KR20040028924A

KR20040028924A - Ｄｎａ와 항원의 조합에 의해 효능이 증강된 백신포뮬레이션

Info

Publication number: KR20040028924A
Application number: KR10-2004-7000574A
Authority: KR
Inventors: 산티에고 듀에나스카레라; 주안 모랄레스그릴로; 리즈 알바레즈-레이존쉐어폰체데레온; 알렉시스 무사치오라사; 롤란도 페이존훼이트; 아리엘 바이나로드리게즈; 줄리오 씨. 알바레즈오브레곤; 넬슨 아코스타리베로; 길리안 마르티네즈도네이토
Original assignee: 센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
Priority date: 2001-07-16
Filing date: 2002-07-12
Publication date: 2004-04-03
Also published as: CN1529616A; EP1417973B1; CU23244A1; WO2003007986A3; RU2294212C2; CA2453260C; ES2393546T3; WO2003007986A8; US20100316669A1; CN1241644C; MXPA04000431A; RU2004104357A; KR100905249B1; US20040234543A1; WO2003007986A2; JP4217611B2; ZA200400286B; US8691234B2; CA2453260A1; EP1417973A2

Abstract

본 발명은 주성분으로서 a) 면역된 개체에서 하나 이상의 단백질을 발현하는 하나 이상의 DNA 및 b) 바이러스 항원을 적당한 비율로 함유하는 백신 항원의 포뮬레이션에 관한 것이다. 본 발명의 신규성은 다른 하나에 대해 생성된 면역반응에 대한 하나 이상의 성분의 향상 효과에 의해 제공된다. 또한, 본 발명은 다양한 병원성 물질에 대한 면역반응의 범위를 향상시키고 다변화시키는 성분의 수를 최소화시키고, 병원체에 대한 혼합 백신을 생성시키는 신규 포뮬레이션을 개발하는 것에 관한 것이다. 이러한 포뮬레이션은 인간의 예방 및/또는 치료 용도로 제약 산업에 적용될 수 있다.

Description

ＤＮＡ와 항원의 조합에 의해 효능이 증강된 백신 포뮬레이션{VACCINE FORMULATION POTENTIATED BY COMBINATION OF DNA AND AN ANTIGEN}

HCV에 대한 효과적인 백신을 수득하는 데에는 다수의 장애가 존재한다. RNA 특성으로 인해, HCV는 환경에 적응하여 신속히 변이를 일으킬 수 있다. 이는 전세계에서 확인된 다수의 바이러스 단리물의 서열의 높은 다양성에 기여한다. 최대 이질성은 HCV E2 단백질의 고가변 영역 I에 집중되어 있는데, 이러한 영역에서 가능한 중화 에피토프가 공지되었다. HCV는 활성 면역반응의 존재에도 불구하고 영속적 감염을 유발한다 (Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226). 바이러스의 효율적인 복제 및 중화 항체의 발생에 관한 실험을 위한 동물 또는 시험관내 배양 시스템은 존재하지 않는다. 질환의 진행 또는 방어와 관련된 면역학적 패턴은 확정되어 있지 않다. 효능적이고 다중특이적이며 장기간 지속되는 체액성 및 세포성 면역반응 둘 모두가 감염의 해결에 필요할 것이다 (Lechmann et al., Semin Liver Dis 2000, 20, 211-226).

다수의 방법이 HCV에 대한 백신을 개발하기 위해 사용되어 왔다. 재조합 단백질, 합성 펩티드, 바이러스 유사 입자, DNA 백신 및 생바이러스 벡터가 가장 널리 평가되어 있다.

단백질 서브유닛을 기초로 하는 백신을 개발하는 것이 HCV에 대해 평가된 첫 번째 전략 중의 하나였는데, 이는 다수의 플라비바이러스의 경우에 표면 단백질에 대해 유도된 항체가 방어를 제공할 수 있기 때문이다. HCV 구성 항원을 기초로 하는 몇몇 변이체는 동물 모델에서 바이러스에 대한 제한된 방어를 달성하였다. 이는 E1-E2 이종이량체로 면역시킨 침팬지의 경우이다. 7마리의 침팬지에 백신접종한 경우, 5마리는 방어되었고, 2마리는 자체 제한성 질병을 발생시켰다 (Choo et al., PROC NATL ACAD SCI USES 1994, 91, 1294-1298). 이러한 방어는 E2가 인간 세포에 결합하는 것을 억제할 수 있는 항체 (Ab)의 존재와 상관있었다 (Rosa et al., PROC NATL ACAD SCI USES 1996, 93, 1759-1763).

유전자형 1b의 단리물로부터의 재조합 E1 단백질이 약 9nm 직경의 입자로 자체 회합하는 동종이량체로서 정제되었다 (Maertens et al., Records Gastroenterol Belg 2000, 63, 203). HCV로 만성 감염된 2마리의 침팬지에 50㎍의 재조합 E1 단백질을 9회 투여하였다. 백신접종은 간 조직학을 개선시키고, 간의 바이러스 항원의 소실을 결정해주었다. 재조합 E1 단백질에 의한 백신접종은 또한 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT)의 수준을 감소시켰다. 혈청내의 바이러스 RNA 수준이 처리동안 변하지 않았다고 하더라도, 간 염증 및 바이러스 항원의 수준은 처리 후에 증가하였다. E1에 대한 고수준의 항체와 질환의 개선 사이의 관련성이 관찰되었다 (Maertens et al., Records Gastroenterol Belg 2000, 63, 203).

특히, 재조합 단백질로부터 바이러스 유사 입자를 형성하고 이들 입자를 백신으로서 사용하는 것이 매우 관심을 끄는데, 이는 이들 입자의 구조가 종종 바이러스 특성을 의태하기 때문이다. HCV 구성 항원의 서열을 함유하는 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 곤충세포로부터 수득된 이러한 종류의 입자는 이러한 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역반응을 둘 모두 생성시킬 수 있었다 (Baumert et al., Gastroenterology 1999, 117, 1397-407; Lechmann et al., Hepatology 1999, 30, 423-429). 단백질 서브유닛을 기초로 하는 백신으로 수득된 결과는 유망하지만, 이러한 변이체에 의해 유도된 면역반응은 주로 체액성이고, 단기간이며, 단리물 특이적이다.

다른 한편, 다양한 재조합 바이러스 벡터가 HCV에 대한 재조합 백신의 개발에서 평가되어 왔다. 특히, 재조합 아데노바이러스 벡터는 이들의 간 지향성, 체액성 및 세포성 면역 둘 모두를 유도하는 능력, 및 경구적 또는 전신적 전달의 가능성으로 인해 관심을 끄는 후보체이다. HCV 구성 단백질에 대한 DNA 엔코딩 서열을 함유하는 아데노바이러스는 이러한 단백질 각각에 대한 항체 반응을 유도한다 (Makimura et al., Vaccine 1996, 14, 28-36). 더욱이, C 및 E1에 대한 재조합 아데노바이러스로 마우스가 면역된 후, 특이적 CTL 반응이 이러한 항원에 대해 검출된다 (Bruna-Romero et al., Hepatology 1997, 25, 470-477). 이러한 결과는 유망했지만, 유전자 요법에서 재조합 아데노바이러스를 사용하는 것과 관련된 최근 문제는 이들 바이러스를 인간에 사용하는 것에 대해 의혹을 제기하였다. 다양한 HCV 유전자를 함유하는, 백시니아, 카나리아두 및 계두와 같은 그 밖의 재조합 바이러스는 마우스에서 강력한 CTL 및 T-헬퍼 면역반응을 유도하였다 (Shirai et al., J Virol 1994, 68, 3334-3342; Large et al., J Immunol 1999, 162, 931-938). 그러나, 이러한 재조합 바이러스 뿐만 아니라 세믈리키 포레스트 바이러스 (Semliki Forest Virus)와 같은 알파 바이러스의 그 밖의 변이체는 이들의 적용과 관련된 규제 문제 및 안전성 문제에 의해 또한 영향을 받는다.

바이러스 제거에서 중요할 수 있는 HCV 폴리프로테인에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대한 다수의 에피토프를 확인한 것은 이러한 병원체에 대한 백신 후보체로서의 합성 펩티드의 평가를 뒷받침해준다. C, NS4 및 NS5의 에피토프를 함유하는 지질화되거나 그렇지 않은 다수의 펩티드가 마우스에서 강력한 CTL 반응을 유도하였다 (Shirai et al., J Infect Dis 1996, 173, 24-31; Hiranuma et al., J Gene Virol 1999, 80, 187-193; Oseroff et al., Vaccine 1998, 16, 823-833).

HCV에 대한 백신을 개발하는 데에 사용되는 또 다른 전략은 선형 에피토프에 대한 Ab를 생성시킬 가능성에 기초를 둔다. 이러한 대안은 기본적으로 HCV의 HVR-1에 대한 Ab를 생성시키기 위해 평가되었으며, 토끼 및 침팬지에서 약간의 유망한 결과가 수득되었다 (Esumi et al., Arch Virol 1999, 144, 973-980; Shang et al., Virology 1999, 258, 396-405). 유사종 (quasi-species)이 HCV에 대한 백신의 표적으로서 HVR-1을 선택하는데 있어서 주된 문제이다.

펩티드 백신에 대한 주된 장애는 헬퍼 T 세포에 대한 에피토프가 없는 펩티드의 면역원성이 불량할 수 있다는 점이다. 더욱이, 백신의 효능은 종종 광범위하게 다양한 항원에 대한 특이적 면역반응의 유도를 기초로 한다. 이러한 제한은 상기 전략의 중대한 결점이다.

DNA 면역법은 백신 개발에서 가장 최신 전략 중의 하나이다. DNA 백신은 진핵세포에서 작용성 전사 단위의 조절을 받는 관심의 항원을 코딩하는 서열을 함유하는 정제된 플라스미드로 존재한다. 플라스미드가 근육 또는 피부에 주입된 후,플라스미드는 숙주 세포에 의해 흡수되고 항원이 세포내에서 발현된다. 숙주 세포에서 엔코딩된 항원이 발현된다는 것은 이러한 방법의 주요 장점 중의 하나인데, 이는 이것이 바이러스 자연 감염과 유사하기 때문이다. DNA의 비교적 저렴한 대규모 생산을 가능하게 하는 DNA 안정성과 함께 DNA의 조작이 간단하는 점은 DNA 백신접종의 그 밖의 장점이다.

이러한 종류의 백신에 의해 유도된 면역반응은 사이토카인과 같은 보조자극 분자를 코딩하는 분자 또는 유전자로 공동 면역시킴으로써 조절될 수 있다. 유전자 작제물은 트랜스멤브레인 도메인, 분비를 위한 신호 서열, 또는 항원의 세포내 트래픽킹 (trafficking) 및 프로세싱에 영향을 주는 그 밖의 유형의 잔기를 삽입시키거나 결실시킴으로써 변형될 수 있다.

특히, DNA 면역법은 HCV에 대한 백신의 개발에서 주로 연구되었다. HCV 캡시드 단백질의 전장 또는 트렁케이팅된 변이체를 엔코딩하는 다양한 발현 벡터가 생성되었다 (Lagging et al., J Virol 1995, 69, 5859, 5863; Chen et al.,Vaccine Res 1995, 4, 135-144). 그 밖의 작제물은 HCV 5' 비번역 영역을 또한 포함한다 (Tokushige et al., Hepatology 1996, 24, 14-20). B형 간염 바이러스 (HBV) 표면 항원 또는 HBV의 다른 외피 항원에 대한 융합 변이체를 발현하는 플라스미드가 평가되었다 (Major et al., J VIROL 1995, 69, 5798-5805). 이러한 플라스미드에 의한 면역법은 일반적으로 포지티브 CTL 및 림프구 증식 반응을 유도하였다.

HCV 외피 단백질은 또한 이러한 유형의 기술을 위한 관심을 끄는 표적을 구성하였다. HCV E2의 경우, 체액성 반응은 주로 HVR-1에 대해 유도되는 것으로 여겨진다 (Lee et al., Mol Cells 1998, 8, 444-451). E1 및 E2 단백질의 세포내 또는 분비된 변이체를 발현하는 플라스미드에 의한 면역법은 유사한 면역반응을 제공하였다 (Lee et al., J VIROL 1998, 72, 8430-8436). GM-CSF 미 HCV E1 또는 E2 단백질을 발현하는 바이시스트론 (bicistronic) 플라스미드에 의한 접종은 체액성 및 세포성 면역반응 둘 모두를 증가시켰다. 최근, E1 및 E2 단백질을 발현하는 바이시스트론 플라스미드의 사용은 DNA로 면역시킨 후에 유도된 면역반응에 대한 이들 단백질 사이의 생체내에서의 이종이량체 형성의 영향을 조사하기 위해 이루어졌다. 이종이량체가 형성된 경우, HCV E1 및 E2 단백질에 대한 항체 반응은 수득되지 않았다. 뚜렷히 대조적으로, 선형 및 입체형태 에피토프 둘 모두에 대해 유도된 고수준의 항체 역가는 E1 및 E2의 트렁케이팅된 변이체를 발현하는 플라스미드로 면역시킨 후에 수득되었다. 따라서, 이러한 항원을 포함하는 작제물이 평가되는 경우에 강력한 항체 반응을 수득하기 위해 이종이량체 형성을 방지할 필요가 있는 것으로 여겨진다 (Fournillier et al., J VIROL 1999, 73, 497-504).

또한, 비구성 단백질이 이러한 기술에 의해 평가되었다. NS3 단백질의 C-말단 도메인을 코딩하는 영역이 이러한 도메인과 IL-2의 동시적이고 독립적인 발현을 가능하게 하는 벡터에 포함된 경우에 양호한 결과가 수득되었다 (Papa et al., Res Virol 1998, 149, 315-319). NS4 및 NS5 단백질은 이러한 면역 전략에 의해 Ab 및 CTL 반응을 또한 생성시킨다 (Encke et al., J IMMUNOL 1998, 161, 4917-4923). 최근, GM-CSF 및 비리온의 비구성 단백질 (NS3, NS4 및 NS5)을 코딩하는 구성을 사용한 경우, 각각의 비구성 단백질에 대한 효능적 Ab 반응 및 증강된 림프구증식 반응이 유도되었다 (Cho et al., Vaccine 1999, 17, 1136-1144).

일반적으로, 실험에서의 조합에 따라 다양한 HCV 항원의 효과적인 발현 뿐만 아니라 1:100 내지 1:100000 수준의 항-HCV Ab의 생성이 다양한 DNA 작제물에 대해 보고되었다 (Inchauspe et al., Vaccine 1997, 15, 853-856). 또한, 특이적 CTL 및 림프구 증식 반응의 발생이 입증되었다 (Inchauspe et al., DNA AND CELL BIOLOGY 1997, 16, 185-195). 그러나, HCV의 다양한 단백질에 대한 보다 강력한 체액성 및 세포성 반응 둘 모두를 생성시키기 위해 이러한 방법을 개선하려는 노력이 필요하다. 따라서, 리포솜 (Gramzinski et al., Mol Medicine 1998, 4, 109-118) 및 사포닌 QS-21 (Sasaki et to the., J Virol 1998, 72, 4931-4939)과 같은 몇몇 변이체가 DNA 백신접종 후에 유도되는 면역반응을 증가시키기 위해 평가되었다. 생물학적 보조제로서의 수지상 세포가 DNA 면역법에서 또한 조사되었다. 종양 항원을 발현하도록 이전에 유전자 변형된 마우스 골수로부터 유래된 수지상 세포 (CD)는, 바이러스 벡터 (Specht et al., J Exp Med 1997, 186, 1213-1221; Brossart et al., J Immunol 1997, 158, 3270-3276; Song et al., J Exp Med 1997, 186, 1247-1256) 또는 RNA (Boczkowski et to the., J Exp Med 1996, 184, 465-472)를 사용함으로써 종양 항원에 대해 특이적인 T 세포 반응 및 마우스에서 종양에 대한 세포 매개된 예방 면역을 촉진시키는 능력을 입증하였다.

현재, 발현된 항원에 대한 면역반응을 증가시키기 위해 CpG 모티프를 삽입시키는 것 (Hasan et al., J Immunol Meth 1999, 229, 1-22)을 포함하는 DNA 면역법을 위한 벡터 및 DNA 전달 시스템을 개선하는 것은 이러한 기술의 제한을 해결하기 위해 중요하다. HCV 감염을 설명하려는 노력이 있고 이러한 병원체에 대한 방어와 상관있는 면역학적 파라미터에 대한 명확한 정의가 없다는 점으로 인해, HCV에 대한 효과적인 백신은 다양한 양태의 면역반응을 자극하는 다중특이적 접근을 필요로 한다는 것이 가능하다. 이러한 문제의 해법은 현재까지 조사된 다수의 백신접종 전략을 조합하는 것일 것이다. 특히, DNA 백신에 의한 초회 투여 및 재조합 단백질 또는 바이러스 벡터에 의한 부스터 투여를 조합한 면역 스케줄 (Hu et al., Vaccine 1999, 17, 3160-3170; Pancholi et al., J Infect Dis 2000, 182, 18-27)이 평가되었는데, 이의 결과는 포지티브이긴 하지만 초회-부스터 전략이 실제로 HCV에 대한 방어 면역을 유도시킬 수 있는 지를 입증하기 위한 추가의 조사를 필요로 한다.

또한, B형 간염 모델의 경우, B형 간염 표현 항원, 이러한 항원에 대해 특이적인 항체 및 이러한 항원을 발현하는 DNA 백신에 의해 형성된 복합체를 포함하는백신 조성물이 평가되었다 (Wen et al., US6221664, 1998). 이러한 포뮬레이션은 다양한 수단에 의한 항원 제시 및 개개의 변이체에 의해 생성된 면역반응에 비해 우수한 면역반응의 신속한 유도를 가능하게 하였다.

본 발명에는 성분으로서 단지 단백질 항원 및 하나 이상의 단백질을 발현하는 플라스미드를 포함하며, 이들 성분 중 하나 이상이 다른 하나의 보조제로서 작용하는 백신 포뮬레이션이 기재되어 있다. 특히, C형 또는 B형 간염 바이러스의 캡시드 항원, 및 HCV E1 단백질의 개개의 또는 폴리프로테인 변이체를 발현하는 플라스미드가 평가된다. B형 간염 모델에 대한 이미 공지된 조성물과 대조적으로, 면역반응을 향상시키기 위해 포뮬레이션에 항체가 존재할 필요가 없으며, 이로써 필요한 성분의 수가 감소된다. 또한, 이러한 백신 조성물의 최대의 탄력성은 다양한 항원에 대한 효능적 면역반응을 동시에 생성시킬 수 있다는 점이다.

본 발명은 의학의 파생분야, 특히 백신 항원의 신규 포뮬레이션에 관한 것이다. 본 발명의 기술적 과제는 성분들 간의 상호작용을 통해 향상된 다양한 면역반응을 유도할 수 있는 성분의 수가 최소화된 신규 백신 포뮬레이션을 개발하는 데에 있다. 또한, 혼합 백신 포뮬레이션을 개발하는 것은 공동 투여된 항원에 대해 유도된 면역반응을 증가시키기 위함이다.

도 1:플라스미드 pAEC-ME, pIDKE1S 및 pIDKE2의 개략적 도면.

도 2:C형 간염 바이러스 캡시드(A), B형 간염 바이러스 표면 항원(B)및 B형 간염 바이러스 캡시드(C)의 전자 현미경 사진.

도 3:pIDKE2 플라스미드 및 코어 단백질을 사용한 면역 스케줄. 동물들을 50㎍의 DNA 및 5㎍의 단백질로 근내 면역시켰다.

도 4:다양한 플라스미드 및 단백질 HBcAg을 사용한 면역 스케줄.

도 5:다양한 플라스미드 및 단백질 HBsAg을 사용한 면역 스케줄. 동물들을 50㎍의 DNA 및 5㎍의 단백질로 근내 면역시켰다.

본 발명은 HCV 및 HBV에 대해 예방적 또는 치료적 방식으로 개체를 면역시키기 위한 조성물 및 방법 뿐만 아니라 이들의 조합을 제공한다. 성분으로서 (a) HCV 외피의 E1 항원의 영역을 포함하는 단백질 변이체를 발현하는 DNA 및 (b) HCV 또는 HBV의 단백질 항원을 적당한 비율로 지니는 백신 포뮬레이션이 최초로 보고된다. 본 발명의 신규성은 나머지 하나에 대해 생성된 면역반응에 대한 하나 이상의 성분의 보조제 효과에 의해 제공된다. 유전자 작제물에 의해 코딩되고 숙주세포에 의해 발현되는 항원 뿐만 아니라 단백질 항원을 포함하는 백신 포뮬레이션이 HCV 및 HBV에 대한 면역반응을 생성시키기 위한 관심을 끄는 표적이다. 따라서, 면역반응은 광범위한 중요 항원에 대해 유도될 수 있다.

본 발명의 백신 포뮬레이션은 함께 혼합된 단백질 항원에 대해 생성되는 면역반응을 향상시키는 DNA를 포함하며, 이러한 효과는 면역된 숙주에서 DNA에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질의 발현에 좌우된다. DNA는 세균 균주로부터 수득되고, 통상적인 절차에 따라 정제된다 (Horn et al., H Gene Ther 1995, 6, 565-573).

본 발명의 백신 포뮬레이션은 바람직한 구체예에서 pIDKE1S, pIDKE2 및 pAEC-ME 중 하나 이상을 포함하며, 발현되는 단백질 변이체를 코딩하는 상기 플라스미드의 DNA 서열은 각각 서열번호 2 내지 4로 확인된다.

pIDKE1S 플라스미드는 HCV E1의 아미노산 176번 내지 363번을 포함하는 단백질을 발현한다 (SEQ. ID. No.2). 다른 한편, pIDE2 플라스미드는 바이러스 폴리프로테인 (C, E1 및 E2의 일부)의 최초 650개 아미노산을 포함하는 단백질을 발현한다 (SEQ. ID. No.3). pAEC-ME 플라스미드는 다양한 HCV 항원의 B 및 T 세포 에피토프를 포함하는 키메라 단백질을 발현한다 (SEQ. ID. No.4). 이러한 플라스미드에서, 바이러스 항원에 대한 코딩 서열은 HCV 쿠바 단리물의 cDNA로부터 수득되었다 (Morales et al., 1998, WO 98/25960). pAEC-ME, pIDKE1S 및 pIDKE2 플라스미드는 pAEC-K6 플라스미드의 다중 클로닝 부위내로 삽입되는 HCV 항원에 대한 코딩 서열을 함유한다 (Herrera et al., Biochem Biophys Res Commun. 2000, 279, 548-551). 본 발명에 포함되는 플라스미드는 인간 세포에서 항원 발현을 유도할 수 있는 조절 엘리먼트를 지닌다. 이러한 조절 엘리먼트는, 예를 들어 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 시미안 바이러스 40의 폴리아데닐화 신호에 의해 통합되는 포유류에서 작용성인 전사 단위를 포함한다 . 또한, 이러한 플라스미드는 세균의 복제 원점 및 카나마아신 내성을 위한 선택 마커를 함유한다.

본 발명의 포뮬레이션의 단백질 성분은 입자를 형성할 수 있으며 순도가 90%를 넘는 가용성 바이러스 항원일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 백신 포뮬레이션의 성분은 HCV 및 HBV의 캡시드 항원이며, 이러한 항원은 이들과 혼합된 DNA에 의해 발현된 단백질에 대해 생성된 면역반응을 향상시켰다.

또한, 본 발명은 DNA와 항원의 혼합물에 대한 절차를 고려한다. 이러한 혼합물은 성분, 즉, DNA 및 항원을 적합한 완충액에 첨가하여 용해시킴으로써 제조된다. 바람직한 구체예에 있어서, 포뮬레이션은 두 성분 모두를 식염 포스페이트에 10/1 (w/w) 비율로 조합하여 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 혼합물은 개체에 투여하기 전에 진탕시키면서 26℃ 내지 30℃에서 2시간 이상 인큐베이션된다. 이러한 포뮬레이션은 근내, 피하, 복강내, 점막내, 정맥내, 설하 등의 경로로 투여될 수 있다. 면역법은 시린지, 유전자 건, 스프레이 또는 그 밖의 전달 장치에 의해 수행될 수 있다. 각각의 개체는 동물종 및 사용된 면역 방법에 의해 측정된 부피로 각각의 성분을 0.001 내지 10mg 투여받는다. 성분으로서 단백질 항원과 혼합된 DNA를 지닌 백신 포뮬레이션의 경우, 다음과 같은 이유로 개개의 성분 각각과 비교하여 우수한 결과가 수득될 수 있다:

- 보다 광범위한 에피토프에 대해 유도된 보다 강력하고 다양한 체액성 및 세포성 면역반응 둘 모두를 생성시키는 것이 가능하다.

- 보조제의 주입에 의해 생성된 독성 효과가 제거될 수 있는데, 이는 항원 2가 동시에 보조제이기 때문이다.

- 이러한 포뮬레이션을 혼합 백신을 위한 코어로서 사용하는 것이 가능하다.

- 백신 포뮬레이션 방법은 항원의 흡착을 필요로 하지 않는다.

HCV E1 단백질 및 HCV 캡시드 단백질의 영역을 포함하는 단백질 변이체를 발현하는 DNA를 함유하는 포뮬레이션의 경우, 다음과 같은 이유로 개개의 성분 각각과 비교하여 우수한 결과가 수득될 수 있다:

- 혼합 또는 다가 백신에 대한 코어로서 DNA + 캡시드를 사용하는 것이 가능하다.

다른 한편, HCV E1 단백질의 영역을 포함하는 단백질 변이체를 발현하는 DNA에 의한 면역법은 포뮬레이션에 존재하는 HBV 단백질 항원의 면역원성을 증가시켰다. 특히, HBsAg 또는 HBcAg와의 혼합물은 다음과 같은 이유로 이러한 항원에 의해 수득된 결과 보다 우수한 결과를 제공한다:

a) HBsAg에 대해 유도된 IgG의 수준은 HBsAg와 알루미늄 히드록시드의 접종에 의해 수득된 수준 보다 우수하다.

b) 잠재적인 혼합 백신 HBV-HCV를 구성한다.

c) 포뮬레이션 방법은 항원의 흡착을 필요로 하지 않는다.

실시예 1: 성분으로서 HCV의 폴리프로테인 캡시드-E1-E2를 발현하는 DNA 및 HCV 캡시드의 단백질 항원을 지닌 포뮬레이션의 면역원성.

플라스미드 pIDKE2 (도 1)와 재조합 HCV 캡시드 입자 (도 2a)의 혼합물의 투여 후의 HCV 구성 항원에 대해 생성된 면역반응의 향상을 입증하기 위해, 8주령된 10마리의 BALB/c 암컷 마우스를 근내 접종시켰다. 스케줄은 0일째 및 21일째의 2회 접종을 포함하였는데, 단, 그룹 중의 하나에 대해서는 0일째의 1회 투여의 영향을 조사하였다. 혈액 샘플을 1차 면역 후 14주째에 채취하였다. 면역원을 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에 함유된 형태로 투여하였다. 그룹 1은 50㎍의 pIDKE2 플라스미드로 접종하였다 (도 1, 플라스미드는 바이러스 폴리프로테인의 최초 650개아미노산을 코딩하는 서열을 함유한다 (SEQ. ID. No.3)). 그룹 2는 5㎍의 코어 단백질 (HCV 캡시드 단백질의 최초 173개 아미노산을 포함함)로 접종하였다. 그룹 3은 첫 번째로 5㎍의 코어 단백질을 투여하고, 두 번째로 50㎍의 pIDKE2를 투여하였다 (코어/pIDKE2). 그룹 4는 그룹 3과 유사한 조건하에서 상반된 순서 (pIDKE2/코어)로 접종하였다. 그룹 5는 0일째 및 21일째에 50㎍의 pIDKE2 및 5㎍의 코어 단백질의 혼합물로 접종하였다 (코어-pIDKE2). 그룹 6는 그룹 5와 동일한 방식이지만 0일째에서만 접종하였다 (코어-pIDKE2 (1)). 또한, 네거티브 대조군인 7번째 그룹은 50㎍의 플라스미드 pAEC-K6 (이것은 HCV 항원을 코딩하는 서열을 함유하지 않는다)으로 면역시켰다.

HCV 구성 단백질에 대한 Ab 반응을 검출하기 위해 항체 반응을 ELISA에 의해 측정하였다. 스튜던트 T 테스트를 사용하여 결과를 분석하였고, 통계학적 차이는 p < 0.05에 대해 간주되었다.

도 3은 개개의 성분에 비해 pIDKE2와 코어 단백질의 혼합물의 2회 용량을 투여함으로써 HCV 구성 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 것이 가능함을 나타낸다. 이러한 포뮬레이션 (2회 용량)은 나머지 그룹에서 수득한 Ab 역가 보다 통계학적으로 높은 HCV E1 및 E2 외피 단백질에 대한 Ab 역가를 유도하였다 (도 3a). 이러한 Ab 역가는 또한 1회 용량으로 투여된 pIDKE2-코어 혼합물에 의해 생성된 HCV 캡시드 단백질에 대한 Ab의 수준 보다 통계학적으로 높았다 (도 3a). 혼합물을 1회 용량으로 접종시키면 면역된 그룹 사이에서 항상 보다 낮은 수준의 Ab를 유도시켰다.

HCV 구성 항원에 대한 림프구증식 반응의 평가 (도 3b)는 나머지 그룹에 비해 2회 용량으로 pIDKE2-코어로 면역시킨 동물의 그룹에서 캡시드에 대한 현저히 우수한 반응을 나타내었다. 결과는 면역시킨 동물로부터 수득된 비장 세포의 자극 지수로서 나타난다. 자극 지수를 (H³) 티미딘 흡수에 의해 측정하였다. pIDKE2와 코어 단백질의 혼합물에 의한 면역법이 HCV 구성 항원에 대해 유도된 면역반응의 상승작용성 자극을 일으키는 것으로 결론내리는 것이 가능하다.

실시예 2: 성분으로서 HCV의 폴리프로테인 캡시드-E1-E2를 발현하는 DNA 및 HBV 캡시드의 단백질 항원을 지닌 포뮬레이션의 면역원성.

pIDKE2 플라스미드와 다른 병원체의 단백질 항원의 혼합물에 의해 생성된 면역반응의 거동을 조사하기 위해, 그룹 당 8주령된 10마리의 BALB/c 암컷 마우스를 상기 언급된 플라스미드와 HBV 캡시드의 재조합 입자 (HBcAg, 도 2c)의 혼합물로 근내 접종시켰다. 스케줄은 0일째 및 21일째의 2회 접종을 포함하였다. 혈액 샘플을 1차 면역 후 9주 및 19주째에 채취하였다. 면역원을 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중에 준비하였다. 플라스미드는 50㎍의 용량으로 투여하고, HBV 캡시드 단백질은 5㎍의 용량으로 투여하였다. 그룹 1은 플라스미드 pAEC-K6으로 접종하였다 (네거티브 대조군). 그룹 2에는 HBcAg 단백질을 투여하였다. 그룹 3는 pIDKE2로 백신접종하였다. 그룹 4 및 5는 HBcAg와, 각각 플라스미드 pIDKE2 및 pAEC-K6의 혼합물로 백신접종하였다. 스튜던트 T 테스트를 사용하여 결과를 분석하였고, 통계학적 차이는 p < 0.05에 대해 간주되었다.

도 4는 1차 면역 후 19주째에 마우스에서 유도된 항체 반응을 나타낸다. 도4a는 pIDKE2 플라스미드와 HBcAg의 혼합물이 백신접종된 나머지 동물에서 관찰된 Ab 역가 보다 통계학적으로 높은 HBcAg에 대한 Ab 역가를 유도하였음을 나타낸다. HBcAg 단독 또는 pAEC-K6와의 혼합물로 면역된 그룹 사이에는 통계학적 차이가 검출되지 않았다. 따라서, 플라스미드 pIDKE2가 HBcAg에 대한 면역반응을 향상시키는 것으로 결론내리는 것이 가능하다.

다른 한편, 도 4b는 pIDKE2 플라스미드와 HBcAg의 혼합물이 pIDKE2 단독으로 면역된 동물에서 생성된 항체 역가 보다 높은 HCV 구성 항원에 대한 항체 역가를 유도한다는 것을 나타낸다. 따라서, HBcAg는 pIDKE2의 투여 후에 유도된 HCV 구성 항원에 대한 면역반응을 또한 향상시킬 수 있다.

실시예 3: 성분으로서 HCV 및 HBV의 변이체를 발현하는 플라스미드 및 HBV 표면 항원의 단백질 변이체를 지닌 포뮬레이션의 면역원성.

pIDKE2 플라스미드와 공동 투여한 후에 관찰된 다른 단백질 항원에 대해 생성된 면역반응의 향상을 입증하고 유사한 보조제 특성을 지닌 다른 플라스미드를 조사하기 위해, 그룹 당 8주령된 10마리의 BALB/c 암컷 마우스를 플라스미드와 HBsAg의 재조합 입자의 혼합물로 근내 접종하였다 (도 2b). 스케줄은 0일째, 21일째 및 50일째의 3회 접종을 포함하였다. 혈액 샘플을 1차 면역 후 16주째에 채취하였다. 모든 면역원을 포스페이트 완충 식염수 (PBS) 중에 준비하였지만, 하나의 그룹은 알루미늄 히드록시드와 포뮬레이션시켰다. 그룹 1은 HCV 캡시드 단백질의 최초 176개의 아미노산을 코딩하는 서열을 함유하는 50㎍의 플라스미드 pIDKCo (Duenas-Carrera et al., Vaccine 2000;19(7):992-997) 및 5㎍의 HBsAg의 혼합물로접종하였다 (pIDKCo-HBsAg). 그룹 2 내지 7은 동일한 양의 DNA 및 HBsAg의 혼합물로 접종하였지만, 하기 플라스미드를 사용하였다: 그룹 2 (pIDKE1S-HBsAg), 플라스미드 pIDKE1S (도 1, HCV 폴리프로테인의 아미노산 176번 내지 363번을 코딩하는 서열을 함유함 (SEQ. ID. No.2)); 그룹 3 (pAEC-ME-HBsAg), 플라스미드 pAEC-ME (도 1, HCV 항원의 다수의 에피토프를 포함하는 단백질을 코딩하는 서열을 함유함 (SEQ. ID. No.4); 그룹 4 (pIDKE2-HBsAg), 플라스미드 pIDKE2 (도 1)는 HCV 폴리프로테인의 아미노산 1번 내지 650번을 코딩하는 서열을 함유함 (SEQ. ID. No.3); 그룹 5 (pIDKE1Sm-HBsAg), 플라스미드 pIDKE1Sm는 pIDKE1S와 동일하지만 오픈 리딩 프레임을 변화시키고 이러한 단백질의 발현을 저해하는 HCV E1를 코딩하는 영역에서 2개의 누클레오티드 삽입을 포함함 (SEQ. ID. No.5); 그룹 6 (pAEC-d2-HBsAg-HBsAg), 플라스미드 pAEC-d2-HBsAg는 HBV HBsAg를 코딩하는 서열을 함유함 (Musacchio et al., Biochem Bioph Res Commun 2001, 282, 442-446); 그룹 7 (pAEC-K6-HBsAg), 플라스미드 pAEC-K6 (네거티브 대조군, 전사 단위의 조절을 받는 코딩 서열을 함유하지 않음). 최종적으로, 그룹 8 및 9는 5㎍의 HBsAg를 각각 알루미늄 히드록시드와 포뮬레이션된 형태로 또는 단독으로 접종하였다. 스튜던트 T 테스트를 사용하여 결과를 통계학적으로 분석하였고, 유의할 만한 차이는 p < 0.05에 대해 간주되었다.

도 5는 1차 면역 후 16주째에 HBsAg에 대해 생성된 Ab 역가를 나타낸다. PBS 중의 HBsAg 단독에 의해 유도된 Ab의 수준은 HBsAg 및 pAEC-K6에 의해 형성된 혼합물을 제외하고는 평가된 변이체의 나머지 보다 통계학적으로 열등하였다. 다른 한편, HBsAg와 플라스미드 pIDKCo, pIDKE1S, pAEC-ME 및 pIDKE2의 혼합물은 알루미늄 히드록시드와 포뮬레이션되거나 pAEC-K6과 혼합된 HBsAg로 면역시킴으로써 유도된 Ab 역가 보다 통계학적으로 높은 HBsAg에 대한 Ab 역가를 유도하였다. 알루미늄 히드록시드와 포뮬레이션되거나 pAEC-K6, pIDKE1Sm 및 pAEC-d2-HBsAg와 혼합된 HBsAg를 사용한 면역법은 HBsAg에 대해 유사한 수준의 Ab 역가를 유도하였다. 숙주 세포에서의 투여된 플라스미드로부터의 HCV E1 항원의 아미노산 영역을 포함하는 단백질 변이체의 발현이 DNA 작제물과 혼합된 단백질 항원에 대해 생성된 면역반응을 향상시키는 것으로 결론내리는 것이 가능하다.

Claims

성분으로서 단백질을 발현하는 DNA 및 단백질 항원을 지니며, 포뮬레이션 성분 중 하나 이상이 다른 하나의 보조제로서 작용하는 백신 포뮬레이션.
제1항에 있어서, 성분으로서 C형 간염 바이러스 E1 항원의 영역을 포함하는 단백질 변이체를 발현하는 DNA 및 바이러스 단백질을 지님을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.
제1항 또는 제2항에 있어서, 성분으로서 SEQ ID No.3에 의해 확인되는 DNA 및 C형 간염 바이러스 캡시드 단백질을 지님을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 성분으로서 SEQ ID No.3에 의해 확인되는 DNA 및 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질을 지님을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.
제1항 또는 제2항에 있어서, 성분으로서 SEQ ID No.2 내지 4에 의해 확인되는 DNA 및 B형 간염 바이러스 표면 항원을 지님을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, C형 간염 바이러스에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용됨을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.
제4항 또는 제5항에 있어서, B형 간염 바이러스에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용됨을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.
제4항 또는 제5항에 있어서, C형 간염 바이러스 및 B형 간염 바이러스 둘 모두에 대한 치료제 및/또는 예방제로서 사용됨을 특징으로 하는 백신 포뮬레이션.