KR20040108567A

KR20040108567A - 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20040108567A
Application number: KR1020040039130A
Authority: KR
Inventors: 황유아; 최왕근; 김진욱; 박장서; 남상준; 정소영
Original assignee: 주식회사 두산
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2004-12-24

Abstract

본 발명은 피지생성세포를 포함하는 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물에 관한 것으로서, 포스파티딜콜린(PC) 및 수화된 포스파티딜콜린(HPC)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 조성물을 이용하면, 피지생성세포와 같은 지방세포의 분화, 성장을 억제함으로써 지방세포와 관련된 질환을 치료 또는 예방할 수 있다. 특히, 지방세포의 비대 또는 지방세포의 과잉 증식으로 인한 비만을 근본적으로 치료하며, 피지분비를 억제하여 여드름을 근본적으로 치료 또는 예방할 수 있다. 이는 지방세포와 관련된 여러 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 병용될 수 있다.

Description

지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물{Composition for inhibiting differentiation or growth of fat cells}

본 발명은 지방세포의 분화 또는 성장을 억제하는 조성물에 관한 것이다. 한편으로는, 본 발명은 피지분비를 억제하는 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린을 유효성분으로 함유한 것을 특징으로 한다.

지질은 인체를 구성하는 주요 구성 성분의 하나임과 동시에, 주로 간에서 산화되어 많은 ATP를 생성하기 때문에 우리 체내에서 중요한 에너지원으로 사용된다. 생체막의 주요 구성 성분이며, 스테로이드계 호르몬(예, 성호르몬)의 전구 물질이기도 하다. 최근에는 생체의 신호전달시스템에서 신호전달을 매개하는 물질로 많은 연구의 관심이 되고 있다. 지질에는 지방산(fatty acid),아실글리세롤(acylglycerol), 인지질(phospholipid), 스핑고지질(sphingolipid), 스테로이드 류(steroids) 등 무수히 많은 종류가 포함된다.

지질은 성인 체중의 평균 10%이상을 차지하며, 음식으로 섭취되는 칼로리의 약 30~40%를 차지한다. 인체 내에 존재하는 지질의 종류는 무수히 많은데, 이중 인지질은 디아실글리세롤(diacylglycerol)의 세번째 글리세롤 탄소에 인산화가 되어 세포막의 주요 구성성분이 되는 지질의 한 종류인 포스파티드산(phosphatidic acid)가 된다. 인지질은 인산 부위(머리, head)의 -OH 기가 친수성을 띠는 반면 나머지 부분(꼬리, tail)은 소수성의 성질을 가지게 된다. 따라서 인지질을 물에 놓으면 인지질 덩이 내부로는 소수성 꼬리들이 모여들고 바깥으로는 친수성 머리들이 배열하는 인지질 이중층을 형성하게 된다. 이러한 특성으로 포스파티드산(phosphatidic acid)은 세포막의 주 구성 물질이 된다. 이와 같은 양성분자의 특성을 가지면서 세포막의 구성 성분으로 참여하는 다른 인지질들로 세팔린(cephalin = phosphatidyl ethanolamine), 레시틴(lecithin = phosphatidyl choline) 등이 있다.

체외에서 섭취된 지방성분은 인체 구성성분이나 에너지원으로 사용되고 남은 지방성분은 지방세포에 축적되게 된다. 지방대사에 문제가 발생하면, 인체에는 여러가지 변화가 발생하며, 심한 경우는 생명을 잃기도 한다.

지방세포의 수와 크기는 인체의 외형에 큰 영향을 미친다. 지방세포는 성장에 따라 수가 증가하여 분열과 증식과정이 끝나면 인체에 약 300억개의 지방세포들이 존재하게 되는데 가장 왕성하게 불어나는 시기는 사춘기이며 이때가 지나면 숫자는 거의 증가하지 않고 크기만 커지게 된다. 우리 몸에서 쓰고 남은 에너지는 지방의 형태로 지방세포에 축적되고, 지방세포의 크기는 커지게 된다.

인체에서 지방이 효율적으로 사용되지 않고 축적되어 정상의 범위를 넘는 정도로 증가한 상태를 비만이라고 한다. 비만은 소수의 예외를 제외하고는 대부분 지방의 섭취가 과하여 일어난다. 즉 섭취 에너지가 소비 에너지보다 많아 체내의 지방 조직에 중성지방이 다량으로 축적되어 체중이 정상 체중에 비해 20% 이상 초과한 것이다. 비만은 성인병을 포함한 여러 질환의 원인이 되므로 주의를 기울여야 한다.

비만은 지방세포 비대형과 지방세포 증식형으로 분류할 수 있다. 지방세포비대형은 지방세포의 크기가 증가하는 것으로 성인 비만의 대부분을 차지한다. 지방 세포 증식형은 어릴 때 비만이 발생하면 더 많은 지방세포가 생겨나는 지방 세포 증식형 비만이 된다. 즉 생후 1년과 사춘기 혹은 임신기에 세포수가 정상이상으로 증가되거나 지방세포의 지방량이 변화하지 않는 2-10세 사이에 열량의 과다섭취로 지방량이 증가하는 경우에는 지방세포 증식형 비만이 많이 발생하게 된다.

한편 인체를 구성하는 막성분의 대부분을 차지하는 지질성분은 피부에 특히 많이 존재하며, 구조적인 기능뿐 아니라 여러 생리적인 기능을 나타내면서 인체의 항상성 유지 및 외부환경으로부터 보호 등 생명현상의 핵심적인 기능을 수행한다.

피부에는 표피, 진피, 피하조직 외에 피부가 변형된 피부부속기관이 있다.

피부 1인치에는 수백만개의 세포, 혈관과 신경이 복잡한 그물망 모양으로 형성되어 있다. 그 외에도 모낭, 피지선, 한선의 구멍이 있으며, 대부분의 피부 문제는 피부의 표면층인 표피에 나타나지만, 본래의 문제는 진피층에서 시작된다. 진피는 콜라겐(교원질, 단백질의 일종) 섬유로 되어 있다. 교원섬유는 피부를 튼튼하게 해주고 모양을 유지해주며 유연성을 준다. 혈관, 지방세포, 피지선, 한선 등이 교원섬유에 의해서 감싸여져 있다. 피부 1cm²에는 평균적으로 95-100개 피지선(Sebaceous gland)을 가지고 있으며 피지(Sebum)를 분비하여 피부를 보호한다.

피지선(Sebaceous glands)에는 작은 주머니(소낭)가 들어 있고 피지선의 도관은 모낭의 중간에 연결되어 있다. 피지선에서는 피지(sebum)를 분비하여 피부를 매끄럽게 해주며, 피부에서 수분이 증발되는 것을 막아준다. 손발바닥을 제외한 모든 부위에 피지선이 있으며 특히 얼굴에 많다. 피지는 반 액체의 기름기 성분이며 피지선에서 만들어진다. 일반적으로 피지는 모낭의 입구까지 피지선의 도관을 따라서 흘러나온다.

피지가 딱딱해지고 모낭이 막혔을 때에는 흑 여드름(black head)이 생긴다.

피지선은 신경의 지배를 받지 않고 남성호르몬(안드로겐, Androgen)의 자극에 의해 분비가 조절된다. 남성호르몬은 남녀 모두 부신 피질에서 소량 분비되며 피지선이나 모낭발육을 자극하여 각질층을 두텁게 하는 작용이 있다. 피지의 분비상태는 연령에 따라서 변화된다. 출생 후 1년은 피지의 분비가 왕성하다가 그 후 퇴화되어 8-10세가 되면 다시 그 기능이 성숙하여 11-13세 경부터는 더욱 더 증가하다가 20-25세에 최고가 된다. 그 후는 거의 변화되지 않으며 노인이 되면 점차감소한다. 피지의 분비는 계절, 연령, 호르몬, 환경에 따라서도 변화하는데, 온도, 피지막의 두께, 발한에 따라서 피지분비가 증가했다가 감소했다가 한다. 피지는 하루 평균 1-2g정도 분비된다. 목욕 후 3-4시간, 샴푸 후 1-2시간, 세안 후 1시간 후 다시 생성된다.

피지는 각질층과 모발의 표면에 피지막을 만들어 수분이 증발하는 것을 방지하여 피부와 모발에 습기를 유지함과 동시에 윤택을 준다. 또한 피지 중에는 지방산이 함유되어 있으며, 지방산에는 어느 정도 화농균과 백선균을 살균하는 작용이 있어 피부 미생물을 조절하는 기능이 있다고 알려져 있다.

피지는 피부표면에 분비되면 땀과 혼합하여 천연크림과 같은 피지막을 형성하는데 이 상태는 피지와 땀이 서로 혼합하여 유화상태를 만들기 때문이다. 피지의 유화작용은 매우 복잡한데 피지와 땀이 적당량 있으면 w/o형의 유화 상태를 만들며, 발한하여 수분이 많아지면 o/w형으로 변하면서 다시 돌아오면 w/o형으로 된다. 즉, 피지막은 피부표면의 지방과 수분의 비율에 따라서 w/o 형이나 o/w형으로 변한다.

이외에도 경피 흡수 조절기능, 비타민 D생성작용 등도 주요한 피지의 기능으로 알려졌다.

이와 같은 작용을 가진 피지의 분비가 정상보다도 많으면 여드름이 생기거나 비듬이 생기며, 피부타입은 지성으로 된다. 피지분비가 너무 적으면 수분이 증발하기 쉽게 되어 광택이 없으며, 황폐해져 피부타입이 건성으로 된다. 또한 살균작용을 하는 피지 중의 지방산도 감소하여 화농균이나 백선균으로부터 침입을 받기 쉽다.

피지는 피부를 보호하는 중요한 역할을 수행하지만, 피지선이 지나치게 발달하면, 피지분비가 증가하게 되며, 여드름이 발생하는 원인이 되기도 한다. 결국 피지선의 발달을 억제하여 피지분비를 조절하는 것은 여드름의 예방 및 치료에 효과적일 것이다.

종래에는 지방세포의 분화 또는 성장을 억제함으로써 비만 또는 여드름과 같은 지질 관련 질환을 치료하는 물질에 대해서 많이 알려지지 않았다. 특히, 여드름 치료에 있어서는, 지방세포의 성장, 분화를 조절함으로써 여드름을 치료하는 약제에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 종래의 대부분의 여드름 치료제는 염증성 여드름의 염증을 완화시키거나, 여드름균을 죽이는 항생제이거나, 막힌 모공을 뚫어줌으로써 여드름을 치료하는 것들이다. 즉 대부분이 항균작용과 항염작용을 통해 여드름을 완화시키는 것에 불과하였으므로, 여드름의 근본적인 치료법이 되지 못하였다.

남성 호르몬인 안드로겐과 여드름균의 증식에 의해 악화된 염증성 여드름은 일반적으로는 여드름 균을 죽이는 항생제와 막힌 모공을 뚫어주는 약으로 치료하고 있다. 여드름이 생긴 부위에 도포하여 쓰이는 국소요법 치료제에는 그 종류가 다양한데 이들의 작용 기전은 각기 다르다. 예를 들어 벤조일 퍼옥시드(Benzoyl peroxide)는 강력한 항균 작용과 항염 작용이 있지만, 피부 자극성을 보이며 피지 분비를 조절하지는 못한다. 한편 세균의 번식을 억제하는 항균 작용 치료제에는 에리쓰로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline),클린다마이신(clindamycin) 등 다양하다. 그러나 지금까지의 치료 방법은 여드름이 심하지 않을 경우 좋은 효과를 보여 왔으나 여드름이 심하거나 자주 재발하는 환자들의 경우에는 큰 영향을 미치지 못했다. 최근에는 항균 작용 치료제가 염증을 일으키지 않은 여드름의 경우 효능을 보이지 않고 있는 보고가 있어 이들 치료제들이 세균 자체의 번식을 억제하기 보다 세균 존재로 인해 유발되는 염증 반응을 억제하는 것으로 보고 있어 장기간 사용을 제한하기도 한다. 또한 이상 과각화를 억제시키는 치료제로 쓰이는 레티노익 액시드(Retinoid acid)는 생성된 면포를 감소시키는 효과는 우수하지만 피부 자극이 심하고, 이 또한 피지분비를 조절하는 효과는 없어 여드름의 원인치료는 아직까지 어려운 실정이다.

국소 요법외에도 경구투여나 주사투여와 같은 전신요법이 있으나 여러 심각한 부작용이 발생 할 뿐만 아니라 임산부나 12세 이하의 어린이에게는 투여를 제한하기도 하여 그 사용이 용이하지 않다.

여드름을 근본적으로 치료하기 위해서는 지방세포의 일종인 피지생성세포의 분화, 성장을 억제함으로써 결과적으로 과잉적인 피지분비를 감소시켜야만 한다. 그러나, 종래의 기술로는 이러한 목적을 달성하기가 어려웠다.

한편, 비만 등 지방세포의 비대 또는 지방세포의 과잉증식으로 인한 질병을 치료하기 위해서는, 지방세포의 분화 및 성장을 억제하는 것이 근본적인 치료법이 될 수 있다. 그러나, 종래에는 이에 대해 효과적인 방안을 제시하지 못하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 하는 것으로서, 본 발명의 목적은 비만 또는 여드름 등 지질 관련 질환을 근본적으로 치료하거나 완화시킬 수 있는 조성물을 제공하는 것이다. 구체적으로, 피지생성세포와 같은 지방세포의 분화, 성장을 억제함으로써 지방세포의 비대 또는 지방세포의 과잉 증식으로 인한 비만을 근본적으로 치료하며, 피지분비를 억제하여 여드름을 근본적으로 치료하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 퍼지 래트의 등에 포스파티딜콜린(PC) 및 수화된 포스파티딜콜린(HPC, hydrogenated phosphatidylcholine)을 처리한 결과와 대조군을 도포한 결과를 비교하는 사진이다.

도 2는 퍼지 래트의 등에 수화된 포스파티딜을 처리한 후 조직을 생검하여 박막크로마토그래피(TLC)로 분석한 결과를 대조군과 비교한 것이다.

도 3a 및 도3b는 상기 도 2의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명에 의한 크림 제형의 조성물을 퍼지 래트의 등에 도포한 결과를 대조군과 비교하는 사진이다.

도 5는 본 발명에 의한 리포좀 제형의 조성물을 퍼지 래트의 등에 도포한 결과를 나타내는 사진이다.

도 6a 내지 도6c는 실시예3과 같이 처리된 퍼지 래트의 등 조직을 H&E 염색법으로 염색한 후 관찰한 사진이며, 도 6d 내지 도 6f는 실시예3과 같이 처리된 퍼지 래트의 등 조직을 지방염색법으로 염색한 후 관찰한 사진이다. 도6g는 상기 도6a 내지 도6f의 결과를 수치화한 그래프이다.

도 7은 실시예3과 같이 처리된 퍼지 래트의 등 조직에 있는 활성화된 피지생성세포의 수를 대조군과 비교한 그래프이다.

도 8은 포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린이 PPARγ의 유전자발현에 미치는 영향을 나타내는 사진이다.

도 9는 지방세포로 분화되기 전의 상태와 지방세포로 분화된 후의 상태를 비교한 사진이다.

도 10은 PC, HPC 처리에 의한 PPARγ의 발현량 변화를 나타내는 사진이다.

도 11a는 인체에서 HPC 처리에 의한 총 지질량의 변화를, 도 11b는 인체에서 HPC 처리에 의한 피지량의 변화를 나타낸다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물은, 포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 의한 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물에 있어서, 상기 지방세포는 피지생성세포인 것을 특징으로 한다.

상기한 본 발명에 따른 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물은, 지질대사이상, 지방세포의 비대 또는 과활성화 및 지방세포의 이상 증식 중 어느 하나 이상의 원인으로 유발되는 질환을 치료하기 위한 용도인 것을 특징으로 한다.

상기한 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물에 있어서, 상기 질환은 비만 또는 여드름인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 피지분비 억제용 조성물은, 포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 피지선 발달 억제용 조성물은, 포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 의한 비만 치료 또는 억제용 조성물은, 포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 조성물에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 계란 또는 대두에서 분리된 것을 특징으로 한다.

상기한 조성물에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린은 전체 조성물에 대해 0.005 내지 90중량% 함유된 것을 특징으로 한다.

상기한 조성물에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린은 단독으로 또는 다른 유효성분과 조합된 형태로 포함된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 비만 치료용 키트는, 상기한 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 여드름 치료용 키트는, 상기한 피지생성세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물 또는 상기한 피지분비 억제용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기한 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물 또는 상기한 피지분비 억제용 조성물은, 다른 조성물과 함께 포함된 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 살펴본다.

본 발명에 있어서, "치료"라 함은, 가장 넓은 범위의 의미를 갖는 것으로 해석된다. 즉, 질병의 증상을 경감 또는 완화시키는 것 뿐만 아니라, 증상이 나타나기 전에 미리 예방하는 것을 포함한다. 예컨대, 지성피부인 사람의 피부의 피지분비를 억제하여 지질 밸런스를 유지함으로써 여드름을 미리 예방하는 것을 포함한다. 또한, 질병이 더욱 악화되지 않도록 유지하는 것을 포함한다.

본 발명에 있어서, "수화된 포스파티딜콜린"이라 함은, 포스파티딜콜린의 모든 불포화지방산이 포화지방산으로 변형된 포스파티딜콜린을 가리킨다.

본 발명에 있어서, "지방세포의 분화"라 함은, 지방조직성장에 있어서 전지방세포(Preadipocyte)로부터 지방세포로 되는 과정을 말한다. 즉 지방세포가 되기 위해 메센키말(Mesenchymal) 줄기세포에서 시작하여 전지방세포를 거쳐 성숙한 지방세포로 분화가 일어나는 과정이다. 이러한 분화단계에서 지질관련 유전자들의 발현이 요구되는데, 여기에 PPAR-감마와 CCAAT/ 인핸서 결합 단백질(C/EBP)등이 관여한다. 지방세포의 분화 유무를 확인할수 있는 방법에는 염색에 의한 실험법과 생화학적으로 접근하는 방법이 있다. 염색방법은 Oil-red-O 의 염색정도를 비교함으로써 확인이 가능하다(도 9 참조). 도 9의 왼쪽 사진은 분화가 되기 전 전지방세포이며, 도 9의 오른쪽 사진은 분화가 일어나 성숙한 지방세포이다. 또한 지방세포로 분화시 발현되는 특정 유전자들을 통해 분화가 일어났는지 알 수 있는데 아디포사이트 지방산 결합 단백질(adipocyte fatty acid binding protein), PPARγ와 아딥신(adipsin) 이 그 예이다.

본 발명에 있어서, "지방세포의 성장"이라 함은, 지방세포가 분화 후 출생초기와 사춘기등 지방세포의 수가 증가하는 기간에 지방세포수가 증가되는 것과 일단 형성된 지방세포의 크기가 증가하는 것을 모두 포함하며, 활성화되지 못한 지방세포가 활성화되는 것도 포함하는 최광의의 뜻을 나타낸다. 성인이 되기 전에 지방세포수 증가 능력은 감소되고, 그 후 지방 조직량의 증가는 주로 지방세포의 크기 증가에 의한다는 가설이 있으나 지방세포가 증식되는 특정시기에 대한 가설은 일부만 사실이다. 성인에서 시작된 일부 비만에서 지방세포의 수와 크기가 모두 증가함을 볼 수 있다. 이처럼 지방세포를 분화시키고 생성된 지방세포의 수와 크기의 조절을 통해 생체내 에너지 밸런스를 맞출 수 있으며 여기에 이상이 생길시 질병이 발생한다. 인슐린 저항성을 보이는 제2형 당뇨병은 주로 비만으로 인해 발생하는데 여기에는 TZD (thiazolidinediones)라는 물질이 치료제로 쓰이고 있다. TZD는 PPAR 감마 수용체의 기질로 알려져 있으나 제2형 당뇨병에서는 인슐린 저항성을 감소시켜 인슐린에 보다 잘 반응한다. 그러나 PPAR 감마 수용체의 기질인 점을 감안하면 TZD의 부작용을 예상할 수 있는데 지방세포로의 분화촉진이 해당된다. 그러므로 TZD와 같이 인슐린 반응성을 높이나 PPAR 감마 수용체의 안타고니스트 기질로 작용하는 물질이 좋은 당뇨병 치료제로 쓰일 수 있겠다.

본 발명에 있어서, 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린의 조성물 내의 농도는 0.005 내지 90중량%인 것이 바람직한데, 상기 농도가 0.005중량% 미만이면 그 효과가 미미하며, 상기 농도가 90중량%를 초과하면 제형 안정성에 문제가 발생하기 때문이다.

여드름은 사람에게만 일어나는 모낭의 염증성 질병으로 흔히 사춘기에 발생하여 20대 중반에 없어지지만 20대 혹은 30대에도 발생하기도 한다. 대부분 얼굴의 피지분비가 왕성한 이마, 코 부위나 손의 접촉이 많은 턱 부위에 주로 발생하나 때로는 가슴, 등에도 발생하고 얼굴의 여드름이 사라진 후에도 상당 기간 몸에 남아있기도 한다. 여드름은 그 종류도 다양해서 전형적인 심상성 여드름 (Acne Vulgaris), 응괴성 여드름 (Acne Conglobata), 월경전 여드름(Premenstrual Acne), 사춘기전 여드름(Preadolescent Acne)등 다양하다. 이들 각각의 주요 발병 부위와 증상은 그 종류 및 원인에 따라 차이가 있으며, 치료방법도 여드름의 종류에 따라 조금씩 다르다.

여드름이 생기는 원인이나 기전은 명확하게 밝혀진 것은 없지만, 남성 호르몬의 작용, 유전적 요인, 음식, 생리 그리고 스트레스 등과 같이 다양한 인자가 관여하며, 이들간의 상호작용에 의하여 발생하는 것으로 보고되고 있다. 특히 과다한 피지분비, 모공의 각질화, 모피지선에서의 비정상적인 미생물 증식, 염증반응은 여드름의 4대 원인으로 생각되고 있다.

사춘기가 되면 남녀 모두 남성 호르몬인 안드로겐(Androgen)의 분비가 왕성해져서 모낭 옆에 있는 피지선을 자극하게 되고 그 결과 피지선의 분화, 성장이 과하게 일어나면서 많은 피지가 분비(overproduction of sebum) 된다. 또한 모낭 내에 존재하는 세균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)가 번식하기 쉬운 조건이 되면서 이들이 분비하는 지방분해 효소에 의해 피지 내부의 중성지방 (Triacylglyceride)이 분해되면서 유리 지방산(free fatty acid)이 발생하고 이것이 모공 입구의 각질세포를 자극하여 각질세포 분화를 촉진시킴으로써 각질층이 두꺼워지는 이상 과각화(Hyperkeratosis)가 일어난다. 접착력이 높아진 각질층의 모공은 그 입구가 과다 피지 분비와 두꺼워진 각질 세포에 의해 좁아지거나 막히게 됨으로써 면포(comedo)가 형성된다. 결국 계속 분비되는 피지와 과각화로 이뤄진 면포로 인해 모낭벽이 얇아지고, 혐기성 세균의 증식이 증가함에 따라 이를 감지한 주위의 면역세포가 활성화되면서 염증 반응을 일으켜 염증성 여드름으로 발전하게 된다.

상기 살펴본 바와 같이, 여드름 생성 기전의 1차적 단계는 안드로겐에 의한 피지선의 과잉 분화 및 성장이다. 따라서, 여드름을 근본적으로 치유하기 위해서는 피지선의 과잉 분화 및 성장을 억제하여야 한다.

최근에는 대두로부터 추출한 리놀렌산(linoleic acid)이 다량 함유된 인지질류 (Phospholipids)가 여드름 치료에 쓰일 수 있다는 보고가 있다. 15년전 다우닝(Downing)이 제안한 가설은 여드름 환자의 피부내 지방산의 비율이 일반인과는 다른 양상을 보이는데 특히 리놀렌산의 함량이 부족하여 외부에서 공급한 리놀렌산의 공급이 이러한 불균형을 보완할 경우 여드름의 발생을 줄여줄 수 있다고 제안하였다. 최근의 연구결과에 의하면 리놀렌산이 결핍된 식이를 할 경우 여드름이 발생하는 것을 관찰하기도 하였다. 그런데, 이 뿐만 아니라 리놀렌산은 과다 분비되는 피지의 합성을 억제하는 효능이 있으므로, 근본적인 여드름의 치료에 많이 사용될 수 있다.

항균 작용 또는 과각화를 억제함으로써 여드름을 치료해왔던 기존방법과는 달리 원천적으로 과도하게 분비되는 지질의 합성을 제어하며 피. 아크네스(P.acnes) 에 의해 유리되는 유리지방산 생성으로 불균형한 지방산 조성을 보완하는 효능을 가진 인지질류는 여드름의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.

인지질에는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine : PC), 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine : PE), 포스파티딜세린 (phosphatidylserine : PS), 스핑고마이엘린 (sphingomyelin : SM)이 있으며, 모든 세포막 지질의 반 이상을 차지한다. 이들 인지질은 세포막 이중층의 내층과 외층에 비대칭적으로 불균등하게 존재한다. 원형질막의 외층은 주로 포스파티딜콜린과 스핑고마이엘린으로 구성되어 있고, 내층은 포스파티딜에탄올아민과 포스파티딜세린으로 구성되어 있다. 다섯번째로 많이 존재하는 인지질인 포스파티딜이노시톨 (phosphtidylinositol : PI)도 역시 세포막의 내층에 존재하며, 비록 세포막의 구성성분으로는 적은 부분을 차지하고 있으나, 세포내 신호전달에 매우 중요한 역할을 한다. 포스파티딜세린과 포스파티딜이노시톨은 모두 머리 부분에 음전하를 띄고 있으며, 세포막의 내층에 존재하기 때문에, 원형질막의 세포질쪽면은 전체적으로 음전하를 띄게 된다. 글리세롤 인지질은 글리세롤에 연결된 두개의 지방산을 가지고 있다. 지방산들은 서로 다를 수 있다. 글리세롤의 세번째 탄소는 인산기에 연결되어 포스파티드산을 이루는데, 이것은 차례로 종종 다른 작은 분자(포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 혹은 포스파티딜이노시톨)와 연결되어 있다.

포스파티딜콜린은 인지질중의 하나로 피부를 부드럽게 하는 효과, 피부의 수분을 공급하는 효과, 피부보호, 피부질환 완화등 피부에 여러 좋은 작용을 한다. 포스파티딜콜린은 글리세린에 지방산과 인산, 콜린이 결합한 구조를 가지며 지방산으로는 리놀렌산, 리놀렌산 등 필수지방산인 불포화지방산이 결합된다. 불포화된 포스파티디콜린은 주로 콩과 계란의 노른자에서 추출되며 12.9% 팔미토산, 4.4% 스테아릭산, 10.5% 올레익산, 66.5% 리놀렌산 그리고 5.7% 리노레닉산의 비율로 지방산이 분포한다. 이들 지방산중 특히 리놀렌산은 염증성 여드름의 치료제로서도 사용되고 있으나 그들의 작용 기작은 명확하지 않다. 여드름 환자들의 경우 피부내 필수지방산인 리놀렌산의 함량이 부족하여 나머지 지방산과의 균열이 깨지는데 이때 외부에서 공급해주는 리놀렌산이 이들을 보충하여 여드름을 완화시킨다는 이론도 있다.

그런데 리놀렌산은 피지선에서 과도하게 분비되는 피지의 생성을 감소시키는 효과가 있다. 따라서 리놀렌산을 다량 함유한 포스파티딜콜린의 여드름 치료제로서의 가능성은 충분하다.

본 발명에서는 포스파티딜콜린 및 이의 지방산을 모두 포화지방산으로 변화시킨 수화된 포스파티딜콜린을 합성하여, 피지분비 억제 및 지방세포의 성장에 미치는 영향을 살펴 보았다.

피지를 생성하는 세포(sebaceous cell: sebocyte)들은 특이적 상피세포로써 분화를 마친 후 파열하면서 지방을 분비한다. 이들 세포들의 증식과 성장에는 절대적으로 안드로겐류의 디하이드로테스토스테론 (dihydrotestosterone)이 관여하나 남성호르몬의 영향뿐만 아니라 최근에는 세포내 퍼옥시좀 성장 - 활성화 수용체 (peroxisome proliferator-activated receptor, 이하 PPAR) 들의 활성화가 지질 합성과 대사기전에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있는 많은 보고들이 있다.

PPAR 은 기질결합으로 활성화된 핵내 호르몬 수용체로 레티노이드X 수용체(Retinoid X receptor)와 헤테로다이머 형태로 존재하는데 활성화된 수용체는 PPAR 반응요소(response element)에 결합함으로써 페록시좀, 마이크로좀 그리고 미토콘드리아내에서 지질대사와 관련된 유전자들을 조절한다. PPAR의 종류도 다양한데, α, β, γ 및 δ로 지금까지 네 가지가 밝혀졌다. 이들 중 특히 PPARγ가 지질대사에 깊이 관여하는데 대부분 지질세포에 분포하며 덜 분화된 지방 세포들의 분화를 촉진시키고 지질을 합성함으로써 피지를 분비한다고 알려져 있다. 따라서, 어떤 성분이 PPAR의 발현을 억제한다면 그 성분은 지방 세포의 분화를 억제할 수 있다는 것을 의미한다. PPARγ와 결합하는 기질에는 여러 지방산과 그들의 대사체들이 있으며 아라키돈산과 리놀릭산이 여기에 해당된다. 프로스타글란딘 J2 대사체와 당뇨병에 쓰이는 티아졸리딘(thiazolidinedione) 도 이들 수용체와 결합함이 잘 알려진 기질들이다. 이러한 지질대사 관여 조절자 이외에도 PPARγ의 활성으로 TNFα 와 IL-6와 같은 염증유발 사이토카인들의 생성이 감소하여 항염 작용이 있음이 알려져 있다. 그러므로 PPARγ의 발현을 감소시킬 수 있는 물질은 지방 세포의 분화를 억제함으로써 지방 세포의 수를 감소시킬 수 있으므로 여드름 및 비만에 효과가 있을 것이다. 또한 PPARγ의 발현을 증가시키는 물질을 염증 완화 물질로 사용함으로써 세균번식을 통해 면포 주위에 염증이 과도하게 일어난 여드름에 사용할 수 있을 것이다. 리놀렌산은 PPARγ 와 결합하여 이 수용체의 활성을 증가시켜 염증을 완화시킨다고 알려져 있다. 본 발명자들은 포스파티딜콜린과 수화된 포스파티딜콜린이 지방세포의 일종인 피지생성세포의 성숙 및 성장을 억제하는 효과를 확인하였다. 또한 수화된 포스파티딜콜린은 PPAR의 mRNA 생성을 저해함으로써 지방세포의 분화를 억제한다는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 의한 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린 함유 조성물은 여드름 및 비만에 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

각 물질들의 피지생성세포의 성숙 및 성장의 억제 효과를 보기 위해 사용한 실험동물은 퍼지 래트(Fuzzy rat)이었으며 "WF/Pm-FZ"이라고 명명한다. "WF"은 "Wistar Furth" 군에서 유래하며 "Pm"은 이 종을 만든 Dr. Palm 을 가리킨다. 또한 "fz"은 퍼지(fuzzy) 유전자가 열성인자로 변이됨을 나타난다.

포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린은 그대로 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 의약에 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물을 제조하기 위하여 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린을 여드름 치료제 또는 비만 치료제 등의 약제학적 조성물로 제제화할 경우, 유효 성분에 악영향을 미치지 않는 한, 필요에 따라 의약에 사용되는 각종 보조제, 예컨대 담체나 기타 첨가제, 예컨대 안정제, 완화제, 유화제 등을 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린 함유 조성물을 비경구, 경구 등으로 투여할 수 있다. 비경구 루트로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 국소도포가 가장 바람직하다. 제형으로는, 연고, 크림, 주사제, 산제, 과립제, 정제 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 제형으로도 할 수 있다.

약제학적 제형에 있어서, 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린의 함유량은 제형에 따라 광범위하게 변할 수 있으며, 통상적인 방법에 따른다. 본 발명에 의한 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 0.001 내지 1000mg / Kg·day이다.

본 발명에 의한 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 약제와 동등하게 또는 다른 약제를 보조하기 위해 함께 투여될 수 있다.

한편, 본 발명에 의한 조성물은 크림, 로션, 스킨, 엣센스, 파운데이션, 팩, 클렌징 크림, 클렌징 로션, 샴푸, 린스 등의 화장품 제형일 수 있다. 화장품 제형의 경우, 얼굴, 두피, 가슴, 등과 같이 여드름이 발생한 어느 부위라도 사용될 수 있다.

이하, 다음 실시예를 통해 본 발명의 효과를 구체적으로 제시한다.

[실시예 1] 고순도 포스파티딜콜린(PC)의 제조

대두 또는 난황레시친 1.5kg을 헥산과 이소프로필알콜이 1:1로 혼합된 용매에 20 중량%가 되게 녹인 후, 동일한 용매로 안정화가 이루어진 실리카겔로 충진된 컬럼 (ID 15 x L 96 cm)에 정량 펌프를 이용하여 400 ml/분의 속도로 주입하였다.이후, 5%의 물과 10%의 물이 혼합된 헥산/이소프로필알콜 용매를 각각 6배와 9배를 흘려주었고, 이와 동시에 컬럼의 토출부에서는 분광광도계를 이용하여 UV 200 nm로 각 성분 인지질 분획을 확인하였으며, 이 중 PC분획을 별도로 회수하였다. 회수된 PC분획은 0.45 ㎛ 필터로 여과한 후, 진공 건조한 후, 다시 증류수에 현탁시켜 동결건조 하였다. 이렇게 하여 대두 PC의 경우에는 약 20%, 난황 PC의 경우에는 약 67% 정도로 획득할 수 있었다.

[실시예 2] 수화된 포스파티딜콜린(HPC)의 제조

고순도의 대두 또는 난황 PC를 약 4배의 메탄올 / 이소프로필알콜 / 에탄올 혼합용매에 녹인 후, 4%의 팔라디움 촉매를 첨가하여 50℃로 가온하였다. 이 후, 15기압의 수소압을 가하여 고순도 PC에 존재하는 이중결합을 환원시켜 포화지방산으로 전환 시켰다. 이렇게 하여 제조된 PC를 가스크로마토그라피법으로 확인한 결과 모두 해당 포화지방산으로 전환됨을 확인하였다.

[실시예 3] 피지분비 억제 효과 실험(동물실험)

본 연구에 사용한 실험동물은 유전변이가 되어 안드로겐이 과다분비되는 퍼지 래트(Fuzzy rat) (체중 약 300g) 이었으며 4주에서 5주령의 수컷을 사용하였다. 퍼지 래트는 7주 후 안드로겐의 영향으로 등 부위에 피지가 분비되는 특성을 가지고 있다. 대조군으로는 용매만 들어있는 비이클을 사용하였고, 실험군으로는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine) 과 수화포스파티딜콜린(hydrogenatedphosphatidylcholine)를 사용하였고 모두 용매에 0.5% (질량/부피) 만큼 녹여 사용하였다. 용매는 1, 3 부틸렌 글리콜(1,3-butylene glycol), 에탄올 그리고 증류수를 5:2:3으로 혼합한 물질이었으며 이를 비이클(vehicle)로 명명하였다. 모든 실험 물질들은 하루에 2회씩 오전 오후로 퍼지 래트의 등부위에 도포했으며 도포량은 1ml정도였다. 비이클(vehicle)을 도포한 퍼지 래트의 피지 분비를 확인한 후 실험종료 시점을 결정하였다. 실험군들의 피지분비억제 효과를 확인하고자 일주일 단위로 육안으로 관찰하였으며 실험 종료 후 등부위의 상태를 사진으로 찍었다. 그 사진은 도 1에 나타나 있다.

도 1에 나타난 바와 같이, 비이클의 경우는 퍼지 래트의 등부위에 노란색의 피지가 분비된 것이 관찰된 반면, PC나 HPC의 경우는 비이클에 비해 상대적으로 피지의 분비량이 매우 적음을 알 수 있었다.

한편, 본 발명자들은 상기 결과를 박막크로마토그래피법(TLC)을 통해 지방세포를 정량적으로 분석하였다. 상기, 비이클 처리 대조군과 상기 HPC(hydrogenated phosphatidylcholine) 처리 실험군의 쥐의 등을 각각 생검하였다. 여기에 소화효소인 디스페이즈(dispase/GibcoBRL, USA)를 인산염완충용액에 섞어서 각 생검된 피부조직에 4℃에서 12시간동안 방치하였다. 표피를 진피로부터 분리하고, 클로르포름:메탄올=2:1용액에 4시간동안 진탕하면서 지질을 추출하였다. 이를 0.45uM 필터로 여과하고, 다시 클로르포름 50ul에 녹였다. 준비된 시료는 박막크로마토그래피(Merck, Germany)에 점적하고, 다음과 같은 조성의 전개용액으로 전개조 내에서 전개하였다. 헥산(19센티까지), 톨루엔(19센티까지),헥산:이서(ether):아세틱에시드=80:20:1으로서 두번 전개 하였다. 이후 50% 황산용액을 분산하여 뿌린 이후 120℃ 오븐에서 천천히 발색시켰다. 그 결과는 도 2에 나타나 있다. 또한 이를 정량화하여 그래프로 나타내었다. 이는 도3a 및 도3b에 나타나 있다.

도2에서, a는 비처리된 표피, b는 처리된 표피, c는 처리된 피부, d는 비처리된 피부에 관한 결과이다. 왼쪽 붉은색 박스는 내부 표준(메틸 올레에이트)를 나타낸다. 또한 a'는 왁스 에스터(WE, wax ester), b'는 트리글리세롤(TG, triglycerol), c'는 프리 지방산(FFA, free fatty acid)를 나타낸다.

도 2에 나타난 바와 같이, HPC 처리군의 경우 전 피부 지질이 현저히 감소하였음을 알 수 있으며, 이는 비처리군과 확연한 차이로 나타난다. 이 결과를 정량적으로 나타낸 그래프가 도 3a 및 도 3b이다.

도3a는 총 지질에 관하여 처리군과 비처리군을 비교한 것이고, 도3b는 지질 종류별로 처리군과 비처리군을 비교한 것이다. 그 도면들에 의하면, 총 지질에 있어서 처리군이 비처리군에 비해 현저히 감소했을 뿐만 아니라, 프리 지방산(FFA, free fatty acid), 왁스 에스터(WE, wax ester), 트리글리세롤(TG, triglycerol)의 각 지질에 있어서도 모두 처리군이 비처리군에 비해 현저히 감소하였음을 알 수 있었다. 왁스 에스터는 피지선으로부터 유래된 지질이기 때문에 상기 결과는 곧 HPC가 피지 분비를 억제하는 효과가 우수하다는 것을 나타내는 것이다. 또한, FFA 및 TG의 결과는 HPC가 지방세포의 분화, 성장을 억제하여 비만 등과 같은 지방세포 관련 질환의 예방 또는 치료의 효과가 있음을 입증하는 것이다.

[실시예 4] 크림제형의 조성물 제조

(크림제형 1)

성분	함량
PC or HPC	0.5%
프로필렌 글리콜	20.0 %
스테아릴 알코올	6.5 %
세틸 알코올	3.5 %
소르비탄 모노스테아레이트	3.0 %
폴리소르베이트 60	2.0 %
이소프로필 미리스테이트	1.0 %
무수 나트륨 설파이트	0.2 %
폴리소르베이트 80	0.1 %
정제수	to 100

제조방법) 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 소르비탄 모노스테아레이트 및 이소프로필 미리스테이트를 이중벽 용기에 도입시키고 혼합물이 완전히 용융될 때까지 가열하였다. 이 혼합물을 70 내지 75℃에서 액체에 대한 균질기를 사용하면서 따로 제조한 정제수, 프로필렌 글리콜 및 폴리소르베이트 60의 혼합물에 가하였다. 생성된 에멀젼을 계속 혼합하면서 25℃ 미만으로 냉각시켰다. PC 또는 HPC, 폴리소르베이트 80 및 정제수의 용액 및 정제수 중의 무수 나트륨 설파이트 용액을 이어서 계속 혼합하면서 에멀젼에 가하였다. 크림을 균질화시킨 후 사용하였다.

(크림제형 2)

성분	함량
PC or HPC	0.5 %
하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린	20.0 %
스테아릴 알코올	2.5 %
세틸 알코올	2.5 %
광유	11.0 %
글리세롤 모노스테아레이트	2.5 %
글리세롤	5.0 %
소르베이트 60	2.0 %
폴리소르베이트 60	3.5 %
정제수	to 100

제조방법) 염산을 용액이 될 때까지 적당량을 가하였다. 수산화 나트륨을 pH 6.0 이 돨 때까지 적당량을 가하였다. 정제수를 적당량을 가하여 100 mg이 되게 하였다. 정제수 중의 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린의 용액에 교반하면서 PC 또는 HPC를 가하였다. 염산을 용액이 될 때까지 가히고 이어서 수산화나트륨을 pH 6.0이 될 때까지 가하였다. 교반하면서 글리세롤 및 폴리소르베이트 60을 가하고 혼합물을 70℃로 가열하였다. 서서히 혼합하면서 생성된 혼합물을 70℃에서 광유, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 모노스테아레이트 및 소르베이트 60의 혼합물에 가하였다. 25℃ 미만으로 냉각시킨 후 정제수의 잔량을 가하고 혼합물을 균질할 때까지 혼합하였다.

(크림 제형 3)

	원료명(INCI Name)	함량
수상부	디소디움 EDTA(DISODIUM EDTA)	0.020
	글리세린(Glycerine)	4.000
	부틸렌글리콜(BUTYLENE GLYCOL)	2.000
	잔탄검(XANTHAN GUM)	0.030
	트리에탄올아민(Triethanolamine)	0.200
	증류수(Di-water)	to 100
	카르보머(Carbomer)	0.1
유상부	스테아르산(Stearic Acid)	1.800
	글리세릴 스테아레이트(Glyceryl Stearate PEG-100 Stearate)	1.000
	세테아릴 알코올(CETEARYL ALCOHOL)	2.000
	글리세릴 스테아레이트(GLYCERYL STEARATE)	2.000
	소르비탄 세스퀴올레이트(SORBITAN SESQUIOLEATE)	0.300
	폴리소르베이트(POLYSORBATE) 60	1.200
	미네랄 오일(MINERAL OIL)	7.000
	이소프로필 미리스테이트(ISOPROPYL MYRISTATE)	1.500
	세틸 옥타노에이트(CETYL OCTANOATE)	1.500
	PC or HPC	0.5
	디메치콘(DIMETHICONE)	0.400
	방부제(Preservative)	Q.S

제조방법) 수상부와 유상부를 각각 75℃로 가열하였다. 수상부와 유상부의 완전용해를 확인한 후 수상부를 본 가마에 투입하였다. 본가마에 유상부를 서서히 투입하면서 호모믹서로 3,500rpm, 페들믹서로 30rpm, 3분간 교반한 후 냉각하였다.

[실시예 5] 크림 제형 조성물의 피지분비 억제 효과 실험

본 연구는 상기 실시예3의 방법에 준하여 실시하였다. 실험에 사용한 시험군은 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, 이하PC)과 수화된 포스파티딜콜린(hydrogenated phosphatidylcholine, 이하 HPC)을 사용하였고, 모두 0.5% ~ 30% (질량/부피)의 농도로 사용하였고, 다음과 같은 여러 제형으로 사용하였다. 모든 실험 제형들은 물질들은 하루에 2회씩 오전 오후로 퍼지 래트의 등 부위에 도포했으며 도포량은 1ml정도였다. 실험군들의 피지분비억제 효과를 확인하고자 일주일 단위로 육안으로 관찰하였으며 실험 종료 후 등부위의 상태를 사진으로찍었다. 그 결과는 도 4에 나타나 있다.

도 4에서 보는 바와 같이, 크림제형에서도 무치치구에 비해 피지분비를 억제하는 효과가 우수함을 알 수 있었다.

[실시예 6] 리포좀 제형의 제조

(리포좀 제형 1)

성분	함량
PC or HPC	30.0 %
콜레스테롤	5.0 %
에틸 알코올	10.0 %
메틸 파라핀	0.15 %
프로필 파라핀	0.02 %
이나트륨 에데테이트	0.15 %
염화나트륨	0.4 %
하이드록시프로필메틸셀룰로오즈	1.2 %
정제수	to 100

제조방법) 정제수를 가하여 100 g 이 되게 하였다. PC 또는 HPC, 콜레스테롤및 에틸 알코올의 혼합물을 교반하고 용액이 될 때까지 55 내지 60 ㅀC에서 가열하며 균질화하면서 정제수 중의 메틸 파라핀, 프로필 파라핀, 이나트륨 에데테이트 및 염화나트륨의 용액에 가하였다. 정제수 중의 하이드록시프로필메틸셀룰로오즈를 가하고 팽윤될 때까지 혼합을 계속하였다.

(리포좀 제형 2)

성분	함량
PC or HPC	10.0 %
콜레스테롤	1.0 %
에틸 알코올	7.5 %
하이드록시프로필메틸셀룰로오즈	1.5 %
정제수	to 100

제조방법) 수산화나트륨 (1 N)을 가하여 pH 5.0이 되게 하였다. 정제수를 가하여 100 g 이 되게 하였다. 에틸 알코올 중의 PC 또는 HPC 및 콜레스테롤의 혼합물을 교반하고 용액이 될 때까지 40 ㅀC에서 가열하였다. 알코올성 용액을 10분 동안 균질화하면서 서서히 수용액에 가하였다. 정제수 중의 하이드록시프로필메틸셀룰로오즈를 가하여 팽윤될 때까지 혼합하였다. 생성된 용액을 1 N 수산화나트륨을 가하여 pH 5.0으로 조절시키고 정제수 잔량을 희석시켰다.

[실시예 7] 리포좀 제형 조성물의 피지분비 억제 효과 실험

상기 실시예 5와 같은 방법으로 상기 실시예6의 리포좀 제형 조성물을 퍼지 래트에 경피 투여한 후 피지분비 억제 효과를 실험하였다. 그 결과는 도 5에 나타난 바와 같다.

리포좀 제형에서도 PC와 HPC의 농도차에 차이는 있으나 피지분비가 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다.

[실시예 8] 피지생성세포의 조직학적 관찰

조직학적 연구를 위해 상기 실시예3의 실험 종료 후 바이오싸이 펀치(biopsy punch)를 이용하여 퍼지 래트의 등 부위의 조직을 회수 하였다.포르말린(Formalin) 고정액에 조직을 슬라이드에 부착시키고, 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin) 염색 (H&E stain) 와 지방염색법( Oil Red O)을 통해 피지선과 모공의 크기 및 모양의 변화 그리고 각질층의 두께변화를 관찰하였다. H&E 염색 결과는 도 6a 내지 도6c에 나타내었고, 지방염색법 결과는 도 6d 내지 도 6f에 나타내었다. 또한, 상기 결과들을 수치화한 그래프를 도 6g에 나타내었다.

상기 도면들에서 보는 바와 같이, PC 및 HPC의 경우 비이클에 비해 피지선의 발달이 둔화됨을 알 수 있다. 활성화된 피지선의 수도 감소한 반면 활성화된 피지선의 크기가 많이 감소하여 있음을 알 수 있다. 이를 통해, PC 및 HPC는 피지생성세포의 분화 및 성장을 효과적으로 억제하였음을 알 수 있었다.

더 나아가, 상기 각 경우에 대해 피지생성세포의 수를 측정한 결과, 도 7과 같은 결과를 얻었다. 도 5에 나타난 바와 같이, PC 및 HPC를 처리한 처리구는 비이클을 처리한 경우에 비해 피지선 개수가 현저히 감소된 것을 볼 수 있었다. 즉, PC 및 HPC는 피지생성세포의 분화 및 성숙을 효과적으로 억제한 것을 알 수 있다.

[실시예 9] HPC가 PPARγmRNA의 전사에 미치는 영향

대조군과 실험물질들이 피지생성에 관여하는 PPARγ의 발현을 촉진 혹은 저해하는지 확인하기 위해 역전사 PCR(Reverse transcription- Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 2달 동안의 실험기간이 종료후 각 실험물질을 도포한 퍼지 래트의 등 부위 조직을 회수한 후 Qiagen사의 Rneasy Protect을 이용하여 총 RNA를 추출하였다. cDNA를 얻기 위해 역전사를 시행하였다. 우선 추출한 RNA 5μg와 oligo-dT 1μg을 적정량의 증류수와 혼합하여 70℃에서 10분 동안 반응하여 RNA의 변성을 시켰다. 10분 동안 4℃에서 냉각한 후 cDNA합성 반응 조성물(5ㅧ역전사완충용액, 2.5mM dNTPs, 0.1M DTT와 MMLV 역전사효소200unit)을 맞춘 후 37℃ 에서 60분 동안 반응시켜 oligo-dT가 RNA에 결합하여 cDNA를 합성하도록 반응시켰다.

확인하고자 하는 PPARγmRNA를 증폭하기 위해 PCR을 시행하였다. 반응혼합물에는 합성된 cDNA 2 μl, 업스트림 프라이머(upstream primer)와 다운스트림 프라이머(downstream primer)(각각 10 pmol/μl), 10mM dNTP, 10ㅧ 반응물 완충용액 그리고 Taq Polymerase (5unit/μl)이 증류수에 포함되어있다. 만들어진 반응혼합물을 30 사이클(94℃ 3min, 94℃ 30sec, 60℃ 3min, 72℃ 1min, 72℃ 9min)씩 돌렸다. PPARγ의 업스트림 프라이머(upstream primer)는 ATA AAG TCC TTC CCG CTG ACC AAA GCC이었으며 다운스트림 프라이머(downstream primer)는 GCG GTC TCC ACT GAG AAT AAT GAC AGC이었다. 상대적인 발현을 비교하기 위해 β-액틴을 기준으로 삼았으며 이것의 업스트림 프라이머(upstream primer)는 CAT GCC ATC CTG CGT CTG GAC 이었으며, 다운스트림 프라이머(downstream promer)는 TAC TCC TGC TTG CTG ATC CAC ATC TGC이었다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 아무것도 처리하지 않는 비이클(vehicle)과 비교시 HPC를 도포한 조직에서는 PPARγ의 mRNA의 생성이 현저히 감소하였다.

이것은 HPC가 PPARγ 메커니즘에 있어서 PPARγ의 mRNA생성을 감소시켜 PPARγ 의 지방세포의 분화를 억제하여 지질 생성을 약화시키는 것으로 판단된다.

[실시예 10] 생쥐 유래 지방세포에서의 PC 및 HPC이 PPAR mRNA 전사에 미치는 영향

대조군과 실험물질들이 지방세포의 분화에 관여하는 PPAR의 발현을 촉진 혹은 저해하는지 확인하기 위해 역전사 PCR(Reverse transcription- Polymerase Chain Reaction)을 세포수준에서 수행하였다. 생쥐 유래 전지방세포인 3T3 L1을 미국세포주은행으로부터 구입하여(ATCC No. CL-173), 제공자에 의한 정보에 따라 배지상에서 37℃ , 5% 이산화탄소하에서 배양하였다. Bernlohr등[1984, Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:5439-5472]에 의한 지방세포분화조건[1uM dexamethasone, 0.5mM isobutylmethylsanthine, 10ug/ml insulin]에서 배양하면서, 대조군 비이클, PC, HPC의 실험물질을 처리하였다. 실험종료 후 세포들을 획득하여 회수한 후 Qiagen사(USA)의 Rneasy Protect을 이용하여 total RNA를 추출하였다. 이로부터 cDNA를 얻기 위해 역전사중합반응[Premix, Bioneer, KOREA]를 시행하였다. 우선 추출한 RNA 5g와 oligo-dT 1 g을 적정량의 증류수와 혼합하여 70℃에서 10분 동안 반응하여 RNA의 변성을 시켰다. 10분 동안 4℃에서 냉각한 후 cDNA합성 반응 조성물(5역전사완충용액, 2.5mM dNTPs, 0.1M DTT와 MMLV 역전사효소 200unit)을 맞춘 후 37℃ 에서 60분 동안 반응시켜 oligo-dT가 RNA에 결합하여 cDNA를 합성하도록 반응시켰다.

확인하고자 하는 PPAR mRNA를 증폭하기 위해 PCR을 시행하였다. 반응 혼합물에는 합성된 cDNA 2 l, 정방향 프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(downward primer)(각각 10 pmol/l), 10mM dNTP, 10 반응물 완충용액 그리고 Taq Polymerase (5unit/l)이 포함되어 이를 증류수에서 반응하였다. 만들어진 반응 혼합물을 30 cycle(94℃ 3min, 94℃ 30sec, 60℃ 3min, 72℃ 1min, 72℃ 9min)을 실시하였다. PPAR 의 정방향 프라이머는 ATGACAGCGACTTGGCAATA이었으며 역방향 프라이머는는 GCAATTGGAAGAAGGGAAT이었다. 상대적인 발현을 비교하기 위해 -actin을 기준으로 삼았으며 이것의 업스트림 프라이머(upstrean primer)는 CATGCCATCCTGCGTCTGGAC 이었으며 다운스트림 프라이머(downstream promer)는 TACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC이었다. 반응이 종료된 이후, 1.2% 정제 한천(agarose)에 전기영동하여 밴드를 확인함으로서 발현을 측정하였다. 그 결과는 도 10에 나타나 있다.

도 10에서, a는 전지방세포, b는 무처리 지방세포, c는 HPC(20uM)처리 지방세포, d는 HPC(5uM) 처리 지방세포, e는 PC(5uM) 처리 지방세포, f는 PC(20uM) 처리 지방세포 각각에서의 PPARγ의 발현량을 나타내는 것이다. 도 10의 사진을 보면 b(무처리 지방세포)의 경우 PPARγ의 발현량이 높게 나타난 반면, HPC로 처리한 b 및 c의 경우에는 거의 나타나지 아니하였으며, PC로 처리한 e, f의 경우에도 매우 낮게 나타난 것을 알 수 있다.

따라서, HPC와 PC, 특히 HPC는 지방세포 분화 및 성장을 억제하는 기능이 세포 수준에서 입증된 것이다.

[실시예 11] HPC의 인체피부에서의 피지 분비 억제 효과 측정을 위한 박막크로마토그래피법(TLC)을 통한 분비지질의 분석

상기 실시예들에서와 같이, 실제 세포단위, 그리고 동물실험에서는 이미 분비지질을 분석한 바 있다. 여기에 더하여 인체 임상실험을 수행하였다. 건강에 문제가 없는 25세부터 30세사이의 남자지원자들에 HPC를 포함하는 크림제형과 포함하지 않은 크림제형을 각각 제공하고 실험을 실시하였다. Downing등의 실험방법에 따라, 최소 15시간에 걸쳐 분비되는 분비지질량을 측정하였다. 먼저 12시간동안, 분지된 피지와 그리고 지질샘관의 분비지질을 제거하기 위해, 물을 첨가한 벤토나이트 크레이(bentonite clay)인 부직포를 이마에 붙여 방치하였다. 시간 경과 후 부직포를 제거해서 실험전까지 보관하고, 이후 다시 이마의 정가운데로부터 각각 이등분하여 2센터미터 부근에 크림제형1로서 도포(각각, 실험 개시 전(0주), 2주 경과 후, 4주 경과 후, 6주 경과 후에 도포하여 추출함) 한 후, 다시 부직포를 부착하여 분비되는 지질을 3시간동안 흡수시켰다. 이를 이서(ether)로서 추출하여 상기 실시예3과 같은 방법으로 분리 정량하였다. 그 결과는 도 11c 및 도 11b에 나타내었다.

도 11a는 총 지질량의 변화를, 도 11b는 피지량의 변화를 나타낸다. 도 11a는 12시간동안 분비된 지질과 그 후 3시간 동안 각 비처리군, 처리군에 대해 분비된 지질의 량을 나타낸다. 지질은 시간에 따라 점차 감소하였다.

도 11b는 피지량의 변화로서 왁스 에스터 25% 함량을 기준으로 계산되었다. HPC 처리군은 피지 분비가 현저히 감소된 것으로 나타났다.

상기 결과를 통해, HPC를 포함하는 제형을 처리한 경우 2주째부터 전체 지질이 감소함을 확인할 수 있어G고, 실제 분비되는 지질 역시 유의적으로 감소함을 알수 있었다.

Claims

포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방세포는 피지세포인 것을 특징으로 하는 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은, 지질대사이상, 지방세포의 비대 또는 과활성화 및 지방세포의 이상 증식 중 어느 하나 이상의 원인으로 유발되는 질환을 치료하기 위한 용도인 것을 특징으로 하는 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 질환은 비만 또는 여드름인 것을 특징으로 하는 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물.
포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피지분비 억제용 조성물.
포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 치료 또는 억제용 조성물.
제1항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린은 계란 또는 대두에서 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.
제7항에 있어서, 상기 포스파티딜콜린 또는 수화된 포스파티딜콜린은 단독으로 또는 다른 유효성분과 조합된 형태로 포함된 것을 특징으로 하는 조성물.
포스파티딜콜린 및 수화된 포스파티딜콜린으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 피지선 발달 억제용 조성물.
제1항에 따른 지방세포의 분화 또는 성장 억제용 조성물 또는 제6항에 따른 비만 치료 또는 억제용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 비만 치료용 키트.
제2항에 따른 지방세포의 분화 또는 성장을 억제하는 조성물, 제5항에 따른 피지분비 억제용 조성물, 또는 제9항에 따른 피지선 발달 억제용 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 여드름 치료용 키트.
제10항에 있어서, 지방세포의 분화 또는 성장을 억제하는 다른 조성물 또는 비만의 치료 또는 예방용의 다른 조성물과 함께 포함된 것을 특징으로 하는 비만 치료용 키트.
제11항에 있어서, 상기 조성물은 피지분비를 억제하는 다른 조성물 또는 피지생성세포의 분화 또는 성장을 억제하는 다른 조성물과 함께 포함된 것을 특징으로 하는 여드름 치료용 키트.