KR20040102534A - 질소성 영양염류의 농도 측정용 전극 및 이를 포함하는바이오센서 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소(2-20mg/ml), 전극 표면과 상기 효소 사이에 결합매체로서 작용할 수 있는 단백질(7 내지 17 w/v%), 뉴트럴 레드(0.1 내지 1 mM), 글루타르알데히드(0.8 내지 2 w/v%), 및 흑연 분말(5 내지 30 w/v%)을 포함하는 혼합물이 금 또는 백금 전극에 도말된, 질소성 영양염류의 농도 측정용 효소 전극과 이를 포함하는 바이오센서를 제공한다.

Description

질소성 영양염류의 농도 측정용 전극 및 이를 포함하는 바이오센서{Electrode for measuring nitrogenic nutrient salts and biosensor comprising the same}

본 발명은 질소성 영양염류의 농도 측정용 전극 및 센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소를 포함하는 질소성 영양염류의 농도 측정용 전극 및 이를 포함하는 바이오센서에 관한 것이다.

바이오센서(biosensor)는 생체에서 특정한 생화학 반응을 선택적으로 촉매하는 효소를 적당한 전기화학적 장치에 고정하여 효소에 의한 촉매반응을 전기신호로 변환하여 반응물질의 농도를 직접 또는 간접적으로 측정하는 장치를 말한다. 바이오센서는 일반적으로 효소의 활성, 효소와 전극간의 전자전달효율, 전극에 고정된 효소의 생화학적인 안정성, 조효소의 산화-환원반응에 대한 의존성이 크다(M.D. Gouda, M.A. Kumar, M.S. Thakur and N.G. Karanth, Biosensors and Bioelectronics, 2002, 17, 503-507).

따라서, 바이오센서의 기능을 유지하기 위해서는 측정대상인 기질이 효소의 촉매반응에 의해 산화 또는 환원될 때 전극에 전자를 공급하거나 전극으로부터 전자를 공급받는 반응이 균일하고 신속하게 이루어져야 한다. 그러므로, 전극표면에 고정한 효소와 기질이 반응할 때 생성되는 효소-기질 복합체가 반응물질로 전환되는 효율(Vmax)과 효소와 기질의 복합체가 형성되는 효율(Km)이 바이오센서의 감도와 기능성을 결정하는 인자가 된다.

또한 효소-기질 복합체가 형성된 후 일정 시간동안 복합체가 반응물질로 전환되지 않고 효소-기질 복합체 상태가 유지되는 경우, 효소-기질 반응은 Vmax 값을 유지할 수 없게 되어 바이오센서의 기능이 저하되는 원인이 된다. 이러한 효소-기질 복합체가 일정 농도를 유지하는 것을 센서의 피로도라 하는데 재사용을 위해서는 피로회복이 필수적이다. 센서의 피로회복을 위해서는 반응이 끝날 때까지 장시간 방치해야 하는데 이 과정에서 효소의 활성은 일정 비율로 상실될 수 있기 때문에 실질적인 사용상 문제가 발생할 수 있다.

전극표면에 고정된 효소는 고정방법에 따라 효소의 구조가 영향을 받을 수 있기 때문에 고정방법 또한 바이오센서의 기능을 결정하는 인자가 된다. 전극에 효소를 고정하는 방법은 공유결합법, 가교법, 흡착법, 포괄법 등이 있는데 이 가운데 바이오센서의 제작을 위해 가장 적합한 것은 공유결합법이다. 그러나 공유결합법은 전극 표면에 공유결합을 위한 특정한 반응 잔기가 존재할 때만 가능하기 때문에 무기전극의 표면에 전극과 효소간에 결합매체로서 작용하는 적절한 폴리머를 코팅한 후 폴리머와 효소를 공유결합시킴으로써 효소를 전극표면에 고정시키기도 한다(Journal of Electroanalytical Chemistry 479, 64-68; 468, 193-201). 이러한 방법은 효소와 전극사이에 폴리머가 결합 매개체로 사용되어야 한다는 점에 있어서 가교법과 매우 유사하다.

폴리머를 결합매체를 사용하는 것과 같이 공유결합이 불가능한 전극에 효소를 공유결합시킬 때 발생 가능한 문제는 효소가 전극에 직접적으로 접촉하지 때문에 효소와 전극간의 전자 전달 효율이 저하될 수 있다는 것이다.

본 발명의 목적은 효소를 전극에 공유결합시키기 위해 결합매체를 사용하면서도 효소와 전극간의 전자 전달 효율이 향상된, 질소성 영양염류의 농도 측정용 전극을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 전극을 포함하는, 질소성 영양염류의 농도 측정용 센서를 제공하는 것이다.

도 1은 질소성 영양염류 농도 측정용 효소 전극이 장착된 바이오센서의 모식도이다.

도 2는 상기 바이어센서가 연결된, 질소성 영양염류 농도측정 장치의 모식도이다.

도 3a는 질산염 환원효소전극의 사이클로볼타메트리 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3b는 질산염 환원효소전극의 질산염의 농도변화에 따른 전류량의 변화를 측정한 그래프이다.

도 4a는 아질산염 산화효소전극의 사이클로볼타메트리 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4b는 아질산염 산화효소전극의 아질산염의 농도변화에 따른 전류량의 변화를 측정한 그래프이다.

도 5a는 암모늄염 산화효소전극의 사이클로볼타메트리 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5b는 암모늄염 산화효소전극의 암모늄염의 농도변화에 따른 전류량의 변화를 측정한 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소(2-20mg/ml), 전극 표면과 상기 효소 사이에 결합매체로서 작용할 수 있는 단백질(7 내지 17 w/v%), 뉴트럴 레드(0.1 내지 1 mM), 글루타르알데히드(0.8 내지 2 w/v%), 및 흑연 분말(5 내지 30 w/v%)을 포함하는 혼합물이 금 또는 백금 전극에 도말된, 질소성 영양염류의 농도 측정용 효소 전극을 제공한다.

상기 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소는 질산염 환원효소, 아질산염 산화효소, 또는 암모늄염 산화효소일 수 있다.

상기 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소로서 세균으로부터 획득한 막분획을 사용할 수 있다.

상기 흑연분말의 입자는 1 내지 5㎛의 직경을 갖는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 상기 전극을 포함하는 질소성 영양염류의 농도 측정용 바이오센서를 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서 제공하는 질소성 영양염류 측정용 전극은 백금 또는 금전극에, 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소(2-20mg/ml), 전극 표면과 상기 효소 사이에 결합매체로서 작용할 수 있는 단백질(7 내지 17 w/v%), 뉴트럴 레드(0.1 내지 1 mM), 글루타르알데히드(0.8 내지 2 w/v%), 및 흑연 분말(5 내지 30 w/v%)의 혼합물이 도포된다.

본 발명에서는 전극으로서 백금 또는 금을 사용할 수 있다. 금이나 백금 이외의 다른 금속은 전기장에서 산화반응에 의해 전자를 잃기 쉽기 때문에 이러한 전극 유래 전자는 센서에서 발생하는 전자의 발생을 간섭할 수 있어 문제가 된다.

상기 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소로는 질산염 환원효소, 아질산염 산화효소, 또는 암모늄염 산화효소을 사용할 수 있다.

상기 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소는 모두 호흡대사의 전자 전달계를 구성하는 효소 가운데 하나로서 세균의 막에 존재하므로, 세균의 막으로부터 효소를 분리하지 않고 막분획을 분리하여 상기 효소로서 사용할 수 있다.

질산염 환원효소는 하수종말 처리장의 혐기 소화조에서 수소를 에너지원으로 사용하여 질산염을 환원하는 기능을 갖는 세균인 Pseudomonas fluorescens, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Alcaligenes licheniformis 등으로부터 분리할 수 있다.

아질산염 산화효소는 아질산을 전자공여체로 산소를 전자 수용체로 사용하여 생산되는 에너지로 생장하는 세균으로부터 분리할 수 있으며, 이러한 세균으로는Nitrococcus mobilis, Nitobacter winogradskyi, Nitrospirna gracilis 등이 있다.

암모늄염 산화효소는 암모늄염을 전자공여체로 산소를 전자수용체로 사용하여 생산되는 에너지로 생장하는 세균으로부터 분리할 수 있으며, 이러한 세균으로는 Nitrosomonas europaea, Nitrosovibrio tenuis, Nitrosospira briensis 등이 있다.

질산염 환원효소, 아질산염 산화효소, 암모늄염 산화효소는 모두 호흡대사의 전자전달계를 구성하는 효소 가운데 하나로 막에 결합되어있기 때문에 막으로부터 효소를 분리하지 않고 막분획을 분리함으로서 효소를 함께 획득할 수 있다.

상기 획득된 효소를 관능잔기가 존재하지 않는 무기전극에 공유결합으로 고정시키기 위하여, 본 발명에서는 무기 전극에 고정될 효소와 무기전극 간에 결합매체로 작용할 수 있는 단백질을 사용한다. 이러한 단백질로는 카제인, 알부민, 글루불린, 시토크롬 등이 있다.

상기 뉴트럴 레드는 전극과 효소간의 전자전달을 용이하게 해주는 역할을 한다. 상기 글루타르알데히드는 상기 결합매체로서 작용하는 단백질간의 가교를 형성한다. 상기 결합매체 단백질간에 가교가 형성되면 효소가 안정적으로 전극과 결합할 수 있게 되어 전극과 전자를 교환하기 용이해 진다.

한편, 상기 획득된 효소를 관능잔기가 존재하지 않는 무기전극에 공유결합기키기 위해 결합매체로서 단백질을 사용할 경우 앞서 설명한 바와 같이 전자 전달 효율의 저하가 발생될 수 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서 본 발명에서는 상기한 바와 같이 흑연분말을 효소분획 및 단백질과 함께 혼합하여 본 발명의 전극에 도말하였다. 전도성의 흑연분말을 효소와 단백질의 혼합 용액에 혼합하여 금 또는 백금 전극에 도말하여 사용한다. 상기 흑연 분말은 전극과 효소사이에 일정하게 분산되어 있어 효소의 산화반응에 의해 생성되는 전자를 전극에 전달하거나 효소의 환원 반응에서 요구되는 전자를 효소에 공급하는 기능을 갖는다. 상기 흑연분말이 효율적인 전자 전달 매체로서 작용하기 위한 적절한 입자의 직경은 1 내지 5㎛이다. 상기 흑연분말의 입자가 크면 압자간에 공극이 생성되어 전자의 이동이 방해된다.

본 발명은 또한 상기 효소 혼합물이 도포된 질소성 영양염류 농도 측정용 전극을 포함하는 바이오 센서를 제공한다.

상기 질소성 영양염류 농도 측정용 효소 전극이 장착된 바이오센서의 모식도는 도 1과 같다. 도 1에 나타나 있는 셀룰로오스막은 전극간의 직접적인 전자의 전달을 방지하고 수소이온이 이동할 수 있는 격막이며, 효소전극의 표면에서 질산염의 환원 또는 아질산염과 암모니움 이온의 산화반응을 촉매한다.

상기와 같은 바이어센서를 대조군과 연결시키고, 여기에 전류 측정부를 연결시켜 질소성 영양염류 농도측정 장치를 제조할 수 있다. 이와 같은 질소성 영양염류 농도 측정 장치의 모식도를 도 2에 나타내었다. 상기 질소성 영양염류 농도 측정 장치는 효소전극의 표면에서 질산염이 환원될 때 소비되는 전자의 양을 전류로 전환하여 측정하는 장치이다. 그러나, 전극간의 일정한 전압차이에 의해 전자의 강제 이동이 발생할 수 있어 증류수를 로딩한 전극에서 발생하는 전자의 이동량을 시료를 로딩하여 발생한 전자의 이동량에서 빼줌으로써 시료의 로딩에 의해 발생하는 순수한 전자의 이동량을 계산할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효소 함유 막분획의 획득

질산염 환원효소는 하수종말 처리장의 혐기소화조에서 수소를 에너지원으로 사용하여 질산염을 환원하는 기능을 갖는 세균인 Pseudomonas spp.를 이용하여 분리하였다.

아질산염 산화효소는 아질산을 전자공여체로 산소를 전자 수용체로 사용하여 생산되는 에너지로 생장하는 Nitrococcus mobilis로부터 분리하였으며, 암모늄염 산화효소는 암모늄염을 전자공여체로 산소를 전자수용체로 사용하여 에너지를 생산하는 Nitrosomonas eutropaea로부터 분리하였다.

효소를 함유하는 막분획을 분리하기 위해 배양한 상기 각각의 균체를 원심분리로써 얻은 다음, Tris-HCl 완충용액(pH 7.0, 50 mM)로 3회 세척하여 배지성분을 완전히 제거하고 리소짐으로 처리한 후 -20℃에서 냉동하였다.

상기 냉동된 미생물을 파쇄하여 얻은 세균 현탁액을 10,000xg에서 40분간 원심분리하여 세포 잔해물을 제거하고 상등액을 취하는 작업을 반복하여 미세한 부유입자까지 모두 제거함으로써 투명한 상등액을 획득하였다. 상기 획득된 상등액을 초원심분리기를 이용하여 150,000xg 에서 4시간 동안 원심분리함으로써 막분획을 획득하였다. 상기 막분획을 Tris-HCl 완충용액(pH 7.2, 50 mM)을 이용하여 3회 세척한 후 동일한 완충용액에 현탁하여 사용하였다.

상기 막분획의 질산 환원효소, 아질산 산화효소, 암모늄 산화효소의 각각의 활성을 질산의 환원, 아질산의 산화, 및 암모늄의 산화 활성을 이용하여 Km과 Vmax를 측정하였다. 또한, 막 분획에 결합된 상기 효소 단백질을 브래드포드법(Bradford 법)을 이용하여 정량 하였다. 각각의 측정결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

효소	Km	Vmax	효소량
질산염 환원효소	0.017 mg/L	4.54 mg/L/분	6.7 mg/L
아질산염 산화효소	0.063 mg/L	5.32 mg/L/분	9.3 mg/L
암모늄염 산화효소	0.053 mg/L	4.21 mg/L/분	12.3 mg/L

실시예 2: 효소 고정

17w/v% 소혈청 알부민을 트리스 완충용액(pH 7.2, 50 mM)에 녹이고, 이 용액에 상기 획득한 각각의 막분획을 효소 단백질 농도로 환산하여 최종농도가 15 mg/ml이 되게 첨가하고 뉴트럴 레드를 최종농도가 0.5 mM이 되게 첨가하였다. 여기에, 단백질간의 가교를 형성시키기 위해 글루타르알데히드를 0.8 w/v% 첨가하였으며, 이 효소-단백질 용액에 입자의 크기가 1 ??m인 흑연 분말을 최종농도 30% w/v%가 되게 첨가하였다. 그리하여 생성된 혼합물을 금 표면에 0.1 mm의 두께로 도말하여 냉장고 내에서 진공 건조하였다. 이와 같이 제작된 효소 전극은 사용할 때까지 -20??의 냉동고에 보관하였다.

실시예 3: 효소전극의 전기화학적 측정

상기 실시예 2에서 제작한 효소전극(질산 환원효소전극, 아질산 산화 효소전극, 암모늄연 산화효소전극)을 이용하여 질산염, 아질산염, 암모늄염의 농도 차이에 따른 반응을 비교하기 위하여 효소전극(Φ 5mm)을 작업전극으로, 백금선을 상대전극으로, Ag/AgCl 전극을 기준전극으로 활용하여 Tris-HCl 완충용액(pH 7.0, 50mM)를 전해질로 하여 사이클로볼타메트리(cyclovoltametry)를 시행하였다. 사이클로볼타메트리는 BAS model CV50W를 사용하였으며 스캐닝 범위는 +0.2에서 -1.2 볼트였고, 스캐닝 속도는 25 mv/s로 조절하였다. 기질의 농도를 각각 0.1 내지 0.8ppm의 범위로 하여 사이클로볼타메트리에서 얻은 전류의 변화를 도시하여 각각 도 3a, 4a, 5a에 나타내었다. 또한, 도 3a에서 전압이 -0.7V로 일정할 때 질산염 농도의 변화에 따를 전류의 변화를 도 3b의 A에 도시하였다. 이와 마찬가지로, 도 4a와 도 5a에서 각각 -0.6V 와 -0.63V에서 각각의 기질의 농도의 변화에 따른 전류의 변화를 각각 도 4b의 A 와 도5b의 A에 나타내었다. 도 3b, 4b, 5b의 A의 각각의 전류값의 회귀분석 평균값을 구해 각각 도 3b, 4b, 5b의 B에 도시하였다. 도 3b, 도4b, 및 도 5b에 기질의 농도에 따른 전류의 변화가 유의성 있게 나타난 바로부터, 본 발명에 따른 효소 전극은 기질의 농도의 변화를 측정할 수 있는 것으로 판명되었다.

본 발명에 따르면, 효소를 전극에 공유결합시키기 위해 결합매체를 사용하면서도 효소와 전극간의 전자 전달 효율이 향상된, 질소성 영양염류의 농도 측정용 전극 및 이를 포함하는 질소성 영양염류의 농도 측정용 바이오 센서를 제공할 수 있다.

Claims (6)

1. 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소(2-20mg/ml), 전극 표면과 상기 효소 사이에 결합매체로서 작용할 수 있는 단백질(7 내지 17 w/v%), 뉴트럴 레드(0.1 내지 1 mM), 글루타르알데히드(0.8 내지 2 w/v%), 및 흑연 분말(5 내지 30 w/v%)을 포함하는 혼합물이 금 또는 백금 전극에 도말된, 질소성 영양염류의 농도 측정용 효소 전극.
2. 제1항에 있어서, 상기 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소는 질산염 환원효소, 아질산염 산화효소, 또는 암모늄염 산화효소인 것을 특징으로 하는 효소 전극.
3. 제1항에 있어서, 상기 질소성 영양염류의 산화효소 또는 환원효소로서 세균으로부터 획득한 막분획을 사용하는 것을 특징으로 하는 효소 전극.
4. 제3항에 있어서, 상기 세균은 Pseudomonas fluorescens, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Alcaligenes licheniformis, Nitrococcus mobilis, Nitobacter winogradskyi, Nitrospirna gracilis, Nitrosomonas europaea, Nitrosovibrio tenuis, 또는 Nitrosospira briensis 인 것을 특징으로 하는 효소 전극.
5. 제1항에 있어서, 상기 흑연분말의 입자는 1 내지 5㎛의 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 효소 전극.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 효소 전극을 포함하는 질소성 영양염류의 농도 측정용 바이오 센서.