KR20040092969A - 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한자기성 나노입자를 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 함유하는 조성물, 상기 자기성 나노입자의 제조방법 및 자기장을 이용해서 상기 자기성 나노입자를 표적 부위에 집중시킬 수 있는 표적지향적 치료제 전달방법에 관한 것이다.

Description

자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 함유하는 조성물{Composition comprising magnetic nanoparticle encapsulating magnetic material and drug with biodegradable synthetic polymer}
본 발명은 표적지향적 치료제 전달방법(targeting drug delivery system)에 이용되는 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 함유하는 조성물, 상기 자기성 나노입자의 제조방법 및 자기장을 이용해서 상기 자기성 나노입자를 표적 부위에 집중시킬 수 있는 표적지향적 치료제 전달방법에 관한 것이다.
표적지향적 치료제 전달방법은 투여방식 및 부위에 상관없이 목적한 기관 또는 조직에 선택적이고 정량적으로 치료제가 축적되도록 하는 치료제 전달방법 중의 하나이다. 이러한 전달방법은 표적 부위에서 치료제의 농도는 증가시켜 치료 효과를 극대화시키는 반면에 비표적 조직 및 기관에서 치료제의 농도는 감소시켜 부작용을 최소화시킬 수 있다. 아울러, 치료학적 효과를 달성하는데 필요한 치료제의 양 뿐만 아니라 치료에 소요되는 비용 또한 상당히 줄일 수 있다.
일반적으로 다양한 실험 및 임상적 용도에서 이용되고 있는 표적지향적 치료제 전달방법의 기본적인 전략(scheme)은 다음을 포함한다:(a) 영향을 받은 부분(기관, 조직)에 치료제의 직접 적용;(b) 누출 맥관 구조를 통한 치료제의 수동적인 축적(예를 들면, 종양, 경색, 염증 등);(c) 종양 또는 염증과 같은 표적 부위에서 비정상적인 pH 및/또는 온도를 이용한 물리적인 표적화(pH 및 온도에 민감한 치료제 캐리어 등을 이용);(d) 자기성 캐리어에 부착된 치료제의 외부 자기장의 작용에 의한 표적화; 및 (e) 영향을 받은 자리에 대하여 고특이적 친화력을 가지는 벡터 분자의 이용.
상기 전략 중에서도 자기장을 이용한 표적지향적 치료제 전달방법은 자기장의 작용으로 인해서 망상 내피 시스템(reticular endothelial system)에서 멀리 떨어져서, 제한된 표적 부위에서만 치료제의 농축을 가능하게 하므로 특히 유용하다. 미국특허 제 4,345,588호는 치료제를 신체의 표적 모세관 베드에 전달하기 위한 방법으로, 혈관 내로 투여될 수 있고 자기장을 이용하여 재배열될 수 있으며 치료제를 포함하는 생분해성 마이크로스피어를 제조하고, 표적 모세관 베드 내에서 방출되도록 하기 위하여 표적 모세관 베드에 영구적으로 국한되도록 투여하는 것을 특징으로 치료방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허에 개시된 입자는 마이크로 크기로서 이는 온전한 세포간의 간극을 침투하지 못하므로 그 적용에 제한이 따르게 된다. 또한, 상기 마이크로입자는 지질, 단백질 및 탄수화물과 같은 천연 물질로 캡슐화되어 있는데, 이러한 물질들로 인하여 제조된 입자를 분리하고 세척하는 일이 용이하지 못한 단점이 있다.
아울러, 국제공개특허 제 01/56546호는 생물조직의 표적부위를 치료하기 위한 마그네토리포좀(magnetoliposome) 함유 조성물과 이를 이용한 치료방법 및 마그네토리포좀(magnetoliposome) 함유 조성물을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허는 전치료제(prodrug)를 치료제로 활성화시키기 위해서 표적 부위에 전기장을 적용시키는 단계가 필요한데, 이때 발생되는 열에 의해서 주변에 있는 정상 조직 또는 세포가 손상될 우려가 있으며, 활성화되지 못한 전치료제가 방출되어 분해되지 못한 상태로 잔류할 경우에는 오히려 인체에 해로운 영향을 미칠 수도 있다.
한편, 치료제를 자기성 나노입자로 캡슐화하는 것은 치료제의 독성을 낮추는데 특히 유용한 것으로 알려져 있다. 대한민국공개특허 제 2001-0086811호는 유화 확산법을 이용한 생분해성 미세입자 제조방법에 관한 것으로, 특히 치료제의 방출 속도를 조절할 수 있고, 생체 조직에 친화력이 강하여 조직 깊숙이 침투할 수 있는 수십 내지 수백 나노미터의 입자 크기를 가지는 생분해성 미세입자의 제조방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 제조방법에 의해서 제조된, 치료제만을 캡슐화한 나노입자를 이용하는 표적지향적 치료제 전달방법은 치료제를 목적한 표적 부위에만 실질적으로 집중시킬 수 없는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 치료제를 실질적으로 표적 부위에 집중시키고 상기 부위에서 깊숙이 침투가능하여 치료제의 작용은 극대화할 수 있는 반면에 부작용은 최소화할 수 있는 자기성 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
하나의 관점으로서, 본 발명은 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
다른 관점으로서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기성 나노입자의 제조방법에 관한 것이다:(a) 치료제, 분해성 고분자 및 자기성 물질을 물에 부분적으로 용해되는 용매(organic phase:유상)에 용해시키는 단계; (b) 상기 용액을 안정화제가 용해되어 있는 수용액(aqueous phase:수상)에 포화시켜 상평형에 도달시키는 단계; (c) 상기 포화 용액을 균질화기를 이용하여 유화시키는 단계; (d) 상기 유화된 용액에 물을 첨가하여 물에 부분적으로 용해되는 용매를 수상에 확산시키는 단계 및 (e) 상기 용액을 여과법, 세럼 교체, 원심 분리 및 진공 건조를 거쳐서 최종 자기성 나노입자를 수득하는 단계.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기성 나노입자의 제조방법에 관한 것이다: (a) 치료제, 자기성 물질 및 유화제를 증류수에 용해시켜서 수상 1을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 물에 부분적으로 용해되는 용매에 용해시켜서 유상을 제조하는 단계; (c) 상기 수상 1을 상기 유상에 부가하고 교반하여 1차 W/O형 유화물을 제조하는 단계; (d) 상기 1차 W/O형 유화물에 유화제가 용해된 증류수(수상 2)를 부가하고 교반하여 W/O/W형 유화물을 제조하는 단계 및 (e) 상기 유화물을 여과법, 세럼 교체, 원심 분리 및 진공 건조를 거쳐서 최종 자기성 나노입자를 수득하는 단계.
또 다른 추가의 관점으로서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적지향적 치료제 전달방법에 관한 것이다: (a) 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계 및 (b) 표적 부위에 일정 시간 동안 외부 또는 내부 자기장을 작용시킴으로써 자기성 나노입자를 표적 부위에 국소적으로 집중시킨 다음 생분해성 고분자가 분해되면서 치료제가 방출되도록 하는 단계.
도 1은 유화 확산법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 유상 : 수상의 비율을 각각 1:1.5(a), 1:2(b), 1:3(c) 및 1:4(d)로 하여 제조한 자기성 나노입자의 SEM 이미지 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 유화 확산법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율을 각각 1:5(a) 및 2:5(b)로 하여 제조한 자기성 나노입자의 SEM 이미지 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 유화 확산법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율에 따른 자기성 나노입자의 평균 직경을 나타낸 것이다.
도 4는 유화 확산법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율을 각각 1:0(a), 1:5(b), 2:5(c) 및 3:5(d)로 하여 제조한 자기성 나노입자의 TEM 이미지 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 다중 유화법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 수상 2에 대한 폴리비닐알콜 농도를 각각 0.25%(a), 0.5%(b), 1%(c) 및 2%(d)로 하여 제조한 자기성 나노입자의 SEM 이미지 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 다중 유화법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율을 각각 1:5(a) 및 2:5(b)로 하여 제조한 자기성 나노입자의 SEM 이미지 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 다중 유화법을 이용한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율에 따른 자기성 나노입자의 평균 직경을 나타낸 것이다.
도 8은 마그네타이트(a), 순수한 PCL 입자(b), 유화 확산법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(c) 및 다중 유화법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(d)의 FTIR 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 마그네타이트(a), 유화 확산법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(b) 및 다중 유화법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(c)의 VSM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 유화 확산법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(a) 및 다중 유화법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(b)의 치료제(젬시타빈)의 방출 양상을 나타낸 것이다.
도 11은 유화 확산법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(a) 및 다중 유화법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자(b)의 치료제(시스플라틴)의 방출 양상을 나타낸 것이다.
도 12의 (a) 및 (b)는 본 발명에 따른 조성물만을 투여한 대조군 마우스를, (c) 및 (d)는 본 발명에 따른 조성물을 투여하고 좌측 종양에 자기장을 적용시킨 실험군 마우스를 나타낸 것이다.
도 13은 실험군의 마우스에서 자기장을 적용시키지 않은 종양 조직에 대한 블루 철 염색반응 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험군의 마우스에서 자기장을 적용시킨 종양 조직에 대한 블루 철 염색반응 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실험군의 마우스에서 종양 이외의 조직인 지라(a), 췌장(b), 간(c)에 대한 블루 철 염색반응 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 생체내에서 젬시타빈을 포함하는 자기성 나노입자의 종양 억제 효과를 나타낸 것이다.
상기 과제를 달성하기 위해서 본 발명은 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 자기성 나노입자의 제조에 이용가능한 생분해성 고분자(biodegradable synthetic polymer)에는 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 이의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트, 폴리오르소에스테르 등이 포함된다. 바람직하게는 혈청 중의 에스테라아제(esterase)의 작용에 의해서 용이하게 생분해될 수 있는 폴리락타이드, 폴리락타이드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤 및 폴리안하이드라이드를 포함하는 폴리에스테르로부터 1종을 선택할 수 있다.
전술한 생분해성 고분자 중에서도 폴리카프로락톤(이하, PCL로 명명함)은 일종의 선형 지방족 폴리에스테르 분자로서, 비극성 메틸렌기 5개 및 상대적으로 극성인 에스테르기 1개로 이루어진 분자 구조로 인하여 몇몇 독특한 성질을 가지고있다. 물리적인 성질은 높은 올레핀 함량으로 인하여 폴리올레핀과 유사한 반면에, 가수분해에 불안정한 지방족 에스테르 결합의 존재는 고분자가 생체내에서 분해되도록 유도한다. 상기 분자 구조는 또한 PCL이 수많은 다른 고분자와 상용성을 갖도록 하므로, 이에 따라 독특한 성질을 가지는 다양한 PCL 고분자 배합체가 제조가능하다. 또한, PCL은 서서히 분해되고 폴리락타이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드와 같이 산성 환경을 만들지 않으며, 생분해되면서 치료제를 방출함과 동시에 독성이 없는 저분자량의 부산물을 생산한다. 따라서, 본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조함에 있어서, PCL이 생분해성 고분자로서 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 자기성 나노입자의 자기성 물질은 자기성 철산화물과 같은 Fe-계 자기성 화합물 등을 포함하며, 가장 바람직한 자기성 물질은 마그네타이트(Fe3O4)이다. 본 발명에 있어서, 상기 자기성 물질은 초미세 상태로 세절된 것으로, 이의 크기는 100㎚ 이하, 바람직하게는 30㎚ 이하, 가장 바람직하게는 10㎚ 이하에 속해야만 한다. 상기와 같이 매우 작은 크기의 마그네타이트를 제조하는 기술들은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 미세 제분법, 진공 증착법 및 화학 침전법 등이 있다. 볼밀(ball mill)에서의 미세 제분법이 마그네타이트의 콜로이드성 현탁물(suspension)을 제조하는데 이용될 수도 있다. 상업적으로, 미세 분말형 또는 현탁액의 마그네타이트는 예를 들면, Ferrofluidics Corporation, Burlington, Massachusetts로부터 구입할 수 있으며, 이러한 입자의 크기는 10 내지 20㎚의 범위이다.
본 발명의 자기성 나노입자에 로딩(loading) 가능한 치료제의 종류 및 화학적 성질은 특별히 제한적이지 않으며, 치료하고자 하는 질병에 따라 다양하게 선택할 수 있다. 치료제는 분말의 형태로, 수용성이라면 수용액의 형태로, 지용성이라면 유기 용매에 용해된 용액의 형태로 자기성 나노입자에 로딩될 수 있다. 따라서, 본 발명의 자기성 나노입자는 각종 수용성 치료제 및 소수성 치료제를 표적 부위에 전달하는데 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 자기성 나노입자를 포함하는 조성물은 치료제를 목적한 위치에 집중시킬 수 있으므로 부작용으로 인해서 임상적 사용이 제한적일 수 밖에 없는 항암제, 면역억제제, 소염진통제 등과 같은 치료제를 전달하는데 이용하면 유용할 것이다.
본 발명에서 이용가능한 항암제에는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 부설판(busulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(diactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 탁소텔(taxotere), 트랜스플라티눔(transplatinum), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 이리노테칸(irinotecan) 등이 포함된다.
본 발명의 하나의 양태로서 이용된 치료제 젬시타빈 및 시스플라틴은 유기플라티늄 복합체(coordination complex)의 형태로서, 소세포(small-cell) 폐암, 전이성 난소 종양, 췌장암 및 진행된(advanced) 방광암 등을 치료하는데 이용되고 있지만, 신장 및 소화기 계통에 심각한 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있어 임상적 이용이 제한되고 있다.
본 발명에서 이용가능한 면역억제제에는 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 아자티오퓨린(azathiopurine), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurin, 6-MP), 시타라빈(cytarabine), 브로모우라실(BUdR), 플루오로우라신(FUdR), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토마이신(mytomycin C), 액티노마이신 D(actinomycin D), 코르티손(cortisone), 프레도니솔론(predonisolone), 덱사메타손(dexamethasone) 등이 포함된다.
본 발명에서 이용가능한 소염진통제에는 나프록센(naproxen), 디클로페낙(diclofenac), 디클로페낙(diclofenac), 인도메타신(indomethacine), 술린닥(sulindac), 피록시캄(piroxicam), 이부프로펜(ibuprofen), 아자프로파존(azapropazon), 나부메톤(nabumeton), 티아프로펜산(tiaprofenic acid), 인도프로펜(indoprofen), 페노프로펜(fenoprofen), 플루비프로펜(flurbiprofen), 피라졸락(pirazolac), 잘토프로펜(zaltoprofen), 나부메톤(nabumetone), 브롬페낙(bromfenac), 암피록시캄(ampiroxicam) 및 로르녹시캄(lornoxicam) 등이 있다.
본 발명에 따른 자기성 나노입자는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직한 양태는 유화 확산법 또는 다중 유화법을 이용하여 자기성 나노입자를 제조하는 것이다. 한편, 통상적으로 자기성 나노입자의 직경은 1000㎚ 이하이지만, 본 발명에서는 500㎚ 이하인 것이 바람직하다. 따라서, 하기에 기술될 제조방법은 500㎚ 이하의 직경을 가지면서, 균일한 크기 분포도를 가지는 자기성 나노입자를 제조하는 것을 목적으로 한다. 이하, 상기 목적에 부합하도록 각각의 제조방법을 단계별로 살펴보기로 한다.
유화 확산법을 이용하여 본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조하는 방법에는 하기의 단계들이 포함된다:(a) 치료제, 생분해성 고분자 및 자기성 물질을 물에 부분적으로 용해되는 용매(organic phase:유상)에 용해시키는 단계;(b) 상기 용액을 안정화제가 용해되어 있는 수용액(aqueous phase:수상)에 포화시켜 상평형에 도달시키는 단계;(c) 상기 포화 용액을 균질화기를 이용하여 유화시키는 단계;(d) 상기 유화된 용액에 물을 첨가하여 물에 부분적으로 용해되는 용매를 수상에 확산시키는 단계 및 (e) 상기 용액을 여과법, 세럼 교체, 원심 분리 및 진공 건조를 거쳐서 최종 자기성 나노입자를 수득하는 단계.
상기 제조방법에 있어서, 물에 부분적으로 용해되는 용매로는 프로필렌카르보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 메틸에틸케톤 등이 이용될 수 있다. 에틸아세테이트는 독성이 적고, 적합한 용해도 및 낮은 끓는점을 가지고 있으므로 특히 바람직하다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 (b)의 안정화제로는 인체에 해가 적은 소듐러릴설페이트, 폴리비닐알코올, 디도데실디메틸암모늄브로미드 등이 이용될 수 있으며, 안정화제는 수상에 대하여 약 1 내지 10%(w/v)의 농도로 용해시키는 것이 적합하다.
상기 제조방법에 있어서, 유상 : 수상의 비율에 따라 다양한 형태와 크기의 입자가 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조하기 위해서, 수상 부피는 유상 부피에 대하여 2 내지 4배로 하는 것이 바람직할 것이다. 수상 부피가 2배 미만이면, 크기에는 큰 변화가 없지만 입자가 응집되는데 반하여 수상 부피가 4배를 초과하면, 표면에 결함이 있고 불규칙성을 보이는 입자가 제조된다. 특히, 유상 : 수상의 비율이 약 1:2인 경우에 상대적으로 작으면서 균일한 크기 분포도를 가지는 입자가 생산되므로, 본 발명에 따른 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 유상 : 수상의 비율은 약 1:2로 하는 것이 바람직하다.
상기 제조방법에 있어서, 자기성 물질 : 생분해성 고분자의 비율에 따라 다양한 형태와 크기의 입자가 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조하기 위해서, 자기성 물질의 양(weight)은 생분해성 고분자의 양(weight)에 대하여 0.2 내지 0.8배로 하는 것이 바람직할 것이다. 자기성 물질의 양을 증가시키면 이에 따라 자기성 나노입자의 크기는 약간씩 증가하는데 반해서, 생분해성 고분자 내부로 자기성 물질이 캡슐화되는 효율은 급격하게 증가한다. 그러나, 자기성 물질의 양이 생분해성 고분자의 양과 동일하거나 그 이상일 경우에는 자기성 나노입자가 잘 형성되지 않을 뿐만 아니라 입자의 크기도 커진다. 따라서, 본 발명에 따른 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 자기성 물질의 양은 생분해성 고분자 양의 약 0.8배로 하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 발명자들은 치료제의 화학적 성질이 소수성인 경우에는 유화 확산법을 이용하면 캡슐화 효율이 우수함을 확인하였다. 따라서, 소수성 치료제를 포함하는 자기성 나노입자를 제조하고자 할 때는 유화 확산법을 이용하여 제조하는 것이 바람직할 것이다. 아울러, 본 발명자들은 유화 확산법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자는 치료제의 방출 속도가 상대적으로 빠르다는 것을 확인하였다. 따라서, 치료제의 빠른 방출을 요구하는 질병을 치료하고자 할 때는 유화 확산법으로 제조한 자기성 나노입자를 이용하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조하는 또 다른 방법인 다중 유화법에는 하기의 단계들이 포함된다:(a) 치료제, 자기성 물질 및 유화제를 증류수에 용해시켜서 수상 1을 제조하는 단계;(b) 생분해성 고분자를 물에 부분적으로 용해되는 용매에 용해시켜서 유상을 제조하는 단계;(c) 상기 수상 1을 상기 유상에 부가하고 교반하여 1차 W/O형 유화물을 제조하는 단계;(d) 상기 1차 W/O형 유화물에 유화제가 용해된 증류수(수상 2)를 부가하고 교반하여 W/O/W형 유화물을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 유화물을 여과법, 세럼 교체, 원심 분리 및 진공 건조를 거쳐서 최종 자기성 나노입자를 수득하는 단계.
상기 제조방법에 있어서, 물에 부분적으로 용해되는 용매로는 프로필렌카르보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 메틸에틸케톤 등이 이용될 수 있다. 에틸아세테이트는 독성이 적고, 적합한 용해도 및 낮은 끓는점을 가지고 있으므로 특히 바람직하다.
상기 제조방법에 있어서, 수상 1 및 수상 2에 용해되는 유화제로는 인체에 해가 적은 소듐러릴설페이트, 폴리비닐알코올, 디도데실디메틸암모늄브로미드 등이이용될 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 수상 2의 유화제 농도에 따라 다양한 형태와 크기의 입자가 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조하기 위해서, 유화제의 농도는 0.25 내지 2%(w/v)로 하는 것이 바람직할 것이다. 유화제의 농도가 0.25% 이하인 경우에는 유화중인 용액을 안정화시키지 못할 뿐만 아니라 응집된 입자를 생산하게 된다. 한편, 유화제의 농도가 증가함에 따라 입자의 크기는 작아지고 균일하게 분산되는데, 유화제의 농도가 2% 이상인 경우에는 유화제의 농도가 2%인 경우와 유사한 형태 및 크기의 자기성 나노입자를 생산하게 된다. 따라서, 본 발명에 따른 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 유화제의 농도는 약 2%로 하는 것이 가장 바람직하다.
상기 제조방법에 있어서, 자기성 물질 : 생분해성 고분자의 비율에 따라 다양한 형태와 크기의 입자가 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 자기성 나노입자를 제조하기 위해서, 자기성 물질의 양(weight)은 생분해성 고분자의 양(weight)에 대하여 0.2 내지 0.8배로 하는 것이 바람직할 것이다. 자기성 물질의 양을 증가시키면 이에 따라 자기성 나노입자의 크기는 약간씩 증가하는데 반해서, 생분해성 고분자 내부로 자기성 물질이 캡슐화되는 효율은 급격하게 증가한다. 그러나, 자기성 물질의 양이 생분해성 고분자의 양과 동일하거나 그 이상일 경우에는 자기성 나노입자가 잘 형성되지 않을 뿐만 아니라 입자의 크기도 커진다. 따라서, 본 발명에 따른 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 자기성 물질의 양은 생분해성 고분자 양의 약 0.8배로 하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 발명자들은 치료제의 화학적 성질이 친수성인 경우 다중 유화법을 이용하면 캡슐화 효율이 우수함을 확인하였다. 따라서, 친수성 치료제를 포함하는 자기성 나노입자를 제조하고자 할 때는 다중 유화법을 이용하여 제조하는 것이 바람직하다. 아울러, 본 발명자들은 다중 유화법을 이용하여 제조된 자기성 나노입자는 치료제의 방출 속도가 상대적으로 느리다는 것을 확인하였다. 따라서, 치료제의 느린 방출을 요구하는 질병을 치료하고자 할 때는 다중 유화법에 의해서 제조된 자기성 나노입자를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 자기성 나노입자를 포함하는 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 그에 따라 제형화될 수 있다. 상기 조성물의 이용가능한 투여경로에는 예를 들면, 맥관내, 림프관내, 비경구적, 피하내, 근육내, 비강내, 복강내, 간극내, 경구적, 종양내 투여 등이 있으며, 바람직한 경로는 맥관내 투여이다. 맥관내 투여의 경우에는 일반적으로 정맥에 주입되지만 동맥으로도 주입될 수도 있다. 본 발명에 따른 조성물은 간극내로 또는 모든 몸의 중공(cavity)내로 주입될 수 있다.
본 발명은 자기장을 이용해서 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 표적부위에 특이적으로 집중시킬 수 있는 표적지향적 치료제 전달방법을 제공한다. 상기 조성물을 피험자에게 투여한 다음 표적 부위에 일정 시간 동안 외부 또는 내부 자기장을 적용시켜서 자기성 나노입자를 표적 부위(즉, 질병 부위)에 국소적으로 집중시킨다. 여기서, 자기장의 적용시간은 투여량의 70%, 바람직하게는 80%, 가장 바람직하게는 90% 이상을 표적 부위에 집중시키는데 소요되는 시간으로, 이 시간은 투여 부위와 표적 부위 사이의 거리 및 투여 경로를 포함한 여러 가지 조건에 의해서 달라질 수 있다. 아울러, 본 발명의 자기성 나노입자를 표적 부위에 집중시키는데 이용되는 자기장의 세기는 약 0.2 내지 0.3 Tesla의 범위 내에 속하는 것이 바람직하다. 이러한 과정에 의해서 표적 부위에 집중된 자기성 나노입자는 혈청 중 효소의 작용으로 분해되면서 내부에 있는 치료제를 방출함으로써 치료 효과를 유발할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예 1
재료 및 치료제의 준비
마그네타이트(Fe3O4)는 Idaho 대학으로부터, 폴리 ε-카프로락톤(M.W.= 42,500Da)은 Aldrich Chemical Co., USA로부터 구입하였다. 에틸아세테이트 및 비이온 계면활성제 폴리비닐알콜(PVA)은 Aldrich Chemical Co., USA로부터 구입하였다. 상기 PVA의 평균 분자량 및 비누화값(saponification)은 각각 15,000-20,000Da 및 88%이다. 암모늄 티오시아네이트, 하이드로퍼옥사이드,이인산(KH2PO4) 및 일인산(K2HPO4)은 Duksan Pure Chemical Co., Korea로부터 구입하였다. 상기 모든 재료들은 HPLC 급으로서 추가적인 정제없이 사용되었다. 본 발명에서 사용된 증류수는 Elgastat의 UHQ 시스템(UK)에 의해서 제조된 초순수(D.D.I) 증류수이다.
친수성 치료제 및 소수성 치료제로는 각각 젬시타빈 하이드로클로라이드(젬자, Lilly co.,Indianapolis, U.S.A.), 디아민디클로플라티늄(시스플라틴, Aldrich Chemical Co., U.S.A.)을 사용하였다.
실시예 2
유화 확산법에 의한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 유상 : 수상의 비율을 변화시켜가며 제조된 자기성 나노입자의 크기 및 형태의 비교
젬시타빈 50mg, PCL 0.5g(5% w/w) 및 마그네타이트 0.4g을 에틸아세테이트 10ml에 용해시켜서 유상(organic phase)을 제조하였다. 한편, 최종 부피가 각각 15, 20, 30 및 40ml이 되도록 수상(aqueous phase)을 제조하는데, 상기 각각의 수상에는 폴리비닐알콜(PVA)을 D.D.I 증류수에 대하여 5% 농도로 용해시켰다. 상기 유상 10ml을 상기 수상에 포화시켜 상평형에 도달시키고, 포화된 용액을 30% 파워(power) 프로브 소니케이터(ULH700S, Ulssohitech, Korea)를 이용하여 10분 동안 유화시켰다. 온화한 교반 조건(150rpm)하에서 상기 유화된 용액에 물 200ml을 첨가하여 에틸아세테이트를 수상으로 확산시켰다. 최종 자기성 나노입자는 상기반응 후 산물을 막여과지(공극 크기:0.45㎛)를 이용하여 여과하고, 세럼을 교체한 다음 10,000rpm에서 30분 동안 3차례 원심분리하여 35℃ 진공 오븐에서 건조시킴으로써 수득하였다.
한편, 이렇게 제조된 자기성 나노입자의 크기 및 형태(morphology)는 SEM을 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1의 사진에 의하면, 일반적으로 수상의 부피가 증가함에 따라 입자크기 또한 커지는 경향이 있었다. 유상 : 수상의 비율이 1 : 2인 경우(b)에 상대적으로 작은 입자의 제조가 가능하였고, 에틸아세테이트의 부피(10ml)를 변화시키지 않은 채 물의 부피를 6.7ml로 감소시켰을 때는 응집된 입자가 제조되었으며, 유상 : 수상의 비율이 1 : 4인 경우(d)에 제조된 입자는 표면 결함 및 불규칙성을 보였다.
실시예 3
유화 확산법에 의한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율을 변화시켜가며 제조된 자기성 나노입자의 크기 및 형태의 비교
마그네타이트의 양을 0.1 내지 0.5g 범위로 변화시켜서 상기 실시예 2와 동일한 방법(단, 유상 : 수상의 비율은 1 : 2)으로 제조하였다. 제조된 자기성 나노입자의 형태, 평균 크기 및 크기 분포도를 SEM, TEM 및 DLS를 이용하여 확인하였고, 이의 결과를 도 2, 도 3 및 도 4에 각각 나타내었다.
도 2의 사진을 통하여 유화 확산법으로 제조된 자기성 나노입자는 매끈하고 잘 분산(well-individualized)되며 균일한 크기 분포도를 가지는 것을 알 수 있었다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 유화 확산법에 의해서 제조된 자기성 나노입자의 평균 직경은 마그네타이트의 양이 0.1g에서 0.5g으로 증가함에 따라 150에서 170nm까지 증가하였다.
실시예 4
다중 유화법에 의한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 수상 2에 대한 유화제의 농도를 변화시켜가며 제조된 자기성 나노입자의 크기 및 형태의 비교
젬시타빈 50mg, 마그네타이트0.4g 및 PVA(0.1% w/w)를 D.D.I 증류수 2ml에 분산시켜서 수상 1을 제조하였고, PCL(5% w/w)을 에틸아세테이트 10ml에 용해시켜서 유상을 제조하였다. 상기 수상 1을 유상에 부가하고 30% 파워 프로브 소니케이터를 이용하여 4분 동안 유화시켰다. 그 다음, PVA 0.05mg 내지 0.4mg을 포함하는 20ml의 수상 2에 상기 W/O 유화액을 부가하고 15% 파워 프로브 소니케이터를 이용하여 1분 동안 유화시켰다. 이렇게 제조된 이중 에멀전(W/O/W)을 D.D.I 증류수 100ml로 희석하였고 이 시스템을 온화한 교반하에 유지하였다. 최종 자기성 나노입자는 상기 반응 후 산물을 막여과지(공극 크기:0.45㎛)를 이용하여 여과하고, 세럼을 교체한 다음 10,000rpm에서 30분 동안 3차례 원심분리하여 35℃ 진공 오븐에서 건조시킴으로써 수득하였다.
한편, 이렇게 제조된 자기성 나노입자의 크기 및 형태(morphology)는 SEM을 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5의 사진으로부터 일반적으로 유화제의 농도가 증가함에 따라 입자크기는작아지고 균일하게 분산되는 것을 확인할 수 있었다. 유화제의 농도가 0.25% 이하인 경우(a)에는 응집된 입자가 제조되었으며, 유화제의 농도가 약 2%인 경우(d)에 적합한 자기성 나노입자가 제조되었다.
실시예 5
다중 유화법에 의한 자기성 나노입자의 제조방법에 있어서, 마그네타이트 : PCL의 비율을 변화시켜가며 제조된 자기성 나노입자의 크기 및 형태의 비교
마그네타이트의 양을 0.1g 내지 0.5g 범위로 변화시켜 상기 실시예 4와 동일한 방법(단, 수상 2에서 PVA의 농도는 2%)으로 제조하였다. 제조된 자기성 나노입자의 형태, 평균 크기 및 크기 분포도를 SEM 및 DLS를 이용하여 확인하였고, 그 결과를 도 6 및 7에 각각 나타내었다.
도 6의 사진을 통하여 다중 유화법으로 제조된 자기성 나노입자는 유화 확산법으로 제조된 자기성 나노입자 보다 더 넓은 크기 분포도를 가지며 더 응집되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 다중 유화법에 의해서 제조된 자기성 나노입자의 평균 직경은 마그네타이트의 양이 0.1g에서 0.5g으로 증가함에 따라 350에서 370nm까지 증가하였다.
실시예 6
본 발명의 자기성 나노입자내에 마그네타이트가 캡슐화되는 효율
전술한 실시예 2(단, 유상 : 수상의 비율은 1 : 2) 및 실시예 4(단, 수상 2에서 PVA의 농도는 2%)에서 제조된 자기성 나노입자 내에 마그네타이트가 로딩되었는지 여부를 확인하기 위해서 FTIR 분석을 실시하였고, 이의 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 (b)에서 볼 수 있는 바와 같이, 순수한 PCL 입자의 스펙트럼은 카르보닐기의 밴드에 해당하는 1726㎝-1, 지방족의 카르복실-하이드로기의 밴드에 해당하는 2943㎝-1에서 특유의 밴드를 형성하였다. 마그네타이트의 IR 스펙트럼(a)은 철 산화물의 구조로 인하여 저주파 영역(1000-300㎝-1)에서 형성되었다. 한편, 도 8의 (c) 및 (d)에 나타낸 바와 같이, 자기성 나노입자의 가장 특징적인 밴드(570㎝-1)는 마그네타이트(570㎝-1)의 그것과 비교해서 확인할 수 있는데, 이를 통하여 전술한 실시예에서 제조된 자기성 나노입자의 스펙트럼에서 순수한 PCL 입자의 모든 밴드가 존재함을 알 수 있었다. 즉, 마그네타이트는 자기성 나노입자의 내에 로딩되었다.
자기성 나노입자 내에 로딩된 마그네타이트의 실질적인 농도는 흡광도를 통해서 측정될 수 있는데, HCl/H2O2= 2:3 v/v 용액을 첨가하여 Fe2+에서 Fe3+로의 산화를 유도하고 1%의 암모늄 티오시아네이트를 부가해서 형성된 티오시아네이트 복합체의 흡광도를 λ=480nm의 파장에서 측정하였다.
이러한 측정 결과를 통해서 나온 수치를 이용하여 계산된 마그네타이트의 캡슐화 효율을 최종 자기성 나노입자의 크기와 함께 표 1(유화 확산법) 및 2(다중 분산법)에 나타내었다. 두 가지 제조방법에 있어서, 자기성 나노입자의 크기는 마그네타이트의 양이 증가함에 따라 일관되게 증가하였지만 이의 변화는 적은 편이었다. 반면에, 캡슐화 효율은 제조방법 및 마그네타이트의 양에 따라 차이가 있었으며, 마그네타이트의 최대 캡슐화 효율은 각각 이론적 로딩(theoretical loading)의 약 7.84%, 15.8%임을 확인하였다.
마그네타이트/PCL 비율(w/w) 평균 크기(nm) 마그네타이트 로딩(mg) 캡슐화 효율(%)
1/5 150±0.5 0.6 3.43
2/5 158±0.5 1.3 4.4
3/5 164±0.5 2.7 5.4
4/5 167±0.5 3.5 7.84
마그네타이트/PCL 비율(w/w) 평균 크기(nm) 마그네타이트 로딩(mg) 캡슐화 효율(%)
1/5 322.4±0.5 1.86 1.18
2/5 324±0.5 3.81 13.32
3/5 329±0.5 5.56 14.83
4/5 339.5±0.5 6.7 15.80
(여기서, 마그네타이트 로딩 : 자기성 나노입자 1mg에 캡슐화된 마그네타이트의 양, 캡슐화 효율 : 이론적 로딩에 대한 상기 마그네타이트 로딩의 비율이다.)
실시예 7
본 발명에 따른 자기성 나노입자의 자기적 성질
마그네타이트 및 전술한 실시예 2(단, 유상 : 수상의 비율은 1 : 2) 및 실시예 4(단, 수상 2에서 PVA의 농도는 2%)에서 제조된 자기성 나노입자에 대한 자기적 성질은 VSM(vibrating sample magnetometer)을 이용해서 확인하였고, 자기 이력 루프(magnetic hysteresis loop)는 도 9에 나타내었다.
도 9의 (a)에 나타낸 바와 같이, 상온에서 마그네타이트의 자기화 곡선은 어떠한 자기 이력도 보이지 않았는데, 이러한 결과는 100㎚ 마그네타이트 자기성 나노입자의 전형적인 초상자기적 성질과 일관성이 있는 것이다. 10koe 이상의 자기장은 기본적으로 상온에서 자기성 분말을 포화시켰으며, 6koe 자기장에서 48emu의 값이 포화 자기화로서 확인되었다. 도 9의 (b) 및 (c)에 나타낸 바와 같이, 자기성 나노입자의 최대 자기적 성질은 자기장 세기 6koe에서 약 10.2 emu/g로 측정되었다. 이러한 자기장 하에서, 곡선은 어떠한 이력 뿐만 아니라, 잔류전기 및 보자력(coercitivity)도 나타내지 않았다. 자기성 나노입자의 포화 자기화는 거대한 마그네타이트의 그것보다 작지만, 이러한 혼성(composite) 입자는 상자기적인 성질을 가지고 있었다.
실시예 8
본 발명에 따른 자기성 나노입자의 치료제 방출 실험
전술한 실시예 2(단, 유상 : 수상의 비율은 1 : 2) 및 실시예 4(단, 수상 2에서 PVA의 농도는 2%)의 제조방법을 이용하여 표 3에 기재된 수치에 따라 자기성 나노입자를 제조하였다.
상기 자기성 나노입자의 치료제 방출 실험은 37±0.5℃에서 인산 완충용액을 포함하는 수용성 방출 매질(aqueous release medium)에서 수행하였다. 건조시킨 자기성 나노입자를 수용성 방출 매질 30ml을 포함하는 플라스크에 넣고, 이 플라스크를 회전(shaking) 인큐베이터(SI-900, J.O Tech., Korea)에 위치시키고 150rpm의 속도로 회전시켰다. 24시간 간격마다, 수용액 3ml를 빼내고 D.D.I. 증류수 3ml로 보충하였다. 방출된 치료제의 양은 표준 보정 곡선(standard calibration curve)을 가지는 UV 분광기(UV16A, Shimadzu, Japan)를 사용해서 흡광도를 측정함으로써 모니터할 수 있었다. 젬시타빈 및 시스플라틴에 대한 흡광도는 각각 267.8nm 및 270.6nm의 파장에서 측정되었으며, 이의 결과는 도 10 및 11에 나타내었다.
이에 따르면, 방출 프로필은 자기성 나노입자의 제조방법에 따라 큰 차이를 보였다. 유화 확산법에 의해서 제조된 입자의 경우, 매우 빠른 방출을 관찰할 수 있었는데, 이는 치료제가 입자의 표면 가까이에 위치하기 때문으로 볼 수 있다. 역으로, 다중 유화법에 의해서 제조된 입자의 경우, 매우 느린 방출 프로필을 관찰할 수 있었으며, 이는 치료제가 고분자 매트릭스 내부에 위치하고 고분자의 붕괴에 의해서 방출이 일어남을 알 수 있었다.
실시예 9
본 발명의 자기성 나노입자 내에 치료제가 캡슐화되는 효율
상기 치료제 방출 실험을 통해서 본 발명에 따른 자기성 나노입자 내에 치료제가 캡슐화되는 효율(30일째 까지 방출되는 젬시타빈 또는 시스플라틴의 총량을통하여)을 알 수 있었으며, 이의 결과를 표 3에 나타내었다.
이에 따르면, 유화 확산법 및 다중 유화법에 의해서 제조된 자기성 나노입자의 젬시타빈 및 시스플라틴의 최대 캡슐화 효율은 각각 이론적 로딩의 약 18.6%, 52.5% 및 71.4%, 30.4%이다. 시스플라틴(소수성)은 유화 확산법에 의해서 제조된 경우에, 젬시타빈(친수성)은 다중 유화법에 의해서 제조된 경우에 캡슐화 효율이 우수하였다. 결론적으로 다중 유화법은 수용성 치료제를, 유화 확산법은 물과 혼합될 수 없는 치료제를 자기성 나노입자 내에 캡슐화하는데 적합하다는 것을 알 수 있었다.
방법 치료제 치료제/PCL 비율 치료제 로딩(mg) 캡슐화 효율(%)
유화-분산법 젬시타빈 0.01 0.11 10.8
0.1 1.93 18.6
시스플라틴 0.01 0.39 39.2
0.1 4.74 52.2
다중유화법 젬시타빈 0.01 0.49 49.4
0.1 6.58 71.4
시스플라틴 0.01 0.24 24.6
0.1 2.8 30.4
(여기서, 치료제 로딩:자기성 나노입자 1mg에 캡슐화된 치료제의 양,
캡슐화 효율 : 이론적 로딩에 대한 상기 치료제 로딩의 비율이다.)
실험예
본 발명에 따른 자기성 나노입자의 항암효과
(1) 췌장암 세포주 배양
HPAC(human pancreatic cancer cell line, ATCC : CRL-2119)는 췌장 도관 유래의 중등도로 분화된 사람의 선암종으로서, DMEM 및 Ham F-12 영양 배지(NaHCO31.2g/l 및 15mM HEPES를 포함)의 1:1 혼합물인 DEEM:F-12에서 배양하였다. 상기 배양 배지는 5% 소태아의 혈청 및 1% 항생제를 첨가하였다. 세포 배양은 5% CO2하에 습윤된 공기, 37℃에서 배양하였고, 배지는 매 3일마다 교체해주었다.
(2) 이종 이식
HPAC 세포 1×07를 좌우대칭적으로 BALB/c 누드 마우스의 옆구리에 있는 피하 조직에 주입하였다. 종양 덩어리는 늑골 융선(costal ridge)을 덮으면서, 대칭적으로 측면 대부분을 차지하게 되었다. 모든 마우스는 먹이 및 수분에 있어서, 동일한 조건하에 유지시켰다.
(3) 치료제 투여 및 자기장의 적용
종양 주입후 14일째에, 마우스는 대칭적으로 HPAC 종양 세포의 그래프트(graft)를 발달시켰다. 상기 마우스들을 무작위적으로 두 개의 치료 그룹 중의 하나로 할당하였다:(a) 대조군(마리수=7) 및 (b) 실험군(마리수=8). 마우스들이 두 개의 서로 다른 치료 프로토콜로 분리된 날을 임의적으로 0일로 명명하였다. 각각 0, 7, 14 및 20일째에 모든 15마리의 마우스에게 실시예 2에서 제조된 자기성 나노입자를 함유하는 조성물을 26 게이지 바늘을 이용하여 꼬리의 혈관을 통해서 정맥 투여하였다(마우스 몸무게 1kg당 자기성 나노입자 120mg의 투여량으로). 투여하자마자, 실험군에 속하는 마우스들은 움직임을 최소화하도록 고정시킨 다음에 간편한 테이프 부착에 의해서 0.25 Tesla 자석을 좌측 종양 덩어리 위에 있는 피부에 고정시켜서 2시간 동안 자기장의 영향을 받도록 하였다. 대조군의 마우스들 역시 동일한 양의 치료제를 동일한 방식으로 투여받았지만, 자기장을 적용시키지 않았다(도 12).
상기 단계에서 적용된 자기장의 세기는 임시적인 생체내 연구를 통하여 약 0.25 Tesla 자석이 본 발명의 자기성 나노입자를 종양 덩어리로 표적화하는데 가장 효과적인 것으로 나타났기 때문에 선택된 것이다.
(4) 종양 절단 및 블루 철 염색
21일까지 생존한 마우스를 경추탈골시켜서 희생시키고, 이 마우스들을 이식된 종양에 대하여 해부하고 회수해서 파라-포름알데하이드에 고정시킨 다음 프러시안 블루 염색에 의한 철분석을 위해서 동결-절단하였다.
상기 종양 조직의 동결된 단편을 아세톤으로 고정시키고 H2O2로 처리한 다음 염색은 Gomori의 프러시안 블루 철 반응에 따라 진행하였다. 블루 철 염색 결과는도 13, 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 13, 도 14 및 도 15에 의하여 본 발명에 따른 자기성 나노입자가 자기장이 적용된 부위에 국소적으로 집중되는 것을 확인할 수 있었다.
(5) 데이터 및 통계적 분석
종양 크기는 캐리퍼스를 이용하여 길이 및 최장의 폭에 대하여 이차원적으로 측정되었다. 종양의 부피는 다음의 수학식 1에 의해서 계산되었고, 도 16에 그 결과를 그래프로서 나타내었다. 상기 계산을 실험군 및 대조군 각각에 대하여 평균화하고 Unpaired Welch's Correction test를 이용해서 비교하였다.
V = (a × 2b)/2 [a=길이(cm), b=폭(cm)]
본 발명에서 발명자들은 종양 크기에 대하여 2가지 비교를 수행하였다. 첫 번째 비교는 실험군 내에서 좌측(자기장 적용) 및 우측(자기장 비적용) 종양을 비교한 것이다. 두 번째 비교는 대조군의 종양 및 실험군의 좌측 종양 사이에 이루어졌다.
본 발명자들은 첫 번째 비교에서, 자기장을 적용시킨 종양이 자기장을 적용시키지 않은 종양에 비해 크기가 더 감소되는 것을 확인하였다. 두 번째 비교에서, 자기장을 적용시킨 종양은 대조군의 종양에 비해서 크기가 더 감소된 것을 확인하였다. 한편, 첫 번째 비교에서 나타난 차이가 두 번째 비교에서 나타난 차이보다 더 크다는 것을 알 수 있었다. 이는 실험군에서는 좌측 종양에 미치는 자석의 작용으로 인하여 자기성 나노입자가 상대적으로 좌측 종양으로 집중되는 반면에, 대조군에서는 좌측 종양의 자기성 나노입자 농도와 우측 종양의 자기성 나노입자 농도가 서로 비슷하기 때문이다. 결론적으로 자기성 나노입자의 농도는 실험군의 우측 종양, 대조군의 좌우측 종양, 실험군의 좌측 종양의 순서로 증가하였으며, 이에 따라 항종양 효과도 증가하였다. 특히, 실험군의 좌측 종양에서는 종양의 성장이 억제될 뿐만 아니라 퇴화되는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 자기성 나노입자를 포함하는 조성물은 치료제가 실질적으로 질병 부위에만 집중되고 조직 깊숙이 침투가능하도록 함으로써 부작용은 최소화하고 병소에 대한 약물의 작용은 극대화시킬 수 있을 것이다.

Claims (16)

  1. 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 함유하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생분해성 고분자가 폴리에스테르인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리에스테르가 폴리카프로락톤인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 자기성 물질이 Fe-계 자기성 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 Fe-계 자기성 화합물이 마그네타이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 자기성 나노입자의 크기가 500nm이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기성 나노입자의 제조방법 :(a) 치료제, 생분해성 고분자 및 자기성 물질을 물에 부분적으로 용해되는 용매(organic phase:유상)에 용해시키는 단계; (b) 상기 용액을 안정화제가 용해되어 있는 수용액(aqueous phase:수상)에 포화시켜 상평형에 도달시키는 단계; (c) 상기 포화 용액을 균질화기를 이용하여 유화시키는 단계; (d) 상기 유화된 용액에 물을 첨가하여 물에 부분적으로 용해되는 용매를 수상에 확산시키는 단계 및 (e) 상기 용액을 여과법, 세럼 교체, 원심 분리 및 진공 건조를 거쳐서 최종 자기성 나노입자를 수득하는 단계.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 수상의 부피가 유상 부피의 약 2배인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 자기성 물질의 양이 생분해성 고분자 양의 약 0.8배인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 치료제가 소수성인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기성 나노입자의 제조방법: (a) 치료제, 자기성 물질 및 유화제를 증류수에 용해시켜서 수상 1을 제조하는 단계; (b) 생분해성 고분자를 물에 부분적으로 용해되는 용매에 용해시켜서 유상을제조하는 단계; (c) 상기 수상 1을 상기 유상에 부가하고 교반하여 1차 W/O형 유화물을 제조하는 단계; (d) 상기 1차 W/O형 유화물에 유화제가 용해되어 있는 증류수(수상 2)를 부가하고 교반하여 W/O/W형 유화물을 제조하는 단계 및 (e) 상기 유화물을 여과법, 세럼 교체, 원심 분리 및 진공 건조를 거쳐서 최종 자기성 나노입자를 수득하는 단계.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 수상 2에 용해되어 있는 유화제의 농도가 약 2%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 자기성 물질의 양이 생분해성 고분자 양의 약 0.8배인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 11항에 있어서, 상기 치료제가 친수성인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 하기의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적지향적 치료제 전달방법: (a) 자기성 물질 및 치료제를 생분해성 고분자로 캡슐화한 자기성 나노입자를 포함하는 조성물을 피험자에게 투여하는 단계 및 (b) 표적 부위에 일정 시간 동안 외부 또는 내부 자기장을 작용시킴으로써 자기성 나노입자를 표적 부위에 국소적으로 집중시킨 다음 생분해성 고분자가 분해되면서 치료제가 방출되도록 하는 단계.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 자기장이 0.2 내지 0.3 Tesla의 세기를 가지는 것을 특징으로 하는 표적지향적 치료제 전달방법.
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