mRNA)로 전사된 다음 특이적 폴리펩티드의 아미노산 특성의 서열로 번역되는 DNA 서열이다. 일반적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사적 도입부에 근접하고, 유전자의 5'영역에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터인 경우, 전사율은 유도용 제제와의 반응이 증가된다. 대조적으로, 프로모터가 구조성 프로모터인 경우의 전사율은 유도용 제제에 의해 조절되지 않는다. 촉진인자는 전사 도입부와 관련된 촉진인자의 거리 또는 배향과 관계없이 전사의 효율을 증가시킬 수 있는 DNA 조절 요소이다.

분리된 DNA 분자는 기관의 유전자 DNA에 통합되지 않는 DNA 단편이다. 예를 들면, 클론된 PAM4 항원 유전자는 포유동물 세포의 유전자 DNA에서 분리된 DNA 단편이다. 분리된 DNA의 또 다른 실시예는 기관의 유전자 DNA에 통합되지 않는 키메라화하여 합성된 DNA 분자이다. 상보적 DNA(cDNA)는 효소 역전사효소에 의해 mRNA 주형으로부터 생성된 단일 가닥의 DNA 분자이다. 일반적으로, mRNA의 부분에 상보적인 짧은 합성 올리고 뉴클레오타이드는 역전사의 시작을 위한 프라이머로 작용하여 첫 번째 가닥 DNA를 생성한다. 또한 당업계에서는 단일 가닥의 DNA 분자와 그것의 상보적인 DNA 가닥으로 이루어진 이중 가닥의 DNA 분자를 "cDNA"라고 말한다.

클로닝 벡터는 숙주 세포에서 자체적으로 복제하는 능력을 가지는 플라스미드, 코스미드 또는 박테리오파지와 같은 DNA 분자이다. 클로닝 벡터에는 일반적으로 하나 또는 적은 수의 제한효소(restriction endonuclease) 인지 부위가 있으며, 외부 DNA 서열이 클로닝 벡터로 형질변환된 세포의 동정 및 선발에서 적절하게 이용되는 표적 유전자뿐만 아니라 벡터의 필수 생물학적 기능의 상실없이 결정할 수 있는 경향으로 삽입될 수 있다. 일반적으로 지표 유전자는 테트라사이클린 내성 및 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 원핵 세포 또는 진핵 세포 중 어느 것이 될 수 있다. 또한 상기 용어는 숙주 세포의 염색체 또는 게놈에서 클론된 유전자를 가지도록 유전공학적으로 제작된 원핵 세포 또는 진핵 세포를 포함한다. 용어 발현은 유전자 생성물의 생합성을 말한다. 예를 들면, 구조 유전자의 경우에서 발현은 mRNA로의 구조 유전자의 전사 및 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 생성하는 mRNA의 번역을 포함한다.

적절한 숙주 세포는 미생물 또는 포유동물 숙주 세포를 포함한다. 바람직한 숙주는 MAbs 생산을 위해 개발된 인간 세포계인 PER.C6 및 다른 융합 단백질이다.따라서, 본 발명의 바람직한 구현예는 PAM4 MAb를 인코딩하는 DNA 서열, 접합체, 융합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. PER.C6 세포(WO 97/00326)는 Adserotype 5 (Ad5) E1A- 및 E1B-코딩 서열(Ad5 뉴클레오타이드 459-3510)이 함유된 플라스미드를 이용하여 인간 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터의 조절하에 일차 인간 배아 망막 세포의 형질감염에 의해 생성되었다. E1A 및 E1B는 각각 아데노바이러스의 조기 유전자 활성 단백질 1A 및 1B이다. 상기 방법 및 조성은 특히 글리코실레이트화와 같은 사후-번역적으로 변형된 관계의 인간 재조합 단백질의 안정한 발현을 생성하기 위하여 이용된다. PER.C6은 온전하게 특정된 인간 세포계이고, 우수한 시험적 실시에 따라 개발된 것이며, 이러한 여러 가지 특징이 PER.C6를 재조합 단백질 생산을 위한 숙주로 이용할 수 있도록 해준다. 더욱이, PER.C6은 인간- 또는 동물-유래 단백질의 어느 것이 빠진 한정된 무혈청 배지에서 현탁 배양하여 성장될 수 있으며, 이들은 롤러병, 교반 플라스크, 스피너 플라스크 및 생물반응기에서 약 35시간의 배가시간(doubling time)으로 적절히 배양된다. 최종적으로, E1A의 존재는 CMV 촉진인자/플모터의 조절하에 있는 유전자 발현의 조절을 상향시키고, E13의 존재는 재조합 이식유전자(transgene)의 과발현을 통해 증가되는 것으로 추정되는 p53-의존 자가사멸을 막는다. 하나의 구현예에서, 세포는 통상적인 포유동물 세포계 보다 2-200배 이상의 재조합 단백질 및/또는 단백성(蛋白性; proteinaceous) 기질을 생성할 수 있다.

치료 및 진단을 위한 키메라화된 PAM4 항체의 용도

본 발명은 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 치료용 접합체의 유효량을 치료악적으로 환자에게 투여하는 단계를 포함하여 환자의 악성종양을 진단하는 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편은 적어도 하나 이상의 진단용 및/또는 치료용 제제와 결합한 다음 약제학적으로 적합한 부형제 내에서 제형화된다. 또한 바람직하게는, 본 발명은 PAM4 항원에 대한 하나 또는 그 이상의 항원 결합 부위 및 하나 또는 그 이상의 헵텐 결합 부위를 포함하는 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 그 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계; 환자의 혈류에서 비항체의 양이 제거되도록 충분한 시간 동안 기다리는 단계; 및 다원자가, 멀티특이성 항체 또는 그 단편의 결합 부위에 결합하는 진단용/검출용 제제, 치료용 제제 또는 이들의 조합을 포함하는 운반 분자를 환자에게 투여하는 단계;를 포함하는 암을 진단하는 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 암은 췌장암이다. 또 다른 바람직한 구현예에서 상기 항체는 다원자가, 일특이성 항체 또는 그 단편이다.

생체 밖에서 진단을 위한 MAb의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Carlssonet al., Bio/Technology7(6):567 (1989) 참조. 예를 들면, MAbs는 생검 표본에서 조직의 종양 관련 항원의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다. 또한 MAbs는 방바성면역분석법, 효소결합면역흡수분석법 및 형광면역분석법과 같은 기술을 이용하여 임상적 유체 샘플에서 종양 관련 항원의 양을 측정하는데 사용될 수있다.

또한 본 발명은 악성종양의 생체밖 진단을 위한 PAM4 항체 및 그 단편 및 PAM4 융합 단백질 및 그 단편의 용도에 관한 것이다. 생체밖 진단을 위한 MAb의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Carlssonet al., Bio/Technology7(6):567 (1989) 참조. 예를 들면, MAbs는 생검 표본에서 조직의 종양 관련 항원의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다. 또한 MAbs는 방바성면역분석법, 효소결합면역흡수분석법 및 형광면역분석법과 같은 기술을 이용하여 임상적 유체 샘플에서 종양 관련 항원의 양을 측정하는데 사용될 수 있다.

종양-표적화된 MAbs와 독소의 접합체는 생체 내에서 암세포를 선택적으로 제거하는데 사용될 수 있다(Spalding,Bio/Technology 9(8): 701 (1991); Goldenberg,Scientific American Science & Medicine1(1): 64 (1994)). 예를 들면, 실험적 동물 모델에서 치료 연구는 세포독성 방사성핵종을 운반하는 항체의 항-종양 활성을 증명해 준다. 동물 모델의 검토 및 치료 연구를 위한 실시예 3 및 실시예 5 참조(Goldenberget al., Cancer Res. 41: 4354 (1981), Cheunget al., J. Nat'l Cancer Inst. 77: 739 (1986), 및 Senekowitschet al., J. Nucl. Med. 30: 531 (1989)).

키메라화된 항체 및 그 단편은 치료용 방법 및 진단용 방법에서 사용이 적절하다. 따라서, 본 발명은 (ⅰ) 적어도 하나 이상의 진단용 및/치료용 제제와 접합된 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및 (ⅱ)상기 진단용 또는 치료용 항체 접합체를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;를 포함하여표적에 진단용 또는 치료용 제제 또는 이들의 조합을 운반하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 PAM4 및 그 단편은 키메라화된 것이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 의한 키메라화된 PAM4 항체 및 그 단편은 악성종양을 치료하는 방법에 이용된다.

또한 본 발명은 본 발명에 의한 항체 중 어느 PAM4 MAb 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 항체 구성성분을 포함하여 암 세포를 표적화하는 진단용 또는 치료용 접합체에 관한 것이며, 상기 항체 구성성분은 적어도 하나 이상의 진단용 또는 적어도 하나 이상의 치료용 제제와 결합된다. 바람직하게는, 진단용 접합체는 광활성 진단용/검출용 제제, 초음파 검출용 제제 또는 MRI 조영제이다. 보다 바람직하게는 상기 진단용/검출용 제제는 20-4,000 keV 사이의 에너지를 가지는 방사성핵종이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 적어도 하나 이상의 PAM4 항체 자체 또는 그 단편 및/또는 PAM4 융합 단백질 또는 그 단편의 치료학적으로 또는 진단학적으로 유효량을 투여하는 단계; 및 PAM4 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편을 약제학적 부형제 내에서 최적으로 제형화하는 단계;를 포함하는 악성종양의 진단 또는 치료 방법에 관한 것이다.

치료용 조성물은 적어도 하나 이상의 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편을 단독 및 비접된, 또는 접합된 또는 비접합된 및 다른 인간화된 또는 키메라 항체, 인간 항체, 치료용 제제 또는 면역조절제와 같은 다른 항체 및 그 단편과의 조합으로 함유한다. 또한 동일한 또는 다른 에피토프 또는 항원에 대한 항체 자체 또는접합된 항체는 하나 또는 그 이상의 본 발명에 의한 PAM4 항체 또는 그 단편과 조합된다.

따라서, 본 발명은 PAM4 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 PAM4 항체 및 그 단편을 단독으로, 항체 또는 항체 단편 자체로 투여되거나, 또는 다원적인 치료(multimodal therapy)로의 투여에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편이다. 본 발명의 다원적인 치료는 항체 자체, 융합 단백질 또는 면역접합체의 형태로 다른 항체의 투여로 보충된 PAM4 항체 자체를 이용한 면역치료법을 더 포함한다. 예를 들면, 키메라화된 PAM4 항체는 또 다른 키메라화된 PAM4 자체 또는 다른 항체, 또는 인간환된 PAM4, 또는 동위원소, 하나 또는 그 이상의 화학치료제, 사이토카인, 독소 또는 이들의 조합과 접합된 다른 항체와 조합될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, la3, aLe^a및 다른 Lewis 항원들(Le(y)), 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA)에 대한 항체, 콜론-특이적 항원-p(CSAp), MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, HER1/neu, EGFR, 혈관신생 인자(예를 들면, VEGF), 인슐린류 성장 인자(IGF), 테나신, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자 생성물 및 종양 괴사 기질에 대한 항체와 같은 다른 췌장 종양 관련 항체와 조합되기 이전의 또는 이후의 항체 자체 또는 접합된 PAM4 항체 또는 그 단편의 치료에 관한 것이다. 이러한 고형 종양 항체는 그 자체 또는 그 중에서도 약물, 독소, 동위원소, 외부 방사능 또는 면역조절제와 접합될 수 있다. 키메라화된 PAM4 항체 및 독소의 융합 단백질 또한 본 발명에서 사용될수 있다. 많은 다른 항체 조합은 항체 자체로 또는 항체의 일부는 자체이고 일부는 치료용 제제 또는 면역조절제로 접합되어 구성된다. 선택적으로, 다른 항체 자체 조합은 연속하여, 동시 또는 순차적으로 주어진 세포독성 약물 또는 방사성물질과의 다른 치료용 제제와의 조합으로 투여될 수 있다.

본 발명에 의한 일특이성 항체는 진단용 또는 치료용 제제와 결합하여 PAM4 양성 종양을 직접 표적한다. 일특이성 분자는 표적화된 항원에 선택적으로 결합하고 분자의 결합 부위 수가 증가하여 표적 세포에 대한 친화력이 증가하고, 원하는 위치에서 장기간 잔류 시간을 얻게 된다. 더욱이, 비항원 결합 분자는 인체에서 신속하게 제거되어 정상조직의 노출이 최소화된다. 멀티특이성 항체는 AES 시스템에서 이용되고, 여기에서 PAM4는 진단용 또는 치료용 제제의 연속하는 특이적 운반을위하여 양성 종양을 예비-표적한다. 상기 제제는 펩티드를 함유하는 히스타민 숙시닐 글리실(HSG)에 의해 운반된다. 679(IgG1, K)로 제작된 뮤린 단클론 항체는 트리-펩티드 부분인 HSG(Morelet al., Molecular Immunology, 27, 995-1000, 1990)을 가지는 분자에 높은 친화력을 가진다. 679 MAb는 HSG와 결합하고 항원을 표적하는 cPAM과 함께 양특이성 항체를 생성할 수 있다. 또한 선택적으로 헵텐이 이용될 수도 있다. 이들 항체는 표적화된 항원에 선택적으로 결합하여 친화력을 증가시키고 원하는 위치에서의 장기간 잔류 시간을 허용한다. 더욱이, 비항원 결합 디아바디는 인체에서 신속히 제거되어 정상 조직의 노출을 최소화한다. PAM4 항체 및 그 단편 및 접합체는 암과 같은 포유동물 질병을 진단 및 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 진단 또는 치료를 위하여 표적화하는 진단용 또는 치료용 제제의 운반은 PAM4 항체 또는 그 단편이 진단용 또는 치료용 제제를 제공하는 단계; 및 상기 항체를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계;를 포함한다. 진단은 알려진 기술로 결합된 단백질을 검출하는 단계를 더 포함한다.

본 발명의 명서서에서 용어 "진단" 또는 "검출"은 다른 것과 교체하여 사용될 수 있다. 일반적으로 진단은 조직의 특이한 조직학적 상태, 검출 인지 및 특정 항원을 가지는 조직, 병변 또는 기관의 위치를 정의하는 것이다.

진단용 또는 치료용 제제와 함께 본 발명에 의한 항체 및 그 단편의 투여는 국소적 도뇨관 또는 직접 병변내 주입을 통해 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하주사, 흉막내, 척수강내, 관류로 포유동물에 영향을 줄 수 있다. 항체를 주입에 의해 투여하는 경우, 상기 항체는 지속적인 주입에 의해 또는 단일 또는 다수의 환약(boluses)으로 투여될 수 있다.

진단용 또는 치료용 제제를 가지는 항체는 약제학적으로 허용가능한 주입 운반제 내에서, 바람직하게는 생리학적 pH 및 농도에서 인산염-완충된 식염수(PBS) 내에서 인간 또는 포유동물 치료 및 진단에 사용하기 위한 키트로 제조될 수 있다. 특히 인간에 사용하기 위해서는 멸균하는 제조하는 것이 바람직하다. 상기 키트의 선택적 구성성분은 안정화제, 완충액, 라벨링 시약, 방사성핵종, 상자성 화합물, 제거율을 증강시키기 위한 이차 항체 및 통상적인 주입기, 컬럼, 바이얼(vial) 등을 포함한다.

하기의 실시예는 본 발명의 실시형태를 설명하는 것이며, 청구범위를 제한하는 것으로 사용되어서는 안된다.

하기의 실시예는 PAM4 MAb 및 CaPan1 인간췌장암을 적용하는 실험연구에 대한 것이다. CaPan1 인간췌장암은 피하(subcutaneous) 및 동소성(orthotopic) 부위모두에 이종이식(xenograft)으로 수행된다. MAb 및 제제는 생존시간을 향상시키는 중요한 결과가 있었다. PAM4 단클론 항체의 고 농도는 환자의 초기 그룹내에서 췌장암의 대부분을 표적하는 이종이식된 인간 종양모델을 표적하는 것으로 나타내었다. 환자의 혈액에서 PAM4 반응성 항원을 정량하는 생체내 면역분석법 적용은 기타 질명 및 정상 그룹뿐만 아니라 췌장염(pancreatity)로부터 췌장암을 구별하는 능력이 있는 것으로 나타낸다.

PAM4 MAb의 임상적 연구는 환자의 손상(lesion)의 대부분이 표적화되었고 정상조직에서 흡수의 신호가 없음을 나타내었다. 약량측정(dosimetry)은 종양과 적색골수(red marrow) 복용량의 비율이 3:1~10:1로 종양에 10~20cGy/mCi로 전달될 가능성이 있음을 나타내었다. 상기 경과는 PAM4가 췌장암의 치료에 상-Ⅰ 시도의 개발에 유용할 수 있음을 제안한다.

실시예 1 - 면역조직화학(Immunohistochemistry) 염색 연구

정상 성인 조직의 면역조직화학은 PAM4 반응성 에피토프가 염색이 약하지만 명확히 양성(표 1)인 위장관(gastrointestinal tract)에 제한적임을 나타내었다. 관(duct), 소도관(ductule), 선방세포(acini), 및 소도 세포(islet cell)를 포함하여 정상 췌장조직은 염색에서 음성이었다. 일반적으로 항원과 같은 조직 호모지네이트 (homogenate)와 효소면역분석 관련 PAM4는 면역조질화학 결과(표 2)를 뒷받침한다. PAM4 에피토프는 정상 췌장 및 기타 위장 조직에는 없었다. 종양(neoplastic) 조직에서 PAM4는 췌장암 25의 경우 중 21의 경우(85%)와 반응하였다(표 3). PAM4 반응성은 종양 분화의 단계와 상호관련이 있음을 나타내었다. 예를들어, 완전 및 중간정도로 분화된 췌장암의 21의 경우 중 20의 경우가 양성인 반면, 약하게 분화된 종양의 4경우 중 1 경우만이 양성이었다. 일반적으로, 약하게 분화된 종양은 모든 췌장암의 10% 미만을 나타낸다.

상기 연구는 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3 및 루이스 항원으로 기록된 것과는 PAM4 반응성 및 조직 분포(정상 및 암 모두)가 상이함을 나타내었다. 특정 MAb와 수행된 크로스블록킹(crossblocking) 연구에서 그 결과는 PAM4 MAb는 유일하고 새로운 에피토프임을 입증한다. CA19.9, DUPAN2 및 aLe^a와 비유할 경우, PAM4는조직분포에서 보다 제한적이고, 췌장암의 높은 퍼센트로 반응하는 것으로 나타난다. 게다가, 동일한 농도에서 반응의 전체 강도는 보다 크고, 종양내에서 세포의 높은 퍼센트로 반응하는 것으로 나타났다. 최종적으로, PAM4은 12개의 만성 췌장염 시편 중 3개에 약하게 반응하는 반면, CA19.9 및 DUPAN2는 모든 12개 시편에서 강하게 반응하는 것으로 나타났다. 특이성은 적용된 분석의 형태, 진찰된 조직의 범위 및 수, 정상 및 종양 정상조직를 구별하는 PAM4의 능력에 따라 의존하지만, 반응강도 뿐만 아니라 암 시편의 다수 퍼센트와 반응하는 능력은 임상적용의 개발적인 연구를 추구하는데 중요한 본의가 있다.

정상 성인 Ti₅의 면역과산화수소(immunoperoxidase) 염색

조직	염색
	반응
췌장(22)a
관	-
선방세포	-
소도세포	-
턱밑샘(submaxillary gland)(2)	-
식도(Esophagus)(2)	-
위(3)	+ 점액분비세포
십이지장 (duodenum)(3)	+배상세포(goblet cell)
공장(Jejunum)(3)	+배상세포(goblet cell)
회장(ileum)(3)	+배상세포(goblet cell)
결장(5)	+배상세포(goblet cell)
간(3)	-
담낭(gallbladder)(2)	-
기관지 (bronchus) (3)	-
폐(3)	-
심장(3)	-
지라 (spleen)(3)	-
신장(3)	-
방광 (bladder)(3)	-
전립선 (prostate)(2)	-
고환(testes)(2)	-
자궁(uterus) (2)	-
난소 (ovary) (2)	-
a - () 진찰된 각 시편의 수

ELA에 의한 정상성인 조직 호모지네이트와 단클론 항체 PAM4 반응성

조직	ug/g 조직a
췌장	6.4
식도	8.1
위	61.3
십이지장	44.7
공장	60.6
결장	74.5
간	0.0
담낭	5.6
심장	3.7
지라	3.4
신장	6.6
방광	4.9
갑상선(thyroid)	3.5
부신(adrenal)	1.3
자궁	2.6
고환	3.9
CaPan1 췌장 종양	569
a - 2개의 해부시편의 평균값

췌장 종양와 여러 단클론항체의 면역조직화학 반응성

	분화(differentiation)	PAM4	CA19.9	aLea	DUPAN2
1	W	+++	-	-	+++
2	M	++	+++	+++	+
3	M	+	-	+	+
4	M	+++	+++	+++	+
5	M	++	+	-	-
6	M	+	ND	ND	ND
7	M*	+++	+++	+++	+++
8	M	+	-	-	+++
9	M	++	+	++	-
10	M	++	++	++	+++
11	M	++	+++	+++	+
12	M	++	+	+	+++
13	M	+	+++	+++	+
14	M	++	+	+	++
15	M	+++	+	+	++
16	M	+	+	++	-
17	M	-	+	+	-
18	M	++	++	++	++
19	M	+++	+	+++	++
20	M	+	-	-	-
21	M	+++	+++	+	++
22	P	+	+	+	+++
23	P	-	-	-	-
24	P	-	-	-	-
25	P	-	-	+	-
합계		21/25	17/24	18/24	16/24
- : 음성; + : 조직의 5~20%가 염색됨; ++ 조직의 21~50%가 염색됨; +++ :조직의 〉50%이 염색됨; W,M,P : 완전(well), 중간(moderate) 또는 약한(poor) 분화; *:전이(metastatic) 조직; ND: 없음

MAb PAM4와 종양 조직의 면역과산화수소 염색

조직	양성/합계
췌장	21/25
결장	10/26
위	1/5
폐	1/15
유방	0/30
자궁	0/10
전립선	0/4
간	0/10
신장	0/4

실시예 2 - 방사선라벨화된 PAM4의 생체내 생분포(biodistribution) 및 종양 표적화

PAM4의 초기 생분포 연구는 예상되는 분화의 범위에 걸쳐 4개의 상이한 이종이식된 인간 췌장종양의 시리즈로 수행하였다. 각각의 4개 종양은 AsPc1, BxPc3, Hs766T, 및 CaPAn1은 투여된 비특이성, 아이소타입(isotype)-매치 Ag8 항체(범위:3.6~9.3% ID/g 3일)보다 현저히 높은(p〈0.01~0.001) 종양내(범위:21~48% ID/g 3일)에서¹³¹I-PAM4의 농도를 나타내었다. 생분포 결과는 종양에 잠재적 방사성량을 각각 AsPc1, BxPc3, Hs766T, 및 CaPAn1에 주입된 약물의 12,230; 10,684; 6,835; 및 15,843cGy/mCi로 산출하여 사용하였다. 0.7mCi의 실질적인 최대내량(maximum tolerated dose:MTD)으로, PAM4은 이종이식된 종양모델의 각각에 라드 양(rad dose)을 제공할 수 있었다. 각 종양에서 방사성라벨화된 PAM4의 혈액수준은 비특이성 Ag8보다 현저히 낮았다(p〈0.01~0.001). PAM4로부터 혈액에 잠재적 방사성량은 Ag8 보다 낮은 1.4~4.4 fold이었다. PAM4로부터의 종양에 방사선량이 PAM4으로부터의 혈액량으로 정상화되었을 경우, 종양은 각각 혈액보다 높은 2.2; 3.3; 3.4; 및 13.1 fold인 양을 받았다. 비-종양 조직에 잠재적 방사선량은 최소화되었다.

PAM4의 생분포는 CaPAn1 종양모델을 사용하여 항-CEA 항체, MN-14와 비교하였다. 종양에서 PAM4의 농도는 초기 타임포인트(timepoint)에서 MN-14보다 매우 높아 3일에서 종양:혈액 비율이 MN-14은 2.7 ±1.9과 비하여 PAM4은 12.7 ±2.3로 얻었다. 종양내에서 섭취한 PAM4이 초기 타임포인트에서 MN-14보다 현저히 높지만(1일-p〈0.001, 3일-p〈0.01), 약량(dosimetry) 분석은 14일간 연구기간에 걸쳐 MN-14와 비교하여 PAM4로부터의 종양에 단지 3.2fold 높은 양을 나타내었다. 이는 종양에서 PAM4의 빠른 제거율때문이고, 그 후 타임포인트에서 종양내 2개의 항체의 유사한 농도를 나타내었다. 또한, 종양에서 PAM4이 빠른 제거율은 BxPc3 및 Hs766T에서 나타났으며, AsPc1 종양모델에서는 나타나지 않았다. 상기의 결과는 결장(colorectal) 암에서 G9 및 B72.3과 같은 기타 항-뮤신(mucin)항체에 기록된 것과는 다르며, MN-14와 비교하여 긴 머무름시간을 나타낸 것이다. PAM4의 물질대사 연구로부터, 종양세포에 초기 결합후, 항체는 빠르게 방출되고 분해되거나 항원:항체 복합체와체로 영향을 미치는 것을 나타낸다. 또한, 이는 환자에 혈액제거율이 매우 빠르다는 것을 제외하고는, 항체의 사용에서 바람하지 못한 적용을 나타내었다. 상기 결과는¹³¹I이 치료성 적용에 적절한 동위원소의 선택이 될 수 없음을 제안한다. 자주 투여될 수 있는⁹⁰Y 또는¹⁸⁸Re와 같은 짧은(short-lived) 방위원소가 보다 효율적은 반응물이 될 수 있음을 입증한다.

PAM4은 CaPan1 종양모델을 제외하고 정상조직에 표적화하는 증거를 나타낼 수 었으며, 실질적으로 비장(splenic) 흡수는 작게(범위 3.1~7.5%ID/g 3일) 관측되었다. 비장 표적화의 상기 형태는 항-뮤신 항체 B72.3 및 CC49의 임상실험에서 관측되었다. 중요하게, 상기 결과는 비장 표적화는 항체의 종양흡수에 영향을 미치지 않았으며, 핵스캔(nuclear scan)의 해석에 방해하지 않음을 나타낸다. 상기 연구는 비장표적은 Fc 수용체에 의해 결합되지 않으면서 비장에서 상호반응하는 항원때문이 아니라, 하기의 가능성 중 하나 이상의 가능성때문이다 : 비장에 포집된 항원의 직접적인 표적화 또는 항원의 간접적인 흡수 : 혈액 또는 종양부위에서 방출된 것에서 형성된 항체 복합체. 후자는 혈액에서 면역복합체의 존재가 요구되고, 그러나 이는 5분의 초기 및 7일후의 시편이 겔 여과법(HPLC, GE-250컬럼)으로 측정될 경우 관측되지 않았으며, 방사성라벨화된 항체는 천연물질로 용출되었다. 전자는 CaPan1 종양이 PAM4-반응성 항원을 기타 종양세포에서 관측되는 것보다 높은 양으로 100~1000 fold로 대량 생산하는 것에 관점으로 보여진다. 상기 기타 종양에서 PAM4에 의한 비장표적화의 부족은 상기 현상들이 과량의 항원생산과 관련이 있음을 나타낸다. 상기 현상에서 비장 표적화는 최초 2㎍ 양으로부터 10㎍까지 잠재적 량을 증가시키면서 극복할 수 있다. 비장의 엔트랩된 항원(entrapped antigen)의 대량은 방사성라벨화된 항체보다 비라벨화된 PAM4과 착화되었다. 단백질 량의 증가는 종양 또는 비종양 조직에 PAM4의 표적화에 악영향을 미치지 않았다. 실제적으로 CaPan1 종양내에서 방사선라벨화된 PAM4의 농도보다 2배 이상인 100㎍로 단백질 량이 증가한다.

실시예 3 - 가슴샘이 없는 생쥐(athymic mice)에서 동소성동소성c)췌장암(pancreatic tumors)의 전개

좀더 가까운 동물모델에서 췌장암의 임상적 존재를 비기기 위하여, 출원인은 췌장의 위쪽으로 직접 종양세포를 주입함으로써 동소성 모델을 전개하였다. 동소성 CaPan1 종양은 복수(ascites)의 전개까지 명백한 증후없이 점차적으로 성장하였으며, 10~14주에 사멸하였다. 체내주입(implantation) 후 3~4주, 동물들은 대략 0.2g의 명백한 종양으로 전개되었다. 성장 8주내에 간 및 비장에서 변형으로 대략 1.2g의 초기 종양이 관측되었다(1~3 전이종양/동물; 각 종양〈0.1g). 10~14주에 복수의 전개와 함께 격막(diaphragm)의 살포가 명백하였다. 복수 형성 및 황달(jaundice)은 종양성장의 명백한 첫 징후였다. 복수는 복부에서 유액의 축적이고, 황달은 혈액에서 과량의 담즙색소로 피부 및 눈이 노락색으로 되는 것이다. 상기 시기에서 종양은 약 1~2g의 크기였으며, 동물은 죽을때까지 단지 3~4주였다.

4주의 동소성 종양(대략 0.2g)을 갖는 동물에 투여된 방사선라벨회된¹³¹I-PAM4는 1일의 7.9 ±3.0의 표시에서 14일의 22.8±15.3으로 증가하여 초기 종양에 특이적으로 표적화하는 것으로 나타났다. 다른 조직에 특이적으로 표적화하는 증거는 관측되지 않았다. 종양이 간 및 비장에 전이되는 것이 관측되는 경우, 양 전이가 표적화되었으며, 방사선라벨화된 항체가 고 농도였다. 게다가, 동물의 절반이 상처부위에서 피하종양이 전개되었다. 동일한 동물내에서 동소성 및 피하 종양의 표적에 차이가 나타나지 않았으며, 동물이 동소성 종양에서 피하종양을 갖고 있는지는 동소성 종양을 표적화하여 관측하였다. PAM4의 방사선 량은 초기 종양 및 혈액에서 각각 6,704 및 1,655cGy/mCi이었다.

실시예 4 -순환하는 종양(circulating tumor) 항원의 정량의 효소 면역학적 감정법(immunoassay)의 전개

효소 면역학적 감정법을 토끼 다클론으로부터 유도된 비라벨화된, 순수한 IgG, 항-췌장 뮤신으로 포집 반응물(capture reagent)로서 PAM4를, 이어 검출반응물로 과산화효소 라벨화된 당나귀 항-토끼 IgG를 도입하여 전개하였다. 상기 분석법을 사용하여 하기의 결과를 얻었다.

분석으로 관측된 항원의 범위에서, 변화값의 계수는 10% 미만으로 얻었다. 25개의 건강에 개체의 혈청을 관찰하였고, 평균 4.0±3.1단위의 ±S.D.를 나타냈다. 양성반응의 컷오프(cutoff) 값은 평균 +2S.D. = 10.2단위로 정해졌다. 전체 37명의 췌장암 환자 중, 22명 또는 86%가 상기 분석으로 양성이었으며, 단지 13명의 췌장염 환자의 3명만이 양성이었다. PAM4 항원은 결장암환자의 55%에서 향상되었으며, 면역학적 감정법에 의하여 PAM4와 반응하는 결장암 시편의 40%정도였다. 기타 암 중에서 PAM4 항원은 모두 과도한 질병을 갖는 16개의 자궁암 중 4개, 20명의 유방암 환자에서 5명이 양성이었다. 또한, 하기 표 5에서 보는 바와 같이, 췌장암의 중간값(84.5단위)은 기타 다른 암(담암(biliary cancer)은 제외)보다 큰 10 fold였으며, 상기 경우의 압도적 다수는 마지막 단계이었다.

혈청과 PAM4의 반응성

		단위/㎖
	n	평균	SD	중간값	범위	%양성a
정상	25	4.0	3.1	4.7	0.0~9.4	0%
췌장염	13	14.6	20.3	6.8	0.4~66.7	23%
췌장 CA	37	317.5	427.1	84.5	0.9~1000	86%
담 CA	8	155.4	343.8	37.8	6.6~1000	63%
간 CA	30	7.9	8.0	6.4	0.0~32.8	30%
결장 CA	33	50.0	171.6	11.8	3.4~1000	55%
폐 CA	38	25.8	44.6	9.3	0.0~196.0	39%
유방 CA	20	11.1	18.5	5.8	0.0~83.3	25%
자궁 CA	16	68.9	248.4	5.5	0.0~1000	25%
비-Hodgkin's Lymphoma	14	6.6	3.1	7.5	2.2~12.8	14%
a 컷오프 10.2 단위/㎖(평균 + 2S.D.)

상기의 결과에 더하여, 예비 연구는 상기 PAM4의 분석의 잠재적 용도를 측정하기 위해 동소성 모델에서 수행하였다. 동소성 CaPan1 종양(대략 종양질량 0.15g)의 주입 후 12주에 모든 동물의 혈액에서 항원이 관측되지 않았다. 4주에서(대략 종양질량 0.2g), 5마리 동물 중 하나가 항원이 관측될 수 있는 수준(72단위)이었으며, 6주에(대략 종양질량 0.4g) 5마리 동물 중 4마리가 정량가능한 항원(범위: 98~6080 단위)을 갖고 있었다. 혈청운반 항원(serum borne antigen)이 관측될 수 있는 초기 시간을 결정하는 관점에서 제한인자는 반복된 출혈이 수행되어 얻을 수 있는 혈액의 제한된 양이었다. 혈청은 분석전에서 1:10로 희석되었다.

실시예 5 - 췌장암의 실험적인 방사선면역치료법

치료에서¹³¹I-PAM4 용도에 대한 초기 연구는 가슴샘이 없는 생쥐에서 피하 이종이식으로서 성장된 CaPan1 종양으로 수행하였다. 0.25g 종양을 갖는 동물은 실험에서 비특이성 Ag8의 유사한 량의 치료적인 효과를 비교하여 350μCi,¹³¹I-PAM4을 투여하였다. 1㎤ 종양을 갖는 동물에¹³¹I-PAM4의 투여의 MTD는 700μCi이었다. 5~6주가 지난 후, 동물에 처리된 PAM4은 종양의 효과적인 경감을 나타났으며, 27주에서 8개 중 5개가 잔여 종양으로 남았다. Ag8처리와 마찬가지로 비처리된 동물은 2개의 대조군사이에서 상이점이 있지만 종양성장의 큰 진전을 타나았다. 7주에서 비처리된 군에서의 종양은 초기시점에서 20.0 ±14.6 fold 성장하는 반면,¹³¹I-Ag8-처리 종양은 단지 4.9 ±1.8 fold이었다. 상기 시간에서 PAM4 종양은 원래 크기의 0.1 ±0.1 fold로 경감되었으며, 비처리된(p〈0.001) 및 비특이성 Ag8 처리된(p〈0.1)동물에서 현저한 차이가 있었다.

CaPan1 종양은¹³¹I-PAM4 처리로 민감하지만, 종양의 경감 또는 진전 결과는 초기 종양크기를 포함하여 많은 인자에 의존한다. 따라서, 0.25g, 0.5g, 1.0g 또는 2.0g의 CaPan1 종양을 갖는 동물 그룹은 350μCi¹³¹I-PAM4의 하나의 량으로 처리하였다. 초기 크기 0.25g 및 0.5g의 종양을 갖는 동물의 대부분(각 그릅당 10동물 중 9마리)은 처리 후 적어도 16주동안 종양경감 또는 성장억제를 나타냈다. 1.0g 종양그룹에서 7마리 중 5마리는 16주동안 종양성장이 나타나지 않았으며, 2.0g 종양그룹에서 9마리 중 6마리가 진전이 발생되기 전 6주동안 종양성장이 나타나지 않았다. 단독 350μCi 복용량은 큰 종양에 대하여 효율적인 것으로 나타나지 않았지만, 단독 복용량은 적절한 요법일 될 수 없으며, 독성연구는 방사성면역치료법의 다 순환을 갖는 능력을 나타낸다. 평균 1.0g의 CaPan1 종양을 갖는 동물들은 각각 350μCi¹³¹I-PAM4의 단독복용을 하며, 0주 및 4주시간에서 2개 복용은 미처리된 것으로 남아있었다. 비처리된 군은 3.7±1.0주의 평균생존시간을 나타났다(생존은 종양이 5㎤ 되는 시간으로 정이됨). 동물들은 초기 3주에 죽었으며, 6주 지난 후 생존한 동물은 없었다. 350μCi¹³¹I-PAM4의 단독 복용량은 18.8±4.2주의 생존시간으로 증가하였다(p〈0.0001). 동물죽음의 범위는 13~20주로 나타났다. 동물은 26주동안의연구 말미에서 살아있는 것은 없었다.

생존시간의 중요한 증가는 단독 복용군과 비교하여 2개의 복용군을 관측하였다. 동물의 절반은 1.0~2.8㎤의 종양크기로 26주에서 생존하였으며, 초기 종양크기로부터 1.6±0.7홀드의 평균 중양크기 속도를 갖는다. 26주에서 비-생존된 동물들은 평균 생존시간(17.7±5.3주)이 단독 복용군과 유사하였다.

또한, PAM4의 치료연구는 동소성 종양모델를 사용하였다. 4주의 동소성 종양(종양무게 0.25g)를 갖는 동물의 군은 비처리되거나 350μCi¹³¹I-PAM4 또는¹³¹I-비특이성 Ag8의 350μCi의 단독 복용으로 처리하였다. 비처리된 동물은 10주까지 50%의 사망율을 나타나고 15주에서 생존자가 없었다. 동물들은¹³¹I-비특이성 Ag8로 4주에서 처리하고, 7주에서 50% 사망율을 나타나고 14주에서 생존자가 없었다. 통계적으로(logrank 분석) 상기 두 군사이에서 차이가 없지만, 방사성 독성은 Ag8 처리된 동물의 절반에서 발생하였다. 그러나, 방사성라벨화된 PAM4은 비처리되거나 Ag8 처리된 동물과 비교하여 생존평균(p〈0.001)를 제공하고, 실험의 말미 16주에서 70%의 생존을 나타났다. 상기 시간에서 생존 동물은 종양크기를 결정하기 위해 희생하였다. 모든 동물은 1.2g의 평균무게를 갖는 종양을 갖으며, 7마리 동물 중 4마리에서 하나 또는 2개의 작은(〈0.1g) 전이증거를 나타냈다. 16주 성장에서 상기 종양은 8주 종양의 전형예가 있었다.

실시예 6 - 젬자르(Gemzar) 화학요법(chemotherapy) 및 ¹³¹ I-PAM4 방사성면역치료법의 조합 양태

초기연구는¹³¹I-PAM4 방사성면역 치료법과 젬시타빈(gemcitabine)의 조합된 사용으로 바둑판 배열로 수행하였으며;¹³¹I-PAM4([MTD] = 700μCi] MTD의 100%, 75%, 50% 0%)의 단독복용에 대하여 젬자르(0, 100, 200, 500㎎/㎏)의 단독복용이다. 조합된 MTD는 350μCi¹³¹I-PAM4(50%MTD)와 500㎎/㎏ 젬자르로 확인되었다. 체중의 손실로 측정되는 독성은 비독성으로 간주되는 최대였으며; 체중 20% 손실이다. 조합된 치료프로토콜이 젬마르 단독보다 현저히 효율적이었지만, 치료는 방사성면역성치료 단독보다 보다 효율적임이 없었다. 다음 연구는 상승작용의 치료적 효과가 관측된다면 젬마르 및 방사성면역성치료의 저 복용량으로 수행되었다. 대략 1㎤의 종양(대략 체중의 5%)을 갖는 동물들은 0, 3, 6, 9 및 12일에 젬마르 100㎎/㎏, 0일에 100μCi¹³¹I-PAM4으로 투여하였다. 치료성 효과는 통계적으로 현저한(p〈0.0001) 경감(5개 종양 중 2개가 0.1㎤ 미만) 및/또는 젬마르 단독과 비교하여 종양의 성장억제가 관측되었다. 게다가, 체중의 관점에서 독성은 관측되지 않았다. 필요하다면 조합치료 프로토콜은 4주에서 상기의 방사선명역치료법 단독으로 시작하여 2차 치료순환으로 다 순환에서 전달될 수 있다.

실시예 7 - 수술불능의 췌장암을 갖는 환자의 치료

췌장의 과도하고 수술불능의 선암(adenocarcinoma)을 갖고 실질적인 체중손실(30lbs 이상), 무기력(lethargy) 및 허약(weakness)한 56세의 남성에게⁹⁰Y-PAM4 방사성라벨화된 키메라화 항체를 90-Y 30mCi 및 항체 단백질 50㎎의 복용으로 정맥주입으로 2시간동안 투여하였다. 5일 후, 환자를 젬시타빈 화학요법의 표준과정을 하였다. 치료에서 몇 달후 부작용의 증거가 없다면, 치료 요법을 반복한다. 몇주 후 치료동안 환자는 더 활성적이고 체중 손실이 늦어질 것으로 예상된다. 췌장의 CT 스캔은 안정한 질병 또는 종양질량의 약한 감소가 있는 것으로 예상된다. 컴퓨터단층촬영에 의한 몇달 후 반복조사는 종양질량의 실질적 경감이 있음을 나타났으며, 따라서 환자는 췌장 종양질량의 절제가 고려될 수 있을 수 있다.

실시예 8 - 이특이성 PAM4 x 734 및 ^99m Tc- 또는 ¹¹¹ In-라벨화된 펩티트 합텐으로 예비표적화

예비표적화된 접근을 사용한 췌장암의 영상을 위해 키메라화 PAM4(cPAM4) Fab' 및 쥐 734(m734)Fab'로 이루어진 이특이성 F(ab')₂항체(bsMAb)를 제조하였다. m734 항체는 In-DTPA 복합체로 인지된다. 상기 bsMAb는¹²⁵I로 라벨화하고 인간 췌장암 이종이식(CaPan1)을 갖는 가슴샘이 없는 쥐에 주입(7μCi;15㎍)하였다. 키메라화 리툭시맵(rituximab) (항-CD20 단클론 항체)으로부터의 비표적화 F(ab')₂bsMAb 및 m734은¹³¹I로 라벨화되고, 대조군으로 함께 주입되었다. 다양한 시간(주입 후 4, 24, 36, 48 및 72시간)에서 쥐들을 해부하고, 조직을 제거하여 그램당 주입된 복용량 퍼세트(% ID/g)를 결정하기 위해 산출하였다. 대조군 bsRituximab와 비교하여 각 시간에서 bsPAM4의 종양흡수가 현저히 높았다(p〈0.032 이상). 예비표적화 시스템의 상기 형태로 우리의 과거 경험으로 1 %ID/g 미만의 혈액수준이 우수한 종양:비종양 비율을 얻기 위해 필요한 것을 제안하였다. bsPAM4의 후-투여 36시간에서 혈액에서 1.10±0.4 %ID/g이었으며, 주입 후 48시간에서 0.56±0.08 %ID/g으로 떨어졌다. 상기 2개의 시간에서 종양흡수는 각각 6.43±1.50 %ID/g 및 5.37±2.37 %ID/g이었다. 상기 값은 36 및 18시간에서 각각 종양의 0.65±0.33 %ID/g 및 0.47±0.19 %ID/g를 갖는 대조군 bsRituximab보다 현저히 높았다((p〈0.018 및 (p〈0.0098). 그러나, 혈액 제거율은 매우 유사하였으며, 현저한 차이는 없었다.

상기 결과를 바탕으로 예비표적화 실험은 방사성라벤화된 펩티드-합텐을 bsMAb 투여 후 40시간에서 주입한 쥐들이 갖는 CaPan1 종양에서 수행하였다. IMP-192 및 IMP-156의 두개의 펩티드를 사용하였으며, 각각은 734 MAb를 인지하기 위해 이가 DTPA를 함유하고 하나는^99mTc를 안정하게 결합하기 위해 부가적인 특이성 그룹을 갖고 있다. 종양 함유 쥐(종양부피 ~0.3㎤)는¹²⁵I-bsPAM4(6μCi;15㎍)를 투여하였으며, 이어 방사성라벨화된 펩티드-합텐(34.5μCi;1.5×10^-11몰 ;bsMAb:펩티드 = 10:1)으로 40시간 후에 투여하였다. 쥐의 한 그룹은^99mTc-라벨화된 IMP-192를 주었으며, 쥐의 두번째 그룹은¹¹¹In-라벨화된 IMP-156을 주었다. 비-특이성 표적화를위한 대조군은 방사성라벨화된 펩티드의 투여에 앞서¹²⁵I-bsRituximab를 부여한 2개의 그룹 및¹¹¹In- 또는^99mTc-라벨화된 펩티드 단독으로 부여한 2개의 다른 그룹을 포함하였다.

쥐들은 펩티드 투여 후 3 및 24시간에서 희생되었으며, 종양 및 다양한 조직에서 % ID/g을 결정하였다. 우리의 상기 결과와 일치하게, 비표적화 대조군 bsRituximab와 비교하여 종양에서 각각 8.2±3.4 % 및 0.3±0.08 %로 bsPAM4가 현저히 컸다(p〈0.0001). 이는¹¹¹In-IMP156의 종양흡수가 현저히 큰것으로 해석되었다(20.2±5.5 %ID/g 대 0.9±0.1 %ID/g, p〈0.0001). 또한, bsRituximab으로 예비표적화된 것과 비교하여 bsPAM4로 예비표적화된 쥐에서^99mTc-IMP192의 종양흡수가 현저히 컸다(16.8±4.8 %ID/g 대 1.1±0.2 %ID/g, p〈0.0005). 단독으로 투여할 경우 각 펩티드의 종양흡수는 bsPAM4를 부여한 쥐보다 작았다(^99mTc-IMP192 및¹¹¹In-IMP156에서 각각 0.2±0.05 %ID/g 및 0.1±0.03 %ID/g, p〈0.0001).

3시간에서 bsRituximab보다 펩티드(bsPAM4 투여 후 64시간)의 주입 후 24시간에서 종양은 bsPAM4보다 더 현저하였다(6.4±2.2 %ID/g 대 0.2±0.09 %ID/g, p〈0.0001). 상기 시간에서 bsPAM4로 예비표적화된 쥐의 종양에서¹¹¹In-IMP156은 11.1±3.5 %ID/g 대^99mTc-IMP192에서 12.9±4.2 %ID/g인 대하여 bsRIT 예비표적화된 종양에서 0.5±0.2 %ID/g 및 0.4±0.03 %ID/g이었다(각각 p〈0.0008 및 p〈0.0002).펩티드 단독을 부여한 쥐에서 bsPAM4로 예비표적화된 펩티드와 비교하여 종양에서^99mTc-IMP192(0.06±0.02 %ID/g, p〈0.0007) 및¹¹¹In-IMP156(0.09±0.02 %ID/g, p〈0.0002)로 현저히 낮았다.

초기 시간에서 종양:비종양 조직 비율

	예비표적화된111In-펩티드	예비표적화된99mTc-펩티트	125I-bsPAM4 F(ab')2
	3시간	3시간	4시간
조직	평균	±STD	평균	±STD	평균	±STD
종양	1.00	0.00	1.00	0.00	1.00	0.00
간	36.07	11.74	16.66	7.19	2.34	0.61
비장	33.40	20.62	14.62	9.12	2.15	0.74
신장	7.79	2.81	8.13	3.33	1.10	0.20
폐	44.55	12.99	15.75	5.85	1.58	0.37
혈액	36.47	8.28	9.93	5.21	0.47	0.11
뼈	123.24	40.00	-	-	-	-
W.bone	378.00	124.57	-	-	-	-
췌장	155.55	30.07	73.29	32.85	4.65	1.23
종양 중량(g)(±STD)	0.189	(0.070)	0.174	(0.050)	0.179	(0.139)

상기 표는 방사선라벨화된 생산물의 투여 후 초기 시간에서 상기 그룹의 다양한 조직의 종양:비종양(T:NT)를 나타낸다. PAM4 x m734 F(ab')₂의 투여 후 4시간에서 종양:혈액 비율은 2:1 미만임을 나타내는 것이 중요하다. 그러나, 투여 후 3시간에서 예비표적화된¹¹¹In-IMP156 및^99mTc-IMP192은 관측된 모든 조직에서 종양:비종양 비율이 현저히 컸으며, 특히 종양:혈액 비율은 36:1 및 9:1로 동일하였다(각각 p〈0.001 및 p〈0.011). 우리가 24시간에서 종양:혈액을 관측할 경우, 예비표적화된¹¹¹In-IMP156 및^99mTc-IMP192은 각각 274:1 및 80:1로 현저히 높은 값을 나타났으며, 반면¹²⁵I-bsPAM4 단독은 4:1이다(p〈0.0002). 상기 결과는 비표적화된 bsPAM4를 이용한 가능성은 비종양 조직에 최소 방사선복용량으로 종양에 고 방사선 복용량으로 전달하는 짧은 반감기, 높은 에너지 방사성동위원소로 접급한다.

다양한 변화 및 변이가 본 발명의 생산물, 조성물, 방법 및 제조방법이 될 수 있음은 당업계의 당업자에게는 명백한 것이다. 따라서, 본 발명은 청구범위내에서 제공되는 상기의 변화 및 변이를 포함하고자 한다.

상기의 모든 공개가 각각 참고적으로 합쳐졌다면 동일범위에서 전체범위로 참고적으로 합쳐진다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 키멜릭화된 PAM4 항체 및 그 단편에 관한 것으로, 본 발명의 키멜릭화된 PAM4 항체 및 그 단편은 췌장암 등 종양의 진단 및 치료에 유용히 사용될 수 있다.

<110> IMMUNOMEDICS, INC. <120> MONOCLONAL ANTIBODY PAM4 AND ITS USE FOR DIAGNOSIS AND THERAPY OF PANCREATIC CANCER <130> FPC-0412008 <140> PCT/GB03/02585 <141> 2003-06-16 <150> US 60/388,313 <151> 2002-06-14 <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic chimerized PAM4 antibody fragment <400> 1 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic chimerized PAM4 antibody fragment <400> 2 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic chimerized PAM4 antibody fragment <400> 3 His Gln Trp Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic chimerized PAM4 antibody fragment <400> 4 Ser Tyr Val Leu His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic chimerized PAM4 antibody fragment <400> 5 Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic chimerized PAM4 antibody fragment <400> 6 Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Phe Lys Tyr Lys 1 <210> 8 <211> 324 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 8 gat att gtg atg acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cct ggg 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag aag gtc acc atg acc tgc agt gcc agc tca agt gta agt tcc agc 96 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ttg tac tgg tac cag cag aag cca gga tcc tcc ccc aaa 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Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Asn Arg Tyr Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 10 <211> 357 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 10 gag gtt cag ctg cag gag tct gga cct gag ctg gta aag cct ggg gct 48 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct gga tac aca ttc cct agc tat 96 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr 20 25 30 gtt ttg cac tgg gtg aag cag aag cct ggg cag ggc ctt gag tgg att 144 Val Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat att aat cct tac aat gat ggt act cag tac aat gag aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aaa ggc aag gcc aca ctg act tca gac aaa tcg tcc agc aca gcc tac 240 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctc agc cgc ctg acc tct gag gac tct gcg gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga ggc ttc ggt ggt agc tac gga ttt gct tac tgg ggc caa ggg 336 Ala Arg Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 act ctg atc act gtc tct gca 357 Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala 115 <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr 20 25 30 Val Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala 115 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric PAM4Vk <400> 12 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Asn Arg Tyr Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric PAM4Vh <400> 13 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr 20 25 30 Val Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Ile Thr Val Ser Ala 115 <210> 14 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric PAM4Vk <400> 14 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Asn Arg Tyr Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Chimeric PAM4Vh <400> 15 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Ser Tyr 20 25 30 Val Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Phe Gly Gly Ser Tyr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser 115

Claims (149)

1. MUC1 반복 도메인의 아미노 말단과 도입부 사이에 위치하는 도메인에 결합하고, 뮤신에 의한 면역화 및/또는 선발에 의해 유래된 항체 또는 그 단편.
2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 췌장암의 뮤신에 대항해서 생성된 항체 또는 그 단편.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 PAM4 항체 또는 그 단편인 항체 또는 그 단편.
4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 키메라화된 항체 또는 그 단편.
5. 제3항에 있어서, 뮤린(murine)의 PAM4 단클론항체의 상보성 결정 영역(CDRs) 및 구조영역(FR)과 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 특정 영역을 포함하되,

   키메라화된 PAM4 단클론항체의 경쇄 변이 영역의 CDRs은 아미노산 서열 SASSSVSSSYLY를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 STSNLAS을 포함하는 CDR2, 아미노산 서열 HQWNRYPYT를 포함하는 CDR3를 포함하고,

   키메라화된 안티-PAM4 단클론항체의 중쇄 변이 영역의 CDRs은 아미노산 서열 SYVLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 YINPYNDGTQYNEKFKG를 포함하는 CDR2, 아미노산 서열 GFGGSYGFAY를 포함하는 CDR3를 포함하는 키메라화된 항체 및 그 단편.
6. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 도 1A의 PAM4Vκ 뉴클레오티드 서열 및 도 1B의 PAM4 V_H뉴클레오티드 서열을 하나 이상 포함하는 항체 또는 그 단편.
7. 암세포에 결합되는 제1항의 항체 또는 그 단편을 포함하고 하나 이상의 진단제 및/또는 하나 이상의 치료제에 결합되어 있는 항체 성분을 포함하는 암세포 표적화 진단 또는 치료 접합체.
8. 제7항에 있어서, 상기 진단/검출제는 방사성핵종, 조영제(contrast agent) 및 광활성 진단/검출제로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 접합체.
9. 제8항에 있어서, 상기 진단/검출제는 방사성핵종인 진단 접합체.
10. 제9항에 있어서, 상기 방사성핵종이 20 내지 4,000 keV의 에너지를 갖는 진단 접합체.
11. 제10항에 있어서, 상기 방사성핵종이 감마-, 베타- 또는 양전자-방사 동위원소인 진단 접합체.
12. 제11항에 있어서, 상기 방사성핵종이¹¹⁰In,¹¹¹In,¹⁷⁷Lu,¹⁸F,⁵²Fe,⁶²Cu,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁸⁶Y,⁹⁰Y,⁸⁹Zr,^94mTc,⁹⁴Tc,^99mTc,¹²⁰I,¹²³I,¹²⁴I,¹²⁵I,¹³¹I,^154-158Gd,³²P,¹¹C,¹³N,¹⁵O,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,⁵¹Mn,^52mMn,⁵⁵Co,⁷²As,⁷⁵Br,⁷⁶Br,^82mRb,⁸³Sr 또는 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 컨쥬케이트.
13. 제8항에 있어서, 상기 진단/검출제가 조영제인 진단 접합체.
14. 제13항에 있어서, 상기 조영제가 상자성 이온인 진단 접합체.
15. 제14항에 있어서, 상기 상자성 이온이 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)을 포함하는 금속인 진단 접합체.
16. 제13항에 있어서, 상기 조영제가 란탄(III), 금(III), 납(II) 및 특히 비스무스(III)를 포함하는 금속인 진단 접합체.
17. 제13항에 있어서, 상기 조영제가 초음파 향상제인 진단 접합체.
18. 제17항에 있어서, 상기 초음파 향상제가 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함하는 리포좀(liposome)인 진단 접합체.
19. 제18항에 있어서, 상기 리포솜이 가스로 채워진 진단 접합체.
20. 제13항에 있어서, 상기 조영제가 요오드 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물 및 탈륨 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사선 불투과성 물질인 진단 접합체.
21. 제20항에 있어서, 상기 방사선 불투과성 물질이 바륨, 디아트리조에이트(diazotriate), 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 갈륨 사이트레이트(gallium citrate), 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오세타믹산(iocetamic acid), 이오다미드(iodamide), 이오디파미드(iodipamide), 이오독사믹산(iodoxamic acid), 이오굴라미드(iogulamide), 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌(iopamidol), 이오파노익산(iopanoic acid), 이오프로세믹산(ioprocemic acid), 이오세파믹산(iosefamic acid), 이오세릭산(ioseric acid), 이오술라미드 메글루민(iosulamide meglumine),이오세메틱산(iosemetic acid), 이오타술(iotasul), 이오테트릭산(iotetric acid), 이오탈라믹산(iothalamic acid), 이오트록식산(iotroxic acid), 이옥사글릭산(ioxaglic acid), 이옥소트리조익산(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리자미드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리오돈(propyliodone) 및 탈로스 클로라이드(thallous chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 접합체.
22. 제8항에 있어서, 상기 진단/검출제가 광활성 진단/검출제인 진단 접합체.
23. 제22항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin),o-프탈데하이드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 표지 화합물인 진단 접합체.
24. 제22항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향성 아크리디늄 에스테르(aromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄염(acridinium salt) 및 옥살레이트 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학발광 표지 화합물인 진단 접합체.
25. 제22항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린(aequorin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오형광 화합물인 진단 접합체.
26. 제8항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접합체는 수술중, 내시경, 또는 혈관내 종양 진단에 사용되는 진단 접합체.
27. 제7항에 있어서, 상기 치료제는 방사성핵종, 면역조절제(immunomodulator), 호르몬, 호르몬 길항제, 올리고뉴클레오티드, 효소, 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성제(cytotoxic agent), 혈관형성 억제제(angiogenesis inhibitor) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 접합체.
28. 제27항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)인 치료 접합체.
29. 제28항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 종양 유전자(oncogene)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 치료 접합체.
30. 제29항에 있어서, 상기 종양 유전자가 bcl-2 또는 p53인 치료 접합체.
31. 제27항에 있어서, 상기 치료제가 세포독성제인 치료 접합체.
32. 제31항에 있어서, 상기 세포독성제가 약물 또는 독소인 치료 접합체.
33. 제32항에 있어서,상기 약물이 세포분열저지제(antimitotic agent), 알킬화제, 대사길항제(antimetabolite agent), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 알칼로이드 및 항생제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 특성을 갖는 치료 접합체.
34. 제32항에 있어서, 상기 약물이 질소 머스타드(nitrgen mustards), 제미사이타빈(gemicitabine), 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazenes), 폴릭산 유사체(folic acid analog), 안트라사이클린(anthracyclines), 탁산(taxanes), SN-38, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 효소 억제제, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 백금 배위 착물, 유사분열억제제(vinca alkaloid), 치환 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 호르몬 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(camptothecins), 독소루비신(doxorubicins) 및 이들의 유사체, 대사길항제, 알킬화제, 세포분열저지제(antimitotic), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 메트로트렉세이트(metrotrexate), CPT-11 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료접합체.
35. 제32항에 있어서, 상기 독소가 동물, 식물 및 미생물 근원으로 이루어진 군으로부터 선택된 근원으로부터 유래되는 치료 접합체.
36. 제32항에 있어서, 상기 독소가 리신(ricin), 아브린(abrin), 알파 독소(alpha toxin), 사포린(saporine), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코칼 엔테로톡신-A(staphylcoccalenterotoxin-A), 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antivirul protein), 젤로닌(gelonin), 디프테린 독소(diphtherin toxin), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 및 슈도모나스 내독소(pseudomonas endotoxin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 접합체.
37. 제27항에 있어서, 상기 치료제가 면역조절제인 치료 접합체.
38. 제37항에 있어서, 상기 면역조절제가 사이토카인(cytokine), 줄기 세포 성장 인자(stem cell growth factor), 세포장애인자(lymphotoxin), 조혈인자(hematopoietic factor), 균체자극인자(colony stimulating factor, CSF), 인터페론(IFN), 줄기세포 성장 인자, 적혈구생성촉진인자(erythropoietin), 혈소판증식인자(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 접합체.
39. 제38항에 있어서, 상기 세포장애인자가 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 이고, 상기 조혈인자가 인터루킨(IL)이고, 상기 균체자극인자가 과립구-균체자극인자(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF) 또는 과립구 대식세포-균체자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GMCSF)이고, 상기 인터페론이 인터페론-α, -β 또는 -γ이고, 상기 줄기세포 성장 인자가 "S1 인자"로 표시되는 치료 접합체.
40. 제37항에 있어서, 상기 면역조절제가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-γ, TNF-α 또는 그 조합인 치료 접합체.
41. 제27항에 있어서, 상기 치료제가 방사성핵종인 치료 접합체.
42. 제41항에 있어서, 상기 방사성핵종이 60 내지 700 keV의 에너지를 갖는 치료 접합체.
43. 제42항에 있어서, 상기 방사성핵종이³²P,³³P,⁴⁷Sc,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷GA,⁸⁶Y,⁹⁰Y,¹¹¹Ag,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I,¹⁴²Pr,¹⁵³Sm,¹⁶¹Tb,¹⁶⁶Dy,¹⁶⁶Ho,¹⁷⁷Lu,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁸⁹Re,²¹²Pb,²¹²Bi,²¹³Bi,²¹¹At,²²³Ra 및²²⁵Ac 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬케이트.
44. 제27항에 있어서, 상기 치료제가 광활성 치료제인 치료 접합체.
45. 제44항에 있어서, 상기 광활성 치료제가 색원체(chromogens) 및 염료(dye)로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 접합체.
46. 제27항에 있어서, 상기 치료제가 효소인 치료 접합체.
47. 제46항에 있어서, 상기 효소가 말레이트 데하이드로제나제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라아제(delta-V-steroid isomerase), 이스트 알콜 데하이드로제나아제, α-글리세로포스페이트 데하이드로제나아제, 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phosphate isomerase), 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 옥시다아제, β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 접합체.
48. MUC1 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 헵텐분자에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 헵텐 결합 부위를 포함하는 다가 다중특이성 항체 또는 그 단편.
49. 제48항에 있어서, 상기 항체가 키메라화된 항체 또는 그 단편.
50. 제49항에 있어서, 진단제 또는 치료제를 더 포함하는 항체 또는 그 단편.
51. 제3항의 PAM4 단클론항체 또는 그 단편을 둘 이상 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
52. 하나 이상의 제1항의 제1 PAM4 안티-PAM4 단클론항체 또는 그 단편 및 PAM4 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 하나 이상의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
53. 제52항에 있어서, 상기 제2 단클론항체는 암종(carcinoma)-결합 항체인 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
54. 제47항에 있어서, 상기 암종-결합 항체가 췌장암 항원에 결합하거나 췌장암으로부터 유래한 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
55. 제47항에 있어서, 상기 암종-결합 항체가 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
56. 제51항에 있어서, 상기 융합 단백질 또는 그 단편이 하나 이상의 진단/검출제 및/또는 치료제를 포함하는 항체 융합 단백질.
57. 제1항의 PAM4 단클론항체 또는 그 단편;

    상기 단클론항체 또는 그 단편을 둘 이상 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편;

    상기 제1항의 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 하나 이상의 제1 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 및 PAM4 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 하나 이상의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편; 및

    상기 제1항의 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 하나 이상의 제1 단클론항체 및 그 단편, 및 제1항의 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 하나 이상의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 포함하고, 상기 제2 단클론항체는 CA19.9, DUPAN2,SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 융합 단백질 또는 그 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단클론항체 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 서열.
58. 제57항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
59. 제57항의 DNA 서열을 포함하는 숙주세포.
60. (i) 하나 이상의 진단/검출제 및/또는 치료제에 접합체 되어 있는 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 및 (ii) 필요한 환자에게 제7항의 진단 또는 치료 접합체를 투여하는 단계를 포함하는, 진단제 또는 치료제 또는 이들의 조합을 표적에게 전달하는 방법.
61. 제60항에 있어서, 상기 진단/검출제는 방사성핵종, 조영제 및 광활성 진단/검출제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
62. 제61항에 있어서, 상기 진단/검출제가 방사성핵종인 방법.
63. 제62항에 있어서, 상기 방사성핵종이 20 내지 4,000 keV의 에너지를 갖는 방법.
64. 제63항에 있어서, 상기 방사성핵종이 감마-, 베타-, 또는 양전자-방사 동위원소인 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 방사성 핵종이¹¹⁰In,¹¹¹In,¹⁷⁷Lu,¹⁸F,⁵²Fe,⁶²Cu,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷Ga,⁶⁸Ga,⁸⁶Y,⁹⁰Y,⁸⁹Zr,^94mTc,⁹⁴Tc,^99mTc,¹²⁰I,¹²³I,¹²⁴I,¹²⁵I,¹³¹I,^154-158Gd,³²P,¹¹C,¹³N,¹⁵O,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,⁵¹Mn,^52mMn,⁵⁵Co,⁷²As,⁷⁵Br,⁷⁶Br,^82mRb,⁸³Sr 또는 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
66. 제61항에 있어서, 상기 진단/검출제가 조영제인 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 조영제가 상자성 이온인 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 상자성 이온이 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)을 포함하는 금속인 방법.
69. 제66항에 있어서, 상기 조영제가 란탄(III), 금(III), 납(II) 및 특히 비스무스(III)를 포함하는 금속인 방법.
70. 제66항에 있어서, 상기 조영제가 초음파 향상제인 방법.
71. 제70항에 있어서, 상기 초음파 향상제가 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함하는 리포좀(liposome)인 방법.
72. 제71항에 있어서, 상기 리포좀이 가스로 채워진 방법.
73. 제66항에 있어서, 상기 조영제가 요오드 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물 및 탈륨 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사선 불투과성 물질인 방법.
74. 제73항에 있어서, 상기 방사선 불투과성 물질이 바륨, 디아트리조에이트(diazotriate), 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 갈륨 사이트레이트(galliumcitrate), 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오세타믹산(iocetamic acid), 이오다미드(iodamide), 이오디파미드(iodipamide), 이오독사믹산(iodoxamic acid), 이오굴라미드(iogulamide), 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌(iopamidol), 이오파노익산(iopanoic acid), 이오프로세믹산(ioprocemic acid), 이오세파믹산(iosefamic acid), 이오세릭산(ioseric acid), 이오술라미드 메글루민(iosulamide meglumine), 이오세메틱산(iosemetic acid), 이오타술(iotasul), 이오테트릭산(iotetric acid), 이오탈라믹산(iothalamic acid), 이오트록식산(iotroxic acid), 이옥사글릭산(ioxaglic acid), 이옥소트리조익산(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리자미드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리오돈(propyliodone) 및 탈로스 클로라이드(thallous chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
75. 제61항에 있어서, 상기 진단제가 광활성 진단제인 방법.
76. 제75항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin),o-프탈데하이드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 표지 화합물인 방법.
77. 제75항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향성 아크리디늄 에스테르(aromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄염(acridinium salt) 및 옥살레이트 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학발광 표지 화합물인 방법.
78. 제75항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린(aequorin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오형광 화합물인 방법.
79. 제60항에 있어서, 상기 치료제는 세포사멸제, 사이토카인, 면역조절제, 호르몬, 호르몬길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 조영제, 올리고뉴클레오티드, 효소, 효소 억제제 및 광활성 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
80. 제79항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)인 치료 접합체.
81. 제80항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 종양 유전자(oncogene)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 치료 접합체.
82. 제81항에 있어서, 상기 종양 유전자가 bcl-2 또는 p53인 치료 접합체.
83. 제79항에 있어서, 상기 치료제가 세포독성제인 방법.
84. 제83항에 있어서, 상기 세포독성제가 약물 또는 독소인 방법.
85. 제84항에 있어서,상기 약물이 세포분열저지제(antimitotic agent), 알킬화제, 대사길항제(antimetabolite agent), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 알칼로이드 및 항생제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 특성을 갖는 방법.
86. 제84항에 있어서, 상기 약물이 질소 머스타드(nitrgen mustards), 제미사이타빈(gemicitabine), 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazenes), 폴릭산 유사체(folic acid analog), 안트라사이클린(anthracyclines), 탁산(taxanes), SN-38, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 효소 억제제, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 백금 배위 착물, 유사분열억제제(vinca alkaloid), 치환 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 호르몬 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(camptothecins), 독소루비신(doxorubicins) 및 이들의 유사체, 대사길항제, 알킬화제, 세포분열저지제(antimitotic), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 메트로트렉세이트(metrotrexate) CPT-11 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
87. 제84항에 있어서, 상기 독소가 동물, 식물 및 미생물 근원으로 이루어진 군으로부터 선택된 근원으로부터 유래되는 방법.
88. 제87항에 있어서, 상기 독소가 리신(ricin), 아브린(abrin), 알파 독소(alpha toxin), 사포린(saporine), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코칼 엔테로톡신-A(staphylcoccalenterotoxin-A), 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antivirul protein), 젤로닌(gelonin), 디프테린 독소(diphtherin toxin), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 및 슈도모나스 내독소(pseudomonas endotoxin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
89. 제79항에 있어서, 상기 치료제가 면역조절제인 방법.
90. 제89항에 있어서, 상기 면역조절제가 사이토카인(cytokine), 줄기 세포 성장 인자(stem cell growth factor), 세포장애인자(lymphotoxin), 조혈인자(hematopoietic factor), 균체자극인자(colony stimulating factor, CSF), 인터페론(IFN), 줄기세포 성장 인자, 적혈구생성촉진인자(erythropoietin), 혈소판증식인자(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
91. 제90항에 있어서, 상기 세포장애인자가 종양 괴사 인자(tumor necrosisfactor, TNF) 이고, 상기 조혈인자가 인터루킨(IL)이고, 상기 균체자극인자가 과립구-균체자극인자(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF) 또는 과립구 대식세포-균체자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GMCSF)이고, 상기 인터페론이 인터페론-α, -β 또는 -γ이고, 상기 줄기세포 성장 인자가 "S1 인자"로 표시되는 방법.
92. 제89항에 있어서, 상기 면역조절제가 사이토카인인 방법.
93. 제90항에 있어서, 상기 면역조절제가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-γ, TNF-α 또는 그 조합인 방법.
94. 제79항에 있어서, 상기 치료제가 방사성핵종인 방법.
95. 제94항에 있어서, 상기 방사성핵종이 60 내지 700 keV의 에너지를 갖는 방법.
96. 제95항에 있어서, 상기 방사성핵종이³²P,³³P,⁴⁷Sc,⁶⁴Cu,⁶⁷Cu,⁶⁷GA,⁸⁶Y,⁹⁰Y,¹¹¹Ag,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I,¹⁴²Pr,¹⁵³Sm,¹⁶¹Tb,¹⁶⁶Dy,¹⁶⁶Ho,¹⁷⁷Lu,¹⁸⁶Re,¹⁸⁸Re,¹⁸⁹Re,²¹²Pb,²¹²Bi,²¹³Bi,²¹¹At,²²³Ra 및²²⁵Ac 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
97. 제79항에 있어서, 상기 치료제가 광활성 치료제인 방법.
98. 제97항에 있어서, 상기 광활성 치료제가 색원체(chromogens) 및 염료(dye)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
99. 제79항에 있어서, 상기 치료제가 효소인 방법.
100. 제99항에 있어서, 상기 효소가 말레이트 데하이드로제나제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라아제(delta-V-steroid isomerase), 이스트 알콜 데하이드로제나아제, α-글리세로포스페이트 데하이드로제나아제, 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phosphate isomerase), 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 옥시다아제, β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-5-포스페이트 데하이드로제나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
101. 제48항의 항체 또는 그 단편을 환자에게 투여하는 단계;

     소정량의 비-항체 단백질이 환자의 혈류를 깨끗이 하도록 충분한 시간을 기다리는 단계; 및

     상기 항체의 결합 부위에 결합하는, 진단/검출제, 치료제 또는 그 조합을 포함하는 담체 분자를 상기 환자에게 투여하는 단계

     를 포함하는 진단/검출제, 치료제 또는 이들의 조합을 표적에 전달하는 방법.
102. 제101항에 있어서, 상기 담체 분자가 상기 항체의 하나 이상의 결합 부위에 결합하는 방법.
103. 제101항에 있어서, 상기 진단/검출제 또는 상기 치료제가 동위원소, 약물, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항체, 올리고뉴클레오티드, 효소, 효소 억제제, 성장인자, 방사성핵종 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
104. 제103항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
105. 제104항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 종양유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
106. 제105항에 있어서, 상기 종양 유전자가 bcl-2 또는 p53인 방법.
107. 제50항의 항체 또는 그 단편을 필요한 환자에게 투여하는 단계;

     소정량의 비-항체가 환자의 혈류를 깨끗이 하도록 충분한 시간을 기다리는 단계; 및

     상기 항체의 결합부위에 결합하는, 진단/검출제, 치료제 또는 그 조합을 포함하는 담체 분자를 상기 환자에게 투여하는 단계

     를 포함하는 암의 진단 또는 치료 방법.
108. 제107항에 있어서, 상기 암이 췌장암인 방법.
109. 제107항에 있어서, 상기 방법이 질병 조직의 수술중 동정, 질병 조직의 내시경 동정 또는 질병 조직의 혈관내 동정에 사용될 수 있는 방법.
110. 하나 이상의 치료제에 결합되어 있는 제1항의 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및

     선택적으로, 상기 PAM4 항체 또는 그 단편을 약학적으로 적절한 부형제로 제형화하는 단계

     를 포함하는 환자의 악성 종양을 치료하는 방법.
111. 제110항에 있어서, PAM4 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 제2 단클론항체 또는 그 단편을 더 포함하는 방법.
112. 제111항에 있어서, 상기 제2 단클론항체 또는 그 단편이 단클론항체 자체 또는 그 단편인 방법.
113. 제111항에 있어서, 상기 제2 단클론항체 또는 그 단편이 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
114. 제111항에 있어서, 상기 제2 단클론항체 또는 그 단편이 치료제 또는 진단/검출제에 접합체 되어 있는 방법.
115. 제110항에 있어서, 제2 PAM4 단클론항체 또는 그 단편을 더 포함하는 방법.
116. 제110항에 있어서, 상기 PAM4 항체가 비경구 투여되는 방법.
117. 제116항에 있어서, 상기 PAM4 항체가 매 복용 당 20 내지 2000 밀리그램 단백질의 복용량으로 투여되는 방법.
118. 제117항에 있어서, 상기 복용량이 반복적으로 투여되는 방법.
119. 제110항에 있어서, 상기 PAM4 항체가 키메라화된 PAM4 항체인 방법.
120. 제119항에 있어서, 상기 키메라화된 PAM4 항체의 특정영역 및 경첩부는 인간 IgG의 특정영역 및 경첩부를 포함하는 방법.
121. 제110항에 있어서, 상기 악성 종양에 의해 발현되는 제2 종양 마커와 반응성이 있는 제2 항체 자체 또는 제2 접합체 항체가 상기 환자에게 투여되기 전, 투여될 때 같이, 또는 투여된 후에 상기 PAM4 항체가 투여되는 방법.
122. 제110항에 있어서, 하나 이상의 치료제 또는 진단/검출제가 상기 환자에게 투여되기 전, 동시에, 또는 그 후에 상기 PAM4 항체가 투여되는 방법.
123. 하나 이상의 진단/검출제에 접합체 되어 있는, PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 PAM4 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 진단 컨쥬게이트의 진단학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및

     선택적으로, 상기 PAM4 항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 약학적으로 적절한 부형제로 제형화하는 단계

     를 포함하는 환자의 악성 종양 진단 방법.
124. 제1항의 PAM4 단클론항체 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편을 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및

     선택적으로, 상기 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 약학적으로 적절한 부형제로 제형화하는 단계

     를 포함하는 환자의 암세포 치료방법.
125. 제124항에 있어서, 상기 조성물이 제2 항체 자체 또는 그 단편을 더 포함하는 방법.
126. 제125항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 MUC1 반복 도메인의 아미노 말단 및 도입부 사이에 위치하는 방법.
127. 제125항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 PAM4 단클론항체 또는 그단편이 아닌 방법.
128. 제125항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
129. 제127항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLe^a, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
130. 제124항에 있어서, 상기 PAM4 항체 자체가 비경구 투여되는 방법.
131. 제130항에 있어서, 상기 PAM4 항체 자체가 매 복용 당 20 내지 2000 밀리그램 단백질의 복용량으로 투여되는 방법.
132. 제131항에 있어서, 상기 복용량이 반복적으로 투여되는 방법.
133. 제124항에 있어서, 상기 PAM4 항체가 키메라화된 PAM4 항체 또는 그 단편인 방법.
134. 제133항에 있어서, 상기 PAM4 항체 자체의 특정부 및 경첩부는 인간 IgG의 특정부 및 경첩부를 포함하는 방법.
135. 제125항에 있어서, 항체 자체가 상기 환자에게 투여되기 전, 투여될 때 같이, 또는 투여된 후에 상기 PAM4 항체 자체가 투여되는 방법.
136. 제124항에 있어서, 치료제 및/또는 진단/검출제 전, 동시, 또는 후에 상기 PAM4 항체 자체가 투여되는 방법.
137. 제1항의 PAM4 단클론항체 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편을 포함하는 조성물로써 환자의 표본에 대해 시험관내(in vitro) 진단 분석을 행하는 것을 포함하는 환자의 악성 종양 진단 방법.
138. 제137항에 있어서, 상기 악성종양이 암종인 방법.
139. 제138항에 있어서, 상기 암이 췌장암인 방법.
140. 제137항에 있어서, 상기 시험관내 진단 분석이 면역측정법, PCR, PT-PCR 및 면역조직화학법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
141. 제140항에 있어서, 상기 시험관내 진단 분석이 PT-PCR 또는 면역측정법인 방법.
142. 제141항에 있어서, 상기 표본이 체액 또는 조직인 방법.
143. 제140항에 있어서, 상기 진단 분석이 면역조직화학법인 방법.
144. 제143항에 있어서, 상기 표본이 세포 집단 또는 조직인 방법.
145. (A) 적어도 한 팔은 PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하고 적어도 다른 한 팔은 표적화가능한 접합체에 특이적으로 결합하되, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 한 팔은 hPAM4 항체 또는 그 단편인 이특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계; 및

     (B) (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

     (ii) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

     (iii) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH₂;

     (iv)

     및

     (v)

     로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화가능한 접합체를 투여하는 단계

     를 포함하는 PAM4 항원을 발현하는 환자의 질병 조직을 수술중 동정하는 방법.
146. (A) 적어도 한 팔은 PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하고 적어도 다른 한 팔은 표적화가능한 접합체에 특이적으로 결합하되, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 한 팔은 cPAM4 항체 또는 그 단편인 이특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계; 및

     (B) (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

     (ii) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

     (iii) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH₂;

     (iv)

     및

     (v)

     로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화가능한 접합체를 투여하는 단계

     를 포함하는 PAM4 항원을 발현하는 환자의 질병 조직을 내시경 동정하는 방법.
147. (A) 적어도 한 팔은 PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하고 적어도 다른 한 팔은 표적화가능한 접합체에 특이적으로 결합하되, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 한 팔은 cPAM4 항체 또는 그 단편인 이특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계; 및

     (B) (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

     (ii) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH₂;

     (iii) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH₂;

     (iv)

     및

     (v)

     로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화가능한 접합체를 투여하는 단계;를 포함하는 PAM4 항원을 발현하는 환자의 질병 조직을 혈관내 동정하는 방법.
148. PAM4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체 결합 부위 및 헵텐에 특이적으로 결합하는 제2 항체 결합 부위를 갖는 이특이성 항체 F(ab)₂또는 그의 F(ab')₂단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody)를 내시경, 혈관 카테터 또는 외과 수술을 겪는 환자에게 주사하여, 이 항체 단편이 표적 부위에 부착되도록 하는 단계;

     선택적으로, 주사후 24시간 내 이특이성 단편이 순환중 대부분 제거되지 않는 경우에는 갈락토실화 안티-요오드형 제거제(galactosylated anti-idiotype clearing agent)를 사용하여 비표적화 항체 단편을 제거하고, 표적 부위에 신속히 국소화하여 신장을 깨끗이하는 이가 표지된 헵텐(bivalent labeled hepten)을 주사하는 단계;

     처음 주사 후 48시간 내에, 검출 수단으로 표적 부위의 부착된 표지의 함량 상승을 근거리 검출함으로써 헵텐의 존재를 감지하는 단계

     를 포함하는 내시경, 혈관 카테터 또는 외과수술 중의 병변 검출 방법.
149. 수술중, 혈관내 또는 내시경 과정 동안 hPAM4 면역접합체 또는 그 단편의 유효량을 환자에게 비경구 주사하는단계;

     주사 후 48시간 내에 상기 과정을 실시하는 단계;

     상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 존재를 검출하는 검출 수단으로 환자의 접근 내부를 근거리에서 스캐닝하는 단계; 및

     상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 부착 부위에서 상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 함량 상승을 검출수단으로 검출함으로써 상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 부착 부위를 알아내는 단계

     를 포함하는 수술중, 혈관내 또는 내시경 과정 동안 근거리 병변 검출 방법.