KR20040084520A - Ｃｒｅ-ＬｏｘＰ 시스템을 이용한 유전자 트랩의 가역적조절방법 및 트랩벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Cre-LoxP 시스템을 이용한 유전자 트랩의 가역적 조절방법 및 트랩벡터에 관한 것이다. 특히 본 발명은 서로 다른 방향성의 LoxP 사이에 스플라이싱 수용체와 IRES를 위치시키고, 이를 Cre 재조합효소를 이용하여 역위시키므로써 스플라이싱 수용체와 IRES의 기능의 활성화 여부를 조절하여 특정 시기와 조직내에서 외부 유전자의 발현을 조절할 수 있는 유전자 트랩방법에 관한 것이다.
Description
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 Cre-LoxP 시스템을 이용한 가역적 유전자 트랩의 가역적 조절방법 및 트랩벡터에 관한 것으로, 보다 상세하게는 서로 다른 방향성의 LoxP 사이에 스플라이싱 수용체와 IRES를 위치시키고, 이를 Cre 재조합효소를 이용하여 역위시키므로써 스플라이싱 수용체와 IRES의 기능의 활성화 여부를 조절하여 유전자 트랩을 특정 시기와 조직내에서 가역적으로 조절할 수 있는 방법에 관한 것이다. 즉, 이는 트랩벡터에 의한 유전자 트랩을 특정 발생 시기와 조직에 따라 스위치 온 또는 오프하여 조절 가능한 방법에 관한 것이다.
[종래기술]
약 10년 전에 개발된 상동 재조합(homologous recombination)을 이용한 넉아웃 마우스(knockout mouse)는 특정유전자에 변이를 유발시키도록 고안된 벡터 DNA를 배아간 세포(ES cell)에 넣어 동형 재조합을 유도한 다음 이로부터 마우스를 발생시키는 방법으로 제조된다. 특정 유전자가 인위적으로 변이된 넉아웃 마우스는 그 표현형을 관찰함으로써 특정 유전자의 생체내 기능을 밝히거나 확인한다.
또한 특정 유전자의 변이 시기 및 발현 조직들을 제한할 수 있는 조건부 넉아웃 마우스(conditional knockout mouse)가 있다. 이 방법은 Cre라는 재조합효소(recombinase)가 LoxP라는 특정 염기배열을 인식하여 재조합을 일으키는 원리를 이용하는 것으로, 제거하고 싶은 특정 유전자 앞뒤에 LoxP를 넣은 생쥐를 제작하고, Cre 유전자가 특정시기와 특정조직에만 제한적으로 발현되게 조작된 유전자 전이마우스(Cre expressing-transgenic mouse)와 교배시키거나, 세포 내에 Cre 를 처리함으로써 특정 유전자가 생쥐의 일부 제한된 세포에만 제거되도록 하는 기술이다. 조건부 넉아웃 마우스는 배아 발달기 초기에 치사 표현형을 나타내는 특정유전자를 Cre-loxP 시스템을 사용하여 성체 또는 배아 발달 후기에 발현시켜 그 기능을 확인하는데 효과적이다.
그 외에도 아직 알려지지 않은 유전자를 분리하거나, 염기서열이 결정된 유전자의 기능을 밝히거나, 또는 다수의 유전자를 동시에 작업할 수 있는 방법으로 유전자 트랩(gene trap)이 있다. 유전자 트랩방법은 프로모터를 갖고 있지 않은 보고자를 포함하는 트랩벡터(trap vector)를 배아간세포(ES cell)에 넣어, 넣어진 벡터가 게놈상에 있는 유전자 내에 우연적으로 삽입되었을 때 보고자 유전자가 발현되는 것을 이용하여 새로운 유전자를 분리, 동정함과 동시에 미지유전자의 기능을 밝혀 내는 데 사용할 수 있는 기술이다.
유전자 트랩법에 사용되는 트랩벡터는 통상적으로 IRES(internal ribosomal entry site) 및 프로모터를 포함하지 않는 보고자 유전자로 이루어진다. 이러한 트랩벡터는 배아간세포 게놈의 인트론에 삽입되고, 스플라이스 수용자에 의하여 특정 유전자에 연결되어 발현되므로써, 배아간세포 게놈상의 유전자를 변이시킨다. 그러나 이런 경우, 변이된 배아간세포는 성체로 분화되지 못하고, 배아 치사(embryonic lethality)되는 경우가 빈번하여 특정 유전자의 기능 또는 서열을 확인하기 어렵다.
최근에는 조건부 넉아웃 및 유전자 트랩을 병행한 방법이 개발되었다. 이 방법은 동일 방향성의 LoxP를 포함하는 트랩 벡터를 배아간 세포에 넣고, 의도한 유전자 자리에 상동 재조합으로 대체시킨 다음 다시 트랩 벡터를 배아간세포에 넣어 상동 재조합을 통하여 LoxP 사이의 염기서열을 재교환하는 방법이다. 그러나 이러한 방법은 유전자 상동 재조합의 반복 실시에 따라 많은 시간과 노력이 요구될 뿐만 아니라, 여전히 배아 치사문제를 해결하기엔 미흡하다.
따라서, 미지의 유전자의 기능 또는 서열을 밝히는데 있어서, 트랩 벡터를 배아간세포에 삽입시킨 다음 게놈 유전자의 변이여부를 자유롭게 조절할 수 있을 뿐만 아니라 배아 치사를 방지할 수 있는 안정된 유전자 트랩방법의 개발이 요구된다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 배아의 치사없이 외부 유전자를 발현시켜, 그 기능을 확인할 수 있는 유전자 트랩방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 유전자 이식마우스에서 삽입된 외부 유전자의 발현을 시기별 또는 부위별로 가역적으로 조절할 수 있는 유전자 트랩방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 LoxP을 포함하며, 외재적인 Cre에 의하여 특정 유전자의 발현여부 및 발현부위를 조절할 수 있는 트랩 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 특정 시기 또는 특정부위에서 외부 유전자를 발현할 수 있는 유전자 이식동물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 본 발명의 Cre-LoxP 시스템을 이용한 유전자 트랩방법을 간략하게 도시한 것이고,
도 2는 PKC405 벡터의 모식도이고,
도 3은 PGK-puro 카세트 벡터의 모식도이고,
도 4는 LacZ 카세트 벡터의 모식도이고,
도 5는 PGK-puro-LoxP 카세트 벡터의 모식도이고,
도 6은 PGK-neo-LoxP 카세트 벡터의 모식도이고,
도 7은 유전자 트랩의 가역적 조절을 확인한 전기영동사진이다.
따라서, 본 발명은 스플라이싱 수용체(splicing acceptor; SA), IRES(internal ribosomal entry site) 및 외부 유전자를 포함하는 트랩 벡터를 게놈 DNA의 인트론 부위에 삽입시켜 외부 유전자를 발현시키는 유전자 트랩의 조절방법에 있어서,
상기 트랩벡터는 LoxP 및 LoxP 역방향체 사이에 SA 및 IRES을 포함하며, 외재적인 Cre 재조합효소에 의하여 트랩벡터내 SA 및 IRES의 방향성이 조절되는 것을 포함하는 유전자 트랩의 조절방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) LoxP, SA, IRES, LoxP 역방향체 및 외부 유전자를 포함하며, LoxP와 LoxP 역방향체 사이의 염기서열은 Cre 재조합효소에 의하여 역전위되는 트랩벡터를 도입하여 동물배를 재구성하는 단계 및 (b) 상기 재구성된 동물 배로부터 동물을 발생시키는 단계를 포함하는 유전자 이식동물 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 유전자 이식동물 제조방법으로 제조된 유전자 이식동물을 제공한다.
또한 본 발명은 LoxP 및 LoxP 역방향체 사이에 위치한 SA 및 IRES, 외부유전자 및 선별마커를 포함하는 트랩벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 트랩벡터가 도입된 형질전환세포를 제공하는 것을 목적으로 한다..
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 언급하는 동물은 바람직하게는 포유류이며, 대표적인 것으로는 사람, 쥐, 소, 양, 토끼, 개, 원숭이 또는 돼지이다.
본 발명에서 언급하는 역방향체는 염기서열의 배열이 반대방향으로 전위된 염기서열을 의미한다.
즉,를 의미한다.
본 발명에서는 역방향체를 보다 명확하게 기재하기 위하여 일예로, 5'-역방향체-3'의 역방향체는 3'-체향방역-5'으로 나타낸다.
본 발명에서 언급하는 유전자 트랩법은 외부 유전자를 동물세포에 도입하여 발현시켜 상기 외부 유전자의 기능, 표현형, 발현기작 및 특징을 확인하는 방법을 의미한다. 대표적인 방법으로는 외부유전자 염기서열 상류(upstream)에 스플라이싱 수용체(splicing acceptor; 이하 "SA"라 함) 및 IRES(internal ribosomal entry site)을 순차적으로 위치시킨 트랩 벡터를 세포의 게놈 DNA의 인트론 부위에 삽입시키고, SA 활성에 의하여 게놈 DNA 엑손에 연결되어 외부 유전자를 전사시킨 후 발현시키는 것이다.
본 발명자들은 상기한 유전자 트랩법에서 Cre/LoxP 시스템을 도입하여, 특정위치 또는 특정시기에 외부 유전자를 발현시킬 수 있는 유전자 트랩의 조절방법을 개발하였다.
상기 Cre는 Cre 재조합 효소를 의미하며, LoxP 염기배열을 인식하여 재조합을 일으키는 효소이다. Cre는 LoxP 사이에 특정 유전자를 삽입된 구조체에 작용하여 LoxP 사이의 특정 유전자를 제거하므로, 이러한 Cre/LoxP 시스템을 이용하여 특정 유전자의 기능을 확인하는 방법이 일반적이다.
본 발명에서의 Cre/LoxP 시스템을 이용한 유전자 트랩의 조절방법은 LoxP와 LoxP 역방향체 사이에 특정 염기서열을 삽입시키고, Cre를 이용하여 LoxP와 LoxP 사이의 특정 염기서열을 역위(invert form)시키는 것이다. 즉, 본원발명은 동일한 방향성을 가지는 LoxP 사이의 염기서열을 제거하는 것이 아닌, 서로 다른 방향성을가지는 LoxP 사이의 염기서열을 역위시키는 것이다.
보다 구체적인 본 발명의 유전자 트랩의 조절방법은 스플라이싱 수용체(splicing acceptor; SA), IRES(internal ribosomal entry site) 및 외부 유전자를 포함하는 트랩 벡터를 게놈 DNA의 인트론 부위에 삽입시켜 외부 유전자를 발현시키는 유전자 트랩의 조절방법에 있어서, 상기 트랩벡터는 LoxP 및 LoxP 역방향체 사이에 SA 및 IRES을 포함하며, 상기 트랩벡터내 SA 및 IRES의 방향성이 Cre 재조합효소에 의하여 조절되어 SA 및 IRES 기능의 활성화 여부가 결정되는 것이다.
상기 SA 및 IRES가 5'-SA-IRES-3' 순으로 배열된 경우, 각각은 활성하되어 스플라이싱 반응시 게놈 DNA 엑손에 연결되어 전사되며, 이후 외부 유전자가 발현된다.
상기 SA 및 IRES가 5'-IRES-SA-3' 순으로 배열된 경우, SA는 IRES 서열에 의하여 스플라이싱 반응시 게놈 DNA 엑손에 연결되지 못하고 인트론으로 인식되어, 전사되지 못하고, 즉 외부 유전자 역시 발현되지 않는다.
본 발명에서 일예로 사용한 LoxP 염기서열은 서열번호 1로, SA 염기서열은 서열번호 2로, IRES 염기서열은 서열번호 3으로 나타낸다.
상기한 원리는 도 1에 간략하게 나타낸다.
본 발명에서는 Cre/LoxP 시스템을 이용한 트랩벡터를 제공한다.
본 발명의 트랩벡터는 LoxP 및 LoxP 역방향체 사이에 위치한 SA 및 IRES, 외부유전자 및 선별마커를 포함하는 구조체를 포함하는 벡터이며, 상기 트랩벡터는 동물세포 게놈 DNA 상에 삽입가능한 벡터이다. 상기 트랩벡터는 상기 구조체를 제외한 부분은 통상의 트랩벡터 또는 바이러스 벡터의 염기서열(backbone)일 수 있다.
본 발명에서 일실시예로 제조한 트랩벡터는 PGK-puro-loxP 카세트 벡터 또는 PGK-neo-loxP 카세트 벡터이다. PGK-puro-loxP 카세트 벡터는 LoxP, SA, IRES, LoxP 역방향체, β-geo(LacZ+네오마이신 저항유전자), pA(poly adenylation signal), PGK 프로모터, 푸로마이신 저항유전자 및 SD를 포함하며, PGK-neo-loxP 카세트 벡터는 LoxP, SA, IRES, LoxP 역방향체, LacZ, pA(Poly adenylation signal), PGK 프로모터, 네오마이신 저항유전자 및 SD를 포함한다. 상기한 트랩벡터는 Cre를 발현하는 벡터와 동시 형질도입하였을 때, Cre에 의하여 트랩벡터내의 SA 및 IRES 염기서열이 역위됨이 확인되었다.
또한 본 발명의 상기의 트랩벡터가 형질도입된 형질전환세포를 제공한다. 상기 형질전환세포는 동물유래 세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하기로는 배아간세포, 간세포 및 수정란으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
또한 본 발명은 (a) LoxP, SA, IRES, LoxP 역방향체 및 외부 유전자를 포함하며, LoxP와 LoxP 역방향체 사이의 염기서열은 Cre 재조합효소에 의하여 역전위되는 트랩벡터를 도입하여 동물배를 재구성하는 단계 및 (b) 상기 재구성된 동물 배로부터 동물을 발생시키는 단계를 포함하는 유전자 이식동물 제조방법을 제공한다. 또한 유전자 이식동물 제조방법은 상기 (b) 단계에서 발생된 동물을 Cre 유전자 이식 동물과 교배시켜 외부유전자를 발현하는 동물을 수득하는 단계를 더욱 포함할수 있다.
상기 (a) 단계에서 동물배를 재구성하는 방법은 통상의 핵이식, 핵치환, 세포융합, 수정란에 배아간세포 미세주입 또는 수정란에 유전자주입 방법으로 실시할 수 있으며, 상기한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 종사하는 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 재구성된 동물배를 동물 자궁에 착상시켜, 산자를 출산시키는 방법이다. 상기한 방법 역시 본 발명이 속하는 기술분야에 종사하는 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.
상기 Cre 유전자 이식동물은 특정시기, 조건 또는 특정조직에서 Cre 유전자를 발현시키는 동물이다. Cre 유전자 이식동물은 상기의 트랩벡터 유전자 이식동물과 교배시켜, Cre 유전자가 발현되는 조건에서 트랩벡터내 삽입한 외부 유전자가 발현된다. 따라서, 상기한 방법으로 삽입한 외부 유전자의 기능 및 표현형을 쉽게 확인할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 트랩벡터
1-1. PGK-puro 카세트 벡터
EMCV(encephalomyoconditis virus) 유래 IRES(AX262346)를 pGT1.8 geo 벡터의 SacI 및 BamHI 제한효소 사이트에 삽입하여 pKC405 벡터(도 2)를 제조하고, pKC405 벡터의 BglII 제한효소 처리후 수득한 스플라이스 수용체(splice acceptor;이하 "SA"라 함)-IRES-b-geo 유전자(LacZ 유전자와 neomycin 항생제 유전자) 단편을 포함한 pKC405 벡터와 LacZ 카세트 벡터를 동일 제한효소로 절단하여 수득한 PGK 프로모터-퓨로마이신 유전자-SD( splice donor)와 연결하여, PGK-puro 카세트 벡터를 구축하였다(도 3).
1-2. LacZ 카세트 벡터
3'LTR, 5'LTR, LacZ 유전자, PGK 프로모터, 네오마이신 저항 유전자 및 SD를 포함하는 LacZ 카세트 벡터를 제작하였다(도 4).
1-3. PGK-puro-loxP 카세트
PGK-puro 카세트 벡터는E.coli. DH5α 에 형질전환시키고, 암피실린을 포함하는 LB 배지 100 ml에 접종하여 37 ℃에서 배양한 다음 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 플라스미드 미디 키트(plasmid midi kit, Qiagen Cat. No. 12145)을 이용하여 PGK-puro 카세트 벡터 DNA를 분리하였다.
PGK-puro 카세트 벡터 DNA를 주형으로 PCR을 실시하여 1.1 kb의 LoxP-SA-IRES-LoxP 역방향체 절편을 수득하였다. 사용한 프라이머 세트는 서열번호 4의 프라이머 1 및 서열번호 5의 프라이머 2이다. 프라이머 1은 SA 일부서열, NruI 제한효소 서열 및 loxP 서열을 포함하며, 프라이머 2는 IRES 일부서열, BamHI 제한효소 서열 및 역방향성 loxP 서열을 포함한다.
PCR 반응은 하기 조성으로 준비하여 PCR을 실시하였다: 94 ℃, 5분 -> (94 ℃, 30초 -> 56 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 30회 반복-> 72 ℃, 10 분.
<PCR의 반응액>
프라이머 1과 2(10 pmole) : 각 1 ㎕
dNTP 혼합물(dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 10 mM) : 4 ㎕
10x PCR 완충 용액 : 5 ㎕
Ex 텍 DNA 중합효소(Takara) : 0.2 ㎕
주형 DNA : 1 ㎕ (100 ng)
총 부피 : 50 ㎕
PCR 산물(LoxP-SA-IRES-LoxP 역방향체)은 1 % 아가로즈 겔에 전기영동하여 분리, 정제하였고, 서열분석하여 loxP의 삽입 및 방향성을 확인하였다.
PGK-puro 카세트 벡터 DNA를 NruI 제한효소로 3시간 처리한 다음 BamHI 제한효소로 부분적(partial enzyme digestion)으로 3분 동안 재처리하였다. 제한효소 처리한 PGK-puro 카세트 벡터 DNA는 0.6% 아가로즈 겔상에 전기영동하여 BamHI 제한효소로 처리되어진 9 kb의 단편을 분리, 정제하고, 이를 NruI 및 BamHI 제한효소로 연차적으로 처리한 LoxP-SA-IRES-LoxP(역방향)과 연결하여 PGK-puro-loxP 카세트 벡터(도 5)를 제조하였다.
1-4. PGK-neo-loxP 카세트 벡터
PGK-puro-loxp 카세트 벡터 및 pBluescript SK(+) 벡터(stratagene)를 각각E.coli. DH5α에 형질전환하고, 암피실린을 포함하는 LB배지에서 배양한 다음 각각의 DNA를 수득하였다.
PGK-puro-loxP 카세트 DNA는 XhoI/BamHI를 처리하여 1.1 kb의 loxP- SA-IRES-loxP 단편을 분리하고, XhoI/BamHI 제한효소로 절단된 pBluescript SK(+) 벡터 DNA에 연결시켜 pBS-SA-IRES-loxP 벡터를 제조하였다. pBS-SA-IRES-loxP 벡터는 pBluescript SK(+) 벡터에 LoxP-SA-IRES-LoxP(역방향체) 단편을 포함하는 것이다.
또한 프로모터를 가지고 있지 않은 LacZ 유전자를 삽입하였다. PGK-puro-loxP 카세트 벡터를 BamHI으로 절단하고, 3 kb의 lacZ 유전자 절편을 분리, 정제하였다. LacZ 유전자 절편은 BamHI 처리된 pBS-SA-IRES-loxP 벡터 DNA에 삽입하여 pBS-SA-IRES-loxP-LacZ 벡터를 제조하였다. 상기 pBS-SA-IRES-loxP-LacZ 벡터는 pBluescript SK(+) 벡터에 LoxP-SA-IRES-LacZ-LoxP(역방향체) 단편을 포함하는 것이다.
이후, XhoI/XbaI로 절단된 3.3 kb의 PGK-puro-loxP 카세트 벡터 단편을 XhoI/XbaI로 절단된 4.0kb의 pBS-SA-IRES-loxP-LacZ 벡터 단편과 연결하였다. 이를 BglII 제한 효소로 절단한 다음 7.8 kb의 DNA 단편을 회수하여, 을 분리, 정제하였다.
LacZ 카세트 벡터 DNA를 주형으로 하여, BglII 제한효소 부위를 포함하는 프라이머 3(서열번호 6)/프라이머 4(서열번호 7)로 PCR(94 ℃, 5분 -> (94 ℃, 30초 -> 55 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분 30초), 35회 반복-> 72 ℃, 10 분)하여 양 말단에 BglII 제한효소 부위를 포함하는 1.6 kb의 PGK 프로모터-네오마이신 저항 유전자-SD 단편을 수득하였다.
<PCR의 반응액>
프라이머 3/ 4(10 pmole) : 각 1 ㎕
dNTP 혼합물(dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 10 mM) : 4 ㎕
10x PCR 완충 용액 : 5 ㎕
Ex 텍 DNA 중합효소(Takara) : 0.2 ㎕
주형 DNA : 1 ㎕ (100 ng)
총 부피 : 50 ㎕
PCR 산물의 서열은 분석하여 PGK 프로모터, 네오마이신 저항 유전자 및 SD 서열배열을 확인하였다. 1.6 kb의 PCR 산물은 BglII 제한효소로 절단한 다음 BglII 제한효소로 절단한 7.8 kb의 DNA 단편에 연결하여 PGK-neo-loxP 카세트 벡터(도 6)를 수득하였다.
실험예 1: Cre 재조합효소에 의해서 서로 다른 방향성의 LoxP사이에 위치한 SA 및 IRES의 역위(inverted form) 검증
CMV 프로모터 및 Cre 재조합효소 유전자를 포함하는 pBS185 벡터(GibcoBRL 제품) DNA를 수득하였다.
(1) 단일 유전자감염
PGK-puro-loxP 카세트 벡터와 PGK-neo-loxP 카세트 벡터가 서로 다른 방향성의 LoxP사이에 위치한 SA 및 IRES 유전자를 정상적인 방향으로 위치되도록 유지하는지 확인하였다.
NIH 3T3 세포를 37 ℃에서 30분간 중탕시킨 10 % FBS(fetal bovine serum, Hyclone) 및 100 unit/ml의 페니실린-스트랩토마이신(GibcoBRL)을 포함하는 DMEM배지(Bio-whittaker 제품)상, 37 ℃, CO2배양기에서 배양하였다. 3 x 105개의 세포로 증식되면 DMEM 배지를 제거하고, PBS 완충액(Bio-whittaker 제품)으로 세척하였다. 세포에 PGK-puro-loxP 카세트 벡터 DNA 및 PGK-neo-loxP 카세트 벡터 DNA 각각을 1 ug씩 넣고, 전체 부피가 100 ㎕이 되도록 DMEM 배지를 넣어준 다음 superfect(Qiagen 제품) 5 ㎕을 첨가하여 혼합하였다. 여기에 10 % FBS(Hyclone 제품), 100 unit/㎖의 페니실린-스트랩토마이신을 포함하는 DMEM 배지 600 ㎕을 첨가하고, 세포를 상온에 10분간 방치하였다. 이후 세포는 PBS 완충액으로 세척하고, 100 unit/ml의 페니실린-스트랩토마이신을 포함하는 DMEM 배지를 2 ㎖을 첨가하여 37 ℃, CO2배양기에서 48시간 배양하였다.
각 벡터가 형질도입된 NIH 3T3 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 세포에 PBS 완충액으로 세척한 다음 0.2 ㎎/㎖의 프로테아제 K(GibcoBRL 제품)을 포함하는 100 mM Tris(pH 8.0)용액, 100 mM NaCl 용액, 1 mM EDTA 용액 및 0.5 % SDS 용액으로 이루어진 세포용혈용액(cell lysis solution)을 600 ㎕을 넣고, 37 ℃, CO2배양기에서 16시간 동안 방치한 다음 페놀용액(phenol : chloroform : Isoamyl alcohol= 25:24:1, amresco 제품) 600 ㎕을 혼합하고, 원심분리(2000 rpm, 10분)하여 상층액을 수득하였다. 상층액은 다시 클로로포름 용액(chloroform : Isoamyl alcohol= 24:1, sigma 제품) 600 ㎕을 혼합, 원심분리하여 상층액을 회수하고, 100 % 에탄올 1 ml을 혼합한 다음 -20 ℃에서 30분간 방치하였다. 이를 원심분리하여 펠렛화하고, 70 % 에탄올로 세척한 다음 TE(Tris-EDTA) 완충액에 용해시켰다.
(2) 공동 유전자감염
Cre 재조합효소에 의한 5'-SA-IRES-3'의 역위를 확인하기 위하여, NIH3T3 세포에 PGK-puro-loxP 카세트 벡터 및 PGK-neo-loxP 카세트 벡터 각각을 pBS185 벡터와 함께 형질도입시켰다. 실험방법은 상기 방법과 동일하게 실시하여 형질전환된 세포를 제조하고, 각각으로부터 게놈 DNA를 분리, 정제하였다.
Cre 재조합효소에 의한 SA-IRES의 역위는 하기의 PCR로 확인하였다.
사용한 프라이머 5(서열번호 8)는 SA의 상위 일부 서열을 포함하며, 프라이머 6(서열번호 9)은 프라이머 5의 상보적인 서열이며, 프라이머 7(서열번호 10)은 LacZ 유전자 하위 일부서열을 포함한다.
<PCR의 반응액>
프라이머 5/7 또는 프라이머 6/7(10 pmole) : 각 1 ㎕
dNTP 혼합물(dATP, dTTP, dCTP, dGTP; 10 mM) : 4 ㎕
10x PCR 완충 용액 : 5 ㎕
superbio-Ex 텍 DNA 중합효소(Takara) : 0.2 ㎕
주형 DNA : 1 ㎕ (100 ng)
총 부피 : 50 ㎕
<PCR 조건>
94 ℃, 1분 -> (94 ℃, 30초 -> 64 ℃, 30초 -> 72 ℃, 1분), 35회 반복-> 72 ℃, 10 분
PCR 산물은 각각 전기영동하여 크기를 확인하였으며, 분리 정제하여 그 염기서열을 확인하였다.
도 7은 전기영동사진으로, 레인1은 사이즈 마커이고, 레인 2 및 3은 PGK-puro-loxP 카세트 벡터로 형질전환된 세포의 게놈 DNA 및 PGK-puro-loxP 카세트 벡터를 pBS185 벡터와 공동 도입한 세포의 게놈 DNA를 프라이머5/프라이머7로 PCR한 것이고, 레인 4 내지 5은 PGK-neo-loxP 카세트 벡터로 형질전환된 세포의 게놈 DNA 및 PGK-neo-loxP 카세트 벡터를 pBS185 벡터와 공동 도입한 세포의 게놈 DNA를 프라이머5/프라이머7로 PCR한 것이고, 레인 6 내지 7은 PGK-puro-loxP 카세트 벡터로 형질전환된 세포의 게놈 DNA 및 PGK-puro-loxP 카세트 벡터를 pBS185 벡터와 공동 도입한 세포의 게놈 DNA를 프라이머6/프라이머7로 각각 PCR한 것이고, 레인 8 내지 9은 PGK-neo-loxP 카세트 벡터로 형질전환된 세포의 게놈 DNA 및 PGK-neo-loxP 카세트 벡터를 pBS185 벡터와 공동 도입한 세포의 게놈 DNA를 프라이머6/프라이머7로 각각 PCR한 것이다.
먼저, PGK-puro-loxP 카세트 벡터 및 PGK-neo-loxP 카세트 벡터를 각각 형질도입한 경우, PCR 산물은 약 700 bp의 크기로 측정되었으며, 그 염기서열은 SA-IRES 순으로 배열된 것으로 확인되었다.
Cre 재조합효소를 발현하는 재조합벡터와 공동 도입한 경우, 프라이머5/프라이머7에 의한 PCR 산물은 약 700 bp, 프라이머6/프라이머7에 의한 PCR 산물은 약 650 bp로 측정되었다. 각각의 염기서열을 분석한 결과, 약 700 bp의 PCR 산물은 주형인 게놈 DNA가 루프(loop) 형태로 휘어져서 PCR 반응을 일으키는 양상을 보였으며, 약 650 bp의 PCR 산물은 Cre 재조합효소에 의해서 5'-SA-IRES-3' 순 배열이3'-SERI-AS-5' 순으로 역방향화된 것을 확인할 수 있었다. 즉, Cre-loxP 시스템을 이용하여 역방향성의 LoxP 사이에 위치한 서열을 역위(inverted form)시킬 수 있음을 확인하였다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 유전자 트랩의 조절방법은 Cre 재조합효소에 의해서 서로 다른 방향성의 LoxP사이에 위치한 스플라이싱 수용체와 IRES 유전자의 역위(inverted form)를 자유롭게 조절할 수 있어, 원하는 특정 시기와 조직내에서 외부 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 유전자 트랩방법은 기능이 알려지지 않은 유전자의 기능을 파악할 수 있도록 하여 주며, 외부 유전자의 발현이 조절가능한 유전자 이식동물을 제조할 수 있도록 한다.
<110> MACROGEN INC.
<120> REVERSIBLE GENE TRAPING USING Cre-LoxP SYSTEM AND TRAP VECTOR
<130> dpp20023108
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LoxP
<400> 1
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34
<210> 2
<211> 407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SA
<400> 2
acatctgcca atcatctcat tttcacacac acacacacaa ctttcccttc tggtcaagtg 60
ggcacatgtc caagcctcaa gtttatatac cccccaatgc ccaacacttg tatggccttg 120
ggcgggtcat cccccccccc acccccagta tctgcaacct caagctagct tgggtgcgtt 180
ggttgtggat aagtagctag actccagcaa ccagtaacct ctgccctttc tcctccatga 240
caaccaggtc ccaggtcccc gaaaaccaaa gaagaagaac ccctaacaaa gaggacaagc 300
ggcctcgcac agccttcact gctgagcagc tccagaggct caaggctgag tttcagacca 360
acaggtacct gacagagcag cggcgccaga gtctggcaca ggagctc 407
<210> 3
<211> 611
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IRES
<400> 3
ggtacccgga agatcatcga attccccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg 60
aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc 120
gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag 180
gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt 240
tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa 300
ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc 360
aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg 420
gctctcctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat 480
gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa 540
acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt tgaaaaacac gatgataagc 600
ttgccacaac c 611
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
atatcgcgaa taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatcgtacgc gtatcgatgg 60
cgcc 64
<210> 5
<211> 64
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
cgcggatcca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatggttgtg gcaagcttat 60
catc 64
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
acaggtaact gacagagcag cgg 23
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
aagaagatct aggtcaattc taccggg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
aagaagatct gagacttacc tgactgg 27
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
ccgctgctct gtcaggtacc tgt 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
ccgtgcatct gccagtttga gggga 25
Claims (12)
- 스플라이싱 수용체(splicing acceptor; SA), IRES(internal ribosomal entry site) 및 외부 유전자를 포함하는 트랩 벡터를 게놈 DNA의 인트론 부위에 삽입시켜 외부 유전자를 발현시키는 유전자 트랩의 조절방법에 있어서,상기 트랩벡터는 LoxP 및 LoxP 역방향체 사이에 SA 및 IRES을 포함하며, 외재적인 Cre 재조합효소에 의하여 트랩벡터내 SA 및 IRES의 방향성이 조절되는 것을 포함하는 유전자 트랩의 조절방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 트랩벡터는 외부 유전자 상부에 5'-LoxP-SERI-AS-LoxP 역방향체-3' 순으로 배열된 염기서열을 포함하여 Cre 재조합효소 존재시 5'-LoxP-SA-IRES-LoxP 역방향체-3'순으로 SA 및 IRES 염기서열이 전위되어 외부유전자가 발현되는 것인 유전자 트랩의 조절방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 트랩벡터는 외부 유전자 상부에 5'-LoxP-SA-IRES-LoxP 역방향체-3' 순으로 배열된 염기서열을 포함하여 Cre 재조합효소 존재시 5'-LoxP-SERI-AS-LoxP 역방향체-3'순으로 SA 및 IRES 염기서열이 전위되어 외부유전자의 발현이 저해되는 것인 유전자 트랩의 조절방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 트랩벡터는 PGK-puro-loxP 카세트 벡터 또는 PGK-neo-loxP 카세트 벡터인 것인 유전자 트랩의 조절방법.
- (a) LoxP, SA, IRES, LoxP 역방향체 및 외부 유전자를 포함하며, LoxP와 LoxP 역방향체 사이의 염기서열은 Cre 재조합효소에 의하여 역전위되는 트랩벡터를 도입하여 동물배를 재구성하는 단계 및;(b) 상기 재구성된 동물 배로부터 동물을 발생시키는 단계를 포함하는 유전자 이식동물 제조방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 발생된 동물을 Cre 유전자 이식 동물과 교배시켜 외부유전자를 발현하는 동물을 수득하는 단계를 더욱 포함하는 것인 유전자 이식동물 제조방법.
- 제 5항 또는 6항의 방법으로 제조된 유전자 이식동물.
- LoxP 및 LoxP 역방향체 사이에 위치한 SA 및 IRES, 외부유전자 및 선별마커를 포함하는 트랩벡터.
- 제 8항에 있어서, 상기 트랩벡터는 동물 게놈 DNA의 인트론상에 삽입되고, Cre 재조합효소에 의하여 SA 및 IRES 염기서열이 역위가능하도록 포함하는 것인 트랩벡터.
- 제 8항에 있어서, 상기 트랩벡터는 동물 게놈 DNA의 인트로상에 삽입된 상태에서 Cre 재조합효소에 의하여 5'-SA-IRES-3' 순으로 배열된 염기서열이 3'-SERI-AS-5'순으로 역위되어 외부유전자를 동물 게놈 DNA의 프로모터에 의하여 발현시키는 것인 트랩벡터.
- 제 8항 내지 10항 중 어느 한항에 따른 트랩벡터가 형질도입된 형질전환세포.
- 제 11항에 있어서, 상기 형질전환세포는 배아간세포, 간세포 및 수정난으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 형질전환세포.
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Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
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