KR20040035807A - Ｌｐａ 수용체의 작용제와 길항제 및 사용 방법 - Google Patents

Ｌｐａ 수용체의 작용제와 길항제 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본원에 기재된 화학식 I의 화합물 및 이들 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 또, LPA 수용체의 작용제 또는 길항제로서의 활성을 갖는 이러한 화합물을 사용하는 방법으로서, LPA 수용체 상에서의 LPA 활성 억제, LPA 수용체 활성 변조, 암 치료, 세포 증식 증대, 상처 치료, 세포고사 치료 또는 세포, 조직 또는 기관에서 기능 보존 또는 복구, 세포 배양, 기관 또는 조직 기능 보존 및는 피부학적 병태 치료를 포함하는 방법이 기재된다.

Description

ＬＰＡ 수용체의 작용제와 길항제 및 사용 방법{LPA RECEPTOR AGONISTS AND ANTAGONISTS AND METHODS OF USE}
형질전환되지 않은 모든 세포는 그들의 생존 및 증식을 위해 성장 인자를 필요로 한다. 폴리펩티드 성장 인자 이외에, 성장 인자 유사 특성을 보유하는 최근 출현한 부류의 지질이 발견되었으며, 이들은 총괄하여 인지질 성장 인자(PLGF; Phospholipid growth factor)라 공지되어 있다. 대부분의 정지 세포의 증식 유도에서 그들의 유사한 약리학적 활성에도 불구하고(Jalink 등, 1994a; Tokumura, 1995;Moolenaar 등, 1997), PLGF는 구조적으로 2개의 넓은 카테고리로 하위 분할할 수 있다. 첫번째 카테고리는 글리세롤 백본을 보유하는 글리세로인지질 매개자(GPM)를 함유한다. GPM의 예로는 LPA, 포스파티드산(PA), 환식 포스파티드산(환식-PA), 알케닐 글리세롤 포스페이트(알케닐-GP) 및 라이소포스파티딜 세린(LPS)을 들 수 있다. 두번째 카테고리는 스핑고이드 베이스 모티프를 보유하는 스핑고지질 매개자(SPM)를 함유한다. SPM의 예로는 스핑고신-1-포스페이트(SPP), 디히드로스핑고신-1-포스페이트, 스핑코실포스포릴콜린(SPC) 및 스핑고신(SPH)을 들 수 있다.
LPA(Tigyi 등, 1991; Tigyi 및 Miledi, 1992), PA(Myher 등, 1989), 알케닐-GP(Liliom 등, 1998), 환식-PA(Kobayashi 등, 1999), SPP(Yatomi 등, 1995) 및 SPC(Tigyi 등, 2000)는 혈청에서 검출되어 왔다. 이들 지질 매개자는 동정되었고 그 특성 또한 규명되어 왔다. 혈청 및 혈장 내에는 성장 인자 유사 특성을 나타내는 아직 알려지지 않은 PLGF가 존재한다(Tigyi 및 Miledi, 1992). LPA(농도 약 20 μM)는 혈청내에 존재하는 가장 풍부한 PLGF이다(Tigyi 및 Miledi, 1992; Jalink 등, 1993).
진핵 세포에서, LPA는 소포체(ER) 막에서 주로 일어나는 인지질 생합성 초기 단계의 중요한 중간체이다(Bosch, 1974; Bishop 및 Bell, 1988). ER에서, LPA는 글리세롤-3-포스페이트에 대한 아실-CoA의 작용으로부터 유도되는데, 이는 더 아실화되어 PA를 형성한다. LPA의 PA로의 아실화 속도는 매우 빠르기 때문에, 생합성 부위에 LPA는 거의 축적되지 않는다(Bosch, 1974). LPA는 ER에 한정되기 때문에, 대사 중간체로서의 그의 역할은 신호전달 물질로서의 그의 역할과는 거의 무관하다고볼 수 있다.
LPA는 혈청의 구성성분이며, 그의 레벨은 낮은 마이크로몰(μM) 범위이다(Eicholtz 등, 1993). 이 레벨은 예측되는데, 그 이유는 LPA가 응집 과정중에 활성화된 혈소판으로부터 방출되기 때문이다(Tigyi 및 Miledi, 1992; Eicholtz 등, 1993). 혈청중에 존재하는 LPA는 알부민에 결합되며, 전혈장 대부분의 열 안정성 비투석성 생물학적 활성에 기여한다(Moolenaar, 1994). 제노퍼스 난모세포에서 내향성 클로라이드 전류(chloride-currents)를 유발하는 데 기여하는 활성 혈청 성분은 LPA(18:0)으로 동정되었다(Tigyi 및 Miledi, 1992). 대형 알부민 결합된 LPA(18:0)는 라이소-PC에 대한 라이소포스포리파제 D(PLD)의 작용에 의해서라기 보다는 응집 과정 중에 생성된다. 후자의 경로는 헤파린 또는 시트레이트 + 덱스트로즈의 작용에 의해 응집되지 않은 '노화된' 혈장내 LPA의 존재에 기여한다(Tokumura 등, 1986). 지적하고 싶은 다른 관점은 LPA가 EDTA로 처리한 혈장 내에 존재하지 않는다는 것이다. 이러한 사실은 혈장 라이소포스포리파제가 Ca2+-의존성일 수 있음을 암시하는 것이다(Tokumura 등, 1986).
알부민의 역할은 혈청 내에 존재하는 포스포리파제의 작용으로부터 LPA를 보호하는 것이다(Tigyi 및 Miledi, 1992). Tigyi 및 Miledi는 알부민이 혈류 내에서 LPA의 담체로서 작용할 뿐만 아니라, 그의 생리학적 반감기를 증가시킨다고 제안하였다. 혈장 알부민 중에서는 제노퍼스(Xenopus) 난모세포 내에서 클로라이드 전류를 유발함에 있어서 LPA의 작용을 모방하는 아직 동정되지 않은 지질 매개자가 존재한다.
LPA-반응성 세포 유형은 점균 아메바 및 제노퍼스 난모세포로부터 포유동물 체세포까지 확장된다. 따라서, LPA 소스 및 그의 방출은 단지 활성화된 혈소판에 국한되지는 않을 수 있는 것으로 생각된다. 최근 실험 결과로부터 밝혀진 바와 같이, 펩티드 성자 인자에 의한 자극시, 포유동물 섬유아세포는 LPA를 신속하게 생성하며, 이는 후속적으로 세포외 매질로 방출된다(Fukami 및 Takenawa, 1992).
알려지지 않은 세포에서 기원한 비교적 많은 양의 생활성 LPA가 난소암 환자의 복수에 존재한다는 증거(Xu 등, 1995), 상기 환자로부터 유래한 복수는 난소암 세포에 대한 강력한 활성을 보유한다는 증거(Mills 등, 1988; Mills 등, 1990)가 존재한다. 상기 생활성 LPA가 종양 세포로부터 세포외 유체로 분비된다거나, 백혈구에 의해 분비된다거나 또는 여러가지 포스포리파제의 작용에 의해 더 복잡한 지질로부터 생성된다거나 하는 점은 아직 미제로 남아있다.
GPM 및 SPM은 계통수(phylogenetic tree)에 걸치는 매우 다양한 세포성 반응을 유발한다(Jalink 등, 1993a). LPA는 뉴런 세포(Jalink 등, 1993; Durieux 등, 1992), 혈소판 세포, 정상 세포 뿐만 아니라 형질전환된 섬유아세포(Jalink 등, 1990), 내피 세포(van Corven 등, 1989; Moolenaar, 1991) 및 제노퍼스 난모세포(Tigyi 및 Miledi, 1992; Durieux 등, 1992; Fernhout 등, 1992)와 같은 여러가지 세포 내의 내세포성 저장물(store)로부터 유래하는 일시적인 Ca2+신호를 유도한다. LPA는 혈소판 응집을 유도하며(Schumacher 등, 1979; Tokumura 등, 1981; Gerrard 등, 1979; Simon 등, 1982), 평활근 수축을 유도하며(Tokumura 등, 1980; Tokumura 등, 1994), 정맥내 투여시 혈압의 종 의존성 변화를유도한다(Schumacher 등, 1979; Tokumura 등, 1978).
LPA를 정지 섬유아세포에 첨가하는 경우, LPA는 DNA 합성 및 세포 분열을 촉진시킨다(van Corven 등, 1989; van Corven 등, 1992). LPA의 성장 유사 효과는 펩티드 성장 인자의 존재를 필요로 하지 않는다. 이러한 관찰로부터 확인할 수 있는 것은 LPA가 세포 증식을 억제하는 인슐린 또는 상피성 성장 인자(Moolenaar, 1991)의 존재를 필요로 하는 엔도텔린 또는 바소프레신과 다르다는 것이다. 강조하고 싶은 점은 Sp2골수종 세포에서, LPA는 cAMP 레벨 증가에 의해 매개되는 항분열촉진성 반응에 기여한다는 것이다(Tigyi 등, 1994; Fischer 등, 1998). 분열촉진성 경로와는 달리, 항분열촉진성 경로는 페르투시스 독소(PTX)에 의해 영향받지 않는다. 또한, 포르스콜린 및 이소부틸 메틸 잔틴의 첨가시, Sp2골수종 세포 내에서 LPA의 항분열촉진성 작용은 부가적이다(Tigyi 등, 1994). 여러 세포 유형에서, LPA는 섬유아세포에서 국소 부착 및 스트레스 섬유의 형성을 포함하는 세포골격의 변화를 유발한다(Ridley 및 Hall, 1992). 또한, LPA는 성장하는 신경돌기의 수축을 유도함으로써 신경아세포종 분화의 역전 및 억제를 촉진한다(Jalink 등, 1994a; Jalink 등, 1994b). 나노몰(nmol)의 LPA를 혈청-기아 N1E-115 신경아세포종 세포에 첨가하면 즉각적인 신경돌기 수축이 일어나며, 이는 신속하나 일시적인 세포체의 라운딩화를 수반한다(Jalink 등, 1993b). LPA가 계속 존재하는 경우, 신경아세포종 세포는 그들의 미분화된 표현형을 유지하나, 유사분열을 수행하지는 않는다(Jalink 등, 1993b). 추가 인자, 예를 들어 인슐린 유사 성장 인자는 세포 주기의 진행을 위해필요하다. 일단 세포가 형태학적 분화를 수행하면, LPA의 첨가는 이 형태학적 변화를 역전시킨다. 따라서, LPA 유도된 신경돌기 수축은 기저(substratum)에 대한 접착 상실에 기인하는 것이라기 보다는 액틴-세포골격의 수축에 기인하는 것이다(Jalink 등, 1993b; Jalink 등, 1994b).
다른 생리학적 주화성제(예를 들어, 인터류킨-8)와 유사한 LPA는 인간 단핵구에서 주촉성 메카니즘에 의해 세포 이동을 유도한다(Zhou 등, 1995). 세포 이동의 유도 이외에, LPA는 중피 세포의 단층 내로 간암 및 암종 세포의 침입을 촉진한다(Imamura 등, 1993). 상기 침입의 기초 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았으나, 증강된 세포 이동성 및 증가된 세포 접착에 기인하는 것일 수 있다. 최종적으로, LPA는 신생아 심근 세포 세포고사를 차단하는 것으로 알려져 있다(Umansky 등, 1997).
독특한 천연 인지질, 즉 환식-PA는 세포 유형에 따라 GPM과 유사하거나 반대되는 세포 작용에 기여하는 것으로 확인되었다. 제노퍼스 난모세포에 대해 테스트하는 경우, 이는 다른 GPM과 꽤 유사하게 클로라이드 전류를 유발하나; 그의 반응은 LPA에 의해 탈감작되지 않는다(Fischer 등, 1998). Murakami-Murofushi 등(1993)으로부터 확인된 바와 같이, 환식-PA는 증식을 유도하는 LPA와는 달리 항증식 작용을 나타냈다.
PLGF 수용체(PLGFR)는 7-경막(7 TM) 구아닌 뉴클레오티드-결합 조절 단백질(G 단백질)-커플링된 수용체(GPCR) 수퍼훼밀리에 속한다. 7 TM GPCR은 이종삼량체성 G 단백질과의 상호작용을 통해 그들의 세포성 반응을 매개하는 세포 표면 수용체의 훼밀리이다. EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24를 포함하는 다수의 LPA 수용체가 동정되었다. 이들 LPA 수용체 및 기타 수용체의 관련성을 나타내는 계통수는 도 1에 도시하였다.
1996년에, Hecht 등은 차등 하이브리드화 기법을 이용하여 마우스 신피질 세포주로부터 추정적인 세르펜틴 수용체를 코딩하는 cDNA를 클로닝하였다(Hecht 등, 1996). 상기 유전자는 심실 영역 유전자-1(Vzg-1)이라 칭한다. 상기 유전자는 신피질 신경인성 영역 내에서 발현되며, 분자량 41 kDa(364 아미노산)의 단백질을 코딩한다. Vzg-1은 내피 분화 유전자-2(EDG-2)라 칭하는 미공개 양 서열(unpublished sheep sequence)와 매우 유사하다. 또한, 동일한 cDNA가 마우스 및 소 라이브러리로부터 고아(orphan) 수용체로서 분리되었으며, recl.3으로 공지되어 있다(Macrae 등, 1996). 이는 마우스 조직에 널리 분포되어 있는데, 특히 뇌와 심장에서 높게 발현된다.
1996년에, Guo 등은 PCR 기초한 프로토콜을 이용하여 제노퍼스 난모세포로부터 다른 추정적인 LPA 수용체 PSP-24(327 아미노산)를 분리하였다(Guo 등, 1996). 이 수용체는 Vzg-1/EDG-2/recl.3과 거의 유사하지 않은 것으로 확인되었다(Guo 등, 1996). EDG-2 인간 LPA 수용체의 cDNA 서열을 이용하여 스핑고지질 수용체에 대한 서열 기초한 조사를 통해 서로 밀접하게 관련된 2개의 GPCR, 즉 래트 H218(EDG-5, 354 아미노산) 및 EDG-3(378 아미노산)이 유도되었다(An 등, 1997a). 노던 분석을 통해 심장 조직에서 EDG-3 및 EDG-5를 코딩하는 mRNA가 높게 발현되는 것을 확인하였다.
LPA에 대한 기능적인 수용체로서 EDG-2의 최근 동정은 An 등이 LPA 수용체의신규 아형에 대한 서열 기초한 조사를 수행하도록 촉구하였다(An 등, 1998a). GPCR을 코딩하는 인간 cDNA가 발견되었으며, EDG-4로 명명하였다(An 등, 1998a). 노던 블롯 분석을 통해 확인한 바와 같이, EDG-2 및 EDG-4는 둘 다 GPM 수용체로서 기능함에도 불구하고, 그들의 조직 분포는 매우 상이하였다. EDG-2와는 달리, EDG-4는 일차적으로 말초 혈액 백혈구 및 고환에서 발현되었다(An 등, 1998a).
인간 주르카트 T 세포로부터 유래한 cDNA의 PCR 증폭으로 EDG 훼밀리에 속하는 이전에 미지였던 GPCR을 동정하여다. 동정된 GPCR은 EDG-7로 명명하였다. 그의 분자량은 40 kDa(353 아미노산)이었다. 인간 조직에서 EDG-7의 노던 블롯 분석으로 확인한 바와 같이, 이는 심장, 췌장, 전립선 및 고환에서 발현되었다(Bandoh 등, 1999). 따라서, 두가지의 명백한 PLGF 수용체 훼밀리, 즉 PSP24 및 EDG가 존재하며; 전체적으로 10개의 개별적인 PLGFR이 존재한다(도 1). 목록은 계속 증가되고 있다.
이들 여러가지 수용체는 GPM 또는 SPM에 대한 그들의 리단드 특이성에 기초하여 분류할 수 있는데, 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.
인지질 성장 인자 수용체, 길이 및 주요 리간드
PLGFR 아미노산의 수 주요 리간드
EDG-1 381 SPP
EDG-2 364 LPA
EDG-3 378 SPP
EDG-4 382 LPA
EDG-5 354 SPP
EDG-6 385 SPP
EDG-7 353 LPA
EDG-8 400 SPP
제노퍼스 PSP24 372 LPA
쥐과동물 PSP24 373 LPA
제노퍼스 PSP24 및 쥐과동물에서 발현된 PSP24는 특이적으로 GPM(LPA, Fischer 등, 1998) 촉발된 진동성 클로라이드 전류를 특이적으로 변환시킨다. 이들은 EDG 훼밀리와 구조적으로 일치하진 않는다(Tigyi 및 Miledi, 1992; Fernhout 등, 1992). EDG 훼밀리는 2개의 현저한 하위 그룹으로 나눌 수 있다. 첫번째 군은 EDG-2, EDG-4 및 EDG-7을 포함하며, 이들은 단지 GPM에 대한 수용체로서 기능하며(Hecht 등, 1996; An 등, 1998a; Bandoh 등, 1999; An 등, 1998b), 리간드 결합에 반응하여 다수의 신호를 전달한다. 두번째 군은 EDG-1, EDG-3, EDG-5, EDG-6 및 EDG-8을 포함하며, SPM에 특이적이다(An 등, 1997a; Im 등, 2000; van Brocklyn 등, 1998; van Brocklyn 등, 2000; Spiegel 및 Milstein, 2000). 여러가지 PLGFR의 원칙적인 조직 발현은 하기 표 2에 나타냈다.
인지질 성장 인자 수용체의 인간 조직 발현
PLGFR 최대 발현 인간 조직
EDG-1 편재
EDG-2 심혈관, CNS, 생식선 조직, GI
EDG-3 심혈관, 백혈구
EDG-4 백혈구, 고환
EDG-5 심혈관, CNS, 생식선 조직, 태반
EDG-6 림프양, 조혈 조직
EDG-7 심장, 췌장, 전립선, 고환
EDG-8 뇌
PSP24 CNS
PLGF는 다수의 G-단백질-매개된 신호 전달 현상을 활성화시킨다. 이들 과정은 이종삼량체성 G-단백질 훼밀리 Gq/11, Gi/0및 G12/13을 통해 매개된다(Moolenaar,1997; Spiegel 및 Milstein, 1995; Gohla 등, 1998).
Gq/11경로는 포스포리파제 C(PLC) 활성화에 기여하는데, 이는 여러 세포에서 Ca2+의 후속 고정화를 이용하여 이노시톨 트리포스페이트(IP3) 생성을 유도한다(Tokumura, 1995). 몇몇 세포에서, 이 반응은 PTX-민감성인데, 이는 다수의 PTX-민감성 경로 및 비민감성 경로가 연루됨을 의미하는 것이다(Tigyi 등, 1996). 또한, 이 경로는 단백질 키나제 C(PKC)의 디아실 글리세롤(DAG)-매개된 활성화에 기연하다. PKC는 세포성 포스포리파제 D(PLD)를 활성화시키는데, 이는 포스파티딜 콜린을 유리 콜린과 PA로 가수분해하는데 기여한다(van der Bend 등, 1992a). 또한, PLC는 몇몇 세포 유형에서 PKC의 DAG 활성화에 의해 또는 직접적으로 MAP 키나제를 활성화시킬 수 있다(Ghosh 등, 1997).
분열촉진성 신호전달 경로는 G-단백질 이종삼량체성 Gi/0서브유닛을 통해 매개된다. 형질감염 연구를 통해 확인된 바와 같이, αi 서브유닛 보다는 오히려 Giβγ이량체가 Ras-MAP 키나제 활성화에 기여한다. Ras의 활성화는 수용체 티로신 키나제(RTK), 예를 들어 EGF(Cunnick 등, 1998) 또는 PDGF 수용체(Herrlich 등, 1998)의 트랜스활성화(transactivation)에 의해 진행된다. 트랜스활성화된 RTKS는 Ras를 활성화시키는데, 이는 Raf에 의해 MAP 키나제의 활성화를 유도한다. PTX-민감성인 Giα서브유닛은 아데닐릴 사이클라제(AC)를 억제하는데, 이는 결국 상기 수용체를 인산화시켜 탈감작시키는 G-단백질-커플링된 수용체 키나제(GRK)에 대한 βγ이량체 도킹으로 귀착된다. 상기 인산화된 수용체는 β-아레스틴에 의해 소집되고, 따라서 EGF-수용체를 인산화시키는src키나제를 소집하여 그의 활성 형태를 생성시킨다(Lin 등, 1997; Ahn 등, 1999; Luttrell 등, 1999). 이어서, 트랜스활성화된 RTK는 Ras를 활성화시키는데, 이는 Raf에 의해 MAP 키나제(ERK 1,2)의 활성화를 유도한다. PTX-민감성인 Giα서브유닛은 AC를 억제하는데, 이는 결론적으로 환식-AMP(c-AMP)의 레벨 감소로 귀착된다. LPA에 의한 반대되는 세포성 효과, 즉 유사분열생식 및 항유사분열생식은 cAMP 2차 전달자 시스템에 대한 반대 효과를 수반한다. 유사분열생식은 결론적으로 cAMP 레벨을 감소시키는 Giα경로를 통해 매개되는 반면(van Corven 등, 1989; van Corven 등, 1992), 항유상분열생식은 cAMP의 비PTX 민감성 Ca2+-의존성 증가를 수반한다(Tigyi 등, 1994; Fischer 등, 1998).
대조적으로, 액틴-세포골격의 재배열을 유도하는 PTX-민감성 G12/13신호전달 경로에 대해서는 알려진 것이 거의 없다. 또한, 이 경로는 RTK의 트랜스활성화와 관련이 있을 수 있으며(Lin 등, 1997; Ahn 등, 1999; Luttrell 등, 1999; Gohla 등, 1998), 작은 GTPase인 Rho 상에 집중된다. Rho의 하류 신호전달에 대해서는 훨씬 더 많은 것이 알려져 있는데, 그 이유는 여러가지 단백질 파트너가 분리 및 동정되었기 때문이다. Rho는 미오신 경쇄 포스파타제(MLC-포스파타제)를 인산화시켜 결론적으로 이를 억제하는 Ser/Thr 키나제를 활성화시킨다(Kimura 등, 1996). 이 경로는 MLC의 인산화된 형태를 축적시키 신경돌기의 수축과 유사한 세포성 효과를 유발하는 세포골격 반응(Tigyi 및 Miledi, 1992; Tigyi 등, 1996; Dyer 등, 1992;Postma 등, 1996; Sato 등, 1997), 스트레스 섬유의 유도(Ridley 및 Hall, 1992; Gonda 등, 1999), 주화성의 자극(Jalink 등, 1993a), 세포 이동(Zhou 등, 1995; Kimura 등, 1992) 및 종양 세포 침입성(Imamura 등, 1993; Imamura 등, 1996)을 유발한다. PLGF-유도되고 Rho-매개된 종양 세포 침입성은 ADP-의존성 메카니즘에서 Ro를 특이적으로 리보실화하는 씨. 보툴리늄(C. Botulinium) C3-독소에 의해 차단된다(Imamura 등, 1996).
또한, Rho는 정지 섬유아세포에서 DNA 합성을 자극할 수 있는 능력을 보유하고 있다(Machesky 및 Hall, 1996; Ridley, 1996). Rho 훼밀리 GTPase의 발현은 초기 유전자 전사를 매개하는 혈청 반응 인자(SRF)를 활성화시킨다(Hill 등, 1995). 또한, PLGF(LPA)는 종양 세포 침입을 유도한다(Imamura 등, 1996); 그러나, 이것이 세포골격 변화 또는 유전자 전사 또는 둘 다와 관련되어 있는지에 대해서는 아직 밝혀지지 않았다.
다수의 세포성 경로 및 세포 활성, 예를 들어 증식 및/또는 이동에 대한 LPA/LPA 수용체의 관련성, 뿐만 아니라 상처 치료 및 암에서의 관련성으로 인해, 이는 상기 동정된 LPA 수용체에서 길항제 또는 작용제로서 작용할 수 있는, 바람직하게는 선택적으로 작용할 수 있는 신규 화합물을 확인하는 데 바람직하다.
현재 밝혀진 합성 또는 내재성 LPA 수용체 억제제는 거의 없다. 현재까지 보고된 길항제 중에, 가장 잘 알려진 것은 SPH, SPP, N-팔미토일-1-세린(Bittman 등, 1996) 및 N-팔미토일-1-티로신(Bittman 등, 1996)에 작용하는 것이다. 상기 화합물은 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류를 억제하는 것으로 공지되어 있다(Bittman 등, 1996; Zsiros 등, 1998). 그러나, 이들 화합물은 모든 세포 시스템에서 연구된 것은 아니다. 또한, SPP는 종양 세포 침입성을 억제하는 것으로 공지되어 있으나, SPP가 LPA의 억제제로서 또는 그 자신의 수용체의 작용에 의해 그러한 작용을 하는지에 대해서는 밝혀진 바 없다. 또한, N-팔미토일-1-세린 및 N-팔미토일-1-티로신은 LPA-유도된 혈소판 응집을 억제하나(Sugiura 등, 1994), 이들 화합물이 LPA 수용체에서 작용하는지 여부는 아직 미확립된 상태로 남아있다. 라이소포스파티딜 글리세롤(LPG)은 LPA 작용을 어느 정도 억제하는 것으로 밝혀진 최초의 지질이지만(van der Bend 등, 1992b), 몇몇 LPA-반응성 세포 유형에서 검출할 수 없었다(Liliom 등, 1996). 이들 억제제 중에서 특이적인 LPA 수용체에서 선택적으로 작용하는 것으로 확인된 것은 없다.
폴리설폰화된 화합물인 수라민은 가역적이며 투여량 의존성 반식으로 LPA-유도된 DNA 합성을 억제하는 것으로 확인되었다. 그러나, 수라민은 LPA 수용체에 대한 임의의 특이성은 없으며, 단지 매우 높은 밀리몰(mM) 농도에서만 LPA의 작용을 차단하는 것으로 확인되었다(van Corven 등, 1992).
본 발명은 현재 LPA 작용제 및 LPA 길항제와 관련된 결점을 극복하는 것이다.
본원은 본원에 전적으로 참고 인용한 2000년 3월 17일 출원된 미국 가출원 제60/190,370호의 우선권 주장 출원인 2001년 3월 19일 출원된 미국 특허 출원 제09/811,838호의 일부 계속 출원이다.
본 발명은 부분적으로 미국 국립보건원 승인 번호 HL07641-12와 GM43880 및 국립 과학 재단 승인 번호 IBN-9728147에 의한 지원으로 완성된 것이다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 향유할 수 있다.
본 발명은 LPA 수용체에 대한 작용제 또는 길항제로서의 활성을 보유하는 라이소포스파티드산(LPA) 유도체 및 전립선암 치료, 난소암 치료 및 상처 치료(이들로 제한되는 것은 아님)를 포함하는 이의 다양한 치료적 용도에 관한 것이다.
도 1은 LPA 수용체, EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24(α,β)를 포함하는 10개의 인지질 성장 인자 수용체의 분류 및 관련성을 나타내는 계통수이다.
도 2는 세린 아미드 화합물 35-43의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 3은 세린 아미드 포스페이트 화합물 55-59의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 4는 비포스페이트 화합물 66-68의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 5A-B는 비포스페이트 화합물의 합성을 예시한다. 도 5A는 1,2-비포스페이트 화합물 85-92의 제조를 위해 사용된 합성도이며, 도 5B는 1,3-비포스페이트 화합물을 제조하기 위해 사용된 합성도이다.
도6A-B는 피로포스페이트 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도7A-C는 토실레이트-보호된 디에테르 중간체로부터 치환된 모노포스페이트 또는 모노포스페이트의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도8은 직쇄 지방산 포스페이트 화합물 106-110의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 9는 직쇄 티오인산 모노알킬 에스테르의 합성도이다.
도 10은 직쇄 알킬아미도-인산의 합성도이다.
도 11은 형태적으로 구속된 환식 포스페이트 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 12는 형태적으로 구속된 환식 포스페이트 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 13은 형태적으로 구속된 환식 포스페이트 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 14는 유리 포스페이트 부분을 가진 형태적으로 구속된 포스페이트 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 15는 2-모노포스페이트의 제조를 위한 사용된 대안적인 합성도이다.
도 16은 1,3-비포스페이트 화합물의 제조를 위해 사용된 대안적인 합성도이다.
도 17은 X3으로서 -N(H)-아실기를 보유하는 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 18은 X3으로서 -N(H)-이미다졸기를 보유하는 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 19는 X3으로서 -N(H)-C(O)-O-R7을 보유하는 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 20은 X3으로서 -N(H)-C(S)-O-R7을 보유하는 화합물의 제조를 위해 사용된 합성도이다.
도 21은 56(SAP, 14:0)의 세포외 적용에 의해 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류의 투여량 의존성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 22는 57(SAP, 18:0)의 세포외 적용에 의해 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류의 투여량 의존성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 23A-B는 66(MAGDP, 18:0)의 세포외 적용에 의해 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류의 투여량 의존성 억제를 나타내는 그래프이다. 화살표는 5 μM 66의 세포내 주입, 이어서 LPA의 세포외 적용 시간을 나타낸다.
도 24는 66(MAGDP, 18:0)의 투여량-억제 효과를 나타내는 그래프이다. 일정량의 LPA(5 nM)를 66의 양을 증가시키면서 난모세포에게 적용하였다. 데이타는 측정된 클로라이드 전류의 피크 진폭을 나타낸다.
도 25는 92(MAGDP, 22:0)의 세포외 적용에 의해 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 클로라이드 전류의 투여량 의존성 억제를 나타내는 그래프이다.
도 26은 제노퍼스 난모세포에 대한 56a(SDAP, 14:0/2:0)의 투여량 의존성 효과를 나타내는 그래프이다.
도 27은 LPA-유도된 HEY 세포 이동에 대한 56(SAP, 14:0), 56a(SDAP, 14:0/2:0) 및 66(MAGDP, 18:0)의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 테스트 화합물 농도는 1 μM이며; LPA 농도는 0.1 μM이다.
도 28A-C는 EDG-2(28A), EDG-4(28B) 또는 EDG-7(28C)을 불균일하게 발현하는 RH7777 세포에서 Ca2+반응에 대한 투여량 반응 관계를 나타내는 그래프이다. 각각이 테이타 포인트는 3회 이상의 측정값의 평균 ±표준편차를 의미한다.
도 29A-D는 EDG-2및 EDG-7은 발현하나 EDG-4는 발현하지 않는 RH7777 세포 내에서 LPA에 의해 유발된 Ca2+반응의 DGPP 8:0 억제를 나타내는 그래프이다. EDG-2, EDG-4 또는 EDG-7을 발현하는 RH7777 세포는 100 nM LPA 18:1 및 1 μM DGPP 8:0의 혼합물에 노출시켰다. 대조군 세포는 100 nM LPA 18:1에 노출시켰다. 대표적인 Ca2+반응은 안정한 EDG-2(29A), EDG-4(29B) 및 EDG-7(29C) 발현 세포에 대해 나타내거나, 또는 EDG-4(29D)를 일시적으로 발현하는 세포에 대해 나타냈다.
도 30A-C는 EDG-7을 발현하는 RH7777 세포(EDG-7 세포)에서 DGPP 8:0에 의한 LPA 반응 억제의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. 세포는 250 nM 농도의 LPA 18:1과 증가하는 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰으며, 생성된 Ca2+반응의 피크 면적을 측정하였다(30A). 또한, 세포는 농도가 증가하는 LPA 18:1과 농도 500 nM DGPP 8:0의 혼합물에 노출시켰다(30B). EDG-7 세포는 농도 250 nM의 LPA 18:1과 농도 500 nM의 표시한 지질과의 혼합물에 노출시켰다(30C). Ca2+반응의 피크 면적은 최소 3회 측정의 평균값 ±표준 편차로 나타냈다.
도 31A-C는 EDG-2를 발현하는 세포(EDG-2 세포)에서 DGPP 8:0에 의한 LPA 반응 억제의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. 안정한 EDG-2 세포는 농도 250 nM의 LPA 18:1과 증가하는 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰으며, Ca2+반응의 피크 면적을 측정하였다(31A). EDG-2 세포는 증가하는 농도의 LPA 18:1과 10 μM 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰다(31B). EDG-2 세포는 250 nM 농도의 LPA 18:1과 10 μM 농도의 표시한 지질과의 혼합물에 노출시켰다(31C). 반응은 최소 3회 측정값의 평균 ±표준 편차로 나타냈다.
도 32A-B는 EDG-4 발현 RH7777 세포에서 DGPP에 대한 구조-활성 관계를 나타내는 그래프이다. 안정한 EDG-4 세포는 500 nM 농도의 LPA 18:1과 5 μM 농도의 표시된 지질과의 혼합물에 노출시켰다(32A). EDG-4를 일시적으로 발현하는 세포는 100 nM 농도의 LPA 18:1과 1 μM 농도의 표시한 지질과의 혼합물에 노출시켰다(32B). Ca2+반응의 피크 면적을 측정하고, 최소 3회 측정값의 평균 ±표준 편차로 나타냈다.
도 33A-C는 제노퍼스 난모세포에서 LPA-유도된 Cl-전류에 대한 DGPP 8:0의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. 난모세포는 5 nM 농도의 LPA 18:1과 증가하는 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰으며, 생성된 진동성 Cl-전류의 피크 진폭을 측정하였다(33A). 난모세포는 증가하는 농도의 LPA 18:1과 200 nM 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰다(33B). 데이타 포인트는 최소 3회 측정의 평균값 ±표준 편차로 나타냈다. 난모세포는 표시된 바와 같이 5 nM LPA 18:1 및 1 μM DGPP 8:0의 혼합물로 처리하였다(33C). 1 μM DGPP 8:0의 세포내 주입은 화살표로 표시하였다.
도 34A-D는 NIH3T3 섬유아세포 및 HEY 난소 암 세포에서 LPA-유도된 Ca2+반응을 억제하는 DGPP 8:0을 나타내는 그래프이다. EDG 및 PSP24 수용체 전사체에 대한 NIH3T3 세포의 RT-PCR 분석(34A). NIH3T3 세포는 100 nM 농도의 LPA 18:1 또는 S1P와 10 μM 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰다(34B). EDG 및 PSP24 전사체의 존재에 대한 HEY 세포의 RT-PCR 분석(34C). HEY 세포는 100 nM 농도의 LPA 18:1 또는 S1P와 10 μM 농도의 DGPP 8:0과의 혼합물에 노출시켰다(34D). 생성된 Ca2+반응의 피크 면적을 측정하였으며, 최소 3회 측정값의 평균 ±표준 편차로 나타냈다.
도 35는 NIH3T3 세포의 LPA-유도된 증식의 DGPP 8:0 억제를 나타내는 그래프이다. NIN3T3 세포는 6 시간 동안 혈청-기아 상태를 유지하였으며, 5 μM 농도의 LPA 18:1과 10 μM 농도의 표시된 지질과의 혼합물에 노출시켰다. 대조군 세포는 LPA 18:1 대신에 용매(BSA)를 수용시켰다. 세포는 24 시간 동안 지질과 함께 항온처리하고, 계수하였다. 데이타는 3회 실험의 대표값이다.
도 36은 제노퍼스 난모세포에서 직쇄 지방산 포스페이트 화합물 106-110에의한 LPA 반응 억제의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다.
도 37은 제노퍼스 난모세포에서 직쇄 지방산 포스페이트 화합물 108에 의한 LPA 반응 억제의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다.
도 38은 직쇄 지방산 포스페이트 화합물 108에 대한 노출후, EDG-2, EDG-4 또는 EDG-7 수용체를 개별적으로 발현하는 RH7777 세포의 길항제 또는 작용제 유도된 반응의 약리학적 특성을 나타내는 그래프이다. Ca2+반응의 피크 면적을 측정하였다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 한 관점은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
화학식 I
상기 화학식에서,
X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O 또는 H와 -NR5R6의 조합이고;
X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
이고;
R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
상기 확인된 R 기(예를 들어, R1- R8) 각각에 있어서, 이들은 식 -(CH2)xCH3(여기서, x는 0 내지 29임)의 직쇄 알킬; 직쇄 알킬에 대해 상기한 바와 같은 식의 분지쇄 알킬(단, 하나 이상의 CH2기는 CHW(식중, W는 알킬 측쇄임)기로 치환됨); 식 -(CH2)xaCH=CH(CH2)xbCH3(여기서, xa 및 xb는 각각 0 내지 27이며, (xa+xb)는 27 이하임)의 직쇄 알케닐; 및 직쇄 알케닐에 대해 상기한 바와 같은 식의 분지쇄 알케닐(단, 하나 이상의 CH2기는 CHW 기로 치환되거나 또는 CH 기는 CW 기로 치환는데, 이때 W는 알킬 측쇄임)로 의도된다.
방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리의 예로는 페닐, 인덴, 피롤, 이미다졸, 옥사졸, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피롤리딘, 피페피딘, 티오펜, 푸란, 나프틸, 비-페닐 및 인돌을 들 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니다. 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리는 고리가 R1-Y1-A- 사슬의 Y1기에 결합하는 경우, 상기 고리 상에서 오르토 위치, 메타 위치 또는 파라 위치에 위치하는 고리의 모노-, 디- 또는 트리-치환체를 포함할 수 있다. 상기 고리상의 치환체로는 알킬, 알콕시, 아민(2차 아민 또는 3차 아민을 포함함), 알킬아민, 아미드, 알킬아미드, 산, 알콜을 들 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니다.
아실기의 예로는 상기한 바와 같은 알킬, 알케닐 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 들 수 있다.
아릴알킬 및 아릴옥시알킬기의 예로는 상기한 바와 같은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬기를 들 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니며, 이들은 R1-Y1-A- 사슬의 Y1기에 결합하는 알킬기를 보유한다.
화학식 I의 화합물의 상기 정의로부터 특이적으로 배제된 것은 하기하는 이미 공지된 내인성 또는 합성 화합물이다: 리소포스파티드산, 포스파티드산, 환식 포스파티드산, 알케닐 글리세롤포스페이트, 디옥틸-글리세롤 피로포스페이트 및 N-팔미토일-L-세린.
화학식 I의 예시적인 화합물은 하기 화합물 II-V의 하위 화합물이다.
상기 화학식 IIA 및 IIB의 구조에서, Q1및 Q2는 둘 다 H2이고; X1, X2및 X3중 하나는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-(여기서, Z1및 Z2는 O임)이며; X1, X2및 X3중 두 개는 R1-Y1-A-(여기서, A는 직접 연결이고, Y1은 각각 O임)이다. 각각의 R1은 독립적으로 화학식 I에서 정의한 바와 같다.
하기 화학식 III의 구조에서, Q1은 H2이고; Q2는 =O이고; X1은 (HO)2PO-Z1-(여기서, Z1은 O임)이고; X2및 X3은 R1-Y1-A-(여기서, A는 직접 연결이고, Y1은 각각 -NH-임)이다. 화학식 III의 범위에 속하는 바람직한 종은 X3이 NH2이고, X2가 -NHR1(식중, R1은 C14-C18 알킬, 더 바람직하게는 C14 알킬 또는 C18 알킬임)이거나, 또는 X3이 -NHR1(여기서, R1은 아세틸기이고, X2는 -NHR1(여기서, R1은 C14 알킬임)인 화합물이다:
화학식 Ⅳ의 구조에서, Q1은 =NR4이고; Q2는 H2이며 ; X1및 X2는 함께 결합하여 -O-PO(OH)-O-을 이루고 ; X3은 R1-Y1-A-로서, 여기서 A는 직접 결합이고 Y1은 -NH-이다. R1및 R4는 상기 화학식 Ⅰ에 관하여 정의된 바와 동일하다.
화학식 ⅤA 및 ⅤB의 구조에서, Q1및 Q2는 모두 H2이고 ; X1, X2및 X3중 두개는 (HO)2PO-Z1-이며, 여기서 Z1은 각각 O이고 ; X1, X2및 X3중 하나는 R1-Y1-A이고, 여기서 A는 직접 결합이며 Y1은 -O-이다. R1은 상기 화학식 Ⅰ에 관하여 정의한 바와 같다. 화학식 ⅤA 및 ⅤB의 범위에 속하는 바람직한 화학종은, R1이 C21알킬을 포함하는 아실 이거나, 또는 R1이 C18알킬인 화합물을 포함한다.
화학식 Ⅰ에 의한 화합물과, 이의 하위 속에 포함되는 화학식 ⅡA, ⅡB, Ⅲ, Ⅳ, ⅤA 및 ⅤB의 화합물은 이하 기술된 합성 반응식을 사용하여 제조될 수 있다.
세린 아미드(SA) 및 세린 아미드 포스페이트(SAP) 계열(화학식 Ⅲ)을 합성하기 위해서, 전구체 t-Boc 보호된 β- 락톤(25)을 처음 합성한다. 시판중인 t-Boc-L-세린(도 2, 24), 트리페닐 포스핀(PPh3) 및 디에틸아지도디카르복실레이트(DEAD)를 출발 물질로 하여 미츠노보 조건하에 도입시킨 결과, 수율 약 50%인 화합물 25를 얻었다[Sun 외 다수, 1996]. 다양한 1차 아민으로 Sun 등에 의하여 개발된 방법을 사용하여 고도로 불안정한 β- 락톤 25를 개방시키려고 시도한 결과, 다양한 시약(트리에틸 아민 등)을 사용하였음에도 불구하고, 히드록시 아미드 26∼34는 얻어지지 않았다. 그 대신, 1차 아민을 THF중에서 β- 락톤과 함께 환류시킨 결과, t-Boc 보호된 히드록시 아미드 26∼34를 얻었다. 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 화합물 26∼34를 정제하였다. t-Boc 보호기의 트리플루오로아세트산(TFA)-매개 제거 방법을 수행한 결과, 화합물 35∼43을 TFA 염으로서 얻었다.
화합물 55∼59를 합성하기 위하여, t-Boc 보호된 히드록시 아미드 26-30을인산화시켰다. 최종 화합물에 관하여 신중히 연구한 결과, 최종 화합물은 소수성이 강한 영역과 친수성이 강한 영역을 보유한다는 사실을 알 수 있었다. 상기 두 영역은 추출 공정중에 문제를 일으킬 수 있으며/있거나 정제 단계중에 컬럼에 부착될 수 있다. 이와 같은 잠재적인 문제점들을 피하기 위해서 포스포라미데이트 화합물을 사용하였다. 상기 포스포라미데이트 화합물을 사용함으로써, 포스페이트 히드록실기는 보호되어 분자를 완전히 소수성으로 만듦으로써, 정제를 원활하게 해준다.
근본적으로, 목적 생성물(55∼59)을 얻기 위해서는 여러가지 방법들을 병행하여 수행하였다[Lynch 등, 1997 ; Bittman 등, 1996 ; Liu 등, 1999]. 출발 히드록시아미드(26∼30)를 무수 피리딘으로 반복하여 세척하고, 이를 48 시간 동안 고진공하에서 건조시켰다. 피리딘-세척된 히드록시아미드를 아르곤 대기하에 유지시켰다. 이후에 1H-테트라졸 및 THF/CH2Cl2의 새로이 증류된 1:1 혼합물을 첨가하였다. 인산화제인 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트를 첨가하였다. TLC로 반응을 모니터한후, 과아세트산을 사용하여 포스포네이트를 동일계내에서 포스페이트로 산화시켰다. 컬럼 크로마토그래피로 반응 혼합물을 정제하여, 화합물 50∼54를 벤질 보호된 포스페이트로서 얻었다. 60 psi의 H2대기하에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 화합물 50∼54를 촉매로 환원시켜 보호 벤질기를 에탄올중에서 제거한 결과, 화합물 55∼59(도 3)를 얻었다. 56과 아세트산 무수물을 반응시킨 결과 화합물 56a(도 3)를 얻었다.
일단 SAP 계열(화합물 55∼59)의 합성을 위한 인산화 기법이 규명되면, 비스포스페이트(화학식 ⅤA 및 ⅤB)의 합성을 위해서 유사한 방법을 사용할 수 있다(도 4 및 5A∼B). 시판중인 디올 60∼62를 무수 피리딘으로 세척하고, 이를 고진공하에서 48 시간 동안 건조시켰다. 이와 같이 건조된 디올(60∼62)을 새로이 증류한 1:1 THF/CH2Cl2중에 용해시킨후, 여기에 1H-테트라졸을 첨가하였다. 이 교반된 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트를 첨가하였다. TLC로 반응 혼합물을 모니터하고, 적당한 시간에 과아세트산을 사용하여 동일계내에서 이 포스포네이트를 포스페이트로 산화시켰다. 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 결과, 벤질-보호된 비스포스페이트로서 화합물 63∼65를 얻었다. 보호 벤질기의 제거는, 60 psi의 H2대기하에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 에탄올중에서 화합물 63∼65를 촉매에 의해 환원시켜 수행되었으며, 그 결과 화합물 66∼68을 비스포스페이트로서 얻었다. 화합물 66∼68의 합성법에 관하여 전술한 바와 유사한 방법을 수행하여 화합물 85∼92를 얻었다.
화합물 85∼92는 1,2-비스포스페이트였으나, 도 5B는 1,3-비스포스페이트의 합성을 나타내는 것이었다. 출발 물질로서 시판중인 2-페녹시-1,3-프로판-디올을 사용하였다. 처음에 출발 화합물을 요드화메틸의 존재하에 t-BuOK로 보호한후, 촉매로 수소화시킨 결과, 중간체를 얻었으며, 이후 이를 할로겐화물(RX, 여기서 R은 상기 R1에 관하여 정의한 바와 같음)과 반응시켰다. 이후 회수된 중간체를 에틸-SH의 존재하에 AlCl3로 처리한 결과, 주쇄의 C2에 RO기가 결합되어 있는 1,3-디올을얻었다. 회수된 1,3-디올을 새로이 증류한 1:1 THF/CH2Cl2중에 용해시킨후, 여기에 1H-테트라졸을 첨가하였다. 이 교반된 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트를 첨가하였다. TLC로 반응 혼합물을 모니터하고, 적당한 시간에 과아세트산을 사용하여 동일계내에서 이 포스포네이트를 포스페이트로 산화시켰다. 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 결과, 벤질-보호된 비스포스페이트 화합물을 얻었다. 보호 벤질기의 제거는, 60 psi의 H2대기하에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 에탄올중에서 화합물을 촉매에 의해 환원시켜 수행되었으며, 그 결과 1,3-비스포스페이트 화합물을 얻었다.
화학식 ⅡA 및 ⅡB의 피로포스페이트를 합성하기 위해서, 글리시달 토실레이트((2(R)(-) 또는 (2R)(+))를 출발 물질로서 사용하였다(도 6A∼B). 개환은 알코올의 존재하에 루이스 산 예컨대, BF3로 촉매화되었으며, 그 결과, C1 위치가 토실레이트 보호된 중간체가 얻어졌다. 다음 단계에서, 과량의 R-트리플레이트 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘을 사용하여 C2 위치의 알코올을 R기(예를 들어, 전술한 바와 같은 R1)로 치환한 결과, 디-에테르 중간체가 얻어졌다. 디-에테르 중간체를 트리스(tert-n-부틸암모늄)하이드로겐 피로포스페이트로 처리하였더니, 상기 토실레이트가 친핵성 공격을 받았으며, 그 결과 이 토실레이트는 C1 위치에서 피로포스페이트 치환기로 치환되었다.
화학식 ⅡB의 피로포스페이트를 생성하기 위하여, 상기 토실레이트 보호된 중간체를 트리플 무수물 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘의 존재하에 벤질 알코올로 처리한 결과, 이 중간체는 C2 위치에서 벤질레이트화되었다. 처음에 18-크라운-6의 존재하에 과산화칼륨의 작용으로 벤질레이트 중간체상의 토실레이트 보호기를 제거한 결과, C1 위치에 히드록실기가 생성되었으며, 과량의 R-트리플레이트 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘을 사용하여 이 히드록실기를 R기(예를 들어, 전술한 바와 같은 R1)로 치환하였다. 생성된 디-에테르 중간체는 여전히 C2 위치에 벤질 보호기를 보유하였다. 수소화에 의하여 상기 벤질 보호기를 제거한후, 피리딘 및 염화p-톨루엔설포닐의 작용으로 히드록실기를 토실레이트화시킨 결과, C2 위치에 토실기를 보유하는 디-에테르가 생성되었다. 트리스(테트라-n-부틸암모늄)하이드로겐 피로포스페이트로 처리하고 토실레이트를 C2 위치에서 피로포스페이트 치환기로 치환하여, 친핵성 공격에 의해 상기 토실레이트기를 제거하였다.
포스페이트 및 비스포스페이트(그리고 피로포스페이트, 포스포네이트 등)를 제조하는 대안적 반응식을 도 15 및 16에 나타내었다.
도 15에서는, 브롬화글리시달을 알코올(ROH)과 함께 출발 물질로 사용하였다. 반응 조건으로서, K2CO3로 처리한후 암모늄 염 C6H6CH2N+(C2H5)3Cl-으로 처리한 결과, 브롬화물과 R기는 치환되었다. 이후 글리시달 중간체의 고리를 개환한 다음, 1M HCl로 에테르 및 알코올(R1OH)중에서 처리한 결과, C2 위치에 히드록시기를 보유하는 디-에테르 중간체를 얻었다. 상기 디-에테르를 1H-테트라졸과 혼합하였으며, 이 교반된 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트를 첨가하였다. 이 반응혼합물을 TLC로 모니터하고, 작당한 시기에 과아세트산을 사용하여 포스포네이트를 포스페이트로 동일계내 산화시켰다. 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 결과, 벤질-보호된 포스페이트를 얻었다. 60 psi의 H2대기하에 에탄올중에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 벤질-보호된 포스페이트를 촉매로 환원시켜 보호 벤질기를 제거한 결과, 모노포스페이트 화합물을 얻었다.
도 16에서는, 유사한 반응식을 사용하였으며, 단, 브롬화글리시달과 알코올(ROH)을 반응시키는 대신, BnOH를 사용하여 C3 위치를 보호하였다. 반응 조건으로서, K2CO3로 처리한후 암모늄 염 C6H6CH2N+(C2H5)3Cl-으로 처리한 결과, 브롬화물과 Bn기가 치환되었다. 이후 글리시달 중간체의 고리를 개환한 다음, 1M HCl로 에테르 및 무수 BnOH중에서 처리하여 C1 위치를 보호하였다. C2 위치에 히드록시기를 보유하는 디-에테르 중간체를 얻었다. 상기 디-에테르를 수성 K2CO3중에서 할로겐화물 염(RX)와 혼합한 결과, C2 위치에 R기가 에테르 결합을 통해 부착되어 있는 보호된 중간체를 얻었다. 이 중간체를 60 psi의 H2대기하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 촉매에 의해 환원시켜 탈보호한 결과, 1,3-디올이 얻어졌다. 상기 디올을 1H-테트라졸과 배합하고, 이 교반된 혼합물에 디벤질디이소프로필 포스포라미데이트를 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 TLC로 모니터하고, 적당한 시기에 과아세트산을 사용하여 동일계내에서 포스포네이트를 포스페이트로 산화시켰다. 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피로 정제한 결과, 벤질-보호된 포스페이트를 얻었다. 60 psi의 H2대기하에 에탄올중에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 벤질-보호된 포스페이트를 촉매로 환원시켜 보호 벤질기를 제거한 결과, 1,3-비스포스페이트를 얻었다.
도 6A에 나타낸 바와 같이 제조된 디-에테르 중간체(예를 들어, R 및 R1치환기를 보유하는 중간체)를 사용하여, 토실기를 제거하면서 다수의 변형된 포스페이트 및 포스포네이트를 C1 위치에 부착시킬 수 있었다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, X4-Z1-PO(O-보호기)2[여기서, Z1은 -(R3)CH-이고, X4는 H임]를 사용하는 염기성 조건하에서 중간체를 반응시켰다. 상기 염기성 조건들은 토실레이트 보호기를 제거하여, 변형된 포스페이트 -Z1-PO(O-보호기)2의 C1 위치에 단일 결합을 형성시켰다. TMSBr을 사용하여 보호기를 제거한 결과, C1 위치에 -(R3)CH-PO(OH)2기를 형성시킬 수 있었다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, X4-Z1-PO(OH)-Z2-PO(OH)2[여기서, Z1은 -O-이고, Z2는 -CH2-이며, X4는 H임]와 함께 트리스(테트라-n-부틸암모늄)을 사용하는 염기성 조건하에서 중간체를 반응시켰다. 상기 염기성 조건을 통하여 토실레이트 보호기를 제거한 결과, 변형된 포스포네이트 -Z1-PO(OH)-Z2-PO(OH)2의 C1 위치에 단일 결합을 형성시켰다. 산성 조건 및 CH3CN으로 처리함에 따라서, 상기 -O-PO(OH)-CH2-PO(OH)2기가 C1 위치에 형성되었다. 도 7C에 나타낸 바와 같이, 중간체를 염기성 조건하에서 X4-Z1-OH(O-보호기)2[여기서, Z1은 -OCH2CH2-이고, X4는 H임]와 반응시켰다. 상기 염기성 조건은 토실레이트 보호기를 제거하였으며, 변형된 포스페이트 -Z1-PO(O-보호기)2의 C1 위치에 단일 결합을 형성시켰다. 이를 콜리딘중에서 TMSBr로 처리하고, 물로 세척하여 보호기를 제거한 결과, C1 위치에 -OCH2CH2-PO(OH)2기가 형성되었다.
형태상으로 제한된 화학식 Ⅲ의 환식-포스페이트 화합물을 제조하기 위하여, 도 11에 나타낸 합성 반응식중 화합물 26∼30을 출발 물질로서 사용하였다. 화합물 26∼30을 1H-테트라졸과 반응시키고, 결과의 생성물을 디-tert-부틸 디이소프로필포스포라미데이트로 처리한 결과, 분자간 고리화가 일어났다. 과아세트산을 사용한 포스포네이트의 동일계내 산화에 의하여 환식 포스페이트 중간체를 얻었다. TFA로 환원시킨 결과, 화학식 Ⅲ의 화합물을 얻었다.
기타의 형태상 제한된 화합물도 제조할 수 있다.
도 12에서는, 환식 포스페이트[여기서, X1및 X2는 모두 -O-PO(OH)-O-임]를 제조하는 대안적 반응식을 나타내었다. 벤질-보호된 1,3-디올 중간체를 POCl3와 반응시킨 결과, 분자간 고리화가 일어났다. H2대기(전술한 바와 같음)하에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 C2 탄소에 히드록실기가 결합되어 있는 환식 포스페이트를 얻었다. 이후 환식 중간체를 과량의 R-트리플레이트 및 2,6-디-tert-부틸-4-메틸피리딘으로 처리한 결과, 최종 화합물을 얻었다.
도 13에서는, X1및 X3가 모두 -O-PO(OH)-NH-인 환식 포스페이트를 제조하는 반응식을 나타내었다. 전술한 바와 같이 제조된 중간체 35∼43을 출발 물질로 사용하였으며, 상기 중간체를 트리스(1,2,4-트리아졸)포스페이트로 처리한후, 2% HCl로 세척한 결과, 분자간 고리화가 일어났다.
도 14에서는, 포스페이트기가 고리의 일부가 아닌 환식 화합물을 제조하는 반응식을 나타내었는데, 특히, 상기 화합물에서 X2및 X3은 모두 -N(H)-C(O)-N(R1)-이다. 상기와 같이 제조된 중간체 50∼54를 출발 물질로 사용하였으며, 상기 중간체를 무수 COCl3로 처리한 결과, 고리화중에 C2 및 C3 탄소에 결합되어 있는 아민 사이에 카르보닐을 삽입하였다. H2대기(전술한 바와 같음)하에서 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 포스페이트로부터 벤질 보호기를 제거하였다.
LPA 수용체의 작용제 또는 길항제로서 사용될 수 있는 화합물의 다른 군은 지방산 포스페이트 또는 직쇄 포스페이트이다. 도 8에 나타낸 바와 같이. 무수 n-알칸올 및 1H-테트라졸을 무수 염화메틸렌중에 용해시킬 수 있다. 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포라미다이트의 무수 염화메틸렌중 용액을 첨가할 수 있다. 추후, 무수 염화메틸렌중 과아세트산을 적가한 결과, 벤질-보호된 지방산 포스페이트 101∼105를 얻을 수 있었다. 무수 메탄올중에서 H2대기(전술한 바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 상기 벤질 보호기를 제거한 결과, 지방산 포스페이트 106∼110을 얻었다.
지방산 포스페이트 제법에 대한 대안으로서, 티오포스페이트 및 아미도포스페이트를 사용할 수도 있다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, n-머캅토알칸 및 1H-테트라졸을 무수 염화메틸렌중에 용해시킬 수 있다. 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포라미다이트의 무수 염화메틸렌중 용액을 첨가할 수 있다. 이후, 무수 염화메틸렌중 과아세트산을 적가한 결과, 벤질-보호된 지방산 티오포스페이트를 얻을 수 있었다. 상기 벤질 보호기를 무수 메탄올중에서 H2대기(전술한 바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 상기 벤질기를 제거한 결과, 지방산 티오포스페이트를 얻었다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, n-알킬아민 및 1H-테트라졸을 무수 염화메틸렌중에 용해시킬 수 있었다. 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포라미다이트의 무수 염화메틸렌중 용액을 첨가할 수 있다. 이후, 무수 염화메틸렌중 과아세트산을 적가한 결과, 벤질-보호된 지방산 아미도포스페이트를 얻었다. 상기 벤질-보호기를 무수 메탄올중에서 H2대기(전술한 바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 상기 벤질-보호기를 제거한 결과, 지방산 아미도포스페이트를 얻었다.
도 17∼20에 나타낸 바와 같이 1차 아민기를 공격하여 상기 정의한 각각의 반응식을 추가로 변형시켰다. 예를 들어, TFA 처리하여 t-Boc 보호기가 제거된 화합물 50∼54로부터 중간체를 제조한 결과, 포스페이트가 여전히 보호된 상태로 존재하는 1차 아민을 얻었다.
도 17에서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 산성 할로겐화물(예를 들어, R1COCl)로 공격하여, 1차 아민을 아미드(-N(H)-C(O)-R1)으로 전환시켰다. 이후 벤질-보호된 포스페이트를 H2대기(전술한 바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)으로 처리하여 탈보호하였다.
도 18에서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 POCl3중 N-아세틸 이미다졸린으로 공격하여, 1차 아민을 2차 아민(-N(H)-이미다졸)으로 전환시켰다. 치환된 이미다졸린을 사용할 수도 있다. 이후 벤질-보호된 포스페이트를 H2대기(전술한 바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 탈보호하였다.
도 19에서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 R1OC(O)Cl로 공격하여, 1차 아민을 카바메이트(-N(H)-C(O)-O-R1)로 전환시켰다. 이후 벤질-보호된 포스페이트를 H2대기(전술한 바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 탈보호시켰다.
도 20에서, C2 위치에 1차 아민을 보유하는 중간체 화합물을 R1NCO 또는 R1NCS로 공격하여, 1차 아민을 우라미드(-N(H)-C(O)-N(H)-R1) 또는 티오우라미드(-N(H)-C(S)-N(H)-R1)로 전환시켰다. 이후 벤질-보호된 포스페이트를 H2대기(전술한바와 같음)하에 활성탄상 10% 팔라듐(Pd/C)을 사용하여 탈보호하였다.
따라서, 본 발명의 비환식 화합물은 (Y2O)2PO-Z11-Z13또는 (Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z1 3[여기서, Z11는 -(H2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1∼50의 정수임), -C(R3)H- 또는 -O-이고 ; Z12는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1∼50의 정수임) 또는 -0-이며 ; Z13은 H 또는 제1 이탈기이거나, 또는 -Z11-Z13은 모두 제1 이탈기를 형성하고, Y2는 H 또는 보호기임]와 화학식 Ⅵ의 중간체 화합물과 반응시키고, 필요한 경우, 화학식 Ⅰ의 화합물 [여기서, X1, X2, 및 X3중 하나 또는 두개는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1- (여기서, Z1및 Z2는 상기 정의한 바와 같음)]을 얻기에 효과적인 조건하에서 탈보호 단계를 수행하여 제조될 수 있었다.
화학식 Ⅵ의 중간체 화합물은 다음의 구조식을 갖는다 :
상기 화학식에서,
X11, X12, 및 X13중 하나 이상은 R11-Y11-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R11-Y11-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X12및 X13은 서로 결합하여 -N(H)-C(O)-N(R11)-를 형성하고 ; X11, X12및 X13중 하나 이상은 OH, NH2, SH, 또는 제2 이탈기이며 ; 임의적으로, X11, X12및 X13중 하나는 H이고 ;
A는 직접 결합인 (CH2)k[식중, k는 0∼30의 정수임] 또는 O이며 ;
Y11은 -(CH2)l- [식중, l은 1∼30의 정수임], -O-,, -S- 또는 -NR12-이고 ;
Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR13, =O, H와 -NR14R15의 조합이며 ;
각각의 X11, X12또는 X13에 있어서 R11은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1∼C30알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2∼C30알케닐, 고리중에 일치환, 이치환 또는 삼치환을 갖거나 또는 갖지 않는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1∼C30 알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1 ∼C30알킬을 포함하는 아릴알킬 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1∼C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
R12, R13, R14, R15, R16, 및 R17은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1∼C30알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2∼C30알케닐, 고리중 일치환, 이치환 또는 삼치환을 갖거나 또는 갖지 않는 방향족 또는 헤테로방향족 고리, C1∼C30알킬 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1∼C30알킬을 포함하는 아릴알킬 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1∼C30알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
본 발명의 LPA 수용체 작용제 및 길항제를 제조하는데 있어서, 이러한 화합물들이 이하 기술된 바와 같이 환자들을 치료하는데 적당한 약학 조성물을 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 측면은 약학적으로 허용 가능한 담체 및 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 약학 조성물은 또한 적당한 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있으며, 고체 또는 액체의 형태 예컨대, 정제, 캡슐, 분말, 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있다. 통상적으로 상기 조성물은 담체, 부형제, 안정화제 등과 함께, 활성화합물(들)을 약 0.01∼99%, 바람직하게는 20∼75% 함유할 것이다.
고체 단위 투여형은 통상의 형태일 수 있다. 상기 고체 투여형은 캡슐 예컨대, 본 발명의 화합물과 담체 예컨대, 윤활제 및 비활성 충전제 예컨대, 락토즈, 수크로즈 또는 옥수수 전분을 함유하는 보통의 젤라틴류일 수 있다. 다른 구체예에서, 이들 화합물은 통상의 정제 기제 예컨대, 락토즈, 수크로즈 또는 옥수수 전분을, 결합제 예컨대, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴, 붕해제 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분 또는 알긴산, 및 윤활제 예컨대, 스테아르산 또는 스테아르산마그네슘과 함께 사용하여 정제화된다.
본 발명의 화합물은 또한, 생리학적 허용 희석제와 약학 담체중 상기 물질의 용액 또는 현탁액으로 주사 가능하거나, 또는 국소 도포되는 투여형으로 투여될 수도 있다. 이러한 담체로서는 멸균 액체 예컨대, 물 및 오일을 포함하며, 여기에는 계면 활성제 및 기타 약학적 및 생리학적 허용 담체 예컨대, 애쥬반트, 부형제 또는 안정화제가 첨가되거나 또는 첨가되지 않는다. 오일의 예로서는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일 예컨대, 땅콩 오일, 대두 오일 또는 광유가 있다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로즈 및 관련 당 용액, 및 글리콜 예컨대, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜은 바람직한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액으로서 바람직하다.
애어로졸로 사용할 경우, 용액 또는 현탁액중 본 발명의 화합물은 가압 애어로졸 용기내에, 적당한 추진제 예컨대, 탄화수소 추진제 예컨대, 프로판, 부탄 또는 이소부탄, 및 통상적인 애쥬반트와 함께 팩키징될 수 있다. 본 발명의 물질은 또한 비가압형 예컨대, 분무기 또는 애토마이저로 투여될 수 있다.
수행되는 치료 방법에 따라서, 본 발명의 화합물은 경구, 국소, 경피, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 비내, 흡입, 공동내 또는 소포내 침습, 안내, 동맥내, 병변내, 또는 점막 예컨대, 코, 인후 및 기관내 점막에 투여될 수 있다.
본 발명의 범위내 조성물은 본 발명의 화합물이 의도로 하는 목적을 이루기에 효과적인 양만큼 포함되어 있는 모든 조성물을 포함한다. 개인에 따라 다양하겠지만, 각 성분의 유효량의 최적 범위의 결정은 당 업계에 공지되어 있다. 통상적인 투여량은 체중 1㎏당 약 0.01∼약 100 ㎎이다. 바람직한 투여형은 체중 1㎏당 약 0.1∼약 100 ㎎이다. 가장 바람직한 투여량은 체중 1㎏당 약 1∼약 100 ㎎이다. 본 발명의 화합물의 투여에 따른 치료 방식은 또한 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 특정 화합물은 LPA 수용체의 작용제로서 유용한 것으로 밝혀졌으며, 이와 달리, 본 발명의 다른 화합물은 LPA 수용체의 길항제로서 유용한 것으로 밝혀졌다. 이러한 활성의 차이로 인하여, 다양한 화합물은 상이한 용도를 갖게 된다. 본 발명의 바람직한 동물 개체는, 포유 동물 즉, 포유류에 속하는 개체이다. 본 발명은 특히 인간 개체의 치료에 유용하다.
본 발명의 하나의 측면은 LPA 수용체 작용제 또는 LPA 수용체 길항제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하고, LPA 수용체의 활성을 조절하는데 효과적인 조건하에서 이 화합물과 LPA 수용체를 접촉시키는 것을 포함하는, LPA 수용체의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.
상기 LPA 수용체는 LPA 수용체를 정상적으로 발현하거나 또는 특정 LPA 수용체를 발현하도록 형질전환된, 세포상에 존재한다. 적당한 LPA 수용체로서는 EDG-2,EDG-4, EDG-7, 및 PSP-24 수용체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 수용체들을 정상적으로 발현하는 세포를 함유하는 조직들을 상기 표 1에 나열하였다. 세포가 본 발명의 LPA 수용체 작용제 또는 LPA 수용체 길항제와 접촉할때, 상기 접촉은 세포가 시험관내 또는 생체내 잔류할 동안에 수행된다.
상기 수용체를 정상적으로 발현하지 않는 숙주 세포내에서 상기 수용체들을 이질적으로 발현시키기 위하여, 이러한 수용체중 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자를 적당한 전사 및 번역 조절 영역(즉, 프로모터 및 전사 종결 시그널)을 포함하는 발현 벡터내에 센스 배향으로 삽입한 후, 이 숙주 세포를 발현 벡터로 형질 전환시킬 수 있다. 발현 벡터는 세포 게놈내에 통합화될 수 있거나, 또는 단순한 염색체외 핵 물질로서 존재할 수 있다. 구성적 발현이 대부분의 목적에 적합함에도 불구하고, 발현은 구성적 또는 유도적일 수 있다.
EDG-2에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 이에 관하여는 문헌[An 등(1997b) ; Genbank 수탁 번호 U80811 ;상기 문헌은 본원에 참고용으로 인용됨]에 보고되어 있다. EDG-2 암호화 핵산 분자는 이하 서열 번호 1과 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다 :
암호화된 EDG-2 수용체는 이하 서열 번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는다 :
EDG-4에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 이에 관하여는 문헌[An 등(1998b) ; Genbank 수탁 번호 NM_004720 ;상기 문헌은 본원에 참고용으로 인용됨]에 보고되어 있다. EDG-4 암호화 핵산 분자는 이하 서열 번호 3과 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다 :
암호화된 EDG-4 수용체는 이하 서열 번호 4와 같은 아미노산 서열을 갖는다:
EDG-7에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 공지되어 있으며, 이에 관하여는 문헌[Bandoh 등(1999) ; Genbank 수탁 번호 NM_012152 ;상기 문헌은 본원에 참고용으로 인용됨]에 보고되어 있다. EDG-7 암호화 핵산 분자는 이하 서열 번호 5와 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다 :
암호화된 EDG-7 수용체는 이하 서열 번호 6과 같은 아미노산 서열을 갖는다 :
PSP-24에 대한 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 관하여는 공지되어 있으며, 이에 관하여는 문헌[Kawasawa 등(2000) ; Genbank 수탁 번호 AB030566 ;상기 문헌은 본원에 참고용으로 인용됨]에 보고되어 있다. PSP-24 암호화 핵산 분자는 이하 서열 번호 7과 같은 뉴클레오티드 서열을 갖는다 :
암호화된 PSP-24 수용체는 이하 서열 번호 8과 같은 아미노산 서열을 갖는다 :
LPA 수용체 작용제는 특히 LPA 수용체로부터의 LPA 유사 활성을 유도할 것이며, 이때 상기 활성은 화학적으로 예를 들어, 난모 세포내 Ca2+또는 Cl-전류, 또는 세포 형태, 이동성 및 증식성 등의 변화를 관찰함으로써 측정될 수 있다. 대조적으로, LPA 수용체 길항제는 특히 LPA 수용체로부터의 LPA-유사 활성을 차단할 것이다. 이 역시 화학적으로 예를 들어, 난모 세포내 Ca2+또는 Cl-전류, 또는 세포형태, 이동성 및 증식성 등의 변화를 관찰함으로써 측정될 수 있다.
LPA 수용체 길항제로 작용하는 본 발명의 화합물에 의하여, 본 발명은 또한 LPA 수용체상 LPA-유도된 활성을 저해하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 LPA 수용체의 LPA 유도 활성을 제해하는데 효과적인 조건하에서, LPA 수용체 길항제 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하고, LPA 수용체와 상기 화합물을 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 LPA 수용체는 전술한 바와 같이 정의될 수 있다. 상기 LPA 수용체는 이 수용체를 정상적으로 발현하는 세포 또는 이 수용체를 이질적으로 발현하는 세포상에 존재한다. 상기 LPA 수용체와 본 발명의 화합물의 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, LPA는 다수의 상이한 세포 경로에 관여하는 시그널 분자로서, LPA 수용체 예컨대, 전술한 바와 같은 LPA 수용체들을 통한 시그널링에 관여한다. 그러므로, 본 발명의 화합물은, LPA 수용체 길항제 또는 LPA 수용체 작용제의 작용에 의해 세포 거동에 대한 LPA의 효과를 조절할 것이다.
본 발명의 하나의 측면은, 본 발명의 화합물을 제공하고, 암 치료에 효과적인 방식으로 환자에게 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화합물로 치료될 수 있는 암의 종류에는, 최소한 부분적으로 LPA-매개 활성에 의하여 기인될 수 있는 거동을 나타내는 암 세포를 특징으로 하는 암을 포함한다. 통상적으로, 이러한 종류의 암은 1 이상의 유형의 LPA 수용체를 발현하는 암 세포를 특징으로 한다. 암의 예시적인 형태로서는 전립선 암 및 난소암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
암 치료에 특히 유용한 본 발명의 화합물은 LPA 수용체 길항제가다.
본 발명의 화합물이 투여될때, 이 화합물은 전신 투여될 수 있거나, 또는 암 세포가 존재하는 특정 부위에 직접 투여될 수도 있다. 그러므로, 투여는 본 발명의 화합물을 암 세포에 전달하는데 효과적인 방식으로 수행될 수 있다. 이론적으로 한정되는 것은 아니지만, 상기 LPA 수용체 길항제는 LPA 수용체에 결합하였을때, 암 세포의 증식 또는 전이를 억제하거나, 또는 이들 암세포를 파괴할 것이다. 실시예 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 몇몇 LPA 길항 화합물은, 전술한 바와 같은 유형의 LPA 수용체를 1 이상 발현하는 전립선 암 세포주에 대하여 세포독성을 나타내었다.
암 치료를 위하여 본 발명의 LPA 길항 화합물 또는 약학 조성물이 투여될 때, 상기 약학 조성물은 또한 기타 치료제를 함유할 수 있거나, 또는 이 치료제와 함께 투여될 수 있거나, 또는 현재 공지되어 있는 치료 방식, 또는 다양한 종류의 암 치료를 위하여 개발된 섭생법에 의하여 투여될 수 있다.
암 침투는 복잡한 다단계 과정으로서, 여기서 각각의 세포 또는 세포 클러스터는 1차 종양으로부터 떨어져나와 전신 혈류 또는 림프에 도달하여 상이한 기관으로 퍼지게 된다[Liotta 등, 1987]. 이 과정에서, 종양 세포는 모세 혈관에 머물러, 삼출된 다음, 조직의 스트로마로 이동하여 2차 지점을 형성하여야 한다. 첫째, 종양 세포는 혈류로부터 종양 세포를 포획한 내피 세포상의 시그널을 인식하여야 한다. 두번째로, 종양 세포는 세포 표면 라미닌 수용체를 통하여 기저 막 당단백질 라미닌에 부착되어야 한다. 상기 기저막에 부착된후, 종양 세포는 프로테아제를 분비하여 기저막을 분해한다. 상기 부착 및 국소 단백 분해후에 이어지는, 침투의 세번째 단계는 종양 세포 이동이다. 세포 이동성은 종양 세포 침입 및 전이에 중요한 역할을 한다. 시험관내 종양 세포의 이동성과 동물 실험에 있어서의 전이 거동 사이의 관계는 직접적으로 강력한 상관성을 가짐을 시사한다[Hoffman-Wellenhof 등, 1995]. PLGF는 시험관내 암 세포의 증식을 촉진시키고 침투성을 증가시킨다는 것은 널리 공지된 사실이다. 이마무라 및 그의 동료들은 암 세포가 침투시 혈청 인자를 필요로 하며(Imamura 등, 1991), 이후 LPA는 무혈청 시스템내 종양 세포 침투를 완전히 회복시킬 수 있는 중요한 혈청 성분이라는 사실을 확인하였다(Xu 등, 1995a ; Imamura 등, 1993 ; Mukai 등, 1993).
PLGFR은 난소암 세포주 즉, OCC1 및 HEY 세포에서 발현된다는 사실을 알아냈다. 특히, RT-PCR 분석 결과, 상기 세포주내 EDG-2 및 EDG-7 수용체가 존재함을 알 수 알아냈다. 최근들어, 문헌[Im 등 (2000)]을 보면, EDG-7은 전립선 암 세포주 즉, PC-3 및 LNCaP 세포내에서 발현된다고 기술되어 있다. 전립선 암 세포주인 DU-145, PC-3 및 LNCaP 주의 RT-PCR 분석결과, EDG-2, 4, 5 및 EDG-7는 3개의 전립선 암 세포주에 존재하는 반면에, EDG-3은 LNCaP 및 DU-145 전립선 암 세포주에 존재함을 알 수 있었다.
실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 몇몇 LPA 수용체 길항제는 특정 전립선 암 세포주 및 특정 난소 암 세포주를 표적화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 LPA 길항제는 LPA-매개성 암 예컨대, 전립선 암과 난소암을 치료하기 위한 대안적인 접근법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 세포 증식을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 세포 증식 촉진 방법은, LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 갖는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계, 및 세포상의 LPA 수용체와 상기 화합물을 세포의 LPA 수용체-유도 증식을 촉진시키는데 효과적인 방식으로 접촉시키는 단계를 포함한다.
암 세포 활성을 조절하는데 있어서 LPA가 하는 역할에 더하여, LPA는 또한 자연 상처 치료에 있어서 생리학적 역할을 갖는다는 것을 제시하는 강력한 증거가 있다. 상처 부위에서, 활성화된 혈소판으로부터 유래된 LPA는 최소한 부분적으로 나마, 기타 혈소판 유래 인자와 동시에 상처 및 염증 부위에서의 세포 증식을 촉진시키는데 관여하는 것으로 생각된다[Balazs 등, 2000]. 더욱이, LPA는 그 자체가 혈소판 응집을 촉진시켜, 초기 응집 반응에 대해서 양의 피드백 요소를 개시하는 인자가 될 수 있다[Schumacher 등, 1979 ; Tokumura 등,1981 ; Gerrard 등, 1979; Simon 등, 1982].
세포 증식에 있어서의 LPA의 역할로 인하여, LPA 수용체 작용제 활성을 갖는 화합물은 상처 치료를 촉진시키는데 효과적인 방식으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면은 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 LPA 수용체 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하여, 상처 부위에 유효량의 화합물을 전달함으로써 수행되는데, 여기서 상기 상처 치료를 촉진하는 화합물은 세포상 LPA 수용체에 결합하고, LPA 수용체 작용제-유도성 세포 증식을 자극하여 상처 치료를 촉진시킨다.
상처 치료에 있어서의 1차적 목표는 상처를 아물게하는 것이다. 벌어진 피부상처는 상처의 주요 부류를 대표하는 것으로서 화상, 신경병성 궤양, 압력으로 인한 통증, 정맥 울혈 궤양 및 당뇨병성 궤양을 포함한다. 벌어진 피부 상처는 보통 다음과 같은 6개의 주요 요소로 이루어진 과정을 통하여 치유된다 : ⅰ) 염증, ⅱ) 섬유아세포 증식, ⅲ) 혈관 증식, ⅳ) 결합 조직 합성, ⅴ) 상피화, 및 ⅵ) 상처 수축. 상기 요소들중 어느 하나 또는 전체가 적당히 작용을 하지 않으면 상처 치료 과정은 제 기능을 발휘하지 못하게 된다. 다수의 요인들 예컨대, 영양 실조, 감염, 약리학적 제제(예를 들어, 악티노마이신 및 스테로이드), 당뇨병 및 노령은 상처 치료 과정에 영향을 미칠 수 있다[Hunt and Goodson, 1988 참조].
인지질은 세포 활성 예컨대, 유사분열(Xu 등, 1995b), 고사, 세포 부착 및 유전자 발현의 조절에 있어서 중요한 조절자인 것으로 알려져 있다. 특히, 예를 들어 LPA는 세포 증식(Moolenaar, 1996) 및 세포 이동(Omamura 등, 1993)에서 성장 인자와 유사한 효과를 나타낸다. 또한, LPA는 상처 치료 및 재생에 있어서 일정한 역할을 수행한다는 사실도 제시되었다(Tigyi 및 Miledi, 1992).
일반적으로, 섬유아세포, 내피 및 상피 세포의 상처로의 유입을 더욱 신속하게 하는 것을 촉진시키는 제제는 상처 치료 속도를 증가시킬 것이다. 상처 치료에 유용한 본 발명의 화합물은 다수의 시험관내 및 생체내 모델에서 확인 및 테스트될 수 있다.
시험관내 시스템 모델에서, 상처 치료 과정에는 상이한 요소들 예를 들어, 세포의 조직 배양 세포 예컨대, 섬유아세포(Verrier 등, 1986), 내피 세포(Kartha 등, 1990) 또는 상피 세포(Kartha 등, 1992)의 "상처입은" 합류 단일층("wounded"confluent monolayer)으로의 회복을 포함한다. 내피 세포 이동 및/또는 증식을 측정하는데 다른 시스템을 사용할 수 있다(Muller 등, 1987 ; Sato 등, 1988).
상처 치료에 대한 생체내 모델은 또한 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이로서는 상처입은 돼지 진피(Ohkawara 등, 1977) 또는 햄스터 볼 주머니의 약물 유도성 경구 점액성 병변(Cherrick 등, 1974)을 포함한다.
상처 치료에 효과적인 본 발명의 화합물은 또한 항균제, 항바이러스제, 항진균제, 구충제, 항염증제, 무통제, 항소양제 또는 이들의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 약물과 함께, 본 발명의 약학 조성물내에 배합된 형태로 투여될 수 있거나, 또는 상이한 경로를 통하여 동시에 투여될 수도 있다.
상처 치료에 있어서 바람직한 투여 방식은 국소 경로에 의한 것이다. 그러나, 이와는 달리, 또는 이와 함께, 상기 제제는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 경피 경로에 의하여 투여될 수 있다. 대안적으로, 또는 이와 함께 투여는 경구 경로에 의할 수도 있다. 투여된 투여량은 수용자의 연령, 건강 및 체중, 만일 행하여 진다면, 병행 치료의 종류, 치료 횟수, 및 목적 효과의 특성에 따라서 달라질 것이다.
바람직한 국소적 방법, 특히 상처를 입은 인간과 동물의 치료에 있어서, 본 발명의 화합물을 유효량 상처 부위 예컨대, 피부 표면에 투여하는 것이 바람직하다. 이때의 투여량은 일반적으로 투여당 약 0.001 ㎎ ∼ 약 1 g의 범위로서, 이는 치료받는 부위, 증상의 심각성 및 사용된 국소 비이클의 특징에 따라서 달라진다. 바람직한 국소 제제는 연고로서, 여기서 활성 성분은 연고 기제 예컨대, PEG-10001 ㎖당 약 0.01∼약 50 ㎎ 사용된다.
본 발명은 추가로 고사의 저해 또는 세포, 조직 또는 기관의 기능을 보존 또는 회복시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 LPA 수용체의 작용제 활성을 갖는 본 발명의 화합물을 제공하고, 세포, 조직 또는 기관과 고사를 치료하거나, 또는 세포, 조직 또는 기관내에서의 기능을 보존 또는 회복시키는데 효과적인 양의 화합물을 접촉시킴으로써 수행된다. 상기 접촉은 시험관내(즉, 세포 배양, 또는 기관 또는 조직 운반중에) 또는 생체내(즉, 이하 기술된 바와 같이 환자에 유효량의 화합물을 투여함으로써) 수행될 수 있다.
치료될 수 있는 다수의 증상으로서는 고사, 국소빈혈, 외상 및 재관류 손상과 관련된 증상들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이 고사와 관련된 증상들로서는 노화에 따른 피부과적 증상, 국소빈혈 발생후의 재관류 증상, 면역억제, 위장관 섭동, 심혈관 질환, 조직이식 거부, 상처 치료 및 알츠하이머병을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료를 통하여 면역억제 바이러스, 화학요법 제제, 또는 방사선 및 면역억제 약물로 인한 고사-관련 문제점들을 줄일 수도 있다.
치료법은 또한 기관 이식의 모든 단계에서 적당하다. LPA 수용체상에 작용제 활성을 갖는 화합물은 공여자에게 기관을 안정화시키거나 또는 보존하는데 효과적인 양으로 투여됨으로써 기관을 제조하는데 사용될 수 있다. 기관은 본 발명의 화합물을 함유하는 OPS중에서 관류 및/또는 보존될 수 있다. 이후 기관 수용자에 기관 안정성 및 기능을 강화시키는데 유효한 양의 화합물을 투여할 수 있다. 본 조성물은 또한, 이식이나 기타 외과적 개입이 관련되어 있든 아니든지 간에, 심장 마비 치료에 사용하기에도 적당하다.
고사 관련 문제는 바이러스 예컨대, HIV(이에 한정되는 것은 아님), 화학요법 제제 및 방사선을 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 다수의 자극에 의하여 발생된다. 이러한 자극은 다수의 질환 예컨대, 소화관 조직 및 관련 위장관 섭동과 관련된 질환(이에 한정되는 것은 아님)에 있어서 고사를 유발시킨다.
위장관 섭동은 장의 배열 손상, 중증 만성 궤양, 대장염, 방사선 유도성 손상, 화학요법 유도성 손상, 및 기생체에 의하여 유발되는 위장관의 섭동 및 기타 원인으로 인한 설사를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 바이러스 및 박테리아 감염도 위장관의 섭동을 유발시키는 것으로 알려졌다. LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물은 또한 이러한 감염과 관련된 부작용의 치료에 사용하는데 적당하다. 이러한 화합물은 특히 화학요법으로 인한 위장관 장애를 완화시키기 위해 사용하는데 적당하다. 그러므로, 이러한 화합물들은 화학요법으로 인한 설사 뿐만 아니라, 메스꺼움을 방지하는데 사용하기 적당하다.
본 발명의 화합물은 특히 동물 예컨대, 가축 및 애완 동물(이에 한정되는 것은 아님)에 있어서의 다수의 위장관 증상의 치료에 적당하다. 이러한 증상중에서도 특히, 설사는 탈수 및 영양 실조로 인해 송아지 및 강아지의 생명을 앗아간다. 위장관 증상의 치료는 위장내 투여에 의하여 수행되는 것이 바람직하다. 소 및 애완용 동물의 경우, 상기 유효량의 화합물은 사료에 혼합되는 것이 편리하다. 인간에서, 투여는 위장내 투여에 관해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의할 수 있다. 바람직한 투여 방법은 경구 투여 방법이다.
또한, LPA 수용체에 대해서 작용제 활성을 갖는 화합물은 면역 결핍 환자 특히, HIV-양성 환자에 투여되어, 결과적으로 AIDS 환자에서 나타나는 면역결핍증을 악화시키는, 상기 증상과 관련된 T 세포 고사를 막아주거나 또는 최소한 완화시킨다. 이러한 환자에 대한 투여는 비경구 투여가 바람직하나, 경피 또는 위장내 투여될 수도 있다.
다수의 증상 예컨대, 관상 동맥 폐색증 ; 뇌경색 ; 척추/두부 외상 및 부수적 중증 마비 ; 기타 상해 예컨대, 동상, 관상동맥 혈관성형술, 혈관 부착증, 사지 부착증, 기관 부착증 및 신장 재관류로 인한 재관류 손상(이에 한정되는 것은 아님)과 연관된 재관류 손상과 관련된 고사를 치료하기 위해서 LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물도 투여될 수 있다.
심근 경색 및 뇌 경색(졸중)은, 색전, 혈전 또는 거시적 부위에 괴사를 발생시키는 압력으로 인하여 동맥 또는 정맥에 혈액 공급이 급작스럽게 불충분해 짐으로써 발생하며 ; 이로써 심장, 뇌, 비장, 신장, 소장, 폐 및 고환 등도 영향을 받을 수 있다. 세포 사멸은 혈액이 특정 부위에 재관류될 때 경색 부위를 애워싸고 있는 조직에서 발생하므로 ; 재관류중에 또는 그 직후에, 경색증이 개시되는 부위에 투여되면 조성물은 유효하다. 본 발명은 LPA 수용체에 작용제 활성을 갖는 치료학적 유효량의 화합물을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여함으로써 재관류 손상을 치료하는 방법을 포함한다.
본 발명은 추가로 LPA 수용체에 작용제 활성을 갖는 화합물을 치료학적 유효량으로 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여함으로써, 심장 마비 및 졸중이 발생할 위험이 높은 환자에서 심근 경색 및 뇌 경색으로 인한 손상을 감소시키는 방법을 포함한다. 바람직하게, 이러한 손상의 치료법은 상기 화합물을 비경구 투여함으로 수행된다. 임의의 기타 적당한 방법 예를 들어, 심근 경색증의 경우 심장 직접 주입법이 사용될 수 있다. 이러한 주입법 수행용 장치는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 예로서는 Aboject 심장 시린지가 있다.
본 발명은 추가로, LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물을 포유 동물의 기관, 조직 및 세포를 배양 또는 유지시키는 용도로 사용되는 임의의 매질 또는 용액에 유효량 첨가함으로써, 세포내 고사의 제한 및 예방 방법, 또는 포유 동물 기관, 조직 및 세포의 배양 또는 유지 동안에 세포를 보존하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 포유동물 기관, 조직 및 세포의 배양 및 유지 분야에 공지된 매질 및 용액을 포함하며, 이는 LPA 수용체에 대한 작용제 활성을 갖는 화합물을, 세포, 조직 또는 기관 기능을 보존 또는 회복시키거나, 또는 배양액중 세포의 고사를 제한 또는 예방하는데 유효한 양으로 포함한다. 본 발명의 이러한 측면은 LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 1 이상의 화합물을 유효량 포함하는, 포유 동물 세포 배양 배지, 및 세포, 조직 또는 기관의 기능을 보존 또는 회복시키거나, 또는 포유 동물 세포 배양액중 고사를 제한 또는 방지하는 배지의 용도를 포함한다. 유효량은 고사의 속도를 감소시키고/감소시키거나 세포, 조직 또는 기관을 보존하는 양을 의미한다. 이러한 화합물은, 고사를 정상적으로 촉진하는 온화한 외상을 세포에 입히는 환경하에서 고사를 제한 또는 방지할 수 있다. 대표적인 외상으로서는 저농도 자극, 동결 세포 스톡의 해동, 배양 배지 온도, pH, 삼투성 또는 이온 농도의 급격한 변화, 배양 배지의 비최적 온도, pH, 삼투성 또는 이온 농도에의 기관 노출, 세포 독소에의 노출, 1차 세포 배양(또는 무혈청 배지중 성장)중 원상태 조직으로부터 유래된 세포의 해리 및 혈청 제거를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 조직 배양 배지 및 LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 유효량의 화합물을 함유하는 조성물을 포함한다. 항고사 배지 보충물로서 조성물이 첨가될 수 있는 무혈청 배지는 AIM V (P Media, Neuman and Tytell's Serumless Media, Trowel's T8 Media, Waymouth's MB 752/1 및 705/1 Media, 및 Williams' Media E를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 무혈청 배지 이외에도, LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물이 항고사 배지 보충물로서 첨가될 수 있는 적당한 포유 동물 세포 배양 배지는 Basal Media Eagle's, Fischer's Media, McCoy's Media, Media 199, RPMI Media 1630 및 1640, F-10 & F-12 Nutrient Mixtures계 Media, Leibovitz's L-15 Media, Glasgow Minimum Essential Media, 및 Dulbecco's Modified Eagle Media를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물이 추가로 첨가될 수 있는 포유 동물 세포 배양 배지는 당 업계에 공지된 임의의 배지 보충물을 포함한다. 대표적인 보충물로서는 당, 비타민, 호르몬, 메탈로프로테인 항생제, 항사상균제, 성장 인자, 리포단백질 및 혈청을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 추가로 이식 이전에 포유 동물 기관을 유지시키기 위한 용액(여기서 상기 용액은 LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물을 유효량 포함함), 및 이식전 기관을 제거 및 취급할때 처리된 포유 동물 기관의 고사를 제한 또는 방지하는 기관의 기능을 보존 또는 회복시키는데 있어서 이러한 용액의 용도를 포함한다. 이 용액은 기관의 쇄도, 관류 및/또는 저장에 사용될 수 있다. 모든 경우에서, 기관의 손상을 제한하거나 또는 방지하는데 필요한 본 화합물(LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물)의 농도는 당업계에 공지된 방법에 의하여 당업자에 의해 실험적으로 측정될 수 있다.
전술한 바 이외에도, LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물은 피부에 국소 투여되어, 다수의 피부과적 증상들을 치료할 수 있다. 이러한 증상으로서는 노화 및/또는 광 손상으로 인한 탈모 및 주름을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명은 또한 피부과적 증상을 치료하는 방법을 포함한다. 특히, 탈모는 머리카락의 모낭 세포의 고사에 의하여 일어날 수 있다(Stenn 등, "Expression of the bcl-2 Protooncogene in the Cycling Adult Mouse Hair Follicle, "J. Invest. Dermatol.103: 107-111 (1994) ; 본 문헌은 본원에 참고 문헌으로 인용함). 따라서, LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물은 계속적인 탈모를 방지하기 위한 피부의 국소 치료에 사용하기에 적당하다.
다수의 피부과적 증상들은 LPA 수용체에 대하여 작용제 활성을 갖는 화합물(또는 이를 포함하는 조성물)을 유효량 국소 도포하여 치료되는 것이 바람직하다. 이러한 화합물의 유효량은 피부과적 증상의 증후군을 완화 또는 감소시키는 양을의미한다. 바람직하게, 본 발명의 치료법을 수행한 결과, 정상 피부 기능의 피부과적 증상을 해결하거나 또는 정상적인 피부 기능이 회복되며 ; 뿐만 아니라, 증상의 완화 또는 경감도 본 발명에 포함된다.
발명의 개요
본 발명은 하기 화학식 I의 화합물에 관한 것이다:
상기 식에서,
X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O 또는 H와 -NR5R6의 조합이고;
X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
이고;
R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이며;
이때, 화학식 I의 화합물은 라이소포스파티드산, 포스파티드산, 환식 포스파티드산, 알케닐 글리세롤포스페이트, 디옥틸 글리세롤 피로포스페이트 또는 N-팔미토일-L-세린이 아니다.
또한, 본 발명의 화합물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물도 제공된다.
본 발명의 다른 관점은 LPA 수용체 길항제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계 및 LPA 수용체의 LPA-유도된 활성을 억제하는 데 효과적인 조건 하에서 상기 화합물과 LPA 수용체를 접촉시키는 단계를 포함하는, LPA 수용체에 대한 LPA 활성을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 LPA 수용체의 작용제 또는 LPA 수용체 길항제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계; 및 LPA 수용체의 활성을 조절하는데 효과적인 조건 하에서 상기 화합물과 LPA 수용체를 접촉시키는 단계를 포함하는, LPA 수용체 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 화합물을 제공하는 단계 및 암 치료에 효과적인 방식으로 환자에게 상기 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는,암 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계 및 세포상의 LPA 수용체와 상기 화합물을 상기 세포의 LPA 수용체-유도된 증식을 증강시키는 데 효과적인 방식으로 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 증식을 증강시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계 및 상처 부위에 상기 화합물의 유효량을 전달하는 단계로서, 이때 상기 화합물은 상처 치료를 촉진하는 세포 상의 LPA 수용체에 결합함으로써 LPA 수용체의 작용제-유도된 세포 증식을 자극하여 상처 치료를 촉진하는 단계를 포함하는, 상처를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 화합물을 제조하는 한 방법은
(Y2O)2PO-Z11-Z13또는 (Y2O)2PO-Z12-P(OH)O-Z11-Z13[식중, Z11은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H- 또는 -O-이고;
Z12는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
Z13은 H 또는 제1 이탈기 또는 -Z11-Z13과 함께 제1 이탈기를 형성하고;
Y2는 H 또는 보호기임]과
하기 화학식 VI의 중간체 화합물을 반응시키고, 이어서, 필요에 따라 탈보호 단계를 수행하는데, 이때 상기 반응 단계 및 탈보호 단계는 화학식 I의 화합물[식중, X1, X2및 X3중 한개 또는 두개는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1- 임]을 생성하기에 효과적인 조건 하에서 수행된다:
상기 화학식에서,
X11, X12및 X13중 적어도 하나는 R11-Y11-A-(이때, X11, X12및 X13중 두개가 R11-Y11-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X12및 X13은 함께 -N(H)-C(O)-N(R11)-로서 연결되고;
X11, X12및 X13중 적어도 하나는 OH, NH2, SH 또는 제2 이탈기이고;
임의로 X11, X12및 X13중 하나는 H이고;
A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
Y11은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
Q11및 Q12는 독립적으로 H2, =NR13, =O 또는 H와 -NR14R15의 조합이고;
X11, X12또는 X13각각에 있어서 R11은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
이고;
R12, R13, R14, R15, R16및 R17은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
본 발명의 또 다른 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계; 및 세포, 조직 또는 기관와 상기 세포, 조직 또는 기관에서 세포고사를 치료하거나 기능을 보전 또는 회복시키는 데 효과적인 상기 화합물의 양을 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포, 조직 또는 기관에서 세포고사를 치료하거나 기능을 보전 또는 회복시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물이 배양물 내에서 세포의 세포고사를 예방하고 세포를 보전하는 데 효과적인 양으로 존재하는 배양 배지 내에서 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 세포 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계 및 기관 또는 조직을 상기 기관 또는 조직 기능을 보전하는 데 효과적인 양의 상기 화합물을 포함하는 용액으로 치료하는 단계를 포함하는, 기관 또는 조직의 보존 방법에 관한 것이다.
본 발명의 관련 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계 및 이식된 기관 또는 조직의 수혜자에게 상기 기관 또는 조직 기능을 보존하는 데 효과적인 화합물의 양을 투여하는 단계를 포함하는, 기관 또는 조직을 보존하는 대안적인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 LPA 수용체의 작용제로서의 활성을 보유하는 본 발명의 화합물을 제공하는 단계; 및 환자에게 피부학적 상태를 치료하는 데 효과적인 양으로 존재하는 상기 화합물을 포함하는 조성물을 국소 투여하는 단계를 포함하는, 피부학적 상태의 치료 방법에 관한 것이다.
하나 이상의 LPA 수용체의 작용제 또는 길항제로서 확인된 본 발명의 화합물은 LPA 수용체 신호전달에 의해 매개되는 생화학적 경로를 각각 억제 또는 증강시키기 위한 용도로 사용할 수 있다. LPA 수용체 신호전달을 조절함으로써, 상기 길항제 및 작용제는 암을 치료하고 상처 치료를 촉진하는 데 특이적이며 실질적으로 사용할 수 있다.
실시예
이하 실시예는 단지 첨부된 청구의 범위에 설정된 바와 같은 본 발명의 영역을 예시하기 위한 것일 뿐 어떠한 수단에 의해서도 그 영역을 제한하기 위한 것이 아니다.
물질 및 방법
토마스-후버(Thomas-Hoover) 모세관 융점(mp) 장치를 사용하여 모든 융점(mp)을 측정하고, 보정하지 않았다.
1H 및13C 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼은 브루커(Bruker) AX 300 분광계(300, 75.5 MHz) 상에서 기록하였다. 화학 이동 값(δ)을 테트라메틸실란(TMS)에 상대적인 ppm(parts per million)으로서 표현하였다. 피이크는 s(단일 피이크), d(이중 피이크), t(삼중 피이크), q(사중 피이크), bs(넓은 단일 피이크), m(다중 피이크)와 같이 약어로 나타내었다.
양성자, 탄소-13 및 인-31 핵자기 공명 스펙트럼은 브루커 AX 300 분광계 상에서 얻었다. 양성자 및 탄소-13에 대한 화학 이동 값을 테트라메틸실란(TMS)에 상대적인 ppm으로서 기록하였다. 인-31에 대한 스펙트럼을 아세톤-d6중의 0.0485M트리페닐포스페이트(δ= 0 ppm)에 상대적인 ppm(δ)으로서 기록하였다.
적외선(IR) 스펙트럼은 퍼킨 엘머 시스템(Perkin Elmer System) 200-FTIR 상에서 기록하였다. 질량 스펙트럼(MS)은 양성 모드 또는 음성 모드로 ESI(Electrospray Interface)를 이용하여 직접 주입에 의한 브루커 에스콰이어 AG 분광계 또는 브루커 에스콰이어 LS/MS 분광계 상에서 기록하였다. 스펙트럼 데이터가 할당된 구조와 일치하였다.
원소 분석을 아틀란틱 마이크로랩 인코포레이티드(Atlantic Microlabs, Inc)(조지아주 노르크로스 소재)에서 구입한 장치에 의해 수행하였고, 실측된 값은 이론 값의 ±4%에 속하였다.
실라카 겔(Merck, 230-400 메쉬 또는 200-425 메쉬, 60Å)을 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 사용하였다.
분석 TLC는 알루미늄 백킹(두께 200 또는 250 마이크론)을 지닌 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 실리카 겔 60F 254 TLC 시이트 상에서 수행하였다.
모든 시약, 용매 및 크로마토그래피 매질을, 달리 특별한 언급이 없는 한, 알드리치 케미칼 컴파니(Aldrich Chemical Company)(위스콘신주 밀워키 소재), 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(펜실베니아주 피츠버그 소재) 또는 시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Co.)(미조리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였고, 추가 정제 없이 사용하였다. 테트라히드로푸란(THF)은 지시약(indicator)로서 벤조페논과 함께 나트륨 금속으로부터 증류에 의해 건조시켰다. 무수 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2)를 수소화칼슘(CaH2)으로부터 증류시켰다. 모든 모노 글리세라이드는 Nu-Check-Prep(미네소타주 미네아폴리스 소재)로부터 구입하였다. t-Boc-L-세린을 플루카(Fluka)로부터 구입하였다.
모든 지질은 아반티 폴라 리피드즈(Avanti Polar Lipids)(알바나주 알라바스터 소재)로부터 구입하였다. 지방산-유리(free) 소 혈청 알부민(BSA). 사용하기 전에, LPA는 1mM EGTA를 함유하는 Ca2+-유리(free) 행스(Hank's) 균형 염 용액 중에 용해된 1mM BSA와 1:1 비율의 몰비로 복합체를 이루었다. 다른 모든 지질의 분취액을 적용하기 전에 또는 달리 특별한 지시가 없는 한 MeOH에 용해시키고, LPA와 혼합하였다.
시토펙텐 트랜스펙션(cytofectene transfection) 시약은 Bio-Rad(캘리포니아주 헤르쿨레스 소재)로부터 구입하였다. Fura-2-AM을 몰리큘라 프로브스(Moelcular Probes)(오리건주 유진 소재)로부터 구입하였다.
배양 배지, 소 태아 혈청(FBS: fetal bovine serum) 및 G418은 셀그로(Cellgro)(버지니아주 헤르돈 소재)로부터 구입하였다.
인간 Edg-4를 안정하게 발현하는 RH7777 세포는 케빈 린치 박사(Dr.Kevin Lynchi)(버지니아주 샤를롯테스빌 소재, 버지니아 대학)에 의해 호의적으로 제공받았다. pCDNA3 발현 플라스미드(캘리포니아주 칼스배드 소재, Invirtogen) 내에 삽입된, 인간 Edg-4 및 -7을 코딩하는 Flag-태그화된(tagged) cDNA's는 준켄 아오키 박사(Dr.Junken Aoki)(일본 동경 소재, 동경 대학)로부터 관대하게 기증받았다. 관대한 기증이었다. RH7777 세포 및 NIH3T3 세포를 ATCC(American Type Culture Collection)(버지니아주 매나사스 소재)로부터 얻었다. HEY 세포는 리사 제닝스 박사(테네시주 메피스 대학)에 의해 제공받았다. 모든 세포주는 10% FBS 및 2 mM 글루타민을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 중에 유지하였다. 난모세포를 전술한 문헌(Tigyi 등, 1999)에서 설명한 바와 같이 성인 제노퍼스 라비스 프라그(adult Xenopus laevis frog)로부터 얻었다.
안정한 트랜스펙션
RH7777 세포는 인간 Edg-2, Edg-4, or Edg-7을 코팅하는 cDNA 구성물로 트랜스펙션 처리한 후, 제조업자의 프로토콜에 따라 시토펙텐 트랜스펙션 시약을 사용하여 pCDNA3 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. 트랜스팩션 처리된 세포는 10% FBS 및 1 mg/ml 게네티신을 함유하는 DMEM 중에서 선택하였다. 내성 세포를 수집하고, 제한 희석에 의해 서브클로닝하였다. 이어서, 형성된 클론은 기능적 측정검사 및 RT-PCR 분석을 이용하여 선별하였다. 데이터는 3개의 개별 클론의 대표 값을 나타낸다.
트란시언트(transient) 트랜스펙션
RH7777 세포를 트랜스펙션 처리 하루 전에 폴리리신-코팅된 유리 커버슬립(뉴저지주 빈랜드 소재, Bellco) 상에 평판 배양하였다. 그 다음 날, 세포를 시토펙텐 6 ㎕와 혼합된 플라스미드 DNA 1 ㎍으로 밤새(16~18 시간) 트랜스펙션 처리하였다. 이어서, 세포를 DMEM으로 2회 세척하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 중에 배양하였다. 그 다음 날, 세포를 DMEM으로 세척하고, 혈청은 새포내 Ca2+를 모니터링하기 전에 최소 2 시간 동안 회수하였다.
새포내 Ca 2+ 의 측정 및 데이터 분석
세포내 Ca2+의 변화는 전술한 문헌(Tigyi 등, 1999)에서 설명한 바와 같이 형광성 Ca2+지시약 Fura-2 AM을 사용하여 모니터링하였다. 세포내 Ca2+측정치로부터 얻어지는 데이터 점은, FL WinLab 소프트웨어(매사추세츠주 웰슬레이 소재, Perkin-Elmer)에 의해 측정할 때, 유도된 Ca2+트란시언트(transient)의 전체 피이크 면적을 나타낸다. 데이터 점은 3 이상의 측정치의 평균 ± 표준 편차를 나타낸다. 데이터 점의 유의수준은 스튜던트 t-테스트를 이용하여 측정하였으며, 값은 p ＜ 0.005에서 유의적인 것으로 간주하였다.
제노퍼스 난모세포(Xenopus oocyte)에서의 전기생리학적 기록
LPA에 의해 유도된 변동하는 Cl-전류는 전술한 문헌(Tigyi 등, 1999)에서 설명한 바와 같이 2-전극 전압 클램프 시스템을 사용하여 기록하였다.
Edg 및 PSP24 mRNA의 RT-PCR 분석
RT-PCR에 의한 Edg 및 PSP24 수용체 mRNA의 동정은, 다음과 같은 올리고뉴클레이티드 서열을 사용하여 전술한 문헌(Tigyi 등, 1999)에서 설명한 바와 같이 수행하였다.
EDG-1
순방향 프라이머 5'-81TCATCGTCCGGCATTACAACTA-3'(SEQ.ID No.9);
역방향 프라이머 5'-GAGTGAGCTTGTAGGTGGTG351-3'(SEQ.ID No.10);
EDG-2
순방향 프라이머 5'-65AGATCTGACCAGCCGACTCAC-3'(SEQ.ID No.11);
역방향 프라이머 5'-GTTGGCCATCAAGTAATAAATA422-3'(SEQ.ID No.12);
EDG-3
순방향 프라이머 5'-137CTTGGTCATCTGCAGCTTCATC-3'(SEQ.ID No.13);
역방향 프라이머 5'-TGCTGATGCAGAAGGCAATGTA597-3'(SEQ.ID No.14);
EDG-4
순방향 프라이머 5'-634CTGCTCAGCCGCTCCTATTTG-3'(SEQ.ID No.15);
역방향 프라이머 5'-AGGAGCACCCACAAGTCATCAG1185-3'(SEQ.ID No.16);
EDG-5
순방향 프라이머 5'-11ATGGGCAGCTTGTACTCGGAG-3'(SEQ.ID No.17);
역방향 프라이머 5'-CAGCCAGCAGACGATAAAGAC720-3'(SEQ.ID No.18);
EDG-6
순방향 프라이머 5'-280TGAACATCACGCTGAGTGACCT-3'(SEQ.ID No.19);
역방향 프라이머 5'-GATCATCAGCACCGTCTTCAGC790-3'(SEQ.ID No.20);
EDG-7
순방향 프라이머 5'-91AGCAACACTGATACTGTCGATG-3'(SEQ.ID No.21);
역방향 프라이머 5'-GCATCCTCATGATTGACATGTG446-3'(SEQ.ID No.22);
EDG-8
순방향 프라이머 5'-88ATCTGTGCGCTCTATGCAAGGA-3'(SEQ.ID No.23);
역방향 프라이머 5'-GGTGTAGATGATAGGATTCAGCA1161-3'(SEQ.ID No.24);
PSP24
순방향 프라이머 5'-320CTGCATCATCGTGTACCAGAG-3'(SEQ.ID No.25); 및
역방향 프라이머 5'-ACGAACTCTATGCAGGCCTCGCl184-3'(SEQ.ID No.26).
세포 증식 측정검사
NIH3T3 세포의 증식은 전술한 문헌(Tigyi 등, 1999)에서 설명한 바와 같이 직접 세포 계수법에 의해 평가하였다. NIH3T3 세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM 중에서 24-웰 평판 내에 10,000 세포/웰의 밀도로 평판 배양하였다. 다음 날, 세포를 세척하고, 혈청은 DMEM 중에서 6 시간 동안 회수하였다. 이어서, 지질을 24 시간 동안 첨가하였다. 세포 수는 쿨터(Coulter) 계수기(플로리다주 히알리흐 소재, Coulter Electronics)에서 계수함으로써 측정하였다.
3 H-티미딘의 혼입
RH7777 세포 내로3H-티미딘의 혼입은 전술한 문헌((Tigyi 등, 1994)에서 설명한 바와 같이 측정하였다.
실시예 1 - N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤, 중간체 화합물 25의 합성
500 ml 3목 플라스크에 저온 온도계 및 100 ml 적하 깔대기를 구비시켰다. 모든 유리 기구는 사용하기 전에 아르곤(Ar) 하에 가열 건조시키고 실온으로 냉각하였다. 플라스크에 트리페닐포스핀(Ph3P)(10 g, 38 mmol, 진공 하에 72 시간 동안 P2O5로 건조됨) 및 새롭게 증류된 THF(90 ml)를 첨가하였다. 이 용액을 아르곤 하에 -78℃(무수 얼음-아세톤 조(bath)에서 냉각 및 교반하였다. 강력하게 교반하면서, 새롭게 증류된 디에틸 아조디카르복실레이트(DEAD)(6.2 ml, 39.9 mmol)를 주사기로 30 분에 걸쳐 첨가하였다. 첨가를 종료한 후, 이 혼합물을 유백색 페이스트가 얻어질 때까지(약 30-40 분) 교반하였다. 새롭게 증류된 THF(75 ml) 중의 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린(화합물 24)(7.79 g, 38 mmol, 진공 하에 72 시간 동안 P205로 건조됨)의 용액을 반응 혼합물에 45 분에 걸쳐 첨가하였다. 이 혼합물을 아르곤 하에 -78℃에서 밤새 교반하고, 0℃로 가온하였다(온도가 -10℃에 도달하였을 때, 플라스크를 빙조(ice batch) 내에 배치하였다).약 30 분 후 빙조를 수조(water bath)로 교체하고, 반응 혼합물을 2 시간 동안 교반하며, 회전 증발기 상에서 30℃ 하에 농축하여 담황색 오일을 얻었다. 이어서, 그 오일을 25% EtOAc/헥산(100 ml)으로 처리하고, 형성된 백색 고체를 여과로 제거하며, 25% EtOAc/헥산(2 x 70 ml)으로 세척하고, 합한 여과액을 농축하며, 잔류 오일은 25%(500 ml) 및 30%(1500 ml) EtOAc/헥산을 연속적으로 사용하여 실리카 겔 상에서의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획들을 합하여 백색 고체로서 화합물 25(3.4 g, 47%)를 얻었다: mp 119-121℃ 분해(Lit. 119.5-120.5℃ 분해);1H NMR(CD2Cl2) δ1.44(s,9H), 4.38-4.42(m,2H), 4.96-5.03(q,J1=6.1Hz,J2=12.5Hz,1H), 5.39(s,br,1H);13C NMR(CD2Cl2) δ 28.31, 60.01, 66.63, 81.50, 155.01, 169.94; IR(KBr) 3361, 2978, 1843, 1680, 1533, 1370, 1292 cm-1; 원소 분석, C8H13NO4에 대한 이론치: C, 51.33; H, 6.94; N, 7.50. 실측치: C, 51.41; H, 7.01; N, 7.51.
실시예 2 - 화합물 26-34의 합성
사용된 유리 기구를 아르곤 대기 하에 가열 건조시키고 실온으로 냉각하였다. 반응을 아르곤 대기 하에 수행하였다. THF는 사용하기 전에 새롭게 증류하였다.
화합물 26: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(노닐아미노)-2-옥소에틸]카르바메이트
THF(60 ml) 중의 데실 아민(490 mg, 3.20 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(300 mg, 1.60 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 백색 왁스상 분말로서화합물 26(290 mg, 52%)을 얻었다: mp 50-52℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.88(t,J=6.4Hz,3H), 1.26(s,14H), 1.46(s,9H), 3.04(bs,1H), 3.16-3.34(m,2H), 3.63(m,1H), 4.06-4.15(m,2H), 5.53(bs,1H), 6.63(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.09, 22.65, 26.80, 28.27, 29.24, 29.27, 29.37, 29.50, 29.51, 31.86, 39.43, 54.34, 62.87, 77.20, 80.34, 171.52; IR(KBr) 3282, 3098, 2929, 2856, 1666, 1547, 1467, 1369, 1300, 1248, 1179 cm-1; 원소 분석, Cl6H32N204에 대한 이론치: C, 62.76; H, 10.53; N, 8.13. 실측치: C, 63.00; H, 10.46; N, 7.98.
화합물 27: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-(테트라데실아미노)에틸]카르바메이트
THF(40 ml) 중의 테트라메틸 아민(273 mg, 1.28 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(200 mg, 1.06 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 27(245 mg, 57%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 59-62℃;1H NMR(CDCl3) δ0.88(t,J=6.3Hz,3H), 1.25(s,24H), 1.45(s,9H), 3.15-3.36(m,3H), 3.63-3.65(m,1H), 4.07-4.13(m,2H),5.60-5.63(m,1H), 6.72(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.10, 22.66, 26.81, 27.99, 28.27, 29.25, 29.33, 29.37, 29.50, 29.57, 29.62, 29.66, 31.90, 39.47, 54.58, 62.87, 77.20, 80.52, 156.34, 171.37; IR(KBr) 3345, 2920, 2852, 1708, 1688, 1655, 1637, 1572, 1529, 1472, 1248, 1173 cm-1; 원소 분석, C22H44N204에 대한 이론치: C, 65.96; H, 11.07; N, 6.99. 실측치: C, 66.04; H, 11.17; N, 6.96.
화합물 28: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(옥타데실아미노)-2-옥소에틸] 카르바메이트
THF(60 ml) 중의 옥타데실 아민(516 mg, 2.08 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(300 mg, 1.60 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 28(300 mg, 41%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 69-71℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.88(t,J=6.3Hz,3H), 1.25(s,30H), 1.46(s,9H), 3.03(bs,1H), 3.16-3.34(m,2H), 3.63(m,1H), 4.05-4.21(m,2H), 5.64(bs,1H), 6.62(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.10, 22.68, 26.81, 28.28, 29.25, 29.35, 29.51, 29.58, 29.69, 31.91, 39.43, 54.29, 62.87, 77.20,171.53; IR(KBr) 3345, 2919, 2852, 1687, 1636, 1570, 1528, 1473, 1305, 1173 cm-1; 원소 분석, C26H52N204ㆍ0.2C4H802에 대한 이론치: C, 67.86; H, 11.39; N, 5.91. 실측치: C, 67.59; H, 11.46; N, 6.1.
화합물 29: tert-부틸 N-{1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-[4-(테트라데실옥시) 아닐리노]에틸}카르바메이트
THF(40 ml) 중의 4-(테트라데실옥시)아닐린(150 mg, 0.490 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(91 mg, 0.490 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 48 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(2회)로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 29(110 mg, 45%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 92-94℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.6Hz,3H), 1.25(s,22H), 1.48(s,9H), 1.76(m,2H), 3.67-3.72(dd,J1=4.9Hz,J2=7.2Hz,1H), 3.92(t,J=6.5Hz,2H), 4.23-4.26(m,2H), 5.65(bs,1H), 6.83-6.87(m,Jo=8.9Hz,2H), 7.36-7.40(m,Jo=8.9Hz), 8.6(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.10, 22.69, 26.01, 28.28, 29.25, 29.34, 29.39, 29.56, 29.58, 29.64, 31.91, 62.53, 68.30, 77.20, 111.17, 114.81, 121.70, 130.25, 156.22, 169.78; IR(KBr) 3304, 2920, 2852,1658, 1514, 1472, 1238, 1174 cm-1; 원소 분석, C28H48N205ㆍ0.05CHCl3에 대한 이론치: C, 67.56; H, 9.71; N, 5.62. 실측치: C, 67.80; H, 9.67; N, 5.60.
화합물 30: tert-부틸 N-[l-(히드록시메틸)-2-(4-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트
THF(20 ml) 중의 p-아니시딘(100 mg, 0.8 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(151 mg, 0.8 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, CHCl3/헥산으로부터 결정화시켜서 화합물 30(135 mg, 54%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 109-111℃;1H NMR(CDCl3) δ 1.48(s,9H), 3.68-3.73(m,1H), 3.80(s,3H), 4.24-4.27(m,2H), 5.68(bs,1H), 6.83-6.88(m,Jo=9Hz,2H), 7.37-7.42(m,Jo=9Hz,2H), 8.61(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 28.29, 54.96, 55.47, 62.54, 81.00, 114.18, 121.78, 130.45, 156.64, 156.98, 169.59; IR(KBr) 3340, 2978, 1673, 1603, 1516, 1298, 1238 cm-1; 원소 분석, C15H22N205에 대한 이론치: C, 58.05; H, 7.15; N, 9.03. 실측치: C, 58.04; H, 7.17; N, 9.06.
화합물 31: tert-부틸 N-{1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-[3-(테트라데실옥시)아닐리노]에틸}카르바메이트
THF(25 ml) 중의 3-(테트라데실옥시)아닐린(179 mg, 0.588 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(91 mg, 0.490 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 48 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 31(105 mg, 43%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 70-72℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.88(t,J=6.6Hz,3H), 1.26(s,22H), 1.48(s,9H), 1.76(m,2H), 3.67-3.73(dd,J1=5.1Hz,J2=6.9Hz,1H), 3.93(t,J=6.5Hz,2H), 4.23-4.26(m,2H), 5.66(bs,1H), 6.64-6.68(m,1H), 6.93-6.96(m,1H), 7.19(t,Jo=8.1Hz,1H), 7.23(t,Jm=2Hz,1H), 8.75(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.11, 22.68, 26.02, 28.28, 29.23, 29.35, 29.39, 29.60, 29.66, 31.92, 62.38, 68.07, 77.20, 106.22, 111.10, 111.92, 129.67, 138.54, 159.75; IR(KBr) 3368, 2918, 2851, 1679, 1618, 1498, 1472, 1286 cm-1; 원소 분석, C28H48N2O5ㆍ 0.05CHCl3에 대한 이론치: C, 67.56; H, 9.71; N, 5.62. 실측치: C, 67.44; H, 9.79; N, 5.57.
화합물 32: tert-부틸 N-[1-(히드록시메틸)-2-(3-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트
THF(30 ml) 중의 m-아니시딘(171 mg, 1.38 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(200 mg, 1.06 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 32(154 mg, 46%)을 황색 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 1.48(s,9H), 3.68-3.73(dd,J1=4.8Hz,J2=6.9Hz,1H), 3.75(s,3H), 4.22-4.25(d,J=10.23Hz,2H), 5.66(bs,1H), 6.66-6.69(m,1H), 6.96-6.99(m,1H), 7.21(m,Jo=8.1Hz,1H), 7.24(m,1H), 8.79(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 28.28, 29.68, 55.30, 62.39, 77.20, 81.11, 105.67, 110.55, 112.15, 129.73, 138.63, 160.19, 169.89.
화합물 33: tert-부틸 N-{1-(히드록시메틸)-2-옥소-2-[2-(테트라데실옥시) 아닐리노]에틸}카르바메이트
THF(25 ml) 중의 2-(테트라데실옥시)아닐린(200 mg, 0.654 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(102 mg, 0.545 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 48 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 33(33 mg, ＜10%)을 황색 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.88(t,J=6.6Hz,3H), 1.26(s, 22H), 1.48(s,9H), 1.76(m,2H), 3.67-3.73(dd,J1=5.1Hz,J2=6.9Hz,1H), 3.93(t,J=6.5Hz,2H), 4.23-4.26(m,2H), 5.66(bs,1H), 6.64-6.68(m,1H), 6.93-6.96(m,1H), 7.19(t,Jo=8.1Hz,1H), 7.23(t,Jm=2Hz,1H), 8.75(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.10, 22.68, 25.88, 28.30, 29.17, 29.35, 29.58, 29.64, 29.68, 31.91, 55.73, 63.03, 68.71, 77.20, 111.06, 119.86, 119.86, 120.78, 124.21, 127.27, 147.75, 157.22, 169.25.
화합물 34: tert-부틸 N-[l-(히드록시메틸)-2-(2-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트
THF(30 ml) 중의 o-아니시딘(238 mg, 1.93 mmol)의 용액에 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-세린 β-락톤(200 mg, 1.06 mmol)을 첨가하고, 이 혼합물을 아르곤 하에 48 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 회전식 증발기 상에서 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, CHCl3/헥산으로부터 결정화시켜서 화합물 34(150mg, 45%)을 황색 분말로서 얻었다: mp 92-94℃;1H NMR(CDCl3) δ 1.49(s,9H), 3.87(s,3H), 3.73-3.83(m,1H), 4.21-4.34(m,2H), 5.64(bs,1H), 6.86-6.97(m,2H), 7.03-7.09(m,Jo=7.80Hz,Jm=1.8Hz,1H), 8.28-8.31(dd,Jo=8.9Hz,Jm=1.5Hz,1H) 8.9(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 28.28, 55.73, 62.87, 80.65, 110.14, 120.03, 120.97, 124.30, 127.13, 148.33, 169.43; IR(KBr) 3525, 3319, 2982, 1672, 1653, 1548, 1528, 1465, 1256, 1160, 1006 cm-1; 원소 분석, C15H22N205에 대한 이론치: C, 58.05; H, 7.15; N, 9.03. 실측치: C, 58.04; H, 7.07; N, 8.85.
실시예 3 - 화합물 35-43의 합성
화합물 35: N-1-노닐-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(1 ml) 중의 화합물 26(20 mg, 0.0580 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 35(19 mg, 95%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 168-170℃;1H NMR(CD30D) δ 0.88(t,J=6.3Hz,3H), 1.27(s,14H), 1.50(m,2H), 3.20(t,J=6.0Hz,2H), 3.70-3.78(m,1H), 3.81-3.88(m,2H);13C NMR(CD30D) δ 14.44, 23.74, 27.96,30.30, 30.42, 30.47, 30.70, 30.73, 30.78, 30.80, 33.10, 40.71, 56.30, 61.77, 167.97; IR(KBr) 3280, 2919, 2850, 1654, 1573, 1464, 1231, 1141, 1089, 1059, cm-1. 원소 분석, C13H28N202ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 50.27; H, 8.16; N, 7.82. 실측치: C, 50.15; H, 8.30; N, 7.95.
화합물 36: N-l-테트라데실-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(1.5 ml) 중의 화합물 27(50 mg, 0.124 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(1.5 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 36(48 mg, 94%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 168-171℃;1H NMR(CD30D) δ 0.89(t,J=6.3Hz,3H), 1.28(s,22H), 3.22(t,J=6.0Hz,2H), 3.73-3.80(m,1H), 3.84-3.91(m,2H);13C NMR(CD30D) δ 14.43, 23.73, 27.95, 30.29, 30.41, 30.47, 30.69, 30.73, 30.78, 30.80, 33.08, 40.71, 56.29, 61.77, 167.99; IR(KBr) 3277, 2919, 2850, 1656, 1573, 1464, 1231, 1141, 1089, 1059 cm-1; 원소 분석, C17H36N202ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 55.06; H, 9.00; N, 6.76. 실측치: C, 54.94; H, 8.99; N, 6.58.
화합물 37: N-1-옥틸데실-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(1 ml) 중의 화합물 28(25 mg, 0.0547 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 37(23 mg, 92%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 170-172℃;1H NMR(CD30D) δ 0.89(t,J=6.4Hz,3H), 1.27(s,30H), 1.49-1.54(m,2H), 3.22(t,J=7.0Hz,2H), 3.74-3.81(m,1H), 3.83-3.91(m,2H);13C NMR(CD30D) δ 14.43, 23.74, 27.95, 30.30, 30.41, 30.47, 30.69, 30.78, 33.07, 40.71, 56.30, 61.77, 167.97; IR(KBr) 3276, 2919, 2850, 1657, 1468, 1207, 1181, 1138, 1059 cm-1; 원소 분석, C21H22N202ㆍCF3COOHㆍ0.15CH2Cl2에 대한 이론치: C, 57.53; H, 9.45; N, 5.80. 실측치: C, 57.45; H, 9.55; N, 5.81.
화합물 38: N-1-[4-(테트라데실옥시)페닐]-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(0.050 ml) 중의 화합물 29(54 mg, 0.110 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(0.050 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축한 후, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 38(55 mg, 99%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 135-139℃;1H NMR(CD30D), δ 0.89(t,J=6.3Hz,3H), 1.28(s,21H), 1.43(m,2H), 1.74(m,J=6.5Hz,2H), 3.86-4.03(m,5H), 6.84-6.88(m,JO=9.0Hz,2H), 7.41-7.47(m,JO=9.0Hz,2H);13C NMR(CD30D) δ 14.42, 23.72, 30.41, 30.46, 30.50, 30.67, 30.74, 33.06, 56.81, 61.72, 69.26, 115.71, 122.96, 131.84, 157.80, 166.06; IR(KBr) 3281, 2920, 2852, 1672, 1604, 1559, 1515, 1240, 1210, 1132 cm-1; 원소 분석, C23H40N203ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 59.27; H, 8.16; N, 5.53. 실측치: C, 59.48; H, 8.09; N, 5.49.
화합물 39: N-1-(4-메톡시페닐)-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(0.049 ml) 중의 화합물 30(50 mg, 0.161 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(0.049 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 39(50 mg, 96%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 182-183℃ 분해;1H NMR(CD30D) δ 3.76(s,3H), 3.87-3.94(m,1H), 3.97-4.04(m,2H), 6.85-6.91(m,JO=9.1Hz,2H), 7.44-7.49(m,JO=9.0Hz,2H);13C NMR(CD30D) δ 55.86, 56.80, 61.73, 115.07, 122.95, 131.99, 158.31, 166.10; IR(KBr) 3278, 3099, 2964,1673, 1562, 1517, 1196, 1131 cm-1; 원소 분석, C10H14N203ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 44.45; H, 4.66; N, 8.64. 실측치: C, 44.31; H, 4.67; N, 8.58.
화합물 40: N-1-[3-(테트라데실옥시)페닐]-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(0.062 ml) 중의 화합물 31(45 mg, 0.091 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(0.062 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 40(45 mg, 99%)을 황록색 고체로서 얻었다: mp 115-119℃;1H NMR(CD30D), δ 0.89(s,J=6.5Hz,3H), 1.28(s,21H), 1.43(m,2H), 1.75(m,J=6.5Hz,2H), 3.8-3.93(m,4H), 4.01-4.05(m,1H), 6.67-6.71(m,1H), 7.04-7.07(m,1H), 7.20(t,Jo=8.1Hz,1H), 7.28(t,Jm=2.1Hz,1H);13C NMR(CD30D) δ 14.44, 23.75, 27.18, 30.38, 30.49, 30.52, 30.73, 30.78, 33.09, 56.96, 61.66, 69.05, 107.71, 111.75, 113.16, 130.72, 140.16, 161.07, 166.36; IR(KBr) 3266, 2920, 2852, 1676, 1608, 1566, 1496, 1438, 1211, 1130, 1045 cm-1; 원소 분석, C23H40N2O3ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 59.27; H, 8.16; N, 5.53. 실측치: C, 59.49; H, 8.13; N, 5.41.
화합물 41: N-1-(3-메톡시페닐)-2-아미노-3-히드록시프로판아미드트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(1 ml) 중의 화합물 32(120 mg, 0.386 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 41(123 mg, 98%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 137-140℃;1H NMR(CD30D) δ 3.77(s,3H), 3.88-3.99(m,2H), 4.01-4.06(m,1H), 6.68-6.71(m,1H), 7.02-7.10(m,1H), 7.22(t,Jo=8.1Hz,1H), 7.29(t,Jm=2.1Hz,1H);13C NMR(CD30D) δ 55.70, 56.94, 61.67, 107.14, 111.11, 113.28, 130.73, 140.22, 161.61, 166.43; IR(KBr) 3265, 1675, 1609, 1566, 1496, 1433, 1268, 1196, 1044 cm-1; 원소 분석, C10H14N203ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 44.45; H, 4.66; N, 8.64. 실측치: C, 44.52; H, 4.59; N, 8.66.
화합물 42: N-1-[2-(테트라데실옥시)페닐]-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세테이트
CH2Cl2(1 ml) 중의 화합물 33(20 mg, 0.044 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 42(21 mg, 95%)을 회백색 고체로서 얻었다: mp 63-66℃;1HNMR(CD30D) δ 0.88(t,J=6.5Hz,3H), 1.27(s,21H), 1.46(m,2H), 1.83(m,J=7.8Hz,2H), 3.90-4.07(m,4H), 4.18(t,J=5.8Hz,1H), 6.87-6.93(m,1H), 6.99-7.02(m,1H), 7.08-7.14(m,1H), 7.96-7.99(m,1H);13C NMR(CD30D) δ 14.43, 23.73, 27.07, 30.27, 30.48, 30.57, 30.79, 33.07, 56.198, 61.67, 69.84, 112.93, 121.40, 123.38, 126.80, 127.53, 150.93, 166.74; IR(KBr) 3282, 2925, 2851, 1679, 1556, 1496, 1458, 1213, 750 cm-1; 원소 분석, C23H40N203ㆍCF3COOHㆍ0.5H2O에 대한 이론치: C, 58.24; H, 8.21; N, 5.43. 실측치: C, 58.59; H, 8.09; N, 5.24.
화합물 43: N-1-(2-메톡시페닐)-2-아미노-3-히드록시프로판아미드 트리플루오로아세트아미드
CH2Cl2(1 ml) 중의 화합물 34(80 mg, 0.257 mmol) 중의 냉각된(0℃, 빙조) 용액에 TFA(1 ml)를 아르곤 대기 하에 적가하였다. 첨가를 종료한 후, 반응 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반하고, 실온에서 감압 하에 농축하며, 진공 펌프로 건조시켜서 화합물 43(81 mg, 97%)을 회백색 고체로서 얻었다: mp 131-133℃;1H NMR(CD30D) δ 3.88(s,3H), 3.91-4.02(m,2H), 4.18-4.22(m,1H), 6.89-6.94(m,1H), 7.01-7.04(m,1H), 7.10-7.16(t,Jo=8.1Hz,1H), 8.00-8.03(t,Jn=2.1Hz,1H);13C NMR(CD30D) δ 56.27, 56.34, 56.47, 61.81, 111.94, 121.52, 123.21, 126.71,127.54, 151.43, 166.80; IR(KBr) 3271, 1675, 1546, 1499, 1465, 1439, 1268, 1207, 1130 cm-1; 원소 분석, C10H14N203ㆍCF3COOH에 대한 이론치: C, 44.45; H, 4.66; N, 8.64. 실측치: C, 44.18; H, 4.57; N, 8.59.
실시예 4 - 중간체 화합물 50-54의 합성
사용된 유리 기구를 아르곤 대기 하에 가열 건조시키고 실온으로 냉각하였다. 출발 알콜을 무수 피리딘으로 3회 세척하고, 고진공 하에 48 시간 동안 건조시켰다. 반응은 아르곤 대기 하에 수행하였다. THF 및 CH2Cl2는 사용하기 전에 새롭게 증류하였다.
화합물 50: tert-부틸 N-[1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-(노닐아미노)-2-옥소에틸]카르바메이트
피리딘-세척된 출발 화합물 28(252 mg, 0.551 mmol)에 1H-테트라졸(231 mg, 3.31 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(50 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트(1.14 gm, 3.31 mmol)을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비스설파이트(2 x 25 ml), NaHC03(2 x 30 ml), 물(2 x 30 ml) 및 염수(2 x 30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시키는 플래쉬 컬럼 클로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 50(195 mg, 49%)을 무색 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.4Hz,3H), 1.25(bm, 29H), 1.34(m,2H), 1.44(s,9H), 3.17-3.23(m,2H), 4.01-4.09(m,1H), 4.31-4.43(m,2H), 4.96-5.09(m,4H), 5.55(bs,1H), 6.33(bs,1H) 7.31-7.39(m, 10H);13C NMR(CDCl3) δ 14.09, 22.66, 26.79, 28.25, 29.24, 29.27, 29.42, 29.50, 29.53, 31.86, 39.68, 66.98, 69.66, 69.73, 77.20, 128.06, 128.10, 128.64, 128.70, 128.72, 135.02, 168.50; MS m/z 603(M-H)-; IR(KBr) 3349, 2919, 2852, 1717, 1685, 1654, 1516, 1470, 1457, 1242, 1163, 1037, 1025, 999 cm-1.
화합물 51: tert-부틸 N-[l-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-옥소-2-(테트라데실아미노)에틸]카르바메이트
피리딘-세척된 출발 화합물 27(305 mg, 0.761 mmol)에 1H-테트라졸(319 mg, 4.56 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(40 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트(1.57gm, 4.56 mmol)을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비스설파이트(2 x 30 ml), NaHC03(2 x 40 ml), 물(2 x 35 ml) 및 염수(2 x 35 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시키는 플래쉬 컬럼 클로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 51(451 mg, 89%)을 백색 왁스상 고체로서 얻었다: mp 33-35℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.4Hz,3H), 1.23-1.25(bm,22H), 1.44(s,9H), 1.52-1.55(m,2H), 3.16-3.23(m,2H), 4.02-4.09(m,1H), 4.31-4.43(m,2H), 5.00-5.15(m,4H), 5.57(bs,1H), 6.34(t,J=5.0Hz,1H) 7.31-7.40(m,10H);13C NMR(CDCl3) δ 14.08, 19.03, 22.67, 26.81, 28.27, 29.25, 29.33, 29.44, 29.51, 29.59, 29.62, 29.65, 31.91, 39.69, 46.49, 54.47, 67.00, 67.07, 67.24, 67.32, 69.66, 69.68, 69.74, 76.12, 77.20, 77.84, 80.57, 128.0, 128.05, 128.09, 128.58, 128.64, 128.68, 135.45, 135.54, 135.59, 168.51; 원소 분석, C36H57N207PㆍlH2Oㆍ0.5C4H802에 대한 이론치: C, 63.14;H, 8.78; N, 3.88. 실측치: C, 62.80; H, 8.38; N, 4.21.
화합물 52: tert-부틸 N-[l-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-(옥타데실아미노)-2-옥소에틸]카르바메이트
피리딘-세척된 출발 화합물 26(270 mg, 0.783 mmol)에 1H-테트라졸(329 mg, 4.70 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(50 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트(1.62 gm, 4.70 mmol)을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(50 ml)로 처리하고, Na-메타비스설파이트(2 x 25 ml), NaHC03(2 x 25 ml), 물(2 x 25 ml) 및 염수(2 x 25 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시키는 플래쉬 컬럼 클로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 52(135 mg, 28%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 52-54℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.4Hz,3H), 1.23(bm,14H), 1.44(s,9H), 1.63(m,2H), 3.17-3.24(m,2H), 4.01-4.09(m,1H), 4.30-4.44(m,2H), 5.00-5.05(m,4H), 5.56(bs,1H), 6.32(bs,1H) 7.29-7.39(m,10H);13C NMR(CDCl3) δ14.11, 22.68, 26.80, 28.25, 29.26, 29.35, 29.42, 29.52, 29.60, 29.64, 29.69, 31.91, 39.68, 67.00, 67.07, 69.69, 69.74, 77.20, 127.93, 128.06, 128.10, 128.65, 128.70, 128.73, 135.43, 168.51, 170.07; IR(KBr) 3349, 2919, 2852, 1717, 1685, 1654, 1516, 1242, 1163, 1037, 1025, 999 cm-1; 원소 분석, C40H65N207Pㆍ0.75H2Oㆍ1C4H802에 대한 이론치: C, 64.56; H, 9.17; N, 3.42. 실측치: C, 64.23; H, 9.05; N, 3.78.
화합물 53: tert-부틸 N-{1-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-옥소-2-[4-(테트라데실옥시)아닐리노]에틸}카르바메이트
피리딘-세척된 출발 화합물 29(310 mg, 0.647 mmol)에 1H-테트라졸(450 mg, 6.42 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(40 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트(2.21 gm, 6.42 mmol)을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비스설파이트(2 x 25 ml), NaHC03(2 x 35 ml), 물(2 x 35 ml) 및 염수(2 x 35 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시키는 플래쉬 컬럼 클로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 53(81 mg, 17%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 74-76℃;1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.5Hz,3H), 1.30(s,22H), 1.46(s,9H), 1.71-1.80(m,2H), 3.91(t,J=6.5Hz,3H), 4.01-4.16(m,1H), 4.42-4.49(m,2H), 4.96-5.09(m,4H), 5.65(bs,1H), 6.806.86(m,JO=9.0Hz,2H) 7.31-7.39(m,12H), 8.82(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 14.10, 22.67, 26.02, 28.26, 29.26, 29.34, 29.40, 29.57, 29.64, 31.91, 68.31, 69.84, 77.20, 114.79, 121.72, 128.07, 128.13, 128.65, 128.74,6 130.03, 166.71; IR(KBr) 3340, 2920, 2852, 1717, 1677, 1513, 1457, 1237, 1059, 998 cm-1; 원소 분석, C42H61N208PㆍlH2Oㆍ0.45C6H14: C, 66.31; H, 8.63; N, 3.46. 실측치: C, 65.92; H, 9.02; N, 3.84.
화합물 54: tert-부틸 N-[l-{([디(벤질옥시)포스포릴]옥시)메틸}-2-(4-메톡시아닐리노)-2-옥소에틸]카르바메이트
피리딘-세척된 출발 화합물 30(225 mg, 0.725 mmol)에 1H-테트라졸(254 mg, 3.625 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(20 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질디이소프로필 포스포아미데이트(1.25 gm, 3.625 mmol)을 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(70 ml)로 처리하고, Na-메타비스설파이트(2 x 15 ml), NaHC03(2 x 25 ml), 물(2 x 25 ml) 및 염수(2 x 25 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시키는 플래쉬 컬럼 클로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 54(195 mg, 47%)을 백색 고체로서 얻었다: mp 82-84℃;1H NMR(CDCl3) δ1.44(s,9H), 4.11(s,3H), 4.09-4.18(m,1H), 4.43-4.51(m,2H), 4.98-5.05(m,4H), 5.72(bs,1H), 6.78-6.82(m,JO=9.0Hz,2H) 7.26-7.33(m, 10H), 7.36-7.41(m,JO=9.0Hz,2H), 8.41(bs,1H);13C NMR(CDCl3) δ 28.26, 55.45, 66.93, 67.00, 69.76, 69.83, 69.90, 77.20, 80.91, 114.11, 121.75, 128.06, 128.12, 128.64, 128.72, 128.73, 130.38, 135.28, 135.42, 156.62, 166.75;31P NMR(CDCl3) δ 16.72(1P); IR(KBr)3337, 2969, 1716, 1689, 1665, 1514, 1457, 1304, 1245, 999 cm-1; 원소 분석, C19H35N208P에 대한 이론치: C, 61.05; H, 6.18; N, 4.91. 실측치: C, 60.80; H, 6.20; N, 4.88.
실시예 5 - 화합물 55-59의 합성
화합물 55: 2-아미노-3-(노닐아미노)-3-옥소프로필 디히드로겐 포스페이트
EtOH(15 ml) 중의 화합물 50(100 mg, 0.165 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 50 psi에서 4 시간 동안 수행하였다. 4 시간 후, TLC에 의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 55(48 mg, 90%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 196-198℃;1H NMR(CF3COOD) δ 0.81-0.82(m,3H), 1.26-1.30(m,14H), 1.59(m,2H), 3.37-3.38(m,2H), 4.54-4.59(m,1H), 4.72-4.81(m,2H);13C NMR(CF3COOD) δ 14.66, 24.39, 28.60, 28.60, 30.46, 30.94, 31.16, 31.30, 31.39, 33.81, 43.53, 57.21, 66.42, 167.86; MS m/z 323(M-H)-; IR(KBr) 3314, 2920, 2853, 1670, 1575, 1477, 1246, 1063, 1043 cm-1; 원소 분석, C13H29N205Pㆍ0.5CH30H에 대한 이론치: C, 47.64; H, 9.18; N, 8.23. 실측치: C, 47.24; H, 8.84; N, 8.02.
화합물 56: 2-아미노-3-옥소-3-(테트라데실아미노)프로필 디히드로겐 포스페이트
EtOH(15 ml) 중의 화합물 50(145 mg, 0.219 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 45 psi에서 3 시간 동안 수행하였다. 3 시간 후, TLC에 의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 56(75 mg, 90%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 189-190℃;1H NMR(CF3COOD) δ 0.81(bs,3H), 1.24(s, 23H), 1.57(m,2H), 3.37(m,2H), 4.54-4.58(m,1H), 4.73-4.78(m,2H);13C NMR(CF3COOD) δ 14.43, 24.16, 28.34, 30.21, 30.69, 31.01, 31.17, 31.22, 31.27, 33.62, 43.27, 56.96, 66.16, 167.60;31P NMR(CF3COOD) δ 17.93(1P); MS m/z 379(M-H)-; IR(KBr) 3318, 2923, 2852, 1671, 1657, 1563, 1475, 1242, 1055 cm-1; 원소 분석, C17H37N205P에 대한 이론치: C, 53.67; H, 9.80; N, 7.36. 실측치: C, 53.40; H, 9.73; N, 7.31.
화합물 56a: 2-(아세틸아미노)-3-옥소-3-(테트라데실아미노)프로필 디히드로겐 포스페이트
피리딘 0.5 ml 중의 화합물 56(20 mg, 0.052 mmol)의 샘플에 과량의 아세트산 무수물을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 과량의 피리딘 및 아세트산 무수물을 회전 증발기 상에서 제거하였다. 형성된 혼합물을 수성 HCl 20 ml와 함께 교반하였다. 산성 혼합물을 EtOAc(2 x 25 ml)로 세척하였다. EtOAc층을 물(2 x 25 ml)과 염수(2 x 25 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하였다. 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 56a(15 mg, 71%)을 고무질 고체로서 얻었다:1H NMR(CD30D), δ 0.89(t,J=6.3Hz,3H), 1.27(s,22H), 1.99-2.02(m,3H), 3.153.20(m,2H), 4.10-4.28(m,2H), 4.54-4.62(m,1H);13C NMR(CDCl3/CD30D) 13.48, 16.19, 22.23, 26.50, 28.91, 29.21, 31.48, 30.21, 31.01, 31.17, 31.22, 31.27, 33.62, 43.27, 56.96, 66.16, 163.02, 174.96; IR(KBr) 3316, 2923, 2853, 1671, 1657, 1560, 1467, 1247, 1059 cm-1.
화합물 57: 2-아미노-3-(옥타데실아미노)-3-옥소프로필 디히드로겐 포스페이트
EtOH(15 ml) 중의 화합물 52(117 mg, 0.164 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 50 psi에서 4 시간 동안 수행하였다. 4 시간 후, TLC에 의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 57(70 mg, 98%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 190-192℃;1H NMR(CF3COOD) δ 0.81(t,J=6.9Hz,3H), 1.25(s,31H), 1.58(m,2H), 3.34-3.44(m,2H), 4.49-4.59(m,1H), 4.71-4.81(m,2H);13C NMR(CF3COOD) δ 14.70, 24.43, 28.60, 30.46, 30.95, 31.28, 31.31, 31.44, 31.48, 31.55, 33.89, 43.53,57.12, 57.21, 66.35, 167.85; MS m/z 435(M-H)-; IR(KBr) 3325, 2922, 2852, 1674, 1655, 1560, 1472, 1045 cm-1; 원소 분석, C21H45N205P에 대한 이론치: C, 57.77; H, 10.39; N, 6.42. 실측치: C, 57.61; H, 10.22; N, 6.25.
화합물 58: 2-아미노-3-옥소-3-[4-(테트라데실옥시)아닐리노]프로필 디히드로겐 포스페이트
EtOH(15 ml) 중의 화합물 53(40 mg, 0.054 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 50 psi에서 4 시간 동안 수행하였다. 4 시간 후, TLC에 의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 58(22 mg, 88%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 187-190℃;1H NMR(CF3COOD) δ 0.80-0.82(m,3H), 1.25(m, 20H), 1.77-1.84(m,2H), 4.20(t,J=6.0Hz,2H), 4.64-4.74(m,1H), 4.90-4.91(m,2H), 7.04-7.07(d,Jo=9.0Hz,2H), 7.32-7.35(d,Jo=9.0Hz,2H);13C NMR(CF3COOD) δ 14.81, 24.54, 27.57, 30.62, 31.19, 31.38, 31.46, 31.52, 31.60, 31.65, 33.99, 57.70, 66.53, 73.66, 119.32, 126.55, 131.25, 158.87, 167.06; MS m/z 471(M-H)-; IR(KBr) 3325, 2923, 2852, 1665, 1553, 1515, 1469, 1240, 1046 cm-1; 원소 분석, C23H41N206P 0.5CH3OHㆍ0.5CHCl3에 대한 이론치: C, 52.58; H, 8.00; N, 5.11. 실측치: C, 52.89; H, 7.83; N, 5.29.
화합물 59: 2-아미노-3-(4-메톡시아닐리노)-3-옥소프로필 디히드로겐 포스페이트
EtOH(15 ml) 중의 화합물 54(125 mg, 0.219 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 45 psi에서 2 시간 동안 수행하였다. 2 시간 후, TLC에 의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 59(82 mg, 96%)을 백색 분말로서 얻었다: mp 199-202 ℃;1H NMR(CF3COOD) δ 3.93(s,3H), 4.65-4.75(m,1H), 4.88-4.94(m,2H), 7.01-7.04(d,Jo=9.0Hz,2H), 7.31-7.34(d,Jo=9.0Hz,2H);13C NMR(CDCl3) δ 57.60, 58.00, 66.54, 117.69, 126.64, 131.07, 159.62, 167.07; MS m/z 289(M-H)-1; IR(KBr) 3317, 2961, 1680, 1565, 1515, 1478, 1236, 1045 cm-1; 원소 분석, C10H15N206P에 대한 이론치: C, 41.39; H, 5.21; N, 9.65. 실측치: C, 41.25; H, 5.35; N, 9.73.
실시예 6 - 중간체 화합물 63-65의 합성
사용된 유리 기구를 아르곤 대기 하에 가열 건조시키고 실온으로 냉각하였다. 출발 알콜을 무수 피리딘으로 3회 세척하고, 고진공 하에 48 시간 동안 건조시켰다. 반응을 아르곤 대기 하에 수행하였다. THF 및 CH2Cl2는 사용하기 전에 새롭게 증류시켰다.
화합물 63: 1,2-(3-옥타데실옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘 세척된 출발 dl-바틸(batyl) 알콜(화합물 60, 225 mg, 0.652 mmol)에 1H-테트라졸(229 mg, 3.26 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(50 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질이소프로필 포스포아미데이트(1.12 gm, 3.26 mmol)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(70 ml)로 처리하고 Na-비스설파이트(2 x 25 ml), NaHC03(2 x 30 ml), 물(2 x 30 ml) 및 염수(2 x 30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 63(303 mg, 53%)을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.86(t,J=6.4Hz,3H), 1.24(bm, 28H), 1.33-1.35(m,2H), 1.45(m,2H), 3.29-3.36(m,2H), 3.48-3.50(d,J=5.2Hz,2H), 4.04-4.22(m,2H), 4.60(m,1H), 5.00(m,8H), 7.27-7.33(m,20H);13C NMR(CDCl3) δ 14.05, 18.96, 22.62, 25.95, 29.29, 29.41, 29.49, 29.53, 29.59, 29.63, 31.85,46.48, 66.58, 69.20, 69.23, 69.28, 69.36, 71.75, 75.37, 127.76, 127.82, 127.86, 127.88, 127.94, 128.36, 128.45, 128.49, 128.61, 128.62, 135.46, 135.54, 135.59, 135.65, 135.68, 135.75, 135.79; MS m/z 866(M+H)+.
화합물 64: 1,2-(3-도데실옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘 세척된 출발 dl-3-O-n-도데실-1,2-프로판디올(화합물 61, 400 mg, 0.652 mmol)에 1H-테트라졸(645 mg, 9.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(40 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질이소프로필 포스포아미데이트(3.18 gm, 9.2 mmol)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(80 ml)로 처리하고 Na-비스설파이트(2 x 35 ml), NaHC03(2 x 40 ml), 물(2 x 30 ml) 및 염수(2 x 30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 64(100 mg, ＜ 10%)을 투명한 오일로서 얻었다 :1H NMR(CDCl3) δ 0.86(t,J=6.3Hz,3H), 1.23(bm,18H), 1.46(m,2H), 3.13-3.36(m,2H), 3.49-3.51(d,J=5.2Hz,2H), 4.03-4.23(m,2H), 4.59(m,1H), 5.01(m,8H), 7.26-7.34(m, 20H);13C NMR(CDCl3) δ 14.11, 22.68, 26.01, 29.35, 29.47, 29.54, 29.59, 29.63, 29.66, 31.91, 69.01, 69.06, 69.26, 69.30, 69.34, 69.42, 69.62, 71.83, 77.21, 127.83, 127.89, 127.94, 127.95, 128.44, 128.52, 128.56, 135.64, 135.74, 135.85; IR(NaCl, 순수물(neat)) 3427, 1276, 1000, 885, 499 cm-1; MS m/z 781(M+H)+, m/z 803(M+Na)+.
화합물 65: 1,2-(3-헥사데실프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘 세척된 출발 dl-3-O-n-헥사데실-1,2-프로판디올(화합물 62, 500 mg, 1.57 mmol)에 1H-테트라졸(664 mg, 9.47 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF/CH2Cl2의 1:1 혼합물(50 ml)을 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질이소프로필 포스포아미데이트(3.27 gm, 9.47 mmol)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF 및 CH2Cl2를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(80 ml)로 처리하고 Na-비스설파이트(2 x 35 ml), NaHC03(2 x 40 ml), 물(2 x 30 ml) 및 염수(2 x 30 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 65(205 mg, 15%)을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.3Hz,3H), 1.25(bm, 26H), 1.46(m,2H), 3.30-3.42(m,2H), 3.49-3.51(d,J=5.2Hz,2H), 3.97-4.23(m,2H), 4.60(m,1H), 5.01(m,8H), 7.26-7.35(m, 20H);13C NMR(CDCl3) δ 14.11, 22.68, 26.00, 29.35, 29.47, 29.54, 29.59, 29.64, 29.68, 31.91, 69.00, 69.06, 69.26, 69.29, 69.34, 69.41, 71.82, 71.74, 75.52, 75.60, 77.20, 126.97, 127.82, 127.88, 127.93, 127.95, 127.99, 128.43, 128.51, 128.55, 128.60, 135.63, 135.73, 135.79, 135.83; IR(NaCl, 순수물) 3423, 1269, 1016, 736 cm-1; MS m/z 837(M+H)+, m/z 859(M+Na)+.
실시예 7 - 화합물 66-68의 합성
화합물 66: 1,2-(3-옥타데실옥시프로판)-비스(디히드로겐 포스페이트)
EtOH(15 ml) 중의 화합물 63(135 mg, 0.156 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 60 psi에서 4 시간 동안 수행하였다. 4 시간 후, TLC의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 66(70 mg, 89%)을 투명한 왁스로서 얻었다:1H NMR(CD30D)δ 0.89(t,J=6.4Hz,3H), 1.28(s,30H), 1.55(m,2H), 3.45-3.50(m,2H), 3.62-3.64(m,2H), 4.00-4.16(m,2H), 4.47(m,1H);13C NMR(CD30D) δ 14.43, 19.30, 23.73, 27.20, 30.47, 30.64, 30.78, 33.07, 72.80; MS m/z 503(M-H)-; IR(NaCl, 순수물) 1011 cm-1.
화합물 67: 1,2-(3-도데실옥시프로판)-비스(디히드로겐 포스페이트)
EtOH(15 ml) 중의 화합물 64(70 mg, 0.089 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 60 psi에서 4 시간 동안 수행하였다. 4 시간 후, TLC의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 67(35 mg, 94%)을 투명한 왁스로서 얻었다:1H NMR(CD30D) δ 0.79(t,J=6.7Hz,3H), 1.90(s,18H), 1.46(m,2H), 3.34-3.41(m,2H), 3.49-3.73(m,2H), 3.78-4.05(m,2H), 4.47(m,1H);13C NMR(CD30D) δ 14.43, 23.71, 23.74, 27.20, 30.49, 30.64, 30.76, 30.81, 33.08, 66.80, 72.79; MS m/z 419(M-H)-; IR(NaCl, 순수물) 1008 cm-1.
화합물 68: 1,2-(3-헥사데실시클로프로판)-비스(디히드로겐 포스페이트)
EtOH(15 ml) 중의 화합물 65(138 mg, 0.164 mmol)의 용액에 10% Pd/C(촉매량)을 첨가하였다. 수소화를 60 psi에서 4 시간 동안 수행하였다. 4 시간 후, TLC의해 반응의 종료를 결정하고, 반응 혼합물을 셀라이트에 여과시키며, 용출액을 감압 하에 농축하여 화합물 68(75 mg, 96%)을 투명한 왁스로서 얻었다:1H NMR(CD30D) δ0.89(t,J=6.4Hz,3H), 1.28(s, 23H), 1.56(m,2H), 3.43-3.50(m,2H), 3.58-3.65(m,2H), 3.89-4.16(m,2H), 4.47(m,1H);13C NMR(CD30D) δ 14.44, 23.74, 27.20, 30.48, 30.64, 30.80, 33.08, 72.80; MS m/z 475(M-H)-; IR(NaCl, 순수물) 1011 cm-1.
실시예 8 - 중간체 화합물 77-84의 합성
사용된 유리 기구를 아르곤 대기 하에 가열 건조시키고 실온으로 냉각하였다. 출발 알콜을 무수 피리딘으로 3회 세척하고, 고진공 하에 48 시간 동안 건조시켰다. 반응을 아르곤 대기 하에 수행하였다. THF 및 CH2Cl2는 사용하기 전에 새롭게 증류시켰다.
화합물 77: 1,2-(3-테트라데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘 세척된 출발 모노미리스틴(화합물 69, 800 mg, 2.6 mmol)에 1H-테트라졸(1.01 gm, 14.5 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF(50 ml)를 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질이소프로필 포스포아미데이트(5.02 gm, 14.5 mmol)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(100 ml)로 처리하고 Na-비스설파이트(2 x 50 ml), NaHC03(2 x 75 ml), 물(2 x 50 ml) 및 염수(2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 77(600 mg, 28%)을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.3Hz,3H), 1.25(bm, 20H), 1.53(m,2H), 2.17-2.32(m,2H), 3.96-4.24(m,4H), 4.614.70(m,1H), 4.99-5.08(m,8H), 7.29-7.35(m, 20H);13C NMR(CDCl3) δ 14.10, 22.67, 24.70, 29.08, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.62, 29.66, 31.90, 33.86, 64.24, 65.82, 69.41, 69.46, 69.48, 69.53, 69.57, 77.20, 127.85, 127.91, 127.98, 127.99, 128.04, 128.57, 128.59, 128.70, 128.71 135.50, 135.59, 173.09; IR(NaCl, 순수물) 3422, 1742, 1457, 1274, 1035, 1001 cm-1; MS m/z 8823(M+H)+, m/z 845(M+Na)+.
화합물 78: 1,2-(3-펜탄데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘 세척된 출발 모노펜타데카노인(화합물 70, 800 mg, 2.5 mmol)에 1H-테트라졸(970 mg, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF(45ml)를 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질이소프로필 포스포아미데이트(4.80 gm, 13.9 mmol)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(100 ml)로 처리하고 Na-비스설파이트(2 x 50 ml), NaHC03(2 x 100 ml), 물(2 x 50 ml) 및 염수(2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 78(741 mg, 35%)을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.4Hz,3H), 1.25(bm, 22H), 1.53(m,2H), 2.17-2.32(m,2H), 3.95-4.24(m,4H), 4.61-4.70(m,1H), 4.99-5.07(m,8H), 7.29-7.35(m,20H);13C NMR(CDCl3) δ 14.09, 22.66, 24.69, 29.08, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.62, 29.65, 31.89, 33.85, 64.23, 65.86, 69.40, 69.46, 69.48, 69.53, 69.56, 77.20, 127.84, 127.90, 127.97, 127.98, 128.03, 128.56, 128.59, 128.69, 128.71 135.50, 135.59, 173.09; IR(NaCl, 순수물) 3421, 1742, 1457, 1275, 1035, 1014, 1001 cm-1; MS m/z 837(M+H)+, m/z 859(M+Na)+.
화합물 79: 1,2-(3-헥사데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘 세척된 출발 모노팔미틴(화합물 71, 800 mg, 2.4 mmol)에 1H-테트라졸(1.00 gm, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새롭게 증류된 THF(45 ml)를 첨가하였다. 10 분 후, 디벤질이소프로필 포스포아미데이트(4.09 gm, 14.2 mmol)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 아르곤 대기 하에 90 분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC는 생성물의 형성을 나타내었다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 과량의 퍼아세트산을 첨가하였다. 이 혼합물을 35 분 동안 더 교반하고, Na-메타비스설파이트를 첨가하여 과량의 퍼아세트산을 퀀칭 처리하였다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축액을 EtOAc(100 ml)로 처리하고 Na-비스설파이트(2 x 50 ml), NaHC03(2 x 100 ml), 물(2 x 50 ml) 및 염수(2 x 50 ml)로 세척하였다. 유기 부분을 Na2S04로 건조시키고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물은 다양한 조성의 EtOAc/헥산으로 용출시키는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적당한 분획을 수집하고, 진공 하에 농축 건조시켜서 화합물 79(786 mg, 38%)을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR(CDCl3) δ 0.87(t,J=6.4Hz,3H), 1.25(bm, 24H), 1.53(m,2H), 2.17-2.32(m,2H), 3.96-4.24(m,4H), 4.61-4.70(m,1H), 4.99-5.08(m,8H), 7.29-7.35(m, 20H);12C NMR(CDCl3) δ 14.09, 22.66, 24.71, 29.09, 29.23, 29.33, 29.45, 29.60, 29.63, 29.67, 31.90, 33.87, 62.23, 62.30, 65.89, 69.43, 69.48, 69.50, 69.55, 69.58, 77.20, 126.96, 127.85, 127.91, 127.98,128.04, 128.56, 128.59, 128.64, 128.71 135.52, 135.61, 173.07; IR(NaCl, 순수물) 3421, 1742, 1457, 1273, 1035, 1016, 1001 cm-1; MS m/z 851(M+H)+, m/z 873(M+Na)+.
화합물 80: 1,2-(3-헵타데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘으로 세척된 출발 모노헵타데카노인 (72, 800 ㎎, 2.32 mmol)에 1H-테트라졸 (980 ㎎, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF (40 ㎖)를 첨가하였다. 10분 후에, 디벤질디이소프로필 포스포르아미데이트 (4.81 gm, 13.9 mmol)를 첨가하고, 반응을 아르곤 대기 하에서 90분간 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC로 생성물의 형성을 확인하였다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 다량의 과초산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 더 교반한 다음 Na-메타비설파이트를 첨가하여 과량의 과초산을 퀀칭시켰다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축물을 EtOAc (100 ㎖)로 처리하고, Na-메타비설파이트 (2x50 ㎖), NaHC03(2x100 ㎖), 물 (2x50 ㎖), 및 염수 (2x50 ㎖)로 세척하였다. 유기 부분을 NaSO4상에서 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 각종 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시킨 순간 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적절한 분획을 모으고, 진공 하에 농축 건조하여 1.48 g (74 %)의 화합물 80을 투명 오일로서 얻었다:1H NMR (CDCl3) δ0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25(bm, 26H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.1 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.05 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);13C δ(CDCl3) 14.10, 22.66, 24.69, 29.07, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.63, 29.66, 31.89, 33.84, 62.21, 62.27, 65.85, 69.40, 69.45, 69.47, 69.52, 69.56, 74.04, 74.23, 77.20, 127.83, 127.87, 127.96, 127.97, 128.53, 128.55, 128.57, 128.59, 135.47, 135.56, 173.07; IR (NaCl, Neat) 3483, 1743, 1457, 1281, 1035, 1013, 1000 cm-1; MS m/z 865 (M+H)+, m/z 887 (M+Na)+.
화합물 81: 1,2-(3-옥타데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘으로 세척된 출발 모노스테아린 (73, 800 ㎎, 2.2 mmol)에 1H-테트라졸 (1.00 gm, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF (40 ㎖)를 첨가하였다. 10분 후에, 디벤질디이소프로필 포스포르아미데이트 (4.92 gm, 14.2 mmol)를 첨가하고, 반응을 아르곤 대기 하에서 90분간 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC로 생성물의 형성을 확인하였다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 다량의 과초산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 더 교반한 다음 Na-메타비설파이트를 첨가하여 과량의 과초산을 퀀칭시켰다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축물을 EtOAc (100 ㎖)로 처리하고, Na-메타비설파이트 (2x50 ㎖), NaHC03(2x100 ㎖), 물 (2x50 ㎖), 및 염수 (2x50 ㎖)로 세척하였다. 유기 부분을 NaSO4상에서 건조하고, 감압 하에농축하였다. 잔류물을 각종 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시킨 순간 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적절한 분획을 모으고, 진공 하에 농축 건조하여 870 ㎎ (45 %)의 화합물 81을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR (CDCl3) δ0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 28H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 3.97-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.07 (m, 8H), 7.29-7.35 (m, 20H);13C (CDCl3) δ14.09, 22.66, 24.69, 29.08, 29.23, 29.33, 29.45, 29.59, 29.63, 29.67, 31.89, 33.85, 62.22, 62.28, 64.23, 65.87, 68.69, 69.23, 69.42, 69.50, 69.54, 69.58, 74.07, 74.25, 127.60, 127.84, 127.90, 127.98, 128.03, 128.54, 128.56, 128.58, 128.60, 128.71, 135.47, 135.57, 173.08; IR (NaCl, Neat) 3421, 1742, 1457, 1273, 1251, 1216, 1035, 1016, 1000 cm-1; MS m/z 879 (M+H)+, m/z 901 (M+Na)+.
화합물 82: 1,2-(3-노나데카노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘으로 세척된 출발 모노노나데카노인 (74, 800 ㎎, 2.1 mmol)에 1H-테트라졸 (977 gm, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF (40 ㎖)를 첨가하였다. 10분 후에, 디벤질디이소프로필 포스포르아미데이트 (4.81 gm, 13.9 mmol)를 첨가하고, 반응을 아르곤 대기 하에서 90분간 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC로 생성물의 형성을 확인하였다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 다량의 과초산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 더 교반한 다음 Na-메타비설파이트를 첨가하여 과량의 과초산을 퀀칭시켰다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축물을 EtOAc (100 ㎖)로 처리하고, Na-메타비설파이트 (2x50 ㎖), NaHC03(2x125 ㎖), 물 (2x75 ㎖), 및 염수 (2x50 ㎖)로 세척하였다. 유기 부분을 NaSO4상에서 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 각종 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시킨 순간 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적절한 분획을 모으고, 진공 하에 농축 건조하여 1.47 gm (78 %)의 화합물 82를 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR (CDCl3) δ0.87 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 30H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.03 (m, 8H), 7.29-7.36 (m, 20H);13C (CDCl3) δ14.08, 22.65, 24.67, 29.06, 29.22, 29.32, 29.43, 29.58, 29.61, 29.66, 31.88, 33.83, 62.25, 65.84, 69.38, 69.46, 69.51, 69.54, 74.03, 74.10, 74.15, 74.22, 77.20, 127.82, 127.88, 127.96, 128.53, 128.56, 135.45, 135.55, 173.06; IR (NaCl, Neat) 3483, 1743, 1457, 1273, 1282, 1216, 1035, 1013 cm-1; MS m/z 893 (M+H)+, m/z 915 (M+Na)+.
화합물 83: 1,2-(3-이코사노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘으로 세척된 출발 모노아라키딘 (75, 800 ㎎, 2.06 mmol)에 1H-테트라졸 (1.00 gm, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF (40 ㎖)를 첨가하였다. 10분 후에, 디벤질디이소프로필 포스포르아미데이트 (4.92 gm, 14.2 mmol)를 첨가하고, 반응을 아르곤 대기 하에서 90분간 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC로 생성물의 형성을 확인하였다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 다량의 과초산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 더 교반한 다음 Na-메타비설파이트를 첨가하여 과량의 과초산을 퀀칭시켰다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축물을 EtOAc (100 ㎖)로 처리하고, Na-메타비설파이트 (2x50 ㎖), NaHC03(2x125 ㎖), 물 (2x75 ㎖), 및 염수 (2x50 ㎖)로 세척하였다. 유기 부분을 NaSO4상에서 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 각종 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시킨 순간 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적절한 분획을 모으고, 진공 하에 농축 건조하여 1.39 gm (74 %)의 화합물 83을 투명한 오일로서 얻었다:1H NMR (CDCl3) δ0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 32H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.05 (m, 8H), 7.29-7.36 (m, 20H);13C (CDCl3) δ14.09, 22.65, 24.69, 29.07, 29.23, 29.33, 29.44, 29.59, 29.63, 29.67, 31.89, 33.84, 62.21, 62.27, 65.86, 69.40, 69.45, 69.48, 69.52, 69.56, 74.05, 74.12, 74.16, 74.24, 77.20, 127.83, 127.89, 127.97, 128.53, 128.55, 128.57, 128.59, 135.47, 135.56, 173.07; IR (NaCl, Neat) 3483, 1743, 1457, 1273, 1282, 1216, 1035,1012, 1000 cm-1; MS m/z 907 (M+H)+, m/z 929 (M+Na)+.
화합물 84: 1,2-(3-도코사노일옥시프로판)-비스(디벤질포스페이트)
피리딘으로 세척된 출발 모노베헤닌 (76, 800 ㎎, 1.92 mmol)에 1H-테트라졸 (1.00 gm, 14.2 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 새로 증류된 THF (40 ㎖)를 첨가하였다. 10분 후에, 디벤질디이소프로필 포스포르아미데이트 (5.14 gm, 14.8 mmol)를 첨가하고, 반응을 아르곤 대기 하에서 90분간 교반하였다. 반응 혼합물의 TLC로 생성물의 형성을 확인하였다. 이 혼합물을 0℃(빙조)로 냉각하고, 다량의 과초산을 첨가하였다. 혼합물을 35분 더 교반한 다음 Na-메타비설파이트를 첨가하여 과량의 과초산을 퀀칭시켰다. THF를 감압 하에 제거하였다. 농축물을 EtOAc (100 ㎖)로 처리하고, Na-메타비설파이트 (2x50 ㎖), NaHC03(2x125 ㎖), 물 (2x75 ㎖), 및 염수 (2x50 ㎖)로 세척하였다. 유기 부분을 NaSO4상에서 건조하고, 감압 하에 농축하였다. 잔류물을 각종 조성의 EtOAc/헥산을 사용하여 용출시킨 순간 컬럼 크로마토그래피로 처리하였다.
적절한 분획을 모으고, 진공 하에 농축 건조하여 1.27 gm (71 %)의 화합물 84를 백색 왁스형 화합물로서 얻었다:1H NMR (CDCl3) δ0.87 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.23-1.25 (bm, 36H), 1.53 (m, 2H), 2.20 (t, J=7.2 Hz, 2H), 4.02-4.24 (m, 4H), 4.66 (m, 1H), 4.99-5.03 (m, 8H), 7.29-7.36 (m, 20H);13C (CDCl3) δ14.08, 22.65, 24.68, 29.07, 29.22, 29.32, 29.44, 29.59, 29.62, 29.66, 31.88, 33.84,62.20, 62.26, 65.85, 69.40, 69.45, 69.48, 69.53, 69.57, 74.05, 74.16, m 74.24, 77.20, 127.83, 127.88, 127.96, 127.97, 128.30, 128.52, 128.54, 128.57, 128.58, 135.46, 135.55, 173.07; MS m/z 935 (M+H)+, m/z 957 (M+Na)+.
실시예 9- 화합물 85 내지 92의 합성
화합물 85: 1,2-(3-테트라데카노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (15 ㎖) 중 화합물 77 (385 ㎎, 0.468 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (촉매량)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 210 ㎎ (98 %)의 화합물 85를 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.28 (s, 20H), 1.56-1.63 (m, 2H), 2.24-2.38 (m, 2H), 3.93-4.42 (m, 4H), 4.59 (m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.44, 23.73, 26.09, 30.71, 30.23, 30.43, 30.47, 30.61, 30.75, 33.07, 34.80, 34.94, 61.90 61.96, 63.96, 63.70, 66.24, 74.33, 77.51, 175.02; MS m/z 461 (M-H)-; IR (NaCl Neat) 3386, 1702, 1216, 1019 cm-1.
화합물 86: 1,2-(3-펜타데카노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (15 ㎖) 중 화합물 78 (451 ㎎, 0.538 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (촉매량)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 250 ㎎ (97 %)의 화합물 86을 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.28 (s, 22H), 1.58 (m, 2H), 2.24-2.38 (m, 2H), 3.97-4.21 (m, 4H), 4.38 (m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.44, 23.74, 26.05, 30.16, 30.36, 30.48, 30.57, 30.76, 33.08, 35.11, 61.36, 63.70, 63.90, 66.24, 67.77, 70.22, 77.33, 77.40, 77.51, 175.63; MS m/z 475(M-H)-; IR (NaCl Neat) 3380, 1728, 1216, 1031 cm-1.
화합물 87: 1,2-(3-헥사데카노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (15 ㎖) 중 화합물 79 (561 ㎎, 0.659 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (610 ㎎)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 300 ㎎ (92 %)의 화합물 87을 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.28 (s, 24H), 1.56-1.63 (m, 2H), 2.24-2.38 (m,2H), 3.95-4.40 (m, 4H), 4.39 (m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.43, 23.73, 25.89, 26.05, 26.09, 30.15, 30.23, 30.36, 30.44, 30.47, 30.56, 30.61, 30.67, 30.75, 33.07, 34.08, 34.94, 35.11, 61.36, 64.00, 66.22, 67.74, 70.22, 77.33, 77.40, 77.51, 175.03; MS m/z 489 (M-H)-; IR (NaCl Neat) 3357, 1729, 1216, 1029 cm-1.
화합물 88: 1,2-(3-헵타데카노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (15 ㎖) 중 화합물 80 (636 ㎎, 0.736 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (724 ㎎)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 365 ㎎ (98 %)의 화합물 88을 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.6 Hz, 3H), 1.28 (s, 26H), 1.56-1.63 (m, 2H), 3.96-4.17 (m, 4H), 4.22-4.42 (m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.54, 23.73, 25.90, 26.10, 30.16, 30.24, 30.36, 30.43, 30.47, 30.56, 30.61, 30.76, 33.07, 34.81, 34.95, 61.37, 61.92, 63.97, 66.26, 67.70, 67.78, 70.06, 74.42, 77.46, 175.04; MS m/z 503 (M-H)-; IR (NaCl Neat) 3357, 1710, 1216, 1032 cm-1; C20H42O10P2·1H20에 대한 원소 분석: C, 45.97; H, 8.49. 실측치: C, 46.32; H, 8.73.
화합물 89: 1,2-(3-옥타데카노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (15 ㎖) 중 화합물 81 (530 ㎎, 0.603 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (617 ㎎)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 305 ㎎ (97 %)의 화합물 89를 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, j=6.3 Hz, 3H), 1.28 (s, 28H), 1.56-1.61 (m, 2H), 2.42-2.38 (m, 2H), 3.91-4.17 (m, 4H), 4.24-4.42 9m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.43, 23.74, 25.90, 26.06, 26.10, 30.16, 30.24, 30.36, 30.47, 30.57, 30.61, 30.67, 30.76, 33.08, 34.81, 34.95, 35.11, 61.37, 63.72, 66.26, 67.68, 67.75, 70.25, 77.48, 175.04; MS m/z 517 (M-H)-; IR (NaCI Neat) 3388, 1731, 1216, 1020 cm-1.
화합물 90: 1,2-(3-노나데카노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (25 ㎖) 중 화합물 82 (952 ㎎, 1.06 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (1.00 gm)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 555 ㎎ (98 %)의 화합물 90을 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.27 (s, 29H), 1.56-1.63 (m, 2H), 2.24-2.38 (m,2H), 4.06-4.17 (m, 2H), 4.22-4.42 (m, 2H), 4.59 (m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.44, 23.74, 25.90, 26.06, 30.16, 30.24, 30.36, 30.48, 30.57, 30.63, 30.76, 30.79, 33.08, 34.81, 35.12, 63.94, 66.25, 175.03; MS m/z 531 (M-H)-; IR (NaCl Neat) 1735, 1216, 1012 cm-1.
화합물 91: 1,2-(3-이코사노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (25 ㎖) 중 화합물 83 (711 ㎎, 0.784 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (813 ㎎)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 419 ㎎ (97 %)의 화합물 91을 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.4 Hz, 3H), 1.28 (s, 32H), 1.58 (m, 2H), 2.24-2.38 (m, 2H), 3.95-4.42 (m, 4H), 4.58 (m, 1H);13C NMR (CD30D) δ14.44, 23.74, 25.90, 26.06, 30.16, 30.24, 30.36, 30.48, 30.57, 30.63, 30.67, 30.76, 33.08, 34.81, 35.11, 61.37, 61.98, 66.26, 67.69, 67.77, 77.42, 175.03; MS m/z 545(M-H)-; IR (NaCl Neat) 3418, 1735, 1261, 1019 cm-1.
화합물 92: 1,2-(3-도코사노일옥시프로판)-비스(이수소 포스페이트)
EtOH (25 ㎖) 중 화합물 84 (663 ㎎, 0.709 mmol)의 용액에 10 % Pd/C (710㎎)를 첨가하였다. 60 psi에서 4 시간 수소화시켰다. 4 시간 후에, TLC로 반응의 종료를 확인하고, 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고, 감압 하에 용출물을 농축시켜 400 ㎎ (98 %)의 화합물 92를 백색 왁스로서 얻었다:1H NMR (CD30D) δ0.89 (t, J=6.3 Hz, 3H), 1.27 (s, 36H), 1.58 (m, 2H), 2.24-2.38 (m, 2H), 3.98-4.42 (m, 4H), 4.59 (m, 1H);13C NMR (CDCl3/CD30D) δ13.72, 22.40, 24.71, 28.84, 28.97, 29.08, 29.18, 29.41, 31.65, 34.1660.15, 60.99, 62.42, 63.17, 65.16, 65.30, 65.98, 73.24, 173, 79; MS m/z 573 (M-H)-; IR (NaCl Neat) 3431, 1739, 1254, 1177 cm-1.
실시예 10 - 제노퍼스 난모세포 분석
PSP24 PLGFR를 내인적으로 발현하는 제노퍼스 난모세포를 사용하여 새로 고안하여 합성한 화합물을 LPA 억제 활성에 대해 스크리닝하였다.
무균 조건 하에서 크실라진으로 마취시킨 성체 제노퍼스 라비스 개구리(미국 노스캐롤라이나주 버링톤 소재의 캐롤리나 사이언티픽)로부터 난모 세포를 얻어서 실험을 위해 준비하였다. Ca2 +-무함유 난소 링거-2 용액((OR-2) 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.5, NaOH 포함) 중에서 1.4 ㎎/㎖로 A형 콜라게나제 처리(미국 인디애나주 뵈링거)하여 V-VI기 난모 세포의 난포 세포 층을 벗겨내었다. 17∼20℃의 항온기에서 난모세포를 바스(Barth) 용액 중에 유지하고, 분리2∼7일 후에 사용하였다.
막 전위가 -60 mV에서 유지되는 표준 2전극 전압-클램프 증폭기(미국 캘리포니아주 액손 인스트루먼츠의 GeneClamp 500)를 사용하여 전기생리학적 리코딩을 실시하였다. MeOH 중에 시험 용액을 용해시키고, 지방산 무함유 BSA로 복합체화하고, 개구리 Na+-링거액(120 nM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES; pH 7.0)으로 희석한 다음, 5 ㎖/분의 유속으로 난모세포에 관류(superfusion)를 통해 가하였다. 막 전류를 NIC-310 디지탈 역전류검출관(미국 위스콘신주 매디슨의 니콜렛)으로 기록하였다. 15분 간격으로 인가하여 적절한 유실 및 탈감작화로부터의 회복을 허용하였다.
도 21 내지 도 27은 화합물 56, 57, 66, 및 92에 의한 LPA 유도형 클로라이드 전류의 용량 의존성 억제를 도시한다.
화합물 36은 비인산화된 유도체 중에서 최적의 억제제였다. 화합물의 억제 효과가 세포 표면에서의 작용 결과인지 또는 세포 내에서의 작용 결과인지를 확인하기 위해서 화합물 36을 세포내 투여한 경우, 화합물 36의 세포내 투여는 작용 부위에 대한 어떠한 정보도 제공하지 못하였다. 따라서, 유리 히드록시 화합물(35-43)과 별도로 세포 표면과 상호작용하고 화합물이 세포 내로 침투하지 못하도록 인산화된 화합물(55-59)을 합성하였다.
화합물 56, 57, 66, 및 92는 제노퍼스 난모세포 중의 LPA-유도된형 클로라이드 전류의 억제제였다. 화합물 56, 57, 66, 및 92는 용량 의존 방식으로 LPA의 작용을 차단할 수 있었다. 또한, 제노퍼스 난모세포를 세척하면 LPA 반응이 완전히 회복되었다. 이 실험 결과는 화합물 56, 57, 66, 92가 가역적 방식으로 LPA-유도된형 클로라이드 전류를 억제할 수 있음을 시사하는 것이다. 5 μM의 화합물 66은 제노퍼스 난모세포에서의 LPA 효과를 완전히 제거하였으며, IC50은 약 1.2 μM이었다(도 23 및 24). 또한, 화합물 66을 세포 내부로 미세주입한 뒤(화살표, 도 23B) LPA(10 nM)를 세포외 적용하면, LPA 반응을 억제하지 못하였다. 이 실험 결과가 시사하는 것은, 화합물 66의 억제 작용은 세포외 특성이라는 것이다.
화합물 35 및 37-43을 제노퍼스 난모세포에서 시험하였지만, 결과는 확정적이 아니었다. 1 μM의 화합물 55는 약간의 억제(2 nM LPA에 대해 38%)를 나타내었다. SAP 시리즈에서, 화합물 58 및 59를 제노퍼스 난모세포 분석에서 시험하였다. 비스포스페이트 시리즈에서, 화합물 89는 LPA-유도된형 반응(2 nM에 대해 59%)을 억제하였다. 그러나, 화합물 67 (역치 ~1 μM), 68(역치 ~10 nM), 및 85 (역치 ~100 nM)은 반응만을 유발할 수 있었다. 화합물 86, 87, 88, 90, 및 91은 아직 평가되지 않았다. 유리 아미노기의 중요성을 시험하기 위해 화합물 56a를 고안하여 합성하였다. 화합물 56a를 제노퍼스 난모세포 분석에서 평가한 경우, 화합물 56a를 LPA와 함께 적용하면 LPA 반응이 향상되었다. 화합물 56a는 2 μM에서는 반응을 유발하지 않았으나(도시되지 않음), 10 μM에서 화합물 56a는 자체에 대한 반응을 유발할 수 있었다(도 26). 이 실험은 유리 아미노기가 억제 활성에 필수적이라는 것을 시사한다.
실시예 11 - HEY 난소 세포 이동
2개의 LPA 수용체인 EDG-2 및 EDG-7이 HEY 난소암 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 LPA-유도된형 세포 운동성을 억제하는 능력에 대해 화합물 56, 56a, 및 66을 평가하였다(화합물 농도: 0.1 μM LPA 농도에 대해 1 μM).
10% 태아 소 혈청 (FBS, 하이클론)이 보충된 2 mM L-글루타민(GIBCO BRL) 함유 RPMI 1640 배지 중에 HEY 난소 세포를 유지하였다. 모든 세포를 2 일간 융합성으로 성장시켜 Go/G1기가 동시에 일어나게 하였다. 세포를 재평판배양하고 세포가 플라스크 상에서 약 50∼60% 융합성이 될 때 실험을 위해 수거하였다. 플라스크로부터 세포를 제거한 후에, 37℃의 PBS 중의 0.53 mM EDTA에 세포를 5분간 노출시켰다. 동부피의 RPMI 1640 + 2 mM L-글루타민과 10% FBS로 EDTA를 중화시켰다. 실온에서 10분간 800 rpm에서 세포를 원심분리하였다. 2 mM L-글루타민 배지를 포함하는 RPMI 1640으로 수거된 세포를 2회 세척하고, 1 ×106세포/㎖의 농도로 재현탁시킨 다음 37℃에서 1 시간 두었다.
변형된 정량 세포 이동 분석(Cat. 번호 ECM500, 미국 캘리포니아주 테메쿨라 소재의 케미콘에서 입수가능)을 사용하여 세포 운동성을 시험하였다. 케미콘 챔버막을 8 미크론 직경의 피브로넥틴 함유 기공으로 코팅하였다. 억제제를 함유하지 않거나 또는 억제제(1 μM)를 함유하는 400 ㎕ RPMI/2 mM L-글루타민을 하부 챔버로 피펫을 이용하여 옮겼다. RPMI 1640/2 mM L-글루카민 중의 약 5 ×104세포를 상부 챔버에 첨가하였다. 삽입물을 포함하는 24 웰 평판을 37℃의 5% CO2항온기에서 4시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 말미에, 챔버를 새로운 24 웰 평판으로 옮기고, 내부 챔버 상의 세포를 면봉으로 수 회 제거하고 실온에서 조제된 세포 착색 용액 중에 30분간 두었다. 항온처리 말미에, 세포 착색 용액을 웰로부터 제거하였다. 챔버를 휄당 1 ㎖ PBS로 3회 세척하였다. 최종 PBS 세척 후에, 챔버를 검사하여 적절한 세포 형태를 확인하고, 도립 현미경을 사용하여 부착 세포를 계수하였다.
HEY 난소암 세포의 LPA-유도된 이행에 대한 새로 합성된 화합물의 효과는 도 27에 도시되어 있다. 화합물 66은 LPA-유도된 세포 운동성을 약 70% 억제하였다. 그러나, 화합물 55(경계) 및 56a는 LPA 유도된 세포 운동성을 강화시켰다.
실시예 12 - 화합물 세포독성
Im 등의 문헌 (2000) 및 RT-PCR 데이타로부터 전립선 암 세포주 DU-145, PC-3, 및 LNCaP의 존재를 확인하였다. 제노퍼스 난모세포에서의 유망한 억제 활성과 세포 운동성 분석에 기초하여, DU-145, PC-3, 및 LNCaP 전립선암 세포주에 대한 다수 화합물의 성장 억제 효과를 조사하였다.
10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 듈베코 변형 이글 배지 또는 RPMI-1640을 함유하는 150 cm2플라스크에서 DU-145, PC-3, 및 LNCaP 세포를 증식시켰다. 트립신을 이용하여 종균 플라스크로부터 세포를 제거하고, 원심분리하고, 새로운 배지에 재현탁시킨 다음 96웰 배양 평판 중에 약 2,000 세포/웰의 밀도로 평판배양하였다. 최종 약물 농도 범위는 0.05 μM 내지 10 또는 50 μM이다. 약물을 첨가하지 않은 대조 실험(음성 대조군)과 5-플루오로우라실을 첨가한 대조 실험(양성 대조군)을 병행 실시하였다. 배지를 제거하고 48 시간에 교체하여 실험 과정에서의 약물 열화효과를 최소화하였다. 약물 노출 96 시간 후에, 차가운 50% 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하여 세포를 고정하고 1 시간 동안 4℃에서 배양하였다. 고정된 세포를 설포호다민 B(SRB)로 염색하고, 흡광도에 대한 세포수를 나타내는 표준 곡선과 비교하여 540 nm에서의 흡광도 비교로 세포수를 결정하였다. 실험은 2중으로 실시하였다. 대조군(미처리 웰)에 대한 백분율로서의 세포수를 약물 농도에 대해 플롯하고, 세포 성장을 50% 억제하는 농도(IC50)를 비선형 회귀(WinNonlin, 파사이트 코포레이션)로 측정하였다.
기준 화합물인 5F-우라실, LPA (18:1), SPH (13:0), SPP (13:0) 및 N-팔미토일 L-세린 인산 (15:0)을 함께 사용하여 전립선암 세포주 DU-145, PC-3, 및 LNCaP에 대해 실시된 세포독성 연구 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다.
x대조군(미처리 웰)에 대한 백분율로서의 세포수를 약물 농도에 대해 플롯하고, 세포 성장을 50% 억제하는 농도(IC50)를 비선형 회귀(WinNonlin, 파사이트 코포레이션)로 측정하였다.
WA = 약한 활성; NA = 활성 없음; ? =최대 억제가 50%였다.
화합물 55, 56, 56a, 66, 및 85는 일정 범위의 성장 억제 활성을 나타내었다. 화합물 56은 5-플루오로우라실보다 DU-145 및 PC-3 세포 성장에 대한 더욱 유효한 억제제였다. 흥미롭게도, 화합물 56a는 DU-145 세포 성장을 선택적으로 억제하였으나, PC-3 세포에 대한 효능은 낮았다. 화합물 55는 DU-145 및 PC-3 세포에서보다 LNCaP 세포에서 세포 성장의 억제제 효능이 더 높았다. 화합물 66은 LNCaP 세포 성장을 선택적으로 억제하였으나, PC-3 및 LNCaP 세포에 대한 활성을 나타내지 않았다. 화합물 85는 비스포스페이트(sn-1 아실) 중에서 활성이 최대였다.
실시예 1-12에 대한 논의
구체적으로 3가지 세트의 화합물이 합성 및 분석되었다(35-43, 55-59, 66-68, 및 85-92). 제1 및 제2 세트는 합성 억제제인 N-팔미토일 L-세린 인산과 내인성 억제제인 SPH 및 SPP의 혼합형인 반면, 제3 계열은 비스포스페이트를 포함한다. 화합물 56, 57, 66 및 92는 제노퍼스 난모세포 분석에서의 LPA-유도된 클로라이드 전류의 억제제였다. 또한, (sn-1) 위치에서 사슬의 길이가 더 짧은 비스포스페이트는 제노퍼스 난모세포에서 클로라이드 전류를 유발할 수 있었다[화합물 67 (역치 ~1 μM), 화합물 68 (역치 ~10 nM), 및 화합물 85 (역치 ~100 nM)]. 화합물 66은 HEY 난소암 세포주에서 LPA-유도된 세포 운동성을 억제하는 것으로 확인되었다. 상기 합성된 화합물의 DU-145, PC-3, 및 LNCaP 전립선암 세포주에 대한 성장 억제 효과를 평가한 결과, 효능이 매우 탁월하고 선택적인 3가지 화합물(56, 56a, 및 66)을 발견하였다.
상기 데이타(표 3)는 (i) 포스페이트가 없는 알코올을 함유하는 화합물은 활성이 적고(화합물 27 대 화합물 56), (ii) 보호된 포스페이트 부분을 갖는 화합물은 활성이 적으며(화합물 51 대 화합물 56), (iii) 아민의 알킬화는 활성을 감소시키지 않으며(화합물 56a), (iv) 가장 유효한 비스포스페이트는 sn-1 위치에서 에테르 결합을 갖으며, (v) SAP 계열의 사슬 길이를 줄이면(화합물 55 대 화합물 56) DU-145 및 PC-3에 대한 효능이 감소하고 (그러나, LNCaP 세포에 대한 효능은 증가함), (vi) 비스포스페이트(sn-1 알킬) 화합물에 대한 사슬 길이를 단축시키면, LNCaP 세포에 대한 선택성은 남아있지만 효능은 감소하며, (vii) sn-1 위치에서의 치환(아실 대 알킬)은 효능을 증가시키지 않는다는 것을 시사한다. (비록 활성 수송계가 존재할 가능성이 있기는 하지만) 극성 포스페이트 유도체는 세포막을 쉽게 통과할 수 없을 것 같으므로 이들 분자에 대한 표적 부위는 세포막 위(예, 막에 걸쳐 있는 수용체)에 있을 것으로 추정된다. 이들 결과가 제시하는 바는, PLGFR 또는 하류 신호 전달 사건의 차이가 전립선 암세포에서의 화합물의 성장 억제 성질에 중요한 역할을 한다는 것이다.
실시예 13 - Edg-2, Edg-4, 및 Edg-7을 발현하는 안정한 세포주의 제조 및 특성화
Edg-2, -4, 및 -7 수용체에 대한 선택적 길항제를 형성하려는 노력의 일환으로, 유효 화합물을 스크리닝하는 시스템이 처음으로 확립되었다. PH7777 세포는 각종 세포 분석에서 LPA에 대해 비반응성인 것으로 보고된 바 있고 어떤 기지의 Edg 수용체에 대한 mRNA도 없는 것으로 밝혀졌기 때문에 이 세포를 모델계로서 선택하였다(Fukushima et al., 1998). EDG 수용체로 형질감염시킨 적절한 세포주와 빈 벡터로 형질감염시킨 대조군 세포주를 RH7777 세포중에 만들었다.
생성되는 클론은, 세포내 Ca2+과도 전류를 모니터링하고 RT-PCR을 이용하여 스크리닝하였다. 이러한 스크리닝 과정으로 Edg-2 및 -7을 발현하는 3 이상의 양성세포주를 동정하였으나, Edg-4를 발현하는 양성 세포주는 동정하지 못하였다. 벡터로 형질감염된 세포는 LPA에 대해 비반응성인 것으로 밝혀졌다. Edg-4를 발현하는 안정한 클론이 분리되지는 않았지만, Edg-4의 일시적 발현은 세포내 Ca2+과도전류의 LPA-매개된 활성화를 초래하여, 구성물이 이들 세포 내에서 기능적으로 활성을 나타냄을 입증하였다. 이들 실험에 사용된 안정한 Edg-4 세포주를, 본 발명자들에게 동일한 클론을 제공해 준 Im 등의 문헌(Im et al., 2000)에 따라 분리 및 특성화하였다.
유효 길항제를 스크리닝하는 데 적절한 분석을 확인하고자 세포주의 특성을 추가로 규명하였다. ERK 1/2의 LPA 유발 활성화는 Edg-2 및 일시적 Edg-4 발현 세포에서 관찰되는 반면에, ERK 1/2는 Edg-7 발현 세포에서 활성화되지 않았다. LPA는 Edg-2, -4 및 -7을 발현하는 모든 안정한 세포주에서 Ca2+과도전류를 유발하였다. 용량 반응 곡선으로부터 Edg-2, -4, -7 발현 세포에 대한 EC50값이 각각 378 ±53, 998 ±67, 및 214 ±26 nM임을 확인하였다(도 28A-C). 안정한 Edg-4 클론에서 측정된 EC50값이 이미 보고된 것과 달라서, 일시적으로 Edg-4를 발현하는 세포에 대한 용량 반응 곡선을 확립하였으며(도 28B, An et al., 1998a; An et al. , 1998b), 이에 따르면 EC50값은 186 ±39였다.
안정한 세포주에서 DNA 합성을 자극하는 LPA의 능력은3H-티미딘의 혼입을 측정하여 조사하였다. 야생형도 벡터로 형질감염된 RH7777 세포도 10 μM LPA와 함께 24 시간 항온처리한 후에3H-티미딘 혼입 증가를 나타내지 않았는데, 이것은 LPA가 이들 세포에서 유사분열물질이라는 예전의 보고와는 대조적인 것이다. 대조군 세포와 비교하여, Edg-2 발현 세포는 1.8배의3H-티미딘 혼입 증가를 나타내는 반면에, Edg-4 및 -7 발현 세포는3H-티미딘 혼입 증가를 나타내지 았았다.
실시예 14 - Edg-2 및 Edg-7 수용체에 대한 단쇄 포스파티데이트 활성
Edg-2, -4, 및 -7을 발현하는 3종의 안정한 세포주 모두에서 Ca2+과도전류가 유도되었기 때문에(도 28A-C), 유효 길항제를 스크리닝하는 데 이 분석을 사용하였다. Edg 수용체군의 LPA 활성화된 구성원인 Edg-2, -4, 및 -7에 대한 선택적 길항제를 동정하기 위해서, LPA 파마코포어(pharmacophore)의 구조적 특징으로부터 출발하였다. 단쇄 (8:0) LPA 또는 LPA (8:0) 및 LPA (18:1)의 혼합물을 Edg-2, -4 또는 -7의 억제제로서 시험하였다. 세포를 LPA (8:0) 및 LPA (18:1)의 혼합물로 처리한 결과, 3종의 안정한 세포주에서는 Ca2+반응이 일어나지 않았다(도 30A-C, 31A-C, 및 32A-B 참조). 단독의 LPA 8:0은 어떤 세포에서도 10 μM의 높은 농도에서 Ca2+반응을 유발할 수 없었다.
이들 결과를 기초로 하여, 출원인은 지방산 사슬의 운동성을 입체적으로 제한하는 LPA 파마코포어 변형이 리간드 성질에 영향을 준다는 가설을 세웠다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 sn-2 위치에서 제2의 단쇄 지방산을 갖는 화합물을 시험하였다. 단쇄 포스파티데이트는 상응하는 단쇄 LPA에 비해 소수성 증가를 나타내었으며, 수용체의 리간드 결합 포켓과 상호작용시 제약을 나타내었다.
포스파티드산(PA) 및 디아실글리세롤 피로포스페이트(DGPP)는 PLA 파마코포어와 일부 주요 화학 성질을 공유하고, 이온성 포스페이트기(들)와 지방산 사슬을 갖는 천연 지질이다. Edg 수용체의 작용제는 아니다(하기 참조). 이러한 유사성을 염두에 두고, 단쇄 DGPP를 제조하고 Edg-2, -4, 또는 -7의 억제제로서 시험하였다. 도 29A-D는 안정한 세포주에서 LPA에 의해 유발되는 Ca2+반응에 대한 DGPP(8:0)의 효과가 10배 이상 높다는 것을 보여준다. Edg-2 발현 세포에서의 Ca2+반응은 약 50% 억제되는 반면에(도 29A), Edg-7 발현 세포에서의 반응은 완전히 제거되었다(도 29C). 대조적으로, Edg-4 발현 세포에서의 Ca2+반응은 DGPP 8:0에 의해 영향을 받지 않았다(도 29B). Edg-4의 안정한 발현 및 일시적 발현에 대한 EC50값의 차이로 인해(도 29B), Edg-4로 일시적으로 형질감염된 세포 상에서 DGPP 8:0을 유사하게 시험하였다. 안정한 세포에서의 실험 결과와 마찬가지로, Ca2+반응은 일시적으로 Edg-4를 발현하는 세포에서 DGPP 8:0에 의해 영향을 받지 않았다(도 29D). DGPP 8:0에 대해 상기 개시된 각 분석에서 PA 8:0을 사용하여 유사한 관찰 결과를 얻었다(히기 참조).
Edg-2 및 -7을 발현하는 세포에서, DGPP 8:0의 농도를 증가시키면서 억제 곡선을 결정하였고, 이 때 LPA의 농도는 연구되는 수용체에 대한 EC50에서 일정하게 유지하였다. 곡선으로부터 Edg-7에 대한 IC50값은 285 ±28 nM(도 30A)이고 Edg-2에 대한 값은 11.0 ±0.68 μM(도 31A)임을 결정하였다. IC50값에 거의 가까운 일정량의 DGPP 8:0을 사용하여(Edg-7에 대해 250 nM, Edg-2에 대해 3 μM), Edg-7 (도 3 OB) 및 Edg-2 (도 31B)에 대한 용량 반응 곡선을 우측으로 이동시켰으며, 이는 억제의 경쟁 메카니즘을 제시하는 것이다.
DGPP에 대한 구조 활성 관계를 더욱 명확하게 하기 위해서, LPA, DGPP, PA, 및 DAG의 단쇄(8:0) 및 장쇄(18:1) 종을 Edg-2 및 -7 발현 세포주 상에서 시험하였다. 도 30C는 LPA 18:1 및 이들 각 지질의 조합에 노출될 때 Edg-7 발현 세포에서의 Ca2+반응에 대한 지질의 효과를 나타낸다. 이들 실험에 있어서, LPA의 농도는 EC50과 거의 유사한 값으로 선택하고, 시험 지질은 DGPP 8:0의 IC50값과 같은 농도에서 적용하였다. LPA 8:0은 Edg-7에 대한 영향이 없었지만, DGPP 8:0 및 PA 8:0은 Ca2+반응을 각각 50% 및 56% 유의적으로 억제하였다. 대조적으로, DAG 8:0은 Ca2+반응을 유의적으로 증가시켰다. DGPP 및 PA의 사슬 길이가 18:1로 증가되면, 이들의 유사체는 더 이상 Edg-7의 억제제가 아니었다(도 30C). DAG 18:1도 유사하게 Edg-7에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다.
동일한 세트의 지질을 Edg-2 발현 세포 (도 31C)에서 시험하였다. DGPP, PA, 및 DAG의 옥틸 사슬 길이 유사체를 10 μM에서 시험하면, 이들 유사체는 각각 대조군의 50, 19, 및 64%로 반응 감소를 나타내었다. 사슬 길이를 18:1로 증가시키면 DGPP 및 DAG는 더 이상 억제 효과를 갖지 못하는 반면에, PA 18:1은 적당한 억제 효과를 유지하여, Ca2+반응을 18% 감소시켰다. 지질 패널을 Edg-4 발현 세포에서 시험하였다(도 32A-B). 이들 지질을 Edg-4를 발현하는 안정한 세포주에서 분석한 결과, 단쇄 또는 장쇄 지질 중 어떤 것도 억제 효과를 나타내지 않은 반면에 PA 8:0 및 18:1은 Ca2+반응을 각각 대조군의 162% 및 137%로 유의적으로 증가시켰다. 안정한 클론으로부터 얻은 결과를 확인하기 위해서, 일시적으로 Edg-4를 발현하는 세포 상에서 지질 패널을 시험하였다(도 32B). 또, DGPP 또는 PA의 단쇄 또는 장쇄 종은 Ca2+반응에 대한 억제 효과를 갖지 못하였으며, 이는 안정한 세포주로부터 얻은 결과와 일치하는 것이다. 안정한 Edg-4 클론과는 대조적으로, PA 유사체는 Edg-4를 일시적으로 발현하는 세포에서 Ca2+반응 증가를 나타내지 않았다. 단독으로 적용된 경우 PA 종은, 일시적으로 또는 안정하게 Edg-4를 발현하는 세포 중에서 최대 10 μM 농도에서 반응을 유발하지 못하였다.
내인적으로 LPA 수용체를 발현하는 세포에 대한 DGPP 8:0의 효과를 조사하였다. DGPP 8:0은 제노퍼스 난모세포 중의 LPA에 의해 유발되는 Ca2+-매개된 내부의 Cl-전류를 96 ±21 nM의 IC50으로 억제하는 것으로 밝혀졌다(도 33A). 200 nM 농도의 DGPP 8:0의 존재 하에, LPA 18:1에 대한 용량 반응 곡선이 우측으로 이동하였으며, 이는 Edg-2 및 -7 클론에서 발견되는 바와 같은 경쟁 작용 메카니즘을 시사하는 것이다(도 33B). DGPP 8:0이 세포내 또는 세포외 메카니즘을 통해 작용하는 지 여부를 조사하기 위해서, DGPP 8:0을 세포내 주사하고 난모 세포를 LPA 18:1에 노출시켰다. 도 32C는, >300 nM 농도에 도달할 것으로 추정되는 DGPP 8:0을 세포내 주사한 후에 5 nM LPA 18:1의 세포외 투여가 대조군과 같은 크기의 반응을 유발한다는 것을 보여준다. 비교하여, LPA 18:1이 일반적으로 유발하는 반응은 DGPP 8:0을 세포외 투여하면 완전히 억제되었다(도 33C). 10분 세척 후에 반응이 대조군 레벨로 회복되기 때문에 DGPP 8:0의 억제 효과는 가역적이었다(도 33C).
난모세포에서 발현되는 LPA 수용체에 대한 DGPP 8:0의 특이성을 확인하기 위해서, 래트 뇌에서 얻은 폴리A+ mRNA를 주사하여 신경전달물질 수용체의 발현을 유도하였다. 그 결과 세로토닌 및 아세티콜린에 대한 G-단백질 커플링된 수용체가 발현되었으며, 비주사된 난모세포에서는 발현되지 않았다. 이들 신경전달물질은 LPA에 의해 활성화되는 동일한 이노시톨 트리포스페이트 Ca2+시그널링 경로를 활성화시킨다(Tigyi et al. , 1990). 이들 난모세포에서, DGPP 8:0은 세로토닌- 또는 카테콜-유발된 반응을 억제하지 않았으며, 이는 LPA 수용체에 대한 DGPP 8:0의 특이성을 입증하는 것이다. 유사한 농도로 PA 8:0이 사용되는 경우, PA 8:0은 난모세포에서 LPA-유발된 반응을 억제하는 데 효과적이었다.
LPA-유발된 반응에 대한 DGPP 8:0의 효과를, LPA 수용체를 내인적으로 발현하는 포유류계에서 조사하였다. Edg 및 PSP24 수용체에 대한 mRNA의 존재에 대해 RT-PCR을 실시하여 NIH3T3 세포를 스크리닝하였다. 도 34A는 NIH3T3 세포에서 Edg-2, -5, 및 PSP24에 대한 mRNA 전사체가 검출되었음을 보여준다. DGPP 8:0이 LPA-유발된 Ca2+반응의 억제에는 특이적이지만 S1P-유발된 Ca2+반응의 억제에는 특이적이지 않다는 것을 확인하기 위해서, NIH3T3 세포를 10 μM DGPP 8:0의 존재 하에 100 nM LPA 또는 S1P에 노출시켰다. 도 34B에 도시된 바와 같이, DGPP 8:0은 LPA-유발된 Ca2+반응을 유의적으로 억제하는 반면에, S1P-유발된 반응은 영향을 받지 않았다.
LPA는 난소암으로부터 발생되며 난소암에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Xu et al., 1995a). 따라서, DGPP 8:0을 HEY 난소암 세포에서 시험하여 치료학적으로 관련된 표적에 대한 효과를 갖는지를 결정하였다. 도 34D는 DGPP 8:0이 LPA-유발된 Ca2+반응을 대조군의 12%로 억제하는 반면에, DGPP 18:1은 영향이 없음을 보여준다. 유사하게, PA 8:0은 Ca2+반응을 대조군의 6%로 억제하였지만, PA 18:1은 영향이 없었다. HEY는 Edg-1, -2, -5, -7 수용체에 대한 mRNA 전사체를 발현한다(도 34C).
실시예 15 - NIH3T3 세포 증식 억제
성장 인자의 검증된 효과는 세포 증식을 유도하는 능력이다. LPA는 여러가지 상이한 세포 유형(Goetzl 등, 2000)의 증식을 자극하는 것으로 나타났고, 세포 증식을 억제하는 DGPP 8:0의 능력은 NIH3T3 세포에서 조사되었다. 도 35는 DGPP 8:0이 NIH3T3 세포의 LPA-유도된 증식을 현저히 억제하여 세포수를 대조구 수준으로감소시키는 반면 용매-처리된 대조구 세포에 대하여는 효과가 없음을 나타낸다. DGPP 8:0의 억제 효과에 대한 구조-활성 관계를 정의하기 위하여, 단쇄 및 장쇄 종의 DGPP, PA 및 DAG를 분석에 포함시켰다. 도 35에 도시된 바와 같이, 테스트 패널에 포함된 지질 중 어느 것도 용매-처리된 대조구 세포에 대하여는 현저한 억제 효과 또는 자극 효과를 가지지 않았다. DGPP 8:0만이 the LPA-유도된 증식을 억제하였다. DGPP 18:1도 장쇄 및 단쇄 PA 및 DAG도 LPA-유도된 증식에 대한 효과를 가지지 않았다. 흥미롭게도, PA 8:0 은 이 분석에서 현저한 억제를 보이지 않았다.
실시예 13-15에 대한 논의
RH7777 세포를 Edg-2, -4 및 -7 수용체의 이종 발현에 사용하여 잠재적 길항제를 스크린하였다. Edg 수용체에 대한 우리의 이전 컴퓨터 모델링(Parrill 등, 2000) 및 이용가능한 구조-활성 데이타(Jalink 등, 1995)를 기초로 한, 상기 실험 결과는 단쇄 포스파티데이트 DGPP 8:0이 Edg-7의 선택적이고 우세한 길항제이며 IC50값이 285 ±28 nM임을 입증한다. 동일한 분자가 Edg-2의 양호하지 못한 억제제(IC50값 11.0 ±0.68 μM)로 판명되었으나, 이것은 Edg-4를 억제하지 않았다. DGPP 8:0은 Xenopus 난모세포에서 내인성 LPA 반응을 억제하였다(IC50값은 96 ±21 nM). PA 8:0은 비슷한 억제 특성을 보였다. 따라서, 이들 단쇄 포스파티데이트는 Edg-2에 비하여 Edg-7에 대한 선택도가 40 내지 100배임을 보인다.
단쇄 포스파티데이트로 얻은 상기 결과는 12 개 이하의 탄소 원자 길이의 아실쇄는 Edg-2, -4 또는 -7을 발현시키는 곤충 세포에서 반응을 유도하지 않는다는Bandoh 등의 결과(2000)를 확인하여 준다. 상기 입증된 바와 같이, LPA 8:0은 포유동물 발현 시스템에서 Edg-2, -4 또는 -7의 길항제도 작용제도 아니었다. Edg-7은 지방산쇄가 sn-2 대 sn-1 위치로 에스테르화된 LPA에 대하여 10배 선호도를 가진다(Bandoh 등, 2000). 따라서, 포스페이트 성분에 대한 탄화수소쇄의 거리는 수용체에의 결합 및 수용체의 활성화를 없애지 않는다. Edg-7은 또 포화 지방산에 비하여 대응하는 장쇄 불포화 지방산에 대한 선호도를 보여준다. 에테르 결합 또는 비닐-에테르 측쇄의 존재는 또 EC50을 2 등급 감소시켰다(Bandoh 등, 2000). 또한, 최적 탄화수소쇄 길이는 18 탄소이고 20 탄소 유사체는 좀더 약한 작용제였다. Edg-7의 약리학적 특성은 수용체 활성화가 측쇄의 가용성 뿐만 아니라 쇄 길이에 따라 달라짐을 시사한다(에스테르 대 에테르 결합).
Edg-1 수용체의 컴퓨터 모델링은 리간드 결합에 요구되는 3의 챠지된 잔기를 식별한다. 이들 잔기 중 하나로서, 포스페이트기와 상호작용할 것으로 예상되는 아르기닌 120은 Edg족의 모든 구성원내에서 보존된다. 제2 잔기인 아르기닌 292는, 모든 Edg-8을 제외한 모든 Edg족 구성원이 거의 양이온성 잔기를 갖는 위치에서 일어난다. 제3 잔기인 글루타메이트 121은 Edg-2, -4 및 -7의 대응 부위의 글루타민과 함께 LPA-특이적 Edg 수용체 중에서 보존되지 않는다, 이 글루타민 잔기는 LPA의 히드록실 성분과 상호작용할 것으로 예상된다. 이러한 잔기의 알라닌 치환은 수용체의 활성화 및 리간드 결합의 손실을 초래하며, PLGF 약물특이분자단의 챠지된 성분들 간의 이온 상호작용 및 이들 3 잔기가 Edg-1 리간드 결합에 필요함을 시사한다(Parrill 등, 2000). 또한, 수용체 및 탄화수소쇄 자체 간의 상호작용은 리간드 결합 및 활성화에 충분하지 않았다(Parrill 등, 2000). 따라서, 이온성 앵커 및 소수성 테일을 모두 포함하는 조합된 상호작용이 작용제 활성에 필요하다는 가설을 세웠다. 이 가설의 지지에서, 상기 결과는 단쇄 LPA 8:0는 Edg-2, -4 또는 -7을 활성화할 수 없음을 입증하여 소수성 테일 및 리간드 결합 포켓 간의 상호작용의 중요성이 강조된다. 결과적으로, 출원인은 소수성 테일을 PLGF 약물특이분자단의 "ㅅ위치" 영역으로 규정하였다. 이들 수용체에 의한 지방산의 sn-1 및 sn-2 치환의 상대적인 내성으로 인하여, 출원인은 그 절단된 탄화수소쇄로 인하여 수용체를 활성화할 수 없는 것으로 생각되는 단쇄 포스파티데이트에 초점을 맞추었다. 포스파티데이트내 아실쇄의 구조적 유동성은 또 인접 지방산 성분에 의하여 제한된다. 출원인은 또 앵커 부분의 음으로 대전된 특성을 변화시키지 않고 오히려 전하를 증가시키는 피로포스페이트 성분의 효과를 탐구하였다.
이러한 개념의 약물 설계를 Edg-2, -4 및 -7 수용체를 발현시키는 클론 세포선에서 테스트하였다. DGPP 8:0 및 PA 8:0의 약리학적 특성은 3 수용체 간에서 극적으로 상이한 것으로 판명되었다. 두 분자들은 Edg-7을 억제시키는데 효과적이나 Edg-2에 대하여 1 등급 이상 효과가 덜 하였다. 분자는 Edg-4에 대하여도 효과적이지 않았다. DGPP 8:0도 또한 Edg-2 및 -7의 경쟁적 억제제로서, 양 수용체 상에서 LPA에 대한 EC50값이 우측으로 점점 증가하는 사용량 반응 곡선을 나타낸다. 해당 장쇄종의 PA 및 DGPP의 작용제 활성 결핍은 결합 포켓에서 우세한 억제를 부각시킨다. 결합 포켓에서 리간드를 도킹하는데 있어 이온성 앵커의 중요성은 DAG 8:0에 의한 억제 부족에 의하여 지지되나 그 세포적 효과는 PKC와 같은 다른 분자 표적상의 세포간 작용에 의하여 교란되는 것 같다.
PA 및 DGPP 모두 자연 발생적인 인지질이다. DGPP (8:0)는 1993년에 식물의 신규한 지질로서 발견되었고 포스파티데이트 키나제에 의한 PA의 포스포릴화 산물이다(Wissing 및 Behrbohm, 1993; Munnik 등, 1996). DGPP는 박테리아, 효모 및 식물에서 확인되었으나 포유동물 세포에서는 확인되지 않았다. 최근 연구는 DGPP가 마크로파지를 활성화시키고 세포기질 인지질 A2의 활성을 통하여 프로스타글란딘을 자극하는 것임을 보여, 염증 반응에서의 DGPP의 역할을 시사한다(Balboa 등, 1999; Balsinde 등, 2000). 이들 저자는 이 효과가 LPA 수용체를 통하여 매개되는 가능성을 배제하였다. 장쇄 DGPP 및 PA 유사체로 얻은 상기 결과는 이 개념을 확인하였고 이들 화합물은 10 μM 이하의 농도에서 Edg 수용체 발현 세포선에서 작용제 특성을 가지지 않았다.
단쇄 포스파티데이트의 효과도 3의 상이한 세포 유형에서 내재적으로 발현되는 LPA 수용체에 대하여 조사하였다. DGPP 8:0 및 PA 8:0은 Xenopus 난모세포에서 LPA-유도된 Cl_-전류의 효과적인 억제자인 것으로 밝혀졌다. 작용 부위를 결정하기 위하여, DGPP 8:0을 난모세포에 주입한 다음 LPA를 세포외 도포한다. DGPP 8:0은 세포외적으로 도포할 경우 LPA-유도된 Cl_전류를 억제하는데 유일하게 효과적이어서, 세포 표면에서 길항제 효과를 발휘한다. LPA 수용체에 대한 DGPP 8:0의 특이성은 난모세포 및 NIH3T3 세포에서 입증되었다. 이들 세포에서, DGPP 8:0은 LPA-유도된 Ca2+반응을 억제하는데 유일하게 효과적이며 SIP, 아세티콜린 또는 세로토닌에 의하여 유도된 반응이 아니다.
RT-PCR 분석은 Edg-4 또는 -7이 아닌 Edg-2 만이 NIH3T3 세포에서 유일하게 발현됨을 밝혔다. NIH3T3 세포에서, 100배 과량의 DGPP 8:0은 유일하게 Ca2+반응을 40% 억제하였다. 이 정도의 억제는 Edg-2를 발현시키는 안정한 세포선(이도 역시 약한 억제제임)에서 관찰되는 것에 필적한다, 단쇄 DGPP 및 PA를 LPA에 대하여 10 배 과량의 HEY 난소암 세포에서 평가시, 모두 유효한 억제제인 반면 장쇄 분자는 아무런 효과를 가지지 않았다. RT-PCR로써 우세한 mRNA는 HEY 세포내에서 Edg-7에 대한 것으로 드러났으나 Edg-2 mRNA의 흔적만이 검출되었다. 이 정도의 억제는 Edg-7을 발현시키는 안정한 세포선에서 관찰되는 것에 필적하는데, DGPP 8:0 및 PA 8:0 모두 유효한 억제자였다.
두 단쇄 포스파티데이트에 대하여 NIH3T3 세포의 LPA-유도된 증식을 차단하는 능력에 대하여 평가하였다. DGPP 8:0은 LPA-유도된 증식을 유효하게 억제하였으나 장쇄 DGPP는 그렇지 않았다. 8:0은 Ca2+반응을 억제하는데는 유효하였으나, 세포 증식을 억제하는데는 유효하지 않았다. 이들 결과는 PA(12:0)가 PA 18:1의 분열촉진 효과를 억제하지 않았다(van Corven 등, 1992). 기관간 분석에서는 지질 포스파타아제가 길항제를 불활성화시킬 수 있으므로 분자의 안정성이 우려된다. PA 및 DAG가 둘다 증식을 억제하지 못한다는 사실은 DGPP 8:0이 이러한 분석 동안 더 안정함을 시사한다. DGPP의 안정성은 또한 Balboa 등(1999)에 의해 입증되었는데, 이들은 실험 과정에서 DGPP가 대사되지 않았음을 보고하였다.
DGPP 8:0은 Edg 수용체가 아닌 다른 PLGF 수용체를 연구하는 분야에 중요한 새로운 도구를 제공한다. Edg 족의 컴퓨터 모델링으로부터 유도되는 PLGP 약물특이분자단의 이온성 앵커 및 소수성 스위치의 개념은 새로운 억제제의 설계 및 합성을 보조할 것이다.
실시예 16 - 직쇄 포스페이트의 합성
중간물 101-105
화합물 101: 인산 디벤질 에스테르 부틸 에스테르
74 mg(1.00 mmol)의 무수 n-부탄올 및 365 mg(5.17 mmol)의 1H-테트라졸을 100 mL의 둥근-바닥 플라스크에서 34 mL의 무수 염화메틸렌에 용해시켰다. 5 mL의 무수 염화메틸렌내 0.895 g(2.58 mmol)의 디벤질-N,N-디이소프로필 포스포르아미디티의 용액을 아르곤 대기하에서 교반하면서 주사기를 통하여 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 시간동안 교반하였다. 이후 반응 혼합물을 약 38℃의 이소프로필 알콜/건빙조에서 냉각시켰다. 28 mL의 무수 염화메틸렌내 0.815 g(3.43 mmol)의 32 % 퍼아세트산을 첨가 깔대기를 통하여 한방울씩 첨가하였다. 첨가후, 반응 혼합물의 온도를 빙조로 약 0℃까지 올렸다. 반응 혼합물을 빙조에서 1 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 분리 깔대기에 옮기고 200 mL의 염화메틸렌으로 희석하였다. 유기층을 10% 소듐 메타비설파이트(2 x 40 mL), 포화 소듐 비카보네이트(2 x 40 mL), 물(30 mL) 및 염수(40 mL)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조시키고 여과하고 진공에서 농축 건조시켰다. 조생성물을 용리제로서 1:1 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 101(과량의 포스포릴화제로부터 유래하는 소량의 불순물을 함유하는 309 mg)을 맑은 용액으로 얻었다.1H NMR(CDCl3) δ0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.34 (sextet, J = 7.2 Hz, 2H,OCH2CH2CH2CH3), 1.59 (quintet, J = 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2CH2CH3), 3.99 (dt, J = 6.6 Hz, 6.6 Hz, 2H,OCH2CH2CH2CH3), 5.02 (d, J = 1.8 Hz, 2H, OCH2Ar), 5.05 (d, J = 2.1 Hz, 2H, OCH2Ar), 7.35 (br s,10H, 2 x ArH);13C NMR (CDCl3) δ13.55, 18.60, 32.16 (d, JC,P= 6.8 Hz), 67.72 (d, JC,P= 6.1 Hz), 69.13 (d, JC,P= 5.5 Hz), 127.90, 128.47, 128.55, 136.00 (d, JC,P= 6.8 Hz);31P NMR(CDCl3) δ16.84; MS (포지티브 모드): [M + 23Na] m/z 357.3.
화합물 102: 인산 디벤질 에스테르 옥틸 에스테르
130 mg(1.00 mmol)의 무수 n-옥탄올을 사용하고 101에 대한 절차와 유사한 절차를 실행하였다. 조생성물을 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 102(351 mg, 90%)을 맑은 용액으로 얻었다.1H NMR(CDCl3) δ0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.24 (br s, 10H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 1.60 (quintet, J = 6. 9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 3.98 (dt, J = 6.6 Hz, 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 5.02 (d, J = 2.1 Hz, 2H, OCH2Ar), 5.05(d, J = 2.4 Hz, 2H OCH2Ar), 7.34 (br s,10H, 2 x ArH);13C NMR (CDCl3) δ14.09, 22.62, 25.38, 29.06, 29.14, 30.17 (d, JC,P= 6.9 Hz), 31.75, 68.05 (d, JC,P= 6.2 Hz), 69.12 (d, JC,P= 5.5 Hz), 127.90, 128.47, 128.56, 135.97 (d, JC,P= 6.9 Hz);31P NMR (CDCl3) δ16.83; MS(포지티브 모드): [M + 23Na]+m/z 413.4.
화합물 103: 인산 디벤질 에스테르 도데실 에스테르
186 mg(1.00 mmol)의 무수 n-부탄올을 사용하고 101에 대한 절차와 유사한 절차를 사용하였다. 조생성물을 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 103(361 mg, 81%)을 맑은 용액으로 얻었다.
1H NMR (CDCl3) δ0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H,CH3), 1.24 (br s, 18H, OCH2CH2(CH2)9CH3), 1.60 (quintet, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)9CH3), 3.98 (td, J = 6.9 Hz, 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)9CH3), 5.02 (d, J = 2.1 Hz, 2H, OCH2Ar), 5.05 (d, J = 2.1 Hz, 2H, OCH2Ar), 7.34 (br s,10H, 2 x ArH);13C NMR(CDCl3) δ14.13, 22.69, 25.38, 29.12, 29.35, 29.49, 29.56, 29.63, 30.18 (d, JC,P= 7.0 Hz), 31.92, 68.05 (d, JC,P= 6.1 Hz), 69.12 (d, JC,P= 5.4 Hz), 127.89, 128.46,128.55, 135.97 (d, JC,P= 6.8 Hz);31P NMR(CDCl3) δ16.84; MS (포지티브 모드): [M +23Na]+m/z 469.1.
화합물 104: 인산 디벤질 에스테르 옥타데실 에스테르
270 mg(1.00 mmol)의 옥타데칸올을 사용하고 101에 대한 것과 동일한 절차를 사용하였다. 조생성물을 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 104(474 mg, 89%)을 흡습성의 백색 고체로 얻었다: 융점 32-33℃;1H NMR (CDCl3) δ0.88 (t, J = 6.9Hz, 3H, <RTI CH3), 1.25 (br s, 30H,OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.60 (quintet, J = 6.9 Hz, 2H,OCH2CH2(CH2)15CH3), 3.98 (td, J = 6.6 Hz, 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 5.02 (d, J = 2.1 Hz, 2H, OCH2Ar), 5.05 (d, J = 2.1 Hz, 2H, OC2Ar), 7.34 (br s, 10H, 2 x ArH);13C NMR (CDCl3) δ14.12, 22.70, 25.40, 29.13, 29.38, 29.51, 29.58, 29.68, 29.72, 30.20 (d, <RTI JC,P= 6.9 Hz), 31.94, 68.06 (d, JC,P= 6.1 Hz), 69.14 (d, JC,P= 5.4 Hz), 127.90, 128.47, 128.55, 136.00 (d, JC,P= 6.8 Hz);31P NMR (CDCl3) δ16.83; MS (포지티브 모드): [M +23Na]+m/z 553.3.
화합물 105: 인산 디벤질 에스테르 도코사닐 에스테르
327 mg(1.00 mmol)의 도코산올을 사용하고 101에 대한 것과 동일한 절차를 사용하였다. 조생성물을 용리제로서 7:3 헥산/에틸 아세테이트를 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 105(516 mg, 88%)을 흡습성의 고체로 얻었다: 융점 43.5-44.5℃;1H NMR (CDCl3) δ0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.25 (br s, 38H, OCH2CH2(CH2)19CH3), 1.60 (quintet, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2CH(CH2)19CH3), 3.98 (td, J = 6. 6 Hz, 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)19CH3), 5.02 (d, J = 2.4 Hz, 2H, OCH2Ar), 5.05 (d, J = 2.4 Hz, 2H, OCH2Ar), 7.35 (br s, 10H, 2 x ArH);13C NMR (CDCl3) δ14.13, 22.70, 25.39, 29.12, 29.37, 29.50, 29.57, 29.66, 29.71, 30.18 (d, JC,P= 6.9 Hz), 31.93, 68.06 (d, JC,P= 6.0 Hz), 69.13 (d, JC,P= 5.6 Hz), 127.89, 128.47, 128.55, 135.98 (d, JC,P= 6,9 Hz);31P NMR(CDCl3) δ16.83; MS (포지티브 모드): [M+23Na]+m/z 609.3.
실시예 17 - 직쇄 포스페이트 화합물 106 ~ 110의 합성
화합물 106: 인산 모노부틸 에스테르
200 mg(0.60 mmol)의 101을 벽이 두꺼운 압력 용기내에서 30 mL의 무수 메탄올에 용해시켰다. 용기를 아르곤으로 퍼징하고 200 mg의 10% Pd/C를 가하였다. 용기에 수소화 장치를 연결하고 실온에서 8 시간 동안 반응 용기내에 약 50 psi의 수소 대기를 유지하였다. 이후 반응 혼합물을 메탄올로 세척한 셀라이트 패드를 통하여 진공 여과하였다. 용매를 진공에서 증발시켰더니 70 mg(86%)의 황색 오일 106이 남았다.1H NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ0.95 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH3), 1.43 (sextet, J = 7.5 Hz, 2H, OCH2CH2CH2CH3), 1.66 (quintet, J = 6.9, 2H, OCH2CH2CH2CH3), 3.99 (td, J = 6.6Hz, 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2CH2CH3);13C NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ13.71, 19.02, 32.72 (d, JC,P= 7.2 Hz), 66.86 (d, JC,P= 5.5 Hz);31P NMR(CDCl3/MeOH-d4) δ18. 84; MS(네거티브 모드): [M-1]_m/z 153.0.
화합물 107: 인산 모노옥틸 에스테르
200 mg(0.51 mmol)의 102를 사용하고, 106에 대한 것과 유사한 절차를 사용하여 100 mg(93%)의 백색/황색 점성 고체 107를 분리하였다.1H NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.29 (br s, 10H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 1.67 (quintet, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3), 3.97 (dt, J = 6.6 Hz, 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3);13C NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ14.18, 22.98, 25.89, 29.57, 29.58, 30.76 (d, JC,P= 7.3 Hz), 32.18, 67.16 (d, JC,P= 5. 2 Hz);31P NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ20.55; MS(네거티브 모드): [M-1]_mlz 209.1.
화합물 108: 인산 모노도데실 에스테르
200 mg(0.45 mmol)의 103을 사용하고 106에 대한 것과 동일한 절차를 사용하여 112 mg (94%)의 백색 고체 108를 얻었다.1H NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ0.88 (t, J = 6.6 Hz, 3H, CH3), 1.27 (br s, 18H, OCH2CH2(CH2)9CH3), 1.67 (quintet, J = 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)9CH3), 3.97 (dt, J = 6.6 Hz, 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)9CH3);13C NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ14.21, 22.98, 25.84, 29.57, 29.67, 29.89, 29.92, 29.96, 29.98, 30.69 (d, JC,P= 7.4 Hz), 32.25, 67.22 (d, JC,P= 5.7 Hz);31P NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ21.22; MS(네거티브 모드): [M-1]_m/z 265.0.
화합물 109: 인산 모노옥타데실 에스테르
200mg (0.38 mmol)의 104를 사용하고 106에 대한 것과 유사한 절차를 사용하여 104 mg (79%)의 백색 고체 109를 얻었다.1H NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ0.89 (t, J = 6.9 Hz, 3H, CH3), 1.27 (br s, 30H, OCH2CH2(CH2)15CH3), 1.68 (quintet, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)5CH3); 3.98 (dt, J = 6.6 Hz, 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)15CH3);13C NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ14.26, 23.14, 26.01, 29.74, 29.84, 30.06, 30.09, 30.16, 30.87 (d, JC,P= 7.2 Hz), 32.42, 67.32 (d, JC,P= 5.8 Hz);31P NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ21.69; MS (네거티브 모드): [M-1]_m/z 349.1.
화합물 110: 인산 모노도코실 에스테르
200 mg (0.34 mmol)의 105를 사용하고 106에 대한 것과 동일한 절차를 사용하여 98 mg (71%)의 백색 고체 110를 얻었다.1H NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ0.88 (t, J = 6.9 Hz, 3H), 1.26 (br s, 38H, OCH2CH2(CH2)9CH3), 1.66 (quintet, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)19CH3), 3.97 (td, J = 6.6 Hz, 6.6 Hz, 2H, OCH2CH2(CH2)19CH3);13C NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ14.22, 23.01, 25.87, 29.61, 29.71, 29.93, 29.97, 30.04, 30.73 (d, JC,P= 7.4 Hz), 32.29, 67.27 (d,JC,P= 5.6 Hz);31P NMR (CDCl3/MeOH-d4) δ20.66; MS (네거티브 모드): [M-1]_m/z 405.1.
실시예 18 - 직쇄 포스페이트 화합물 106-110
내재적으로 PSP24 PLGFR을 발현시키는 Xenopus 난모세포를 사용하여 화합물 106-110을 이들의 LPA 억제 활성에 대하여 스크리닝하였다. 무균 조건하에 크실라진으로 마취시킨 다 자란 Xenopus 라이비스 프로그(노스캐롤라이나주, 벌링턴, 캐롤라이나 사이언티픽)로부터 난모세포를 얻어 실험을 위해 준비하였다. 단계 V-VI 난모세포를 Ca2+-유리 난소 Ringers-2 용액((OR-2) 82.5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5mM HEPES, pH 7.5 NaOH 사용)내 1.4 mg/ml로 A형 콜라겐 처리(인디애나주 뵈링거)하여 난포 세포층으로부터 노출시켰다. 난모세포를 17∼20℃의 항온처리기에서 Barth 용액내에 유지하고 분리후 2∼7일 동안 사용하였다.
막전위를 -60 mV로 유지하는 표준 2-전극 전압-클램프 증폭기(캘리포니아주, 액손 인스트루먼츠, GeneClamp 500)를 사용하여 전기생리학적 기록을 수행하였다. 테스트 화합물을 MeOH에 용해시키고 지방산 유리 BSA로 착화시키고, 개구리의 Na+-Ringers solution (120 nM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES; pH 7.0)으로 희석하였는데, 상기 용액은 5 ml/분의 속도로 초융합을 통하여 난포세포에 가하였다. 막전류를 NIC-310 디지탈 오실로스코프(위스콘신주, 매디슨 소재 Nicolet)로 기록하였다. 15분(최소) 간격으로 도포하여 적절한 세척이 이루어져 감지불능으로부터 회복될 수 있게 하였다.
도 36은 화합물 106∼110에 의한 LPA-유도된 클로라이드 전류의 사용량-의존 억제를 보여준디. 화합물 108은 IC50값이 약 8.1 nM으로서 최상의 억제제였다. 단쇄 또는 장쇄 알킬기를 갖는 화합물은 LPA-유도된 클로라이드 전류를 억제하는데 효율이 감소됨을 보이나, 화합물 107은 IC50값이 약 10.2 nM로서 효능이 더 작았다. 도 37은 포지티브 대조구 용액(LPA 단독), 25 nm와 LPA 및 100 nM의 화합물108을 함유하는 용액, 343 nM의 EC50값을 비교한다. 따라서, 화합물 108은 Xenopus 난모세포내 PSP24 수용체의 LPA 신호를 효과적으로 억제한다.
상기 결과를 기초로, 개별 수용체를 이종 발현시키는 RH7777 세포내 Edg-2, -4 및 -7 수용체의 길항체로서의 효과에 대하여 화합물 108을 조사하였다.
도 38은 LPA 18:1 및 화합물 108의 조합물에 노출시 Edg-2, Edg-4 및 Edg-7 발현 세포내의 Ca2+에 대한 화합물 108의 효과를 나타낸다. 이들 실험에 대하여, LPA 농도는 EC50에 가깝도록 선택하였다. 화합물 108은 Edg-2 및 Edg-7 발현 세포선에서 각각 대조구의 약 63% 및 56%로 Ca2+반응을 현저히 억제시켰다. 대조적으로, 화합물 108은 Edg-4 발현 세포선에서는 대조구의 약 148%로 Ca2+반응을 현저히 증가시켰다.
따라서, 직쇄 포스페이트는 생체내에서 Edg-2 및 Edg-7 활성을 선택적으로 억제하고 생체내에서 Edg-4 활성을 선택적으로 증대시키는 것으로 기대될 것이다.
참고문헌 목록
하기 나열한 각각의 참고문헌은 본 출원 명세서에 전체로서 참고로 포함되어 있다.
본원에서는 바람직한 구체예를 상세히 설명 및 기술하였으나 본 발명의 개념으로부터 일탈하지 않는 한 여러가지 개질, 부가, 치환 등이 가능하므로 이들은 하기의 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 영역내에 속하는 것으로 고려됨이 당업계의 숙련자들에 분명할 것이다.

Claims (16)

  1. LPA 수용체 작용제로서의 활성을 갖는 하기 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계 및 세포, 조직 또는 기관에서 기능을 보존 또는 복구하거나 세포고사를 치료하기에 유효한 양의 상기 화합물과 상기 세포, 조직 또는 기관을 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포, 조직 또는 기관에서 기능을 보존 또는 복구하거나 세포고사를 치료하는 방법.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
    임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
    A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
    Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
    Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
    Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
    Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O, H와 -NR5R6의 조합이고;
    X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
    이고;
    R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, LPA 수용체는 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 시험관내에서 이루어지는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 접촉이 생체내에서 이루어지는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 접촉이 세포고사, 허혈, 외상 또는 재관류 손상에 관계된 병태를 겪고 있는 환자에 화합물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 접촉이 위장관 섭동을 앓고 있는 환자에 화합물을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  7. LPA 수용체 작용제로서의 활성을 갖고 배양중의 세포를 보존하거나 세포고사를 예방하는 데 유효한 양으로 존재하는 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는 배양 배지에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 세포 배양 방법.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
    임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
    A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
    Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
    Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
    Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
    Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O, H와 -NR5R6의 조합이고;
    X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
    이고;
    R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
  8. 제7항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, LPA 수용체는 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  10. LPA 수용체 작용제로서의 활성을 갖는 하기 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계 및 기관 또는 조직 기능을 보존하는 데 유효한 양의 상기 화합물을 포함하는용액으로 기관 또는 조직을 치료하는 단계를 포함하는 기관 또는 조직 보존 방법.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
    임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
    A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
    Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
    Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
    Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
    Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O, H와 -NR5R6의 조합이고;
    X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
    이고;
    R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
  11. 제10항에 있어서, LPA 수용체는 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. LPA 수용체 작용제로서의 활성을 갖는 하기 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계 및 이식된 기관 또는 조직 기능을 보존하는 데 유효한 양의 상기 화합물을 상기 기관 또는 조직을 이식 받은 수용체에 투여하는 단계를 포함하는 기관 또는 조직 기능 보존 방법.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
    임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
    A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
    Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
    Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
    Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
    Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O, H와 -NR5R6의 조합이고;
    X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
    이고;
    R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
  13. 제12항에 있어서, LPA 수용체는 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. LPA 수용체 작용제로서의 활성을 갖는 하기 화학식 I의 화합물을 제공하는 단계 및 피부학적 병태를 치료하는 데 유효한 양의 상기 화합물을 포함하는 조성물을 환자에게 국소적으로 투여하는 단계를 포함하는, 피부학적 병태를 치료하는 방법.
    화학식 I
    상기 화학식에서,
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 (HO)2PO-Z1- 또는 (HO)2PO-Z2-P(OH)O-Z1-이고, X1및 X2는 함께 -O-PO(OH)-O-로서 연결되거나, 또는 X1및 X3은 함께 -O-PO(OH)-NH-로서 연결되고;
    X1, X2및 X3중 적어도 하나는 R1-Y1-A-(이때, X1, X2및 X3중 두개가 R1-Y1-A-인 경우 각각 동일하거나 상이함)이거나, 또는 X2및 X3은 함께 -N(H)-C(O)-N(R1)-로서 연결되고;
    임의로 X1, X2및 X3중 하나는 H이고;
    A는 직접 연결, (CH2)k(여기서, k는 0 내지 30의 정수임) 또는 O이고;
    Y1은 -(CH2)l-(여기서, l은 1 내지 30의 정수임), -O-,, -S- 또는 -NR2-이고;
    Z1은 -(CH2)m- 또는 -O(CH2)m-(여기서, m은 1 내지 50의 정수임), -C(R3)H-, -NH-, -O- 또는 -S-이고;
    Z2는 -(CH2)n- 또는 -O(CH2)n-(여기서, n은 1 내지 50의 정수임) 또는 -O-이고;
    Q1및 Q2는 독립적으로 H2, =NR4, =O, H와 -NR5R6의 조합이고;
    X1, X2또는 X3각각에 있어서 R1은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬,
    이고;
    R2, R3, R4, R5, R6, R7및 R8은 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C30 알케닐, 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리(이 고리에는 모노-, 디- 또는 트리-치환체가 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음), C1-C30 알킬 또는 방향족 고리 또는 헤테로방향족 고리를 포함하는 아실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴알킬, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C30 알킬을 포함하는 아릴옥시알킬이다.
  15. 제14항에 있어서, 피부학적 병태는 주름 또는 탈모인 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, LPA 수용체는 EDG-2, EDG-4, EDG-7 및 PSP-24로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 방법.
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