KR20040088514A - 2'-ｏ-(2-메톡시)에틸 변형체를 갖는올리고뉴클레오티드를 사용한 ｔｒｐｍ-2 안티센스 치료법 - Google Patents

2'-ｏ-(2-메톡시)에틸 변형체를 갖는올리고뉴클레오티드를 사용한 ｔｒｐｍ-2 안티센스 치료법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열 CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT의 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물에 관한 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드(뉴클레오티드 5-17)는 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4 및 19의 시토신은 5-메틸시토신이다. 이 화합물은 생체내 안정성 증가와 시험관내 및 생체내 항종양 활성 증가를 나타낸다.

Description

2'-Ｏ-(2-메톡시)에틸 변형체를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용한 ＴＲＰＭ-2 안티센스 치료법 {TRPM-2 ANTISENSE THERAPY USING AN OLIGONUCLEOTIDE HAVING 2'-0-(2-METHOXY)ETHYL MODIFICATIONS}
전립선암은 남성에게 발생하는 가장 일반적인 암으로서, 서구에서는 암에 의한 남성의 사망 원인 중 그 두 번째를 차지하고 있다. 전립선암은 안드로겐-민감성 종양이기 때문에, 진행형 전립선암 환자를 위한 일부 치료법에서는, 예컨대 거세를 통해 안드로겐을 중단시키는 방법을 이용하고 있다. 안드로겐 중단은 전립선 종양에서 광범위한 아폽토시스를 유도하여 질병을 회귀시킨다. 그러나 거세에 의한 아폽토시스는 완전하지 않고, 궁극적으로는 종양 세포가 안드로겐-독립 세포로 진행하게 된다. 이러한 진행은 생존과 삶의 질을 향상시키는 데 주요 장애물이 되므로, 안드로겐-독립 세포에 대한 연구에 노력을 기울여 왔다. 이러한 노력은 안드로겐-독립성 종양 세포를 표적화하는 비호르몬 요법에 그 초점을 맞추어 왔으나, (Yagoda et al., Cancer 71 (Supp.3):1098-1109 (1993); Oh et al., J. Urol. 60:1220-1229 (1998)), 아직까지는 생존률을 향상시키는 비호르몬제는 없다.
TRPM-2는 제안된 활성이 광범위한 편재성 단백질이다. 전립선 상피 세포에서, TRPM-2의 발현은 거세 직후 증가하여, 대량 세포사의 개시와 일치하는 거세 3～4일에 래트 전립선 세포에서 최대 수준에 도달한다. 일부 연구진들은 이러한 결과로부터 TRPM-2가 세포사의 마커이며 아폽토시스의 촉진인자라는 결론을 내렸다. 한편, 세르토리 세포와 일부 상피 세포가 세포사 레벨을 증가시키지 않고 TRPM-2를 고레벨로 발현한다는 관찰 결과는, 그러한 결론이 옳은 것인가에 대한 의문을 제기한다.
Sensibar 등[Cancer Research 55:2431-2437 (1995)]은 전립선 세포사에서 TRPM-2의 역할을 더욱 명백하게 해명하기 위해 실시된 시험관내 실험에 대해 보고한 바 있다. 이들은 TRPM-2를 암호화하는 유전자로 형질감염된 LNCaP 세포를 이용하고, 상기 단백질의 발현이 LNCaP 세포가 매우 민감하게 반응하는 종양 괴사 인자 α(TNFα)의 효과에 영향을 주는지 여부를 관찰하였으며, 세포사는 일반적으로 약 12시간 내에 일어났다. TNFα로 형질감염된 LNCaP 세포를 처리하면 수 시간 동안 TRPM-2 레벨이 일시적으로 증가하는 것으로 확인되었으나, 그 레벨 증가는 세포사에 앞서 DNA 단편화가 관찰되는 시점에서 제거되었다. TRPM-2 서열의 염기 1～21번에 상응하는 안티센스 분자(다른 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티는 제외됨)는 TRPM-2의 발현을 실질적으로 감소시키고, TNFα에 노출된 LNCaP의 아폽토시스 세포사를 증가시킨다. 따라서 Sensibar 등은, 그 작용 기전은 분명하지 않지만, TRPM-2의 과다발현이 TNFα의 세포독성 효과로부터 세포를 보호하고, TRPM-2 고갈은 세포사의 개시의 원인이 된다는 가설을 세웠다.
Sensibar 등은 TRPM-2의 가능한 역활에 관한 정보를 제공하였지만, TRPM-2의 발현이 형질감염된 유전자에 기초하는 모델계로부터 얻은 결과만을 개시하고 있다. 또한, 다른 실험실에서 증식시킨 LNCaP 세포에서의 TRPM-2의 발현 레벨은 매우 낮거나 또는 발현되지 않는다. 전립선 종양 세포에 대해 안드로겐 중단 조치를 취한 경우 생체내에서 일어나는 상황은 더욱 복잡하며, 그 결과 다수의 단백질의 발현 레벨이 변한다. 따라서 Sensibar 등의 데이타로는, TRPM-2가 다른 단백질과 함께 존재하는 경우 동일한 기능을 수행하는지 여부 또는 생체내 안드로겐 중단 후에 TRPM-2의 레벨 변화가 임의의 치료 장점을 제공할 수 있는지 여부를 예측할 수 없다. 실제로, TRPM-2가 안드로겐 중단 후에, 유의적인 아폽토시스 세포사가 일어나는 단계를 비롯한 각종 단계의 전립선 종양 세포에서 상당량으로 발현된다는 사실은 생체내 TRPM-2의 역할이 더욱 복잡해질 수 있다는 것을 시사한다.
종래 기술에 따르면 전립선 종양 세포에서 일어나는 아폽토시스 세포사의 특정 측면과 관련된 데이타가 제공되었지만, 안드로겐-독립성의 개시 지연을 제공하는 방법을 교시하거나 제안한 적은 없었다.
본 발명은 테스토스테론에 의해 억제된 전립선 메시지-2(TRPM-2)에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 암의 안티센스 치료에 관한 것이다.
도 1은 안티센스 TRPM-2 ODN을 사용하여 실현한 안드로겐-독립성의 개시 지연을 도시한다.
도 2는 TRPM-2 발현을 억제하고 안드로겐-독립성의 개시를 지연하는 능력에 대해 평가한 10개 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치를 나타낸다.
도 3은 각종 안티센스 ODN의 존재 하의 TRPM-2 mRNA의 발현 레벨을 도시한다.
도 4는 상이한 양의 안티센스 TRPM-2 ODN 또는 부정합 대조군으로 시험관내 처리한 시오노기(Shionogi) 세포에서의 TRPM-2 mRNA의 레벨을 도시한다.
도 5는 탁솔과 안티센스 TRPM-2 ODN의 조합에 대한 용량-반응 곡선을 도시한다.
도 6은 탁솔, 안티센스 TRPM-2 ODN 및 안티센스 Bcl-2 ODN의 조합에 대한 용량-반응 곡선을 도시한다.
도 7a는 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리한 후에 인간 신장 세포암에서의 TRPM-2 mRNA 레벨 감소를 도시한다.
도 7b는 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리한 후에 탁솔에 대한 인간 신장 세포암의 약물 민감성의 증가를 도시한다.
도 8은 각종 선량의 방사선 조사 후에 PC-3 전립선암 세포에서의 TRPM-2 발현을 도시한다.
도 9a 및 9b는 TRPM-2를 과다발현하는 인간 전립선 세포주(LNCaP/T) 및 정상적으로 발현하는 인간 전립선 세포주(LNCaP/P)의 방사선 내성을 비교한 것이다.
도 10은 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리한 후 방사선에 대한 PC-3 세포의 감수성 증가를 도시한다.
도 11a 및 11b는 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리한 후 방사선에 대한 PC-3 세포의 민감성 증가를 도시한다.
도 12a 및 12b는 안티센스 TRPM-2 ODN의 투여시 약물요법제인 파클리탁셀과 미톡산트론에 대한 시오노기 종양 세포의 민감성 증가를 도시한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 TRPM-2 서열의 번역 개시 코돈과 이에 이은 6개 코돈을 표적으로 하는 21량체 올리고뉴클레오티드(CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT; 서열 번호 4)인 안티센스 TRPM-2 올리고뉴클레오티드 ISIS 112989에 관한 것이다(젠뱅크 기탁 번호: NM_001831). ISIS 112989는 본 명세서 중에 2'-MOE 변형된 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 2'-MOE ASO라고도 불리워진다. 이 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 갖는다. 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분("날개")은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드(뉴클레오티드 5-17: "데옥시 갭")는 2'-데옥시뉴클레오티드이다. 날개 중의 시토신(즉, 뉴클레오티드 1, 4 및 19)은 5-메틸시토신이다. 또한, 본 발명은 암 치료에 있어서 ISIS 112989 조성물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 암 세포가 TRPM-2를 발현하는 암 치료에 적용할 수 있다. TRPM-2를 발현하는 중요한 종류의 암 세포로는 전립선암 세포, 인간 신장 세포암(RCC) 세포, 비-소세포 폐암 세포, 요로상피 이행 암 세포, 난소암 세포 및 일부 유방암 세포 등이 있다.
모출원(2001년 8월 30일에 출원된 미국 특허 출원 09/944,326호와 2001년 8월 10일에 출원된 09/913,325호)에서 보고된 바와 같이, 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제함으로써 거세에 의해 유도되는 세포사의 증가와 안드로겐-민감성 전립선암 세포의 안드로겐-독립성으로의 진행 지연이 실현된다. 3가지 모델계, 즉 생체내 시오노기 종양 모델, 인간 TRPM-2 형질감염된 LNCaP 모델 및 인간 PC-3 모델에서 실험을 실시하였으며, 이들 결과를 취합하여 안드로겐-독립성으로의 진행을 지연시키는 억제는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)로 안드로겐-민감성 전립선 종양 세포를 처리하여 실현될 수 있다는 것을 입증하였다.
모출원에서 보고된 제1 실험에서는, 시오노기 종양 모델에서 안드로겐 독립성의 개시를 지연시키는 마우스 TRPM-2 안티센스 분자(서열 번호 1)의 능력을 평가하였다. TRPM-2의 발현을 억제하여 안드로겐-독립성의 개시를 지연하는 안티센스ODN의 능력은, 시오노기 종양 모델에서 거세후 종양 부피를 측정하여 평가하였다. 완충된 염수액 중의 안티센스 TRPM-2 ODN(서열 번호 1)을 12.5 ㎎/kg의 반복 투여량으로 1일 1회 테스트 동물(n=7)에게 복강내 투여하였다. 대조군으로서, 부정합 ODN(서열 번호 2)으로 동물(n=7)을 처리하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 테스트군과 처리군은 모두 거세 직후에 예상한 대로 종양 부피 감소를 나타내었지만, 안티센스 TRPM-2 ODN 처리된 마우스에서의 종양은 대조군보다 빠르게 퇴화되었다. 또한, 대조군은 안드로겐-독립성의 형성과 관련된 종양 부피의 예측된 증가를 나타내었다. 대조적으로, 안티센스 TRPM-2를 사용하여 처리한 마우스에서는 거세 49일 후에 종양 재성장이 거의 일어나지 않았다. 결국 안티센스 TRPM-2 ODN 처리된 마우스에서 종양은 재발되었지만, 재발 시간의 중앙값은 대조군의 대략 2배이다. 따라서 TRPM-2의 억제는, 안드로겐 중단 직후에 발생하는 세포사의 양을 증가시킬 뿐 아니라, 안드로겐-독립성의 개시를 지연시키는 데 효과적이다. 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리한 마우스에서 종양 부피가 더욱 빠르게 감소하는 원인은, 거세에 의해 유도된 아폽토시스가 더욱 조기에 개시되고 더욱 광범위하기 때문이었다. 이것은 시오노기 종양 표본에서 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제(PARP) 분해 단편을 검출하여 확인하였다(Miyake, et al., Cancer Res. 60:170-176 (2000)).
모출원에서는, TRPM-2 mRNA 서열에 상보적인 인간 안티센스 ODN 중 어떤 것이 이러한 용도로 가장 유효한 지를 평가한 실험을 개시하였다. 도 2에 도시된 바와 같이 각종 mRAN 영역에 걸쳐 있는 일련의 10개 안티센스 포스포로티오에이트 ODN을 제조하였다. 이들 10개의 ODN의 서열은 서열 번호 3 내지 12로서 서열 목록에 첨부되어 있다. TRPM-2 형질감염됨 LNCaP 세포와 인간 전립선암 PC-3 세포를 사용하여, TRPM-2 mRAN의 발현을 억제하는 ODN의 능력에 대해 10개의 인간 안티센스 ODN을 평가하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 테스트된 안티센스 ODN이 생성하는 TRPM-2 mRNA 발현의 억제 레벨은 가변적이었으며, 서열 번호 4, 5 및 12의 서열을 이용할 때 최상의 결과가 얻어졌다. 서열 번호 5는 LNCaP 세포에서의 TRPM-2 발현을 억제하는, Sensibar가 사용한 서열에 상응하며, TRPM-2 mRAN의 처음 21개 염기에 상보적이다. 서열 번호 4를 이용하면 가장 효과적인 하향조절이 일어났다. 모든 유효 서열의 공통점은 TRPM-2 mRAN의 개시부 또는 종결부와 중복된다는 것이다. 따라서 안티센스 ODN, 특히 번역 개시부 또는 종결부에 걸쳐있는 TRPM-2 mRNA의 영역에 상보적인 안티센스 ODN을 투여하면 TRPM-2의 발현을 억제할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
모출원에 따르면, 안드로겐 중단을 개시하여 개체의 전립선암 세포의 아폽토시스 세포사를 유도하고, 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물을 개체에게 투여하여, 개체에서 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연시킴으로써, 전립선암을 앓고 있는 인간을 비롯한 개체를 처치 치료할 수 있다고 개시되어 있다. 수술(양 고환 제거) 또는 의약(약물에 의해 유도되는 테스토스테론 억제) 거세를 통해 안드로겐 중단을 개시할 수 있으며, 현재 전립선암 치료를 위해 처방되고 있다. 의약 거세는, LHRH 제제 또는 항안드로겐을 비롯한 각종 방법으로 실현할 수 있다. (Gleave et al., CMAJ 160:225-232 (1999)). 가역적 안드로겐 중단이 실시되는 간헐 요법이 Gleave 등의 문헌[Eur. Urol. 34 (Supp.3):37-41 (1998)]에 개시되어 있다. TRPM-2 발현 억제는 일시적일 수 있으며, 이상적으로는 안드로겐 중단과 동시에 일어나야 한다. 이것은, 인간의 경우 발현 억제가 안드로겐 중단 당일 또는 2일 내에 개시하여 약 3～6개월 동안 실시되어야 한다는 것을 뜻한다.
또한 모출원에는, 안티센스 TRPM-2 ODN이 인간 신장 세포암(RCC)의 약물 민감성을 증가시키는 것으로 결정되었다고 보고되어 있다. RCC는 내약물성 질환으로서, 목적 반응율이 10%를 넘는 활성 약물치료제가 없다. 아폽토시스를 진행하는 신장 근위 곱슬 세포에서의 TRPM-2 발현 증가가 요관 폐쇄 및 아미노글리코시드를 비롯한 각종 자극 후에 관찰되었다. RCC에서의 TRPM-2 발현의 기능적 중요성이 문헌에 개시된 바 없지만, 테스트 결과 안티센스 TRPM-2 ODN이 인간 RCC CaKi-2 세포에서 약물 민감성을 증가시킨다는 것이 확인되었다(하기 실시예 6 참조). 안티센스 TRPM-2 ODN은 방사선에 대한 민감성도 증가시키는 것으로 밝혀졌다(실시예 7 및 8 참조).
모출원에 따르면, 사용된 ODN은 변형되어 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다고 보고되어 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 증가시킨 포스포로티오에이트 유도체(다리걸침하지 않은 포스포릴 산소 원자를 황 원자로 치환)로서 ODN을 사용할 수 있다. 2'-MOE (2'-0-(2-메톡시에틸)) 변형체 (ISIS 골격)도 유효하며, 안티센스 TRPM-2 올리고뉴클레오티드의 시험관내 및 생체내 항종양 활성을 향상시킨다.
본 발명은 2'-MOE 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 112989, 전술한 바와 같음), 거세에 의해 유도되는 종양 세포사를 증가시키고 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연시키며, 전립선암을 앓고 있는 인간을 비롯한 개체의 치료를 위해 ISIS 112989를 사용하는 방법, 및 그러한 방법에 사용하는 데 효과적인 ISIS 112989를 함유하는 치료제를 개시한다. 본 발명의 치료 방법은 진행형 전립선암 개체의 치료에 가장 일반적으로 사용되게 될 것이다.
ISIS 112989의 투여는, 자체 투여 및 약학적으로 허용가능한 지질 담체 중에서의 투여를 비롯하여 당업계에 공지된 각종 기전을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 안티센스 전달용 지질 담체는 참고 인용한 미국 특허 5,855,911호 및 5,417,978호에 개시되어 있다. 일반적으로, 정맥내(i.v.), 복강내(i.p.), 피하(s.c.) 또는 경구 경로, 또는 직접적인 국소 종양 주사를 통해 ISIS 112989를 투여한다. 모출원에 보고된 시오노기 마우스 모델을 사용한 실험으로부터, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 종양 세포 내에서 우선적으로 작용한다는 것이 확인된다.
투여되는 ISIS 112989의 양은 전립선 세포에서 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 양이다. 이 양은 사용된 임의의 담체의 특성에 따라 달라질 것이다. 임의의 소정 조성물을 위한 적량은, 적절한 치료 레벨을 평가하도록 고안된 표준 테스트 시리즈를 이용하여 당업자가 결정한다.
본 발명에 따라 전립선암을 치료하는 방법은 약물요법제 및/또는 다른 표적을 지향하는 추가의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 모출원에서는 안티센스 TRPM-2 ODN이 탁산(파클리탁셀 또는 도세탁셀) 및 미톡산트론과 같은 종래의 약물요법제에 대한 민감성을 증가시킨다는 것을 시오노기 종양 모델을 이용하여 확인하였다(도 12a 및 12b). 도 12a 및 12b에 도시된 바와 같이, 탁솔 또는 미톡산트론의 존재 하에 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리하면, 탁솔 또는 미톡산트론과 부정합(MM) ODN의 조합물에 의한 처리와 비교하여 종양 부피를 감소시켰다. 상승 활성을 나타낼 것 같은 다른 제제로는 기타 세포독성제(예, 시클로포스파미드, 토포이소머라제 억제제), 혈관형성 억제제, 분화제 및 신호 변환 억제제 등이 있다. 이와 마찬가지로, TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드와 다른 안티센스 종(예, 안티센스 Bcl-2 ODN)의 조합물은 ODN을 단독으로 사용한 것보다 시험관 내에서 시오노기 세포를 사멸시키는 데 더욱 양호하게 작용하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 TRPM-2가 다른 안티센스 분자(예, 안티센스 Bcl-2, Bcl-xl 및 c-myc 올리고뉴클레오티드)와 함께 작용하여 유효성을 높일 수 있다는 것이 모출원에서 확인되었다.
본 발명을 위해서, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드와 제2 세대 골격 2'-0-(2-메톡시)에틸(2'-MOE) 리보스 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ISIS 112989 또는 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 효능, 조직 반감기 및 독성을 비교한 연구를 실시하였다. 이들 연구 방법 및 결과는 실시예 13에 개시되어 있다. 연구 결과는, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드가 용량 의존적이고 서열 특이적인 방식으로 TRPM-2 mRNA 레벨을 감소시킨다는 것이다. 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여 TRPM-2 mRNA를 더욱 강력하게 억제하였다. 파클리탁셀의 IC50은 양 화합물에 의해 동등하게 감소되었다. 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드의 생체내 조직 반감기는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 유의적으로 길었다. 생체내 파클리탁셀 효능을 증가시키는 데 있어서 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드를 매주 투여하는 것은 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드를 매일 투여하는 것과 같았다. 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드는 TRPM-2 발현을 유효하게 억제하고 조직 반감기가 길며 추가의 부작용이 없었다. 이들 결과는 효능을 유효하게 증가시키고 임상 시험에서 투여 간격이 길다는 점에서 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용할 것을 권장하는 것이다.
본 발명은, 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 ISIS 112989로 생체내 안드로겐-민감성 전립선 종양 세포를 처리하여 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 전립선암을 앓고 있는 개체에서 전립선암을 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 안드로겐 중단을 개시하여 개체의 전립선 종양 세포의 아폽토시스 세포사를 유도하는 단계, 및 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물을 개체에게 투여하여, 개체의 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연시키는 단계를 포함한다. TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물은 ISIS 112989이다. 이 방법은 약물요법제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 약물요법제는 탁산 또는 미톡산트론이다. 이 방법은 TRPM-2 이외의 항아폽토시스 단백질의 발현을 억제하는 제2의 안티센스올리고뉴클레오티드를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제2의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 Bcl-2 올리고뉴클레오티드이다. 대안적으로, 이 방법은 이들 2가지 추가의 단계의 조합을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 동일한 유형의 정상 조직과 다른 양으로 TRPM-2를 발현하는 암을 앓고 있는 개체에서의 암세포의 약물 민감성 또는 방사선 민감성을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 암세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 이 때 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물은 ISIS 112989이다.
또, 본 발명은 살아있는 전립선 종양 세포가 안드로겐-민감성인 상태로부터 살아있는 종양 세포가 안드로겐-독립성인 상태로 진행하는, 전립선 종양 세포군의 그러한 진행을 지연시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 ISIS 112989로 안드로겐-민감성 전립성 종양 세포군을 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 하기 비한정적인 실시예를 참조하여 추가로 개시될 것이다.
발명의 개요
본 발명은 서열 CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT(서열 번호 4)의 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물을 제공하는데, 여기서 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드(뉴클레오티드 5-17)는 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4 및 19의 시토신은 5-메틸시토신이다. 이러한 신규 화합물은 생체내 안정성이 증가되고, 시험관내 및 생체내 항종양 활성이 향상되는 것으로 밝혀졌다. 이 화합물은, 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연시키고, 전립선암을 앓고 있는 개체의 전립선암을 치료하고, 동일한 유형의 정상 조직과 다른 양으로 TRPM-2를 발현하는 암에 걸린 개체에서 암 세포의 약물 민감성 또는 방사선 민감성을 높이고, 살아있는 전립선 종양 세포가 안드로겐-민감성인 상태로부터 살아있는 종양 세포가 안드로겐-독립성인 상태로 진행하는, 전립선 종양 세포군의 진행을 지연시키기는 데 사용될 수 있다.
실시예 1
이식가능한 SC-115 AD 마우스 유방암의 토론토 하위 계통으로부터 얻은 세포를 사용하여 시오노기 종양 모델 실험을 실시하였다. 생체내 연구를 위해서, 시오노기 암종 약 5 ×106 세포를 성체 수컷 DD/S 종 마우스 내에 피하 주사하였다. 시오노기 종양의 직경이 1～2 cm가 되면, 일반적으로 주사한 지 2～3주 후에, 메톡시플루란으로 마취하고 복부를 절개하여 거세를 실시하였다. 마우스의 관리, 종양 스톡 및 조작 절차에 관한 상세한 설명은 이전에 개시된 바 있다. (Bruchovsky et al., Cancer res. 50:2275-2282 (1990); Rennie et al., Cancer Res. 48:6309-6312 (1988); Bruchovsky et al., Cell 13:272-280 (1978); Gleave et al., in Genitourinary Oncology, pp. 367-378, Lange et al., eds, Lippencott (1997); Gleave et al., J. Urol. 157:1727-1730 (1997); Bruchovsky et al., The Prostate 6:13-21 (1996)).
쥐 포스포로티오에이트 안티센스 TRPM-2 ODN(서열 번호 1), 또는 서열 내 2개의 염기가 안티센스 TRPM-2 ODN과 다른 부정합 대조군(서열 번호 2)으로 처리하기 위해 마우스를 무작위로 선택하였다. 각 실험군은 7마리의 마우스로 구성되어 있다. 거세 제1일에, 인산염 완충 염수 중에 용해된 안티센스 TRPM-2 또는 부정합 대조군 ODN 12.5 ㎎/kg을 40일간 각 마우스에게 1일 1회 복강내 주사하였다. 1주 2회 종양 부피를 측정하고, 길이 ×폭 ×깊이 ×0.5236의 식에 따라 계산하였다. Gleave et al., Cancer Res. 52:1598-1605 (1992). 평균 종양 부피 ±표준 편차로 데이타점을 보고하였다.
이 연구 결과는 도 1에 제시되어 있다. 도시된 바와 같이, 시오노기 종양이 더욱 빠르게 퇴화되었으며, 완전한 퇴화는 안티센스 TRPM-2 ODN으로 처리한 마우스에서 더욱 조기에 발생하였다. 또한, 안티센스 TRPM-2 ODN에 의한 처리는 안드로겐-독립 상태의 개시를 실질적으로 지연시켰는 데, 대조군 동물에서는 그러한 독립 상태가 21일 후에 종양 부피 증가로 확인된다. 안티센스 TRPM-2 또는 부정합 대조군과 관련된 부작용은 관찰되지 않았다.
TRPM-2 mRNA 레벨에 대한 생체내 ODN 처리 효과를 조사하기 위해서, 마우스로부터 얻은 시오노기 종양 조직을 노던 블롯 분석하였다. 거세 후 제1일에 시작하여 안티센스 TRPM-2 ODN (n=6) 또는 부정합 대조군 (n=6) 12.5 ㎎/kg을 마우스에게 매일 복강내 주사하였다. 거세 4일째, 종양 조직을 수거하고 TRPM-2 mRNA에 대한 노던 블롯으로 분석하였다. 안티센스 TRPM-2 ODN은 시오노기 종양에서, 부정합 대조군 ODN 처리한 종양과 비교하여 TRPM-2 mRNA 레벨을 75% 감소시켰다(도 3).
정상 마우스 장기에 대해서도 유사한 분석을 실시하였다. 동일한 처리 스케쥴에 따라 안티센스 TRPM-2 ODN 및 부정합 대조군으로 처리한 시오노기 종양 마우스로부터 비장, 신장, 전립선 및 뇌 샘플을 수거하고, 노던 블롯으로 분석하였다. TRPM-2 mRNA 레벨이 종양 조직에서 유의적으로 낮았지만, 정상 장기에서 안티센스 TRPM-2 ODN은 TRPM-2 mRNA 레벨에 영향을 주지 않았다.
실시예 2
안티센스 TRPM-2 ODN(서열 번호 1)의 서열 선택성은, 안티센스 TRPM-2 ODN 또는 부정합 대조군(서열 번호 2)의 레벨을 다양하게 하여 처리한 후에, 시험관 내에서 유지되는 시오노기 종양 세포내에서 TRPM-2 mRNA의 발현 레벨을 비교하여 확인하였다. 세포 내로의 ODN의 흡수를 촉진하기 위해서, ODN를 양이온 지질 담체 (리포펙틴(Life Technologies, Inc.)) 중에서 조제하였다. 하기 프로토콜을 이용하여 2일간 2회 세포를 처리하였다. 무혈청 OPTI-MEM(Life Technologies, Inc.) 중에서 세포를 리포펙틴 4 ㎍/㎖과 함께 20분간 사전배양한 다음, 선택된 농도의 ODN과리포펙틴을 함유하는 배지를 이용하여 4시간 동안 배양하였다. 이 배지를 표준 배양 배지로 교체하였다.
세포 중 TRPM-2 mRNA의 양은 노던 블롯 분석을 이용하여 평가하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 안티센스 TRPM-2 ODN으로 시오노기 세포를 처리하면 용량 의존 방식으로 TRPM-2 mRNA 레벨이 감소되었다. 대조적으로, 사용된 어떤 농도에서의 부정합 ODN(서열 번호 2)도 TRPM-2 mRNA 레벨에 영향을 주지 않았다. 따라서 안티센스 TRPM-2 ODN의 영향은 서열 특이적인 것이 분명하다.
실시예 3
다양한 양의 탁솔을 단독으로 또는 500 nM 안티센스 TRPM-2 ODN(서열 번호 1) 또는 부정합 대조군(서열 번호 2)과 조합하여, 시험관 내에서 유지되는 시오노기 세포의 처리에 사용하였다. 실시예 2에 개시된 바와 같이 세포를 2회 처리하고, 남아있는 생세포의 비율(%)을 결정하였다. 결과는 도 5에 요약되어 있다. 도시된 바와 같이 안티센스 TRPM-2 ODN을 포함하는 것은 용량-반응 곡선이 왼쪽으로 이동하여, IC50을 5～10배 낮추었다. 파클리탁셀 대신에 미톡산트론을 사용하여 유사한 결과를 얻었다(도 12a 및 12b).
실시예 4
안티센스 Bcl-2 ODN (서열 번호 13) 또는 부정합 Bcl-2 ODN (서열 번호 14)을 안티센스/부정합 TRPM-2 ODN 및 탁솔의 각종 조합물과 함께 첨가하여, 실시예 3의 실험을 반복하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. 안티센스 TRPM-2 ODN과 안티센스 Bcl-2 ODN 및 탁솔의 조합은 탁솔의 세포독성 효과를 추가로 증가시켰다. 따라서 추가의 항아폽토시스제의 표적화는 치료 이점을 제공하는 것으로 보인다.
실시예 5
인간 치료용의 적절한 안티센스 TRPM-2 ODN 서열을 동정하기 위해서, 인간 TRPM-2 유전자 중 10개의 상이한 부위에 대한 안티센스 ODN 서열 (도 2, 서열 번호 3～12)을 합성하고, 실시예 2에 개시된 바와 동일한 처리 프로토콜을 이용하여 TRPM-2를 과다발현하는 인간 전립선암 PC-3 및 형질감염된 LNCaP 세포에서의 TRPM-2 유전자 발현을 감소시키는 능력에 대해 시험하였다. 결과는 도 3에 요약되어 있다. 도시된 바와 같이, TRPM-2 발현 감소에 대해 서열 4, 5 및 12가 활성이다. 이들 3개의 서열은 중복되거나, 또는 전사 개시부 또는 종결부에 직접 인접해있다.
실시예 6
근치 신장제거술 표본으로부터 얻은 17개 RCC 및 정상 신장 조직에서의 TRPM-2 발현을 특성화하기 위해 면역조직화학 염색을 이용하였다. 인간 신장암 세포주 ACHN, CaKi-1 및 CaKi-2에서의 TRPM-2 발현은 노던 및 웨스턴 블롯 분석으로 평가하였다. 노던 블롯 분석을 이용하여 안티센스 TRPM-2 ODN 처리 후 TRPM-2 mRNA 발현 변화를 평가하였다. CaKi-2 세포 증식에 대한 조합된 안티센스 TRPM-2 ODN 및 탁솔 처리의 효과는 MTT 분석을 이용하여 조사하였다(Zellweger et al., Neoplasia 3:360-367 (2001)).
면역염색 결과, 인접한 정상 신장 조직과 비교하여 11개 RCC 표본에서는 TRPM-2 발현이 증가된 것으로 나타났다. 나머지 6 사례에서는 악성 조직과 정상 조직 사이에 차이가 관찰되지 않았다. TRPM-2 mRNA 및 단백질 발현은 둘다 3가지 모든 인간 RCC 세포주에서 검출가능하며, CaKi-2에서 최대 레벨이었다. 부정합 대조군 ODN(서열 번호 2)이 아니라, 안티센스 TRPM-2 ODN (서열 번호 1)이 용량 의존적 및 서열 특이적 방식으로 CaKi-2 세포에서 TRPM-2 발현을 억제하였다(도 7a). 또한, 안티센스 TRPM-2 ODN은 탁솔 약물 민감성을 실질적으로 증가시켜, 부정합 대조군 ODN과 비교하여 1 로그(500 nM～50 nM)만큼 탁솔의 IC50을 감소시켰다(도 7b). 이들 데이타는 TRPM-2 및 그 단백질, 클러스테린이 정상 신장 조직과 비교하여 RCC에서 고 레벨로 발현되며, 안티센스 TRPM-2 ODN은 진행형 RCC에서 종래 약물요법의 세포독성 효과를 증가시키는 데 유용할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 7
안티센스 TRPM-2 ODN은 TRPM-2를 발현하는 암세포의 방사선 민감성을 증가시킨다. 노던 블롯 분석을 이용하여, 방사선 치료로 인해 인간 전립선암 PC-3 세포에서 TRPM-2 유전자 발현이 용량 및 시간 의존적으로 증가한다는 것을 발견하였다(도 8). TRPM-2의 과다발현은 방사선이 유도하는 세포사에 대한 내성을 증가시켰다. TRPM-2를 과다발현하는 인간 전립선 LNCaP 세포(LNCaP/T1)는 방사선 요법에 대한 내성이 더욱 크다(도 9a 및 9b). 인간 전립선암 PC-3 세포를 100 및 500 mM 안티센스 TRPM-2 ODN(서열 번호 1)으로 처리하면, 부정합 ODN(서열 번호 2)으로 처리한 것과 비교하여 4 Gy 방사선 1회 치료후 세포 생존율이 유의적으로 감소하였다. (도 10). 도 11a 및 11b는 시험관내 10, 50 및 100 mM 안티센스 TRPM-2 올리고로 처리한 후 인간 전립선암 PC-3 세포의 용량 의존적인 방사선 민감화를 도시한다.
실시예 8
인간 안티센스 TRPM-2 ODN을 이용한 치료가 PC-3 인간 전립선암 세포주에서 약물 민감성을 증가시키는 지를 결정하기 위해서, PC-3 종양을 보유하는 마우스를 안티센스 인간 TRPM-2 ODN + 교질 파클리탁셀 또는 미톡산트론과, 부정합 대조군 ODN + 교질 파클리탁셀 또는 미톡산트론으로 처리하였다(도 12a 및 12b). ODN을 28일간 투여하고, 0.5 ㎎ 교질 탁솔 또는 0.3 ㎎ 미톡산트론을 2가지 시기, 즉 10～14일과 24～28일에 투여하였다. 부정합 대조군 ODN으로 처리된 동물과 비교하여 안티센스 ODN으로 처리된 동물에서 종양 크기의 유의적인 감소가 관찰되었다. 이러한 효과는 교질 파클리탁셀 또는 미톡산트론을 2차 투약한 후에 더욱 명백해졌다.
실시예 9
올리고뉴클레오티드 합성용 뉴클레오시드 포스포르아미디트
데옥시 및 2'-알콕시 아미디트.2'-데옥시 베타-시아노에틸디이소프로필 포스포르아미디트를 시판원(예, 미국 매사츄세츠주 니드함의 Chemgenes, 또는 미국 버지니아주 스터링의 Glen Research, Inc)으로부터 구입하였다. 시판되는 포스포르아미디트(미국 버지니아주 스터링의 Glen Research 또는 미국 매사츄세츠주 니드함의 ChemGenes)를 사용하여 공개된 방법 (Sanghvi, et al., Nucleic Acids Research 21:3197-3203 (1993))에 따라 5-메틸-2'-데옥시시티딘 (5-Me-C) 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하였다.
2'-0-(2-메톡시에틸) 변형된 아미디트.2'-O-메톡시에틸-치환된 뉴클레오시드 아미디트를 다음과 같이 제조하거나, 또는 Martin, P의 방법[Helvetica Chimica Acta 78:486-504 (1995)]에 따라 제조하였다.
2,2'-안히드로[1-(베타-D-아라비노푸라노실)-5-메틸우리딘].5-메틸우리딘(리보실티미딘, 일본 초시의 Yamasa에서 입수가능) (72.0 g, 0.279 M), 디페닐카르보네이트 (90.0 g, 0.420 M) 및 중탄산나트륨 (2.0 g, 0.024 M)을 DMF (300 ㎖)에 첨가하였다. 교반하면서 혼합물을 환류 하에 가열하여, 발생하는 이산화탄소 기체가 조절 방식으로 방출되도록 하였다. 1시간 후에, 약간 어둡게 된 용액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 시럽을 교반하면서 디에틸에테르(2.5 ℓ)에 부었다. 생성물은 검을 형성하였다. 에테르를 따라버리고 잔류물을 최소량의 메탄올(약 400 ㎖)에 용해시켰다. 용액을 새로운 에테르(2.5 ℓ)에 부어 딱딱한 검을 형성하였다. 에테르를 따라버리고, 검을 진공 오븐(1 mmHg, 60℃에서 24 시간)에서 건조하여 고체를 얻었으며, 이를 연갈색 분말로 분쇄하였다((57 g, 85% 미정제 수율). NMR 스펙트럼은 페놀의 나트륨염(약 5%)으로 오염된 구조와 일치하였다. 이 물질을 그대로 추가 반응에 사용하였다 (또는, 에틸 아세테이트 중 메탄올 구배(10～25%)를 이용하여 컬럼 크로마토그래피로 추가 정제하여 백색 고체를 얻을 수 있다, mp 222-4℃).
2'-0-메톡시에틸-5-메틸우리딘.2,2'-안히드로-5-메틸우리딘 (195 g, 0.81 M), 트리스(2-메톡시에틸)보레이트 (231 g, 0.98 M) 및 2-메톡시에탄올 (1.2 ℓ)을 2ℓ스테인레스강 압력 용기에 첨가하고, 160℃의 예열된 오일조에 두었다. 155～160℃에서 48 시간 동안 가열한 후에, 용기를 개방하고, 용액을 증발 건조시키고, MeOH(200 ㎖)로 분쇄하였다. 잔류물을 고온 아세톤(1 ℓ) 중에 현탁시켰다. 불용성 염을 여과하고, 아세톤(150 ㎖)으로 세척하고, 여과물을 증발시켰다. 잔류물(280 g)을 CH3CN(600 ㎖) 중에 용해시키고 증발시켰다. 실리카겔 컬럼(3 kg)을 0.5%Et3NH를 함유하는 CH2Cl2/아세톤/MeOH (20:5:3) 중에 충전하였다. 잔류물을 CH2Cl2 (250 ㎖)에 용해시키고, 실리카(150 g) 상에 흡착시킨 다음 컬럼 상에 적재하였다. 생성물을 충전 용매로 용출시켜 생성물 160 g (63%)을 얻었다. 불순물을 포함하는 분획을 재작업하여 추가의 물질을 얻었다.
2'-0-메톡시에틸-5'-0-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘.2'-O-메톡시에틸-5-메틸우리딘 (160 g, 0.506 M)을 피리딘 (250 ㎖)과 함께 동시증발시키고, 건조된 잔류물을 피리딘 (1.3 ℓ) 중에 용해시켰다. 디메톡시트리틸 클로라이드 (94.3 g, 0.278 M)의 제1 분액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 교반하였다. 디메톡시트리틸 클로라이드 (94.3 g, 0.278 M)의 제2 분액을 첨가하고 반응물을 1시간 더 교반하였다. 메탄올 (170 ㎖)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. HPLC 결과 약 70% 생성물이 존재하는 것으로 확인되었다. 용매를 증발시키고 CH3CN (200 ㎖)으로 분쇄하였다. 잔류물을 CHCl3 (1.5 ℓ) 중에 용해시키고, 2 x 500 ㎖의 포화된 NaHCO3 및 2 x 500 ㎖의 포화된 NaCl로 추출하였다. 유기상을 Na2SO4 상에서 건조하고, 여과하고, 증발시켰다. 잔류물 275 g을 얻었다. 잔류물을 3.5 kg 실리카겔 컬럼 상에서 정제하고, 충전하고, 0.5% Et3NH를 함유하는 EtOAc/헥산/아세톤 (5:5:1)으로 용출시켰다. 순수한 분획을 증발시켜 생성물 164 g을 얻었다. 불순물을 함유하는 분획으로부터 추가 생성물 약 20 g을 얻어 총 생성량은 183 g (57%)이었다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘.2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘 (106 g, 0.167 M), DMF/피리딘 (DMF 562㎖ 및 피리딘 188 ㎖로부터 제조된 3:1 혼합물 750 ㎖) 및 아세트산 무수물 (24.38 ㎖, 0.258 M)을 합하고, 실온에서 24시간 동안 교반하였다. MeOH를 첨가하여 TLC 샘플을 먼저 퀀칭하여 반응을 TLC에 의해 모니터링하였다. TLC에 의해 판단시 반응이 완료되면, MeOH (50 ㎖)를 첨가하고, 혼합물을 35℃에서 증발시켰다. 잔류물을 CHCl3 (800 ㎖)에 용해시키고, 포화된 중탄산나트륨 2 x 200 ㎖ 및 포화된 NaCl 2 x 200 ㎖로 추출하였다. 물층을 다시 CHCl3 200 ㎖로 추출하였다. 합한 유기물을 황산나트륨으로 건조하고 증발시켜 잔류물 122 g(약 90% 생성물)을 얻었다. 잔류물을 3.5 kg 실리카겔 컬럼 상에서 정제하고 EtOAc/헥산 (4:1)으로 용출시켰다. 순수한 생성물 분획을 증발시켜 96 g (84%)을 얻었다. 나중 분획으로부터 1.5 g을 더 회수하였다.
3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘.
CH3CN (700 ㎖) 중에 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸우리딘 (96 g, 0.144 M)을 용해시켜 제1 용액을 제조하고 정치시켰다. 트리에틸아민 (189 ㎖, 1.44 M)을 CH3CN (1 ℓ) 중 트리아졸 (90 g, 1.3 M) 용액에 첨가하고, -5℃로 냉각하고, 오버헤드 교반기를 사용하여 0.5 시간 동안 교반하였다. POCl3를 30분에 걸쳐 0～10℃로 유지되는 교반 용액에 적하하고, 생성되는 혼합물을 2시간 더 교반하였다. 제1 용액을 45분에 걸쳐 나중 용액에 적하하였다. 생성된 반응 혼합물을 저온실에서 밤새 저장하였다. 반응 혼합물로부터 염을 여과하고, 용액을 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc (1 ℓ) 중에 용해시키고, 불용성 고체를 여과시켜 제거하였다. 여과물을 NaHCO3 1 x 300 ㎖ 및 포화된 NaCl 2 x 300 ㎖로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조하고, 증발시켰다. 잔류물을 EtOAc로 분쇄하여 표제 화합물을 얻었다.
2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘.디옥산 (500 ㎖) 및 NH40H (30 ㎖) 중 3'-O-아세틸-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸-4-트리아졸우리딘 (103 g, 0.141 M) 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 디옥산 용액을 증발시키고 잔류물을 MeOH (2 x 200 ㎖)와 함께 공비시켰다. 잔류물을 MeOH (300 ㎖) 중에 용해시키고 2 리터 스테인레스강 압력 용기로 옮겼다. NH3 기체로 포화된 MeOH (400 ㎖)를 첨가하고, 용기를 2 시간 동안 100℃로 가열하였다 (TLC 결과 완전한 전환이 확인되었다). 용기의 내용물을 증발 건조시키고, 잔류물을 EtOAc (500 ㎖) 중에 용해시키고 포화된 NaCl (200 ㎖)로 1회 세척하였다. 유기물을 황산나트륨 상에서 건조하고 용매를 증발시켜 표제 화합물 85 g (95%)을 얻었다.
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘.2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘 (85 g, 0.134 M)을 DMF (800 ㎖) 중에 용해시키고 벤조산 무수물 (37.2 g, 0.165 M)을 교반하면서 첨가하였다. 3 시간 동안 교반한 후에, TLC 반응 결과 약 95%가 완료된 것으로 확인되었다. 용매를 증발시키고, 잔류물을 MeOH (200 ㎖)와 함께 공비시켰다. 잔류물을 CHCl3 (700 ㎖) 중에 용해시키고, 포화된 NaHCO3 (2 x 300 ㎖) 및 포화된 NaCl (2 x 300 ㎖)로 추출하고, MgSO4 상에서 건조하고 증발시켜 잔류물을 얻었다(96 g). 0.5% Et3NH를 함유하는EtOAc/헥산(1:1)을 용출 용매로서 사용하여 1.5 kg 실리카 컬럼 상에서 잔류물을 크로마토그래피하였다. 순수한 생성물 분획을 증발시켜 표제 화합물 90 g (90%)을 얻었다.
N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘-3'-아미디트.N4-벤조일-2'-O-메톡시에틸-5'-O-디메톡시트리틸-5-메틸시티딘 (74 g, 0.10 M)을 CH2Cl2 (1 ℓ) 중에 용해시켰다. 테트라졸 디이소프로필아민(7.1 g) 및 2-시아노에톡시테트라(이소프로필)포스파이트(40.5 ㎖, 0.123 M)를 질소 대기 하에 교반하면서 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 20 시간 동안 교반하였다 (TLC 결과 반응이 95% 완료되었음을 확인하였다). 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 (1 x 300 ㎖) 및 포화된 NaCl (3 x 300 ㎖)로 추출하였다. 수성 세척물을 CH2Cl2 (300 ㎖)로 다시 추출하고, 추출물을 합하고, MgSO4 상에서 건조하고, 농축하였다. 얻어진 잔류물은, EtOAc/헥산 (3:1)을 용출 용매로서 사용한 1.5 kg 실리카 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다. 순수한 분획을 합하여 표제 화합물 90.6 g (87%)을 얻었다.
실시예 10
올리고뉴클레오티드 합성.포스포로티오에이트 (P=S) 올리고뉴클레오티드는, (산화를 위한) 요오드 대신에 아인산염 결합의 단계별 황화 반응(thiation)을 위해서 아세토니트릴 중 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥시드 0.2 M 용액을 사용한 것 외에는 표준 포스포르아미디트 화학을 이용하여 자동화된 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템즈 모델 380B)에서 합성하였다. 황화 대기 단계를 68초로 늘린 다음 캡핑 단계를 실시하였다. CPG 컬럼으로부터 분해하고 55℃(18 시간)에서 진한 수산화암모늄으로 탈블록킹한 후에, 0.5M NaCl 용액으로부터 에탄올 2.5 부피로 2회 침전시켜 올리고뉴클레오티드를 정제하였다.
실시예 11
[2'-O-(2-메톡시에틸)]--[2'-데옥시]--[2'-O-(메톡시에틸)] 키메라 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합성.2'-O-메톡시에틸 포스포로티오에이트 및 2'-데옥시 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 분절을 갖는 키메라 올리고뉴클레오티드는, 전술한 바와 같이 어플라이드 바이오시스템즈 자동화된 DNA 합성기 모델 380B를 사용하여 합성한다. 자동화된 합성기와, DNA 부분에 대한 2'-데옥시-5'디메톡시트리틸-3'-O-포스포르아미디트와 5' 및 3' 날개에 대한 5'-디메톡시트리틸-2'-O-(메톡시에틸)-3'-O-포스포르아미디트를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 테트라졸 및 염기 전달 후 대기 단계의 시간을 600 초로 늘려 표준 합성 사이클을 변형시키고, RNA에 대해 4회, 2'-O-메톡시에틸에 대해 2회 반복한다. 지지체로부터 완전히 보호된 올리고뉴클레오티드를 분해하고, 인산기를 밤새 실온에서 3:1 암모니아/에탄올 중에서 탈보호한 다음 동결건조한다. 실온에서 24 시간 동안 메탄올계 암모니아 중에서 처리하면 모든 염기가 탈보호되고, 샘플을 다시 동결건조한다. THF 중 1 M TBAF에 펠렛을 24 시간 동안 실온에서 재현탁하여 2' 위치를 탈보호시킨다. 그 다음 1M TEAA로 반응을 퀀칭하고, 회전증발기로 부피를 1/2로 줄인 다음, G25 사이즈 배제 컬럼 상에서 탈염시킨다. 회수된 올리고뉴클레오티드의 수율 및 순도는, 모세관 전기영동 및 질량 분광분석에 의해 분광분석계측으로 분석한다.
[2'-O-(2-메톡시에틸)포스포디에스테르]--[2'-데옥시 포스포로티오에이트]--[2'-O-(2-2-메톡시에틸)포스포디에스테르] 키메라 올리고뉴클레오티드.[2'-O-(2-메톡시에틸 포스포디에스테르]--[2'-데옥시 포스포로티오에이트]--[2'-O-(메톡시에틸)포스포디에스테르]키메라 올리고뉴클레오티드는, 요오드로 산화시켜 키메라 구조의 날개부 내에 뉴클레오티드간 포스포디에스테르 결합을 형성하는 대신에 황화(예컨대, 3,H-1,2 벤조디티올-3-온 1,1 디옥시드(Beaucage Reagent))시켜 중앙 갭에 뉴클레오티드간 포스포로티오에이트 결합을 형성하여 전술한 절차에 따라 제조한다.
실시예 12
올리고뉴클레오티드 분리.조절형 다공성 유리 컬럼(어플라이드 바이오시스템즈)으로부터 분해하고 18시간 동안 55℃에서 진한 수산화암모늄 중에서 탈블록킹한 후에, 0.5M NaCl과 2.5 부피 에탄올로 2회 침전시켜 올리고뉴클레오티드를 정제한다. 변성 겔 상에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동하여 합성된 올리고뉴클레오티드를 분석한 결과, 적어도 85%가 전길이 물질임을 확인하였다. 합성시 얻은 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 결합의 상대량은, 31P 핵자기공명 분광분석으로 주기적으로 조사하였으며, 일부 연구에서는 Chiang 등의 문헌[J. Biol. Chem. 266:18162-18171 (1991)]에 개시된 바와 같이 HPLC로 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. HPLC-정제된 물질을 이용하여 얻은 결과는 비-HPLC 정제된 물질로 얻은 결과와 유사하였다.
실시예 13
노던 분석은 인간 PC-3 세포 및 종양에서 TRPM-2 mRNA 레벨 변화를 정량하였다. MTT 분석은 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 + 파클리탁셀의 조합물의 PC-3 세포 성장에 대한 효과를 측정하였다. PC-3 종양을 갖는 무흉선 마우스를, 파클리탁셀과 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드로 28일간 처리하였다. 주 단위로 체중과 혈청 파라미터를 측정하여 독성을 평가하였다. PC-3 종양에서 포스포로티오에이트 및 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조직 반감기는, 모세관 겔 전기영동(CGE)을 이용하여 평가하였다.
종양 세포주.호르몬 무반응성 인간 전립선암으로부터 유도된 PC-3은 미국 모식균 배양 수집소(미국 매릴랜드주 록빌)로부터 입수하였다. 5% 열불활성화된 태아 송아지 혈청이 보충된 DMEM(미국 매릴랜드주 게더스버그의 Life Technologies, Inc.) 중에 세포를 유지하고, 일반적으로 90% 융합성일 때 계대배양하였다.
안티센스 올리고뉴클레오티드.본 연구에 사용된 포스포로티오에이트 및 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이전에 개시된 바와 같이 합성하였다(Monia et al., J Biol Chem 268:14514-14522 (1993); Dean et al., J Biol Chem 269:16416-16424 (1994)). 사용된 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 인간 TRPM-2 번역 개시 부위 (5'-CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT-3') (서열 번호 4)에 해당하였다. 2염기 TRPM-2 부정합 올리고뉴클레오티드 (5'-CAGCAGCAGAGTATTTATCAT-3') (서열 번호 15)를 대조군으로서 사용하였다. 통상적인 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 용량 의존적 및 서열 특이적 방식으로 TRPM-2 mRNA 발현을 유의적으로 억제하는 것으로 입증된 바 있다(Miyake et al., Clin. Cancer Res., 6:1655-1666 (2000)). 포스포로티오에이트 및 2'-MOE 안티센스 유사체, 및 이들의 대조군의 서열은 동일하였다. 2'-MOE 유사체의 디자인은CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT이며, 이중 밑줄친 염기는 2'-MOE 잔기를 나타낸다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 세포의 처리.양이온 지질인 리포펙틴(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 세포의 안티센스 올리고뉴클레오티드 흡수를 증가시켰다. PC-3 세포를, 무혈청 OPTI-MEM(Life Technologies, Inc.) 중 리포펙틴 10 ㎍/㎖와 함께 20분간 사전배양한 다음, 각종 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 배양 개시 4시간 후에, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리포펙틴을 함유하는 배지를 전술한 바와 같이 표준 배양 배지로 교체하였다.
노던 블롯 분석.산-구아니듐 티오시아네이트-페놀-클로로포름법을 사용하여 배양된 PC-3 세포 및 PC-3 종양 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 전기영동, 하이브리드화 및 세척 조건은 Miyake 등[Oncogene 16:933-943 (1998)]이 이전에 보고한 대로 실시하였다. 인간 TRPM-2 및 GAPDH cDNA 프로브는, TRPM-2의 경우 프라이머 5'-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3' (센스) (서열 번호 16) 및 5'-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3' (안티센스) (서열 번호 17), GAPDH의 경우 5'-TGCTTTTAACTCTGGTAAAGT-3' (센스) (서열 번호 18) 및 5'-ATATTTGGCAGGTTTTTCTGA-3' (안티센스) (서열 번호 19)를 사용하여 인간 신장의 총 RNA로부터 역전사-PCR에 의해 형성하였다. TRPM-2에 대한 밴드 밀도를 밀도측정 분석하여 GAPDH의 밀도에 대해 표준화하였다.
모세관 겔 전기영동(CGE).CGE (PACE 5000 System, 미국 캘리포니아주 풀러톤의 Beckman)를 사용하여 PC-3 종양에서의 전장 안티센스 올리고뉴클레오티드의 분획을 결정하고 20% 변성 PAGE 및 레이저 스캐닝 밀도측정기(미국 캘리포니아주 서니베일의 Molecular Dynamics)로 확인하였다. CGE를 위해서, ~0.1 AU260 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드 100 ㎕ 용액을, 100 mM 트리스-보레이트(pH 8.0) 작동 완충액을 이용하여 45 cm 폴리아크릴아미드 충전된 모세관 컬럼에 -5 kV에서 전기역학적으로 주입하였다. 30분에 걸쳐 -10 kV에서 분리를 실시하고, 피크 검출은 260 nM에서 UV 흡수를 통해 측정하였다.
MTT 분석.통상적인 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 + 파클리탁셀 또는 도세탁셀 대비 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드 + 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 PC-3 세포에 대한 시험관내 성장 억제 효과는, 전술한 바와 같이 MTT 분석을 이용하여 비교하였다(Miyake et al., Oncogene 16:933-943 (1998)). 간단히 요약하면, 1 ×104 세포를 96웰 미량역가 평판의 각 웰에 접종하고 밤새 부착시켰다. 그 다음 세포를 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드 500 nM로 2일간 1일 1회 처리하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후에, 각종 농도의 파클리탁셀 또는 도세탁셀로 세포를 처리하였다. 48 시간 배양한 후에, PBS 중 5 ㎎/㎖ MTT(Sigma Chemical Co.) 20 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 포르마잔 결정을 디메틸 설폭시드(DSMO) 중에 용해시켰다. 마이크로배양판 판독기(미국 뉴저지주 링컨 파크의 Becton Dickinson Labware)를 이용하여 광학 밀도를 측정하였다. 생존율을 측정하기 위해 흡광도 값을 비히클 처리된 세포에 대해 없은 값으로 표준화하였다. 각 분석을 3중으로 실시하였다.
생체내 처리.약 1 ×106 인간 PC-3 세포를 Matrigel(미국 매사츄세츠주 베드포드의 Becton Dickinson Labware) 0.1 ㎖와 함께, 할로탄 마취(5% 유도- 및 1.5% 유지-농도) 하에서 6～8주령 수컷 무흉선 마우스의 측부에 피하 접종하였다. PC-3 종양이 10 mm 직경으로 성장하면, 일반적으로 주사 4～6주 후에, 동물 치료를 개시하였다.
제1 실험에 있어서, 통상적인 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 + 파클리탁셀, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드 + 파클리탁셀 또는 포스포로티오에이트 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드 + 파클리탁셀로 처리하기 위해 마우스를 3개 부분군 중 하나로 무작위로 나누었다. 각 실험군은 10마리의 마우스로 구성되었다. 무작위화 후에, TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 유형 또는 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드 유형 12.5 ㎎/kg을 28일간 1일 1회 각 마우스에게 복강내 주사하였다. 10～14일과 24～28일에, 중합체 교질 파클리탁셀 0.5 ㎎을 Leung 등의 문헌[Prostate 44:156-163 (2000)]에 개시된 바와 같은 방법에 따라 정맥내 주사로 1일 1회 투여하였다. 종양 부피를 주 1회 측정하고, 길이 ×폭 ×깊이 ×0.5236의 식에 따라 계산하였다. 데이타점은 평균 종양 부피 ±표준 편차로 기록하였다. 3개의 처리 부분군 각각에서, 무작위화 직후 회수하고자 하는 3마리의 마우스를 지정하여 마지막 올리고뉴클레오티드/파클리탁셀 처리 1주 후(35일)에, 생체내 안티센스 올리고뉴클레오티드 독성 비교를 위한 복수 혈청 파라미터를 결정하였다.
제2 실험 세트에서, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 1일 1회, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 1주 1회, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드 1주 1회 또는 포스포로티오에이트 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드 1주 1회 처리하기 위해 마우스를 4개 부분군 중 하나로 무작위로 나누었다. 각 실험군은 8마리의 마우스로 구성되었다. 무작위화 후에, TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드 12.5 ㎎/kg을 4주간 1일 1회 또는 주 1회 각 마우스에게 복강내 주사하였다. 4개 처리 부분군에 속하는 동물에게는 전술한 바와 같은 중합체 교질 파클리탁셀을 추가로 투여하였다. 종양 부피를 측정하고, 전술한 바와 같이 데이타점을 기록하였다.
제3 생체내 실험에서, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하기 위해 마우스를 2개 부분군 중 하나로 무작위로 나누었다. 각 실험군은 12마리의 마우스로 구성되었다. TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 12.5 ㎎/kg을 5일간 1일 1회 각 마우스에게 복강내 주사하였다. TRPM-2의 노던 블롯과 CGE 분석을 위해 마지막 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주사한 지 1, 3, 5 및 7일에 PC-3 종양을 수거하였다. 모든 동물 절차는 캐나다 동물 보호 협회(Canadian Council on Animal Care)의 가이드라인에 따라 적절한 제도적 확인 절차를 받고 실시하였다.
2'-MOE 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 PC-3 세포에서의 TRPM-2 mRAN의 억제 증가.노던 블롯 분석을 사용하여, PC-3 세포에서의 TRPM-2mRNA 발현에 대한 종래 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 처리의 효과를 비교하였다. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모두 용량 의존적 및 서열 특이적 방식으로 TRPM-2 mRNA의 레벨을 감소시켰다. 500 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도를 사용하면, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드는 PC-3 세포에서의 TRPM-2 mRNA 레벨을 80% 감소시키는 데 비해, 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 40% 감소시키므로, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드가 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 효능이 높았다.
종래의 포스포로티오에이트 및 2'-MOE 변형된 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레토이드는 시험관 내에서 PC-3 세포의 약물 민감성을 동등하게 증가시킨다.시험관 내에서 세포독성을 증가시키는 데 있어서 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능을 비교하기 위해서, PC-3 세포를 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 유형으로 2일간 1일 1회 처리한 다음, 각종 농도의 파클리탁셀 또는 도세탁셀을 함유하는 배지와 함께 배양하였다. 배양 48 시간 후에, MTT 분석으로 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 양 유형의 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유사하게 파클리탁셀 및 도세탁셀의 약물 민감성을 각각 70% 이상 및 50% 이상 증가시켰다.
2'-MOE 변형체에 의한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조직 반감기 증가.CGE를 사용하여 PC-3 종양에서 시간 의존적 안티센스 올리고뉴클레오티드 대사를분석하였다. 생체내 안티센스 올리고뉴클레오티드의 조직 반감기는, 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여 2'-MOE 변형체를 사용한 경우 5배 이상 증가하였다(>5일 대 <1일). 1주일이 되었을 때 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드의 90%가 전길이 물질로서 검출가능한 반면, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 투약 중단 후 1일째에 10%만이 전길이 물질로서 발견되었다. 최종 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 5일 및 7일째에, 종양 조직 중에 검출된 전길이 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 없었다. 또한, 이 기간 동안 생체내 TRPM-2 mRAN 발현은 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우, 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사용한 경우와 비교하여 더욱 효과적으로 억제되었다.
2'-MOE 변형된 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생체내 파클리탁셀의 효능을 증가시킨다.생체내 파클리탁셀의 세포독성을 증가시키는 데 있어서 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드 대비 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능을 비교하기 위해서, PC-3 종양을 갖는 무흉선 마우스를 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 유형 또는 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드 유형으로 28일간 처리하였다. 10～14일과 24～28일에, 중합체 교질 파클리탁셀 0.5 ㎎을 1일 1회 정맥내 주사로 투여하였다. 양 유형의 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드는 처리 개시 7주 후에 PC-3 종양에서의 파클리탁셀 약물 민감성을 증가시켰다. 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하면, 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리한 것과 비교하여 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드(40%)보다 평균 종양 부피(80% 이상)를 감소시키는 데 유의적인 효과를 나타내었다.
2'-MOE 변형된 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드의 주 1회 투여는 생체내에서 종래의 포스포로티오에이트 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드의 1일 1회 투여와 등가이다.2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드의 안정성 증가와 조직 반감기 증가로 인하여 효능 상실 없이 투약 간격을 연장할 수 있는지를 평가하기 위해서, PC-3 종양을 갖는 무흉선 마우스에게 TRPM-2 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드를 주 1회 투여하고, 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 1일 1회 투여하였다. 10～14일 및 24～28일에, 중합체 교질 파클리탁셀 0.5 ㎎을 1일 1회 정맥내 주사하였다. 파클리탁셀과 함께, 2'-MOE 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주 1회 투여하는 것은 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드를 1일 1회 투여하는 것과 같으며, 처리 개시 6주 후에 부정합 대조군 올리고뉴클레오티드를 주 1회 투여한 것괴 비교하여 31%, 종래의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드를 주 1회 투여한 것과 비교하여 21%만큼 평균 종양 부피를 감소시켰다.
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Claims (11)

  1. 서열 CAGCAGCAGAGTCTTCATCAT(서열 번호 4)의 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 5-17은 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4 및 19의 시토신은 5-메틸시토신인 화합물.
  2. 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연시키는 방법으로서, 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 생체내에서 안드로겐-민감성 전립선 종양 세포를 처리하는 단계를 포함하며, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지고, 상기 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 5-17은 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4 및 19의 시토신은 5-메틸시토신인 방법.
  3. 전립선암을 앓고 있는 개체의 전립선암을 치료하는 방법으로서, 안드로겐 중단을 개시하여 개체의 전립선 종양 세포의 아폽토시스 세포사를 유도하는 단계, 및 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물을 개체에게 투여하여, 개체에서 전립선 종양 세포의 안드로겐-독립 상태로의 진행을 지연시키는 단계를 포함하고, 상기 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지고, 상기 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 5-17은 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4 및 19의 시토신은 5-메틸시토신인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 약물요법제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 약물요법제가 탁산 또는 미톡산트론인 방법.
  6. 제3항에 있어서, TRPM-2 이외의 항아폽토시스 단백질의 발현을 억제하는 제2의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제2 안티센스 올리고뉴클레오티드가 안티센스 Bcl-2 올리고뉴클레오티드인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 약물요법제를 개체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 약물요법제가 탁산 또는 미톡산트론인 방법.
  10. 동일한 유형의 정상 조직과 다른 양으로 TRPM-2를 발현하는 암을 앓고 있는 개체에서 암세포의 약물 민감성 또는 방사선 민감성을 증가시키는 방법으로서, 암세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 TRPM-2의 발현을 억제하는 데 효과적인 조성물은 안티센스올리고뉴클레오티드이며, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지고, 상기 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 5-17은 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4 및 19의 시토신은 5-메틸시토신인 방법.
  11. 살아있는 전립선 종양 세포가 안드로겐-민감성인 상태로부터 살아있는 종양 세포가 안드로겐-독립성인 상태로 진행하는 전립선 종양 세포군의 진행을 지연시키는 방법으로서, 종양 세포에 의한 TRPM-2의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 안드로겐-민감성 전립선 종양 세포군을 처리하는 단계를 포함하고, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 4에 제시된 서열을 가지고, 상기 올리고뉴클레오티드는 그 전체에 걸쳐 포스포로티오에이트 골격을 가지며, 뉴클레오티드 1-4 및 18-21의 당 부분은 2'-O-메톡시에틸 변형체를 보유하고, 나머지 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 5-17은 2'-데옥시뉴클레오티드이며, 뉴클레오티드 1, 4및 19의 시토신은 5-메틸시토신인 방법.
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