KR20040064471A - 인슐린 분비세포 증식, 재생 및 혈당강하 기능을 갖는췌장 세포 추출물 - Google Patents

인슐린 분비세포 증식, 재생 및 혈당강하 기능을 갖는췌장 세포 추출물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장을 일부 절제하고 일정기간 경과 후 재생된 췌장을 적출하고 적출된 췌장을 세포 용해하여 얻어지는 인슐린 분비 세포 증식 기능을 갖는 췌장 세포 추출물과 이를 이용한 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 췌장 절제시 췌장의 재생을 위해 새로 발현되는 다음 14종의 단백질군에서 선택된 하나 이상의 단백질을 함유하는 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다: 고분자량 H1(MW: 85-87 KD, pI: 4.6-4.8), H2(MW: 84-86 KD, pI: 4.7-4.9), H3(MW: 84-86 KD, pI: 4.8-5.0), H4(MW: 41-43 KD, pI: 6.7-6.9), H5(MW: 33-35 KD, pI: 6.5-6.7), H6(MW: 25-27 KD, pI: 6.5-6.7), 저분자량 L1(MW: 15-17 KD, pI: 5.5-5.7), L2(MW: 15-17 KD, pI: 4.3-4.5), L3(MW: 16-18 KD, pI: 5.8-6.0), L4(MW: 18-20 KD, pI: 6.2-6.4), L6(MW: 15-17 KD, pI: 6.4-6.6), L7(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7), L8(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7).
본 발명에 따르는 췌장 세포 추출물은 췌장의 도관줄기세포와 그 외에 존재하는 내·외분비 전구세포나 췌장줄기세포를 인슐린 분비세포로 재생 및 분화를 유도하고 궁극적으로 췌장소도세포의 신생을 유도하여, streptozotocin으로 유도된 당뇨 쥐(rat 또는 mouse)의 혈당을 강하해서 정상의 혈당과 HbA1c를 유지하여, 당뇨병 치료효과를 가지는 약제로서, 특히 제 1형과 2형의 손상된 췌장 복원으로 당뇨병의 치료에 유용하다.

Description

인슐린 분비세포 증식, 재생 및 혈당강하 기능을 갖는 췌장 세포 추출물{Regenerated pancreatic cell extract involved in pancreatic islet neogenesis and beta-cell differentiation}
본 발명은 당뇨병 치료에 유용한 췌장 세포 추출물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 본 발명은 췌장을 일부 절제하고 일정기간 경과 후 재생된 췌장을 적출하고 적출된 췌장을 세포 용해하여 얻어지는 인슐린 분비 세포 증식 기능, 재생 및 혈당강하 기능을 갖는 췌장 세포 추출물과 이를 이용한 당뇨병 치료용 조성물에 관한 것이다.
당뇨병(Diabetes Mellitus)은 인체 내 췌장 베타-세포의 인슐린 분비능 부족과 인슐린 이용 기관 및 장기의 수용체(receptor) 고장으로 인한 혈중 포도당 농도(blood glucose concentration)의 조절 실패로 당의 평형상태(homeostasis)가 파괴됨으로 유발되며, 고혈압, 신장병, 망막증 및 면역적 방어력 부족으로 인한 여러 합병증을 유발한다. 일반적으로 유년기 자가면역(autoimmune disease)에 의한 베타-세포의 파괴로 유발되는 제 1형과 40세 이후 췌장 기능의 노화(ageing), 비만(obesity), 인슐린 수용체(insulin receptor) 및 당 운반체(glucose transporter)의 결함으로 유발되는 제2형으로 구분된다.
당뇨병의 치료는 주로 인슐린에 의존하고, 경구 혈당강하제, 인슐린 분비촉진제, 인슐린 센시타이저 등이 치료제 또는 개선제로 이용되며 궁극적 완치의 방법은 아직 없는 난치성 질환이다. 최근 당뇨 치료의 다양한 치유 전략의 접근방법이 있으나 인공췌장(artificial insulin delivery system)은 단시간 제한성(short-term durability of the glucose sensor)과 췌장이식은 공여자의 절대부족과 지속적인 면역억제제(immunosuppressor)의 투여 등 이용 가능성의 보편화와 부작용에 대한 문제점이 내포하고 있다.
인체의 췌장 소도세포 이식(Pancreatic islet transplantation)의 문제점은소도세포의 공급 부족, 면역억제제의 장기적 투여로 인한 부작용, 이식된 소도세포 기능 미비 및 면역거부, 자가면역으로 인한 파괴 등이 있으며, 면역억제제의 변형, immunoisolation, induction of tolerance(관용), xenotransplantation(이종이식)의 방법으로 해결책을 모색하고 있다(Titus, T., Badet, L., and Gray, D.W.R. (2000) Islet cell transplantation for insulin-dependent diabetes mellitus: perspectives from the present and prospects for the future. Expert Reviews in Molecular Medicine 6, 1-28).
췌장조직 및 소도와 베타세포의 재생(Regeneration therapy)은 배아줄기세포(embryonic stem cell)(Lumelsky, N., Blondel, O., Laeng, P.et al.(2001) Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar to pancreatic islets. Science 292, 1389-1394), 췌장도관세포(pancreatic duct epithelial cell) 또는 췌도전구세포(islet progenitor cell)(Bonner-Weir, S., Taneja, M., Weir, G.C.et al.(2000) In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7999-8004), 베타-세포주(beta-cell line)와 골수줄기세포(bone marrow stem cell)(Jiang, Y., Jahagirdar, B.N., Reinhardt, R.L.et al.(2002) Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 418, 41-49)등으로 분화와 증식 가능성에 대한 연구가 진행 중이며 이러한 세포들을 이용한 치료는in vivo,in vitro그리고ex vivotherapy 영역으로 구분된다. 여러 배아성 줄기세포(ES, EG, EC)와 췌장 도관세포(ductal cell)에서 베타세포로 분화 가능성을 제시하나, 골수, 뇌, 근육, 피부 및 장 상피세포 등의 성체 줄기세포에서 베타세포로의 분화에 대해서는 아직 연구 발표된 것이 없으나 골수줄기세포(bone marrow stem cell)를 이용하여 단일 혹은 조합된 분화 인자의 자극에 의한 가능성에 대해서 본 실험실에서 연구를 진행 중에 있다. 췌장 도관 세포의 인슐린 분비세포로 분화는 가능하며 체내·외에서 안정적인 세포들을 얻을 수 있으나 수적인 면에서 공급의 부족이 수반된다. 배아성 줄기세포는 이미 잘 알려져 있지만 분리 및 임상 적용 시에 윤리적 문제에 의해서 제한성이 있으며 또한 어느 특정의 세포로 분화를 유도하여 이식한다 하더라도 이후에 타 조직/기관 내에서의 다른 세포로의 분화가 진행되어 암화될 가능성에 대해서 충분한 안전성을 고려하지 않으면 안된다. 인슐린 분비 세포주의 연구 개발에 있어서 선행 연구자들은 췌관세포 및 nestin 양성세포에서 인슐린 분비세포를 분화 및 증식하고자 하였으나 수적제한성과 지속적인 인슐린의 분비를 유도하지는 못하였다.
제1형 당뇨에서는 베타세포의 자가면역 파괴(autoimmune destruction)가 지속되는 한 베타세포로 proliferation(增殖)과 neogenesis(新生)를 유도하여도 치료효과에 있어서 제한적이다. 따라서in vitro와ex vivoregeneration은 면역억제제 사용이나 앞서 언급한 면역적장벽(immunological barrier)을 적절히 조절하여야 제1형 당뇨의 치료 가능성이 지속될 수 있다. 제2형에서는 환자자신의 베타세포의 증식이나 다른 세포(non-beta-cell)로부터 베타세포로의 신생을 유도하면 면역적 문제가 관여되지 않기 때문에in vitro와ex vivoregeneration은 가능하나, 궁극적인 제2형 당뇨의 치료는 개발된 약물투여로 베타세포의 proliferation과neogenesis를 유도한in vivoregeneration은 비용절감과 부작용이 배제된 안전성 있는 방식으로서 제1형의 재생 치료와 더불어서 전 세계적으로 수많은 당뇨환자에 적용할 수 있으며, 가장 유용한 치료 방법이 될 것이다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 쥐 췌장 절제후 2일차의 재생 추출물을 이용하여 당뇨쥐에 투여시 인슐린분비세포의 재생 및 혈당강하 현상을 확인 할 수 있었고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 인슐린 분비세포 증식, 재생 및 혈당강하 기능을 갖는 췌장 세포 추출물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 췌장 세포 추출물을 함유하는 인슐린분비세포 재생용 조성물, 혈당강하용 조성물, 및 당뇨병 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여에 의한 혈당강하 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여전 내당능을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여후 내당능을 나타내는 그래프이다.
도 4는 췌장 추출물중 고분자량 부분(High MW part)의 2-D 겔 지도로서, 도 4a는 정상 췌장 추출물의 것이고, 도 4b는 본 발명의 췌장절제(pancreatectomy) 2일후 재생된 추출물의 것이고, 도 4c는 새로 생긴 스팟들의 비교 사진이다.
도 5는 췌장 추출물중 저분자량 부분(Low MW part)의 2-D 겔 지도로서, 도 5a는 정상 췌장 추출물의 것이고, 도 5b는 본 발명의 췌장절제(pancreatectomy) 2일후 재생된 추출물의 것이, 도 5c는 새로 생긴 스팟들의 비교 사진이다.
도 6은 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여후 인슐린 분비 세포 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여후 인슐린 분비 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 췌장 재생 추출물 분획 후 인슐린 분비 세포 세포 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 쥐의 손상된 소도세포(islet)를 나타내는 사진이고, 도 9b는 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여후 췌도관의 분화된 소도세포(islet)를 나타내는 사진이다.
도 10은 마우스(Mouse)에서 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여 후 혈당강하 효과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 마우스(Mouse)에서 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여 후 HbA1c 저하 효과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 마우스(Mouse)에서 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여 후 내당능 효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 마우스(Mouse)에서 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여 후 췌장 소도세포 분화능을 나타내는 그래프이다.
도 14a는 당뇨 마우스(mouse)의 췌장 소도세포를 나타내는 사진이고, 도 14b는 본 발명의 췌장 재생 추출물 투여후 재생된 마우스(mouse)의 췌장 소도세포를 나타내는 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌장을 일부 절제하고 일정기간 경과 후 재생된 췌장을 적출하고 적출된 췌장을 세포 용해하여 얻어지는 인슐린 분비 세포 증식 기능을 갖는 췌장 세포 추출물을 제공한다.
본 발명에서, 췌장은 목표로 하는 포유동물의 췌장에 대하여 증식 및 재생 기능을 갖는 어떤 포유동물의 췌장도 가능하나, 본 발명에서는 예시적으로 쥐의 췌장을 사용하였으며, 이것이 래트(rat)와 마우스(mouse)에 모두 상기 기능을 가짐을 시험함으로써 한 종에서 분리된 췌장 세포 추출물이 다른 종의 췌장 재생에도 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 발명에서, 췌장의 일부 절제(partial pancreatectomy)는 나머지 부분이 계속해서 정상적인 혈당을 유지하며 재생기능을 나타낼 수 있을 만큼의 부피를 절제할 수 있으나, 바람직하게는 췌장의 50-90%, 가장 바람직하게는 약 60% 절제하는 것을 특징으로 한다. 상기 수치범위 미만에서는 췌장의 재생물질 발현이 적으며, 상기 수치범위 초과에서는 췌장 자체의 재생이 어렵게 된다.
본 발명에서, 췌장의 적출은 재생이 개시된 후 완료되기 전의 어느 시간에도 적출할 수 있으나, 바람직하게는 췌장 절제한지 1-10일 후, 가장 바람직하게는 약 2일 후 재생된 췌장을 적출하는 것을 특징으로 한다. 상기 일자보다 이른 경우 실험상 혈당강하 효과가 없었으며, 절제 후 2일 이후에는 실제로 혈당강하 효과에 큰 변화가 없었다.
본 발명에서, 췌장 세포 추출물은 바람직하게는 췌장을 절제하기 전에 베타세포를 사멸시키는 약물(chemical agent)를 투여하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 본 발명에서는 인슐린을 분비하는 베타세포를 사멸시키는 약물인 스트렙토조토신(STZ)을 복강투여 후 다시 그 쥐에 췌장의 약 60 %정도를 절제하여 상대적인 재생복구능력을 향상시켜 재생에 관여하는 물질이 과량 생성되도록 하였다.
본 발명에서, 췌장 세포 추출물은 바람직하게는 적출된 췌장의 세포 용해물을 원심분리하고 단백질 상등액을 수집하여 얻어지는 것을 특징으로 한다. 여기서, 세포 용해는 균질화(homogenization), 초음파(sonication), 효소분해(enzyme digesion), 또는 해동용해(freeze-thow lysis) 방법 등으로 실시할 수 있으며, 원심분리는 핵산(nucleic acids) 및 세포조각(cell debris)과 단백질(proteins)을 분리시킬 수 있는 속도로 실시할 수 있다.
본 발명에서, 췌장 세포 추출물은 바람직하게는 상기 단백질 상등액을 이온교환 크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 MONO Q HR 5/5 칼럼을 이용하여 이온교환 크로마토그래피를 수행한 결과 정제된 분획에서 인슐린분비세포의 증식효과가 크게 나타남을 확인하였다.
본 발명에서, 췌장 세포 추출물은 바람직하게는 하기와 같은 분자량(MW)과 등전점(pI)을 갖는 단백질 군에서 선택된 하나이상의 단백질을 함유하는 것을 특징으로 한다:
H1(MW: 85-87 KD, pI: 4.6-4.8), H2(MW: 84-86 KD, pI: 4.7-4.9), H3(MW: 84-86 KD, pI: 4.8-5.0), H4(MW: 41-43 KD, pI: 6.7-6.9), H5(MW: 33-35 KD, pI: 6.5-6.7), H6(MW: 25-27 KD, pI: 6.5-6.7), L1(MW: 15-17 KD, pI: 5.5-5.7), L2(MW: 15-17 KD, pI: 4.3-4.5), L3(MW: 16-18 KD, pI: 5.8-6.0), L4(MW: 18-20 KD, pI: 6.2-6.4), L6(MW: 15-17 KD, pI: 6.4-6.6), L7(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7), 및 L8(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7).
본 발명의 췌장 세포 추출물에 포함된 상기 단백질들은 췌장 소도 세포의 재생 및 분화에 관계되는 물질로서 인슐린 분비 세포의 증식에 활성을 갖는 모든 포유류의 정제된 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 췌장 세포 추출물을 함유하는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 인슐린 분비 세포재생(regeneration)용 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 본 발명의 췌장 세포 추출물이 시험관내(in vitro)에서 인슐린 분비 세포의 증식 활성을 가지며, 생체내(ex vivo)에서 인슐린 분비 세포의 재생 효과가 있음을 확인하였다. 따라서, 환자자신의 세포를 일시적으로 제거하여 본 발명의 췌장 세포 추출물을 함유하는 조성물을 처리하여 재생 및 분화를 유도한 후 환자에 이식하는 세포외(ex vivo) 재생 치료가 가능하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 췌장 세포 추출물을 함유하는 생체내(in vivo) 혈당 강하용 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 본 발명의 췌장 세포 추출물이 생체내(in vivo)에서 혈당 강하 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 췌장 세포 추출물을 함유하는 당뇨병 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 췌장 세포 추출물은 상기와 같이 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 인슐린 분비 세포 증식, 재생 및 혈당 강하 효과가 있으므로 제 1형 및 2형의 당뇨병 치료용 조성물에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.
일반적으로 어떤 세포나 조직이 물리적, 화학적 손상을 받더라도 곧 이어서 기능이 회복이 부가되며, 이는 재생 복구인자 즉 호르몬이나 성장인자(재생복구인자)가 분비되어 정상적인 세포나 조직으로 재생을 유도한다. 따라서 췌장도 물리적, 화학적 손상을 가하면 이와 같은 손상에 반하여 여러 재생 복구인자가 분비 될 것으로 사려되어 본 발명에서는 이러한 재생 물질을 획득하여 여러 손상된 췌장 세포나 조직의 복구 및 재생에 이용하고자 한다. 정상적인 쥐에서 췌장을 약 80-90%정도 절제를 하더라도 계속해서 정상적인 혈당이 유지되며 당뇨병이 유발되지는 않는다는 것을 실제적인 실험을 통하여 확인하였다. 결론적으로 췌장내의 베타세포가 정상의 약 10%만 존재하여도 혈당이 유지되어 당뇨병이 유발되지 않으며, 이는 췌장 스스로 세포나 조직 재생을 통한 신생(neogenesis)이 발생되어 소도세포(islet)가 신소도(neo-islet) 상태로 존재하여 정상적인 인슐린을 분비함을 의미한다. 따라서 인슐린을 분비하는 베타세포를 사멸시키는 약물(chemical agent)인 STZ를 복강투여 후 다시 그 쥐에 췌장의 약 50-90%정도 절제하면 상대적인 재생복구능력이 커짐에 의해서 재생에 관여하는 물질이 과량 생성될 수 있다.
췌장을 절제한 후 조직 추출물을 당뇨쥐에 투여했을 때 당뇨 대조군과 비교하여 현저한 혈당강하 능력을 보였으며, 6개월 이상 follow-up 하는 중에도 지속적인 혈당조절로 당뇨쥐가 정상쥐로 복원됨을 확인하였다. 또한 재생물질을 대조군과 비교하여 2-D 전기영동으로 분석한 결과 14개 내외의 새로운 spot들이 나타났으며, 그 외 약 56개의 spot들이 정상군에 비하여 증감되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 앞서 말한바와 같이 재생 및 분화를 확인하기 위하여 췌장 추출물을 투여하여 혈당이 강하된 rat과 mouse를 대상으로 하여 정상군과 당뇨 대조군을 비교한 결과 혈당 강하 지표의 하나인 HbA1c도 5-6개월 후 정상쥐와 동일하였으며, 조직화학적 분석에 의하면 췌장 소도세포 및 인슐린 분비세포인 베타세포를 염색한 결과 새로이 생성된 췌장 소도세포 및 복구된 베타세포 역시 숫적인 증가와 더불어 기능의 향상을 확인 할 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시 예1: 쥐 췌장 절제
Wistar-Kyoto 쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harvor, Maine)에 마취제 entobarbital (20 mg/kg)과 ketamine·HCl (60 mg/kg)을 투여한 후 개복하여 물리적인 췌장 손상의 방법으로는 쥐의 췌장을 절제해 본 결과 60-80 % 범위에서도 정상적인 혈당을 유지하였으나 (80-120 mg/dl), 재생조직을 얻고자 할 때 최적의 시료 양을 고려하여 약 60 %의 부분적 췌장 절제(partial pancreatectomy)를 Spleen portion으로부터 절제하되 췌도관을 피한 부분의 절제를 수행하였다. 또한, 화학적인 손상을 가하기 위해서 Streptozotocin (STZ)을 40-80 (mg/kg)의 농도로 복강 투여 한 후 췌장의 재생을 관찰한 결과 STZ의 농도와 고혈당이 진행함에 비례적으로 췌장 소도세포의 파괴가 심화되었다.
실시 예2: 재생된 췌장 세포 추출물의 제조
실시예1에서 췌장 절제 후 2일이 경과된 쥐에 마취제 entobarbital (20 mg/kg)과 ketamine·HCl을 투여한 후 개복하여 물리적 손상으로 재생된 췌장을 외과적 수술법에 의해서 적출하고 액체질소에 snap-freeze한다. Protease inhibitor를 첨가한 재생조직 시료를 얼음 상에서 균질화(homogenize) 시킨 후 3,000 rpm에서 10분, 곧이어 12,000 rpm에서 20분 원심 분리하여 단백질 상등액을 분획·수집하였다.
실시 예3: Streptozotocin (STZ)에 의한 당뇨모델 쥐의 확립
Wistar-Kyoto 쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harvor, Maine)의 몸무게에 따라서 40-50 (mg/kg)의 STZ를 citrate buffer (pH 4.5)에 녹여 복강투여(intraperiotoneal cavity)한 후 정기적으로 혈당을 측정하고, 평균 10일에서 2주일이내의 쥐를 사용하되 3 일간 연속적으로 혈당치가 250-300 mg/dl인 쥐를 당뇨모델 쥐로 이용하였다.
실시 예4: 췌장 세포 추출물의 혈당 강하 효과 시험
실시예2에서 STZ와 pancreatectomy에 의해서 손상된 쥐 췌장에서 추출한 세포 추출물(sample)과 정상쥐(sham-operation)의 췌장에서 추출한 조직추출물(control)을 실시예3에서 확립된 STZ 투여 당뇨 모델 쥐와 정상쥐에 0.3 ㎖ (40 ㎍ protein)를 3주간 복강 투여한 후 혈당의 변이를 주기적으로 Surestep kit(Jonhson & Jonhson, USA )를 이용하여 체크하고 5 개월간의 혈당 추이를 관찰한 바 투여 20일 경과후부터 혈당이 정상(80-120 mg/dl)으로 회복이 되어 대조군에 비하여 지속적으로 5개월까지 정상의 혈당강하 현상을 보였다. 도 1은 본 발명의 재생추출물 투여에 의한 혈당강하 효과를 나타내는 그래프다.
또한, 정상으로 회복된 당뇨쥐의 당에 대한 췌장의 기능을 파악하기 위해서 실험 대상의 쥐를 over-night 동안 금식을 한 후 당을 2 g/㎏의 농도로 복강 투여 한 후 0, 30, 60, 90, 120, 180, 300 분 간격으로 혈당을 측정하여 당에 대한 부하능 실험을 실시한 결과 정상으로 회복된 쥐에서는 2시간 이내에 내당능을 가진 것으로 나타났다. 도 2는 재생추출물 투여전 내당능을 나타내는 그래프이고, 도 3은재생추출물 투여후 내당능을 나타내는 그래프이다.
또한, 혈당 강하 지표의 하나인 HbA1c를 측정하기 위하여, 대조군(Normal), STZ로 당뇨유발한 쥐에 PBS만 처리한 군(STZ+PBS), 및 STZ로 당뇨유발한 쥐에 세포추출물(CE)를 처리한 군(STZ+CE)을 대상으로 MicromatTMReader (Biorad, USA)를 이용하여 chromography에 의해서 분석하였다. 상기 실험의 결과 5개월 후 변화된 HbA1c는 다음 표1과 같으며, 회복된 쥐에서 정상의 대조군과 유사한 결과를 얻었다.
[표1] 재생추출물 투여후 HbA1c의 변화 수치
HbA1c Normal STZ+PBS STZ+CE(Not recovery) STZ+CE(Recovery)
1st 4.4±0.06 9.0±0.06 7.9±0.61 3.9±0.37
2nd 4.4±0.06 9.9±0.52 8.6±0.10 4.0±0.06
3rd 4.4±0.06 7.2±0.06 7.3±0.13 3.4±0.06
실시 예5: 췌장 세포 추출물의 이차원(2-D) 전기영동 실험
실시예2에서 제조된 췌장 추출물을 3K centricon(Amicon)을 이용하여 desalting한 후, protein 100 ㎍을 Immobiline DryStrips (24 cm, pH 4-7, Amersham)에 loading하고 IPGphore (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 9,000Vh가 되도록 IEF(isoelectric focusing)를 하여 일차원 전기영동을 하였다. 일차원 전기영동이 끝난 strip을 평형화시킨후 12.5%(고분자량 단백질용)와 15%(저분자량 단백질용) acrylamide gel위에 장착하고 Ettan Dalt (Amerahsm Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 이용하여 이차원 전기영동을 하였다. 고분자량 부분(high molecular weight part)와 저분자량 부분(low molecularweight part)를 각각 다른 acrylamide gel상에서 분리 후, silver staining을 이용하여 visualization하고 ImageMaster (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 이용하여 protein spot을 분석하였다.
정상 추출물과 본 발명의 재생 추출물을 2D 전기영동 한 결과, 정상 췌장 추출물에 비하여 본 발명의 절제된 췌장 시료에서 변화된 단백질 spot (pI 4-7 range)들은 총 70개 였으며, 그 중 새로 생긴 것 14개, 양이 증가된 것 36개 그리고 20개의 감소된 단백질들을 확인하였다. 새로 생긴 spot은 고분자량(25KD-90KD 범위)에서 6개와 저분자량(10KD-25KD 범위)에서 8개로 구분되어 나타났으며 6개의 고분자량 spot은 H1(MW: 85-87 KD, pI: 4.6-4.8), H2(MW: 84-86 KD, pI: 4.7-4.9), H3(MW: 84-86 KD, pI: 4.8-5.0), H4(MW: 41-43 KD, pI: 6.7-6.9), H5(MW: 33-35 KD, pI: 6.5-6.7), H6(MW: 25-27 KD, pI: 6.5-6.7)이고, 8개의 저분자량 spot은 L1(MW: 15-17 KD, pI: 5.5-5.7), L2(MW: 15-17 KD, pI: 4.3-4.5), L3(MW: 16-18 KD, pI: 5.8-6.0), L4(MW: 18-20 KD, pI: 6.2-6.4), L6(MW: 15-17 KD, pI: 6.4-6.6), L7(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7), L8(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7)이다. 도 4a, b 와 c는 정상 췌장 및 본 발명의 췌장절제 2일후 재생 추출물(High MW part: 25KD-90KD 범위)의 2-D 젤 지도와 새로 생긴 spots들의 비교 사진이고, 도 5a, b 와 c는 정상 췌장 및 본 발명의 췌장절제 2일후 재생 추출물(Low MW part: 10KD-25KD 범위)의 2-D 젤 지도와 새로 생긴 spots들의 비교 사진이다.
실시 예6: 췌장 세포 추출물의 질량분석 실험
이미지 분석프로그램으로 찾아낸 점들을 동정하기 위해 실시예5의 2D gel에서 spot을 떼어내어 destaing한 후, trypsine으로 in-gel digestion하여 peptide를 얻어서, MALDI-TOF Voyager DE-STR Mass spectrometer (Framingham, MA, USA)를 이용하여 mass 값을 얻는다. 얻어진 펩타이드의 질량 결과를 MS-Fit program (http://prospector.ucsf.edu/msfit)을 사용하여 NCBInr 데이터베이스에 대해 서치하여 단백질 동정(protein identification)을 수행하였다.
실시 예6: 췌장 세포 추출물의 인슐린 분비세포주에 대한 증식 효과 시험
본 발명의 재생된 췌장 조직 추출물의 인슐린 분비 세포증식 효과를 시험하기 위하여 인슐린 분비세포주(HIT-T15)를 24-well plate에 1×105/cell 분주하여 실시예2의 췌장세포추출물 50, 100, 150, 200 ㎍/㎕로 배양배지에 첨가하여 배양 2일 후 MTT assay한 결과 조절군에 비해서 50에서는 1.3배, 100에서는 1.44 배, 150에서는 1.46배와 200에서는 1.78배의 세포 증식효과를 보였다. 도 6은 본 발명의 재생추출물 50, 100, 150, 200 ㎍/㎕ 투여후 세포 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
또한, 증식된 세포에서의 인슐린 분비 효과를 시험하기 위하여 실시예2의 췌장세포추출물 50, 100, 150, 200 ㎍/㎕로 배양배지에 첨가하여 배양 2일 후 각 배양세포에 대한 글루코스 11.2 mM 반응에 대한 인슐린의 분비능을 EnzymeIimmunoassay (RIA)방법으로 조사한 결과 50-200㎍/㎕의 투여 농도에 의한 유의적인 분비능은 1.07에서 6.71 ng/ml으로상승하였다(KRB 1ml에 포함된 인슐린양을 계산, Linco Research, USA). 도 7은 본 발명의 재생추출물 50, 100, 150, 200㎍/㎕ 투여후 인슐린 분비 효과를 나타내는 그래프이다.
또한, 크로마토그래피로 분획된 세포 추출물의 인슐린 분비세포주 증식 효과를 시험하기 위하여, 실시예2의 췌장세포추출물 20 mg을 0.2 ul filter를 이용하여 여과시킨 후, 이온교환수지인 MONO Q HR 5/5 칼럼에 주사하였다. 10 ml의 buffer A(20 mM Tris, pH 8.0)로 칼럼을 세척한 후, 5 ml 만큼 0 에서 30% buffer B(1 M NaCl in 20 mM Tris, pH 8.0)로, 그 후 또 5 ml은 30에서 70% buffer B로, 마지막 5 ml은 70에서 100% buffer B로 elution하였다. 전체 flow rate은 0.5 ml/min이었고 분획(fraction)은 1ml 단위로 받아졌으며, 모든 절차는 4℃에서 행해졌다. 상기 크로마토그래피 결과 얻은 20개의 분획을 24-well plate에 1×105/cell 분주된 인슐린 분비세포주(HIT-T15)에 세포추출물 농도 400㎕로 투여하여 3일간 배양후에 MTT assay를 이용하여 분획별 세포의 증식 정도를 조사한 결과 분획 1, 2, 3, 5, 15, 17, 20 에서 조절군에 비하여 1 이상의 상대적인 세포의 증식효과를 나타냈다. 도 8은 본 발명의 재생추출물 분획 후 세포 증식 효과를 나타내는 그래프이다.
실시 예7: 생체내에서의 췌장소도세포의 재생 및 분화 효과 시험
본 발명의 췌장 재생 추출물의 췌장소도세포 재생 효과를 시험하기 위하여, 대조군의 정상 OLETF rat(Normal), 당뇨 유발쥐(STZ treated), 회복이 안된쥐(Not recovery), 및 추출물 처리후 회복이 된 쥐(CE treated)를 대상으로 하여 췌장 조직의 후미 부분을 적출한 후 고정액에 하루정도 넣어둔다. 그리고 조직에 파라핀을 침투시킨 후, 강철 칼날을 이용해서 6㎛ 두께의 얇은 절편을 잘라낸다. 이 파라핀절편을 유리슬라이드에 옮기고, 이 슬라이드를 haematoxylin(H) 용액과 eosin(E)용액에 차례로 담그어 파라핀속의 조직을 염색한다. 이렇게 염색된 슬라이드를 광학현미경을 이용하여 islet의 크기와 수를 관찰한 결과 본 발명의 췌장 추출물로 회복된 경우에 회복되지 안은 쥐에 비해서 직경 50 um이하가 약 2배로 나타났으며, 숫적인면에서 STZ 처리된 당뇨쥐보다 본 발명의 췌장 추출물로 회복된 쥐에서 약 2배(21개 : 38개)의 증가를 나왔으며, 20주령의 OLETF rat (Normal)와 비교할때에 150 이상이 16개에 비해서 5개, 100이하인 경우 8개인 반면에 28개의 숫적인 차이를 보이므로 새로이 신생된 췌장의 소도세포의 분포가 변한 양상을 보여 주었다(표 2).
[표 2] 쥐의 정상, 당뇨와 회복된 상황에서의 췌장 소도세포의 크기
Normal (%) STZtreated (%) Notrecovery (%) CEtreated (%)
<50 14 (31.8) 7 (33.3) 6 ( 16.2) 11 (28.9)
50-100 14 (31.8) 7 (33.3) 18 (48.6) 17 (44.7)
100-150 8 (18.2) 5 (23.8) 6 (16.2) 5 (13.2)
150-200 5 (11.4) 1 ( 4.8) 2 ( 5.4) 1 ( 2.6)
200-300 2 ( 4.5) 1 ( 4.8) 4 (10.8) 3 ( 7.9)
>300 1 ( 2.3) 0 (0) 1 ( 2.7) 1 ( 2.6)
Total 44 (100) 21 (100) 37 (100) 38 (100)
본 발명의 췌장 재생 추출물의 인슐린 분비세포로의 분화 효과를 시험하기 위하여, Deparaffinized된 췌장 조직시료를 5 ㎛ 절단하여 primary antibody(polyclonal Guinea pig anti-human insulin, 1:500 dilution)으로 실온에서 90분간 반응 후 secondary antibody(peroxidase-condugated rabbit anti-Guinea pig immunoglobulins, 1:400 dilution) 반응을 실시한다. 또한 기질로 DAB(diaminobenzidine)을 이용해서 조직을 관찰한 바 손상된 췌장 소도세포에 비하여 인슐린 베타세포는 회복되어 재생된 췌장 조직에 상대적으로 많이 분포되어 있으며, 염색한 결과 회복된 재생 조직에서 작은 췌장 소도세포의 분화를 확인할 수 있었다. 도 9a는 쥐(rat)의 손상된 소도세포(islet)을 나타내고, 도 9b는 본 발명의 재생물질투여후 췌도관의 분화된 소도세포(islet)을 나타내는 사진이다.
실시 예8: 타 개체(mouse)에서의 혈당 강하효과 시험
쥐(rat)에서 재생된 췌장 조직 추출물의 타 개체(mouse)에서 혈당 강하 효과를 시험하기 위하여, 실시예2의 STZ와 pancreatectomy에 의해서 손상된 쥐와 정상쥐(sham-operation)의 췌장에서 추출한 조직추출물을 STZ mouse와 정상 mouse에 100, 150, 200 ㎍/㎕ 농도별로 3주간 복강 주사한 후 혈당의 변이를 주기적으로 Surestep kit를 이용하여 체크하고 지속적으로 follow-up 한다. 상기 실험의 결과 추출물 100㎍/㎕ 투여시 40%, 150㎍/㎕ 투여시 60% 그리고 200㎍/㎕ 투여시 80%의 혈당 및 당뇨 회복율을 보였다. 도 10은 마우스(mouse)에서 재생추출물 200㎍/㎕ 투여 후 혈당강하 효과를 나타내는 그래프이다. 상위의 삼각형과 역삼각형(2개)은 조절이 안된 그룹이고, 하위의 각 도형들(8개)은 각각의 당뇨유도된 쥐에 추출물을 200㎍/㎕ 투여시 하향곡선으로 혈당조절이 된 그룹들이다.
또한, 마우스(mouse)에서 혈당 강하 지표의 하나인 HbA1c를 측정하기 위하여, STZ투여된 당뇨쥐(control (diabetic)), 정상쥐(control (non-diabetic)), 및 추출물 처리후 회복된 쥐(RPE-treated group)를 대상으로 1, 2, 3, 4, 5개월간 연속적으로 HbA1c 레벨을 follow-up한 결과 약 90일 후에 정상의 대조군과 유사한 감소 효과가 입증되었다. 도 11은 마우스(mouse)에서 재생추출물 200㎍/㎕ 투여 후HbA1c 저하 효과를 나타내는 그래프이다.
또한, 정상으로 회복된 마우스(mouse)의 당에 대한 췌장의 기능을 파악하기 위해서 추출물 투여전의 당뇨유발쥐(RPE-treated group (before)), 당뇨유발쥐에 추출물 투여 30일 후 조절군(RPE-treated group (after 30 days)), 및 당뇨유발쥐에 추출물 투여 150일 후 조절군(RPE-treated group (after 150 days))을 대상으로 over-night 동안 금식을 한 후 당을 2 g/㎏의 농도로 복강 투여 한 후 0, 30, 60, 90, 120, 180 분 간격으로 혈당을 측정하여 당에 대한 부하능 실험을 실시한 결과 회복된 마우스에서의 내당능 부하 실험의 결과는 5개월 후 정상의 기능을 완전히 복구하였다. 도 12는 마우스(mouse)에서 재생추출물 200㎍/㎕ 투여 후 내당능 효과를 나타내는 그래프이다.
실시 예9: 타 개체(mouse)에서의 췌장 재생 및 분화 효과
쥐(rat)에서 재생된 췌장 조직 추출물의 타 개체(mouse)에서 췌장 재생 효과를 시험하기 위하여, STZ투여된 당뇨쥐(control (diabetic)), 정상쥐(control (non-diabetic)), 및 추출물 처리후 회복된 쥐(RPE-treated group)를 대상으로 하여 췌장 조직의 후미 부분을 적출한 후 고정액 췌장 소도세포의 크기를 측정한 결과 재생물질 투여후 재생 및 분화된 경우 직경 50 마이크로 이하가 약 57%증가된 반면 정상과 회복이 안된 마우스에서는 10% 이하로 보여졌다. 도 13은 본 발명의 재생추출물 투여 후 마우스(mouse)에서 췌장 소도세포 재생 효과를 나타내는 그래프이다.
또한, 본 발명의 재생된 췌장 소도세포 내의 인슐린 분비세포의 분화 효과를시험하기 위하여, Deparaffinized된 췌장 조직시료를 5 ㎛ 절단하여 primary antibody(polyclonal Guinea pig anti-swine insulin, 1:100 dilution)으로 실온에서 90분간 반응 후 secondary antibody(goat anti-Guinea pig biotinylated) 반응을 실시한다. 또한 기질로 streptavidin-peroxidase conjugate와 aminoethyl carbazol을 이용해서 조직을 관찰한 결과, 회복된 마우스 재생 조직에서 작은 췌장 소도세포의 분화를 확인할 수 있었다. 도 14a는 당뇨 마우스(mouse)의 췌장소도세포를 나타내고, 도 14b는 재생 마우스(mouse)의 췌장소도세포를 나타내는 사진이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 췌장 재생 추출물은 췌장의 도관줄기세포와 그 외에 존재하는 내·외분비 전구세포나 췌장줄기세포를 인슐린 분비세포로 재생 및 분화를 유도하고 궁극적으로 췌장소도세포의 신생을 유도하여, streptozotocin으로 유도된 당뇨 쥐(rat)과 마우스(mouse)의 혈당을 강하해서 정상의 혈당과 HbA1c를 유지하며, 제 1형과 2형의 손상된 췌장의 복원으로 당뇨병 치료효과를 가지는 약제로서 유용한 물질이다.

Claims (10)

  1. 췌장을 일부 절제하고 일정기간 경과 후 재생된 췌장을 적출하고 적출된 췌장을 세포 용해하여 얻어지는 인슐린 분비 세포 증식 기능을 갖는 췌장 세포 추출물.
  2. 제1항에 있어서, 췌장을 50-90% 절제하는 것을 특징으로 하는 췌장 세포 추출물.
  3. 제1항에 있어서, 췌장 절제한지 1-10일 후 재생된 췌장을 적출하는 것을 특징으로 하는 췌장 세포 추출물.
  4. 제1항에 있어서, 췌장을 절제하기 전에 베타세포를 사멸시키는 약물(chemical agent)를 투여하는 것을 특징으로 하는 췌장 세포 추출물.
  5. 제1항에 있어서, 세포 용해물을 원심분리하고 단백질 상등액을 수집하는 것을 특징으로 하는 췌장 세포 추출물.
  6. 제5항에 있어서, 단백질 상등액을 이온교환 크로마토그래피로 정제하는 것을 특징으로 하는 췌장 세포 추출물.
  7. 제1항에 있어서, 하기와 같은 분자량(MW)과 등전점(pI)을 갖는 단백질 군에서 선택된 하나이상의 단백질을 함유하는 것을 특징으로 하는 췌장 세포 추출물:
    H1(MW: 85-87 KD, pI: 4.6-4.8), H2(MW: 84-86 KD, pI: 4.7-4.9), H3(MW: 84-86 KD, pI: 4.8-5.0), H4(MW: 41-43 KD, pI: 6.7-6.9), H5(MW: 33-35 KD, pI: 6.5-6.7), H6(MW: 25-27 KD, pI: 6.5-6.7), L1(MW: 15-17 KD, pI: 5.5-5.7), L2(MW: 15-17 KD, pI: 4.3-4.5), L3(MW: 16-18 KD, pI: 5.8-6.0), L4(MW: 18-20 KD, pI: 6.2-6.4), L6(MW: 15-17 KD, pI: 6.4-6.6), L7(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7), 및 L8(MW: 15-17 KD, pI: 4.5-4.7).
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 췌장 세포 추출물을 함유하는 시험관내(in vitro) 또는 생체외(ex vivo) 인슐린 분비 세포 재생(regeneration)용 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 췌장 세포 추출물을 함유하는 생체내(in vivo) 혈당 강하용 조성물.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 췌장 세포 추출물을 함유하는 당뇨병 치료용 조성물.
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