KR20040046874A - 나프타자린 유도체 ｓ64를 함유하는 고형암 치료 및예방용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 활성 성분으로 하기 화학식의 나프타자린 유도체인 S64를 약제학적으로 유효한 양으로 포함하는 것을 특징으로 하는 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 고형암세포에 특이적으로 작용하여 Hsp70 유전자의 발현억제, Hsp70 및/또는 Hsf 단백질의 활성억제 및 글루타치온의 양을 감소시킴으로써 고형암 치료 및 예방에 효과를 나타낸다.

Description

나프타자린 유도체 Ｓ64를 함유하는 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물{A Pharmaceutical Composition For Treatment And Prevention of Solid Cancer Comprising Naphthazarin Derivative S64}

본 발명은 6-(1-프로필옥시이미노도데실)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논

[6-(1-propyloxyiminododecyl)-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinone, 이하 "S64"라 한다]를 함유하는 것을 특징으로 하는 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 활성 성분으로 약제학적으로 유효한 양의 S64 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함께 함유한 여러 종류의 고형암을 치료 및 예방하는데 유용한 조성물에 관한 것이다.

악성 종양들은 종종 정상적이지 않은 혈관망상조직의 형성으로 인해 저산소 상태(hypoxic)의 세포들을 가지게 된다(Moulder et al., Cancer Metastasis Rev., 5, 313~341, (1987)). 한편, 저산소 상태의 세포에서 재산소화는 일시적으로 막혔던 혈관들의 재관류로 인해 종양이 성장하는 동안 일어나기도 한다. 또한, 재산소화는 종양 세포의 불활성화를 유도하여 암을 치료하는 방사선요법을 시행할 때도 일어난다(Kallman, Radiology, 105, 135~142, (1972)). 그러나 종양 세포의 미세혈관에서 혈류의 불안정한 흐름은 종양 선 세포 조직에서 저산소 상태의 발생을 유발한다(Kimura et al., Cancer Res., 56, 5522~5528, (1996)). 이러한 저산소 상태는 고형암을 치료하는데 있어서 오랫동안 문제점으로 지적되어 왔다. 즉, 저산소 상태의 종양세포들은 방사선 및 화학적 치료에 대해 저항성이 큰 것으로 알려져 있고(Teicher et al., Cancer Res., 41, 73~81, (1981); Gatenby et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 14, 831~838, (1988); Teicher et al., Cancer Metastasis Rev., 13, 139~168. (1994); Brizel et al., Cancer Res., 56, 941~943, (1996); Brizel et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 38, 285~289, (1997); Koong et al., Cancer Res., 60, 883~887, (2000)), 종양세포의 전이능력을 증가시킨다는 결과가 보고된 바 있으며(Young et al., J. Natl. Cancer. Inst., 82, 371~380, (1990); Schwickert et al., Cancer Res., 55, 4757~4759, (1995); Brizel et al., Cancer Res., 56, 941~943, (1996); Rofstad et al., Br. J. Cancer, 80, 1697~1707, (1999)), 고형암 내에서 저산소증(hypoxia)은 세포사멸(apoptosis)에 대한 저항성을 나타낸다고 한다(Graeber et al., Nature (Lond), 379, 88~91, (1996)). 이는 연부 조직, 뇌, 목, 경부암 등에서 저산소 상태의 종양들과 관련된 임상적인 실험을 통해 확인되었다(Brizel et al., Cancer Res., 56, 941~943, (1996); Hockel et al., Cancer Res., 56, 4509~4515, (1996); Nordsmark et al., Radiother Oncol., 41, 31~40, (1996); Brizel et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 38, 285~289, (1997).

종양세포, 특히 저산소 상태로 인한 고형암에서의 저항성은 일부 유전자의 발현을 조절하여, 종양을 악성으로 진행시키게 되는 원인이라고 추측할 수 있다. 이는 저산소증의 결과로 열 충격 단백질(Heat Shock protein, 이하 "Hsp 단백질"라 한다) 유전자들 중 일부의 전사적 활성이 높다는 것과 저산소증에 의한 신호가 열충격 전사인자(heat shock transcription factor, 이하 "Hsf"라 한다) 및 저산소 유도인자-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)에 동시에 전달되어 여러 종류의 Hsp 단백질, 조혈인자(hematopoietic factor) 및 혈관형성인자(angiogenic factor)들의 유도에 관여한다는 것으로 증명된다(Guttman et al., Cell, 22, 229~307, (1980); Heacock et al., Br. J. Cancer. 62, 217~225, (1990); Iwaki et al., Circulation 87, 2023~2032, (1993); Baek et al., J. Cell Physiol., 188, 223~235, (2001); Wang et al., Blood, 82, 3610~3615, (1995); Forsythe et al., Mol. Cell. Biol., 16, 4604~4613, (1996); Back et al., J. Cell Physiol., 32, 112~118, (1999); Back et al., J. Cell Physiol., 188, 223~235, (1999)). 따라서 종양세포가 악성으로 진행되는 것을 억제하기 위하여 당업자들은 특히, 저산소 상태로 유도되는 유전자의 발현을 제어하기 위해 연구하고 있다(Brown et al., Int. J. Radiat. Biol., 65, 95~102, (1994); Giaccia, Seminars in Radiat. Oncol., 6, 46~58, (1996); Brown et al., Cancer Res., 60, 883~887, (1998); Koong et al., Cancer Res., 58, 1408~1416, (2000)).

이 중 화학적 치료에 있어서 일부 나프타자린 유도체의 항암효과는 하기 문헌 및 논문 등에 공지되어 있다. 예를 들면 사이클로시코닌(Cycloshikonin) 및 사이클로알카닌(Cycloalkannin)으로 알려진 5,8-디하이드록시-2-(테트라하이드로-5,5-디메틸-2-퓨라닐)-1,4-나프탈렌디온[5,8-dihydroxy-2-(tetrahydro-5,5-dimethyl-2-furanyl)-1,4-naphthalenedione]과 항종양 물질을 함께 사용하면 좋은 효과를 나타낸다는 것이 보고된 바 있었고(Sankawa et al., Chem. Pharm. Bull(Tokyo)., 29(1), 116~122, (1981)), 일본특허공개 소63-112530호에는 1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌(1,4,5,8-Tetramethoxynaphthalene)을 생산하여 여러 가지 유도체를 제조하고, 이를 이용하여 항종양 효과, 항균작용 및 항염증성 작용을 나타내는 시코닌, 에치논(echinone), 미톡시안트론(mithoxanthrone) 등의 나프타자린 유도체를 합성할 수 있다는 내용이 개시되어 있다. 따라서, 시코닌 및 알카닌과 같이 자연상태에서 얻어지는 나프토퀴논계의 물질 및 유도체의 항암효과에 대한 종래의 연구결과 및 문헌을 바탕으로 본 발명자들은 나프타자린 유도체인 2 또는 6-아실-5,8-디메톡시-1.4-나프토퀴논[2 or 6-acyl-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinone] 및 2 또는 6-(1-옥시이미노알킬)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논[2 or 6-(1-oxyiminoalkyl)-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinones] 등을 합성하여 림프성백혈병 림프아세포인 L1210 세포를 대상으로 연구한 결과, 상기 세포에 대한 DNA 토포이소머라아제-I(topoisomerase-I)의 활성억제, 증식억제 및 독성을 나타낸다는 것을 확인하였다(Song et al., Eur. J. Med. Chem., 35, 291~298, (2000); Song et al., Arch. Pharm. Med. Chem,, 333, 87~92, (2000)).

이를 바탕으로 하여 본 발명자들은 나프타자린 유도체로 저산소 상태의 종양세포에서 발생하는 저항성 요소를 억제시킬 수 있는 S64를 합성하고, 이를 고형암세포에 적용하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명에서는 고형암 세포에서 저산소 상태로 유발되는 저항성 요소를 억제시켜 고형암 치료 및 예방에 효과를 나타내는 조성물을 제공하고자 한다.

구체적으로, 본 발명의 목적은 활성 성분으로서 약제학적으로 유효한 양으로 나프타자린 유도체인 S64를 포함하고, 이를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 함유하여 고형암을 효과적으로 치료 및 예방할 수 있는 약제학적 조성물을 제공함에 있다.

도 1a는 저산소 상태의 대장암 세포에서 경과시간에 따라 추출한 Hsp70 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿 분석으로 나타낸 것이다.

도 1b는 저산소 상태의 대장암 세포에서 경과시간에 따라 추출한 Hsp70 유전자를 역전사연쇄중합반응(RT-PCR)으로 증폭한 것이다.

도 2는 저산소 상태의 대장암 세포에서 경과시간에 따라 Hsf의 활성화 정도를 겔 시프트 분석으로 나타낸 것이다.

도 3a는 S64를 처리한 저산소 상태의 대장암 세포에서 경과시간에 따라 추출한 Hsp70 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿 분석으로 나타낸 것이다.

도 3b는 S64를 처리한 저산소 상태의 대장암 세포에서 경과시간에 따라 추출한 Hsp70 유전자를 역전사연쇄중합반응(RT-PCR)으로 증폭한 것이다.

도 4는 S64를 처리한 저산소 상태의 대장암 세포에서 경과시간에 따라 Hsf의 활성화 정도를 겔 시프트 분석으로 나타낸 것이다.

도 5는 저산소 상태의 대장암 세포, S64를 처리한 저산소 상태의 대장암 세포 및 S64를 처리한 정상산소 상태의 대장암 세포에서 글루타치온의 양을 측정한것이다.

도 6은 저산소 상태의 대장암 세포, S64를 처리한 저산소 상태의 대장암 세포 및 정상산소 상태의 대장암 세포에서 γ-GCS(γ-glutamylcysteine synthetase)의 활성을 측정한 것이다(γ-GCS 활성=NADH 산화속도와 동일하게 나타나는 ADP(adenosine diphosphate) 형성속도).

본 발명은 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공한다. 보다 자세하게는, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 활성 성분으로 약제학적으로 유효한 양의 하기 화학식으로 표시되는 나프타자린 유도체인 S64를 포함하는 것을 특징으로 하는 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 2 또는 6-(1-하이드록시이미노알킬)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논[2 or 6-(1-hydroxyiminoalkyl)-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinone]을 합성하여 복수암세포인 S(sarcoma)-180 세포에 처리하여 종양 성장 억제율(T/C(%)=테스트 그룹(T)의 생존기간 평균/대조군 그룹(C)의 생존기간 평균×100)을 측정한 결과, 종래에 밝혀진 나프타자린 유도체, 예를 들면 2 또는 6-(1-하이드록시알킬)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논 또는 2 또는 6-아실-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논 유도체 보다도 항암효과가 높다는 것을 확인하였고, 특히 6-(1-프로필옥시이미노알킬)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논 유도체를 처리한 결과, 종양 성장 억제율이 현저하게 증가함을 알 수 있었다(Song et al., Arch. Pharm. Res., 24, 35~38, (2001)).

이에 본 발명자들은 상기 유도체의 종양 성장의 억제효과와 관련하여, 나프타자린 고리의 6번위치 치환체 1-프로필옥시이미노알킬에서 알킬기가 도데실인 나프타자린 유도체, S64를 합성하고 이를 대장암 세포주에 처리한 결과, 다른 나프타자린 유도체와는 달리 특이하게 고형암에서 발생하는 저항성 요소인 Hsp70 유전자의 발현억제, Hsp70 및/또는 Hsf 단백질의 활성억제 및 글루타치온의 양을 감소시킨다는 것을 발견하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

Hsp70 유전자의 발현억제 및 Hsp70 단백질의 축적 감소

본 발명자들은 이전의 문헌에서 쥐의 고형 종양 세포인RIF(radiation-induced fibrosarcoma) 세포에서 저산소 상태의 처리 후, 시간의 경과에 따라Hsp70 유전자의 발현이 유도된다고 보고한 바 있다(Baek et al., J. Cell. Physiol., 188, 223-235, (2001)). 한편, 본 실험의 적용 대상인 대장암은 가장 흔한 고형암 형태 중 하나이며, 다양한 성장속도 및 잠재적 전이능력을 가진 암세포에서 조직된 이종 종양(heterogeneous neoplasm)으로 알려져 있다(Fearon et al., Cell, 61, 759~767, 1990; Filder, Cancer Res., 50, 6130~6138, (1990)). 또한 저산소 상태의 대장암에서 발현되는 단백질인 일부 Hsp 단백질은 다양한 스트레스 자극의 해로운 영향 및 효과로부터 세포를 보호하는 것으로 알려져 있다. Hsp 단백질들의 과발현은 열 및 화학적 약물에 대한 저항성과 관련이 있으며, 종양세포의 악성 진행과도 관련이 있다(Ciocca et al., J. Natl. Cancer. Inst., 85, 570~574, (1993); Richards et al., Cancer Res., 56, 2446~2451, (1996); Soti et al., Pathol. Oncol. Res., 4, 316~321, (1998)). 이와 관련하여, 본 발명자들은 임상적·병리적 기준과 관련하여 초기의 사람 대장암 조직을 분석하였고 Hsp70 유전자의 발현 및 양성 림프혈관 침투(positive LN involvement)와 같은 임상적 단계에서 의미 있는 연관성을 발견하였다. 따라서, 대장암 세포주인 클론 A(clone A)에서 저산소 상태에 의한 Hsp70 단백질의 축적이 본 발명자들의 최근 임상적 관찰결과와 일치하는 것으로 나타났다. 그러므로 Hsp70 단백질의 축적은 대표적인 고형암인 대장암 세포의 악성 진행에 영향을 미칠 것이며, 이는 고형암 세포가 저산소 상태에서 저항성을 지니게 하는 중요한 요소임을 알 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 대장암 세포주인 클론 A에 저산소 상태를 유발시켜 Hsp70 유전자 발현을 유도하여 Hsp70 단백질을 축적시켰으며, 이에 S64를 처리하여Hsp70 유전자 및 단백질의 변화를 측정하였다. 그 결과, Hsp70 유전자의 발현 및 Hsp70 단백질의 축적이 유의적으로 감소함을 알 수 있었다(도 3a 및 도 3b 참조). 이는 S64가 고형암의 저항성 요소인 Hsp70 유전자의 발현억제 및 Hsp70 단백질의 축적을 감소시키는 효과를 보여주는 것이다.

Hsf 활성의 억제 및 글루타치온의 감소

본 발명자들이 상기에서 증명한 바와 같이, 저산소 상태의 대장암 세포에 S64를 처리한 결과로 Hsp70 유전자의 발현억제 및 Hsp70 단백질의 활성억제 효과는 특정한 메카니즘(mechanisms)에 의해서 나타날 수 있다. 그 중 하나는 저산소 상태의 종양 세포에 대해 저항성 및 보호작용을 나타내며, 산화 스트레스에 대한 유전적 반응을 결정하는 조절요소인 글루타치온의 소비에 의해서 세포내 산화·환원 상태가 불안정화 되고(Jin et al., Chin. Med. J., 105, 647~650, (1992); Bump et al., Science, 217, 544~545, (1982); Bump et al., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 8, 439~442 (1982)), 이 때 S64의 작용으로 글루타치온의 감소가 Hsp70 유전자의 발현을 활성화시키는 인자인 Hsf를 억제시킴으로서 Hsp70 단백질의 활성이 억제된다는 것이다. 이는 여러 문헌들에 밝혀진 바와 같이, 세포내 산화·환원 상태를 조절하는 시약들이 Hsf 활성의 유도에 영향을 준다는 것을 언급하고 있는 점으로 볼 때 타당성이 있다(Huang et al., J. Biol. Chem., 269, 30718~30725, (1994); Aucion et al., Am. J. Physiol., 268, H1651~H1658, (1995); Saunders et al., Radiat. Res., 125, 267~276, (1991)). 또한, Hsf의 활성조절에 인산화가 필요하다는 점에서, S64의 작용으로 글루타치온 양의 변화가 발생하여 세포내 산화·환원의 불안정 상태가 유발될 때, Hsf의 활성을 조절하는 인산화 과정은 산화·환원으로 조절되는 변화로 억제될 수 있을 것이다. 이는 Hsf의 활성을 일으키는 신호전달과 관련된 분자들로서 간접적으로 발생하는 Hsf 활성억제를 의미한다.

한편, Hsf의 전사활성의 억제는 정확한 산화·환원의 변화에 민감한 여러 과정들로 이루어져 복잡하게 일어날 것이다. 최근에, 효모로부터 분리된 Hsf를 사용하여 생체 외 실험을 한 결과, 초과산화물(superoxide)의 생성이 Hsf의 구성을 변화시키는데 중요한 역할을 한다고 보고된 바 있다(Lee et al., Mol. Biol. Cell, 11, 1753~1764, (2000)). 즉, Hsf가 갖고 있는 산화·환원의 변화에 민감한 시스테인 잔기(cysteine residues) 및 과산화물질(oxidants)이 Hsf의 DNA-결합 활성을 억제시킨다는 점에서(Jacquier-Sarlin et al., Biochem. J., 318, 187~193. (1996)), S64의 작용으로 고형암에서 산화·환원의 변화가 Hsf의 활성을 억제시킨다는 것은 본 발명에서 증명하고자 하는 것이다. 또한 본 발명자들은 다양한 세포 시스템에서 S64의 처리에 의한 글루타치온의 생화학적 과정을 연구한 결과, 나프타자린의 다양한 유도체들을 사용한 종래의 연구에서 밝혀진 바와 같이(Song et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., in press, (1999)), 글루타치온 양의 감소는 글루타치온과 S64가 결합을 형성하는 과정에서 시작될 것이라고 가정할 수 있었고, 이것은 글루타치온의 항상성을 일으키는 효소적인 장치의 활성 측면에서 증명할 수 있다(도 6 참조).

따라서, 본 발명자들은 S64를 처리한 저산소 상태의 대장암 세포주인 클론 A를 대상으로 Hsf의 DNA-결합 활성 및 글루타치온의 양을 측정하였다.그 결과, Hsf의 DNA-결합 활성이 현저하게 감소됨을 알 수 있었고(도 4 참조), 글루타치온의 양은 회복되지 않고 계속해서 감소하였다(도 5 참조). 이는 S64의 작용으로 글루타치온의 양을 감소시켜 Hsp70 유전자의 발현을 유도하는 인자인 Hsf의 활성을 억제시킬 수 있는 효과를 보여주는 것이다.

고형암 치료용 조성물

방사선 및 화학적 치료시에 나타나는 저항성 요소들 중에서, Hsp70 유전자, Hsp70 단백질, Hsf 활성 및 글루타치온 양의 측정을 통해 밝혀낸 고형암에 대한 S64의 효과는 중요한 임상적 의미를 가진다. 또한 상기 저항성 요소들은 고형암의 저산소 상태의 종양에서 더 큰 저항성을 유발하기 때문에, S64가 고형암에서 저항성 요소들을 억제시킬 수 있는 중요한 역할을 지니고 있는 것이다. 따라서, 본 발명은 활성 성분으로서 나프타자린 유도체인 S64를 함유함을 특징으로 하는 고형암 치료제 조성물을 제공한다.

S64의 합성은 하기 문헌(Song et al., Arch. Pharm. Med. Chem,, 333, 87~92, (2000))에 공지된 방법으로 실시 할 수 있다. 2-아실-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌[2-acyl-1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene] 유도체에 하이드록실아민(hydroxylamine, H₂NOH)을 처리하여 2-(1-하이드록시이미노알킬)-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌[2-(1-hydroxyiminoalkyl)-1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene] 유도체를 제조한 후, 2-(1-하이드록시이미노알킬)-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌 유도체의 옥심(oxime) 그룹을 프로필화(propylated)하여 2-(1-프로필옥시이미노알킬)-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌[2-(1-propyloxyiminoalkyl)-1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene] 유도체를 제조한다. 상기와 같이 제조된 2-(1-프로필옥시이미노알킬)-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌 유도체를 삼산화 크롬(Chromium trioxide, CrO₃)으로 산화시켜 6-(1-프로필옥시이미노알킬)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논[2-(1-propyloxyiminoalkyl)-5,8-dimethoxy-1,4-naphthoquinone] 유도체를 얻을 수 있고, 이를 이용하여 알킬기 중 도데실기를 가진 나프타자린 유도체인 S64를 수득할 수 있다.

본 발명에 있어서,“고형암”이란 덩어리로 이루어진 암을 의미하며, 이들로 한정되는 것은 아니지만 다음과 같은 여러 고형암을 치료하는데 본 발명의 조성물은 유용하다: 방광, 유방, 장, 신장, 간, 폐(소세포폐암 포함), 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 경부, 갑상선, 전립선 및 피부(편평상피 세포 암종 포함)와 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포증, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포종, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양, 바람직하게는 폐암, 뇌암, 유방암, 난소암 및 대장암을 치료하는데 유용하며, 특히 바람직하게는 대장암을 치료하는데 유용하다.

본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명은 활성 성분으로서 S64를 약제학적으로 유효한 양으로 이를 허용되는 담체와 함께 함유한 고형암 치료제 조성물을 제공한다.

본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 유효한 양"이라 함은 고형암에 대해 개선 또는 치료효과를 나타내는 활성성분의 양을 의미한다. 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 활성 성분을 수송하는 역할을 하는 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제 또는 용매와 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다.

본 발명의 조성물에서 활성 성분인 S64의 치료 유효량은 환자의 연령, 성별, 피부조건, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 일반적으로 약 0.0001 내지 1중량%, 바람직하게는 약 0.001 내지 0.1중량%이다.

본 발명에 있어서, 상기의 활성 성분을 함유한 조성물의 치료 유효량은 환자의 연령, 성별, 적용부위, 투여회수, 투여시간, 제형, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있지만, 주사제의 경우 일반적으로 50 내지 200㎎, 바람직하게는 100 내지 150㎎을 1일 3회 투여하고, 경구 투여제의 경우 일반적으로 250 내지 1,000㎎, 바람직하게는 300 내지 500㎎을 1일 3회 투여한다.

본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 방사선 요법 또는 화학 요법(세포성장정지 또는 세포독성 물질, 항생물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제(예를 들면, COX-2 억제제), 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 테로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합제, 토포이소머라제 I 억제제, 토포이소머라제 II 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 리포좀 제제내에 임의로 함유된 하나 이상의 화학요법제제(예를 들면, 택산, 택산 유도체, 캡슐화 택산, CPT-11, 캠프토테신 유도체, 안트라사이클린 글리코사이드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 에토포사이드, 나벨바인, 빈블라스틴, 카르보플라틴, 시스플라틴, 에스트라무스틴, 셀레콕시브, 슈겐 SU-5416, 슈겐 SU-6668, 헤르셉틴 등)와 병용하여 투여할 수도 있다.

이러한 조합물을 일정한 용량으로 제형화하는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 제시된 용량 범위내에서 사용하고 다른 약제학적 활성 물질은 승인된 용량 범위 내에서 사용한다. 또한, 본 발명의 조성물은 조합 제제가 부적절할 경우 알려진 항암제와 순차적으로 사용할 수 있다.

상기 활성 성분과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 본 발명의 조성물은 보통 통상적인 방법에 따라 제형화하고 약제학적으로 적합한 형태로 투여한다. 즉, 본 발명의 조성물은 여러 제형, 예를 들면 정제, 캡슐, 당의정 또는 필름 피막 정제, 액제 또는 현탁제의 경구 형태, 근육내, 정맥내 및/또는 척수강내 및/또는 척수내 주사 또는 주입의 비경구 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 조성물을 경구용 고형제로 제형화하는 경우, 활성 성분과 함께 희석제(예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 자당, 셀룰로즈, 옥수수 전분 또는 감자 전분), 활탁제(예를 들면, 실리카, 탈크, 스테아린산, 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트 및/또는 폴리에틸렌 글리콜), 결합제(예를 들면, 전분, 아라빅검, 젤라틴 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 피롤리돈), 붕해제(예를 들면, 전분, 알긴산, 알기네이트 또는 나트륨 전분 글리콜레이트), 포르말 혼합물, 염료, 감미제, 습윤제(예를 들면, 레시틴, 폴리솔베이트, 라우릴설페이트) 및 일반적으로 약제에 사용되는 약물학적 불활성 물질을 함유할 수 있다. 이들 약제는 공지된 방법, 예를 들면 혼합, 과립화, 타정, 당의 또는 필름-피복 공정의 수단에 의해 제조할 수 있다.

또한, 시럽, 유화액 및 현탁액 등의 경구 투여용 액체 분산액으로 제형화하는 경우, 활성 성분과 함께 천연 검, 한천, 나트륨 알기네이트, 펙틴, 메틸셀룰로즈, 카르복시메틸셀룰로즈 또는 폴리비닐 알코올을 함유할 수 있다.

또한, 근육내 주사를 위한 현탁액 또는 용액으로 제형화하는 경우, 활성 성분과 함께 멸균수, 올리브유, 에틸 올레에이트, 글리콜(예를 들면, 프로필렌 글리콜) 및 필요한 경우 적합한 양의 리도카인 하이드로클로라이드를 함유할 수 있다.

또한, 정맥내 주사 또는 주입용 용액으로 제형화하는 경우, 활성 성분과 함께 멸균수를 함유하거나 바람직하게는 멸균, 수성, 등장성 염수 용액의 형태일 수 있거나 담체 프로필렌 글리콜을 함유할 수 있다.

본 발명은 하기 실험예 및 제형 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실험예 및 제형 실시예는 단지 본 발명의 구현예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

<실험예 1>

⑴S64의 합성

본 발명의 활성 성분인 S64는 하기 문헌(Song et al., Arch. Pharm. Med. Chem,, 333, 87~92, (2000))에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 쓰인 시약들은 Sigma 제품(St. Louis, MO, U.S.A.)을 사용하였다.

S64의 합성방법은 다음과 같다. 2-아실-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌 10mM 및 내 하이드록실아민(hydroxylamine, H₂NOH) 14mM을 함유한 에탄올 80㎖에 피리미딘(pyridine) 1.1㎖을 첨가하였다. 이 혼합용액을 10시간동안 상온에서 잘 섞으면서 반응시킨 다음 실리카 겔(silica gel) 컬럼(column)을 이용한 크로마토그래피(chromatograph) 방법으로 정제한 후, 실리카 겔에 50%의 에틸 아세트산(ethyl acetate)이 용해된 n-핵산(n-Hexane)을 처리하여 2-(1-하이드록시이미노알킬)-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌 유도체를 추출하였다.

상기에서 추출된 유도체 10mM 및 NaH 15mM을 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 50㎖에 용해시키고, 이에 프로필브로마이드(propylbromide) 11mM을 첨가하여 10시간 동안 반응시켰다. 상기 반응 혼합액을 실리카 겔(silica gel) 컬럼(column)을 이용하여 크로마토그래피(chromatograph) 방법으로 정제하여 2-(1-프로필옥시이미노알킬)-1,4,5,8-테트라메톡시나프탈렌 유도체를 추출하였다. 상기의 2-(1-프로필옥시이미노알킬)-1,4,9,10-테트라메톡시나프탈렌 유도체를 삼산화 크롬(Chromium trioxide,CrO₃)으로 산화시켜 6-(1-프로필옥시이미노알킬)-5,8-디메톡시-1,4-나프토퀴논 유도체를 제조하였다. 이 유도체 중 알킬기가 도데실기인 것을 수득하여 본 발명에 사용하였다.

(2)세포주의 배양

대장암 세포주인 사람 클론 A를 다음과 같이 배양하였다. 10% 소 태아 혈청(fetal calf serum)을 포함하는 RPMI 1640(GIBCO-BRL, Richmond, U.S.A.)배지에 37℃, 5% CO₂및 95% 공기(air) 상태로 상기 세포주를 배양기안에서 48시간 배양하였다.

⑶세포의 저산소 상태의 처리

⑵에서 배양한 세포의 배양 배지를 37℃의 저산소실(hypoxic chamber)에서 저산소 상태로 만들기 3 내지 5시간 전에 신선한 배지로 교체한 후, 산소를 제거한 RPMI 1640 배지를 3번 교환함으로서 산소를 박탈시켰다. 그 후, 배지에 37℃, 5% C0₂, 85% N₂및 10% H₂를 포함하는 저산소성 혼합기체를 공급하여 평형상태(혐기성 상태)로 만들어 준다. 저산소실 및 배지 안의 산소 농도는 산소표시기(Forma Scientific, Marietta, U.S.A.)로 측정하였고, 산소 농도는 0.05% 이하로 유지시켰다. 그 후, 저산소 상태로 처리한 세포를 경과시간(0.5시간, 1.5시간, 2시간, 3시간, 8시간 및 16시간)에 따라 각각 수집한 후 -70℃ 초저온 냉동고에 보관한다.대조군으로서 정상산소 상태의 세포는 5% C0₂, 95% 공기(air) 상태로 37℃의 배양기에서 배양시켰다. 배양은 70 내지 80%의 단층 배양하여 수행하였고, 실험의 지속을 위해 배지의 pH는 7.0 내지 7.4로 하였다.

⑶세포의 S64의 처리

⑴에서 합성한 S64를 10㎍/㎖로 처리하여 배지를 만든 후, 이를 ⑵에서 배양한 세포가 저산소 상태로 되기 6시간 전에 처리하고 저산소 상태 동안 같은 농도로 유지시켰다. 그 후, 배지에 0.1% 이하 농도의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 S64를 용해시켰다. 대조군으로서, ⑵에서 배양한 세포를 정상산소 상태로 배양하기 전에 상기와 같은 방법으로 S64를 처리하였다. 그 후, S64를 처리한 저산소 상태 및 정상산소 상태의 세포를 경과시간(0.5시간, 1.5시간, 2시간, 8시간 및 16시간)에 따라 각각 수집한 후 -70℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.

⑷총 단백질 합성 속도의 측정

저산소 상태의 지속정도를 결정하기 위해, 총 단백질 합성 속도는 저산소 상태를 처리한 시간에 따라 측정하였다. ⑶에서 배양한 세포를 37℃, 30분 동안 [³⁵S]메티오닌(methionine)(특이적 활성 ＞ 140 Ci/mM, Amersham, Buckinghamshire, England)을 포함하는 배지에 노출시켰다. 단백질 합성 속도는 방사선활성/㎍ 단백질/분(radioactivity/㎍ protein/min)으로 계산하였다. 4시간 정도 저산소 상태에노출된 세포의 단백질 합성 속도는 정상산소 상태의 세포를 100%로 보았을 때 약 30 내지 40%였다.

<실험예 2>

⑴세포의 용해

실시예 1에서 수득한 세포들을 각각 용해 완충액(lysis buffer)을 가하고 동결/해동을 5번 반복하여 용해시켰다. 사용된 용해 완충액의 조성은 50 mM 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES)-NaOH(pH 6.0), 100 mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1㎍/㎖ 루펩틴(leupeptin), 10mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)이며, 아르곤 가스로 1시간 버블링(bubbling)하여 산소를 제거한 후 세포에 가했다. 반응 후 20 mM의 β-머캅토에탄올을 가하여 반응을 중지시켰다.

⑵웨스턴 블럿 분석

상기에서 추출한 시료를 원심분리(4℃, 12000rpm, 10분)하여 취 한 상등액을 단백질 정량하고(Lowry et al., J. Biol. Chem. 193, 265~275, (1951)), 단백질을 5㎕ 취하여 13% SDS-PAGE(Laemmli, 1970)하고 쿠마시 블루(coomassie blue)용액으로 염색, 탈색 및 건조하여 단백질 분리를 확인하였다. 또한, 상기와 동일한 양의 단백질을 취하여 13% SDS-PAGE하고 트렌스-블럿 기구(BioRad, Richmond,U.S.A.)를 사용하여 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막으로 단백질을 옮겼다. 단백질이 옮겨진 니트로셀룰로오스 막을 1% 소 혈청 알부민이 포함된 TBST[TBS(tris-buffered saline)-Tween 20]용액으로 1시간동안 블로킹시키고, 블로킹을 위해 사용된 용액을 제거하고 TBST 용액으로 막을 3회에 걸쳐 10분 간격으로 세척하였다. TBST 용액을 이용하여 적당한 농도로 희석시킨 Hsp70 단백질에 대한 항체를 4℃에서 1시간 처리하여 막에 옮겨진 Hsp70 단백질에 결합하도록 하였다. Hsp70 단백질의 발현을 확인하기 위해 단백질과 결합시킨 항체로서 C92F3A-5(StressGen, Canada)을 사용하였고, β-actin(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.)을 대조군으로 사용하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 TBST 용액으로 막을 3회에 걸쳐 10분 간격으로 세척하였다. 항원-항체 반응이 일어난 것을 확인하기 위해 항체와 결합하는 이차항체로 호스래디쉬 퍼록시다아제(horseradish peroxidase)가 결합된 항-토끼 IgG를 처리하여 1시간 동안 반응시키고 TBST 용액으로 3회에 걸쳐 10분 간격으로 세척하였다. 그런 다음, TBS 용액으로 10분 동안 마지막 세척하였다. 세척한 막을 ECL 시스템(Amersham, Buckinghamshire, England)을 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

⑶세포로부터 RNA의 분리

실험예 1에서 수득한 세포들로부터 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA의 분리는 변형된 싱글 스텝 구아니듐 이소티오시안 산 분석(single step guanidium isothiocyanate lysis) 방법에 의해 추출하였다(Chomczynski et al., Anal.Biochem., 162, 156~159, 1987).

실험예 1에서 수득한 세포들로부터 트리졸(TRIzol, GIBCO-BRL Grand Island, NY, USA) 방법을 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 이때 사용한 모든 용액은 0.1% 디에틸피로카보네이트 처리수(diethyl pryrocarbonate-treated water , DEPC-dH₂O)로 RNA분해효소 활성(RNase activity)을 저해하기 위해 처리하였다. 상기 실험예 1에서 각 조건하에서 배양된 대장암 세포들을 PBS로 완전하게 세척한 다음 1㎖의 TRIzol/1x10⁶cells 시약을 첨가하여 피핏팅하여 세포를 분쇄하였다. 얼음에서 20분간 방치 후, 분쇄물을 4℃에서 14,000rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 상층액에 200㎕의 클로로포름을 첨가하고 15초 동안 볼텍싱(vortexing)하여 섞어 주고 이를 3회 반복하였다. 얼음에서 20분간 방치 후, 혼합물을 4℃에서 14,000 rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 새 튜브에 상층액만 따서 동량의 페놀/클로로포름, 0.2M 아세트산 나트륨(pH 5.2)을 첨가하여 5초 동안 섞어 주고 이를 3회 반복하였다. 얼음에서 20분간 방치 후, 혼합물을 4℃에서 14,000rpm으로 15분간 원심분리 하였다. 상층액과 동일 양의 이소프로판올을 첨가하여 혼합하고, -70℃에서 1 내지 12시간 보관한 후, 4℃에서 14,000rpm으로 10분간 원심분리 하여 총 RNA를 획득하였다. RNA 펠렛을 DEPC-dH₂O 처리된 1㎖의 75% 에탄올로 씻어준 다음 건조시키고, DEPC-dH2O로 재 균질화 시킨 뒤 -70℃에서 보관하였다. RNA 농도는 동일한 조건 하에서 260㎚(RNA;1 OD 260 = 40 ㎍ of RNA/㎖)와 280㎚의 흡광도를 측정하였다. 1% TAE 아가로스 겔에 1㎕을 러닝(running)하였다.

⑷역전사연쇄중합반응(RT-PCR) 분석

상기에서 추출한 RNA를 역전사연쇄중합반응시켜 Hsp70 유전자를 동정하였다. RNA 1㎍에 10X 랜덤 핵사머(random hexamer) 1㎕를 넣고, 20 ㎕이 되도록 DEPC-처리수를 첨가한 후, 70℃에서 10분간 반응시키고, 곧바로 얼음으로 냉각시켰다. 상기 시료에 5X 초기 가닥 완충액(first strand buffer) 4㎕, 100mM DTT(dithiothreitol), 10mM dNTP 혼합액 4㎕, 0.2㎕ MMLV(Molomey murine leukemia virus) 역전사 효소를 넣어 잘 섞어주고 원심 분리한 후 37℃, 1시간 30분 반응시킨 다음 65℃에서 10분간 배양하여 잔류 단백질을 불활성 시켰다. 여기에 증류수를 30㎕을 넣어서 다음 사용 할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 이렇게 해서 만들어진 역전사 반응 혼합액 2㎕에 Hsp70 및 대조군으로 사용된 β-actin 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍(각각 200pmol, 하기 표 1참조) 0.5㎕, 1.25mM dNTP 1.6㎕, 10X 완충용액[(10mM 트리스(Tris), pH 8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.01% 젤라틴(gelatin)] 2㎕, AmpliTaq DNA polymerase(TaKaRa, 5U/㎕)] 0.1㎕ 및 나머지는 증류수로 20㎕가 되도록 첨가한 후, 증폭은 PerkinElmer thermal cycler로 수행하였다 (PerkinElmer, Norwalk, U.S.A). 증폭된 생성물은 1.5% 아가로스 겔에서 전기영동하여 분리하고, 에티디움 브로마이드(Ethidium bromide)로 염색하여 자외선(UV) 조명 하에 촬영하였다.

Hsp70 및 β-actin 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍

유전자	위치	염기서열	서열번호
Hsp70	833-5801452-1435	5'-GATCGTCTAGATGGGGATACCTTCTTAGC-3'5'-GATCGGAATTCCAGTAGAGAATACCTGGC-3'	12
β-actin	226-243843-826	5'-GATCGTCTAGATTCCTATGTGGGCGACGA-3'5'-GATCGGAATTCCAGCGGAACCGCTCATTG-3'	34

⑸핵 추출물과 겔 시프트(gel shift) 분석

실험예 1에서 수득한 세포로부터 핵 추출물을 얻기 위해 세포를 PBS(phosphate-buffered saline)로 닦아주고, 완충액[(10mM HEPES(hemi-sodium salt), pH 7.9, 1.5mM MgCl₂)] 1㎖을 넣어 다시 퍼트렸다. 세포는 15분 동안 얼음에서 유지시킨 후, 원심분리(4℃, 3000g, 30분)하여 침전물을 취함으로서 핵을 얻었다. 침전물은 200㎕ 완충액[(30mM HEPES, pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 0.2mM DTT, 1mM PMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌, 1㎍/㎖ 루펩틴, 500mM KCl, 10% 글리세롤(glycerol)]으로 풀어주어 얼음에서 30분 동안 유지시킨 후, 원심분리(4℃, 12000g, 15분)하였다. 상층액은 핵 추출물로서 회수하였으며, 단백질 정량은 Lowry 방법을 사용하였다(Lowry et al., J. Biol. Chem., 193, 265~275, (1951)).

겔 시프트 분석을 위해 10㎍의 핵 추출 단백질은 결합 완충액[(30mM HEPES, pH 7.9, 1.5mM MgCl2, 0.2mM DTT, 1mM PMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌, 1㎍/㎖ 레우펩틴, 500mM KCl, 10% glycerol, 0.5㎍ poly(dI-dC)]과 섞어주었다. Hsf(Mosser et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, 3748~3752, (1990)) 결합 부위가 포함된 이중나선에³²P로 표지된 올리고뉴클레오타이드 약 10,000cpm을 탐침으로 사용하였다.전기 영동은 0.5X TBE가 첨가된 4% 폴리아크릴아미드 겔(40:1)에 차가운 상태로 10V/cm을 걸어주어 수행하였다. 겔을 건조시킨 다음 방사선 자동 사진(autoradiography)을 위해 -70℃에서 밤새도록 노출시켜 이를 사진건판에 대고 감광촬영하였다. 경쟁실험을 위해서, 표지되지 않은 경쟁자 올리고뉴클레오타이드를³²P 표지된 탐침을 첨가하기 10분전에 넣어주었다.

실험예 2에서 실시한 웨스턴 블럿 분석, 역전사연쇄중합 반응 분석 및 겔 시프트 분석을 통해, 저산소 세포 및 S64를 처리한 저산소 세포에서 Hsp70 단백질의 발현, Hsp70의 mRNA 수준 및 열 충격 인자(heat shock factor, Hsf)의 활성 정도를 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4에 나타내었다.

저산소 세포에서 실험한 결과로서, 도 1a로부터 알 수 있는 바와 같이, 경과시간에 따른 저산소 세포에서 Hsp70 단백질이 눈에 띄게 축적된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과가 Hsp70의 mRNA 수준이 증가되어 나타난 것인지를 확인하기 위해서 역전사연쇄중합반응(RT-PCR) 분석을 실시한 결과, 도 1b로부터 알 수 있는 바와 같이, 경과시간에 따른 저산소 세포에서 Hsp70의 mRNA 수준이 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 Hsp70의 mRNA 수준은 Hsf의 활성화로부터 증가되었다고 판단할 수 있다. 따라서, Hsp70 단백질의 축적이 Hsf의 활성에 의한 결과인지 확인하기 위해 겔 시프트 분석을 실시하였다. 그 결과, 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 저산소 세포에서 Hsf의 DNA-결합 활성이 증가됨을 확인할 수 있었다. DNA-결합 활성은 저산소 상태가 시작된 후, 이른 시간대인 0.5시간이 지나서 관찰되었고, 저산소 상태가 시작된 후, 1.5시간이 지나서 대부분의 Hsf 활성이 확인되었다.

한편, S64를 처리한 저산소 세포의 결과로서, 도 3a으로부터 알 수 있는 바와 같이, S64를 처리한 저산소 세포에서 Hsp70 단백질의 축적이 현저하게 감소되었다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3b로부터 알 수 있는 바와 같이, S64를 처리한 저산소 세포에서 Hsp70의 mRNA 수준도 눈에 띄게 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 Hsp70 단백질의 감소가 Hsp70의 mRNA가 감소되는 전사 수준부터 시작되었다는 것으로 판단할 수 있다. 따라서, S64를 처리한 저산소 세포에서 S64가 Hsf의 활성을 방해하는지를 겔 시프트 분석을 통해 확인한 결과, 도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, S64를 처리한 저산소 세포에서 Hsf의 DNA-결합 활성이 현저하게 감소됨을 알 수 있었다. 이는 저산소 세포에서 Hsf의 활성이 대부분 확인되는 반면, S64를 처리한 저산소 세포에서 저산소 상태가 시작된 후, Hsf의 DNA-결합 활성이 억제됨을 알 수 있었다.

<실험예 3>

⑴글루타치온(glutathione)의 측정

실험예 2-⑵의 세포 추출액에서 5% 과염소산(perchloric acid) 추출은 2,4-디니트로플루오로벤젠(2,4-dinitrofluorobenzene)과 유도체를 형성하고, Spherisorb NH₂컬럼(column)을 사용한 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 추출하였다(ISCO, Lincoln, NE, U.S.A.). 글루타치온 산화형및 환원형의 표준물질은 Sigma 제품(St. Louis, MO, U.S.A.)을 사용하였다. 그 밖의 다른 시약들은 분석용 등급 또는 고등급의 제품을 사용하였다. 모든 글루타치온 결정은 세포 추출액의 단백질 함유량으로 일반화하였다. 단백질 정량은 Lowry 방법을 사용하였다.

실험예 2의 결과로부터, 저산소 세포에서 S64가 Hsf의 활성을 억제한다는 효과를 확인하였다. 이와 관련하여, 산화 스트레스에 대한 유전적 반응을 결정하는 조절요소의 하나로서 글루타치온이 중요한 역할을 한다는 점을 이용하여 S64의 효과를 세포내 글루타치온 수준에서 확인하였다. 도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, S64를 처리하지 않은 세포내 글루타치온의 감소는 저산소 상태가 시작된 후, 이른 시간대인 0.5시간이 지나서 관찰되었지만 저산소 상태가 시작된 후, 16시간이 지나서 글루타치온 수준은 본래의 수준보다 약간 더 증가했다. 이와 반대로, S64를 처리한 저산소 세포에서 세포내 글루타치온 수준은 회복되지 않고 계속해서 감소하였다.

⑵γ-GCS(γ-glutamylcysteine synthetase)의 활성 측정

γ-GCS의 활성은 Seelig and Meister의 방법으로 측정하였다(Seelig and Meister, Anal. Biochem., 141, 510~514, 1984).

실험예 2-⑴에서 추출한 각 세포의 단백질 10 ㎍을 150mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH 8.2, 75mM KCl, 25mM MgCl₂, 5mM L-글루타민산(L-glutamate), 10mM 아미노-L-부티르산(amino-L-butyrate), 0.3mM NADH, 0.2mM EDTA, 10mMATP(adenosine triphosphate), 1mM 포스포엔올피루브산(phosphoenolpyruvate), 10 unit/㎖ PK(pyruvate kinase), 10 unit/㎖ LDH(lactate dehydrogenase)로 구성된 반응 혼합액을 첨가하여 배양시킨다. 반응은 포스포엔올피루브산의 첨가로 시작된다. γ-GCS 활성은 NADH 산화속도와 동일하게 나타나는 ADP(adenosine diphosphate) 형성속도를 340nm에서 흡광도 변화를 측정함으로서 결정되었다. 효소 활성의 측정을 위해서 모든 시약들은 Sigma 제품(St. Louis, MO, U.S.A.)을 사용하였다.

실험예 3-⑴의 결과와 관련하여, 본 발명자들은 S64가 단독으로 글루타치온의 합성을 방해하는 것인지를 조사하기 위해 γ-GCS 활성을 측정하였다. 글루타치온의 새로운 합성에서 γ-GCS는 속도결정 효소이다. 따라서, γ-GCS의 활성을 측정한 결과, 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, S64를 처리한 저산소 세포에서 γ-GCS의 활성이 약간 증가하였다. 이러한 결과는 S64를 처리한 세포에서 세포내 글루타치온의 감소가 글루타치온의 새로운 합성을 방해하는 것은 아니다. 즉, S64에 의한 글루타치온의 감소는 다양한 형태의 글루타치온이 S64와 결합을 형성하기 때문이라는 결론을 얻을 수 있었다.

<제형 실시예 1>

주사제

S640.05중량%

10N 수산화나트륨pH7 조정량

멸균수100% 조성량

상기 성분들을 제시된 함량으로 배합하여 바이알(100㎎)에 충진하여 제조하였다.

<제형 실시예 2>

정제

S640.05중량%

락토즈30중량%

마그네슘 스테아레이트5중량%

나트륨 전분 글리콜레이트10중량%

10N 수산화나트륨pH 7 조성량

멸균수100% 조성량

상기 성분들을 제시된 함량으로 혼합하여 30 내지 60℃로 유지하면서 1시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시키고, 통상적인 정제의 제조 방법에 따라 타정하여 조성물 350㎎씩을 함유하는 정제를 제조하였다.

상술한 바와 같이, 활성 성분으로서 나프타자린 유도체인 S64를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 고형암세포에 특이적으로 작용하여 Hsp70 유전자의 발현억제, Hsp70 및/또는 Hsf 단백질의 활성억제 및 글루타치온의 양을 감소시킴으로써 고형암 치료 및 예방에 효과를 나타낸다.

Claims (2)

1. 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 활성 성분으로 약제학적으로 유효한 양의 하기 화학식의 나프타자린 유도체인 S64를 포함하는 것을 특징으로 하는 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 고형암이 폐암, 뇌암, 간암, 유방암, 난소암 및 대장암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 고형암 치료 및 예방용 약제학적 조성물.