KR20040108265A - 플라보노이드를 포함하는 항-죽상경화증 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 플라보노이드를 포함하는 항-죽상경화증 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 혈관내피세포에 단핵구의 세포유착을 방지하여 동맥경화로의 발생을 초기에 차단시킬 수 있는 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항-죽상경화증 조성물을 제공한다.

Description

플라보노이드를 포함하는 항-죽상경화증 조성물{ANTI-ATHEROSCLEROSIS COMPOSITION CONTAINING FLAVONIDS}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 플라보노이드를 포함하는 항-죽상경화증 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항-죽상경화증 조성물에 관한 것이다.

[종래기술]

혈중 고콜레스테롤은 죽상경화증을 발현시키는 핵심요인으로 간주되어 왔다(Ross R. 1993.Nature362: 801-809 ; Krauss RM. 1987.Am Heart J113: 578-582 ; Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Khoo JC, Witztum JL. 1989.N Eng J Med320: 915-924). 죽상경화과정의 초기단계는 임파구, 다형다핵성 백혈구 및 단핵구가 손상된 혈관 내피조직에 결집되면서 나타나는데, 이는 세포유착분자들(cell adhesion molecules: CAMs) 예를들면, VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1(intracellular cell adhesion molecule-1) 및 E-selectin 등에 의하여 수반된다고 알려져 있다(Scalia R, Appel JZ III, Lefer AM. 1998.Arterioscler Thromb Vasc Biol18: 1093-1100 ; Schonbeck U, Mach F, Libby P. 2001.Circ Res89: 1092-1103 ;Osborn L, Hessian C, Tizard R, Vassalio C, Luhowskyj S, Chi-Rosso S, Lobb R. 1989.Cell59: 1203-1211; Cybulsky ML, Gimbrone MA Jr. 1991.Science251: 788-791).

상기 CAMs은 인터루킨-I과 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α: TNF-α) 등의 염증성 사이토카인들에 의하여 발현이 증가된다(Dustin ML, Rothlein R, Bhan AK, Dinarello CA, Springer TA. 1986.J Immunol137: 245-254). 또한 CAMs의 발현은 다양하게 이루어지며, 성장인자, 혈소판 활성자 및 주화성 인자(chemotactic factor)에 의한 복잡한 조절기전이 관여하는 것으로 추정된다. CAMs은 토끼와 생쥐에서 뿐만 아니라 사람의 관상동맥과 복부대동맥의 죽상경화성 병변부위에서 발견되며, 신생혈관 및 염증성 침범부위의 죽상경화성 플라그 형성에 관여하는 것으로 보고되고 있다(Iiyama K, Hajra L, Iiyama M, Li H, DiChiara M, Medoff BD, Cybulsky MI. 1999.Circ Res85: 199-207 ; Lessner SM, Prado HL, Waller EK, Galis ZS. 2002.Am J Pathol160: 2145-2155 ; Van der Wal AC, Das PK, Tigges AJ, Becker AE. 1992.Am J Pathol141: 161-168 ; O`Brien KD, Allen MD, McDonald TO, Chait A, Harlan JM, Fishbein D, McCarty J, Furgerson M, Hudkins K, Benjamin CD, Lobb R, Alpers CE. 1993.J Clin Invest92: 945-951).

플라보노이드는 녹차, 콩류, 포도, 마늘 및 양파류 등의 채소나 과일 등의 식물체에 존재하는 수용성 색소물질로, 프랑스인 등이 적포도주의 생리활성작용 효과를 설명한 프렌치 파라독스(French Paradox)에 잘 나타나 있다(Levy A, Fuhrman B, Markel A, Dankner G, Ben-Amotz A, Presser D, Aviram M. 1994.Ann Nutr Metab38: 287-294). 플라보노이드는 다양한 형태로 존재하며 플라보놀, 플라본, 이소플라본, 플라보논, 플라반-3-올 및 안토시아니딘의 소그룹으로 분류된다. 그러나, 모든 플라보노이드가 동일한 생리활성을 갖는다고 볼 순 없다.

플라보노이드는 세포나 조직에서 활성산소종을 제거하는 자연적인 항산화제의 역할을 지니고 있다고 보고되고 있으며(Kris-Etherton PM, Keen CL. 2002.Curr Opin Lipidol13: 41-49 : Nijveldt RJ, van Nood E, van Hoorn DE, Boelens PG, van Norren K, van Leeuwen PA. 2001.Am J Clin Nutr74: 418-425 ; Braca A, Sortino C, Politi M, Morelli I, Mendez J. 2002.J Ethnopharmacol79: 379-381), CAMs과 기질 프로테아제(matrix protease)를 억제시키는 항염증성 물질로서도 보고되고 있다(Bito T, Roy S, Sen CK, Shirakawa T, Gotoh A, Ueda M, Ichihashi M, Packer L. 2002.FEBS Lett520: 145-152 ; Sartor L, Pezzato E, Dell'Aica I, Caniato R, Biggin S, Garbisa S. 2002.Biochem Pharmacol64: 229-237 ; Middleton E Jr, Kandaswami C, Theoharides TC. 2000.Rev52: 673-751). 또한, 플라보노이드는 프로안토시아니딘과 페놀릭산과 동일하게 폴리페놀릭 화합물로, 현재 순환기 질환의 예방이나 치료에 그 활용성이 제시되고 있다(Cotelle N. 2001.Curr Top Med Chem1: 569-590 ; Hirano R, Sasamoto W, Matsumoto A, Itakura H, Igarashi O, Kondo K. 2001.J Nutr Sci Vitaminol(Tokyo) 47: 357-362). 그러나 플라보노이드의 생리적인 효과가 생체 내에서도 유효한지 확인된 바 없으며, 작용기작에 관한 보고는 이루어지지 않은 실정이다.

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 동맥경화로의 진행을 억제할 수 있는 항-죽상경화증 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 혈관내피세포에 단핵구의 세포유착을 저해할 수 있는 물질을제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 종양괴사인자가 처리된 혈관내피세포에서의 플라본 및 쿼세틴의 활성을 확인하여 그 활용성을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 혈관내피세포에 칼세인-AM으로 염색 표지된 단핵구의 유착을 확인한 사진(A) 및 THP-1 유착율을 나타낸 그래프(B)이다.

도 2는 플라보노이드을 처리한 세포의 생존율을 나타낸 것이다.

도 3은 플라보노이드가 TNF-α에 의해 유도된 VCAM-1 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 것이다.

도 4는 플라보노이드의 혈관내피세포에서 ICAM-1과 E-selectin 발현 억제효과를 확인한 웨스턴 블롯사진이다.

도 5는 VCAM-1 및 ICAM-1의 mRNA 전사를 RT-PCR로 확인한 것이다.

도 6은 NF-κB의 전위에서 플라보노이드 영향을 확인한 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다.

도 7은 NF-κB의 세포내 국지성을 형광현미경으로 확인한 것이다.

도 8은 플라보노이드의 NF-κB 핵전사인자 활성에 미치는 영향을 혈관내피세포에서 확인한 것이다.

도 9는 플라보노이드의 AP-1 전사인자 활성에 미치는 영향을 혈관내피세포에서 확인한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항-죽상경화증 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 종양괴사인자-α에 의하여 발현이 유도된 세포유착단백질의 발현억제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 핵전사인자 활성 저해용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 플라보노이드의 항동맥경화작용을 연구하던 중, 플라보노이드 중 쿼세틴 및 플라본계 화합물(flavones)이 종양괴사인자로 유도된 세포유착분자의 발현을 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항죽상경화증 조성물을 제공한다.

본 발명의 플라본계 화합물은 플라본 또는 플라본의 골격 구조를 갖는 통상의 화합물로, 대표적인 것으로는 플라본, 크리신, 프리메틴, 아피제닌 및 루테올린이 있다.

본 발명의 쿼세틴 또는 플라본계 화합물은 염증성 종양괴사인자인 TNF(tumor necrosis factor)-α에 의하여 유도된 세포유착단백질 발현을 억제하여 죽상경화증으로의 진행을 방지한다. 대표적인 세포유착단백질로는 E-selectin, VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)과 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule-1)가 있다.

이러한 쿼세틴 또는 플라본계 화합물의 항-죽상경화증 활성은 핵전사인자 예를들어 NF-κB 및 AP-1의 핵내 전위 또는 활성을 억제하고, 이로 인하여 세포유착단백질 발현을 억제하는 것이다.

본 발명의 일실시예에서, TNF-α를 처리한 혈관내피세포는 무처리군에 비하여 THP-1 단핵구 유착이 유의적으로 증가되었으나, 플라본과 플라바놀 중 쿼세틴을 부가적으로 처리한 경우 혈관내피조직에 단핵구의 유착이 억제됨을 확인하였다(도 1a 및 1b). 이러한 세포유착 억제활성은 플라본과 쿼세틴의 세포독성에 의한 것이 아닌(도 2), TNF-α에 의하여 유도된 세포유착단백질 발현을 억제하여 나타난 것이다(도 3, 4 및 5).

또다른 실시예에서, 세포유착단백질 발현 억제가 전사인자와 관련이 있는지 여부를 확인한 결과, 플라본계 화합물과 쿼세틴이 NF-κB 및 AP-1의 핵내 활성을 저해함을 관찰하였다(도 6 내지 9).

따라서, 본 발명의 플라본계 화합물 또는 쿼세틴은 전사인자의 핵내 활성을 저해하며, TNF-α로 유도된 세포유착단백질의 발현을 현저히 감소시키므로써 죽상경화증을 예방 및 치료하는 용도로 사용할 수 있다.

이에, 본 발명은 플라본계 화합물 또는 쿼세틴을 유효성분으로 포함하는 항-죽상경화증 조성물을 제공한다.

본 발명의 항-죽상경화증 조성물은 플라본계 화합물 또는 쿼세틴을 단독으로 포함할 수 있으며, 약리학적으로 허용가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)는 모두 사용가능하다.

본 발명의 항-죽상경화증 조성물은 플라본계 화합물 또는 쿼세틴을 단독 또는 2종이상 포함할 수 있으며, 함량은 적절히 조절하는 것이 좋으나 바람직하기로는 항-죽상경화증 조성물에 20 내지 70 중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 함량이 10 중량% 미만인 경우, 항-죽상경화증 효과가 미비할 수 있으며 함량이 90 중량% 초과하는 경우 투여량 대비 효과가 다소 감소될 수 있어 비경제적이다.

본 발명의 항-죽상경화증 조성물은 약제 또는 식품첨가제로 사용할 수 있다. 항-죽상경화증 조성물의 제형은 경고제, 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 침제, 정제, 주사제, 캅셀제, 크림제, 트로키제 또는 파스타제일 수 있으며, 경구 또는 비경구로 사용될 수 있다. 바람직하게는 경구용이다.

본 발명의 항-죽상경화증 조성물의 투여량은 약제의 통상적인 투여량으로, 일예로 1일 300 내지 1,000 mg의 플라본계 화합물 또는 쿼세틴을 사용할 수 있다. 상기 투여량은 이에 한정되진 않으며, 환자의 연령, 성별, 상태 및 병용되는 약물에 따라 달리 적용되는 것이 바람직하다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 플라보노이드에 의한 단핵구 세포유착 억제효과 검증

1-1. 실험방법

혈관내피세포

혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cells)는 콜라게나제 효소(collagenase type III, Worthington Biochemicals Co., Lakewood, NJ, USA)를 이용하여 분리하였고, 37 ℃, 95 % O₂＋5 % CO₂배양조건에서 일차배양 하였다(Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, Minick CR. 1973.Clin Invest52: 2745-2756). 혈관내피세포의 진위 판별은 DiI(1.1'-dioctadecyl-3,3,3,3- tetramethylindocarbocyanine perchlorate)의 형광물질(Molecular Probes Co., Eugene, OR, USA)로 표지된 아세틸화된 저밀도지단백의 축적 실험을 통하여 이루어졌다(Voyta JC, Via DP, Butterfield CE, Zetter BR. 1984.J Cell Biol99: 2034-2040).

세포배양실험

일차배양으로 준비된 미세혈관 내피세포는 10 % FBS(fetal bovine serum), 2 mM 글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 0.9 mg/mL bovine brain extract, 0.75 mg/mL 사람 외피성장인자 및 0.075 mg/mL 하이드로코르티존이 첨가되어 있는 25 mM HEPES-M199 배지(Sigma Co. St. Louis, MO, USA)에서 배양하였다. 사람 단핵구 백혈병 세포인 THP-1 단핵구 세포주는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다.

플라보노이드

플라보노이드 소그룹으로 분류되는 4가지 형태는 각각 시그마사에서 구입하였다.

- 플라바놀: (-)에피갈로카테킨 갈레이트, (+)카테킨

- 플라보놀: 쿼세틴, 미리세틴

- 플라바논: 나리긴, 헤스페리딘

- 플라본: 루테올린, 아피제닌

플라보노이드는 세포배양실험을 위하여 미리 디메틸 술폭시드(DMSO)에 녹여서 사용하였고(Anderson JJ, Garner SC. 1998.Baillieres Clin Endocrinol Metab12: 543-557), 세포배양에 사용된 DMSO의 최종농도는 0.5 %로 하였으며, 예비실험을 통한 각각 플라보노이드의 배양실험을 위한 적정농도는 50 μM이었다.

In vitro유착 실험

플라보노이드 50 μM가 첨가된 M199 배지에서 혈관내피세포를 20분간 전처리하여 10 ng/mL TNF-α로 6시간 활성화시켰다. RPMI 1640 배지에서 배양한 THP-1 단핵구는 5 μM 칼세인-AM(Molecular Probes Co.)으로 30분간 염색시키고, 혈관내피세포와 동시배양시켜서 세척한 다음 SPOT II 디지털 카메라가 부착된 형광현미경 상에서 485 nm 여기, 538 nm 방출 파장으로 THP-1 단핵구의 혈관내피세포에 유착정도를 측정하였다.

통계처리

실험결과는 평균 ± SEM으로 표시하였으며, SAS PC 프로그램(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 그룹간의 차이(p<0.05)를 비교하였다. 2 웨이 ANOVA로 검증하였고 유의적인 차이를 보이는 그룹에 대해서는 투키 검정(Tukey correction)으로 검증하였다.

1-2. 결과

TNF-α로 활성화된 혈관내피세포와 단핵구의 유착에, 50 μM 플라보노이드가 어떠한 영향을 미치는 지를 조사하였다. 최 등(Choi YJ, Choi JS, Lee SH, Lee YJ, Kang JS, Kang YH. 2002.J Soc Food Sci Nutr31: 672- 678)의 연구결과에 따라 50 μM 플라보노이드를 세포배양에 사용하였는데, 이 농도에서는 혈관내피세포의 증식과정에서 세포독성을 나타내지 않았다.

도 1은 혈관내피세포에 칼세인-AM으로 염색 표지된 단핵구의 유착을 확인한 사진(A) 및 THP-1 유착율을 나타낸 그래프(B)이다.

TNF-α를 6시간 처리한 혈관내피세포는 이것을 처리하지 않은 혈관내피세포에 비하여 THP-1 단핵구 유착이 유의적으로 증가되었다. 한편, TNF-α를 처리한 혈관내피세포에 각각의 플라보노이드를 처리하였을 때, 단핵구 유착을 억제시키는 플라보노이드의 효과는 각기 다르게 나타났다. 플라본인 아피제닌과 루테올린은 TNF-α에 의한 단핵구 유착을 완전히 억제하였으며, 플라보놀인 쿼세틴에서도 상당한 억제효과가 나타났다. 반면에, 플라바논인 나린긴, 헤스페리딘, 그리고 플라바놀인 (-)에피갈로카테킨 갈레이트와 (+)카테킨에서는 이러한 억제효과가 전혀 보여지지 않았다. 따라서, 플라본과 플라바놀 중 쿼세틴은 죽상경화과정에서 활성화된 혈관내피조직 부위에 단핵구의 유착을 억제하여 죽상경화과정의 초기단계를 억제시킬 수 있을 것으로 여겨진다.

또 다른 실험에서는, 루테올린 아피제닌 및 쿼세틴에 의한 단핵구 유착 억제가 플라보노이드가 TNF-α-활성화된 혈관내피세포에 세포독성을 유발하여 혈관내피세포의 숫적 감소로 인하여 나타난 것인지를 조사하였다. TNF-α 존재하에 플라보노이드의 세포독성 효과를 측정하기 위하여 플라보노이드에 의한 세포생존율을 조사하였다. 세포생존율은 TNF-α가 처리된 세포에 플라보노이드를 가한 후 5시간 후 MTT법으로 측정하였다.

도 2는 플라보노이드 처리한 세포의 생존율을 나타낸 것이다. 혈관내피세포의 THP-1 유착에 탁월한 억제효과를 보인 루테올린, 아피제닌 및 쿼세틴은 혈관내피세포 대조군의 세포생존율과 유의적으로 다르지 않았으므로, 플라보노이드 50 μM은 TNF-α로 처리된 혈관내피세포에 세포독성을 전혀 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

따라서, TNF-α로 활성화된 혈관내피세포의 단핵구 유착은 플라보노이드의 세포독성이 아닌 플라보노이드의 생리활성으로 인하여 억제되었다고 볼 수 있다.

활성화된 혈관내피세포의 단핵구 유착에 대한 플라보노이드의 억제효과는 플라보노이드의 활성산소를 제거하는 항산화능과는 무관한 것이 아닌가 추정할 수 있다. 본 연구에 사용된 플라보노이드는 세포나 조직에서 활성산소종을 제거하는 자연적인 항산화제의 역할을 지니고 있다고 보고되고 있다. 최근 연구에서, 본 실험에 사용된 (-)에피갈로카테킨 갈레이트, (+)카테킨 및 아피제닌의 1,1-디페닐-2-피크릴-하이드라질(DPPH) 자유 라디칼의 소거활성이 보고된 바 있다. (-)에피갈로카테킨 갈레이트와 (+)카테킨은 DPPH를 50 % 소거할 수 있는 농도인 SC₅₀이 10 μM 이하로 상당한 항산화능을 가지는 것으로 확인되었다. 그러나, 혈관내피세포의 단핵구 유착에 탁월한 억제효과를 보인 아피제닌의 DPPH 소거활성인 SC₅₀은 10 mM 이상으로 항산화능을 전혀 나타내지 못하는 것으로 확인되었을 뿐만 아니라, H₂O₂의 하이드록실 라디칼에 의하여 유발된 세포사멸에 대하여 억제효과를 전혀 갖지 못하였다. 따라서, 플라보노이드의 단핵구 유착 억제작용은 라디컬 소거활성작용으로 인하여 발휘되는 것으로 아닌 것으로 생각된다.

실시예 2: TNF-α로 증가된 CAMs 단백질 발현에 대한 플라보노이드의 억제효과 검증

2-1. 실험방법

단백질 분리와 웨스턴 블롯 분석

혈관내피세포의 VCAM-1, ICAM-1 및 E-selectin의 CAMs 단백질 발현을 측정하기 위하여 웨스턴 블롯을 실시하엿다.

혈관내피세포에 100 % 글리세롤, 10 % SDS, 1 % β-글리세로포스페이트, 0.1 M Na₃VO₄, 0.5 M NaF 및 프로테아제 저해 칵테일이 함유된 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 세포용혈 완충액을 처리하여 세포 추출물을 준비하였다. 세포 추출물의 단백질은 8 % SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동된 단백질 밴드들은 나이트로셀룰로스막으로전이시키고, 비특이적인 결합을 방지하기 위하여 5 % 스킴 밀크를 처리한 다음 각각의 CAMs 단백질의 일차항체(monoclonal rabbit anti-human antibody, Santa Cruz Biotech. Inc., Santa Cruz, CA, USA)를 1,000배로 희석하여 교반하면서 반응시키고, 염소 항-토끼 호스래디시 페록시다제(1:7,500, Jackson Immuno Research Lab., West Grove, PA, USA)의 이차항체로 1시간 반응시켰다. 나이트로셀룰로스막에 있는 CAMs 단백질은 슈퍼시그널 웨스트 피코 화학발광기(Supersignal West pico chemiluminescence, Pierce Biotech. Inc., Rockford, IL, USA)로 검출하여 코니카 X-레이 필름으로 촬영하였다.

2-2. 결과

CAMs은 주로 혈관내피조직에 단핵구가 결집하는 것을 담당하고, 죽상경화성 혈관손상을 초래하며 죽상경화성 플러그 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다(Dustin ML, Springer TA. 1988.J Cell Biol107: 321-331). TNF-α에 의한 혈관내피세포의 단핵구 유착에 있어 플라보노이드의 억제효과가 혈관내피세포의 CAMs 발현 억제에 기인한 것일지 조사하였다. 이를 위하여 CAMs 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 시도하였다.

도 3은 플라보노이드가 TNF-α에 의해 유도된 VCAM-1 단백질 발현에 미치는 영향을 확인한 것이다. 혈관내피세포 대조군은 TNF-α 무처리시 VCAM-1 단백질을 거의 발현하지 않으나, TNF-α를 처리하였을 때 VCAM-1 단백질을 10배 이상 발현하였다. 반면에 TNF-α로 처리된 내피세포에 각각의 50 μM 플라보노이드로 처리한 경우 각각의 플라보노이드는 VCAM-1 발현을 억제하였다. 특히, 루테올린과 아피제닌은 TNF-α에 의하여 증가된 혈관내피세포의 VCAM-1 발현을 완전히 억제시켰으며, 쿼세틴 역시 TNF-α에 의하여 증가된 VCAM-1 발현을 3배 정도 억제시켰다. 그 외에도 단핵구의 유착에는 별 효과를 보이지 않은 미리세틴과 헤스페리딘도 VCAM-1 발현을 유의적인 수준으로 감소시켰다. 그러나, 녹차의 폴리페놀릭 화합물인 (-)에피갈로카테킨 갈레이트와 (+)카테킨은 염증성 사이토카인에 의한 VCAM-1 발현에 전혀 유의적인 억제효과를 나타내지 못하였다.

따라서, 플라보노이드에 의한 VCAM-1 단백질 발현 억제가 THP-1 단핵구의 유착을 차단시키는 결과로 나타나는 것으로 볼 수 있다.

도 4는 플라보노이드의 혈관내피세포에서 ICAM-1과 E-selectin 발현 억제효과를 확인한 웨스턴 블롯사진이다. TNF-α로 활성화되지 않은 정상세포는 ICAM-1과 E-selectin을 아주 약하게 발현하나, TNF-α 처리로 인하여 발현이 현저히 증가하였다. 반면에 각각의 플라보노이드 전처리후 TNF-α를 처리한 경우 특히 쿼세틴, 루테올린 및 아피제닌에서 TNF-α에 의하여 증가된 ICAM-1 및 E-selectin 발현이 현저히 감소되었다. 그 외 플라보노이드는 ICAM- 1과 E-selectin 발현에 대한 뚜렷한 억제효과를 보이지는 않았다.

따라서, 쿼세틴, 루테올린 및 아피제닌은 혈관내피세포의 CAMs 단백질의 발현을 억제하므로써 적어도 혈관내피조직에 단핵구의 유착을 억제시킴을 확인할 수 있었다. 또한 각각의 CAMs 단백질 발현 억제작용에 있어서 플라보노이드는 억제능이 다르게 나타나며, VCAM-1 단백질 발현에 대한 억제작용이 여러 플라보노이드에서 현저하게 나타난다는 것도 알 수 있었다. 여기서 모든 플라보노이드가 이러한활성을 지니지 않으며, 라디컬 소거활성이 낮은 플라본 계통의 플라보노이드가 죽상경화의 초기과정을 차단시키면서 죽상경화증과 관상동맥질환을 예방하고 치료하는 데에 효과적이라고 할 수 있다.

실시예 3: 활성화된 혈관내피세포의 CAMs 단백질 전사작용에 대한 플라보노이드의 억제효과 검증

3-1. 실험방법

RNA 분리와 역전사 중합효소 연쇄반응법

배양실험 후에 혈관내피세포의 RNA를 상업용 트리졸 시약(Gibco BRL, Gainsberg, MD, USA)을 제조회사의 사용법에 따라 사용하여 추출하였다. RNA (5 μg)를 Tris 완충액(50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM dNTP)에서 10,000 units 역전사효소(Promega Co., Madison, WI, USA) 및 500 μg/ mL oligo-(dT)₁₅프라이머(Bioneer Co., Korea)를 넣고 42 ℃에서 50분간 역전사 과정을 실시하였다. RT-PCR은 70 ℃에서 15분간 실시한 다음 중지하였다.

VCAM-1 mRNA 증폭용 프라이머는 서열번호 1 및 2의 서열을 사용하였고, ICAM-1 mRNA 증폭용 프라이머는 서열번호 3 및 4의 서열을 사용하였으며, β-엑틴(a housekeeping gene) mRNA 증폭용 프라이머로 서열번호 5 및 6의 서열을 사용하였다.

PCR 과정은 트리스 완충액(10 mM Tris-HCl (pH 8.3)), 25 mM MgCl₂, 10 mM dNTP, 100 unitsTaqDNA 중합효소(Promega Co.), 0.1 μM β-엑틴 프라이머 및0.1 μM VCAM-1 프라이머 또는 ICAM-1 프라이머로 94 ℃에서 1분간, 55 ℃에서 2분간 그리고 72 ℃에서 3분간씩 30번 반복 실시하였다. 증폭된 PCR 산물(5 μL)은 EtBr(0.5 μg/mL)이 함유된 1 % 아가로즈-포름알데하이드 겔 상에서 전기영동을 실시하였으며, 겔상의 밴드들은 UV 트랜스-일루미네이터(Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ, USA)로 가시화 시킨 후 폴라로이드 타입 667 양성/음성 필름으로 현상하였다. 또한 프라이머를 음성 대조구 시료로 RT-PCR을 동일하게 실시하여 오염상태를 정기적으로 검사하였다.

3-3. 결과

활성화된 CAMs 단백질 발현에 대한 플라보노이드의 억제효과가 CAMs 단백질의 mRNA 수준에서 조절되는 지를 규명하기 위하여, 혈관내피세포에서의 CAMs 단백질의 mRNA 수준을 반정량적인 RT-PCR 방법으로 조사하였다.

도 5는 VCAM-1 및 ICAM-1의 mRNA 전사를 RT-PCR로 확인한 것이다.

도 5에서, TNF-α를 처리하지 않은 정상세포에서는 VCAM-1과 ICAM-1 각각의 mRNA 발현이 매우 낮았으나, TNF-α 처리시 전사가 현저히 증가되었다. 또한 루테올린과 아피제닌은 VCAM-1 mRNA의 발현을 상당히 억제하였으며, ICAM-1 mRNA의 전사는 다소 억제된 것으로 나타났다. 쿼세틴은 VCAM-1과 ICAM-1 mRNA 전사를 다소 억제시켰다.

따라서, 단핵구의 세포유착을 억제시키는 플라보노이드들은 CAMs 단백질 발현과정에서 유전자 전사단계에 직접 작용하여 CAMs의 발현을 억제시킨 것으로 확인되었다.

실시예 4: 활성화된 혈관내피세포의 CAMs 단백질 전사작용에 대한 플라보노이드의 핵전사인자 활성 억제효과 검증

4-1. 실험방법

NF-κB 단백질 국재화

혈관내피세포(6.0 x 10⁴cells)를 4-웰 글라스 챔버에서 배양하고, TBS로 세척한 다음 TBS에 10 % 염소 혈청을 가하여 1시간동안 배양하여 비특이적인 결합을 방지하였다. 세포들은 4 % 차가운 포름알데하이드로 30분간 고정시키고 TBS로 두차례 세척한 다음 토끼 다클롱성 항-인간 NF-κB 일차항체(1:50 희석)를 충분히 가하였다. 4 ℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음 세포는 TBS로 세척한 다음 이차항체인 형광성 이소티오시아네이트-접합된 염호 항-토끼 IgG(1:200 희석)을 가하여 배양하였다. 세포는 올림푸스 BX50 형광현미경으로 촬영하였다.

핵 추출물 준비

핵 단백질 추출물은 NF-κB 및 AP-1 의 DNA 결합활성을 검증하기 위하여, 혈관내피세포의 세제 용해물 준비방법으로 준비하였다(Baer M, Dillner A, Schwartz RC, Sedon C, Nedospasov S, Johnson PF. 1998.Mol Cell Biol18: 5678-5689).

세포는 PBS로 세척하고 완충액(20 mM HEPES, pH 7.9, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1% Nonidet-P40, 0.4 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 0.1 ng/mL 루펩틴 및 5 g/mL 아포트로닌)으로 용해시킨 다음 10분간 얼음에 방치하였다. 이후 3,000g로 20분간 원심분리하여 펠렛을 수거하고, 펠렛은 고농도 염 완충액(420 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM HEPES (pH 7.9), 25% 글리세롤, 1 mM DTT, 0.4 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 0.1 ng/mL 루펩틴 및 5 g/mL 아포트로닌)에 4 ℃에서 20분간 교반하였고, 원심분리하여 상층액을 회수하여 -70 ℃에 보관하였다.

또한 NF-κB 국재를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석을 핵단백질 추출물로 실시하였다. 웨스턴 블롯에 사용한 항체는 항-인간 NF-κB 일차항체(1:1,000 희석)를 사용하였고, 방법은 상기에 언급한 방법에 따라 실시하였다.

전기영동상 이동변이 분석(Electrophoretic mobility shift assay; EMSA)

NF-κB 및 AP-1에 대한 결합부위의 보존적 서열을 포함하는 두가닥 올리고뉴클레오타이드를 각각 서열번호 7 및 8로 제조하여 프로메가사로부터 구입하였고, 이를 EMSA에 프로브로 이용하였다(Lee YW, Hennig B, Yao J, Toborek M. 2001.J Neurosci Res66: 583-591). NF-κB 및 AP-1 각각의 프로브들은 30 μCi의 [γ-³²P]ATP(Amersham Pharmacia Biotech)로 표지하였다.³²P-표지된 프로브에 25 μL 반응혼합물(250 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 2.5 mM EDTA, 2.5 mM DTT, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 % 글리세롤, 0.25 mg/mL poly(dl-dC)poly(dI-dC) 및 4 μg 핵추출물)을 가하여 상온에서 10분간 두어 DNA 결합반응을 유도하였다. 프로브-DNA 복합체는 5 % 폴리아크릴아마이드 겔상에서 0.25배 TAE(40 mM Tris-acetate, 1.0 mM EDTA, pH 8.0) 완충액으로 전기영동하였으며, 겔은 건조시킨 후 X-레이 필름에 현상하였다.

4-2. 결과

NF-κB p65의 세포내 국재성 확인

쿼세틴, 루테올린 및 아피제닌이 TNF-α에 의한 CAMs 단백질 발현을 전사인자들의 결합 및 트랜스엑티베이션(transactivation) 간섭으로 저해하는지 여부를 확인하기 위하여, 플라보노이드의 NF-κB 세포내 국재성에 미치는 영향을 TNF-α 처리된 혈관내피세포에서 조사하였다.

도 6은 NF-κB의 트랜스엑티베이션에서 플라보노이드 영향을 확인한 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다. TNF-α가 처리된 혈관내피세포에서는 NF-κB가 다량 핵내로 전위하였으며, 플라보노이드를 각각 50 μM로 처리한 세포의 핵에서는 NF-κB의 수준이 감소하였고, 세포질에서는 여전히 높은 수준을 유지하였다. 따라서, 플라보노이드가 NF-κB의 핵내 국재성을 저해하는 것으로 여겨진다.

도 7은 NF-κB의 세포내 국재성을 형광현미경으로 확인한 것이다. 대조군에서는 세포질 염색이 확인되었으나 TNF-α를 처리한 경우 핵내 염색이 확인되었다. 즉, TNF-α는 NF-κB의 핵내 국재성을 유도하는 것으로 추정된다. 그러나 TNF-α 및 플라보노이드를 처리한 세포에서는 핵내 염색이 현저히 감소되었다.

또한 플라보노이드의 존재 유무 조건에서, 전사인자인 NF-κB 및 AP-1의 DNA 결합활성을 TNF-α처리한 혈관내피세포의 핵추출물에서 EMSA로 확인하였다.

도 8은 플라보노이드의 NF-κB 전사인자 활성에 미치는 영향을 혈관내피세포에서 확인한 것이다. 도 8에서, TNF-α처리군은 NF-κB 결합활성이 핵추출물에서 매우 강한 것으로 확인되어, 단백질-NF-κB DNA 복합체가 TNF-α에 의하여 활성화되는 것으로 설명되었다. 그러나 플라보노이드 처리군에서는 활성화된 NF-κB결합이 억제되는 것으로 확인되어, 플라보노이드가 NF-κB-의존적 DNA-단백질 복합체 형성을 특이적으로 방지하여 내피세포의 CAMs 유전자의 활성화를 저해하는 것으로 추정되었다.

또한 AP-1을 통한 CAMs 프로모터 활성은 TNF-α 및/또는 플라보노이드 처리한 혈관내피세포 핵추출물의 AP-1 올리고뉴클레오타이드의 DNA 결합활성 실험으로 조사하였다. AP-1 결합 특이성은 비표지된 AP-1과의 결합능으로 결정하였다.

도 9는 플라보노이드의 AP-1 전사인자 활성에 미치는 영향을 혈관내피세포에서 확인한 것이다. TNF-α가 처리된 세포의 핵추출물에서는 AP-1 결합활성이 유도되었으나, 반면에 플라보노이드 처리된 세포에서는 AP-1 결합활성이 매우 약하게 유도되었다. 따라서, 플라보노이드는 TNF-α로 인하여 유도된 AP-1 활성을 저해하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 쿼세틴 및 플라본계 화합물은 혈관내피세포에 단핵구의 세포유착을 방지하여 동맥경화로의 발생을 초기에 차단할 수 있으며, 이를 항-죽상경화증 조성물로 사용할 수 있다.

<110> HALLYM UNIVERSITY <120> ANTI-ATHEROSCLEROSIS COMPOSITION CONTAINING FLAVONIDS <130> dpp20031459 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for VCAM-1 mRNA <400> 1 atgcctggga agatggtcgt ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for VCAM-1 mRNA <400> 2 tggagctggt agaccctcgc tg 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for ICAM-1 mRNA <400> 3 ggtgacgctg aatggggttc c 21 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for ICAM-1 mRNA <400> 4 gtcctcatgg tggggctatg actc 24 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for beta-actin <400> 5 gactacctca tgaagatc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for beta-actin <400> 6 gatccacatc tgctggaa 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NF-kB probe <400> 7 agttgagggg actttcccag gc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ap-1 probe <400> 8 cgcttgatga gtcagccgga a 21

Claims (7)

1. 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 항-죽상경화증 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 플라본계 화합물은 루테올린 또는 아피제닌인 것인 조성물.
3. 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 종양괴사인자-α에 의하여 발현이 유도된 세포유착단백질의 발현억제용 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 세포유착 단백질은 E-셀렉틴(selectin), VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1) 및 ICAM-1(Intracellular adhesion molecule-1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
5. 제 3항에 있어서, 상기 플라본계 화합물은 루테올린 또는 아피제닌인 것인 조성물.
6. 쿼세틴 또는 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 전사인자 핵내 활성 저해용 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 전사인자는 NF-κB 또는 AP-1인 것인 조성물.