KR20040022244A

KR20040022244A - Hybrid interferon/interferon tau proteins, compositions and method of use

Info

Publication number: KR20040022244A
Application number: KR10-2004-7002138A
Authority: KR
Inventors: 빌라레테로렐리에이치.; 캠포스재크라인; 리웨이너
Original assignee: 펩젠 코포레이션
Priority date: 2001-08-12
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2004-03-11
Also published as: WO2003016472A2; US7232563B2; WO2003016472A9; JP2005525784A; EP1425409A2; CN1568369A; WO2003016472A3; US20030130486A1; CA2454860A1; EP1425409A4

Abstract

본 발명은 인터페론-α 단백질의 C-말단영역 이 인터페론-τ의 C-말단영역 으로 치환된 인터페론-α 단백질로 형성된 하이브리드 인터페론 하이브리드 단백질과 관련된다. 인터페론 하이브리드 단백질을 암호화하는 핵산 서열, 그러한 서열을 함유하는 발현 벡터, 인터페론 하이브리드 단백질의 치료적 사용도 또한 기술되었다. 치료적 사용은 항바이러스, 항세포 증식, 항염증 사용을 포함한다. 본 발명의 인터페론 하이브리드 폴리펩타이드의 한가지 잇점은 세포를 치료하기 위해 사용했을 때 세포독성 부작용이 낮다는 것이다.The present invention relates to a hybrid interferon hybrid protein in which the C-terminal region of the interferon-α protein is formed of an interferon-α protein substituted with the C-terminal region of interferon-τ. Nucleic acid sequences encoding interferon hybrid proteins, expression vectors containing such sequences, therapeutic use of interferon hybrid proteins have also been described. Therapeutic use includes antiviral, anti cell proliferation, anti inflammatory use. One advantage of the interferon hybrid polypeptides of the present invention is the low cytotoxic side effects when used to treat cells.

Description

HYBRID INTERFERON / INTERFERON TAU PROTEINS, COMPOSITIONS AND METHOD OF USE} Hybrid Interferon / Interferon Tau Protein

인터페론(IFN) 단백질은 여러 세포 유형의 성장과 기능에 다면적 효과를 나타내는 구조적 및 기능적으로 관련된 단백질의 집단이다. 1957년에 항바이러스제로 발견된 이후에, IFN는 자연 킬러세포 활성의 조절과 주 조직적합성 항원 발현의 조절, 악성 세포의 항-증식 활성의 조절을 포함한 다양한 효능있는 면역조절효과를 나타내는 것으로 드러났다(Walter, et al., 1998).Interferon (IFN) proteins are a group of structurally and functionally related proteins that have a multifaceted effect on the growth and function of many cell types. Since its discovery as an antiviral agent in 1957, IFN has been shown to exhibit a variety of potent immunomodulatory effects, including regulation of natural killer cell activity, regulation of primary histocompatibility antigen expression, and regulation of anti-proliferative activity of malignant cells. Walter, et al., 1998).

IFN 의 주된 종류는 유형I (산에 안정한)으로 지정된 IFN-α, -β, -γ, -ω와 IFN-τ(유형II으로 지정된, 산에 불안정)이다. 하기 표 1은 IFN 의 주된 종류의 양상을 요약한다.The main types of IFN are IFN-α, -β, -γ, -ω and IFN-τ (acid-stable, designated type II), designated as type I (acid stable). Table 1 below summarizes the main types of aspects of IFN.

단백질의 IFN-α 집단은 하나의 의사유전자와 같은 단백질을 암호하는 2개의 유전자를 포함하여 적어도 14 유전자로 구성되어 있음이 알려져 있다. 따라서, 14 유전자로부터 생산된 12개의 독립적 IFN-α 단백질이 있다. 다양한 IFN-α 은 아미노산 서열 수준에서 약 80% 유사성을 공유한다.It is known that the IFN-α population of proteins consists of at least 14 genes, including two genes coding for the same protein as one pseudogene. Thus, there are 12 independent IFN-α proteins produced from 14 genes. The various IFN-α share about 80% similarity at the amino acid sequence level.

인터페론 α-D(IFNαD)으로 알려진 인터페론α-1 (IFNα1)는 연구와 임상적 관심인 유형I 인터페론이다. 최근의 보고에 의하면 동물과 인간에서 다양한 바이러스 질병의 치료에서 재조합체 IFNαD의 효율성을 증명하였다(Noisakran and Carr, 2000; Noisakran, et al., 1999). 인간 IFNαD 에서 임상적 그리고 연구적인 관심 때문에 다른 발현 시스템가 개발되고 사용되었다.Interferonα-1 (IFNα1), also known as interferon α-D (IFNαD), is a type I interferon of research and clinical interest. Recent reports have demonstrated the effectiveness of recombinant IFNαD in the treatment of various viral diseases in animals and humans (Noisakran and Carr, 2000; Noisakran, et al., 1999). Different expression systems have been developed and used because of clinical and research interest in human IFNαD.

1982년에 재조합체인간 IFNαD (rHuIFNαD)의 발현이 lac 프로모터를 사용하는Methylophilus methylotrophus시스템와E. coli시스템에서 기술되었다(De Maeyer, 1982). 1984년에, 유전자 ntech 과학자들은 α-인자 신호 서열과 하이브리드된 IFNαD 유전자가 비하여 낮은 생물학적 활성을 가진 분비된 IFNαD 단백질을 생성한Saccharomyces cerevisiae시스템를 보고했다(Singh, 1984). 여러 해후에, 1989년에E. coli와Bacillus subtilis(B. subtilis)에서 스타필로키나아제 이종 발현-분비 신호를 이용한 인간 인터페론유전자의 분비 발현이 개발되었다(Breitling, 1989). 이러한 연구에서,E. coli시스템는 아니고 오직B. subtilis시스템만 배양 배지로 rHuIFNαD 을 분비할 수 있다.E. coli에서 감소된 특정 성장 비율에서 단백질의 발현이 더 효과적으로 되게하는 발효동안에 페드 배치 모드에서 정해진 배지를 사용하여E. coli에서 rHuIFNαD의 세포내 발현이 매우 향상된 것이 1990년에 보고되었다. 하지만, 11년동안 인간 IFNαD의 생산에서 추가적인 중요한 개선은 없었다.In 1982 the expression of recombinant human IFNαD (rHuIFNαD) was described in the Methylophilus methylotrophus system and the E. coli system using the lac promoter (De Maeyer, 1982). In 1984, gene ntech scientists reported the Saccharomyces cerevisiae system, which produced secreted IFNαD proteins with lower biological activity compared to the IFNαD gene hybridized with α-factor signal sequences (Singh, 1984). Several years later, in 1989, secretory expression of human interferon genes was developed in E. coli and Bacillus subtilis ( B. subtilis ) using staphylokinase heterologous expression-secreting signals (Breitling, 1989). In this study, only the B. subtilis system, not the E. coli system, can secrete rHuIFNαD into the culture medium. In the specific growth rate decreased from E. coli using the medium determined in fed batch fermentation during which expression is to be more effective mode of the protein is highly expressed in cells of the improved rHuIFNαD in E. coli were reported in 1990. However, there has been no further significant improvement in the production of human IFNαD for 11 years.

확인된 첫번째 IFN-τ는 18-19 kDa 단백질인 양 IFN-τ이었다(OvIFN-τ). 여러가지 동일형태가 태아(배와 주위막) 동질체에서 확인되었다(Martal, et al., 1979). 후속하여, 태아 배양 배지로 방출된 분자량이 적은 단백질은 정제되었고 열에 불안정하고 프로테아제에 민감한 것이 제시되었다(Godkin, et al., 1982). 양에서 모계 인지의 결정적 기간동안에 양 태아의 영양아층에 의해 처음으로 생산된 일차 분비 단백질이기 때문에 OvIFN-τ는 원래 양 영양아층 단백질-one (oTP-1)으로 불리었다. 후속하는 실험에 의하면 OvIFN-τ는 양과 소와 같은 반추동물에서 임신에 대한 생리적 반응을 설정하는데 필수적인 임신 인지 호르몬임을 결정하였다(Bazer and Johnson, 1991).The first IFN-τ identified was sheep IFN-τ, an 18-19 kDa protein (OvIFN-τ). Several identical forms have been identified in fetal (embryonic and pericardium) isomers (Martal, et al., 1979). Subsequently, low molecular weight proteins released into fetal culture medium were purified and suggested to be heat labile and protease sensitive (Godkin, et al., 1982). OvIFN-τ was originally called sheep trophic protein-one (oTP-1) because it is the first secreted protein produced by the nutrient layer of both fetuses during the critical period of maternal cognition in sheep. Subsequent experiments have determined that OvIFN-τ is a pregnancy cognitive hormone essential for establishing physiological responses to pregnancy in ruminants such as sheep and cattle (Bazer and Johnson, 1991).

양 낭포 라이브러리를, N-말단 아미노산 서열을 대표하는 합성적 올리고뉴클레오티드로 프로브하여 획득한 IFN-τ cDNA는(Imakawa, et al., 1987) 인간, 생쥐, 쥐, 돼지 유래의 IFN-α와 45-55% 동일하고 IFN-Ω로 언급되는 소 IFN-αII와 70%동일한 예측된 아미노산 서열을 갖는다. 다른 동일형태를 대표하는 여러 cDNA 서열이 보고되었다(Stewart, et al., 1989; Klemann, et al., 1990; and Charlier, M., et al., 1991). 모든 것은 23 아미노산 리더 서열과 172 아미노산 성숙한 단백질을 암호화하는 585 염기 공개 판독 구조가 있는 약 1 kb 이다. 아미노 말단과 카르복시 말단과 병치인 4개의 나선 다발로서 IFN-τ의 예측된 구조는 유형I IFN 으로서 분류를 더 지지한다(Jarpe, et al., 1994).IFN-τ cDNAs obtained by probing both cyst libraries with synthetic oligonucleotides representative of the N-terminal amino acid sequence (Imakawa, et al., 1987) were derived from IFN-α and 45 derived from humans, mice, mice and pigs. Has a predicted amino acid sequence that is -55% identical and 70% identical to bovine IFN-αII, referred to as IFN-Ω. Several cDNA sequences have been reported that represent different isoforms (Stewart, et al., 1989; Klemann, et al., 1990; and Charlier, M., et al., 1991). Everything is about 1 kb with a 23 amino acid leader sequence and a 585 base open read structure that encodes a 172 amino acid mature protein. The predicted structure of IFN-τ as four helix bundles juxtaposed with amino and carboxy termini further supports classification as Type I IFN (Jarpe, et al., 1994).

IFN-τ는 유형I IFN와 분류적으로 관련된 많은 활성을 보이지만(상기 표1 참조), 다른 유형I IFN 사이에 큰 차이점이 존재한다. 가장 현저한 차이점은 상기 상세화된 임신에서 역할이다. 또한 다른 것은 바이러스 유도이다. IFN-τ을 제외한 모든 유형I IFN 은 바이러스와 dsRNA 에 의해 쉽게 유도된다(Roberts, et al., 1992). 유도된 IFN-α와 IFN-β 발현은 일시적이고 약 몇 시간동안 지속된다. 반면에, 일단 유도되면 IFN-τ 합성은 몇 일동안 유지된다(Godkin, et al., 1982). 개개의 세포에서 다른 유형I IFN 보다 300배 이상의 IFN-τ가 생성된다(Cross and Roberts, 1991).IFN-τ shows a number of activities that are taxonomically related to type I IFNs (see Table 1 above), but there are significant differences between other type I IFNs. The most significant difference is the role in this detailed pregnancy. Another is viral induction. All type I IFNs, with the exception of IFN-τ, are readily induced by viruses and dsRNAs (Roberts, et al., 1992). Induced IFN-α and IFN-β expression is transient and lasts for several hours. On the other hand, IFN-τ synthesis persists for several days once induced (Godkin, et al., 1982). Individual cells produce 300 times more IFN-τ than other type I IFNs (Cross and Roberts, 1991).

다른 차이점은 IFN-τ 유전자의 조절영역 에서 존재한다. 예를 들어, 소 IFN-Ω유전자로 트랜스펙션하면 항-바이러스 활성이 나타나지 않는 반면 인간 영양아층 세포라인 JAR를 소 IFN-τ에 대한 유전자로 트랜스펙션하면 항-바이러스 활성이 나타난다. 이는 IFN-τ 유전자 발현에 관련된 유일한 트랜스 작용성 인자를 암시한다.Another difference exists in the regulatory region of the IFN-τ gene. For example, transfection with a bovine IFN-Ω gene results in no antiviral activity, whereas transfection of the human trophic cell line JAR with a gene for bovine IFN-τ shows antiviral activity. This suggests the only trans functional factor involved in IFN-τ gene expression.

관찰한 것에 의하면 IFN-τ의 인접하는 프로모터영역 (126으로부터 전사 시작 부위까지)은 IFN-α 와 IFN-β의 인접하는 프로모터영역 과 매우 동일한 반면; -126 부터 -450 까지의영역 은 동일하지 않고 오직 IFN-τ 발현만을 향상시킨다. (Cross and Roberts, 1991). 따라서, 다른 유형 I IFN과 비교하여 다른 조절 인자는 IFN-τ 발현에 관련되어 있는 것 같다.Observations show that the adjacent promoter regions of IFN-τ (from 126 to the start of transcription) are very identical to the adjacent promoter regions of IFN-α and IFN-β; The regions from -126 to -450 are not identical and only improve IFN-τ expression. (Cross and Roberts, 1991). Thus, other regulatory factors seem to be involved in IFN-τ expression compared to other type I IFNs.

IFN-τ 발현은 종마다 다르다. 예를 들어, IFN-τ 발현이 반추동물에서 태아 발전의 특정 단계(일차적으로 13-21일)에 제한되어있을지라도 (Godkin, et al., 1982), 예비 연구는 IFN-τ의 인간 형태는 임신동안에 구조적으로 발현된다는 것을 제시한다(Whaley, et al., 1994).IFN-τ expression varies from species to species. For example, although IFN-τ expression is limited to certain stages of fetal development (primarily 13-21 days) in ruminants (Godkin, et al., 1982), preliminary studies indicate that the human form of IFN-τ It is shown to be structurally expressed during pregnancy (Whaley, et al., 1994).

중요하게, 인터페론의 유용성은 독성 때문에 제한되었다. 암과 바이러스 질병의 치료에서 인터페론을 사용하면 심각한 부작용이 나타난다. IFN-α는 1991 년에 미국과 1992년에 일본에서 임상적 간염C의 추가로 도입되었다(Saito, et al., 2000). 하지만, 임상적 효율성을 나타내기에 효율적인 투여량으로 IFN-α을 사용하는 것(즉, 상기 약 1×10⁶유닛/치료의 양)은 열, 두통, 무기력,관절통과 근육통의 특성이 있는 "감기 유사" 신드롬과 대개 관련있다(Tyring, et al., 1992).Importantly, the availability of interferon was limited because of its toxicity. The use of interferon in the treatment of cancer and viral diseases has serious side effects. IFN-α was introduced as an addition of clinical hepatitis C in 1991 in the United States and Japan in 1992 (Saito, et al., 2000). However, using IFN-α as an effective dose to demonstrate clinical effectiveness (ie, the amount of about 1 × 10 ⁶ units / treatment) is a “cold” characterizing fever, headache, lethargy, joint pain and muscle pain. Similar "syndrome, usually associated with (Tyring, et al., 1992).

5-10×10⁶유닛/치료 그리고 그 이상의 투여량에서 구역, 구토, 설사와 식욕부진과 같은 상기 다른 독성은 더 빈번해진다. IFN-α 치료와 관련된 신경정신적 증상도 또한 보고되었다(Dieperink, et al., 2000). 추가로, 일부 연구는 IFN-α 치료의 효율성이 투여량 의존적이지 않다는 것(Saito, et al., 2000)과 IFN-α로 치료하는 것이 종양 또는 바이러스 간염이 있는 환자에서 자가면역 질병의 발전 또는 악화와 관련되어 있다는 것(Jimenez-Saenz, et al., 2000)을 제시하였다.At other doses of 5-10 × 10 ⁶ units / treatment and other doses such as nausea, vomiting, diarrhea and anorexia become more frequent. Neuropsychiatric symptoms associated with IFN-α treatment have also been reported (Dieperink, et al., 2000). In addition, some studies have shown that the effectiveness of IFN-α treatment is not dose dependent (Saito, et al., 2000), and that treatment with IFN-α may result in the development of autoimmune diseases in patients with tumor or viral hepatitis, or Related to exacerbation (Jimenez-Saenz, et al., 2000).

따라서, 높은 항-바이러스 활성과 낮은 세포독성이 있는 인터페론 단백질이 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 만족시키도록 디자인되었다.Thus, there is a need for interferon proteins with high anti-viral activity and low cytotoxicity. The present invention is designed to meet this need.

발명의 개요Summary of the Invention

따라서, 한 양태에서 본 발명의 목적은 인터페론 단백질을 포함한 인터페론/인터페론-τ 하이브리드 단백질을 제공하는 것이고 여기서 상기 인터페론 단백질의 C-말단영역 은 인터페론-τ의 C-말단영역 으로 치환된다. 한 실시예에서, 발명은 비-τ 인터페론 단백질을 포함하여 비-τ 인터페론/인터페론-τ 하이브리드 단백질을 제공하고 여기서 상기 비-τ 인터페론 단백질의 C-말단영역 은 인터페론-τ의 C-말단영역 으로 대체된다. 또다른 실시예에서, 인터페론 단백질은 유형I 인터페론 단백질이다. 유형I 인터페론 단백질은 인터페론-α이다. 바람직하게, 인터페론-α는 인간 인터페론-α이다. 한 실시예에서, 인간 인터페론-α 은 인간 인터페론-αD이다. 또다른 실시예에서, 인터페론 단백질은 인터페론-β이다.Accordingly, in one aspect, an object of the present invention is to provide an interferon / interferon-τ hybrid protein comprising an interferon protein, wherein the C-terminal region of the interferon protein is substituted with the C-terminal region of interferon-τ. In one embodiment, the invention provides a non-τ interferon / interferon-τ hybrid protein comprising a non-τ interferon protein, wherein the C-terminal region of the non-τ interferon protein is the C-terminal region of interferon-τ. Replaced. In another embodiment, the interferon protein is type I interferon protein. Type I interferon protein is interferon-α. Preferably, the interferon-α is human interferon-α. In one embodiment, human interferon-α is human interferon-αD. In another embodiment, the interferon protein is interferon-β.

한 실시예에서, 하이브리드 의 적어도 2000 항-바이러스 유닛/㎖을 포함하는 배양 배지에서 7일동안 PBMC의 첫번째 샘플을 배양하는 것과 항-바이러스 유닛/㎖으로서 본래 IFN-α의 동등한 농도를 가진 배양 배지에서 7일동안 PBMCs의 두번째 샘플을 배양하는 것을 포함하는 검정에서 두번째 샘플에서 생존가능한 세포의 비율과 첫번째 샘플에 남아있는 생존가능한 세포의 비율과 비교하여 하이브리드 단백질은 본래 인터페론, 즉 인터페론-α에 비하여 낮은 독성을 나타낼 수 있고 여기에서, 생존가능한 세포의 비율이 높은 것은 배양 배지에서 IFN 종의 독성이 비하여 낮은 것을 나타낸다.In one embodiment, culturing the first sample of PBMC for 7 days in a culture medium comprising at least 2000 anti-viral units / ml of hybrid and a culture medium with an equivalent concentration of IFN-α originally as an anti-viral unit / ml In assays involving culturing a second sample of PBMCs for 7 days at a hybrid protein compared to the percentage of viable cells in the second sample and the percentage of viable cells remaining in the first sample, the hybrid protein was originally compared to interferon, ie interferon-α. A low toxicity may be present, wherein a high percentage of viable cells indicates a low toxicity of IFN species in the culture medium.

발명의 한 실시예에서, 인터페론 단백질은 치환된 C-말단영역 의 어느 것도 갖지 않지만 그 대신에, 전체 길이 인터페론 단백질에 첨가된 인터페론-τ의 C-말단영역 을 가진다. 따라서, 인터페론 단백질 치환된 C-말단의 아미노산을 갖지 않는다. 또다른 실시예에서, 인터페론 단백질은 치환된 C-말단의 약 1-30 아미노산을 갖는다. 또다른 실시예에서, 인터페론 단백질은 치환된 C-말단의 약 1-10 아미노산을 갖는다. 바람직하게, 인터페론 단백질은 치환된 C-말단의 최종 4개의 아미노산을 가진다. 관련된 실시예에서, 인간 인터페론-αD의 C-말단영역 은 잔기 163-166에 해당하는 서열에 해당한다.In one embodiment of the invention, the interferon protein has none of the substituted C-terminal regions but instead has the C-terminal region of interferon-τ added to the full length interferon protein. Thus, it does not have an interferon protein substituted C-terminal amino acid. In another embodiment, the interferon protein has about 1-30 amino acids of the substituted C-terminal. In another embodiment, the interferon protein has about 1-10 amino acids substituted at the C-terminus. Preferably, the interferon protein has the last four amino acids substituted C-terminal. In a related embodiment, the C-terminal region of human interferon-αD corresponds to the sequence corresponding to residues 163-166.

한 실시예에서, 하이브리드 단백질은 인터페론-τ의 잔기 163-172 에 해당하는 서열에 해당하는 인터페론-τ의 C-말단영역 을 포함한다. 바람직하게, 인터페론 단백질은 인간 인터페론-αD이고 인간 인터페론-αD 의 C-말단영역 은 잔기163-166에 해당하고 인터페론-τ의 C-말단영역 은 인터페론-τ의 잔기163-172에 해당하는 서열과 대응한다.In one embodiment, the hybrid protein comprises a C-terminal region of interferon-τ corresponding to a sequence corresponding to residues 163-172 of interferon-τ. Preferably, the interferon protein is human interferon-αD and the C-terminal region of human interferon-αD corresponds to residues 163-166 and the C-terminal region of interferon-τ corresponds to a sequence corresponding to residues 163-172 of interferon-τ. Corresponds.

한 실시예에서, 하이브리드 단백질은 인터페론 또는 비-τ 인터페론 단백질의 세포독성에 비하여 감소된 세포독성을 가진다. 또다른 실시예에서, 하이브리드 단백질은 인터페론 또는 비-τ 인터페론 단백질의 항-바이러스 활성과 비하여 항-바이러스 활성을 증가시켰다. 관련된 실시예에서, 하이브리드 단백질은MDBK/VSV 항-바이러스 시스템에서 적어도 약 1×10⁸항-바이러스 유닛/mg의 항-바이러스 활성을 가진다. 또다른 관련된 실시예에서, 하이브리드 단백질은 MDBK/VSV 항-바이러스 시스템에서 적어도 약 2×10⁸항-바이러스 유닛/mg의 항-바이러스 활성을 가진다.In one embodiment, the hybrid protein has reduced cytotoxicity relative to the cytotoxicity of interferon or non-τ interferon protein. In another embodiment, the hybrid protein increased anti-viral activity compared to the anti-viral activity of interferon or non-τ interferon protein. In related embodiments, the hybrid protein has an anti-viral activity of at least about 1 × 10 ⁸ anti-viral units / mg in the MDBK / VSV anti-viral system. In another related embodiment, the hybrid protein has an anti-viral activity of at least about 2 × 10 ⁸ anti-viral units / mg in the MDBK / VSV anti-viral system.

발명은 인터페론-τ 단백질은 반추동물 인터페론-τ임을 계획했다. 한 실시예에서,인터페론-τ는 양 또는 소 인터페론-τ이다. 발명은 또한 상기 기술된 어떠한 하이브리드 단백질은 페길화된 것을 의도한다.The invention envisions that the interferon-τ protein is ruminant interferon-τ. In one embodiment, the interferon-τ is either positive or bovine interferon-τ. The invention also intends that any hybrid protein described above is PEGylated.

또다른 양태에서, 발명은 상기 기술된 하이브리드 단백질을 암호화하는 핵산 입자를 포함한다. 또다른양태에서, 발명은 인터페론 하이브리드 단백질을 제조하는 방법을 포함한다. 방법을 실행하는데 관련된 단계는 재조합체발현 시스템에서 상기 기술된 핵산 입자를 위치시키는 것; 하이브리드 단백질을 생산하기 위해서 핵산 입자의 발현에 영향을 미치는 것; 하이브리드 단백질을 회복시키는 것을 포함한다. 한 실시예에서, 재조합체발현 시스템는P. pastoris을 포함한다.In another embodiment, the invention includes nucleic acid particles encoding the hybrid proteins described above. In another embodiment, the invention includes a method of making an interferon hybrid protein. The steps involved in carrying out the method include placing the nucleic acid particles described above in a recombinant expression system; Affecting the expression of nucleic acid particles to produce hybrid proteins; Recovering the hybrid protein. In one embodiment, the recombinant expression system comprises P. pastoris .

또 다른 양태에서, 본 발명에서 약학적 조성물은 상기 기술된 바와 같이 준비된 하이브리드 단백질과 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 조성물은 또한 리바비린을 포함한다.In another embodiment, the pharmaceutical composition in the present invention comprises a hybrid protein prepared as described above and a pharmaceutically acceptable carrier. The composition also includes ribavirin.

한 양태에서, 발명은 또한 바이러스로 감염된 세포에서 바이러스 복제를 억제하는 방법을 포함한다. 방법은 세포에서 바이러스의 복제를 억제하기에 충분한 양으로 세포를 하이브리드 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다.In one aspect, the invention also includes a method of inhibiting viral replication in a virus infected cell. The method includes contacting the cell with a hybrid protein in an amount sufficient to inhibit the replication of the virus in the cell.

종양 세포의 성장을 억제하는 방법도 또한 계획되었다. 방법은 또한 성장을 억제하기에 충분한 양으로 하이브리드 단백질과 종양 세포를 접촉시키는 것을 포함한다.Methods have also been planned to inhibit the growth of tumor cells. The method also includes contacting the tumor cells with the hybrid protein in an amount sufficient to inhibit growth.

발명의 또다른 양태는 시험체에서 자가면역 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 방법은 질병을 치료하기에 효과적인 양으로 상기 기술된 바와 같이 준비된 하이브리드 단백질을 시험체에 투여하는 것을 포함한다.Another aspect of the invention includes a method of treating an autoimmune disease in a subject. The method comprises administering to the test body a hybrid protein prepared as described above in an amount effective to treat the disease.

발명의 또다른 양태는 시험체에서 임상적 염증을 치료하는 방법을 포함한다. 방법은 염증을 치료하기에 효과적인 양으로 상기 기술된 바와 같이 제조된 하이브리드 단백질을 시험체에 투여하는 것을 포함한다.Another aspect of the invention includes a method of treating clinical inflammation in a test subject. The method comprises administering to the test body a hybrid protein prepared as described above in an amount effective to treat inflammation.

발명의 또다른 양태는 인터페론에 반응하는 질병 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 방법은 질병 상태를 치료하기에 효과적인 양으로 상기 기술된 바와 같이 제조된 하이브리드 단백질을 질병이 있는 시험체에 투여하는 것을 포함한다.Another aspect of the invention includes a method of treating a disease state in response to interferon. The method comprises administering a hybrid protein prepared as described above to an diseased test subject in an amount effective to treat the disease state.

상기 기술된 방법에서 투여는 구강, 국부적, 흡입, 코 그리고 주사로 구성된 집단에서 선택된 투여 방법으로 수행된다.In the methods described above, the administration is performed by a method of administration selected from the group consisting of oral, topical, inhalation, nasal and injection.

발명의 다음 상세한기술을 첨부한 도면과 함께 읽을 때 발명의 목적과 특징은 완전히 높게 평가된다.When the following detailed description of the invention is read in conjunction with the accompanying drawings, the objects and features of the invention are highly appreciated.

도의 간단한 설명Brief description of the figure

도. 1 는 HVV 단편 1과 최종 연결된 산물을 생산하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열을 제시한다;Degree. 1 sets forth the sequence of oligonucleotides used to produce the product that was finally linked to HVV fragment 1;

도. 2 는 HVV 단편 2와 최종 연결된 산물을 생산하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열을 제시한다;Degree. 2 sets forth the sequence of the oligonucleotides used to produce the product finally linked to HVV fragment 2;

도. 3 는 HVV 단편 3과 최종 연결된 산물을 생산하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열을 제시한다;Degree. 3 sets forth the sequence of oligonucleotides used to produce the product that was finally linked to HVV fragment 3;

도. 4 는 HVV 단편 4와 최종 연결된 산물을 생산하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열을 제시한다;Degree. 4 sets forth the sequence of the oligonucleotides used to produce the product finally linked to HVV fragment 4;

도. 5A-5C는 HVV-pPICZ-α 구조물의 서열과 선택된제한 부위를 제시한다;Degree. 5A-5C show the sequence of the HVV-pPICZ-α construct and selected restriction sites;

도. 6A-6B는 구성에서 선택된 HVV 단백질을 제시한다;Degree. 6A-6B show HVV proteins selected from the constructs;

도. 7 은 1% 메탄올로 72시간 유도한 후P. pastorisHVV 재조합체 배양 상청액의 SDS-PAGE 젤이다;Degree. 7 is the SDS-PAGE gel of P. pastoris HVV recombinant culture supernatant after 72 hours induction with 1% methanol;

도. 8 은P. pastoris상청액 유래의 HVV 단백질의 부분 정제를 제시하는 SDS-PAGE 젤이다.Degree. 8 is an SDS-PAGE gel showing partial purification of HVV protein from P. pastoris supernatant.

도. 9 은 흐름 세포측정으로 분석한 PBMC 세포의 특이 세포 죽음의 비율을 예시한다.Degree. 9 illustrates the rate of specific cell death of PBMC cells analyzed by flow cytometry.

도. 10은 선택된 인터페론 단백질의 아미노산 서열 정렬을 제시한다.Degree. 10 shows the amino acid sequence alignment of the selected interferon protein.

본 발명은 인터페론-τ에서 유래한 C-말단 영역과 다른 인터페론에서 유래한영역으로 구성된 하이브리드 인터페론 단백질에 관한 것이다.The present invention relates to a hybrid interferon protein consisting of a C-terminal region derived from interferon-τ and a region derived from another interferon.

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I.정의 I. Definition

다르게 제시되지 않으면, 여기서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명의 당업계에 능숙한 이들에게 알려진 바와 같은 의미를 가진다. 당업계의 정의와 용어에 대해서 업계에 종사하는 이들은 특정하게 Sambrook et al., 1989,와 Ausubel F M et al., 1993, 을 참조한다. 본 발명은 기술된 특정 방법론, 프로토콜, 그리고 시약에 한정되지 않고 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.Unless otherwise indicated, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as known to those skilled in the art. Those in the industry with respect to definitions and terms in the art specifically refer to Sambrook et al., 1989, and Ausubel F M et al., 1993. It is to be understood that the present invention may vary without being limited to the particular methodology, protocols, and reagents described.

여기에 인용된 모든 출판과 특허는 발명과 관련하여 사용되는 조성물과 방법론을 기술하고 개시하는 목적으로 참고문헌으로 통합된다.All publications and patents cited herein are incorporated by reference for the purpose of describing and disclosing the compositions and methodologies used in connection with the invention.

"이종" 핵산 구조물 또는 서열은 발현되는 세포 그대로이지 않은 서열의 위치를 가진다. 조절 서열과 관련하여 이종은 현재 조절하는 발현의 같은 유전자를 본래 조절하도록 기능하지 않는 조절 서열(즉 프로모터 또는 인핸서)을 말한다.A “heterologous” nucleic acid construct or sequence has a position in the sequence that is not intact for the cell to be expressed. Heterologous with respect to regulatory sequences refers to regulatory sequences (ie, promoters or enhancers) that do not originally function to regulate the same gene of expression that is currently regulated.

일반적으로, 이종 핵산 서열은 세포에 내생적이지 않거나 또는 그들이 존재하는 게놈의 일부이고 감염, 트랜스펙션, 미세주입, 일렉트로포레이션, 또는 유사 방법으로 세포에 첨가된다. "이종" 핵산 구조물은 본래 세포에서 발견되는 조절 서열/DNA 암호화서열 조합에서 유래한 것과 같은 것 또는 다른 조절 서열/DNA 암호화서열 조합을 포함한다.In general, heterologous nucleic acid sequences are not endogenous to the cells or are part of the genome in which they exist and are added to the cells by infection, transfection, microinjection, electroporation, or similar methods. “Heterologous” nucleic acid constructs include those as derived from regulatory sequence / DNA coding sequence combinations found inherently in cells or other regulatory sequence / DNA coding sequence combinations.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 " 벡터"는 다른 숙주 세포사이의 전이를 목적으로 한 핵산 구조물을 말한다. "발현 벡터" 는 외부 세포에서 이종 DNA 단편을 통합하고 발현하는 능력을 가진 벡터를 말한다. 원핵과 진핵 발현 벡터는 시중구입 가능하다. 적절한 발현 벡터를 선택하는 것은 당업계 숙련자의 지식 내이다.As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid construct intended for transfer between different host cells. An "expression vector" refers to a vector having the ability to integrate and express heterologous DNA fragments in foreign cells. Prokaryotic and eukaryotic expression vectors are commercially available. Choosing the appropriate expression vector is within the knowledge of those skilled in the art.

여기에서 사용된 것과 같이, "발현 카세트" 또는 "발현 벡터"는 표적 세포 또는 시험관 내에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 지정된 핵산 요소가 있는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구조물이다. 재조합체 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스, 또는 핵산 단편으로 통합될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합체 발현 카세트 위치는 다른 서열중에서 전사될 핵산 서열과 프로모터를 포함한다.As used herein, an "expression cassette" or "expression vector" is a recombinantly or synthetically generated nucleic acid construct having a series of designated nucleic acid elements that allow transcription of a particular nucleic acid in a target cell or in vitro. . Recombinant expression cassettes can be integrated into plasmids, chromosomes, mitochondrial DNA, plastid DNA, viruses, or nucleic acid fragments. Typically, the recombinant expression cassette position of an expression vector comprises a nucleic acid sequence and a promoter to be transcribed among other sequences.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "플라스미드" 는 벡터를 클로닝하는데 사용되고 많은 세균과 일부 진핵세포에서 염색체외의 자가 복제적 유전적 요소를 형성하는 원형 이중 가닥(ds) DNA 구조물을 말한다.As used herein, the term "plasmid" refers to a circular double stranded (ds) DNA construct that is used to clone a vector and forms an extrachromosomal autologous genetic element in many bacteria and some eukaryotic cells.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "선택가능한 마커-암호화 뉴클레오티드서열"은 숙주 세포에서 발현할 수 있고 선택가능한 마커가 발현되면 해당하는 선택제가 존재할 때 자랄 수 있는 능력을, 발현된 유전자를 함유하는 세포에게 주는 뉴클레오티드서열을 말한다.As used herein, the term “selectable marker-encoding nucleotide sequence” refers to a cell containing an expressed gene that is capable of being expressed in the host cell and, when the selectable marker is expressed, the ability to grow in the presence of the corresponding selector. Refers to the nucleotide sequence given to.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "프로모터" 와" 전사 개시자"는 하류 유전자의 전사를 지시하는 기능을 하는 핵산 서열을 말한다. 프로모터는 일반적으로 표적 유전자가 발현되는 숙주 세포에 적절할 것이다. 다른 전사와 번역 조절 핵산 서열(또한 "조절 서열"이라 불리는)과 함께 프로모터는 주어진 유전자를 발현하는데 필요하다. 하류에서, 전사와 번역 조절 서열은 제한되지 않고 모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 시작과 종결 서열, 번역 시작과 종결 서열과 인핸서 또는 활성자 서열을 포함한다.As used herein, the terms “promoter” and “transcription initiator” refer to a nucleic acid sequence that functions to direct transcription of a downstream gene. The promoter will generally be appropriate for the host cell in which the target gene is expressed. Along with other transcriptional and translational regulatory nucleic acid sequences (also called "regulatory sequences"), a promoter is needed to express a given gene. Downstream, transcriptional and translational regulatory sequences include, but are not limited to, motor sequences, ribosomal binding sites, transcriptional start and stop sequences, translational start and stop sequences, and enhancer or activator sequences.

여기서 정해진 바와 같이 "가공할 유전자" 또는 "이종 핵산 구조물"은 조절 요소를 포함한 다른 유전자의 부분으로 구성된 비-본래유전자(즉, 숙주로 도입된 것)를 말한다. 숙주 세포의 형질전환에 대한 가공할 유전자 구조물은 전형적으로이종 단백질 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 또는 선택가능한 마커 가공할 유전자에서, 형질전환된 숙주 세포에 항생제 저항성을 주는 단백질을 암호화하는 선택가능한 마커 유전자에 연결된 전사 조절영역(프로모터)로 구성되어 있다.As defined herein, "gene to be processed" or "heterologous nucleic acid construct" refers to a non-native gene (ie, introduced into a host) consisting of parts of other genes including regulatory elements. Gene constructs to be processed for transformation of host cells are typically selectable marker genes that encode proteins that give antibiotic resistance to the transformed host cell in the genes to be processed or selectable markers operably linked to heterologous protein coding sequences. It consists of a transcriptional control region (promoter) connected to.

숙주 세포로 형질전환하기 위해서, 본 발명의 전형적 가공할 유전자는 구조적 또는 유도가능한 전사 조절영역 , 단백질 암호화 서열과 터미네이터 서열을 포함한다. 표적 단백질의 분비가 바람직하면 가공할유전자 구조물은 신호 펩티드를 암호화하는 두번째 DNA 서열을 포함한다.For transformation into host cells, typical genes to be processed of the present invention include structural or inducible transcriptional regulatory regions, protein coding sequences and terminator sequences. If secretion of the target protein is desired, the genetic construct to be processed comprises a second DNA sequence encoding a signal peptide.

다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이면 핵산은 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 분비 리더를 암호화하는 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프레단백질로 발현되면 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결된다; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치면 암호화서열에 작동가능하게 연결된다; 또는 번역을 촉진하기 위해서 위치한다면 리보솜 결합 부위는 암호화서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 인접하고 분비 리더의 경우에, 판독 시기에서 인접하는 것을 의미한다. 하지만, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 편리한 제한 부위에서 라이게이션하여 연결을 달성한다. 그러한 부위가 존재하지 않는다면, 통상적 수행에 따라 합성적 올리고뉴클레오티드 어뎁터 또는 링커가 사용된다.Nucleic acids are “operably linked” when in functional relationship with other nucleic acid sequences. For example, the DNA encoding the secretory leader is operably linked to the DNA of the polypeptide when expressed as a preprotein that participates in the secretion of the polypeptide; A promoter or enhancer is operably linked to the coding sequence when it affects the transcription of the sequence; Or the ribosomal binding site, if located to facilitate translation, is operably linked to a coding sequence. In general, “operably linked” means that the linked DNA sequences are contiguous and, in the case of a secretory leader, contiguous at the time of reading. However, enhancers do not have to be contiguous. Ligation is achieved at convenient restriction sites to achieve connectivity. If such sites do not exist, synthetic oligonucleotide adapters or linkers are used in accordance with conventional practice.

여기에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 암호화지역에 선행하고 후속하는영역 을 포함 또는 포함하지 않는 폴리펩티드 체인을 생성하는데 관련되는 DNA의 단편, 즉 각 암호화 단편 (엑손)사이에 개재하는 서열(인트론)과 5' 번역되지 않은(5' UTR) 또는 "리더" 서열과 3' UTR 또는 "트레일러" 서열을 의미한다.As used herein, the term “gene” refers to a fragment of DNA involved in generating a polypeptide chain that includes or does not contain a region preceding and following a coding region, ie, a sequence interposed between each coding fragment (exon). Intron) and 5 'untranslated (5' UTR) or "leader" sequences and 3 'UTR or "trailer" sequences.

여기에서 사용된 것과 같이, "재조합체"는 세포 또는 이종 핵산 서열을 도입하여 변경된 또는 세포가 변경된 세포에서 유래한 세포 또는 벡터를 언급하는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 고의적 인간이 개입하여 형성된 모든 것에서 발현 또는 발현되지 않는 상태에서 재조합체세포는 세포의 본래 (비재조합체) 형태 내의 동일한 형태에서 발견되지 않은 유전자를 발현하거나 또는 비정상적으로 발현된 본래 유전자를 발현한다.As used herein, “recombinant” includes the introduction of a cell or heterologous nucleic acid sequence to refer to a cell or vector derived from a cell that has been altered or has changed. Thus, for example, in a state in which a recombinant cell is expressed or not expressed in everything formed by intentional human intervention, the recombinant gene expresses a gene that is not found in the same form in the original (nonrecombinant) form of the cell or is abnormally expressed. Expresses.

핵산 서열을 세포에 삽입시킨다는 문맥에서 용어 "도입된"은 "트랜스펙션", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고 핵산 서열이 자기 복제체로 전환된 또는 일시적으로 발현된(예를 들어, 트랜스펙트된 mRNA)세포의 게놈(예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드, 또는 미토콘드리아 DNA)으로 통합되는 진핵 또는 원핵 세포로 핵산 서열을 통합하는 것을 언급함을 포함한다.The term "introduced" in the context of inserting a nucleic acid sequence into a cell means "transfection", or "transformation" or "transduction" and the nucleic acid sequence has been converted or self-expressed (for example, For example, incorporating nucleic acid sequences into eukaryotic or prokaryotic cells that integrate into the genome (eg, chromosome, plasmid, plasmid, or mitochondrial DNA) of a transfected mRNA) cell.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "발현" 은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열에 근거하여 생산되는 공정을 말한다. 공정은 전사와 번역을 포함한다.As used herein, the term “expression” refers to the process by which a polypeptide is produced based on the nucleic acid sequence of a gene. The process includes transcription and translation.

용어 "신호 서열" 은 세포 외부로 단백질의 성숙한 형태의 분비를 촉진하는 단백질의 N-말단 위치에서 아미노산의 서열을 말한다. 세포외 단백질의 성숙한 형태는 분비 공정동안에 절단되는 신호 서열이 없다.The term "signal sequence" refers to the sequence of amino acids at the N-terminal position of a protein that promotes the secretion of the mature form of the protein out of the cell. Mature forms of extracellular proteins lack signal sequences that are cleaved during the secretion process.

용어 "숙주 세포" 는 벡터를 포함하고 발현 구조물의 복제 및/또는 전사 또는 전사와 번역(발현)을 보조하는 세포를 의미한다. 본 발명에 사용되는 숙주 세포는E. coli와 같은 원핵 세포 또는 효모, 식물, 곤충, 양서류, 또는 포유동물세포와 같은 진핵 세포가 될 수 있다.The term “host cell” means a cell comprising a vector and which assists in the replication and / or transcription or transcription and translation (expression) of an expression construct. Host cells used in the present invention may be prokaryotic cells such as E. coli or eukaryotic cells such as yeast, plants, insects, amphibians, or mammalian cells.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "활성적"와 "생물학적으로 활성적" 은 효소적 활성과 같은 특정 표적 단백질과 관련된 생물학적 활성을 말한다. 주어진 단백질의 생물학적 활성은 당업계에서 능숙한 이들에 의해 단백질에 전형적으로 부여된 생물학적 활성을 말한다.As used herein, the terms "active" and "biologically active" refer to biological activity associated with a particular target protein, such as enzymatic activity. The biological activity of a given protein refers to the biological activity typically conferred to the protein by those skilled in the art.

"간염C 바이러스 또는 HCV" 는 병원성 유형의 바이러스 종은 비-A 비-B 간염(NANBH)과 감소된 유형 또는 거기서부터 유도된 결손된 간섭 입자을 유도하는 바이러스 종을 말한다. HCV 게놈은 RNA로 구성되어 있다. 바이러스를 포함하는 RNA는 보도에 따르면 통합된 핵산당 10^-3에서 10^-4의 크기로 비하여 자발적 돌연변이의 비율이 높다. 유전형의 이질성과 유동성은 RNA 바이러스에서 선천적이기 때문에, 독성 또는 비독성인 HCV 종내에 다수의 유형/서브타입이 있다. 다양한 HCV 유형 또는 균주의 전파, 동정, 검출, 분리가 본문에 문서로 증명되었다."Hepatitis C virus or HCV" refers to a viral species in which a pathogenic type viral species induces non-A non-B hepatitis (NANBH) and a reduced type or missing interfering particles derived therefrom. The HCV genome consists of RNA. RNA containing viruses reportedly have a higher rate of spontaneous mutations compared to 10 ⁻³ to 10 ⁻⁴ size per integrated nucleic acid. Because heterogeneity and fluidity of genotypes are inherent in RNA viruses, there are many types / subtypes within HCV species that are toxic or nontoxic. The propagation, identification, detection and isolation of various HCV types or strains has been documented in the text.

상태를 "처리"하는 것은 상태의 증상을 감소시키고/또는 상태의 강도를 경감시키기에 효율적인 치료 물질을 투여하는 것을 말한다."Treating" a condition refers to administering a therapeutic agent that is effective to reduce the symptoms of the condition and / or lessen the intensity of the condition.

"구강"은 입으로 투여 또는 위 투여를 포함한 위 또는 창자로 직접 투여와 관련된 어느 경로를 말한다."Oral" refers to any route associated with oral administration to the stomach or intestine, including oral administration.

"OAS 수준"은 혈액 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 (OAS) 단백질의 농도 또는 활성을 말한다."OAS level" refers to the concentration or activity of blood 2 ', 5'-oligoadenylate synthase (OAS) protein.

"효모"는 자낭홀씨생산 효모(Endomycetales), 담자홀씨생산 효모, 불완전균류(Blastomycetes)에 속하는 효모를 말한다. 자낭홀씨생산 효모는 Spermophthoraceae와 Saccharomycetaceae 두 집단으로 나누어진다. 후자는 4개의 하부집단 Schizosaccharomycoideae (즉, 속 Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae, 와 Saccharomycoideac (즉, 속 Pichia, Kllyveromyces, Saccharomyces)으로 구성되어 있다. 담자홀씨생산 효모는 속 Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporiobolus, Filobasidium, Filobasidiella을 포함한다. 불완전균류에 속하는 효모는 두 집단 Sporobolomycetacea (즉, 속 Sporoholomyces, Bullera) 와 Cryptococcaceae (즉, 속 Candida)으로 나누어진다. 본 발명에서 매우 흥미로운 것은 속Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida.내부의 종이다. 특히 흥미로운 것은Pichia종P. pastoris이다. 효모의 분류는 미래에 변하기 때문에, 본 발명의 목적에 따라서 효모는 Skinner et al에 기술된 바와 같이 정해진다. 앞서 말한 것에 추가로, 당업계에서 능숙한 사람들은 효모의 생물학과 효모 유전학의 조작에 익숙할 것이다. 여기에 참고문헌으로 통합된 예를 들어, Bacila et al.; Rose and Harrison; Strathern et al.; 참조."Yeast" refers to yeast belonging to the endomycetales, basidiomycete production yeast, Blastomycetes. Asymptomatic seed yeast is divided into two groups, Spermophthoraceae and Saccharomycetaceae. The latter consists of four subgroups Schizosaccharomycoideae (ie Genus Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae, and Saccharomycoideac (ie Genus Pichia, Kllyveromyces, Saccharomyces). Basidiomycete production yeast includes genus Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporiobolus, Filobasidium, Filobasidiella. Yeasts belonging to incomplete fungi are divided into two groups, Sporobolomycetacea (ie, genus Sporoholomyces, Bullera) and Cryptococcaceae (ie, genus Candida). Very interesting in the present invention are species within the genus Pichia , Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida. Of particular interest is the Pichia species P. pastoris . Since the classification of yeast changes in the future, for the purposes of the present invention yeast is defined as described in Skinner et al. In addition to the foregoing, those skilled in the art will be familiar with the biology of yeast and the manipulation of yeast genetics. See, eg, Bacila et al .; incorporated herein by reference; Rose and Harrison; Strathern et al .; Reference.

본 발명의 뉴클레오티드서열은 효모 프로모터에 작동가능하게 연결되었을 때 효모 숙주 세포에서 해당하는 생물학적으로 활성적인 성숙한 이종 단백질을 생산하는데 유용하다. 이러한 방식으로, 본 발명의 하이브리드 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드서열은 효모 숙주 세포로 도입하기 위해서 발현 카세트에 제공된다. 이러한 발현 카세트는 하이브리드 전구체 폴리펩티드를 암호화하는뉴클레오티드서열에 연결된 전사 시작영역 을 포함한다. 그러한 발현 카세트에 조절영역 의 전사 조절하에서 뉴클레오티드서열의 삽입에 대해서 다수의 제한 부위가 제공된다. 발현 카세트는 추가적으로 선택가능한 마커 유전자를 함유한다.Nucleotide sequences of the present invention are useful for producing corresponding biologically active mature heterologous proteins in yeast host cells when operably linked to yeast promoters. In this way, nucleotide sequences encoding the hybrid precursor polypeptides of the invention are provided in an expression cassette for introduction into yeast host cells. Such expression cassettes comprise a transcription start region linked to a nucleotide sequence encoding a hybrid precursor polypeptide. Such expression cassettes are provided with a number of restriction sites for insertion of nucleotide sequences under transcriptional control of regulatory regions. The expression cassette additionally contains a selectable marker gene.

클로닝 또는 발현 벡터는 추가적 요소를 포함한다. 예를 들어, 발현 벡터에는 2개의 복제 시스템가 있기 때문에, 따라서 두가지 유기체, 예를 들어 인간 또는 곤충 세포에서 발현을 위해서 그리고 원핵 숙주에서 클로닝과 증폭을 위해서 유지되도록 한다.Cloning or expression vectors include additional elements. For example, because there are two replication systems in an expression vector, they are thus maintained for expression in two organisms, for example human or insect cells, and for cloning and amplification in prokaryotic hosts.

클로닝과 발현 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제되게 하는 핵산 서열을 함유한다. 게다가, 발현 벡터를 통합하기 위해서, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈과 동일한 적어도 한 서열, 그리고 바람직하게 발현 구조물에 끼어든 두 개의 동일한 서열을 함유한다. 통합 벡터는 벡터에서 포함하기 위해서 적절한 동일한 서열을 선택하여 숙주 세포의 특정 위치로 향한다. 통합 벡터에 대한 구조물은 기술서에 잘 공지되어 있다.Cloning and expression vectors contain nucleic acid sequences that allow the vector to replicate in one or more selected host cells. In addition, to integrate the expression vector, the expression vector contains at least one sequence identical to the host cell genome, and preferably two identical sequences interrupted in the expression construct. The integration vector selects the same sequence appropriate for inclusion in the vector and directs it to a specific location in the host cell. Structures for integrating vectors are well known in the art.

클로닝과 발현 벡터는 전형적으로 선택가능한 마커를 함유한다. 전형적 선택가능한 마커 유전자는 예를 들어, (a)암피실린, 네오마이신, 트메토트렉사트, 제오신 또는 테트라사이클린과 같은 항생제 또는 다른 독신에 저항성을 주고 (b) 영양 요구성의 부족을 보완 또는 (c) 예를 들어,Bacilli에 대한 D-알라닌 라세마제을 암호화하는 유전자 같은 복합 배지로부터 유용하지 않은 중대한 영양분을 제공하는 단백질을 암호화한다.Cloning and expression vectors typically contain selectable markers. Typical selectable marker genes may be: (a) resistant to antibiotics or other toxins, such as (a) ampicillin, neomycin, tmethotrexate, zeocin or tetracycline, (b) supplementing the lack of nutritional requirements or (c) ) Encodes a protein that provides significant nutrients that are not useful from complex media, such as, for example, the gene encoding D-alanine racemase for Bacilli .

"IFN-τ"는 인터페론 단백질의 한 집단은 여기서 전체가 참고문헌으로 통합된 U.S. Pat. No. 5,939,286에 제시된 IFN-τ 서열 또는 도. 10에 제시된 IFN-τ 와 양 IFN-τ 서열과 70% 이상, 또는 바람직하게 약 80% 이상, 또는 더 바람직하게 약 90% 이상,그리고 더 바람직하게 약 95% 이상의 아미노산 유사성을 가진 단백질을 말한다. 디폴트 변수를 가지고 있는 ALIGN 프로그램을 사용하여 아미노산 유사성을 결정할 수 있다."IFN-τ" refers to a group of interferon proteins in which U.S. Pat. No. IFN-τ sequence shown in 5,939,286 or FIG. Refers to a protein having at least 70%, or preferably at least about 80%, or more preferably at least about 90%, and more preferably at least about 95% amino acid identity with an IFN-τ and a quantity IFN-τ sequence set forth in 10. Amino acid similarity can be determined using the ALIGN program with default variables.

이 프로그램은 서열 비교 프로그램의 FASTA 버전 1.7에서 발견할 수 있다(Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; program available from William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, Va.).This program can be found in FASTA version 1.7 of the sequence comparison program (Pearson and Lipman, 1988; Pearson, 1990; program available from William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, Va.) .

"IFN-α"은 도. 10 에 제시된 바와 같이 IFN-αD 아미노산 서열을 포함한 인터페론 단백질 집단 중 하나 그리고 아미노산이 치환되고 단백질의 활성에 중요하게 영향을 미치지 않는 중성 아미노산 치환과 같은 변경이 있는 단백질을 말한다. 바람직하게 서열은 도.10의 IFN-αD 서열과 도.10 에 제시된 서열과 약 70% 이상, 또는 바람직하게 약 80% 이상, 또는 더 바람직하게 약 90% 이상, 더 바람직하게 약 95% 이상의 아미노산 서열 유사성을 가진 단백질을 포함한다. 상기 기술된 바와 같이 예를 들어, 디폴트 매개변수가 있는 ALIGN 프로그램을 사용하여 아미노산 유사성을 결정할 수 있다."IFN-α" is shown in FIG. Refers to a protein in one of the populations of interferon proteins comprising the IFN-αD amino acid sequence as shown in 10 and alterations such as neutral amino acid substitutions where the amino acids are substituted and do not significantly affect the activity of the protein. Preferably the sequence is at least about 70%, or preferably at least about 80%, or more preferably at least about 90%, more preferably at least about 95% amino acid with the IFN-αD sequence of Figure 10 and the sequence shown in Figure 10; Include proteins with sequence similarity. As described above, for example, amino acid similarity can be determined using the ALIGN program with default parameters.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "IFN 발현"은 상기 기술된 IFN 유전자, 전구체 RNA, mRNA, 폴리펩티드, 후 번역 공정된 폴리펩티드와 유도체를 포함하는 산물의 전사와 번역을 말한다. 실시예를 통해서, IFN 발현에 대한 검정은 표준 세포변성 보호 검정, 웨스턴과 노던 블랏 분석과 IFN mRNA에 대한 역 전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 포함한다.As used herein, the term “IFN expression” refers to the transcription and translation of a product, including the IFN gene, precursor RNA, mRNA, polypeptide, post-translationally processed polypeptides and derivatives described above. By way of example, assays for IFN expression include standard cytopathic protection assays, Western and Northern blot analysis and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) on IFN mRNA.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "IFN의 생물학적 활성"과 "생물학적으로 활성적 IFN"은 특정하게 표준 세포변성 보호 검정으로 측정할 수 있는 항-바이러스 활성을 포함한, 효소적 활성과 같은 IFN, 또는 IFN의 단편, 유도체, 또는 유사물과 관련된 생물학적 활성을 말한다.As used herein, the terms “biological activity of IFN” and “biologically active IFN” refer specifically to IFNs, such as enzymatic activity, including anti-viral activity that can be measured by standard cytopathic protection assays, or Refers to a biological activity associated with a fragment, derivative, or analog of IFN.

여기에서 사용된 것과 같이, IFN과 관련된 단백질에 비하여 용어 "변경된 형태 "는 본래 단백질의 유도체 또는 변이 형태를 의미한다. 즉, 단백질의 "변경된 형태"는 아미노산 치환이 특정하게 바람직하고 적어도 하나의 아미노산치환, 삭제 또는 삽입을 함유하는 유도체 폴리펩티드 서열을 가진다. 아미노산 치환, 삽입 또는 삭제는 단백질의 생물학적 활성을 방해하는 폴리펩티드 서열 내의 어떠한 잔기에서도 발생한다. 변이체 또는 유도체 단백질을 암호화하는 해당 핵산 서열은 유전자 또는 그러한 암호화 서열의 "변이된" 또는 "변경된" 형태로 간주되고 본 발명의 범위 내에 포함된다.As used herein, the term “modified form” as compared to a protein associated with IFN refers to a derivative or variant form of the original protein. In other words, a "modified form" of a protein has a derivative polypeptide sequence that is particularly preferably amino acid substitution and contains at least one amino acid substitution, deletion or insertion. Amino acid substitutions, insertions, or deletions occur at any residue in the polypeptide sequence that interferes with the biological activity of the protein. Corresponding nucleic acid sequences encoding variant or derivative proteins are considered "muted" or "modified" forms of the gene or such coding sequences and are included within the scope of the present invention.

"변형"은 삭제(절단)으로 본래 폴리펩티드에서 유래한 폴리펩티드 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산을 N-말단 및/또는 본래 단백질의 C-말단에 첨가 및/또는 ; 본래 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삭제 또는 첨가; 또는 본래 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 부위에서 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환을 말한다. 그러한 변형은 예를 들어, 유전적 다형 현상 또는 인간조작으로부터 생성된다. 그러한 조작 방법은 일반적으로당업계에 공지되어 있다."Modification" is deletion (cutting) adding a polypeptide or one or more amino acids derived from the original polypeptide to the N-terminus and / or to the C-terminus of the original protein; Deletion or addition of one or more amino acids at one or more sites of the original polypeptide; Or substitution of one or more amino acids at one or more sites in the original polypeptide. Such modifications result from, for example, genetic polymorphisms or human manipulation. Such methods of operation are generally known in the art.

예를 들어, 폴리펩티드의 아미노산 서열 변형은 하이브리드 IFN의 어느 것을 암호화하는 클론된 DNA 서열에서 돌연변이로 제조할 수 있다.For example, amino acid sequence modifications of polypeptides can be made with mutations in cloned DNA sequences encoding any of the hybrid IFNs.

돌연변이와 뉴클레오티드서열 변경에 대한 방법은 당업계에 공지되어 있다. , 예를 들어, Walker and Gaastra, eds. (1983); Kunkel (1985); Kunkel et al. (1987); and Sambrook et al. (1989) 참조. 해당 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침서를 Dayhoff et al.의 모델(1978)에서 발견할 수 있고, 여기에 참고문헌으로 통합되어 있다. 유사한 성질을 가진 다른 것과 한 아미노산을 치환하는 것과 같은 보전된 치환이 바람직하다. 보전된 치환의 실시예는 Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln, Phe⇔Trp⇔Tyr을 포함하지만 한정되지 않는다. 하이브리드 IFN의 변이체를 제조할 때, 바람직한 활성을 가지도록 변경된다. 명백하게, 변형 단백질을 암호화하는 DNA에서 생성된 어떤 변이도 판독 구조 외부로 서열을 위치시키면 안되고 바람직하게 두번째 mRNA 구조를 생성할 수 있는 보완적인 영역 을 생성하지 않을 것이다.Methods for mutations and nucleotide sequence alterations are known in the art. , For example, Walker and Gaastra, eds. (1983); Kunkel (1985); Kunkel et al. (1987); and Sambrook et al. (1989). Guidelines for appropriate amino acid substitutions that do not affect the biological activity of the protein can be found in Dayhoff et al.'S model (1978) and are incorporated herein by reference. Preserved substitutions, such as substituting one amino acid with another with similar properties, are preferred. Examples of conserved substitutions include, but are not limited to, Gly⇔Ala, Val⇔Ile⇔Leu, Asp⇔Glu, Lys⇔Arg, Asn⇔Gln, Phe⇔Trp⇔Tyr. When preparing variants of hybrid IFNs, they are altered to have the desired activity. Obviously, any mutations made in the DNA encoding the modified protein should not position the sequence outside the read structure and preferably would not create a complementary region capable of producing a second mRNA structure.

따라서, 본 발명의 단백질은 그러한 변형과 하이브리드 IFN/IFN-τ 단백질을 포함한다. 이러한 변형은 실질적으로 동일하고 기능적으로 본래 단백질과 동일하다. 적어도 약 80%, 더 바람직하게 적어도 약 90%, 그리고 가장 바람직하게 아미노산 서열과 적어도 약 95%이 본래 단백질의 아미노산 서열과 동일할 때 본래 단백질의 변형은 본래 단백질과 "실질적으로 동일하다". 변형은 1, 2, 3, 또는 4아미노산만큼 다르다. "기능적으로 동등한"은 본래 IFN와 실질적으로 같은 생물학적 활성을 가진 단백질을 생산하는 체인을 정의하는 것으로 의도한다.Thus, the proteins of the present invention include such modifications and hybrid IFN / IFN-τ proteins. These modifications are substantially identical and functionally identical to the original protein. When at least about 80%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% of the amino acid sequence is identical to the amino acid sequence of the original protein, the modification of the original protein is "substantially identical" to the original protein. The modifications differ by 1, 2, 3, or 4 amino acids. "Functionally equivalent" is intended to define a chain that produces a protein with a biological activity substantially the same as the original IFN.

실질적인 서열 변이를 포함하는 기능적으로 동등한 변형은 또한 발명에 포함된다. 따라서,기능적으로 동등한 하이브리드 IFN 단백질의 변형은 치료적으로 유용한 충분한 생물학적 활성을 가진다. "치료적으로 유용한 "은 예를 들어, 허피스 단순 바이러스유형1-유도된 뇌염에 대한 보호와 같은 치료 목적을 달성하려고 의도한다.Functionally equivalent modifications, including substantial sequence variations, are also included in the invention. Thus, modifications of functionally equivalent hybrid IFN proteins have sufficient biological activity that is therapeutically useful. "Therapeutically useful" is intended to achieve therapeutic purposes such as, for example, protection against Herpes simple virus type 1 -induced encephalitis.

기능적 등가를 결정하는 방법이 당업계에서 유용하다. 본 발명과 여기에 참고문헌으로 전체 통합된 U.S. Pat. No. 6,204,022에서 기술된 검정을 포함한, 특정하게 IFN 단백질의 활성을 측정하도록 고안된 검정을 이용하여 생물학적 활성을 측정할 수 있다.Methods of determining functional equivalency are useful in the art. U.S., which is incorporated herein by reference in its entirety. Pat. No. Biological activity can be measured using assays specifically designed to measure the activity of IFN proteins, including the assays described in 6,204,022.

추가적으로, 생물학적으로 활성적 본래단백질에 대해 향상된 항체는, 효과적 결합이 본래 단백질의 입체 구조와 유사한 입체 구조를 가진 단백질의 예시인 기능적으로 동등한 변형에 결합하는 능력에 대해서 시험될 수 있다.In addition, antibodies that are enhanced against biologically active native proteins can be tested for their ability to bind functionally equivalent modifications where effective binding is an example of a protein having a conformation similar to that of the original protein.

II.하이브리드 인터페론하이브리드 단백질 II. Hybrid Interferon Hybrid Protein

IFN-τ에서 유래한 C-말단 위치와 비-τ 인터페론유형I 폴리펩티드에서 유래한 N-말단 위치를 가진 하이브리드 인터페론하이브리드 단백질을 생성하는데 사용되는 가공할 DNA 구조물을 지지하여 본 발명은 IFN-τ의 C-말단영역 에 의해 부여된 감소된 독성에 대한 관찰을 사용한다. 그러한 비-τ 인터페론유형I 폴리펩티드의 실시예는 IFN-β 와 IFN-α의 다양한 동일형태를 포함한다.The present invention supports a DNA construct to be used to generate a hybrid interferon hybrid protein having a C-terminal position derived from IFN-τ and an N-terminal position derived from a non-τ interferon type I polypeptide. Use observations for reduced toxicity conferred by the C-terminal region. Examples of such non-τ interferon type I polypeptides include various isoforms of IFN-β and IFN-α.

도. 10을 참고하여, 가공할 핵산 입자로 암호화되는 또는 본래 화학적 라이게이션으로 생산되는, 그러한 하이브리드 인터페론하이브리드 단백질 또는 폴리펩티드 HVV는 IFN-αD의 아미노산 위치 1로부터 IFN-αD의 아미노산 위치 163까지를 포함하는 N-말단과 아미노산 위치 163 으로부터 IFN-τ의 아미노산 위치 172 을 포함하는 C-말단을 가진다. N-말단 단편은 가공할 핵산 입자의 5' 말단 단편에 의해 암호화되는 비-τ 인터페론폴리펩티드의 N-말단 아미노산 서열과 C-말단 단편을 함유한다. C-말단 단편은 가공할 핵산 입자의 3' 말단 단편에 의해 암호화되는 IFN-τ 폴리펩티드의 C-말단 아미노산 서열을 함유한다.Degree. With reference to 10, such hybrid interferon hybrid proteins or polypeptides HVV, encoded by the nucleic acid particles to be processed or produced in native chemical ligation, comprise N from amino acid position 1 of IFN-αD to amino acid position 163 of IFN-αD. The C-terminus comprising the amino acid position 172 of IFN-τ from the terminal and amino acid position 163. The N-terminal fragment contains the C-terminal fragment and the N-terminal amino acid sequence of the non-τ interferon polypeptide encoded by the 5 'terminal fragment of the nucleic acid particle to be processed. The C-terminal fragment contains the C-terminal amino acid sequence of an IFN-τ polypeptide encoded by the 3 'terminal fragment of the nucleic acid particle to be processed.

서열의 상류가 비-τ 인터페론에 대응하고, 서열의 하류가 IFN-τ 에 대응하는 적정 결합 또는 아미노산 잔기 위치를, 실시예 5에 기술된 항-바이러스 검정과 실시예 6에 기술된 독성 검정과 같은 여기에 기술된 기능적 검정과 조합하여 IFN-τ(163-172)내부 또는 그 이상으로 확장하는 더 길고 짧은영역 에 해당하는 펩티드를 암호화하는 펩티드 또는 DNA 서열을 사용하여 여기서 기술된 방법으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IFN-τ의 인간 IFN-αD 와 10 최종 C-말단 아미노산의 아미노산1-166을 함유하는 하이브리드 또는 가공할 인터페론은 가짐을 의도한다. IFN-τ의 10 최종 C-말단 아미노산은 관련된 생물학적 활성을 가지거나 또는 보통 IFN-α 에 기인하여 인터페론τ와 관련된 낮은 독성을 가진다. 예를 들어, IFN-α/IFN-τ 하이브리드 는 IFN-α의 독성을 감소시키지만 IFN-α 항-바이러스 성질을 방해하지 않거나 증가시키지 않는다.Proper binding or amino acid residue positions upstream of the sequence correspond to non-τ interferon and downstream of the sequence correspond to IFN-τ, including the anti-viral assay described in Example 5 and the toxicity assay described in Example 6. Peptides or DNA sequences encoding peptides corresponding to longer and shorter regions that extend within or beyond IFN-τ (163-172) in combination with the functional assays described herein can be identified by the methods described herein. have. For example, it is intended to have a hybrid or processed interferon containing human IFN-αD of IFN-τ of the present invention and amino acids 1-166 of the 10 final C-terminal amino acids. The 10 final C-terminal amino acids of IFN-τ have an associated biological activity or usually have low toxicity associated with interferon τ due to IFN-α. For example, IFN-α / IFN-τ hybrids reduce the toxicity of IFN-α but do not interfere with or increase IFN-α anti-viral properties.

본 발명의 우선적 실시예는 N-말단 단편의 서열이 인간 IFN-αD으로부터 유래하고 C-말단 단편은 양 IFN-τ으로부터 유래하는 하이브리드 단백질이다. 다른적절한 IFN 서열은 GenBank 또는 다른 대중 서열 기탁소에서 획득한다.A preferred embodiment of the invention is a hybrid protein in which the sequence of the N-terminal fragment is derived from human IFN-αD and the C-terminal fragment is derived from both IFN-τ. Other suitable IFN sequences are obtained from GenBank or other popular sequence depository.

상기 지적한 바와 같이, 본 발명의 하이브리드 인터페론하이브리드 단백질 조성물에 대해 의도된 상당한 잇점은 치료제로 승인된 본래 비-τ 유형I 인터페론과 비하여 조성물의 감소된 독성이다. 하이브리드 조성물은 IFN-τ의 감소된 세포독성을 가진 비-τ 유형I IFN와 같은 생물학적 활성을 갖는다.As noted above, a significant advantage intended for the hybrid interferon hybrid protein compositions of the present invention is the reduced toxicity of the composition compared to the original non-τ type I interferon approved as a therapeutic. Hybrid compositions have the same biological activity as non-τ type I IFN with reduced cytotoxicity of IFN-τ.

III.하이브리드 인터페론 단백질의 생산 III. Production of Hybrid Interferon Proteins

한 양태에서 발명은 비-τ 인터페론/인터페론-τ 하이브리드 단백질을 생산하는 방법을 포함한다.P. pastoris발현 숙주가 적절한 핵산 서열을 함유하는 벡터로 형질전환되었을 때, 많은 양의 비하여 순수하고 기능적으로 활성적 비-τ 인터페론/인터페론-τ 하이브리드 단백질의 생산이 가능하다는 것이 발견되어 왔다. 하기 고려되는 것은 발명을 실행할 때 단계이다.In one aspect the invention includes a method of producing a non-τ interferon / interferon-τ hybrid protein. It has been found that when P. pastoris expression hosts are transformed with a vector containing an appropriate nucleic acid sequence, it is possible to produce large amounts of relatively pure and functionally active non-τ interferon / interferon-τ hybrid proteins. Considered below are the steps in carrying out the invention.

본 발명에 유용한 서열, 방법, 조성물은 Sep. 28, 1999에 발행된 U.S. Pat. Nos. 5,958,402,; Aug. 24, 1999에 발행된 5,942,223; Apr. 14, 1998에 발행된 5,738,845,;Aug. 17, 1999에 발행된 5,939,286 ;March 20, 2001에 발행된 6,204,022,May 25, 1999에 발행된 5,906,816, ; May 9, 2000에 발행된 6,060,450, ; Apr. 16, 2002에 발행된 6,372,206;에서 발견되고 각각은 전체가 여기서 참고문헌으로 통합되어 있다. 본 발명에 유용한 추가적 서열, 방법과 조성물은 현안인 Jul. 19, 2001에 출원된 U.S. 특허 출원 Ser. Nos. 09/910,406,; 와 May 2, 2002에 출원된 10/137,127에서 발견되고 ,각각은 여기에 전체가 참고문헌으로 통합되어 있다.Sequences, methods, and compositions useful in the present invention are described in Sep. U.S., issued 28, 1999. Pat. Nos. 5,958,402; Aug. 5,942,223, issued 24, 1999; Apr. 14, 1998, 5,738,845, Aug. 5,939,286, issued 17, 1999; 6,204,022, May 25, 1999, issued March 20, 2001; 5,906,816, issued March 17, 1999; 6,060,450, issued May May, 2000; Apr. 6,372,206, published on 16, 2002, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. Additional sequences, methods and compositions useful in the present invention are described in the current Jul. U.S. filed 19, 2001. Patent Application Ser. Nos. 09 / 910,406; And 10 / 137,127, filed May 2, 2002, each of which is hereby incorporated by reference in its entirety.

A. P. pastoris 숙주 세포 A. P. pastoris host cell

비-τ 인터페론/인터페론-τ 하이브리드 단백질의 발현에 선택된 숙주는 바람직하게 효모이다. 본 발명의 방법에서 사용되는 효모는Pichia속 내의 종이다. 특별히 관심있는 것은Pichia종P. pastoris이다. 하나의 대표적인P. pastoris균주는 X-33이다.The host selected for the expression of the non-τ interferon / interferon-τ hybrid protein is preferably yeast. Yeast used in the method of the invention is a species in the genus Pichia . Of particular interest is the Pichia species P. pastoris . One representative P. pastoris strain is X-33.

P. pastoris는 알콜 산화 효소를 유도하여 유일한 탄소 원천으로서 메탄올을 대사할 수 있다(Cregg, 1993). 대부분P. pastoris발현 균주는 형질전환 시 적절한 선택가능한 마커 유전자를 함유하는 발현 벡터의 선택을 허용하는 하나 또는 그 이상의 영양 요구성의 돌연변이를 가진다. 형질전환 전에, 이러한 균주는 최소 배지에서 성장하기 위해서 적절한 영양분으로 보충하는 것이 필요한 복합 배지에서 자란다. P. pastoris can induce alcohol oxidase to metabolize methanol as the only carbon source (Cregg, 1993). Most P. pastoris expression strains have one or more trophic mutations that allow the selection of expression vectors containing appropriate selectable marker genes upon transformation. Prior to transformation, these strains are grown in complex media that need to be supplemented with appropriate nutrients in order to grow in minimal media.

본 발명의P. pastoris균주는 야생형(Mut)에서 메탄올 위에서 자라는 균주와 하나 또는 양 AOX 유전자에서 삭제 때문에 메탄올을 이용하는 능력에 대해서 변하는 것들을 포함한다. 외부 단백질의 분해를 감소시키는 데 효과적인 프로테아제-결핍 균주가 계획되었다(Brierley, 1998; and White et al., 1995). P. pastoris strains of the invention include strains that grow on methanol in the wild type and those that vary in their ability to use methanol because of deletions in one or both AOX genes. Protease-deficient strains have been designed that are effective in reducing degradation of foreign proteins (Brierley, 1998; and White et al., 1995).

본 발명을 실시하기 위해서 적절한 효모와 다른 유기체 숙주을 선택하는 것은 당업계의 능숙한 이들 내이다. 발현에 대한 효모 숙주를 선택할 때, 적절한 숙주는 특히, 좋은 분비 능력, 낮은 단백질 분해 활성과 전체 활력을 가진 것들을 포함한다. 효모와 다른 미생물은 일반적으로, Yeast Genetic Stock Center,Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, Calif.); the American type Culture Collection (Manassas, Va.); Northern Regional Research Laboratories (Peoria, Ill.); 와 Invitrogen과 같은 판매상(San Diego, Calif.)을 포함한 다양한 출처로부터 유용하다.It is within the skill of those skilled in the art to select suitable yeasts and other organism hosts to practice the present invention. When selecting a yeast host for expression, suitable hosts include, in particular, those with good secretion capacity, low proteolytic activity and total vitality. Yeast and other microorganisms are generally described in Yeast Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, Calif.); the American type Culture Collection (Manassas, Va.); Northern Regional Research Laboratories (Peoria, Ill.); And from a variety of sources, including vendors such as Invitrogen (San Diego, Calif.).

B.효모 발현 벡터 B. Yeast Expression Vectors

본 발명에서 사용하기 위한 발현 벡터는 발현 카세트로부터 상류와 하류의 동반 서열이 있고 효모에서 작동하기 위해 고안된 가공할 유전자 (또는 발현 카세트)를 포함한다.Expression vectors for use in the present invention include genes to be processed (or expression cassettes) that have a companion sequence upstream and downstream from the expression cassette and are designed for operation in yeast.

동반 서열은 플라스미드 또는 바이러스 기원이고 세균으로부터 바람직한 효모 숙주로 벡터가 DNA를 이동시키도록 하는 필요한 특징을 제공한다.The companion sequence is of plasmid or viral origin and provides the necessary features to allow the vector to transfer DNA from the bacteria to the desired yeast host.

적절한 형질전환 벡터는 하기 기술되어 있다. 전사와 번역 개시자, 신호 서열, 하이브리드 IFN에 대한 암호화서열, 적절한 전사와 번역 터미네이터를 포함한 발현 플라스미드의 적절한 조성물이 하기 기술되어 있다. 하나의 대표적인 구조물은 도. 5A-5C 에 제시된 pPICZα-HVV 플라스미드 서열이다.Suitable transformation vectors are described below. Suitable compositions of expression plasmids, including transcription and translation initiators, signal sequences, coding sequences for hybrid IFNs, and suitable transcription and translation terminators, are described below. One representative structure is shown in FIG. PPICZα-HVV plasmid sequence shown in 5A-5C.

i.전사 & 번역 개시자 i. Transcription & Translation Initiator

본 발명의 뉴클레오티드서열은 효모 프로모터에 작동가능하게 연결되었을 때Nucleotide sequences of the invention when operably linked to a yeast promoter

효모 숙주 세포에서 해당 생물학적으로 활성적으로 성숙한 이종 단백질을 생산하는데 유용하다. 이러한 방식으로, 본 발명의 하이브리드 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드서열이 효모 숙주 세포로 도입하기 위한 발현 카세트에 제공된다. 이러한 발현 카세트는 하이브리드 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산서열에 연결된 전사 시작영역 을 포함한다.It is useful for producing corresponding biologically active mature heterologous proteins in yeast host cells. In this way, nucleotide sequences encoding the hybrid precursor polypeptides of the invention are provided in expression cassettes for introduction into yeast host cells. Such expression cassettes comprise a transcription start region linked to a nucleic acid sequence encoding a hybrid precursor polypeptide.

그러한 발현 카세트에 조절영역 의 전사 조절하에서 뉴클레오티드서열의 삽입에 대한 다수의 제한 부위가 제공된다.Such expression cassettes are provided with a number of restriction sites for insertion of nucleotide sequences under transcriptional control of regulatory regions.

전사 시작영역 , 효모 프로모터는 암호화 서열의 하류(3') 번역을 시작하기 위한 RNA 폴리머라아제에 대한 결합 부위를 제공한다. 프로모터는 구조적 또는 유도가능한 프로모터이고 특이적 효모 숙주에 그대로 또는 유사 또는 외부 또는 이종이다. 추가적으로, 프로모터는 자연적 서열 또는 대안적으로 합성적 서열이다. 외부는 전사 시작영역 이 도입되는 본래 해당 효모에서 전사 시작영역 이 발견되지 않는 것을 말한다.The transcription start region, the yeast promoter, provides a binding site for RNA polymerase to initiate (3 ') translation of the coding sequence downstream. A promoter is a structural or inducible promoter and is intact or similar or external or heterologous to a specific yeast host. In addition, the promoter is a natural sequence or alternatively a synthetic sequence. The external means that no transcription start area is found in the yeast in which the transcription start area is introduced.

적절한 본래 효모 프로모터는 하기 기술된 야생형α-인자 프로모터에 제한되지 않고 다른 효모 프로모터도 포함한다.Suitable native yeast promoters are not limited to the wild type α-factor promoters described below and include other yeast promoters.

바람직하게 프로모터는P. pastoris글리세르알데히드 3-인산 디하이드로제나아제(GAP), 포름알데히드 디하이드로제나아제(FLD1), 퍼옥시좀 기질 단백질 (PEX8), YPT1 프로모터를 암호화하는 GTPase를 포함하는 목록에서 선택된다.Preferably the promoter is a list comprising a GTPase encoding P. pastoris glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAP), formaldehyde dehydrogenase (FLD1), peroxysome substrate protein (PEX8), YPT1 promoter Is selected.

더 바람직하게 프로모터는 알코올 산화효소 AOX1 프로모터이다.More preferably the promoter is an alcohol oxidase AOX1 promoter.

a.AOX1 프로모터 a. AOX1 promoter

Pichia가 두 개의 알코올 산화효소 유전자, AOX1 와AOX2를 암호화해도, AOX1 유전자는 효모 세포에서 대부분의 알코올 산화효소 활성에 책임이 있다. (Tschopp,et al., 1987; Ellis, et al., 1985; and Cregg,et al., 1989). AOX1 유전자의 발현은 AOX1 프로모터에 의한 전사 수준에서 엄격히 조절된다. 메탄올에서 성장한 세포에서, poly(A) RNA의 5%가 AOX1 유래이다; 하지만, 대부분의 다른 탄소 출처에서 성장한 세포에서, AOX1 메시지는 검출가능하지 않다(Cregg,et al., 1988). AOX1 유전자의 조절은 두 개의 기작과 관련되어 있는 것처럼 보인다:S. cerevisiaeGAL1 유전자의 조절과 비슷한 억제/활성화 기작과 유도 기작, Although Pichia encodes two alcohol oxidase genes, AOX1 and AOX2, the AOX1 gene is responsible for most alcohol oxidase activity in yeast cells. (Tschopp, et al ., 1987; Ellis, et al., 1985; and Cregg, et al ., 1989). Expression of the AOX1 gene is tightly regulated at the level of transcription by the AOX1 promoter. In cells grown in methanol, 5% of the poly (A) RNA is derived from AOX1; However, in cells grown from most other carbon sources, AOX1 messages are not detectable (Cregg, et al ., 1988). The regulation of the AOX1 gene appears to be related to two mechanisms: inhibition / activation mechanisms and induction mechanisms, similar to those of the S. cerevisiae GAL1 gene,

GAL1 조절과 다르게, 배지에서 글루코스와 같은 억제하는 탄소 원천이 없으면 AOX1의 실질적인 전사가 되지 않는다. 메탄올이 존재하는 것은 전사의 높은 수준을 유도하는 것이 필수적이다(Tschopp, et al., 1987).Unlike GAL1 regulation, there is no substantial transcription of AOX1 in the absence of inhibitory carbon sources such as glucose in the medium. The presence of methanol is essential to induce high levels of transcription (Tschopp, et al., 1987).

b.GAP 프로모터 b. GAP promoter

노던과 리포터 활성화 결과에 의하면 AOX1 프로모터를 가진 것과 비교가능한 수준의 글루코스에서P. pastoris GAP유전자 프로모터가 강한 구조적발현을 제공한다(Waterham, et al., 1997). 글리세롤과 메탄올-성장한 세포에서GAP프로모터 활성 수준은 각각 글루코스에서 관찰된 수준의 약 3분의 2 또는 3분의 1을 나타낸다. GAP 프로모터를 사용하는 잇점은 균주 성장을 더 직접적으로 만들어서 메탄올이 유도에 필요하지 않고 하나의 탄소 출처로부터 다른 것으로 배양물을 옮기는 것이 필요하다는 것이다. 하지만, 구조적으로 발현되는 GAP 프로모터는 효모에 독성인 단백질을 생성하기 위한 좋은 선택이 아니다.Northern and reporter activation results show that the P. pastoris GAP gene promoter provides strong structural expression at levels of glucose comparable to those with the AOX1 promoter (Waterham, et al., 1997). GAP promoter activity levels in glycerol and methanol-grown cells represent about two-thirds or one-third of the levels observed in glucose, respectively. The advantage of using the GAP promoter is that it makes strain growth more direct so that methanol is not needed for induction and transfer of culture from one carbon source to another. However, structurally expressed GAP promoters are not a good choice for producing proteins that are toxic to yeast.

c.FLD1 프로모터 c. FLD1 promoter

FLD1 유전자는 글루타치온-의존적 포름알데히드 디하이드로제나아제, 질소 출처로서 특정 메틸화된 아민과 탄소 출처로서 메탄올의 대사에 필요한 핵심 효소를 암호화한다.(Shen,et al., 1998). FLD1 프로모터는 유일한 탄소 출처(그리고질소 출처로서 암모늄 설페이트)로서 메탄올과 또는 유일한 질소 출처로서 메틸아민(탄소 출처로서 글루코스)으로 유도될 수 있다. 메탄올 또는 메틸아민으로 유도한 후, AOX1 프로모터로부터 유도된 메탄올로 획득한 것과 유사한 β-락타마제 리포터 유전자의 수준을 PFLD1는 발현할 수 있다. FLD1 프로모터는 메탄올 또는 메틸아민을 사용하여 값싼 비독성 질소 출처의 발현을 높은 수준으로 유도하는 탄력성을 제공한다.The FLD1 gene encodes glutathione-dependent formaldehyde dehydrogenase, a key enzyme required for the metabolism of methanol as a carbon source and certain methylated amines as a nitrogen source (Shen, et al ., 1998). The FLD1 promoter can be derived from methanol as the only carbon source (and ammonium sulfate as the nitrogen source) or methylamine (glucose as the carbon source) as the only nitrogen source. After induction with methanol or methylamine, PFLD1 can express levels of β-lactamase reporter gene similar to that obtained with methanol derived from the AOX1 promoter. The FLD1 promoter provides the resilience to induce high levels of expression of inexpensive non-toxic nitrogen sources using methanol or methylamine.

d.PEX8 와 YPT1 프로모터 d. PEX8 and YPT1 promoter

일부P. pastoris균주에 대해서, 유전자를 매우 높은 수준에서 발현하여 AOX1, GAP, FLD1 프로모터는 매우 강할 수 있다.For some P. pastoris strains, genes are expressed at very high levels so that the AOX1, GAP, FLD1 promoters can be very strong.

특정 외부 유전자에 대해서 ,P_AOX1로부터 발현 수준이 높으면 세포의 후-번역 기작을 압도하고 외부 단백질의 상당 부분이 잘못 접혀지고, 공정되지 않거나, 또는 잘못 위치한다(Thill, et al., 1990; Brierley, 1998)는 증거가 있다.For certain external genes, high expression levels from P _AOX1 overwhelm the post-translational mechanisms of cells and largely erroneously fold, unfair, or misplace a large portion of foreign proteins (Thill, et al., 1990; Brierley , 1998).

이러한 그리고 다른 응용에서, 적당히 프로모터를 발현시키는 것이 바람직하다. 이 말단 쪽으로,P. pastorisPEX8 와 YPT1 프로모터가 사용된다. PEX8 유전자는 퍼옥시좀 생합성에 필수적인 퍼옥시좀 기질 단백질을 암호화한다(Liu, et al., 1995). 이는 글루코스에서 낮지만 중요한 수준에서 발현되고 세포가 메탄올로 이동할 때 적당하게 유도된다. 탄소 출처로서 글루코스, 메탄올, 또는 마니톨을 함유하는 배지에서 YPT1 유전자는 분비에 관련된 GTPase을 암호화하고 이의 프로모터는 발현의 낮지만 구조적 수준을 제공한다(Sears, et al., 1998).In these and other applications, it is desirable to express the promoter as appropriate. To this end, P. pastoris PEX8 and YPT1 promoters are used. The PEX8 gene encodes a peroxysome substrate protein essential for peroxysome biosynthesis (Liu, et al., 1995). It is expressed at low but important levels in glucose and moderately induced when cells migrate to methanol. In media containing glucose, methanol, or mannitol as the carbon source, the YPT1 gene encodes GTPase involved in secretion and its promoter provides a low but structural level of expression (Sears, et al., 1998).

e.대안적 프로모터 e. Alternative promoter

하나의 유도가능한 발현이 되게 하는 효모 프로모터의 상류 활성자 서열과 다른 효모 프로모터의 전사 활성화영역 으로 구성된 합성적 하이브리드 프로모터는 효모 숙주에서 또한 기능적 프로모터로 기능한다.A synthetic hybrid promoter consisting of the upstream activator sequence of the yeast promoter that results in one inducible expression and the transcriptional activation region of the other yeast promoter also functions as a functional promoter in the yeast host.

효모-인지된 프로모터는 또한 효모 RNA 폴리머라아제에 결합하고 암호화서열의 번역을 시작하는 자연적으로 발생하는 비-효모 프로모터를 포함한다.Yeast-recognized promoters also include naturally occurring non-yeast promoters that bind to yeast RNA polymerase and initiate translation of coding sequences.

그러한 프로모터는 당업계에서 유용하다. 예를 들어, 각각은 여기서 참고문헌으로 통합된 Cohen et al. (1980); Mercereau-Puigalon et al. (1980); Panthier et al. (1980); Henikoff et al. (1981); and Hollenberg et al. (1981)을 참조.Such promoters are useful in the art. For example, each is described by Cohen et al. (1980); Mercereau-Puigalon et al. (1980); Panthier et al. (1980); Henikoff et al. (1981); and Hollenberg et al. (1981).

ii.신호 서열과 리더 서열 ii. Signal sequence and leader sequence

해당 단백질을 암호화하는 것에 추가로, 발현 카세트의 가공할 유전자는 적절하게 하이브리드 IFN 단백질의 공정과 전위를 허용하는 신호 펩티드를 암호화한다.In addition to encoding the protein of interest, the gene to be processed in the expression cassette suitably encodes a signal peptide that allows for the processing and translocation of the hybrid IFN protein.

본 발명의 목적대로, 신호 펩티드는 효모 분비된 단백질의 성숙한 형태의 전구체 폴리펩티드에 대한 N-말단 서열인 프레서열이다. 하이브리드 전구체 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드서열이 형질전환된 효모 숙주 세포에서 발현될 때, 신호 펩티드 서열은 해당 성숙한 이종 단백질을 포함한 하이브리드 전구체 폴리펩티드를 소포체(ER)로 이동시키는 기능을 한다. ER 의 루멘으로 이동시키는 것은 효모 숙주 세포의 분비 경로로 초기 단계를 대표한다. 본 발명의 신호 펩티드는 효모 숙주 세포에 이종 또는 본래가 될 수 있다. 본 발명의 신호 펩티드 서열은 신호 펩티드의 기능에 역으로 영향을 주지 않는 상기 기술된 바와 같은 공지된 자연적으로 발생하는 신호 서열 또는 어떠한 변형이다.For the purposes of the present invention, the signal peptide is a preserum which is the N-terminal sequence for the precursor polypeptide of the mature form of the yeast secreted protein. When a nucleotide sequence encoding a hybrid precursor polypeptide is expressed in a transformed yeast host cell, the signal peptide sequence functions to transfer the hybrid precursor polypeptide, including the corresponding heterologous protein, to the endoplasmic reticulum (ER). Migration to the lumen of the ER represents an early stage in the secretory pathway of yeast host cells. Signal peptides of the invention may be heterologous or native to yeast host cells. The signal peptide sequence of the present invention is a known naturally occurring signal sequence or any modification as described above that does not adversely affect the function of the signal peptide.

ER로 들어가는 동안, 신호 펩티드는 공정 부위에서 전구체 폴리펩티드로부터 절단된다. 공정 부위는 효모 단백질 분해 효소에 의해 생체 내 인지된 펩티드서열을 포함한다. 이 공정 부위는 신호 펩티드에 대해서 자연적으로 발생하는 공정 부위이다. 더 바람직하게, 자연적으로 발생하는 공정 부위는 변경되거나 또는 공정 부위는 우선적공정 부위가 되도록 합성적으로 유도된다. "우선적 공정 부위"는 자연적으로 발생하는 부위보다 더 효과적으로 효모 단백질 분해 효소에 의해 생체 내에서 절단되는 공정 부위를 의미한다.During entry into the ER, the signal peptide is cleaved from the precursor polypeptide at the process site. Process sites include peptide sequences recognized in vivo by yeast proteolytic enzymes. This process site is a naturally occurring process site for the signal peptide. More preferably, the naturally occurring process site is altered or the process site is synthetically derived to be a preferential process site. "Preferred process site" means a process site that is cleaved in vivo by yeast proteolytic enzymes more effectively than a naturally occurring site.

우선적 공정 부위의 실시예는 Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Lys, 또는 Arg-Arg, 가장 바람직하게 Lys-Arg인 두 개의 염기성 잔기 Lys 와Arg의 특정한 조합에 한정되지 않고 이중염기성 펩티드를 포함한다.Examples of preferred process sites include, but are not limited to, specific combinations of two basic residues Lys and Arg, Lys-Lys, Lys-Arg, Arg-Lys, or Arg-Arg, most preferably Lys-Arg, and include a bibasic peptide. do.

이러한 부위는P. pastoris의 KEX2 유전자에 의해 암호화되는 엔도펩티다아제에 의해 절단된다(Julius et al. (1983). KEX2 엔도펩티다아제가 해당 성숙한 이종 단백질에 대한 펩티드서열 내의 부위를 절단하는 경우에, 다른 우선적 공정 부위는 해당 펩티드서열이 완전히 남아 있도록 사용될 수 있다(참조, 예를 들어, Sambrook et al. (1989)).These sites are cleaved by endopeptidase, encoded by the KEX2 gene of P. pastoris (Julius et al. (1983). Process sites can be used so that the peptide sequence remains completely (see, eg, Sambrook et al. (1989)).

기능적 신호 펩티드 서열은 효모 세포로부터 이종 단백질의 세포외 분비를 유도하는데 필수적이다. 추가적으로, 하이브리드 전구체 폴리펩티드는 이 분비공정을 더 촉진시키기 위해서 효모 분비된 단백질의 분비리더 펩티드서열을 포함한다. 존재할 때, 리더 펩티드서열은 일반적으로 신호 펩티드 서열 공정 부위의 3'에 인접하여 위치한다. "분비리더 펩티드서열"은 전구체 폴리펩티드의 이동을 지시하는 펩티드이고 본 발명의 목적이 ER로부터 골지체까지 그리고 골지체부터 분비 소낭까지 세포벽영역 및/또는 성장 배지로 세포막을 가로질러 분비하기 위한 분비될 성숙한 이종 단백질을 포함하는 하이브리드 전구체 폴리펩티드이다. 리더 펩티드서열은 효모 숙주 세포와 같거나 또는 이종이다.Functional signal peptide sequences are essential for inducing extracellular secretion of heterologous proteins from yeast cells. Additionally, hybrid precursor polypeptides contain secretory leader peptide sequences of yeast secreted proteins to further facilitate this secretion process. When present, the leader peptide sequence is generally located adjacent 3 'of the signal peptide sequence processing site. A "secretory leader peptide sequence" is a peptide that directs the migration of a precursor polypeptide and the objective of the present invention is to mature the heterologous to be secreted across the cell membrane into the cell wall region and / or growth medium from ER to Golgi and from Golgi to secretory vesicles. Hybrid precursor polypeptides comprising proteins. The leader peptide sequence is the same or heterologous to the yeast host cell.

본 발명의 리더 펩티드서열은 신호 펩티드 서열의 출처로 기능하는 같은 효모 분비된 단백질에 대해 자연적으로 발생하는 서열, 다른 효모 분비된 단백질에 대해 자연적으로 발생하는 서열, 또는 합성적 서열, 또는 리더 펩티드의 기능에 역으로 영향을 미치지 않는 어떠한 변형이다.The leader peptide sequence of the present invention is a sequence of naturally occurring sequences for the same yeast secreted protein that functions as a source of signal peptide sequences, naturally occurring sequences for other yeast secreted proteins, or synthetic sequences, or leader peptides. Any variation that does not adversely affect function.

a. S. cerevisiae α-인자 프레프로 펩티드 a. S. cerevisiae α-factor prepropeptide

본 발명의 목적에 따라, 존재할 때 리더 펩티드서열은 바람직하게 신호 펩티드 서열의 출처로 기능하는 같은 효모 분비된 단백질, 더 바람직하게 α-인자 단백질에서 유도된다. 전구체 α-인자 단백질을 암호화하는 많은 유전자가 클론되었고 이들의 조합된 신호-리더 펩티드서열이 확인되었다. 예를 들어, Singh et al. (1983)참조. α-인자 신호-리더 펩티드서열이 효모에서 이종 단백질을 발현시키는데 사용되었다. 예를 들어, Elliott et al. (1983); Bitter et al. (1984); 와Smith et al. (1985). 참조.For the purposes of the present invention, the leader peptide sequence, when present, is derived from the same yeast secreted protein, more preferably α-factor protein, which preferably serves as the source of the signal peptide sequence. Many genes encoding precursor α-factor proteins have been cloned and their combined signal-leader peptide sequences identified. For example, Singh et al. (1983). α-Factor signal-leader peptide sequences were used to express heterologous proteins in yeast. For example, Elliott et al. (1983); Bitter et al. (1984); And Smith et al. (1985). Reference.

길이가 약 11 잔기인 α-인자, 올리고펩티드 교미 페로몬이 길이가 약 100와 200 잔기 사이, 더 전형적으로 약 120-160 잔기인 큰 전구체 폴리펩티드로부터 생성된다. 이 전구체 (프레) 폴리펩티드는 약 19-23 (더 전형적으로 20-22 잔기), 약 60-66 잔기인 리더 서열 (프로), 그리고 전형적으로 성숙한 페로몬 서열의 2-6 텐덤 리피트인 신호 서열을 포함한다. 신호 펩티드 서열과 전-길이 α-인자 리더 펩티드서열이 사용될 수 있어도, 본 발명은 양 요소가 하이브리드 전구체 입자에 존재할 때 신호 펩티드와 사용될 수 있는 절단된 α-인자 리더 펩티드서열을 의도한다.Α-Factors, oligopeptide mating pheromones, about 11 residues in length are generated from large precursor polypeptides that are between about 100 and 200 residues in length, more typically about 120-160 residues. This precursor (pre) polypeptide comprises about 19-23 (more typically 20-22 residues), a leader sequence (pro) that is about 60-66 residues, and a signal sequence that is typically 2-6 tandem repeats of a mature pheromone sequence. do. Although signal peptide sequences and full-length α-factor leader peptide sequences can be used, the present invention contemplates truncated α-factor leader peptide sequences that can be used with signal peptides when both elements are present in the hybrid precursor particles.

이 신호 서열의 공정은 세 단계와 관련되어 있다. 첫번째는 소포체에서 신호 펩티다아제로 pre 신호를 제거하는 것이다. 두번째, Kex2 엔도펩티다아제는 pro 리더 서열의 Arg-Lys 사이를 절단한다. 그다음, 존재하면 Ste13 단백질에 의한 빠르게 Glu-Ala 반복의 절단이 후속한다(Brake, et al, 1984).The process of this signal sequence involves three steps. The first is to remove the pre signal with signal peptidase from the endoplasmic reticulum. Second, Kex2 endopeptidase cleaves between Arg-Lys of the pro leader sequence. Then, if present, rapid cleavage of Glu-Ala repeats by Ste13 protein (Brake, et al, 1984).

본 발명의 하이브리드 전구체 폴리펩티드 서열이 α-인자 리더 서열과 같은 리더 펩티드서열을 포함할 때, 리더 펩티드서열의 3' 말단에 매우 인접한 공정 부위가 있다. 이 공정 부위로 효모 숙주 세포에 본래적인 단백질 분해 효소가 성숙한 해당 이종 단백질의 본래 N-말단 pro펩티드서열의 5' 말단으로부터 또는 성숙한 이종 하이브리드 IFN에 대한 펩티드서열의 5' 말단으로부터 분비 리더 펩티드서열을 절단하게 한다. 공정 부위는 효모 단백질 분해 효소에 의해 생체 내 인식되어 해당 성숙한 이종 단백질이 정확하게 공정되도록 하는 펩티드서열을 포함한다.When the hybrid precursor polypeptide sequence of the present invention comprises a leader peptide sequence such as an α-factor leader sequence, there is a process site very close to the 3 ′ end of the leader peptide sequence. This process site produces a secretory leader peptide sequence from the 5 'end of the native N-terminal propeptide sequence of the corresponding heterologous protein mature to the yeast host cell or from the 5' end of the peptide sequence for mature heterologous hybrid IFN. Let the cut The process site contains peptide sequences that are recognized in vivo by yeast proteolytic enzymes to ensure that the mature heterologous protein is processed correctly.

이 공정 부위에 대한 펩티드서열은 리더 펩티드서열의 본래 공정 부위에 대한 자연적으로 발생하는 펩티드서열이다. 더 바람직하게, 자연적으로 발생하는 공정 부위는 상기 기술된 것과 같이 우선적 공정 부위가 되도록 변경되거나 또는 공정 부위는 합성적으로 유도된다.The peptide sequence for this process site is a naturally occurring peptide sequence for the original process site of the leader peptide sequence. More preferably, the naturally occurring process site is altered to be the preferred process site as described above or the process site is synthetically derived.

b.대체적 신호 서열 b. Alternative signal sequence

적절한 신호 서열은 또한 식물 렉틴Phaseolus vulgaris어글루티닌 유래의P. pastoris산 포스파타아제 (PHO1)와 PHA-E를 포함한다(Cereghino and Cregg, 2000; and Raemaekers, et al., 1999). 추가로, 당업계에서 유용한 혼성화 프로브 기술을 사용하여 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 신호 서열은 합성적으로 유도되거나 또는 결정된다( Sambrook et al. (1989)참조).Suitable signal sequences also include P. pastoris acid phosphatase (PHO1) and PHA-E from plant lectin Phaseolus vulgaris agglutinin (Cereghino and Cregg, 2000; and Raemaekers, et al., 1999). In addition, signal sequences from the genome or cDNA library are synthetically derived or determined using hybridization probe techniques useful in the art (see Sambrook et al. (1989)).

상기 기술된 바와 같이 본 발명에 따라, 효모 신호 펩티드와 분비리더 펩티드서열은 효모 숙주 세포의 분비경로를 통해서 성숙한 이종 IFNαD에 대한 서열을 지시할 수 있는 본 발명의 하이브리드 전구체 폴리펩티드의 일부를 대표한다.In accordance with the present invention as described above, the yeast signal peptide and secretory leader peptide sequences represent a portion of the hybrid precursor polypeptide of the present invention that can direct the sequence for mature heterologous IFNαD through the secretory pathway of yeast host cells.

iii.하이브리드 IFN 펩티드암호화서열 iii. Hybrid IFN Peptide Coding Sequence

대표적인 하이브리드 IFN 암호화서열은 표2-HVV에 제시되어 있다. 암호화 서열의 기원은 실시예 1에서 검토되고 도 1-4에서 예시되었다.Representative hybrid IFN cryptographic sequences are shown in Table 2-HVV. The origin of the coding sequence was reviewed in Example 1 and illustrated in FIGS. 1-4.

적절할 때, 하이브리드 IFN 펩티드을 암호화하는 뉴클레오티드서열과 해당 추가적 뉴클레오티드서열은 형질전환된 효모에서 증가된 발현에 대해 최적화된다. 즉, 이러한 뉴클레오티드 서열은 향상된 발현에 대한 효모-우선적 코돈을 사용하여 합성될 수 있다. 해당 효모-우선적 뉴클레오티드서열을 합성하기 위한 방법은 당업계에서 유용하다. (참조, 예를 들어, 전체가 참고문헌으로 통합된 U.S.Pat. Nos. 5,219,759 와 5,602,034 ).When appropriate, nucleotide sequences encoding hybrid IFN peptides and corresponding additional nucleotide sequences are optimized for increased expression in transformed yeast. That is, such nucleotide sequences can be synthesized using yeast-first codons for enhanced expression. Methods for synthesizing the corresponding yeast-priority nucleotide sequences are useful in the art. (See, eg, U.S. Pat. Nos. 5,219,759 and 5,602,034, incorporated by reference in their entirety).

추가적 서열 변경은 효모 숙주에서 뉴클레오티드 암호화서열의 발현을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 이는 가짜의 폴리아데닐화 신호를 암호화는 서열, 엑손-인트론 스플라이스 부위 신호, 트랜스포존 유사 반복과 유전자 발현에 해로운 다른 잘 특성화된 서열을 제거하는 것을 포함한다. 서열의 G-C 양은 숙주 세포에서 발현된 알려진 유전자를 참고하여 계산된 바와 같이 주어진 세포 숙주에 대한 수준 평균으로 조정된다. 가능하면, 뉴클레오티드 암호화서열은 예측된 헤어핀 두번째 mRNA 구조를 회피하기 위해서 변경된다.Further sequence alterations are known to enhance the expression of nucleotide coding sequences in yeast hosts. This includes removing sequences encoding mock polyadenylation signals, exon-intron splice site signals, transposon-like repeats and other well characterized sequences that are detrimental to gene expression. The G-C amount of the sequence is adjusted to the level average for a given cell host as calculated by reference to known genes expressed in the host cell. If possible, the nucleotide coding sequence is altered to avoid predicted hairpin second mRNA structure.

iv.전사와 번역 터미네이터 iv. Warrior and Translation Terminator

발현 카세트의 종결 조절영역 은 효모 숙주에 의하여 인지된다는 것을 제공하여 전사 시작영역 과 함께 본래이거나 또는 다른 출처로부터 유도된다. 종결영역 은 상기 언급된 효소의 종결영역 과 같은 본래 α-인자 전사 종결 서열, 또는 다른효모-인지된 종결 서열의 종결영역 이다. 전사 종결영역 은 특정하게 mRNA의 안정성에 대해서 발현을 향상시키도록 선택된다.The termination regulatory region of the expression cassette is provided by the yeast host so that it is derived from an original or other source along with the transcription start region. The terminating region is the terminating region of the original α-factor transcription termination sequence, such as the terminating region of the enzyme mentioned above, or other yeast-recognized termination sequence. Transcription termination regions are specifically selected to enhance expression with respect to the stability of the mRNA.

바람직하게 전사 터미네이터는 Mat-α (α-인자) 전사 터미네이터이다. 더 바람직하게 전사 종결 서열은 도.1에 제시된 것과 같은 AOX1 전사 종결영역 이다.Preferably the transcription terminator is a Mat-α (α-factor) transcription terminator. More preferably the transcription termination sequence is an AOX1 transcription termination region as shown in FIG. 1.

v.선택가능한 마커 v. Selectable Marker

선택가능한 마커는P. pastoris또는 S. cerevisiae, 유래의 생합성 경로 유전자 HIS4, S. cerevisiae 유래의 ARG4, 블레오마이신-관련된 약물 제오신에 저항성을 주는Streptoalloteichus hindustanus유래의 Sh ble 유전자 (Cregg et al.,1985; Cregg and Madden, 1989; and Higgins, et al., 1998)를 포함한다. 더 최근에 개발된 생합성 마커 세트는P. pastorisADE1 (PR-,아미도이미다졸숙시노카복사마이드 합성효소), ARG4 (아르기노숙시네이트 라이아제), URA3 (또는 오로티딘 5'-포스페이트 디카복시라아제) 유전자를 포함한다.Selectable markers include the biosynthetic pathway gene HIS4 from P. pastoris or S. cerevisiae, ARG4 from S. cerevisiae, the Sh ble gene from Streptoalloteichus hindustanus , which resists bleomycin-associated drug zeocin (Cregg et al., 1985; Cregg and Madden, 1989; and Higgins, et al., 1998). More recently developed biosynthetic marker sets include P. pastoris ADE1 (PR-, amidoimidazolesuccinocarboxamide synthase), ARG4 (arginosuccinate lyase), URA3 (or orotidine 5'-phosphate Dicarboxylase) gene.

vi.형질전환 벡터의 제조 vi. Preparation of Transformation Vector

이종 하이브리드 IFN 단백질의 경우처럼, 하이브리드 전구체 폴리펩티드에 존재하는 각 다른요소는 여기에 기술된 것과 같은 요소의 기능에 역으로 영향을 미치지 않는 변형을 포함하여 알려진 자연적으로 발생하는 폴리펩티드 서열일 수 있거나 또는 합성적으로 유도될 수 있다. "역으로 영향을 미치는"은 요소의 변형 형태를 포함시키면 요소의 본래 형태를 포함한 하이브리드 전구체 폴리펩티드에 상대적인 해당 분비된 성숙한 이종 단백질의 생물활성이 감소하는 것을 의도한다.As in the case of heterologous hybrid IFN proteins, each other element present in the hybrid precursor polypeptide may be a known naturally occurring polypeptide sequence, including modifications that do not adversely affect the function of the element as described herein or synthesized. May be induced. "Inversely affecting" is intended to include the modified form of the urea, which reduces the bioactivity of the corresponding secreted mature heterologous protein relative to the hybrid precursor polypeptide containing the urea's original form.

발현 카세트를 제조할 때, 다양한 뉴클레오티드서열 단편은 적절한 배향의 서열을 제공하기 위해서 그리고 적절한 판독 구조로 조작된다. 이 말단 쪽으로, 어뎁터 또는 링커가 사용된다. 뉴클레오티드단편을 연결하기 위해서 또는 편리한 제한 부위를 제공하고, 과잉의 핵산을 제거, 제한 부위를 제거하기 위해서 다른 조작이 관련된다. 이 목적을 위해서, 시험관 내 돌연변이, 프라이머 복구, 제한, 아닐링, 재치환, 즉, 변이와 전환이 관련된다. 특정하게 Sambrook et al. (1989)참조.When preparing an expression cassette, various nucleotide sequence fragments are manipulated to provide sequences of the proper orientation and with the appropriate read structure. To this end, an adapter or linker is used. Other manipulations are involved to link nucleotide fragments or to provide convenient restriction sites, to remove excess nucleic acid, and to remove restriction sites. For this purpose, in vitro mutations, primer repair, restriction, annealing, resubstitution, ie mutations and conversions are involved. Specifically Sambrook et al. (1989).

본 발명의 발현 카세트는 생체 내 자가 DNA 복제할 수 있는 발현 벡터를 형성하여 레플리콘(즉, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 최소-염색체)으로 연결될 수 있다. 바람직하게 레플리콘은 플라스미드이다. 그러한 플라스미드 발현 벡터는, 원핵 숙주 내에서 클로닝 목적으로 그리고 효모 숙주 세포 내에서 발현목적으로 통합하도록 하는 하나 또는 그 이상의 복제시스템 바람직하게 두 개의 복제 시스템에서 유지된다.Expression cassettes of the invention can be linked to replicons (ie, plasmids, cosmids, viruses, minimal chromosomes) by forming expression vectors capable of autologous DNA replication in vivo. Preferably the replicon is a plasmid. Such plasmid expression vectors are maintained in one or more replication systems, preferably two replication systems, which allow integration for cloning purposes in prokaryotic hosts and for expression in yeast host cells.

추가적으로, 플라스미드 발현 벡터는 복사본 수가 많거나 작은 플라스미드로서 통합된다. 발현 카세트의 다수의 통합된 복사본을 함유하는 균주는 때로 단일 복사본 균주보다 이종 단백질을 더 생성할 수 있다(Clare, et al., 1991).In addition, plasmid expression vectors are incorporated as plasmids with high or low copy numbers. Strains containing multiple integrated copies of an expression cassette can sometimes produce more heterologous proteins than single copy strains (Clare, et al., 1991).

B.효모 세포의 형질전환 B. Transformation of Yeast Cells

효모 세포는 리튬 클로라이드와 폴리에틸렌 글리콜과 연관된 것들과 같은 일렉트로포레이션, 미세입자 주사, 세포벽불완전제거균 생성 방법, 또는 전체세포 방법을 포함한 다양한 표준 기술을 사용하여 상기 기술된 발현 구조물로 형질전환된다. (Cregg et al., 1985; Liu et al., 1992; Waterham et al., 1996; and Cregg and Russell, 1998).Yeast cells are transformed with the expression constructs described above using a variety of standard techniques, including electroporation, microparticle injection, cell wall incomplete bacteria production methods, or whole cell methods, such as those associated with lithium chloride and polyethylene glycol. (Cregg et al., 1985; Liu et al., 1992; Waterham et al., 1996; and Cregg and Russell, 1998).

C.분비된 하이브리드 IFN 단백질의 배양 및 획득 C. Cultivation and Acquisition of Secreted Hybrid IFN Proteins

형질전환체는 적절한 영양분 배지에서 자라고 내생적인 DNA 보유를 확실히 하기 위해서 적절한 곳에서, 선택적 압력하에서 유지된다. 발현이 유도되는 곳에서, 고밀도의 세포를 생성하기 위해서 효모 숙주의 성장이 허용되고 발현이 유도된다. 대표적인 하이브리드 IFN 단백질, HVV의 재조합체 생성이 실시예 2에 기술되어 있다. HVV의 부분 정제가 실시예 3에 기술되어 있다.The transformants are grown in appropriate nutrient medium and maintained under selective pressure where appropriate to ensure endogenous DNA retention. Where expression is induced, growth of the yeast host is allowed and expression is induced to produce high density cells. Recombinant production of a representative hybrid IFN protein, HVV, is described in Example 2. Partial purification of HVV is described in Example 3.

본 발명의 중요한 양태에 따라, 형질전환된P. pastoris는 실시예 4에 개시된 바와 같이 약 2.75×10⁸U/mg 내지 약 3×10⁸U/mg의 특이적 활성을 가진 하이브리드 IFN 단백질을 발현하고 분비할 수 있음이 발견되었다.According to an important aspect of the present invention, transformed P. pastoris expresses a hybrid IFN protein with specific activity of about 2.75 × 10 ⁸ U / mg to about 3 × 10 ⁸ U / mg as disclosed in Example 4. Has been found to secrete.

당업계에서 능숙한 이들에게 알려진 항-바이러스 검정으로 특이적 활성을 결정할 수 있다. 대표적인 항-바이러스 검정이 실시예 5에 기술되어 있다. 다른항-바이러스 검정은 전체가 참고문헌으로 통합된 Pontzer and Johnson, 1985에 기술되어 있다.Specific activities can be determined by anti-viral assays known to those skilled in the art. Representative anti-viral assays are described in Example 5. Other anti-viral assays are described in Pontzer and Johnson, 1985, which is incorporated by reference in its entirety.

D.분비된 인간 IFNαD의 분리 D. Isolation of Secreted Human IFNαD

Pichiapastoris에서 분비된 단백질로서 rHuIFNαD을 발현하는 주된 잇점중 하나는 Pichia 가 배양 배지에서 오염시키는 본래단백질의 낮은 수준을 분비하는 것이다. 단백질의 양이 적은 최소 Pichia 성장 배지를 사용하는 것과 조합하여 이로 인해 배지에서 대부분의 전체 단백질을 구성하는 생물학적으로 활성적 rHuIFNαD 가 효과적으로 분비되도록 한다.One of the major benefits of expressing rHuIFNαD as a protein secreted from Pichia pastoris is the secretion of low levels of native protein that Pichia contaminates in the culture medium. Combined with using minimal Pichia growth medium with a low amount of protein, this allows for effective secretion of the biologically active rHuIFNαD, which constitutes most of the total protein in the medium.

본질적으로, 이 분비된 발현 시스템의 성질로 단백질을 정제 공정에서 첫번째 단계로 기능하는 배지로 분비할 수 있다. 이로 인해 분자 체, 이온-교환 크로마토그래피, 전기영동 , 투석, 용매-용매 추출, 유사 방법과 같은 기술을 사용하여 더 정제하기 위해서 직접적이고 단순한 공정이 된다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있고 예를 들어 Deutscher, 1990 and Scopes, 1982 에 기술되어 있다.In essence, the nature of this secreted expression system allows the secretion of proteins into the medium which serves as the first step in the purification process. This is a straightforward and simple process for further purification using techniques such as molecular sieves, ion-exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, solvent-solvent extraction, and similar methods. Such methods are known in the art and are described, for example, in Deutscher, 1990 and Scopes, 1982.

실시예 3에 기술된 바와 같이, 분자 체 크로마토그래피를 1회전하면 실질적으로 고분자량 오염단백질을 제거하고 높은 항-바이러스 활성을 가진 순수한 하이브리드 IFN(도. 8) 를 남긴다.As described in Example 3, one round of molecular sieve chromatography substantially removes high molecular weight contaminant proteins and leaves pure hybrid IFN (FIG. 8) with high anti-viral activity.

IV.응용 IV. Applications

본 발명의 하이브리드 IFN 단백질은 다른 인터페론은 전에 제시된 활성을 갖는 것을 포함하여 다양한 암과 바이러스 질병을 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 전체가 참고문헌으로 통합된 U.S. Pat. Nos. 4,885,166, 4,975,276, 와 5,939,286, 참조. 본 발명에서 치료하려고 계획하는 하나의 대표적인 바이러스 병은 간염C 바이러스(HCV)이다.The hybrid IFN proteins of the present invention are useful for treating a variety of cancer and viral diseases, including those where other interferons have the previously suggested activity. For example, U.S., which is incorporated by reference in its entirety. Pat. Nos. 4,885,166, 4,975,276, and 5,939,286, see. One representative viral disease that is planned to be treated in the present invention is hepatitis C virus (HCV).

HCV는 전세계적으로 추산된 1억 7천만 인구와 일부 국가에서 약 인구의 10% 이상에 영향을 주는 주된 공중 보건 문제이다(Lechner, et al., 2000). HCV 는 감염된 혈액과 혈액 산물의 수혈로 일차적으로 전염된다(Cuthbert, et al., 1994; Mansell, et al., 1995). The Centers for 질병 Control and Prevention에 의하면 HCV 가 매년 미국에서 급성 간염의 160,000 새로운 건에 책임이 있는 것으로 예측한다. 따라서, 효과적인 항-HCV제가 긴급하게 의료적으로 필요하다.HCV is a major public health problem that affects an estimated 170 million people worldwide and in some countries more than 10% of the population (Lechner, et al., 2000). HCV is primarily transmitted by transfusion of infected blood and blood products (Cuthbert, et al., 1994; Mansell, et al., 1995). The Centers for Disease Control and Prevention estimates that HCV is responsible for 160,000 new cases of acute hepatitis in the United States each year. Thus, effective anti-HCV agents are urgently needed medically.

HCV는 길이가 약 만 뉴클레오티드인 Flaviviridae 집단의 양성-가닥, 지질-뚜껑이 있는 RNA 바이러스이다(Choo, et al., 1989). 간염B 바이러스와 다르게 HCV는 DNA 중간체가 없고 따라서 숙주 게놈으로 통합될 수 없다. (Berenguer, et al., 1996). HCV는 클론되었지만, 바이러스는 시험관 내에서 배양하기 힘들다 (Trepo, 2000). 이 지속성의 기작은 알려져 있지 않지만 HCV 는 매우 지속적이어서, 감염된 개인의 85%에서 임상적 감염이 나타난다. (Trepo, 2000).HCV is a positive-stranded, lipid-lid RNA virus of the Flaviviridae population, about 10,000 nucleotides in length (Choo, et al., 1989). Unlike hepatitis B virus, HCV lacks DNA intermediates and therefore cannot be integrated into the host genome. (Berenguer, et al., 1996). HCV has been cloned, but viruses are difficult to culture in vitro (Trepo, 2000). The mechanism of this persistence is unknown but HCV is very persistent, with clinical infection occurring in 85% of infected individuals. (Trepo, 2000).

HCV의 치료는 염증과 간 세포 손상을 감소시키는 목적이 있어서 경화증과 간세포 암종을 방지한다(Horiike, et al., 1998; Benvegnu, et al., 1998). HCV 에 현재 유용한 치료는 작은 소집단의 감염된 환자에게만 유용하다(Magrin, et al., 1994; Choo, et al., 1991; Choo, et al., 1989). IFN-α는 1991 년 미국과 1992년 일본에서 임상적 간염C 의 치료로 도입되었다(Saito, et al., 2000). 하지만, 상기 기술된 바와 같이, 임상적 효율성을 나타낼 만큼 충분한 양(즉, 약 1×10⁶유닛/치료 와 그 이상의 양)으로 IFN-α을 사용하는 것은 대개 많은 심한 부작용과 관련되어 있다.Treatment of HCV prevents sclerosis and hepatocellular carcinoma, with the aim of reducing inflammation and liver cell damage (Horiike, et al., 1998; Benvegnu, et al., 1998). Currently available treatments for HCV are only available to small, subgroup of infected patients (Magrin, et al., 1994; Choo, et al., 1991; Choo, et al., 1989). IFN-α was introduced as a treatment for clinical hepatitis C in 1991 in the United States and Japan in 1992 (Saito, et al., 2000). However, as described above, the use of IFN-α in an amount sufficient to demonstrate clinical efficiency (ie, about 1 × 10 ⁶ units / treatment and above) is usually associated with many serious side effects.

본 발명의 하이브리드 단백질의 세포독성이 낮기 때문에 HCV와 같은 병의 매력적 지원자가 될 수 있다.Because of the low cytotoxicity of the hybrid proteins of the invention, they can be attractive candidates for diseases such as HCV.

V.약학적 조성물 V. Pharmaceutical Compositions

약학적으로 유용한 조성물을 제조하기 위해서 본 발명의 하이브리드 인터페론 하이브리드 단백질은 알려진 방법에 따라 제제될 수 있다. 인터페론 또는 인터페론 유사 화합물을 포함하는 제제를 앞서 기술하였다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 조성물의 효과적 투여를 용이하게하기 위해서, 하이브리드 인터페론의 효과적인 양을 적절한 담체와 혼합되도록 조제된다.Hybrid interferon hybrid proteins of the invention can be formulated according to known methods to prepare pharmaceutically useful compositions. Formulations comprising interferon or interferon-like compounds have been described above. In general, the compositions of the present invention are formulated to mix an effective amount of hybrid interferon with a suitable carrier to facilitate effective administration of the composition.

이러한 치료에서 사용되는 조성물은 다양한 형태가 될 수 있다. 이에는 예를 들어, 정제, 알약, 가루, 액체 용액 또는 현탁액, 리포좀 , 좌약, 주사 용액, 및 주입 용액과 같은 고체, 반-고체 및 액체 투여 형태가 있다. 바람직한 형태는투여의 의도된 방식과 치료적 응용에 따라 달라진다. 조성물은 또한 당업자에게 알려진 통상적인 약학적으로 수용가능한 담체와 보조약을 바람직하게 포함한다. 바람직하게, 발명의 조성물은 단위 복용량의 형태이고 환자에 하루에 한 번 또는 그 이상으로 투입한다.The compositions used in such treatments can take various forms. These include, for example, solid, semi-solid and liquid dosage forms such as tablets, pills, powders, liquid solutions or suspensions, liposomes, suppositories, injection solutions, and infusion solutions. Preferred forms depend on the intended mode of administration and the therapeutic application. The composition also preferably includes conventional pharmaceutically acceptable carriers and adjuvants known to those skilled in the art. Preferably the composition of the invention is in the form of a unit dose and is administered to the patient once or more times per day.

하이브리드 인터페론 하이브리드 폴리펩티드 또는 관련된 폴리펩티드는 경 구 복용, 흡입, 비강내 스프레이, 복막내, 정맥내, 근육내, 상처내, 또는 피하 주사를 포함한 약학적으로 수용가능한 투여량 형태로 환자에게 투여된다. 구체적으로, 다른 인터페론 화합물에 사용되는 조성물과 방법이 이러한 화합물을 전달하는데 사용될 수 있다.Hybrid interferon hybrid polypeptides or related polypeptides are administered to a patient in a pharmaceutically acceptable dosage form including oral administration, inhalation, intranasal spray, intraperitoneal, intravenous, intramuscular, intravenous, or subcutaneous injection. Specifically, compositions and methods used for other interferon compounds can be used to deliver such compounds.

하지만, 본 발명의 화합물의 한가지 주 잇점은 본 발명의 하이브리드 IFN 단백질의 극도로 낮은 세포독성이다. 이러한 낮은 세포독성 때문에, 다른인터페론(예를 들면, IFN α) 화합물에 일반적으로 이용될 수 있는 것들보다 더 높은 농도로 하이브리드 인터페론 조성물을 투여하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 하이브리드 인터페론 조성물은 약 5×10⁴에서 2×10⁷유닛/day 또는 약 5×10⁷유닛/day 또는 바람직하게, 약 1×10⁸유닛/day, 또는 더 바람직하게, 약 1×10¹⁰유닛/day의 비율로 투여될 수 있음이 의도된다. 또다른 실시예에서, 본 발명의 하이브리드 인터페론 조성물은 약 5×10¹¹유닛/day, 또는 바람직하게 약 5×10¹²유닛/day의 투여량으로 투여된다.However, one major advantage of the compounds of the present invention is the extremely low cytotoxicity of the hybrid IFN proteins of the present invention. Because of this low cytotoxicity, it is possible to administer hybrid interferon compositions at higher concentrations than those generally available for other interferon (eg IFN α) compounds. Thus, the hybrid interferon composition of the present invention may be about 5 × 10 ⁴ to 2 × 10 ⁷ units / day or about 5 × 10 ⁷ units / day or preferably about 1 × 10 ⁸ units / day, or more preferably, about It is intended that it can be administered at a rate of 1 × 10 ¹⁰ units / day. In another embodiment, the hybrid interferon composition of the present invention is administered at a dosage of about 5 × 10 ¹¹ units / day, or preferably about 5 × 10 ¹² units / day.

고투여량은 전신 투여에 선호된다. 물론, 본 발명의 조성물과 방법은 예를들어 리바비린과 같은 다른 치료와 조합하여 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.High doses are preferred for systemic administration. Of course, it should be understood that the compositions and methods of the present invention can be used in combination with other therapies, for example ribavirin.

리바비린 (1-β-D-리보푸라노실-1,2,4-트리아졸-3-카복사마이드)은 바이러스 mRNA 합성을 방해하고 다양한 범위의 RNA 와 DNA 바이러스의 생체 내 그리고 시험관 내 복제를 억제하는 것으로 발견된 퓨린 뉴클레오시드 유사물이다(Fernandez, et al., 1986; Balzarini, et al., 1991). 리바비린은 아미노트랜스퍼라아제 수준을 정상화하는데 효과적인 것으로 제시되었지만, 임상적 간염C 환자에서 혈청 HCV RNA의 작은 활성을 가진다(Di Bisceglie, et al., 1992). 하지만, 리바비린의 유리한 효과는 일시적 일지라도(Clarke, 2000; Koskinas, et al., 1995) 심각한 부작용 때문에, IFN-α과의 조합한 리바비린은 허용되기 어려울 수 있다(Cotler, et al., 2000). 따라서, 본 발명의 하이브리드 IFN 단백질과 조합한 리비비린은 본래 IFN-α과 조합한 리비비린에 바람직하다.Ribavirin (1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide) interferes with viral mRNA synthesis and inhibits in vivo and in vitro replication of a wide range of RNA and DNA viruses Purine nucleoside analogs found to be (Fernandez, et al., 1986; Balzarini, et al., 1991). Ribavirin has been shown to be effective at normalizing aminotransferase levels, but has little activity of serum HCV RNA in patients with clinical hepatitis C (Di Bisceglie, et al., 1992). However, although the beneficial effects of ribavirin may be transient (Clarke, 2000; Koskinas, et al., 1995), due to serious side effects, ribavirin in combination with IFN-α may be difficult to tolerate (Cotler, et al., 2000). Thus, ribavirin in combination with the hybrid IFN protein of the present invention is preferred for ribavirin in combination with IFN-a.

환자의 상태가 일단 개선되면, 필요할 때 유지 투여량이 투여된다. 후속하여, 증상의 기능으로서 투여량 또는 투여 빈도, 또는 두가지 모두 개선된 상태가 유지되는 수준까지 감소한다. 증상이 바람직한 수준까지 경감되면, 치료는 멈춰야 한다. 하지만, 환자 는 병 증상이 재발하면 긴 기간동안 간헐적인 치료가 필요하다.Once the condition of the patient improves, maintenance doses are administered as needed. Subsequently, the dose or frequency of administration, or both, as a function of the symptom is reduced to a level where an improved state is maintained. If symptoms relieve to a desirable level, treatment should stop. However, patients need intermittent treatment for a long period of time when symptoms recur.

다음부터, 발명의 다양한 목적과 특징이 어떻게 충족되는지 볼 수 있다.In the following, it can be seen how various objects and features of the invention are met.

VII.실시예 VII. Example

다음 실시예는 여기에 기술된 발명을 더 예로 들었고 발명의 영역을 제한하지 않는다.The following examples further illustrate the invention described herein and do not limit the scope of the invention.

실시예 1Example 1

HVV 클로닝 전략HVV Cloning Strategy

HVV 입자는 C-말단으로부터 최종 4개의 아미노산이 양 IFN-τ으로부터 10개의 6 C-말단 아미노산으로 대체된 HuIFNαD 입자로 구성된 하이브리드 입자이다. 형성된 아미노산 암호화서열은,Pichia pastoris에서 발현에 최적화된 코돈 사용을 가진 해당하는 DNA 암호화서열을 생성하는데 사용한다. 올리고뉴클레오티드 단편 (길이가 약 150 염기쌍; 도. 1-4)을 G2라 불리는 세균 벡터로 연속적 클로닝하여 DNA 암호화서열을 합성적으로 형성한다(Operon Technologies, Alameda, Calif.).HVV particles are hybrid particles consisting of HuIFNαD particles in which the last 4 amino acids from the C-terminus have been replaced by 10 6 C-terminal amino acids from both IFN-τ. The formed amino acid coding sequence is used to generate the corresponding DNA coding sequence with codon usage optimized for expression in Pichia pastoris . Oligonucleotide fragments (about 150 base pairs in length; FIGS. 1-4) are sequentially cloned into a bacterial vector called G2 to synthesize DNA coding sequences (Operon Technologies, Alameda, Calif.).

벡터로 클로닝하는 것을 단순화하기 위해 특이적 제한 효소 5' 또는 3' 돌출로 디자인한 중복하는 합성적 올리고뉴클레오티드(길이가 40 bp 이하)를 라이게이션하여 4개의 150염기쌍 단편의 각각 (HVV 단편 1-4)을 생성한다.To simplify cloning to the vector, each of the four 150 base pair fragments (HVV fragment 1-) was ligated by overlapping synthetic oligonucleotides (40 bp in length or less) designed with specific restriction enzyme 5 'or 3' overhangs. Create 4).

A.클로닝 단계 #1 A. Cloning Step # 1

절단할 벡터:G2Vector to cut: G2

효소로 절단:Xbal 와 BamHIEnzymatic cleavage: Xbal and BamHI

연결할 단편:단편 1 (도. 1)Fragment to Connect: Fragment 1 (Fig. 1)

새로운 벡터 이름:G2HVV1F1New vector name: G2HVV1F1

B.클로닝 단계 #2 B. Cloning Step # 2

절단할 벡터:G2HVV1F1Vector to cut: G2HVV1F1

효소로 절단:EcorI 와 BamHIEnzymatic cleavage: EcorI and BamHI

연결할 단편:단편 2 (도. 2)Fragment to Connect: Fragment 2 (Fig. 2)

새로운 벡터 이름:G2HVV1F2New vector name: G2HVV1F2

C.클로닝 단계 #3 C. Cloning Step # 3

절단할 벡터:G2HVV1F2Vector to cut: G2HVV1F2

효소로 절단 :Sac I 와 BamHIEnzymatic cleavage: Sac I and BamHI

연결할 단편:단편 3 (도. 3)Fragment to Connect: Fragment 3 (Fig. 3)

새로운 벡터 이름:G2HVV1F3New vector name: G2HVV1F3

D.클로닝 단계 #4 D. Cloning Step # 4

절단할 벡터:G2HVV1F3Vector to cut: G2HVV1F3

효소로 절단:EcorI 와 BamHIEnzymatic cleavage: EcorI and BamHI

연결할 단편 :단편 4 (도. 4)Fragment to Connect: Fragment 4 (Fig. 4)

새로운 벡터 이름: G2HVV1F4New vector name: G2HVV1F4

E.최종 점검 E. Final Inspection

효소로 절단: Sac IIEnzymatic Cleavage: Sac II

플라스미드의 XhoI 와 NotI 부위를 사용하여 HVV 유전자를 G2HVV1F4 벡터로부터 절단하고 pPICZ-α□ 벡터(Invitrogen, San Diego) 에 연결한다. HVV-pPICZ-α 구조물의 서열이 도. 5A-5.에 기술되어 있다.The HVV gene is cleaved from the G2HVV1F4 vector using the XhoI and NotI sites of the plasmid and linked to the pPICZ-α @ vector (Invitrogen, San Diego). The sequence of the HVV-pPICZ-α construct is shown in FIG. It is described in 5A-5.

실시예 2Example 2

P. pastorisP. pastoris 에서 HVV의 재조합체 생성Generation of recombinant HVV

선택된 양성P.pastorisHVV 형질전환체는 BMGY배지안에서 밤새 성장하고, 그때 세포를 BMMY메탄올 포함 배지안에 2의 OD₆₀₀을 사용하여 유도하였다. 배양물에 24 그리고 48시간 후 유도에서 10% 메탄올의 1㎖을 첨가하였다. 배양 72시간후에, 전체 배양 상청액을 수확하고, 여과 멸균하여 Colloidal Coomassie (Novex, San Diego, Calif.)로 염색된 14% Tris-glycine SDS-PAGE로 분석하였다. pPICZα 조절 플라스미드 형질전환체 유래의 상청액은 음성 대조구로 사용했다. 도. 7에 제시된 바와 같이, 결과에 의하면 클론 HVV-16 는 HVV 발현이 가장 강하였다.Selected positive P. pastoris HVV transformants grew overnight in BMGY medium, then cells were induced using OD ₆₀₀ of 2 in BMMY methanol containing medium. To the culture was added 1 ml of 10% methanol in induction after 24 and 48 hours. After 72 hours of culture, the whole culture supernatant was harvested, filtered and sterilized and analyzed by 14% Tris-glycine SDS-PAGE stained with Colloidal Coomassie (Novex, San Diego, Calif.). Supernatants from pPICZα regulatory plasmid transformants were used as negative controls. Degree. As shown in Fig. 7, the results showed that clone HVV-16 had the strongest HVV expression.

실시예 3Example 3

HVV 정제HVV tablet

도. 8은P.pastoris상청액 유래의 HVV단백질의 부분적인 정제를 설명한다. 배양 상청액(20㎖)을 10 밀리미터 Tris,NaCl 150밀리미터와 버퍼 교환하고 HiPrep Sephacryl 26/60 S-100 크기-배제 컬럼에 로딩하기 전에 최종 부피 2 ㎖ (pre-부분)로 농축되었다. 샘플을 주사한 다음 첫번째 120 ㎖ 흐름을 1 ㎖/min에서 수집하고 부분 1으로 지정하였다. 20 ㎖ 각각의 세 개의 부분을 수집하고 부분 2, 3, 와4로 각각 지정하였다. 부분 2, 3 와 4는 1 ㎖로 농축하고 14% SDS-PAGE 젤에서 작동시켰으며 Novex colloidal blue 염색 키트로 염색하였다.Degree. 8 describes a partial purification of HVV protein from P. pastoris supernatant. The culture supernatant (20 mL) was buffer exchanged with 10 mm Tris, NaCl 150 mm and concentrated to a final volume of 2 mL (pre-part) before loading on a HiPrep Sephacryl 26/60 S-100 size-exclusion column. After injection of the sample the first 120 mL flow was collected at 1 mL / min and designated part 1. Three sections of 20 ml each were collected and designated as sections 2, 3, and 4, respectively. Parts 2, 3 and 4 were concentrated to 1 ml and run on 14% SDS-PAGE gels and stained with Novex colloidal blue staining kit.

실시예 4Example 4

HVV 항-바이러스 특이적 활성HVV anti-virus specific activity

실시예 3에 기술된 것과 같이 HVV 단백질을 크기-배제 젤 크로마토그래피를 사용하여 HVV 클론 16(도. 7)P. pastoris재조합체 배양 상청액으로부터 부분적으로 정제하였다. 4개의 다른 정제 실험(샘플IDs: S-0018; S-0019; S-0063; S-0064)유래의 부분 3(도. 8)을 1 ㎖으로 농축하고 각 샘플의 전체 단백질 농도와 항-바이러스 활성을 하기 실시예 5에 기술된 바와 같이 결정하였다. 결과는 하기 표3에제시되었다.HVV proteins were partially purified from HVV clone 16 (Fig. 7) P. pastoris recombinant culture supernatant using size-exclusion gel chromatography as described in Example 3. Concentrate part 3 (FIG. 8) from four different purification experiments (Sample IDs: S-0018; S-0019; S-0063; S-0064) to 1 ml and total protein concentration and anti-viral of each sample. Activity was determined as described in Example 5 below. The results are shown in Table 3 below.

실시예 5Example 5

정량적 항-바이러스 검정Quantitative Anti-Virus Assay

Madin Darby bovine kidney(MDBK)세포를 96-웰 평평한 바닥 플레이트에서 10% fetal 소 serum(FBS) 와 항생제로 보완된 Eagle's MEM을 사용하여 합류점까지 배양한다. 세포가 합쳐지면, 검정 배지는 2%FBS과 항생제로 보충되는 Eagle's MEM이다. 바이러스만(즉 16-24 시간) 밤새 배양한 후 합류 MDBK 세포의 100% CPE를 나타내는 최적 작동 희석을 결정하기 위해서 VSV의 공격 바이러스 제조물을 사전 대수적 일련의 희석에서 시험한다. 96-웰 플레이트에서 200㎕/웰 최종 전제 부피로 희석 당 4개의 복제 웰을 사용하여 VSV 희석은 50㎕/웰 당 10^-1에서 10^-6까지의 범위이다. 100% CPE를 형성하는 바이러스의 희석에 근거하여, TCID50 을 결정한다. 현재, 사용되는 스탁 바이러스는 10^6.5TCID₅₀/㎖을 가지고 있다. 검정에서 사용되고 있는 전염 바이러스 입자의 실제 수는 10^3.5TCID₅₀/웰 이다.Madin Darby bovine kidney (MDBK) cells are incubated in a 96-well flat bottom plate using Eagle's MEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics to the confluence. When the cells are combined, the assay medium is Eagle's MEM supplemented with 2% FBS and antibiotics. Attack virus preparations of VSV are tested in a pre-algebraic series of dilutions to determine the optimal working dilution that represents 100% CPE of confluent MDBK cells after overnight incubation of virus alone (ie 16-24 hours). VSV dilution ranges from 10 ⁻¹ to 10 ⁻⁶ per 50 μl / well using four replicate wells per dilution at 200 μl / well final total volume in 96-well plates. Based on the dilution of the virus forming 100% CPE, TCID 50 is determined. Currently, the stock virus used has 10 ^6.5 TCID ₅₀ / ml. The actual number of infectious virus particles used in the assay is 10 ^3.5 TCID ₅₀ / well.

인터페론을 시험하기 위해서, 성장 배지가 제거되고 세포를 멸균 PBS로 한 번 씻기 전에 MDBK 세포를 합류점까지 키운다. 대조구로서 인터페론 샘플이 있는 배지 또는 인터페론이 없는 배지를 상기 기술된 검정배지를 사용하여 100 ㎕/웰에서 일련의 10배 희석(즉 10^-1에서 10^-10까지)을 사용하여 3반복으로 첨가한다. 그 다음 세포를 18시간동안 37℃에서 배양한다. 재조합체 HuIFNαA(Biosource Intl., Camarillo, CA)를 표준 인터페론 대조구로 사용할 수 있다. 인터페론 배양 단계 후에, 미리 결정된 바이러스희석 ＠ 10^3.5TCID₅₀/웰의 웰 당 100 ㎕을 첨가하기 전에 세포를 PBS로 두 번 씻는다. 바이러스를 인터페론 처리된 시험 웰과 비처리된 웰에 첨가하고 추가적 16-24 시간동안 37℃에서 배양한다. 배지의 100 ㎕을 각 웰에서 제거하고 0.2% neutral red solution (Gibco-BRL) 100 ㎕으로 대체하고 37℃에서 1시간동안 배양한다. 산 알코올 100 ㎕(50% 에탄올, 1% 아세트산)을 첨가하기 전에 모든 배지를 제거하고 세포를 가볍게 PBS로 2번 씻는다. 용해된 염색약의 A₅₅₀을 Bio-Kinetics Reader로 읽는다 (Bio-Tek Instruments, Winooski Vt.). 보호퍼센트는 다음 공식을 사용하여 계산한다:To test the interferon, the growth medium is removed and the MDBK cells are grown to confluence before washing the cells once with sterile PBS. As a control, medium with interferon sample or medium without interferon is added in three iterations using a series of 10-fold dilutions (ie, from 10 ⁻¹ to 10 ⁻¹⁰ ) at 100 μl / well using the assay medium described above. . Cells are then incubated at 37 ° C. for 18 hours. Recombinant HuIFNαA (Biosource Intl., Camarillo, Calif.) Can be used as a standard interferon control. After the interferon incubation step, the cells are washed twice with PBS before adding 100 μl per well of predetermined virus dilution ＠ 10 ^3.5 TCID ₅₀ / well. Virus is added to interferon treated test wells and untreated wells and incubated at 37 ° C. for an additional 16-24 hours. 100 μl of medium is removed from each well and replaced with 100 μl of 0.2% neutral red solution (Gibco-BRL) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Remove all medium and wash cells twice with PBS lightly before adding 100 μl of acid alcohol (50% ethanol, 1% acetic acid). Read A ₅₅₀ of the dissolved dye with Bio-Kinetics Reader (Bio-Tek Instruments, Winooski Vt.). The percentage of protection is calculated using the following formula:

1 항-바이러스 유닛(U)은 50% 보호로 정의된다. 인터페론 적정 농도 (유닛/㎖)를 세포 단일층의 50% 보호를 대표하는 ( 0.1 ㎖ 샘플 당 )희석의 역수로 읽고 인자 10을 곱한다.One anti-viral unit (U) is defined as 50% protection. Interferon titration concentrations (units / ml) are read as the inverse of the dilution (per 0.1 ml sample) representing 50% protection of the cell monolayer and multiply by factor 10.

10-배 희석범위를 사용하여 인터페론의 항-바이러스 유닛/㎖을 결정하면, 본 검정에서 인터페론의 두 배 희석 범위(최대 10 배 희석)에 대해서 이 데이타를 시작 희석을 결정하는데 사용한다. 이는 시험된 인터페론에 대해 더 정확한 항-바이러스 유닛/㎖ 값을 제시한다. 이 열량측정 검정은 Crawford-Miksza (1994)가 출판한 검정을 개조한 것임을 주의한다.Once the 10-fold dilution range is used to determine the anti-viral unit / ml of interferon, this data is used to determine the starting dilution for the double dilution range (up to 10-fold dilution) of interferon in this assay. This gives a more accurate anti-viral unit / ml value for the interferon tested. Note that this calorimetric assay is a modification of the assay published by Crawford-Miksza (1994).

실시예 6Example 6

말초 혈액 단핵 세포에서 IFNα 유사물을 시험하는 시험관 내 독성 검정In Vitro Toxicity Assays Testing IFNα Analogs in Peripheral Blood Mononuclear Cells

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)을 사용하여 HuIFNα, OvIFNτ, IFN 하이브리드 단백질의 시험관 내 독성을 비교하였다. 전체 혈액의 담황갈색 코팅 부분을 PBS로 1:4 희석하고 Nycoprep 1.077에 깐다(Nycomed Pharma, Oslo, Norway). 20 분 동안 20℃에서 600×g 에서 원심분리한 후에, 경계에서 띠를 이루는 PBMC를 피펫을 사용하여 제거한다. 세포를 한번 PBS로 씻고 96-웰 플레이트에서 5×10세포/웰의 농도로 플레이트한다. 플레이팅한 후, 세포를 3반복으로 IFNα, IFNτ, 또는 IFN 하이브리드 단백질 2000 U/㎖ 부터 128,000 U/㎖ 까지로 처리한다. 세포를 12일동안배양한 후에, 세포는 아넥신 V 검정을 사용하여 검정할 준비가 되어 있다(Pharmingen). 이러한 검정은 실험실에서 통상적으로 사용되고 일관되며, 신뢰할만한 정량적 결과를 제시함을 주의한다.Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were used to compare in vitro toxicity of HuIFNα, OvIFNτ, IFN hybrid proteins. The pale yellow coated part of the whole blood is diluted 1: 4 with PBS and placed in Nycoprep 1.077 (Nycomed Pharma, Oslo, Norway). After centrifugation at 600 × g at 20 ° C. for 20 minutes, the banded PBMCs at the boundary are removed using a pipette. Wash cells once with PBS and plate at a concentration of 5 × 10 cells / well in 96-well plates. After plating, cells are treated with IFNα, IFNτ, or IFN hybrid protein 2000 U / mL to 128,000 U / mL in three replicates. After 12 days of culture, the cells are ready to be assayed using the Annexin V assay (Pharmingen). Note that these assays are commonly used and consistent in the laboratory and provide reliable quantitative results.

아넥신 V 검정 :Annexin V Black:

아넥신 V 는 인지질 포스파티딜세린 (PS)에 대한 친화성이 높은 35-36 kD Ca 의존적, 인지질결합 단백질이다. 세포자살 세포에서 원형질막의 내부층부터 바깥층으로 막 PS가 이동한다. 아넥신 V는 노출된 막PS를 가진 세포자멸사의 초기 단계를 경험하는 세포에 결합한다. 따라서, 중요한 염색약인 프로피디움 아이오다이드와 함께 아넥신 V로 염색하면 초기 세포자살 세포를 확인할 수 있다. 이 검정으로 세포자멸사를 이미 겪은 세포와 괴사로 죽은 세포를 구별하지 않는다.Annexin V is a 35-36 kD Ca dependent, phospholipid binding protein with high affinity for phospholipid phosphatidylserine (PS). In apoptotic cells, the membrane PS migrates from the inner layer to the outer layer of the plasma membrane. Annexin V binds to cells undergoing an early stage of apoptosis with exposed membrane PS. Therefore, staining with Annexin V together with propidium iodide, which is an important dye, can identify early apoptotic cells. This assay does not distinguish between cells that have already undergone apoptosis and cells that have died from necrosis.

PBMC를 3 웰에서 수확하고 Pharmingen 검정 안내서로 구체화된 아넥신 V 검정용으로 제조한다. 아넥신 V 검정 키트는 세포염색에 필요한 모든 시약이 갖추어져 있다. Becton dickinson FACScan 와 세포 Quest Software을 사용하여 염색된 세포를 획득하고 분석한다. PBMC 집단 내에 세포자멸사 (아넥신 V 양성, 프로피디움 아이오다이드 음성)와 괴사(아넥신 V와 프로피디움 아이오다이드 이중 양성)의 기초 수준이 있고 이 수준은 각 기증자에 대해 약간 다르다는 것을 인식하는 것이 중요하다. 따라서, 처리되지 않은 집단이 세포자살과 죽은 세포의 기초 수준을 정의하는데 사용된다. 각 샘플에 대한 데이타를 다음 공식을 사용하여 획득된 전체 10,000 세포 유래의 특이적 세포 죽음(아넥신 V+ 또는 프로피디움 아이오다이드 +)의 비율로 제시된다.PBMCs are harvested in 3 wells and prepared for the Annexin V assay specified in the Pharmingen Assay Guide. The Annexin V Assay Kit has all the reagents needed for cell staining. Acquire and analyze stained cells using Becton dickinson FACScan and Cell Quest Software. Recognizing that there is a baseline level of apoptosis (annexin V positive, propidium iodide negative) and necrosis (annexin V and propidium iodide double positive) in the PBMC population and that these levels are slightly different for each donor It is important. Thus, untreated populations are used to define the basal level of apoptosis and dead cells. Data for each sample is presented as the ratio of specific cell death (annexin V + or propidium iodide +) from total 10,000 cells obtained using the following formula.

*주: 프로피디움 아이오다이드 염색에 근거하여 % 특이적 세포 죽음을 계산할 때 아넥신 V 값을 프로피디움 아이오다이드 값으로 대체한다.* Note: Replace Annexin V values with propidium iodide values when calculating% specific cell death based on propidium iodide staining.

실시예 7Example 7

1.5×10⁵항-바이러스 U/㎖에서 rHuIFN□ 또는 roIFN□와 함께 인간 PBMC (5×10⁵/웰 )을 12 일 동안 배양하고 그 다음 아넥신 V-FITC과 프로피디움 아이오다이드로 이중-염색한다. 특이적 세포 죽음의 퍼센트를 다음 공식을 사용하여 계산한다: [(대조군 웰 유래의 % AV+ 또는 PI+ 세포)/(처리된 웰 유래의 % AV+ 또는 PI+ 세포 )×100].Human PBMC (5 × 10 ⁵ / well) was incubated with rHuIFN® or roIFN® for 12 days at 1.5 × 10 ⁵ anti-viral U / mL and then double-stained with annexin V-FITC and propidium iodide do. The percentage of specific cell death is calculated using the following formula: [(% AV + or PI + cells from control wells) / (% AV + or PI + cells from treated wells) × 100].

실시예 8Example 8

흐름 세포측정으로 분석한 특이적 세포 죽음의 비율Rate of specific cell deaths analyzed by flow cytometry

도9 는 흐름 세포측정으로 분석한 특이적 세포 죽음을 제시한다. 인간 PBMC (5×10⁵/웰 )을 9, 10, 12 일 동안 1.5×10⁵항-바이러스 U/㎖에서 rHuIFNα 또는 roIFNτ 로 배양하고 그다음 아넥신 V-FITC 와 프로피디움 아이오다이드로 이중-염색한다. 특이적 세포 죽음의 비율은 다음 공식을 사용하여 계산한다: [(대조군 웰 유래의 % AV+ 또는 PI+ 세포)/(처리된 웰 유래의 % AV+ 또는 PI+ 세포)×100]. 칼럼과 기호는 아넥신 V와 프로피디움 아이오다이드 계산을, 개별적으로 제시한다.9 shows specific cell death analyzed by flow cytometry. Human PBMC (5 × 10 ⁵ / well) was incubated with rHuIFNα or roIFNτ in 1.5 × 10 ⁵ anti-viral U / mL for 9, 10, 12 days and then double-stained with Annexin V-FITC and propidium iodide do. The ratio of specific cell death is calculated using the following formula: [(% AV + or PI + cells from control wells) / (% AV + or PI + cells from treated wells) × 100]. Columns and symbols present Annexin V and propidium iodide calculations separately.

본 명세서에 언급된 모든 출판과 특허 출원은 본 발명이 관련되는 당업계에서 능숙한 이들의 기술 수준을 나타낸다. 각 출판 또는 특허 출원이 특정하게 그리고 개별적으로 참고문헌으로 통합되어 예시되어 있어도 모든 출판과 특허 출원은 여기에서 같은 정도로 참고문헌으로 통합되어 있다.All publications and patent applications mentioned in the specification are indicative of their skill level in the art to which this invention relates. Although each publication or patent application is specifically and individually illustrated by reference, all publications and patent applications are hereby incorporated by reference to the same extent.

발명이 특정 실시예에 대해 기술되어 있어도, 당업계에서 능숙한 이들에게본 발명에서 벗어나지 않고 다양한 변화와 변경을 할 수 있음이 명백하다.Although the invention has been described with respect to particular embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made therein without departing from the invention.

Claims

An interferon / interferon-τ hybrid protein comprising an interferon protein,

The C-terminal region of the interferon protein is substituted with the C-terminal region of interferon-τ,

The hybrid protein is an interferon / interferon-τ hybrid protein, characterized in that it has a reduced cytotoxicity compared to the cytotoxicity of the interferon protein.

The hybrid protein of claim 1, wherein the interferon protein is a type I interferon protein.

3. The hybrid protein of claim 2, wherein said type I interferon protein is interferon-α.

4. The hybrid protein of claim 3, wherein the interferon-α protein is human interferon-α.

5. The hybrid protein of claim 4, wherein the interferon-α is human interferon-αD.

The hybrid protein of claim 1, wherein the interferon protein has about 0-30 amino acids of the substituted C-terminal.

7. The hybrid protein of claim 6, wherein the interferon protein has about 1-10 amino acids at the substituted C-terminus.

8. The hybrid protein of claim 7, wherein the interferon protein has the last four amino acids substituted at the C-terminus.

The hybrid protein of claim 5, wherein the C-terminal region of the human interferon-αD corresponds to a sequence corresponding to residues 163-166.

The hybrid protein of claim 1, wherein the C-terminal region of interferon-τ corresponds to a sequence corresponding to residues 163-172 of interferon-τ.

The method of claim 1 wherein the interferon protein is human interferon-αD and the C-terminal region of the human interferon-αD corresponds to residues 163-166, and the C-terminal region of interferon-τ is a residue of interferon-τ. A hybrid protein characterized by corresponding to the sequence corresponding to 163-172.

The hybrid protein of claim 1, wherein the hybrid protein has reduced cytotoxicity compared to the cytotoxicity of interferon protein.

The hybrid protein of claim 1, wherein the hybrid protein has an antiviral activity of at least about 1 × 10 ⁸ antiviral units / mg in an MDBK / VSV antiviral system.

The hybrid protein of claim 1, wherein the type I interferon is interferon-β.

The hybrid protein of claim 1, wherein the interferon-τ is sheep or bovine interferon-τ.

The hybrid protein of claim 1, wherein the hybrid protein is PEGylated.

A nucleic acid molecule encoding a hybrid protein according to any one of claims 1 to 16.

18. A method of making an interferon hybrid protein comprising placing a nucleic acid molecule according to claim 17 in a recombinant expression system, affecting expression of the nucleic acid molecule to produce a hybrid protein, and recovering the hybrid protein.

19. The method of claim 18, wherein said recombinant expression system comprises P.pastoris .

A pharmaceutical composition comprising the hybrid protein according to claim 1 and a pharmaceutically acceptable carrier.

21. The method of claim 20, wherein the composition further comprises ribavirin.

A method of inhibiting viral replication in a virus infected cell, comprising contacting the cell with the hybrid protein according to claim 1 in an amount effective to inhibit the replication of the virus in the cell.

A method of inhibiting growth of tumor cells, comprising contacting the cells with the hybrid protein according to claim 1 in an amount effective to inhibit the growth of tumor cells.

A method for treating an autoimmune disease in a test body comprising administering to the test body an amount of the hybrid protein according to claim 1 effective to treat the disease.

A method of treating chronic inflammation in a test body comprising administering to the test body an amount of the hybrid protein according to claim 1 effective to treat inflammation.

A method for treating a disease state in response to interferon, comprising administering to a test subject an amount of the hybrid protein according to claim 1 effective to treat the disease state.

27. The method of any one of claims 22 to 26, wherein said administering is performed by a method of administration selected from the group consisting of oral, topical, inhalation, nasal and injection.