KR20040086644A - DNA Chip for Diagnosis of Leukemia - Google Patents

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KR20040086644A
KR20040086644A KR20030020982A KR20030020982A KR20040086644A KR 20040086644 A KR20040086644 A KR 20040086644A KR 20030020982 A KR20030020982 A KR 20030020982A KR 20030020982 A KR20030020982 A KR 20030020982A KR 20040086644 A KR20040086644 A KR 20040086644A
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leukemia
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Inventor
김동욱
한병돈
최희백
천성민
김희진
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(주)디스진
김동욱
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Abstract

PURPOSE: A DNA chip for diagnosis of leukemia is provided, which rapidly and accurately discriminates genotype of leukemia, so that it can be useful for diagnosis of leukemia at an early stage. CONSTITUTION: The DNA chip for diagnosis of leukemia comprises (i) gene probes for detecting leukemia specific gene disorder, comprising 18 to 25 nucleotides; (ii) a linker comprising 15 thymines(dTTP), 6 CH2 chains and amine, and linked to the 5'-terminal of the gene probe; and (iii) a solid with aldehyde on its surface and linked to the linker by Schiff's base reaction between the surface aldehyde with the amine of the linker, wherein the gene probes comprise selection probes of SEQ ID NO:1 to SEQ ID NO:23 and comparison probes of SEQ ID NO:24 to SEQ ID NO:31.

Description

백혈병 진단용 DNA 칩{DNA Chip for Diagnosis of Leukemia} Leukemia diagnostic DNA chip {DNA Chip for Diagnosis of Leukemia}

본 발명은 백혈병 진단용 DNA 칩에 관한 것이다. The present invention relates to leukemia diagnostic DNA chip. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 백혈병 특이적인 유전자 이상을 분석하기 위한 백혈병 진단용 DNA 칩, 전기 DNA 칩의 제조방법 및 전기 DNA 칩을 포함하는 백혈병 진단용 유전형 분석키트에 관한 것이다. More specifically, the present invention relates to leukemia diagnostic genotyping kit comprising a leukemia diagnostic DNA chip, a DNA chip manufacturing method of the electrical and electric DNA chip for analyzing a leukemia specific genes or more.

백혈병은 혈액 세포와 림프구를 생산하는 조혈모세포를 포함한 인체의 조혈계에서 발생하는 악성 혈액질환으로서, 백혈구가 성숙하는 조혈 과정에 장애가 생겨 발생한 미성숙 악성백혈구가 골수에서 증식함으로써, 정상 적혈구, 백혈구, 혈소판의 생성이 방해되어 전체 골수 조혈모세포의 30% 이상을 악성 백혈구가 차지하는 혈액 암의 일종이다. Leukemia is a malignant blood disorder that occurs in the blood cells of the human hematopoietic including the hematopoietic stem cells to produce lymphocytes system by leukocyte proliferation mature failure to stem the process immature malignant white blood cells caused blossomed to the bone marrow, normal red blood cells, white blood cells and platelets the creation of the interference is a kind of whole bone marrow hematopoietic blood cancer accounts for more than 30% of malignant white blood cells. 백혈병은 급성과 만성, 골수성과 림프구성에 따라 크게 4 가지 유형으로 분류하고 있으며, 이를 조직학적 측면에서 세분화하여 20 종류의 백혈병으로 분류한다. Leukemia is largely classified into four types depending on the acute and chronic myelogenous and lymphocytic, by subdividing it in terms of histological classified as 20 types of leukemia. 모든 종류의 백혈병은 모든 연령에서 나타날 수 있으나, 소아 (2-10세)에서 주로 나타나는 것은 급성 림프구성 백혈병이고, 중년기 또는 노년기에 흔히 나타나는 것은 급성 골수성 백혈병 또는 만성 골수성 백혈병으로 알려져있다. But can occur in all types of leukemia every age, but appears mostly in children (2-10 years old), acute lymphocytic leukemia, it often appears in middle age or old age is known as acute myeloid leukemia or chronic myeloid leukemia. 우리나라에서 백혈병의 발병율은 1992년 현재 인구 10만 명당 0.96명이고, 매년 3,000-4,000 명이 신규 백혈병으로 진단되며, 2000년에는 전체사망원인의 0.54 %에 해당하는 1,306명이 백혈병으로 사망하였다(참조: 보건복지부 암 환자 조사보고서, 1996; 통계청 사망원인별 통계연보, 2000). The incidence of leukemia in the country is the current population of 0.96 people per 100,000 in 1992, and from 3000 to 4000 people diagnosed each year with new leukemia in 2000 was 1,306 people, which corresponds to 0.54% of the total death cause of death in leukemia (see: Health cancer Welfare survey report, 1996 cause of death statistics by statistical Yearbook, 2000).

현재까지 알려진 백혈병 진단방법으로는 말초 혈액세포 및 골수세포를 기존의 광학 현미경과 염색에 의해 진단하는 방법이 알려져 있으나, 동일한 소견을 보이는 종양이라 하더라도 환자에 따라 매우 다른 임상결과를 나타내고 각종 치료에도 각기 다르게 반응을 보일 수 있기 때문에, 병리, 형태학적 특이성에 따른 진단 및 분류법은, 백혈병을 치료하기 위한 적합한 치료방법을 결정하는데 한계를 나타내고 있는 실정이다. Known as leukemia diagnosis so far, but how to diagnosed by peripheral blood cells and bone marrow cells in conventional optical microscopy and staining known, even in a tumor it looks the same findings represent very different clinical outcomes depending on the patient, each in various therapeutic because otherwise the reaction can be seen, diagnosis and classification according to the pathology, morphological specificity, a situation that has a limitation in determining the appropriate therapy for the treatment of leukemia. 최근에는 분자유전학이 발달되고, 악성 혈액질환의 80-90% 이상에서 백혈병 특이염색체 및 유전자의 이상이 규명되면서, 염색체 이상에 의한 분자생물학적 진단방법인 고 분염법, 형광 인시튜 하이브리드법( in situ hybridization), 중합효소 연쇄반응법 등이 사용되어 진단 성공율을 향상시키고 있다. Recently, molecular genetics has been developed, as a leukemia-specific chromosomal abnormalities and gene identified in more than 80-90% of malignant blood diseases, molecular diagnostics by a chromosomal abnormality is high yeombeop minutes, fluorescence in-situ hybrid method (in situ include hybridization), PCR has been used to improve the success rate of diagnosis. 그럼에도 불구하고, 백혈병의 종류를 판단하기 위한 진단 정확도가 30 내지 40% 정도에 불과하며, 진단에 소요되는 시간이 많다는 단점이 개선되지 않고 있다. Nevertheless, the diagnostic accuracy for determining the type of leukemia and only about 30 to 40%, does not improve the disadvantage is the time it takes to diagnose lot. 이에, 다양한 백혈병 특이 유전자를 보다 정확하고 신속하게 진단할 수 있고, 미세 잔류 질환 여부를 측정하여 질병치료 후 예후를 확인할 수 있는 새로운 분자 유전학적 진단법의 개발이 절실히 요구되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.. Thus, a variety of leukemia can be more accurately and quickly diagnose specific genes, a fine measuring residual disease, whether Although being urgently required the development of new molecular genetic diagnostics that can determine the outcome after medical treatment, yet little results until a situation that is not reported.

따라서, 신속하고 정확하게 백혈병 환자의 유전자 이상을 분석할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다. Therefore, fast and it needs to be developed a method that can accurately analyze genetic abnormalities in leukemia patients were constantly emerging.

이에, 본 발명자들은 신속하고 정확하게 백혈병 환자의 유전자 이상을 분석할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 백혈병 특이적인 이상 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 포함하는 DNA 칩, 시료로부터 채취한 RNA를 cDNA로 역전사시키고 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머 및 증폭 시 증폭산물을 형광표지시키기 위한 디데옥시 뉴클레오타이드를 포함하는 백혈병 진단용 유전형 분석키트를 사용하여 백혈병 환자의 유전자 이상을 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. Thus, the present inventors have quick and effort study cases to develop a method capable of accurately analyzing the genes or more of leukemia patients results, leukemia collected from specific or more genes with specific DNA chip, the sample containing a probe capable of binding to confirmed that it is possible to analyze at least a leukemia gene using a leukemia diagnostic genotype for reverse transcription of RNA into cDNA and include primers and amplified during the amplification products for amplifying by PCR a dideoxy nucleotide for fluorescent labeling assay kit and, thereby completing the present invention.

결국, 본 발명의 주된 목적은 백혈병의 종류를 분류, 진단하기 위한 백혈병 진단용 DNA 칩을 제공하는 것이다. After all, the main object of the invention to provide a DNA chip for diagnosis of leukemia for classifying, diagnosing the type of leukemia.

본 발명의 다른 목적은 전기 DNA 칩의 제조방법을 제공하는 것이다. It is another object of the invention to provide a method for manufacturing an electro-DNA chip.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 DNA 칩을 포함하는 백혈병 진단용 유전형 분석키트를 제공하는 것이다. A further object of the present invention is to provide a leukemia diagnostic genotyping kit comprising electrical DNA chip.

도 1은 DNA 칩에서 탐침의 위치를 나타내는 모식도이다. 1 is a schematic view showing the position of the probe in the DNA chip.

도 2는 BCR유전자의 엑손(exon) 14번과 ABL 유전자의 엑손 2번이 융합되어 발병한 만성골수성백혈병(CML)을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. Figure 2 is a photograph showing a result of analysis of chronic myelogenous leukemia (CML) is a disease fusion exon 2 exon (exon) 14 times and ABL genes BCR gene.

도 3은 BCR유전자의 엑손 13번과 ABL 유전자의 엑손 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 3 is a photograph showing a result of analysis of the onset CML is fused to the exon 2 of the exon 13 and ABL gene of the BCR gene.

도 4는 BCR유전자의 엑손 1번과 ABL 유전자의 엑손 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. Figure 4 is a photograph showing a result of analysis of the onset CML is fused to the exon 2 of ABL gene and exon 1 times the BCR gene.

도 5는 BCR유전자의 엑손 19번과 ABL 유전자의 엑손 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. 5 is a photograph showing a result of analysis of the onset CML is fused to the exon 2 of the exon 19 and ABL gene of the BCR gene.

도 6은 AML유전자와 ETO1 유전자가 융합되어 발병한 급성골수성백혈병(AML)을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. Figure 6 is a photograph showing a result of analysis of the acute myeloid leukemia (AML) is a disease fusion gene is AML and ETO1 gene.

도 7은 PMLa1유전자와 Rara 유전자가 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. Figure 7 is a photograph showing a result of analysis of the AML a fused gene and a PMLa1 Rara genetic disease.

도 8은 PMLb1유전자와 Rara 유전자가 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. Figure 8 is a photograph showing a result of analysis of the AML a fused gene and a PMLb1 Rara genetic disease.

도 9은 CBFB유전자와 MYH유전자의 엑손 12번이 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를 나타내는 사진이다. FIG. 9 is a photograph showing the results of an analysis of AML develop the fusion gene and exon 12 times the CBFB MYH gene.

본 발명의 백혈병 진단용 DNA 칩은 18 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 백혈병 특이적인 유전자 이상을 검출하기위한 유전자 탐침; Leukemia diagnostic DNA chip of the present invention is composed of 18 to 25 nucleotides, genetic probe for detecting a leukemia specific genes or more; 15개의티민(dTTP), 6개의 CH 2 사슬 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 티민부위에 연결된 링커; 15 thymine (dTTP), 6 of CH 2 chain and an amine (amine) comprises a one by one, and the 5 'end of the gene electric probe connected to the thymine linker region; 및, 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체를 포함한다: 이때, 유전자 탐침이 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 1 내지 23의 선별용 탐침 및 서열번호 24 내지 31의 대조용 탐침을 사용함이 바람직하다. And, the aldehyde is bound to the surface, and the electrical linker amine group contains associated solids through the aldehyde group with the Schiff base (Schiff's base) reaction of the surface: In this case, but are not gene probe is not particularly limited, of SEQ ID NO: 1 to 23 this uses the verification use of the probe selection and probe SEQ ID NO: 24 to 31 for being preferred.

전기 백혈병 진단용 DNA 칩의 제조방법은 18 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 백혈병 특이적인 유전자 이상을 검출하기위한 유전자 탐침을 합성하는 공정; Method for manufacturing an electro-leukemia diagnostic DNA chip is composed of 18 to 25 nucleotides, the process for synthesizing a gene probe for the detection of leukemia-specific gene or higher; 15개의 티민(dTTP), 6개의 CH 2 사슬 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하는 링커를 합성하는 공정; A group of 15 thymine (dTTP), 6 of CH 2 chain and an amine (amine) a step of synthesizing a linker, including in sequence; 전기 합성된 유전자 탐침의 5' 말단을 전기 합성된 링커의 티민부위에 결합시키는 공정; The step of combining the 5 'end of the synthetic gene electric probe to the site of the electric thymine synthesized linker; 유전자 탐침이 결합된 링커를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 결합시키는 공정; A step of bonding through a Schiff base (Schiff's base) reacting the linker with a gene probe bound to the surface of the aldehyde has combined solids; 및, 반응되지 않고 잔존하는 알데히드를 환원시키는 공정을 포함한다: 이때, 고체는 특별히 제한되는 것은 아니나 유리인 것이 바람직하고, 알데히드의 환원조건이 특별히 제한되는 것은 아니나 NaBH 4 등의 환원제를 사용함이 바람직하다. And, it is not the reaction include remaining process for the reduction of the aldehyde: At this time, the solid is not particularly limited but are to be glass, preferably, the reducing conditions of the aldehyde but are not particularly limited and preferred to use a reducing agent such as NaBH 4 Do.

한편, 본 발명의 백혈병 진단용 DNA 칩을 이용하여, 백혈병 환자를 선별하기 위한 유전형 분석키트를 제작할 수 있다. On the other hand, by using the leukemia diagnostic DNA chip of the present invention, it can be prepared a genotyping kit for screening a leukemia patient. 즉, 본 발명의 백혈병 진단용 유전형 분석키트는 백혈병 진단용 DNA 칩, 시료로부터 채취한 RNA를 cDNA로 만들고 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 중합연쇄반응 시 증폭산물을 표지화시킬 수 있는 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드 및 증폭산물을 단일가닥으로 분리하기 위한 람다 엑소누클레아제(lambda exonuclease)를 포함한다: 이때, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드가 특별히 제한되는 것은 아니나 텍사스 레드(Texas Red) ddATP, 시아닌 3(Cyanine 3) ddCTP, 시아닌 5(Cyanine 5) ddGTP 또는 플루오레세인-12(fluorescein-12) ddUTP를 사용함이 바람직하다. That is, leukemia diagnostic genotyping kit of the present invention leukemia diagnostic DNA chip, to create the RNA collected from the sample to the cDNA a fluorescent label capable of labeling the primers, the amplification products during PCR for amplifying by PCR a dideoxy nucleotide and the amplification product contains the lambda exo press nuclease (lambda exonuclease) for separating the single-stranded: in this case, the fluorescence-labeled dideoxy nucleotides not particularly limited Texas red (Texas Red) ddATP, cyanine 3 (cyanine 3 ) ddCTP, cyanine 5 (cyanine 5), it is preferred to use a ddGTP or fluorescein -12 (fluorescein-12) ddUTP.

상술한, 본 발명의 유전형 분석키트를 이용하여 백혈병 환자를 선별할 수 있다. Described above, it may be selected for leukemia by using a genotyping kit of the present invention. 즉, 본 발명의 유전형 분석키트의 프라이머를 이용하여 검사할 시료로부터 채취한 RNA로부터 cDNA를 합성하고, 합성된 cDNA를 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드를 이용하여 증폭시키는 단계; That is, the step of synthesizing cDNA from a RNA collected from the sample to be examined by using the primer of the genotyping of the present invention kit and amplified using the dideoxy-nucleotide with a fluorescent label the synthesized cDNA; 증폭된 cDNA를 단일가닥으로 분리하는 단계; Separating the amplified cDNA into a single strand; 단일가닥으로 분리된 cDNA를 DNA 칩에 적용하여 보합반응시키는 단계; Step of hybridization reaction by applying the separated single-stranded cDNA as a DNA chip; 및, 보합된 DNA 칩을 세척하고, 스캐너를 이용하여 DNA 칩에 보합된 탐침부위를 검사하는 단계를 통하여, 백혈병 환자를 선별할 수 있다: 이때, cDNA를 증폭시킬 때 사용되는 프라이머는 백혈병 특이적인 이상 유전자를 종류별로 모두 증폭시킬 수 있도록 여러 종의 프라이머를 조합하여 사용하는 것이 바람직하고, 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드가 특별히 제한되는 것은 아니나, 시아닌 5(Cyanine 5) ddCTP를 사용함이 바람직하며, 단일가닥으로 분리하는 방법이 특별히 제한되는 것은 아니나, 효소를 이용하는 방법을 사용함이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 본 발명의 유전형 분석키트에 포함된 람다 엑소누클레아제(lambda exonuclease)를 이용한다. And, washing the hybridization DNA chip, through the step of using the scanner checks the probe region hybridization on DNA chip, it is possible to screening for leukemia: In this case, the primers used to amplify the cDNA is a leukemia-specific to use a combination of primers of different kinds to be able to amplify all of the above genes by type but are not preferred, and fluorescently labeled dideoxy nucleotides is not particularly limited, and preferred to use a cyanine-5 (cyanine 5) ddCTP, single but is not a method of separating the strands particularly limited, it is preferred to use a method of using an enzyme, and more preferably, uses a lambda nuclease exo press the (lambda exonuclease) included in the genotyping kit of the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. The present invention will be described in further detail with reference to the following examples. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. These embodiments will be evident in the person of ordinary skill that for illustrating only the present invention in more detail, the scope of the present invention according to the aspects of the present invention is not limited by these Examples in the art .

실시예 1 : DNA 칩의 제조 Example 1: Preparation of DNA chip

실시예 1-1 : 링커와 연결된 탐침의 작제 Example 1-1: Construction of a probe connected to the linker

백혈병 특이 유전자를 진단하기 위하여, 전위된 유전자 부위를 포함하는 18 내지 22mer의 올리고뉴클레오티드와 대조군으로 이용하기 위하여 각각의 유전자 전위 부위에서 정상적인 염기서열이 있는 부위를 포함하는 탐침을 작제하고, 15개의 티민(dTTP), 6개의 CH 2 사슬 및 아민(amine)기가 순차적으로 연결된 링커를 작제한 다음, 전기 작제된 탐침의 5' 말단을 링커의 티민부위에 연결시켰다. In order to diagnose leukemia-specific genes, oligonucleotides of 18 to 22mer containing the potential gene regions also prepared each probe comprising a portion with a normal base sequence in the genetic potential site to use as a nucleotide with the control group, and 15 thymidine (dTTP), 6 of CH 2 chain and an amine (amine) group was connected to the linker attached in order to limit the operation, then the 5 'end of the electrical probe constructed on the site of the thymidine linker. 탐침의 염기서열은 다음과 같다: Base sequence of the probe is as follows:

선별용 탐침 Probe for screening

탐침 1: BA1 5'-GCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAG-3' (서열번호 1) Probe 1: BA1 5'-GCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAG-3 '(SEQ ID NO: 1)

탐침 2: BA2 5'-CCATCAATAAGGAAGAAGCCC-3' (서열번호 2) Probe 2: 5'-BA2 CCATCAATAAGGAAGAAGCCC-3 '(SEQ ID NO: 2)

탐침 3: BA3 5'-GGAGACGCAGAAGCCCTTC-3' (서열번호 3) Probe 3: BA3 5'-GGAGACGCAGAAGCCCTTC-3 '(SEQ ID NO: 3)

탐침 4: BA4 5'-CCTTCGACGTCAAAGCCCTTCA-3' (서열번호 4) Probe 4: BA4 5'-CCTTCGACGTCAAAGCCCTTCA-3 '(SEQ ID NO: 4)

탐침 5: AEA1 5'-GAGAACCTCGAAAATCATGGATG-3' (서열번호 5) Probe 5: AEA1 5'-GAGAACCTCGAAAATCATGGATG-3 '(SEQ ID NO: 5)

탐침 6: AMDS 5'-GAACCTCGAAATAATGAGTGTG-3' ( 서열번호 6) Probe 6: AMDS 5'-GAACCTCGAAATAATGAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 6)

탐침 7: AET1 5'-GAGAACCTCGAAATCGTACTGA-3' ( 서열번호 7) Probe 7: AET1 5'-GAGAACCTCGAAATCGTACTGA-3 '(SEQ ID NO: 7)

탐침 8: PRa1 5'-GGGGAGGCAGCCATTGAGAC-3' ( 서열번호 8) Probe 8: PRa1 5'-GGGGAGGCAGCCATTGAGAC-3 '(SEQ ID NO: 8)

탐침 9: PRb1 5'-CAGGGGAAAGCCATTGAGAC-3' ( 서열번호 9) Probe 9: PRb1 5'-CAGGGGAAAGCCATTGAGAC-3 '(SEQ ID NO: 9)

탐침 10: NuRa1 5'-GGGGCCCCTCCAGCCATT-3' (서열번호 10) Probe 10: NuRa1 5'-GGGGCCCCTCCAGCCATT-3 '(SEQ ID NO: 10)

탐침 11: PR2 5'-TTACTGGCTCATTCAGCCATTGA-3' (서열번호 11) Probe 11: PR2 5'-TTACTGGCTCATTCAGCCATTGA-3 '(SEQ ID NO: 11)

탐침 12: CM1 5'-AGGAAATGGAGGAGTTGCTTC-3' (서열번호 12) Probe 12: CM1 5'-AGGAAATGGAGGAGTTGCTTC-3 '(SEQ ID NO: 12)

탐침 13: CM(e7) 5'-AGGAAATGGAGTTCAAGAGGG-3' (서열번호 13) Probe 13: CM (e7) 5'-AGGAAATGGAGTTCAAGAGGG-3 '(SEQ ID NO: 13)

탐침 14: CM(e8) 5'-GGAAATGGAGAATGAAGTTGAG-3' (서열번호 14) Probe 14: CM (e8) 5'-GGAAATGGAGAATGAAGTTGAG-3 '(SEQ ID NO: 14)

탐침 15: CM(e12) 5'-AGGAAATGGAGTCCATGAGCT-3' (서열번호 15) Probe 15: CM (e12) 5'-AGGAAATGGAGTCCATGAGCT-3 '(SEQ ID NO: 15)

탐침 16: ME1 5'-CTGTAATCCCGAGAGAATGG-3' (서열번호 16) Probe 16: ME1 5'-CTGTAATCCCGAGAGAATGG-3 '(SEQ ID NO: 16)

탐침 17: ME2 5'-AGTGGACTTTAAGGATTCTGTTTT-3' (서열번호 17) Probe 17: ME2 5'-AGTGGACTTTAAGGATTCTGTTTT-3 '(SEQ ID NO: 17)

탐침 18: MA4 5'-CTAAGTGTTAATAGACTTCTGCA-3' (서열번호 18) Probe 18: MA4 5'-CTAAGTGTTAATAGACTTCTGCA-3 '(SEQ ID NO: 18)

탐침 19: A4M2 5'-GTTTGTAAATACTGGCAGGCG-3' (서열번호 19) Probe 19: A4M2 5'-GTTTGTAAATACTGGCAGGCG-3 '(SEQ ID NO: 19)

탐침 20: MA6 5'-CCAGAATCAGGATTTGGAGTTCCA-3' (서열번호 20) Probe 20: MA6 5'-CCAGAATCAGGATTTGGAGTTCCA-3 '(SEQ ID NO: 20)

탐침 21: MA9 5'-GGGCATGTAGAGGACCCTAAT-3' (서열번호 21) Probe 21: MA9 5'-GGGCATGTAGAGGACCCTAAT-3 '(SEQ ID NO: 21)

탐침 22: MA10 5'-AGAAACAAAAAAAACATTTTATTTGAA-3' (서열번호 22) Probe 22: MA10 5'-AGAAACAAAAAAAACATTTTATTTGAA-3 '(SEQ ID NO: 22)

탐침 23: MA17 5'-CAGAATCAGGCATCTACACCAG-3'(서열번호 23) Probe 23: MA17 5'-CAGAATCAGGCATCTACACCAG-3 '(SEQ ID NO: 23)

대조용 탐침 For verification probe

탐침 24: ABL 5'-TATCTGGAAGAAGCCCTTCAGC-3' (서열번호 24) Probe 24: 5'-ABL TATCTGGAAGAAGCCCTTCAGC-3 '(SEQ ID NO: 24)

탐침 25: BCR13 5'-AATAAGGAAGATGATGAGTCTCCG-3' (서열번호 25) Probe 25: BCR13 5'-AATAAGGAAGATGATGAGTCTCCG-3 '(SEQ ID NO: 25)

탐침 26: BCR14 5'-AGCAGAGTTCAAATCTGTACTGCAC-3' (서열번호 26) Probe 26: BCR14 5'-AGCAGAGTTCAAATCTGTACTGCAC-3 '(SEQ ID NO: 26)

탐침 27: AML1 5'-GAGAACCTCGAAGACATCGGCA-3' (서열번호 27) Probe 27: AML1 5'-GAGAACCTCGAAGACATCGGCA-3 '(SEQ ID NO: 27)

탐침 28: EAP 5'-GTAGAAGATGGAATCATGGATG-3' (서열번호 28) Probe 28: EAP 5'-GTAGAAGATGGAATCATGGATG-3 '(SEQ ID NO: 28)

탐침 29: RARA 5'-CCCCAGCCACCATTGAGAC-3' (서열번호 29) Probe 29: RARA 5'-CCCCAGCCACCATTGAGAC-3 '(SEQ ID NO: 29)

탐침 30: CBFB 5'-AGGAAATGGAGGTGAGAGTTTC-3' (서열번호 30) Probe 30: CBFB 5'-AGGAAATGGAGGTGAGAGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 30)

탐침 31: MLL6 5'-CCAGAATCAGGAAAAACCACC-3' (서열번호 31) Probe 31: MLL6 5'-CCAGAATCAGGAAAAACCACC-3 '(SEQ ID NO: 31)

실시예 1-2 : DNA 칩의 제조 Example 1-2: Preparation of DNA chip

전기 실시예 1-1에서 작제된 각각의 링커와 연결된 탐침을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μM로 용해시키고, 알데히드가 도포된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, TX, USA) 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. Buffer solution, the probe is associated with the respective linker constructed from electrical Example 1-1 (350mM sodium bicarbonate, pH 9.0) the slide (silylated slide, CSS-100, CEL, Houston, respectively dissolved to 50μM and the aldehyde is applied to, TX, USA) using a control layer (MicroGrid II, BioRobotics, USA) to the surface and then added dropwise to a size 150㎛, 400㎛ interval, were performed Schiff base reaction. 이어, 0.2%(w/v) SDS용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척하고, NaBH 4 용액(0.1g NaBH 4 , 30㎖ PBS, 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다(참조: 도 1). Then, using a 0.2% (w / v) SDS solution and the distilled water was immersed for 15 minutes in wash sequentially, and NaBH 4 solution (0.1g NaBH 4, 30㎖ PBS, ethanol 10㎖), the amine is coupled after reduction of the aldehyde moiety that is not, washed and dried in the distilled water for a DNA chip was prepared (Fig. 1). 도 1은 DNA 칩에서 탐침의 위치를 나타내는 모식도이다. 1 is a schematic view showing the position of the probe in the DNA chip. 도 1에서 표시된 각각의 표기는 해당 탐침을 의미하고, +로 표시된 부분은 DNA 칩의 방향 식별을 위한 마커이다. Fig each title shown in the first portion is a means that the probe, and marked with + is a marker for identifying the orientation of the DNA chip. 이때, 마커는 효모( S. cerevisiae )의 크로모좀 XVI에 위치한 YPL223c 유전자의 1082bp 내지 1932bp에 해당하는 부분을 주형으로하고, cy5-ddCTP를 이용한 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭시킨 증폭산물을 사용하였다. In this case, the markers were used as the amplification products in which the part of the 1082bp to 1932bp of YPL223c gene located on chromosome XVI of yeast (S. cerevisiae) as a template, amplified using the polymerase chain reaction using cy5-ddCTP . 도 1에서 보듯이, 본 발명의 DNA 칩은 DNA 칩상에 23개의 선별용 탐침 및 8개의 대조용 탐침을 순서적으로 배열하여, 각 백혈병의 원인이 되는 이상 유전자를 효과적으로 선별할 수 있도록 제조되었다. As shown in FIG. 1, the DNA chip of the present invention is arranged in the order of 23 selected probes and eight-verified probe for the DNA chip publications, was prepared to effectively screening the above genes that cause each of leukemia.

실시예 2 : DNA 칩을 이용한 백혈병 특이 유전자 선별 Example 2 Selection of leukemia-specific genes using the DNA chip

실시예 2-1 : RNA의 수득 및 cDNA 합성 Examples 2-1: obtained and cDNA synthesis of RNA

혈액에서 림프구를 피콜(Ficoll-Hypaque)을 이용한 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)방법으로 분리하고, 분리된 림프구에서 TRI용액(TRI Reagent, Molecular Research Center, INC.)을 이용하여 총 RNA를 수득하였다. Separated by Ficoll lymphocytes in the blood density gradient centrifugation using (Ficoll-Hypaque) (density gradient centrifugation) method, to obtain a total RNA using a TRI solution (TRI Reagent, Molecular Research Center, INC.) In the separated lymphocytes It was. 전기 수득한 총 RNA 8ug, 100units 역전사효소(M-MLV Reverse Transcriptase, Ambion, USA), 20units 수퍼라제(SUPERase·in TM , Ambion, USA), 100uM 랜덤프라이머(random 9mer primer), 2.5mM dNTP(Roche, USA), 10X 합성완충용액(first strand synthesis buffer) 및 DEPC-증류수를 사용하여 65℃에서 5분, 4℃에서 5분, 38℃에서 2시간, 99℃에서 5분 및 4℃서 10분간 반응시켜서, cDNA를 합성하였다. Electrical obtained total RNA 8ug, 100units reverse transcriptase (M-MLV Reverse Transcriptase, Ambion , USA), 20units super cyclase (SUPERase · in TM, Ambion, USA), 100uM random primers (random 9mer primer), 2.5mM dNTP (Roche , USA), 10X synthesis buffer (first strand synthesis buffer), and 5 min at 65 ℃ using DEPC- distilled water, in a 4 ℃ 5 minutes and 2 hours at 38 ℃, at 99 ℃ 5 minutes and 10 minutes standing 4 ℃ by the reaction, it was synthesized cDNA.

실시예 2-2 : cDNA의 증폭 및 가공 Example 2-2: amplification and processing of the cDNA

전기 합성한 cDNA 5㎕, 10X PCR 완충용액 5㎕, 2.5mM ddAGT(2.5mM ddATP, 2.5mM ddGTP, 2.5mM ddTTP) 2㎕, 0.1mM ddCTP 5㎕, 0.1mM 시아닌 5(Cyanine 5) ddCTP 5㎕, Taq 중합효소 2.5unit, 각각의 프라이머들을 혼합하고, 3차 증류수를 넣어 50㎕로 맞춘 후, cDNA를 중합연쇄반응으로 증폭시켰다. Electrical synthesized cDNA 5㎕, 10X PCR buffer 5㎕, 2.5mM ddAGT (2.5mM ddATP, 2.5mM ddGTP, 2.5mM ddTTP) 2㎕, 0.1mM ddCTP 5㎕, 0.1mM cyanine 5 (Cyanine 5) ddCTP 5㎕ , Taq polymerase 2.5unit, mixing of each primer, and to put the distilled water was then adjusted to 50㎕, amplifying the cDNA by polymerase chain reaction. 이때, 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같고, 이중 센스프라이머는 5' 방향에 인산기(phosphate)를 포함한다. At this time, the nucleotide sequences of primers used are as follows, and dual sense primer comprises a phosphate group (phosphate) in the 5 'direction.

CML 관련 센스프라이머 CML-related sense primer

ABL-F: 5'-GTTGGAGATCTGCCTGAAGC-3' (서열번호 32) ABL-F: 5'-GTTGGAGATCTGCCTGAAGC-3 '(SEQ ID NO: 32)

BCR13/14-F: 5'-GATGCTGACCAACTCGTGTG-3' (서열번호 33) BCR13 / 14-F: 5'-GATGCTGACCAACTCGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 33)

AML1-F: 5'-TCGAAGTGGAAGAGGGAAAA-3' (서열번호 34) AML1-F: 5'-TCGAAGTGGAAGAGGGAAAA-3 '(SEQ ID NO: 34)

EAP-F: 5'-CCATGGCTCCTGTGAAAAAG-3' (서열번호 35) EAP-F: 5'-CCATGGCTCCTGTGAAAAAG-3 '(SEQ ID NO: 35)

BCR1-F: 5'-GCAGAACTCGCAACAGTCCT-3' (서열번호 36) BCR1-F: 5'-GCAGAACTCGCAACAGTCCT-3 '(SEQ ID NO: 36)

BCR19-F: 5'-TCGGAGTCAAGATTGCTGTG-3' (서열번호 37) BCR19-F: 5'-TCGGAGTCAAGATTGCTGTG-3 '(SEQ ID NO: 37)

CML 관련 안티센스프라이머 CML-related antisense primer

ABL-R: 5'-AACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3' (서열번호 38) ABL-R: 5'-AACGAAAAGGTTGGGGTCAT-3 '(SEQ ID NO: 38)

BCR13/14-R: 5'-CAGCTGTGTCCCTGTAGACG-3' (서열번호 39) BCR13 / 14-R: 5'-CAGCTGTGTCCCTGTAGACG-3 '(SEQ ID NO: 39)

AML1-R: 5'-GCTCGGAAAAGGACAAGCTC-3' (서열번호 40) AML1-R: 5'-GCTCGGAAAAGGACAAGCTC-3 '(SEQ ID NO: 40)

EAP-R: 5'-TTGCTCTTGCTCCTTTCGAT-3' (서열번호 41) EAP-R: 5'-TTGCTCTTGCTCCTTTCGAT-3 '(SEQ ID NO: 41)

AML에 관련된 센스프라이머 세트 2 : RARA-F, PMLa1-F, PMLb1-F, PLZF-F, NuMA-F Sense primer set related to AML 2: RARA-F, PMLa1 -F, PMLb1-F, PLZF-F, NuMA-F

RARA-F: 5'-CCTCCCTACGCCTTCTTCTT-3' (서열번호 42) RARA-F: 5'-CCTCCCTACGCCTTCTTCTT-3 '(SEQ ID NO: 42)

PMLa1-F: 5'-CAAGAAAGCCAGCCCAGAG-3' (서열번호 43) PMLa1-F: 5'-CAAGAAAGCCAGCCCAGAG-3 '(SEQ ID NO: 43)

PMLb1-F: 5'-GTGCGCCAGGTGGTAGCTC-3' (서열번호 44) PMLb1-F: 5'-GTGCGCCAGGTGGTAGCTC-3 '(SEQ ID NO: 44)

PLZF-F: 5'-CCACAAGGCTGACGCTGTATT-3' (서열번호 45) PLZF-F: 5'-CCACAAGGCTGACGCTGTATT-3 '(SEQ ID NO: 45)

NuMA-F: 5'-CGAGCCACCTCCTCTACTCA-3' (서열번호 46) NuMA-F: 5'--CGAGCCACCTCCTCTACTCA 3 '(SEQ ID NO: 46)

AML에 관련된 안티센스프라이머 세트 2 : RARA-R Antisense primer set related to AML 2: RARA-R

RARA-R : 5'-GCTTGTAGATGCGGGGTAGA-3' (서열번호 47) RARA-R: 5'-GCTTGTAGATGCGGGGTAGA-3 '(SEQ ID NO: 47)

AML에 관련된 센스프라이머 세트 3 : AML1-F, CBFB-F, MLL6-F Sense primer set related to AML 3: AML1-F, CBFB -F, MLL6-F

AML1-F: 5'-TCGAAGTGGAAGAGGGAAAA-3' (서열번호 34) AML1-F: 5'-TCGAAGTGGAAGAGGGAAAA-3 '(SEQ ID NO: 34)

CBFB-F: 5'-TTTGAAGAGGCTCGGAGAAG-3' (서열번호 48) CBFB-F: 5'-TTTGAAGAGGCTCGGAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 48)

MLL6-F: 5'-GAGCCCAAGAAAAAGCAGCC-3' (서열번호 49) MLL6-F: 5'-GAGCCCAAGAAAAAGCAGCC-3 '(SEQ ID NO: 49)

AML에 관련된 안티센스프라이머 세트 3 : CBFB-R, MLL6-R, ETO-R, MDS-R Antisense primer set related to AML 3: CBFB-R, MLL6 -R, ETO-R, MDS-R

CBFB-R: 5'-GTAAAGATGGGCAGCACACA-3' (서열번호 50) CBFB-R: 5'-GTAAAGATGGGCAGCACACA-3 '(SEQ ID NO: 50)

MLL6-R: 5'-ATCCTGTGGACTCCATCTGC-3' (서열번호 51) MLL6-R: 5'-ATCCTGTGGACTCCATCTGC-3 '(SEQ ID NO: 51)

ETO-R: 5'-TTGAGTAGTTGGGGGAGGTG-3' (서열번호 52) ETO-R: 5'-TTGAGTAGTTGGGGGAGGTG-3 '(SEQ ID NO: 52)

MDS-R: 5'-CGATCTTCCTTTTGGTCCATATTC-3' (서열번호 53) MDS-R: 5'-CGATCTTCCTTTTGGTCCATATTC-3 '(SEQ ID NO: 53)

AML에 관련된 센스프라이머 세트 4 : CBFB-F Sense primer set related to AML 4: CBFB-F

CBFB-F: 5'-TTTGAAGAGGCTCGGAGAAG-3' (서열번호 54) CBFB-F: 5'-TTTGAAGAGGCTCGGAGAAG-3 '(SEQ ID NO: 54)

AML에 관련된 안티센스프라이머 세트 4 : CBFB-R, MYH11-R, MYH11(e12)-R, MYH11(e7/e8)-R Antisense primer set related to AML 4: CBFB-R, MYH11 -R, MYH11 (e12) -R, MYH11 (e7 / e8) -R

CBFB-R: 5'-GTAAAGATGGGCAGCACACA-3' (서열번호 50) CBFB-R: 5'-GTAAAGATGGGCAGCACACA-3 '(SEQ ID NO: 50)

MYH11-R: 5'-GCAGCTTCGTAGACACGTTG-3' (서열번호 55) MYH11-R: 5'-GCAGCTTCGTAGACACGTTG-3 '(SEQ ID NO: 55)

MYH11(e12)-R: 5'-ATCCCTGTGACGCTCTCAAC-3' (서열번호 56) MYH11 (e12) -R: 5'-ATCCCTGTGACGCTCTCAAC-3 '(SEQ ID NO: 56)

MYH11(e7/e8)-R: 5'-CATCTCCTCCATCTGGGTCT-3' (서열번호 57) MYH11 (e7 / e8) -R: 5'-CATCTCCTCCATCTGGGTCT-3 '(SEQ ID NO: 57)

이어, 증폭된 cDNA에 람다 엑소누클레아제(lambda exonuclease, 10units/㎕)를 처리하여 단일가닥 DNA로 만들었다. Then, process the lambda Exo press nuclease (lambda exonuclease, 10units / ㎕) of the amplified cDNA and made into single-stranded DNA.

실시예 2-3 : DNA 칩을 이용한 보합반응 및 확인 Example 2-3: hybridization reaction and confirmation by using a DNA chip

전기 실시예 1-2에서 제조된 DNA 칩에 전기 실시예 2-2에서 단일가닥으로 분리된 cDNA를 적용하고, 45℃에서 1시간 동안 보합반응을 실시하였다. In the electrical embodiment 2-2, the DNA chip prepared in Example 1-2 electricity applied to the separated single-stranded cDNA as a, and the hybridization reaction was performed for 1 hour at 45 ℃. 이어, 보합반응이 종료된 DNA칩을 세척액 Ⅰ(0.1% SDS, 2X SSC)로 실온에서 5분간 2회 세척하고, 세척액 Ⅱ(0.2X SSC)로 실온에서 5분간 1회 세척한 다음, 세척액 Ⅲ(0.1X SSC)으로 실온에서 5분간 1회 세척하고, 실온에서 건조시킨 후, 시아닌 5(Cyanine 5) ddCTP 파장범위인 667nm의 파장으로 건조된 DNA 칩을 스캔하였다(참조: 도 2 내지 도 9). Next, one at room temperature, the hybridization reaction was completed the DNA chip with washing liquid Ⅰ (0.1% SDS, 2X SSC) then washed twice for 5 minutes, wash liquid at 1 Ⅱ washed five times at room temperature (0.2X SSC), and then washing liquid Ⅲ (0.1X SSC) as then washed once for 5 minutes at room temperature, dried at room temperature, cyanine 5 (cyanine 5) was scanning a DNA chip dried at a wavelength of 667nm ddCTP wavelength range (see FIG. 2 to 9 ). 도 2 내지 도 9는 본 발명의 백혈병 진단용 유전형 분석키트를 이용하여, 만성골수성백혈병(CML)에서 발견되는 BCR유전자의 이상과 급성골수성백혈병(AML)에서 발견되는 AML유전자, ETO1 유전자, PMLa1유전자, Rara 유전자, CBFB유전자 및 MYH유전자의 이상을 검출한 사진이다. 2 to 9 are AML gene, ETO1 gene, PMLa1 gene found in acute myeloid leukemia (AML) or more of the BCR gene and is found in using a leukemia diagnostic genotyping kit of the present invention, chronic myelogenous leukemia (CML), a photo detecting a gene Rara, CBFB MYH genes and gene abnormalities.

도 2는 BCR유전자의 exon 14번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, CML과 관련된 센스프라이머세트 1과 안티센스 프라이머 세트 1을 이용하여 증폭된 cDNA가 CML과 관련된 대조군용 탐침인 24, 25, 26, 27 및 28번과 선별용 탐침 1번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 2 is an amplified cDNA by using the sense primer set 1 and an antisense primer set 1 associated with pictures showing the results of analysis of the CML outbreaks are fusion exon 2 times of the ABL gene exon 14 times of the BCR gene, and CML in the control of the probe 24, 25, 26, 27 and 28 times the selected probe # 1 for related CML it was found to show a positive reaction.

도 3은 BCR유전자의 exon 13번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, CML과 관련된 센스프라이머세트 1과 안티센스 프라이머 세트 1을 이용하여 증폭된 cDNA가 CML과 관련된 대조군용 탐침인 24, 25, 26, 27 및 28번과 선별용 탐침 2번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 3 is the amplified cDNA by using the sense primer set 1 and an antisense primer set 1 associated with pictures showing the results of analysis of the CML outbreaks are fusion exon 2 times of exon 13 times and ABL genes BCR gene, and CML in the control of the probe 24, 25, 26, 27 and 28 times the selected probe 2 for associated with CML it was found to show a positive reaction.

도 4는 BCR유전자의 exon 1번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, CML과 관련된 센스프라이머세트 1과 안티센스 프라이머 세트 1을 이용하여 증폭된 cDNA가 CML과 관련된 대조군용 탐침인 24, 25, 26, 27 및 28번과 선별용 탐침 3번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 4 is an amplified cDNA by using the sense primer set 1 and an antisense primer set 1 associated with pictures showing the results of analysis of the CML outbreaks are fusion exon 2 times of exon one, and ABL gene 1 of the BCR gene, and CML in the control of the probe 24, 25, 26, 27 and 28 times the selected probe 3 for related CML it was found to show a positive reaction.

도 5는 BCR유전자의 exon 19번과 ABL 유전자의 exon 2번이 융합되어 발병한 CML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, CML과 관련된 센스프라이머세트 1과 안티센스 프라이머 세트 1을 이용하여 증폭된 cDNA가 CML과 관련된 대조군용 탐침인 24, 25, 26, 27 및 28번과 선별용 탐침 4번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 5 is an amplified cDNA by using the sense primer set 1 and an antisense primer set 1 associated with pictures showing the results of analysis of the CML outbreaks are fusion exon 2 times of the ABL gene exon 19 times of the BCR gene, and CML in the control of the probe 24, 25, 26, 27 and 28 times the selected probe 4 for related CML it was found to show a positive reaction.

도 6은 AML유전자와 ETO1 유전자가 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, AML과 관련된 센스프라이머세트 2과 안티센스 프라이머 세트 2, 센스프라이머세트 3과 안티센스 프라이머 세트 3을 이용하여 증폭된 cDNA가 AML과 관련된 대조군용 탐침인 29, 30 및 31번과 선별용 탐침 7번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 6 is a photograph showing a result of analysis of the AML outbreaks are fused AML gene and ETO1 gene, by using the sense primer set 2 and the antisense primer set 2, and the sense primer set 3 and an antisense primer set 3 associated with AML amplified it was found that the cDNA show a positive response in the control of the probe 29, 30 and 31 times the selected probe 7 for related to AML.

도 7은 PMLa1유전자와 Rara 유전자가 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를나타내는 사진으로, AML과 관련된 센스프라이머세트 2과 안티센스 프라이머 세트 2, 센스프라이머세트 3과 안티센스 프라이머 세트 3을 이용하여 증폭된 cDNA가 AML과 관련된 대조군용 탐침인 29, 30 및 31번과 선별용 탐침 8번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 7 is a photographs showing the result of analyzing the AML a fused is PMLa1 gene and Rara genetic disease, amplified using the sense primer set 2 and the antisense primer set 2, and the sense primer set 3 and an antisense primer set 3 associated with AML it was found that the cDNA show a positive response in the control of the probe 29, 30 and 31 times the selected probe 8 for related to AML.

도 8은 PMLb1유전자와 Rara 유전자가 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, AML과 관련된 센스프라이머세트 2과 안티센스 프라이머 세트 2, 센스프라이머세트 3과 안티센스 프라이머 세트 3을 이용하여 증폭된 cDNA가 AML과 관련된 대조군용 탐침인 29, 30 및 31번과 선별용 탐침 9번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 8 is a photographs showing the result of analyzing the AML a fused is PMLb1 gene and Rara genetic disease, amplified using the sense primer set 2 and the antisense primer set 2, and the sense primer set 3 and an antisense primer set 3 associated with AML it was found that the cDNA show a positive response in the control of the probe 29, 30 and 31 times the selected probe 9 for related to AML.

도 9는 CBFB유전자와 MYH유전자의 exon 12번이 융합되어 발병한 AML을 분석한 결과를 나타내는 사진으로, AML과 관련된 센스프라이머세트 4과 안티센스 프라이머 세트 4을 이용하여 증폭된 cDNA가 AML과 관련된 대조군용 탐침인 30번과 선별용 탐침 15번에서 양성반응을 보임을 알 수 있었다. Figure 9 is a photograph showing a result of analysis of the AML who are fused onset exon 12 times the CBFB gene MYH gene, control the amplified cDNA by using the sense primer set 4 and the antisense primer set 4 related to AML is associated with AML to show a positive reaction from the probe 15 for screening and for the probe of 30 times was found.

이상의 결과에서 보듯이, 본 발명의 백혈병 진단용 유전형 분석키트를 이용하면, 각각의 백혈병의 유전자이상을 구체적으로 선별할 수 있음을 알 수 있었다. As shown in the above results, by using the leukemia diagnostic genotyping kit of the present invention, it was found that the genetic abnormality of each of the leukemia can be specifically selected to.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 백혈병 특이적인 유전자 이상을 분석하기 위한 백혈병 진단용 DNA 칩, 전기 DNA 칩의 제조방법 및 전기 DNA칩을 포함하는 백혈병 진단용 유전형 분석키트를 제공한다. As will be described in detail and proved above, the present invention provides a leukemia diagnostic genotyping kit comprising a leukemia diagnostic DNA chip, a DNA chip manufacturing method of the electrical and electric DNA chip for analyzing a leukemia specific genes or more. 본 발명의 백혈병 진단용 DNA 칩은 18 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 백혈병 특이적인 유전자 이상을 검출하기위한 유전자 탐침; Leukemia diagnostic DNA chip of the present invention is composed of 18 to 25 nucleotides, genetic probe for detecting a leukemia specific genes or more; 15개의 티민(dTTP), 6개의 CH 2 사슬 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 티민부위에 연결된 링커; 15 thymine (dTTP), 6 of CH 2 chain and an amine (amine) comprises a one by one, and the 5 'end of the gene electric probe connected to the thymine linker region; 및, 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체를 포함한다. And, the aldehyde is bound to the surface, of the electro-linker amine group and a solid linked via Schiff base and the aldehyde (Schiff's base) of the reaction surface. 본 발명의 유전형 분석키트를 이용하면, 신속하고 정확하게 백혈병의 유전형을 구별할 수 있으므로, 백혈병의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다. Using genotyping kit of the present invention, it is possible to quickly and accurately distinguish the genotype of leukemia, it could be widely used in the early diagnosis of leukemia.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. To a person of ordinary skill in the art over the bar hayeotneun described a preferred embodiment of the present invention the content, that this description is the point is not to be just only a preferred embodiment thereof, thereby limit the scope of the present invention it will be apparent. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

<110> DISGENE KIM, Dong Wook <120> Genotyping Kit for Diagnosis of Leukemia <160> 57 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA1 <400> 1 gcagagttca aaagcccttc ag 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA2 <400> 2 ccatcaataa ggaagaagcc c 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA3 <400> 3 ggagacgcag aagcccttc 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA4 <400> 4 ccttcgacgt caaagccctt ca 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AEA1 <400> 5 gagaacctcg aaaatcatgg atg 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AMDS <400> 6 gaacctcgaa ataatgagtg tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AET1 <400> 7 gagaacctcg aaatcgtact ga 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PRa1 <400> 8 ggggaggcag ccattgagac 20 <210> 9 < <110> DISGENE KIM, Dong Wook <120> Genotyping Kit for Diagnosis of Leukemia <160> 57 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA1 <400> 1 gcagagttca aaagcccttc ag 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA2 <400> 2 ccatcaataa ggaagaagcc c 21 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA3 <400> 3 ggagacgcag aagcccttc 19 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe BA4 < 400> 4 ccttcgacgt caaagccctt ca 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AEA1 <400> 5 gagaacctcg aaaatcatgg atg 23 <210> 6 <211> 22 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AMDS <400> 6 gaacctcgaa ataatgagtg tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe AET1 <400 > 7 gagaacctcg aaatcgtact ga 22 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PRa1 <400> 8 ggggaggcag ccattgagac 20 <210> 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<400> 52 ttgagtagtt gggggaggtg 20 <210> 53 <211> > Artificial Sequence <220> <223> probe PMLb1-F <400> 44 gtgcgccagg tggtagctc 19 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe PLZF-F <400> 45 ccacaaggct gacgctgtat t 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe NuMA-F <400> 46 cgagccacct cctctactca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe RARA-R <400> 47 gcttgtagat gcggggtaga 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe CBFB-F <400> 48 tttgaagagg ctcggagaag 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MLL6-F <400> 49 gagcccaaga aaaagcagcc 20 <210> 50 <211> 20 < 212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe CBFB-R <400> 50 gtaaagatgg gcagcacaca 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MLL6 -R <400> 51 atcctgtgga ctccatctgc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe ETO-R <400> 52 ttgagtagtt gggggaggtg 20 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MDS-R <400> 53 cgatcttcct tttggtccat attc 24 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe CBFB-F <400> 54 tttgaagagg ctcggagaag 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MYH11-R <400> 55 gcagcttcgt agacacgttg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MYH11(e12)-R <400> 56 atccctgtga cgctctcaac 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MYH11(e7/e8)-R <400> 57 catctcctcc atctgggtct 20 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MDS-R <400> 53 cgatcttcct tttggtccat attc 24 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223 > probe CBFB-F <400> 54 tttgaagagg ctcggagaag 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MYH11-R <400> 55 gcagcttcgt agacacgttg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MYH11 (e12) -R <400> 56 atccctgtga cgctctcaac 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe MYH11 (e7 / e8) -R <400> 57 catctcctcc atctgggtct 20

Claims (6)

  1. (ⅰ) 18 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 백혈병 특이적인 유전자 이상을 검출하기위한 유전자 탐침; (Ⅰ) it consists of 18 to 25 nucleotides, genetic probe for detecting a leukemia specific genes or more;
    (ⅱ) 15개의 티민(dTTP), 6개의 CH 2 사슬 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5' 말단이 티민부위에 연결된 링커; (Ⅱ) 15 of thymine (dTTP), 6 of CH 2 chain and an amine (amine) comprises a one by one, and the 5 'end of the gene electric probe connected to the thymine linker region; 및, And,
    (ⅲ) 표면에 알데히드가 결합되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체를 포함하는, 백혈병 진단용 DNA 칩. (Ⅲ) and the aldehyde is bound to the surface, of the electro-linker aldehyde with the amine groups of the Schiff base surface (Schiff's base), including the associated solid through the reaction, leukemia diagnostic DNA chip.
  2. 제 1항에 있어서, According to claim 1,
    유전자 탐침은 서열번호 1 내지 23의 선별용 탐침 및 서열번호 24 내지 31의 대조용 탐침인 것을 특징으로 하는 Gene probe for verification that the probe of SEQ ID NO: 1 to 23 selected probe and SEQ ID NO 24 to 31, characterized for the
    백혈병 진단용 DNA 칩. Leukemia diagnostic DNA chip.
  3. (ⅰ) 18 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되고, 백혈병 특이적인 유전자 이상을 검출하기위한 유전자 탐침을 합성하는 공정; (Ⅰ) consists of 18 to 25 nucleotides, the process for synthesizing a gene probe for the detection of leukemia-specific gene or higher;
    (ⅱ) 15개의 티민(dTTP), 6개의 CH 2 사슬 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하는 링커를 합성하는 공정; (Ⅱ) 15 of thymine (dTTP), a group of six CH 2 chain and an amine (amine) a step of synthesizing a linker, including in sequence;
    (ⅲ) 전기 합성된 유전자 탐침의 5' 말단을 전기 합성된 링커의 티민부위에 결합시키는 공정; (Ⅲ) the step of combining the 5 'end of the synthetic gene electric probe to the site of the electric thymine synthesized linker;
    (ⅳ) 유전자 탐침이 결합된 링커를 알데히드가 결합된 고체의 표면에 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 결합시키는 공정; (Ⅳ) a step of bonding through a Schiff base (Schiff's base) reacting the linker binding the gene probe to the surface of the aldehyde has combined solids; 및, And,
    (ⅴ) 반응되지 않고 잔존하는 알데히드를 환원시키는 공정을 포함하는, 백혈병 진단용 DNA 칩의 제조방법. (Ⅴ) process, a process for producing a DNA chip for diagnosis of leukemia comprising the reduction reaction which is not an aldehyde remaining.
  4. 제 1항의 DNA칩, 시료로부터 채취한 RNA를 cDNA로 만들고 PCR방법으로 증폭시키기 위한 프라이머, 중합연쇄반응 시 증폭산물을 표지화시킬 수 있는 형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드 및 증폭산물을 단일가닥으로 분리하기 위한 람다 엑소누클레아제(lambda exonuclease)를 포함하는 백혈병 진단용 유전형 분석키트. Paragraph (1) a DNA chip, to create the RNA collected from the sample to the cDNA to remove the primers, polymerase chain fluorescently labeled dideoxy that the amplification product can be labeled during the reaction oxy oligonucleotide and the amplification products for the amplification by PCR of a single-stranded leukemia diagnostic genotyping kit comprising a lambda exo press nuclease (lambda exonuclease).
  5. 제 4항에 있어서, 5. The method of claim 4,
    프라이머는 서열번호 32 내지 57의 염기서열을 가지는 안티센스프라이머 또는 센스프라이머인 것을 특징으로 하는 Primers, characterized in that the anti-sense primer or a sense primer having a base sequence of SEQ ID NO: 32 to 57
    백혈병 진단용 유전형 분석키트. Leukemia diagnostic genotyping kit.
  6. 제 4항에 있어서, 5. The method of claim 4,
    형광표지된 디데옥시 뉴클레오타이드는 텍사스 레드(Texas Red) ddATP, 시아닌 3(cyanine 3) ddCTP, 시아닌 5(cyanine 5) ddGTP 또는 플루오레세인-12(fluorescein-12) ddUTP인 것을 특징으로 하는 Fluorescently labeled dideoxy nucleotides is Texas red (Texas Red) ddATP, cyanine 3 (cyanine 3) ddCTP, characterized in that the cyanine-5 (cyanine 5) ddGTP or fluorescein -12 (fluorescein-12) ddUTP
    백혈병 진단용 유전형 분석키트. Leukemia diagnostic genotyping kit.
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