KR20040018302A - 흉선 재생의 조작을 통한 이식체 수용능의 개선 - Google Patents

Abstract

본 개시 내용은 기관, 조직 및(또는) 세포의 미스매치된 이식체에 대한 수용자의 허용을 유도하는 방법을 제공한다. 수용자의 흉선을 수용하고 공여자로부터 조혈 간세포를 제공함으로써, 기존의 "외래" 물질이 수용자에게서 "자가"로서 인식되어 거부되지 않는다. 환자의 T 세포 집단을 고갈시킨다. 바람직한 실시양태에서, 조혈 간세포는 CD34⁺이다. 수용자의 흉선은 성 스테로이드에 의해 매개된 흉선으로의 신호전달을 파괴함으로써 재활성화된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 파괴는 LHRH 아고니스트, LHRH 길항제, 항-LHRH 수용체 항체, 항-LHRH 백신 또는 이들의 조합물을 투여함으로써 생겨난다.

Description

흉선 재생의 조작을 통한 이식체 수용능의 개선 {Improvement of Graft Acceptance through Manipulation of Thymic Regeneration}

면역계

면역계의 주요 기능은 "외래 (foreign)" 항원을 "자가 (self)"와 구별하고, 이에 따라 반응함으로써 감염으로부터 신체를 보호하는 것이다. 정상적인 면역 반응에서는, 외래 항원을 포획하고 이를 작은 펩티드 단편으로 가공하여 상기 단편을 항원 표출 세포 (APC) 표면상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자의 개열부 (cleft)에 표출시키는 특정 목적의 항원 표출 세포가 순차적 사건에 관여한다. MHC 분자는 모든 핵형성 세포에서 발현되는 클래스 I (세포독성 T 세포 (Tc)에 의해 인식됨) 또는 면역계의 세포에 의해 주로 발현되는 클래스 II (헬퍼 T 세포 (Th)에 의해 인식됨)일 수 있다. Th 세포는 APC 상의 MHC II/펩티드 복합체를 인식하여 반응하고; 이들 세포에 의해 방출된 인자들은 그 후에 Tc 세포들 모두 또는 특정 항원에 대해 특이적인 항체 생성 B 세포의 활성화를 촉진한다. 사실상 모든면역 반응에 있어서 Th 세포의 중요성은 HIV/AIDS에서 가장 극명하게 예시되는데, 바이러스에 의해 파괴되어 Th 세포가 없으면 심각한 면역 결핍증이 유발되어 결국 사망에 이를 수도 있다. Th의 부적절한 분화 (및 보다 적은 양의 Tc)는 알레르기, 암 및 자가면역성과 같은 다양한 다른 질환을 유발할 수 있다.

항원을 인식하는 능력은 T 및 B 림프구의 원형질막 수용체에 귀속된다. 이들 수용체는 가능한 다수 유전자들의 복잡한 일련의 재배열에 의해 무작위로 생성되어, 각각의 T 또는 B 세포가 독특한 항원 수용체를 가지게 된다. 이와 같은 거대한 잠재적 다양성은, 신체가 접촉할 수 있는 어떤 단일 항원에 대해서도 다수의 림프구가 다양한 결합 강도 (친화도)로 이를 인식하여 다양한 정도로 반응할 것임을 의미한다. 항원 수용체의 특이성은 우연히 발생되기 때문에, 신체가 자가 항원에 대해 반응하는 림프구를 통해 "자폭 (self destruct)"하지 않는지의 이유에 대한 문제가 발생한다. 다행스럽게도, T 및 B 세포가 그렇게 작용하는 것을 방지하는 몇몇 메카니즘이 존재한다 - 집합적으로, 이들은 면역계가 자가에 대해 허용하는 상황을 창출한다.

자가 허용의 가장 효율적인 형태는 잠재적으로 반응하는 임의의 림프구를 그들이 생성되는 부위 (T 세포의 경우 흉선, B 세포의 경우 골수)에서 물리적으로 제거하는 (사멸시키는) 것이다. 이를 중심 허용 (central tolerance)이라고 부른다. 부가적인 중요한 허용 방법은, 자가반응성 세포를 직접적으로 또는 주로 사이토킨을 통해 억제하는 조절성 Th 세포를 통한 것이다. 사실상 모든 면역 반응이 T 헬퍼 세포에 의한 개시 및 조절을 필요로 한다는 점에서, 모든 허용 유도 체계의 주요 목적은 T 헬퍼 세포를 표적으로 할 것이다. 이와 유사하게, Tc 세포는 매우 중요한 이펙터 (effector) 세포이기 때문에, 이들의 생성은 항암 요법 및 항-바이러스 요법 등에 대한 전략의 주요 목적이다.

흉선

흉선은 T 림프구가 생성되는 1차적인 부위이기 때문에, 흉선은 논증의 여지는 있지만 면역계에서 주요 기관이다. 흉선의 작용은 적당한 골수-유도 전구체 세포를 혈액으로부터 유인하여, 항원에 대한 T 세포 수용체 (TCR)의 생성에 필수적인 유전자 재배열을 비롯하여 상기 전구체의 T 세포 계통으로의 위탁을 유도하는 것이다. 이와 관련된 것으로는, 탁월한 정도의 세포 분열을 통해 T 세포의 수를 증대시킴으로써 모든 외래 항원이 인식 및 제거될 가능성을 증가시키는 것이다. 그러나, T 세포에 의한 항원 인식의 독특한 특징은, B 세포와 달리 TCR이 MHC 분자와 물리적으로 결합된 펩티드 단편만을 인식한다는 것이다 (통상적으로 이를 자가 MHC라고 하며, 이 능력은 흉선에서 선별된다). 이 과정은 포지티브 선별 (positive selection)이라 불리우며, 피질 상피 세포의 독점적인 특징이다. TCR이 자가 MHC/펩티드 복합체에 결합하지 못하면, T 세포는 "니글렉트 (neglect)"에 의해 사멸하게 된다 - 이는 지속적인 성숙을 위해 TCR을 통한 어느 정도의 신호전달을 필요로 한다.

흉선은 기능적 면역 반응에 대한 기본으로 하루에 자신의 T 세포 함량 중 약 1％를 혈액으로 방출하지만, 포유동물의 분명한 이형(異形) 중 하나는 이 기관이 성 스테로이드의 생성 결과로 심각한 위축증에 걸린다는 것이다. 이는 어린이에게서도 시작될 수 있지만, 사춘기때부터 심해진다. 정상적인 건강한 개체의 경우, (비록 면역계 장애가 연령에 따라 그 발병율 및 심각성이 증가하기는 하지만) 이러한 생성 손실 및 새로운 T 세포의 방출이 항상 임상적인 중요성을 갖는 것은 아니다. 예를 들어 AIDS에서, 그리고 화학요법 및 방사선요법 이후에, 대부분의 T 세포가 손실되는 경우, 환자는 면역이 억제되어 있기 때문에 질환에 걸릴 가능성이 매우 높다.

그러나, 많은 T 세포는 분화하여, 높은 친화도로 자가 MHC/펩티드 복합체를 우연히 인식할 수 있다. 따라서, 그러한 T 세포는 잠재적으로 자가-반응성이 있으며, 다발성 경화증, 관절염, 당뇨병, 갑상선염 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)와 같은 심각한 자가면역성 질환을 유발할 수 있다. 다행스럽게도, 흉선에서 자가 MHC/펩티드 복합체에 대한 TCR의 친화도가 너무 높으면, 분화중인 흉선세포는 자멸 활성화 (suicidal activation)를 거치도록 유도되어 아팝토시스 (apoptosis)에 의해 사멸하게 되는데, 이를 네가티브 선별 (negative selection)이라 부른다. 이것이 중심 허용이라 불리는 것이다. 그러한 T 세포는 흉선에서 여전히 미성숙 상태이기 때문에 반응하지 않고 사멸된다. 흉선에서 네가티브 선별의 가장 강력한 유도인자는 수상돌기 세포 (DC)라 불리우는 APC이다. APC로서 이들은 가장 강력한 신호를 T 세포에 전달하는데, 흉선에서 이 신호가 없으면 T 세포가 보다 성숙해지는 말초 림프양 기관에서 DC가 활성화된다.

흉선 위축증

흉선은 신경내분비계와의 2방향 통신에 의해 유의한 정도로 영향을 받는다[Kendall, 1988]. 특히 중요한 것은, 영양성 효과 [갑상선 자극 호르몬 (TSH) 및 성장 호르몬 (GH)] 및 위축성 효과 [황체 호르몬 (LH), 여포 자극 호르몬 (FSH) 및 부신피질자극 호르몬 (ACTH)]를 비롯한 흉선 기능 상의 뇌하수체, 부신 및 생식선 사이의 상호작용이다 [Kendall, 1988; Homo-Delarche, 1991]. 흉선의 독특한 생리적 특징 중 하나는 구조 및 기능의 점진적 퇴화이며, 이는 사춘기 부근에 순환중인 성 스테로이드 생성의 증가와 동일한 정도이다 [Hirokawa and Makinodan, 1975; Tosi et al., 1982; Hirokawa, et al., 1994]. 흉선 위축증을 유도하는 호르몬 및 메카니즘의 정확한 표적은 아직 밝혀져 있지 않다. 흉선은 말초 T 세포 집단 (pool)의 생성 및 유지를 위한 1차적인 부위이기 때문에, 흉선 위축증은 노령일수록 면역계 장애의 발병율이 증가하는 주요 원인으로서 널리 인정되어 왔다. 특히, 세포독성 T 세포 활성 및 유사분열 촉진인자 반응과 같은 T 세포 의존성 면역 기능의 감소에 의해 예시되는 면역계 결핍은 일생의 후반기에 면역결핍증, 자가면역성 및 종양의 발병율 증가로 나타난다 [Hirokawa, 1998].

흉선 위축증의 영향은 말초부에서 나타나는데, T 세포 집단으로의 흉선 신호 입력이 감소하면 T 세포 수용체 (TCR) 레파토리의 다양성이 감소한다. 변경된 사이토킨 프로필 [Hobbs et al., 1993; Kurashima et al., 1995], CD4⁺및 CD8⁺서브세트의 변화, 및 고유 (naive) T 세포에 대한 기억 T 세포로의 편향 [Mackall et al., 1995]도 관찰된다. 더욱이 흉선 생성의 효율은, T 세포가 고갈된 후에 정상적인 T 세포 수를 재생하는 면역계의 능력이 결국 손실되도록 연령에 따라 손상된다 [Mackall et al., 1995]. 그러나, 도우엑 등에 의한 최근 연구는 노령의 인간에서도 흉선 신호 출력이 발생할 수 있음을 보여주었다 [Douek et al. (1998)]. TCR-유전자 재배열의 DNA 절단 생성물을 사용하여, 노령의 환자에서 HIV 감염 후에 순환중인, 새로이 생성된 고유 T 세포의 존재를 입증하였다. 이러한 신호 출력 및 그 후 말초 T 세포 집단의 재생 비율은, 화학요법을 치료받은 환자의 경우에 사춘기 전의 환자에 비해 사춘기 후의 환자에서 T 세포 집단 (특히, CD4⁺T 세포)의 재생 비율이 급격하게 감소하였기 때문에 추가로 연구될 필요가 있다 [Mackall et al., 1995]. 이는 팀 및 토만 [Timm and Thoman (1999)]에 의한 최근 연구에서 추가로 예시되는데, 이들은 CD4⁺T 세포가 골수 이식 (BMT) 후 노령의 마우스에서 재생된다 하더라도, 고유 T 세포의 불량한 흉선 생성과 관련된 노령의 말초부 미세환경으로 인해 기억 세포로 편향됨을 입증하였다.

흉선은 본질적으로 분화 중인 흉선세포로 구성되는데, 이 흉선세포는 미세환경을 구성하며 T 세포의 최적 분화에 필수적인 성장 인자 및 세포 상호작용을 제공하는 다양한 간질세포 (주로 상피 세포 서브세트) 내에 산재되어 있다. 흉선의 분화 및 성숙화를 조절하는 상피 세포 서브세트와 흉선 사이의 공생적 발전 관계 [Boyd et al., 1993]는 성 스테로이드 억제가 어느 한 세포형 (이후에 다른 세포형의 상태에 영향을 미칠 수 있음)의 수준에서 발생할 수 있음을 의미한다. 방사선 키메라를 이용한 선행 연구에서 골수 (BM) 간세포가 연령에 의해 영향받지 않으며 [Hirokawa, 1998; Mackall and Gress, 1997] 분화 초기의 BM 세포와 유사한 정도의흉선 재구성 (reconstitution) 능력을 지닌다는 것이 밝혀졌기 때문에, 흉선세포 자체 내에서 고유의 결함이 있을 가능성은 낮다. 더욱이, 노령 동물의 흉선세포는 적어도 어느 정도의 분화능을 보유하고 있다 [Mackall and Gress, 1997; George and Ritter, 1996; Hirokawa et al., 1994]. 그러나, 아스피날에 의한 최근 연구 [Aspinall (1997)]에서는 TCRγ쇄 유전자-재배열 단계에서 나타나는 CD3^-CD4^-CD8^-삼중 네가티브 (TN) 집단 내에서의 결함을 입증하였다.

<발명의 요약>

본 개시 내용은 동일하지 않은 또는 미스매치된 공여자로부터의 이식체에 대한 숙주 T-세포 집단의 반응성을 변화시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 나이든 (사춘기 후) 환자에서의 위축성 흉선이 재활성화된다. 따라서, 재활성화된 흉선은 혈액으로부터 조혈 전구체 세포를 흡수하여 상기 세포를 흉선에서 새로운 T 세포 및 DC로 전환시킬 수 있게 된다. DC는 그 후에 전구체 세포 공여자의 것과 동일한 조직적합성을 갖는 이식편에 대한 T 세포에서의 허용을 유도한다. 이것은 동종이형 이식체의 수용능을 크게 개선시켜 준다.

이 방법은 대상체에서 성 스테로이드에 의해 매개된 흉선으로의 신호전달을 파괴하는 것을 토대로 이루어진다. 한 실시양태에서는 거세를 이용하여 성 스테로이드 매개된 신호전달을 파괴한다. 바람직한 실시양태에서는 화학적 거세가 이용된다. 다른 실시양태에서는 외과술에 의한 거세가 이용된다. 거세는 흉선의 상태를 사춘기 전의 상태로 되돌림으로써 흉선을 재활성화시킨다.

특정 실시양태에서, 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달은 LHRH의 아고니스트 또는 길항제, 항-에스트로겐 항체, 항-안드로겐 항체, 또는 수동적 (항체) 또는 능동적 (항원) 항-LHRH 백신 또는 이들의 조합물 ("차단제")의 투여에 의해 차단된다.

바람직한 실시양태에서, 차단제(들)은 서방형 펩티드 제제로서 투여된다. 서방형 펩티드-방출 제제의 예는 WO 98/08533에서 제공되며, 상기 문헌은 전문이 본원에 참고로 도입된다.

본 발명에서, 공여자로부터의 조혈 또는 림프양 간세포 및(또는) 전구 세포는 수용자에 이식되어, 공여자로부터의 이식체에 대한 허용능을 생성한다. 한 실시양태에서, 이는 흉선의 재활성화 직전, 재활성화 시기 및 재활성화 직후에 발생한다. 다른 실시양태에서, 이는 T 세포 고갈의 초기에 또는 고갈 시기에 발생한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 세포는 CD34⁺전구체 세포이다.

본 개시 내용은 동물에서 세포, 조직 및 기관을 이식하는 분야에 속한다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 흉선의 자극을 통해 이식체, 특히 동종이형 및 이종 항원에 대한 이식체의 허용능을 생성하는 분야에 속한다.

도 1A 및 B: 거세 전후에서 흉선세포수의 변화. 연령에 따라, 흉선 위축으로 인해 흉선세포의 수가 유의하게 감소했다. 거세 2주 후, 세포수는 어린 성숙 마우스 수준으로 증가하였다. 거세 3주 후에는 어린 성숙 마우스 수준에서 유의하게 증가하여 거세 4주 후에는 안정화되었다. *** = 어린 성숙 마우스 (2개월)의 흉선과 유의하게 상이함 (p < 0.001).

도 2A-C: (A) 비장 내 세포수는 연령과 무관하게 일정하게 유지되었고 거세후에도 일정하게 유지되었다. 말초부의 B 세포 : T 세포 비율 역시 일정하게 유지되었지만 (B), CD4 : CD8의 비율은 연령에 따라 유의하게 감소했으며 (p < 0.001), 거세 4주 후에는 정상적인 어린 마우스 수준으로 회복되었다.

도 3: 연령에 따라 및 거세 후에 CD4 대 CD8 흉선세포 집단에 대한 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 프로필. 각 4분면의 백분율(％)은 각 플롯의 상단에 나타냈다. 흉선세포의 아집단은 연령과 무관하게 일정하게 유지되었으며, 거세 후에는 흉선세포의 동시 증대가 뒤따랐다.

도 4: BrdU 펄스의 혼입량으로 검출한 흉선세포의 증식률(％). 흉선세포의 증식률은 연령과 무관하게 일정하게 유지되고, 거세 후에도 일정하게 유지된다.

도 5A-D: 연령 및 거세가 흉선세포 서브세트의 증식에 미치는 영향. (A) 증식하는 집단 전체를 구성하는 각 서브세트의 비율 - 증식하는 집단 내에서 CD8⁺T 세포의 비율은 유의하게 증가하였다. (B) 증식하는 각 아집단의 백분율(％) - TN 및 CD8 서브세트는 2개월 된 마우스에서 보다 2년 된 마우스에서 유의하게 덜 증식하였다. 거세 2주 후, TN 집단의 증식률은 정상적인 어린 마우스 수준으로 회복되었지만, CD8 집단의 증식률은 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 거세 4주 후에는 상기 수준이 정상적인 어린 마우스 수준과 동등하였다. (C) 전반적인 TN 증식률은 연령과 무관하게 일정하게 유지되고, 거세 후에도 일정하게 유지된다. 그러나, (D) 연령에 따른 TN1 아집단 증식률의 유의한 감소는 거세 4주 후에도 정상적인 수준으로 회복되지 않았다. *** = 매우 유의함 (p < 0. 001) ** = 유의함 (p <0.01).

도 6: 마우스에게 FITC를 흉선내 주사하였다. 24시간 후에 말초부 내 FITC⁺세포의 수를 계산하였다. RTE (recent thymic migrants) 비율은 연령에 따라 흉선 세포수의 약 1％로 꾸준하게 유지되었으나, 거세 2주 후에는 유의하게 감소하여 연령에 따라 RTE 세포수가 유의하게 (p < 0.01) 감소했다. 거세 후, 이들 수치는 증가하였지만, 거세 후 제2주에도 어린 마우스 보다는 훨씬 유의하게 낮았다. 연령에 따라 CD4⁺RTE : CD8⁺RTE의 비율은 유의하게 증가하는 것으로 나타났고, 이는 거세 1주 후에 정상화되었다.

도 7A-C: 화학요법제인 시클로포스프아미드 처치 후, 흉선 (A), 비장 (B) 및 림프절 (C) 세포수의 변화. 처치 후 제1주 및 제2주에 거세한 동물의 흉선에서는 거세하지 않은 (시클로포스프아미드만을 처치함) 군에 비해 세포수가 신속하게 증대되었음에 주목해야 한다. 또한, 거세된 군의 비장 및 림프절의 세포수도 시클로포스프아미드만을 처치한 군에 비해 크게 증가하였다. 4주 후에는 세포수가 정상화되었다 (n = 각 처치 군 및 각 시점 마다 3 내지 4 마리).

도 8A-C: 외과술로 거세한 지 1주 뒤에 조사 (625 Rad)한 후, 흉선 (A), 비장 (B) 및 림프절 (C) 세포수의 변화. 처치 후 제1주 및 제2주에, 거세한 동물의 흉선에서는 거세하지 않은 (조사 처치만 수행함) 군에 비해 세포수가 신속하게 증대되었음에 주목해야 한다 (n = 각 처치 군 및 각 시점 마다 3 내지 4 마리).

도 9A-C: 동일자로 조사 및 거세를 수행한 후, 흉선 (A), 비장 (B) 및 림프절 (C) 세포수의 변화. 처치 후 제2주에, 거세된 동물의 흉선에서는 거세하지 않은 군에 비해 세포수가 신속하게 증대되었음에 주목해야 한다. 그러나, 처치 1주 전에 거세한 마우스 (도 7)와 비교할 때, 명백한 차이는 관찰되지 않았다 (n = 각 처치 군 및 각 시점 마다 3 내지 4 마리).

도 10: 동일자로 화학요법제인 시클로포스프아미드 처치 및 외과술에 의한 거세 또는 화학적 거세를 수행한 후, 흉선 (A), 비장 (B) 및 림프절 (C) 세포수의 변화. 처치 후 제1주 및 제2주에, 거세된 동물의 흉선에서는 거세하지 않은 (시클로포스프아미드만을 처치함) 군에 비해 세포수가 신속하게 증대되었음에 주목해야 한다. 또한, 거세한 군의 비장 및 림프절에서는 시클로포스프아미드만을 처치한 군에 비해 세포수가 크게 증가하였다 (n = 각 처치 군 및 각 시점 마다 3 내지 4 마리). 시클로포스프아미드 처치후의 면역계 재생과 관련해서, 화학적 거세는 외과술에 의한 거세에 필적할 만 했다.

도 11: 단순포진바이러스-1 (HSV-1)에 의한 발바닥 면역화 후, 림프절의 세포충실성 (cellularity). 나이든 거세 후 마우스에서는 거세되지 않은 나이든 군에 비해 세포충실성이 증가되었음에 주목해야 한다. 아래쪽의 그래프는 FACS를 통해 CD25 대 CD8 세포에 대해 게이팅 (gating)된, 활성화된 전체 세포수를 예시한다.

도 12A-C: HSV-1 접종 후, 활성화된 LN (림프절) 내 CTL (세포독성 T 림프구)에서의 Vβ10 발현량. 나이든 마우스에서의 클론 반응 감소 및 거세 후 반응 기대치의 회복에 주목해야 한다.

도 13A-C: 거세에 의한, HSV-1 면역화에 대한 반응성 회복. (a) 감염 후, 나이든 마우스에서는 어린 마우스 및 동일 연령의 거세 후 마우스에 비해 전체 림프절 세포충실성이 유의하게 감소된 것으로 나타났다. (b) HSV-1로 감염된 마우스의 LN에서 활성화된 (CD8⁺CD25⁺) 세포의 대표적인 FACS 프로필. 연령에 따라 또는 거세 후에 활성화된 CTL의 비율 차이는 관찰되지 않았다. (c) 나이든 마우스의 림프절 내 세포충실성이 감소되었음이, 활성화된 CTL 수에서의 유의한 감소로 반영되었다. 나이든 마우스를 거세했을 때, HSV-1에 대한 면역 반응이 회복되어 CTL 수가 어린 마우스와 동등해졌다. 결과는 마우스 8 내지 12 마리의 평균 ± 1SD로 나타냈다. ** = p ≤0.01, 어린 마우스 (2개월)와 비교함; ^ = p ≤0.01, 나이든 (거세하지 않음) 마우스와 비교함.

도 14: HSV-1로 면역화시킨 마우스에서 슬와부 림프절을 절개하여 3일 동안 배양했다. 면역화되지 않은 마우스를 용해의 백그라운드 수준에 대한 대조군으로서 사용하여 CTL 분석을 수행했다 (⁵¹Cr-방출량으로 측정함). 결과는 마우스 8 마리로 3벌 수행한 평균 ± 1SD로 나타냈다. 나이든 마우스는 E : T 비율이 10 : 1 및 3 : 1일 때 모두에서 CTL 활성이 유의하게 (p ≤0.01, *) 감소되는 것으로 나타났으며, 이는 림프절 내 존재하는 특이적 CTL의 백분율(％) 감소를 지시한다. 나이든 마우스를 거세했을 때, CTL 반응은 어린 성숙 마우스 수준으로 회복되었다.

도 15A 및 B: HSV-1 감염에 대한, CD4⁺T 헬퍼 세포 및 VβTCR 반응의 분석. HSV-1 감염 후 제5일에, 슬와부 림프절을 절개하여 (a) CD25, CD8 및 특이적 TCRVβ 마커 및 (b) CD4/CD8 T 세포의 발현에 대해 생체외 분석하였다. (a) Vβ10 또는 Vβ8.1을 발현하는 활성화된 (CD25⁺) CD8⁺T 세포의 백분율(％)을 군 당 마우스 8 마리의 평균 ± 1SD로 나타냈다. 연령에 따라 또는 거세 후에, 차이는 관찰되지 않았다. (b) 감염되지 않은 LN 집단 내 CD4/CD8 비율은 연령에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다. 이는 거세 후에 회복되었다. 결과는 군 당 마우스 8 마리의 평균 ± 1SD로 나타냈다. *** = p < 0.001, 어린 마우스 및 거세된 마우스와 비교함.

도 16A-D: Ly5 유사유전자형 (congenic) 마우스의 골수 이식 후, 흉선 (A), 비장 (B), 림프절 (C) 및 골수 (D) 세포수의 변화. 처치 후, 거세된 동물에서는 거세하지 않은 군에 비해 흉선의 세포수가 모든 시점에서 신속하게 증대되었음에 주목해야 한다. 또한, 거세한 군에서는 시클로포스프아미드만을 처치한 군에 비해 비장 및 림프절의 세포수가 크게 증가하였다 (n = 각 처치 군 및 각 시점 마다 3 내지 4 마리). 거세된 마우스에서는 거세되지 않은 동물에 비해 유사유전자형 (Ly5.2) 세포가 유의하게 증가했다 (데이타는 나타내지 않음).

도 17A 및 B: 태아 간 재구성 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스에서 흉선 세포수의 변화 (n = 각 시험군 마다 3 내지 4 마리). (A) 제2주에, 거세된 마우스의 흉선 세포수는 정상적인 수준이었고, 거세되지 않은 마우스에 비해 유의하게 더 높았다 (*p ≤0.05). 4주 후에, 거세된 마우스의 흉선에서 비대증은 관찰되지 않았다. 거세되지 않은 마우스의 세포수는 대조군 수준 미만으로 유지되었다. (B) CD45.2⁺세포 - CD45.2⁺는 공여자 유래되었음을 나타내는 마커이다. 재구성 2주 후에, 공여자-유래 세포는 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에 존재했다. 처치 4주 후에, 거세된 마우스 흉선 내 세포의 약 85％가 공여자 유래의 것이었다. 거세되지 않은 흉선에는 공여자-유래 세포가 없었다.

도 18: 치명적 조사 및 태아 간 재구성 후에 외과술로 거세한 후, CD4 대 CD8 공여자 유래의 흉선세포 집단의 FACS 프로필. 각 4분면의 백분율(％)은 각 플롯의 오른쪽에 나타냈다. 동일 연령의 대조군 프로필은 8개월 된 Ly5.1 유사유전자형 마우스의 흉선이었다. 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스의 경우에는 CD45.2⁺세포에 대해 게이팅되었으며, 오직 공여자 유래 세포만을 나타낸다. 재구성 2주 후, 흉선세포 아집단은 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 차이가 없었다.

도 19A 및 B: 치명적 조사, 태아 간 재구성 및 거세 후, 골수양 및 림프양 수상돌기 세포 (DC) 수 (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리). 그래프에서, 대조군 (백색 막대)은 동일 연령의 미처치 마우스에 존재하는 수상돌기 세포의 정상적인 수이다. (A) 공여자 유래의 골수양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 후, DC는 거세되지 않은 마우스에서 정상적인 수준으로 존재했다. 동일한 시점에서, 거세된 마우스에서의 DC 수는 유의하게 (*p ≤0.05) 더 높았다. 제4주에, 거세된 마우스에서의 DC 수는 대조군 수준을 초과한 채로 유지되었다. (B) 공여자 유래의 림프양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 후, 거세된 마우스의 DC 수는 거세되지 않은 마우스의 2배였다. 처치 4주 후, DC 수는 대조군 수준을 초과한 채로 유지되었다.

도 20A 및 B: 태아 간 재구성 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스에서 세포의 총 수 및 CD45.2⁺골수 세포수의 변화 (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리). (A) 세포의 총 수 - 재구성 2주 후, 골수 세포수가 정상화되었고, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 유의한 차이는 없었다. 재구성 4주 후에는 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 세포수가 유의하게 차이가 났다 (*p ≤0.05). (B) CD45.2⁺세포수. 재구성 2주 후, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 골수 내 CD45.2⁺세포수에는 유의한 차이가 없었다. 제4주에, 거세된 마우스에서 CD45.2⁺세포수는 높은 수준인 채로 유지되었다. 동일한 시점에서, 거세되지 않은 마우스에는 공여자-유래 세포가 없었다.

도 21A-C: 태아 간 재구성 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스에서 T 세포수 및 골수 내 골수양 및 림프양 유래의 수상돌기 세포 (DC) 수의 변화 (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리). 그래프에서, 대조군 (백색 막대)은 동일 연령의 미처치 마우스에 존재하는 T 세포 및 수상돌기 세포의 정상적인 수이다. (A) T 세포수 - 재구성 2주 및 4주 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에서 T 세포수가 감소되었다. (B) 공여자 유래의 골수양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 후, DC 세포수는 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에서 정상이었다. 이 시점에서, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에 세포수의 유의한 차이는 없었다. (C) 공여자 유래의 림프양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 및 4주 후, 상기 세포수는 정상이었다. 제2주에, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 이 수치에는 유의한 차이가 없었다.

도 22A 및 B: 태아 간 재구성 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스에서 세포의 총 수 및 공여자 (CD45.2⁺) 비장 세포수의 변화 (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리). (A) 세포의 총 수 - 재구성 2주 후, 세포수가 감소되었고, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 세포수에는 유의한 차이가 없었다. 재구성 4주 후에는 거세된 마우스의 세포수가 정상적인 수준에 도달하였다. (B) CD45.2⁺세포수 - 재구성 2주 후, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 비장 내 CD45.2⁺세포수에는 유의한 차이가 없었다. 제4주에, 거세된 마우스에서 CD45.2⁺세포수는 높은 수준인 채로 유지되었다. 동일한 시점에서, 거세되지 않은 마우스에는 공여자-유래 세포가 없었다.

도 23A-C: 태아 간 재구성 후, 비장 T 세포 및 골수양 및 림프양 유래의 수상돌기 세포 (DC) (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리). 그래프에서, 대조군 (백색 막대)은 동일 연령의 미처치 마우스에 존재하는 T 세포 및 수상돌기 세포의 정상적인 수이다. (A) T 세포수 - 재구성 2주 및 4주 후에, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에서 T 세포수는 감소했다. (B) 공여자 유래의 (CD45.2⁺) 골수양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 및 4주 후에, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에서 DC 수는 정상적이었다. 제2주에는, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에 유의한 차이가 없었다. (C) 공여자 유래의 (CD45.2⁺) 림프양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 및 4주 후, 상기 세포수는 정상적인 수준이었다. 제2주에, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 이 수치에는 유의한 차이가 없었다.

도 24A 및 B: 태아 간 재구성 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스에서 세포의 총 수 및 공여자 (CD45.2⁺) 림프절 세포수의 변화 (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리) (A) 세포의 총 수 - 재구성 2주 후, 세포수는 정상적인 수준이었고, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에 유의한 차이는 없었다. 재구성 4주 후, 거세된 마우스의 세포수는 정상적인 수준이었다. (B) CD45.2⁺세포수 - 재구성 2주 후, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에서 림프절 내 공여자 CD45.2⁺세포수에는 유의한 차이가 없었다. 제4주에, 거세된 마우스에서 CD45.2 세포수는 높은 수준인 채로 유지되었다. 동일한 시점에서, 거세되지 않은 마우스에는 공여자-유래 세포가 없었다.

도 25 A-C: 태아 간 재구성 후, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스의 장간막 림프절 내 T 세포 및 골수양 및 림프양 수상돌기 세포에서의 변화 (n = 각 시험군 마다 마우스 3 내지 4 마리). 대조군 (백색 막대)은 동일 연령의 미처치 마우스에 존재하는 T 세포 및 수상돌기 세포의 수이다. (A) 재구성 2주 및 4주후, T 세포수는 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에서 감소되었다. (B) 공여자 유래의 골수양 수상돌기 세포는 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스 모두에서 정상이었다. 4주 후, 세포수가 감소되었다. 제2주에, 거세된 마우스와 거세되지 않은 마우스 사이에 세포수에는 유의한 차이가 없었다. (C) 공여자 유래의 림프양 수상돌기 세포 - 재구성 2주 및 4주 후의 세포수는 정상 수준이었다. 제2주에, 거세된 마우스 및 거세되지 않은 마우스의 세포수에는 유의한 차이가 없었다.

도 26: 전립선 암에 대하여 LHRH-아고니스트 처치를 수행한 인간 환자 (모두 60세를 넘음)에서 말초혈 림프구의 형질 구성을 분석하였다. 처치 이전 및 LHRH-아고니스트 처치 4개월 후 환자 샘플을 분석하였다. 혈액 1 ml 당 림프구의 총 세포수는 모든 환자에서 처치 이전의 대조군 수치의 최저값이었다. 처치 이후, 9명 중 6명의 환자에서 총 림프구 수가 실질적으로 증가하는 것으로 나타났다 (일부의 경우에서는 전체 세포의 2배 증가가 관찰되었다). 이와 관련하여, 9명의 환자 중 6명에서 총 T 세포수가 증가하였다. CD4⁺서브세트 내에서, 이러한 증가는 훨씬 더 두드러져, 9명의 환자 중 8명에서 그러한 증가가 나타났는데, 이는 CD4 T 세포의 수준이 증가되었음을 입증한다. CD8⁺서브세트내에서는 이러한 경향이 뚜렷하지 않았으며, 일반적으로 CD4⁺T 세포 보다는 적은 정도였지만 9명의 환자 중 4명에서 수준이 증가하는 것으로 나타났다.

도 27: LHRH-아고니스트 처치 전후의 인간 환자 혈액의 분석 결과는 처치 이후 T 세포, CD4 또는 CD8 T 세포의 전체 비율의 실질적인 변화 및 CD4 : CD8 비율의 다양한 변화가 없음을 입증하였다. 이러한 결과는 처치 이후 전체 T 세포수의 실질적인 변화에도 불구하고 T 세포 서브세트의 항상성 유지에 대한 처치의 효과가 미미했음을 나타낸다. 모든 수치를 대조군 수치와 비교하였다.

도 28: LHRH-아고니스트 처치를 수행한 인간 환자의 말초혈 내 B 세포 및 골수양 세포 (NK, NKT 및 대식세포)의 비율 분석 결과는 서브세트내에서 다양한 정도의 변화를 입증하였다. NK, NKT 및 대식세포 비율은 처치 이후 비교적 일정하였지만, B 세포의 비율은 9명의 환자 중 4명에서 감소하였다.

도 29: 처치 후 인간 환자의 말초혈 내 B 세포 및 골수양 세포의 총 세포수 분석 결과는 처치 후 NK (9명의 환자 중 5명), NKT (9명의 환자 중 4명) 및 대식세포 (9명의 환자 중 3명) 세포수의 수준 증가를 분명히 나타냈다. B 세포수는 뚜렷한 경향을 나타내지 않았는데, 9명의 환자 중 2명에서는 수준이 증가하는 것으로 나타났고, 9명의 환자 중 4명에서는 변화가 없었으며, 9명의 환자 중 3명에서는 수준이 감소하는 것으로 나타났다.

도 30A 및 B: LHRH-아고니스트 처치 후 나타난 주요 변화는 말초혈의 T 세포 집단 내에 있었다. 특히, 고유 (CD45RA⁺) CD4⁺세포 비율이 선택적으로 증가하였으며, CD4⁺T 세포 서브세트에서 기억 세포 (CD45RO⁺)에 대한 고유 세포 (CD45RA⁺)의 비율은 인간 환자 9명 중 6명에서 증가하였다.

도 31: 다양한 레이저 펄스 에너지를 사용한 피부의 임피던스 감소. 곡선을작도하여 데이타를 기입하였을 때, 10 mJ 만큼 적은 에너지로 자극한 피부에서 피부 임피던스가 감소되었다.

도 32: 피부를 통한 의약품의 침투. 샘플 의약품으로서 인슐린을 사용하였으며, 레이저 조사를 통해 피부의 투과성을 크게 증가시켰다.

도 33: 5-아미노레불렌산 (ALA)의 추가 및 피부에 대한 1회의 임펄스 트랜지언트 (impulse transient) 이후 시간에 따른 피부의 형광도 변화. 강한 피크가 약 640 nm에서 나타났으며, 처치 210분 (점선) 후에 가장 높았다.

도 34: 임펄스 트랜지언트 없이 5-아미노레불렌산 (ALA)의 추가 이후 시간에 따른 피부의 형광도 변화. 강도는 여러 다른 시점에서 거의 변화하지 않았다.

도 35: 5-아미노레불렌산 (ALA)의 추가 및 여러 피크 스트레스 하에서 1회의 임펄스 트랜지언트 이후 피부의 형광도 변화 비교. 각질층의 투과도는 피크 스트레스에 따라 달라진다.

본 개시 내용은 미스매치된 기관, 조직 및(또는) 세포의 이식체에 대한 수용자의 허용을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이 방법을 이용하여 수용자의 흉선을 재활성화시킴으로써, 기존의 "외래" 물질이 수용자의 면역계에 의해 "자가"로서 인식된다. 수용자의 흉선은 성 스테로이드에 의해 매개된 흉선으로의 신호전달을 파괴함으로써 재활성화된다. 상기 파괴는 수용자의 호르몬 상태를 회복시켜 준다. 신호전달을 파괴하는 바람직한 방법은 거세를 통한 것이다. 거세 방법에는 화학적 거세 및 외과술에 의한 거세가 포함되지만, 이것으로 한정되지는 않는다.거세 단계 동안 또는 거세 후, 공여자로부터의 조혈 간세포 또는 전구체 세포, 또는 상피 간세포가 수용자에 이식된다. 이들 세포는 흉선에 의해 수용자에 속하는 것으로 받아들여져서, 흉선에 의한 새로운 T 세포 및 DC 생성의 일부분이 된다. 결과의 T 세포 집단은 수용자 및 공여자 둘 다를 자가로서 인식함으로써 공여자로부터의 이식체에 대한 허용능을 생성한다.

바람직한 흉선 재활성화 방법은 뇌하수체에 대한 LHRH의 직접 및(또는) 간접적인 자극 효과를 차단시켜 생식선자극호르몬인 FSH 및 LH를 감소시키는 것이다. 이러한 생식선자극호르몬은 일반적으로 생식선에 작용하여 성 호르몬, 특히 여성에서 에스트로겐, 남성에서는 테스토스테론을 방출시키며; 이러한 방출은 FSH 및 LH의 감소에 의해 차단된다. 이에 따른 직접적인 결과는 성 스테로이드의 혈장 수준의 즉각적인 감소이며, 그 결과 흉선에 대한 억제 신호가 점차적으로 방출된다. 흉선 재발달의 정도 및 양상은 CD34⁺조혈 세포 (자가 조직에서 유래한 것이 이상적임)의 주입에 의해 증대될 수 있다.

본 발명에서는 성 스테로이드의 유도에 의해 성숙되고 면역계를 보유하는 임의의 동물 종 (인간 포함), 예를 들어 포유동물 및 유대류, 바람직하게는 대형 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 이용할 수 있다.

"재생", "재활성화" 및 "재구성"이라는 용어 및 이들의 유사어는 본원에서 서로 바꿔쓸 수 있으며, 위축된 흉선이 그의 활성 상태로 회복되는 것을 의미한다.

"수용자", "환자" 및 "숙주"는 본원에서 서로 바꿔쓸 수 있으며, 이식체를수용하는 대상체를 나타낸다. "공여자"는 유전적 동계의, 동종이형의 또는 이종의 이식체일 수 있는 이식체의 공급원을 지칭한다. 동종이형의 이식체가 바람직하다. 동종이형의 이식체는 동일한 종의 매치되지 않은 구성원들 사이의 이식체를 나타내고, 이종 이식체에서의 공여자 및 수용자는 상이한 종이다. 매치된 동물들 사이에서 유전적 동계의 이식체가 가장 바람직하다. 이식체와 관련된 용어 "매치된", "매치되지 않은", "미스매치된" 및 "동일하지 않은"은 공여자와 수용자의 MHC 및(또는) 소 (minor) 조직적합성 마커가 동일하거나 (매치됨) 동일하지 않음 (매치되지 않음, 미스매치됨 및 동일하지 않음)을 나타내기 위해 사용된 것이다.

본원에 사용된 바와 같이 "거세"는 체내 성 스테로이드 생산 및 분포의 현저한 감소 또는 제거를 의미한다. 거세는 흉선이 완전하게 기능하는 경우 환자를 사춘기 이전의 상태로 효과적으로 되돌려놓는다. 외과술에 의한 거세는 환자의 생식선을 제거한다.

보다 영구적이지 못한 형태의 거세는 일정 기간 동안 화학물질을 투여하는 방법에 의한 것이며, 본원에서는 "화학적 거세"라 칭한다. 이러한 방식으로 기능할 수 있는 다양한 화학물질들이 있다. 화학적 전달 동안 및 이후 일정 기간 동안, 환자의 호르몬 생산은 중단된다. 화학적 거세 상태는 화학물질 전달을 중단할 때 원래 상태로 회복되는 것이 바람직하다.

성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달 파괴

쉽게 이해되는 바와 같이, 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달은 당업자에게 공지된 방법들의 범위 이내에서 파괴될 수 있으며, 그의 일부가본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 성 스테로이드 생산의 억제 또는 흉선 내의 1종 이상의 성 스테로이드 수용체의 차단은 성 스테로이드 아고니스트 및(또는) 길항제의 투여, 또는 능동적 (항원) 또는 수동적 (항체) 항-성 스테로이드 백신의 투여로 원하는 신호전달의 파괴를 달성하게 될 것이다. 성 스테로이드 생산의 억제는 또한 1종 이상의 성 스테로이드 유사체의 투여에 의해 달성될 수 있다. 어떤 임상 상황에서는, 물리적 거세를 통한 생식선의 영구 제거가 적절할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달은 성 스테로이드 유사체, 바람직하게는 황체형성호르몬 분비호르몬 (LHRH)의 유사체의 투여에 의해 파괴된다. 치료요법 및 화학적 거세에 있어서 성 스테로이드 유사체 및 그의 용도는 잘 알려져 있다. 이러한 유사체들로는 다음과 같은 LHRH 수용체 (LHRH-R)의 아고니스트를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다: 부세렐린 (Buserelin) (훽스트 (Hoechst) 제품), 시스토렐린 (Cystorelin) (훽스트 제품), 데카펩틸 (Decapeptyl) (등록상표: Debiopharm; 입센/뷰프어 (Ipsen/Beaufour) 제품), 데슬로렐린 (Deslorelin) (밸런스 파마슈티칼스 (Balance Pharmaceuticals) 제품), 고나도렐린 (Gonadorelin) (아이어스트 (Ayerst) 제품), 고세렐린 (Goserelin) (등록상표: Zoladex; 제네카 (Zeneca) 제품), 히스트렐린 (Histrelin) (오르토 (Ortho) 제품), 류프롤라이드 (Leuprolide) (등록상표: Lupron; 애보트/TAP (Abbott/TAP) 제품), 류프로렐린 (Leuprorelin) [Plosker et al.], 루트렐린 (Lutrelin) (와이어트 (Wyeth) 제품), 미테렐린 (Meterelin) [W0 9118016], 나파렐린 (Nafarelin) (신텍스 (Syntex) 제품) 및 트리프토렐린 (Triptorelin) [미국특허 제4,010,125호]. 또한, LHRH 유사체로는 다음과 같은 LHRH-R의 길항제를 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다: 아바렐릭스 (Abarelix) (등록상표: Plenaxis; 프래시스 (Praecis) 제품) 및 세트로렐릭스 (Cetrorelix) (등록상표: Zentaris). 아고니스트의 조합물, 길항제의 조합물, 및 아고니스트와 길항제의 조합물이 또한 포함된다. 상기 언급된 각 문헌의 개시 내용은 본원에 참고로 도입된다. 유사체가 데슬로렐린 (Deslorelin) (미국특허 제4,218,439호에 기재됨)인 것이 현재로서는 바람직하다. 보다 상세한 목록에 대하여는, 문헌 [Vickery et al., 1984]을 참조한다.

바람직한 실시양태에서, LHRH-R 길항제를 환자에게 전달한 다음, LHRH-R 아고니스트를 전달한다. 이러한 프로토콜은 성 스테로이드 생산의 감소에 앞서 아고니스트의 투여에 의해 생성될 수 있는 성 스테로이드 생산의 임의의 급격한 상승을 저해하거나 제한한다. 다른 실시양태에서, LHRH-R 길항제를 미리 투여하거나 투여하지 않고, 성 스테로이드 생산의 급격한 상승을 거의 또는 전혀 나타내지 않는 LHRH-R 아고니스트를 사용한다.

흉선 재활성화를 위한 자극은 기본적으로는 성 스테로이드의 효과 및(또는) LHRH 유사체의 직접적 효과를 억제하는 것을 기초로 하지만, 흉선 효과를 일제히 증대시키는 작용을 할 수 있는 추가의 물질을 포함시키는 것이 유용할 수 있다. 이러한 화합물로는 인터루킨 2 (IL2), 인터루킨 7 (IL7), 인터루킨 15 (IL15), 상피 및 섬유아세포 성장 인자 족의 구성원들, 간세포 인자, 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF) 및 각질세포 성장 인자 (KGF)를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.이러한 추가의 화합물(들)은 초기 LHRH 유사체 이용시 단지 1회만 제공되는 것으로 생각된다. 그러나, 이러한 물질들 중 어느 하나 또는 이들의 조합물을 임의의 시점에서 추가로 투여하여 흉선을 추가로 자극할 수 있다. 또한, 흉선 특이적으로 표적화될 수 있는 스테로이드 수용체 기재 조절제를 개발하여 사용할 수 있다.

제약 조성물

본 발명에 사용되는 화합물은 제약상 허용가능한 임의의 담체와 함께, 또는 담체 없이 공급할 수 있다. 담체의 예에는 생리적으로 상용가능한 코팅제, 용매 및 희석제가 포함된다. 비경구, 피하, 정맥내 및 근육내 투여의 경우, 상기 조성물은 예를 들어, 캡슐화로 보호할 수 있다. 별법으로, 상기 조성물은 활성 성분들의 서방출을 허용하면서 활성 성분(들)을 보호하는 담체와 함께 공급할 수 있다. 서방 제제를 제조하는 데 사용되는, 락트산/글리콜산 공중합체의 다양한 버젼과 같은 다수의 중합체 및 공중합체가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 생분해성 코팅제로서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 변형 중합체를 사용하는 미국 특허 제5,410,016호를 참조한다.

경구 전달하고자 하는 제제는 액체, 캡슐, 정제 등으로서 제조할 수 있다. 이들 조성물은 예를 들어, 활성 성분(들)을 분해로부터 보호하는 부형제, 희석제 및(또는) 코팅제를 포함할 수 있다. 이러한 제제들은 잘 공지되어 있다.

임의의 제제에서, LHRH 유사체의 활성에 부정적인 영향을 주지 않는 다른 화합물들도 포함될 수 있다. 이러한 화합물들의 예로는 본 명세서에 기재된 다양한 성장인자 및 기타 사이토킨이 있다.

투여량

LHRH 유사체는 일정 기간 동안 지속될 1회 투여량으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 제제는 1 내지 2개월 동안 효과적일 것이다. 표준 투여량은 사용되는 유사체의 타입에 따라 달라진다. 일반적으로, 상기 투여량은 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 10 mg/kg, 바람직하게는 약 0.01 mg/kg 내지 약 5 mg/kg이다. 투여량은 사용되는 LHRH 유사체 또는 백신에 따라 달라진다. 바람직한 실시양태에서, 투여량은 주기적인 전염병이 지속되는 기간만큼 지속되도록 제조한다. 예를 들어, "감기 시즌"은 통상적으로 겨울에 일어난다. LHRH 유사체의 제제를 만들어 본 명세서에 기재된 바와 같이 전달하여 감기 시즌의 초기에 시작되는 2개월 이상의 기간 동안 환자를 보호할 수 있고, 감염의 위험이 감소되거나 사라질 때까지 2개월 이상마다 전달한다.

제제는 면역계를 개선시키도록 제조할 수 있다. 별법으로, 제제는 면역계를 개선시키면서 감기 바이러스에 의한 감염을 특이적으로 막도록 제조할 수 있다. 상기 후자 제제는 감기 바이러스에 대한 내성이 생기도록 개조된 GM 세포를 포함할 것이다 (하기 참조). GM 세포는 공간 및(또는) 시간적으로 LHRH 유사체 제제와 함께 투여하거나 따로 투여할 수 있다. 비-GM 세포와 마찬가지로, 일정 시간에 걸친 다회 투여량을 환자에게 투여하여 감기 시즌 기간에 걸친 감기 바이러스로의 감염으로부터 보호하고 감염을 예방할 수 있다.

화학적 거세를 위한 물질의 전달

본 발명의 화합물의 전달은 당업자에게 공지된 다수의 방법을 통하여 달성할수 있다. 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달을 억제하는 화학적 억제제를 투여하는 한 표준 방법은 3개월 동안 효과적인 단회 투여량의 LHRH 아고니스트를 사용하는 것이다. 이 경우, 상기 아고니스트가 3개월이 지나기 전에 환자의 체내로부터 깨끗이 제거될 수 있기 때문에 간단한 1회 정맥내 또는 근육내 주사로는 충분하지 않을 것이다. 대신에, 데포 주사 또는 이식체를 사용할 수 있거나, 상기 억제제의 서방출을 허용할 다른 억제제 전달 수단을 사용할 수 있다. 마찬가지로, 본원에 필요한 기능을 유지하면서 체내에서 상기 억제제의 반감기를 증가시키는 방법, 예를 들어, 화학적 변형법을 이용할 수 있다.

보다 더 유용한 전달 메카니즘의 예에는 피부의 레이저 조사, 및 피부에 고압 임펄스 트랜지언트 (스트레스 파동 또는 임펄스 트랜지언트로도 불림)가 포함하나 이에 제한되지 않으며, 상기 각 방법은 동일한 좌위에서 담체와 함께 또는 담체 없이 화합물(들)을 배치시키는 것을 동반하거나, 상기 각 방법 후에 동일한 좌위에서 담체와 함께 또는 담체 없이 화합물(들)을 배치시킨다. 이 배치의 바람직한 방법은 치료 기간 동안 피부 상에 배치되어 유지되는 패치이다.

한 전달 수단은 특정하게 초점이 맞춰지는 레이저 광선 및 적절한 파장에서의 레이저 조사를 이용하여 환자의 피부에서 작은 천공 또는 변경을 발생시킨다. 본 명세서에 전문이 참고로 도입되는 미국 특허 제4,775,361호, 미국 특허 제5,643,252호, 미국 특허 제5,839,446호 및 미국 특허 제6,056,738를 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 레이저 광선은 0.2 내지 10 미크론의 파장을 갖는다. 보다 바람직하게는, 파장은 약 1.5 내지 3.0 미크론이다. 가장 바람직하게는, 파장은 약 2.94 미크론이다. 한 실시양태에서, 레이저 광선은 피부의 표피를 통해 피부 상의 조사 스폿을 형성하는 렌즈에 의해 초점이 맞춰진다. 추가 실시양태에서, 레이저 광선은 피부의 각질층을 통해서만 조사 스폿을 형성하도록 초점이 맞춰진다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, "절제부" 및 "천공"은 피부에 생긴 구멍을 의미한다. 이러한 구멍은 그 깊이에서 다양할 수 있는데, 예를 들어, 구멍은 각질층만을 침투할 수 있거나, 피부의 모세층 내로 항상 침투할 수 있거나, 각질층과 모세층 사이의 어느 지점에서 침투를 끝낼 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "변경"은 구멍의 생성이 없는, 피부의 침투성을 증가시키는 피부 구조의 변화를 의미한다. 천공과 마찬가지로, 피부는 임의의 깊이까지 변경될 수 있다.

파장, 에너지 플루언스, 펄스 시간폭 (pulse temporal width) 및 조사 스폿-크기를 비롯한 여러 인자가 레이저 광선을 한정하는 데 고려될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 에너지 플루언스는 0.03 내지 100,000 J/cm²이다. 보다 바람직하게는, 에너지 플루언스는 0.03 내지 9.6 J/cm²이다. 광선 파장은 Er : YAG와 같은 레이저 재료에 부분적으로 달려있다. 펄스 시간폭은 예를 들어, 한줄로 늘어선 축전기, 플래쉬램프 및 레이저 막대 재료에 의해 형성되는 펄스폭의 결과이다. 이 펄스폭은 임의로 1 fs (펨토초) 내지 1,000 μs이다.

본 발명의 방법에 따라, 레이저에 의해 형성된 천공 또는 변경은 레이저로부터의 단일 펄스에 의해 생성될 필요는 없다. 바람직한 실시양태에서, 각질층을 통한 천공 또는 변경은 다회 레이저 펄스를 사용하여 생성하고, 이들 펄스 각각은 표적 조직 두께의 일부만을 천공시키거나 변형시킨다.

결국, 당업자는 단일 펄스의 에너지를 결정하고 이를 바람직한 펄스의 수로 나누어 다회 펄스로 각질층을 천공시키거나 변경시키는 데 필요한 에너지를 대략적으로 산출할 수 있다. 예를 들어, 특정한 크기의 스폿이 전체 각질층을 통한 천공 또는 변경을 생성시키기는 데 1 J의 에너지를 필요로 하는 경우, 당업자는 10회의 펄스 (이들 각 펄스는 1/10 J의 에너지를 가짐)를 이용하여 정량적으로 유사한 천공 또는 변형을 만들 수 있다. 환자가 레이저 조사 기간 동안 표적 조직을 이동시키지 않고 (인간 반응 시간은 100 ms 크기임), 각 펄스 동안 발생되는 열이 유의하게 확산되지 않는 것이 바람직하기 때문에, 바람직한 실시양태에서 레이저로부터 나오는 펄스 반복 속도는 완전한 천공이 100 ms 미만의 시간내에 생성되도록 하는 속도이어야 한다. 별법으로, 표적 조직 및 레이저의 방향은 표적 위치에서의 변화가 보다 더 오랜 조사 시간 동안 일어나지 않도록 기계적으로 고정시킬 수 있다.

혈액을 거의 흘리지 않거나 전혀 흘리지 않는 방식으로 피부를 천공시키기 위해, 피부는 모세층만큼 깊지 않은 각질층과 같은 외표면을 통해 천공할 수 있거나 변경시킬 수 있다. 레이저 광선은 피부에서의 광선 직경이 대략 0.5 미크론 내지 5.0 cm 범위가 되도록 피부 상에 정확하게 초점을 맞춘다. 임의로, 스폿은 폭이 약 0.05 내지 0.5 mm이고 길이가 2.5 mm 이하인 슬릿형일 수 있다. 상기 폭은 임의의 크기일 수 있고, 조사되는 영역의 해부구조, 및 제거되는 유체 또는 사용되는 의약품의 원하는 천공 속도에 의해 조절된다. 초점 렌즈의 초점 길이는 임의의길이일 수 있지만, 한 실시양태에서, 이 초점 길이는 30 mm이다.

파장, 펄스 길이, 에너지 플루언스 (이는 레이저 에너지 출량 (J 단위) 및 초점에서의 광선의 크기 (cm²)의 함수임), 및 조사 스폿 크기를 변화시킴으로써, 절제 변형 (천공)과 비-절제 변형 (변경) 사이의 각질층에 대한 효과를 달리할 수 있다. 각질층의 절제 및 비-절제 변경 둘 다는 나중에 적용되는 의약품의 침투를 상승시킨다.

예를 들어, 다른 변수를 일정하게 유지하면서 펄스 에너지를 감소시킴으로써, 절제 조직-효과와 비-절제 조직-효과 사이에서 변화시킬 수 있다. 단일 펄스 또는 복사 에너지를 사용하며 피부 상의 2 mm의 스폿을 조사하는, 펄스 길이가 약 300 μs인 Er : YAG 레이저를 사용하면, 대략 100 mJ를 넘는 펄스 에너지가 각질층에 대한 부분 또는 완전한 절제를 일으키고, 대략 100 mJ 미만의 임의의 펄스 에너지는 각질층에 대한 부분 절제 또는 비-절제 변경을 일으킨다. 임의로, 다회 펄스를 이용하여, 체액의 침투 또는 의약품 전달을 상승시키는 데 필요한 임계 펄스 에너지는 대략적으로 펄스의 수와 동일한 계수만큼 감소한다.

별법으로, 다른 변수를 일정하게 유지하면서 스폿 크기를 감소시킴으로써, 절제 조직-효과와 비-절제 조직-효과 사이에서 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 스폿 면적을 이등분하면 동일한 효과를 나타내는 데 필요한 에너지가 이등분될 것이다. 예를 들어, 레이저의 복사 출력을 현미경 (예를 들어, 뉴욕주 멜빌 소재의 니콘 인크사 (Nikon, Inc.)로부터 구입가능함) 대물 렌즈 내로 커플링함으로써 0.5미크론까지 조사할 수 있다. 이러한 경우, 약 0.5 미크론의 크기일 수 있는, 현미경의 해상 한계의 크기로 광선을 스폿까지 초점을 맞출 수 있다. 사실상, 광선 프로필이 정규곡선인 경우, 양향을 받은 조사된 면적은 측정된 광선 크기 미만일 수 있고 현미경의 상 해상도를 초과할 수 있다. 이 경우 비-절제적으로 조직을 변경시키기 위해, 3.2 J/cm²의 에너지 플루언스를 사용하는 것이 적합한데, 이 때 0.5 미크론 크기의 스폿 크기는 약 5 nJ의 펄스 에너지를 필요로 할 것이다. 이 낮은 펄스 에너지는 다이오드 레이저로부터 쉽게 이용가능하고, 예를 들어, 유리와 같은 흡수 필터로 광선을 약화시킴으로써 Er : YAG로부터 얻을 수도 있다.

임의로, 다른 변수를 일정하게 유지하면서 복사 에너지의 파장을 변화시킴으로써, 절제 조직-효과와 비-절제 조직-효과 사이에서 변화시킬 수 있다. 예를 들어, Er : YAG (에르븀 : YAG; 2.94 미크론) 레이저 대신에 Ho : YAG (홀뮴 : YAG; 2.127 미크론)을 사용하여 조직에 의한 에너지의 흡수가 보다 작게 하여 천공 또는 변경이 보다 덜 일어나도록 한다.

레이저에 의해 발생되는 피코초 및 펨토초 펄스를 사용하여 피부에서 변경 또는 절제를 일으킬 수도 있다. 이는 1 펨토초 내지 1 ms 범위의 시간 폭으로 단일 펄스를 전달하는 조정된 다이오드 또는 관련 마이크로칩 레이저로 달성할 수 있다 (1 펨토초까지 펄스 길이를 사용하는 것을 개시한, 본 명세서에 전문이 참고로 도입되는 문헌 [D. Stern et al., "Corneal Ablation by Nanosecond, Picosecond, and Femtosecond Lasers at 532 and 625 nm,"Corneal Laser Ablation, Vol. 107,pp. 587-592, 1989] 참조).

또 다른 전달 방법은 피부 상에서 고압 임펄스 트랜지언트를 사용하여 투과성이 생기게 한다. 본 명세서에 전문이 참고로 도입되는 미국 특허 제5,614,502호 및 미국 특허 제5,658,892호를 참조한다. 고압 임펄스 트랜지언트, 예를 들어, 특정한 상승 시간 및 피크 스트레스 (또는 압력)를 갖는 스트레스 파동 (예컨대, 레이저에 의해 발생되는 레이저 스트레스 파동 (LSW))은 각질층 및 점막과 같은 상피 조직층을 통해 본 명세서 개시된 것과 같은 화합물의 수송을 안정하고 효율적으로 달성할 수 있다. 이 방법들은 그들의 전체 전하와 관계없이 광범위한 크기의 화합물을 전달하는 데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 임펄스 트랜지언트는 조직 손상을 피한다.

임펄스 트랜지언트에 노출시키기 전에, 상피 조직층, 예를 들어, 각질층은 외부 화합물에 대해 불투과성일 것이고, 이것은 상피층의 아래에 놓여있는 세포 내로 화합물이 분산되는 것을 저해한다. 상피층을 임펄스 트랜지언트에 노출시켜 화합물이 상피층을 통해 확산되도록 할 수 있다. 일반적으로, 확산 속도는 임펄스 트랜지언트의 성질 및 전달되는 화합물의 크기로 나타낸다.

특이적 상피 조직층, 예컨대 피부의 각질층을 통한 투과 속도는 또한 pH, 피부 기질 조직의 대사, 각질층 외부 영역과 각질층 내부 영역 사이의 압력차뿐 아니라, 피부의 해부학적 부위 및 물리적 조건을 비롯한 여러 다른 인자에 따라 달라진다. 또한, 피부의 물리적 조건은, 건강, 연령, 성별, 인종, 피부 관리 및 병력에 따라 달라진다. 예를 들어, 유기 용매 또는 계면활성제와의 사전 접촉은 피부의물리적 조건에 영향을 미친다.

상피 조직층을 통해 전달되는 화합물의 양은 상피층이 투과성으로 유지되는 시간의 길이, 및 투과성이 된 상피층의 표면적의 크기에 따라 달라진다.

임펄스 트랜지언트의 특성 및 특징은 그를 생성시키기 위해 사용되는 에너지원에 의해 제어된다. 본원에 참고로 도입된 WO 98/23325호를 참조한다. 그러나, 그의 특성은 그들이 전파되는 커플링 매질의 선형 및 비선형 특성에 의해 변형된다. 커플링 매질에 의해 야기되는 선형 감쇠는 임펄스 트랜지언트의 고주파 성분을 우세하게 감쇠시킨다. 이는 대역폭을 감소시키면서 임펄스 트랜지언트의 상승 시간을 상응하게 증가시킨다. 한편, 커플링 매질의 비선형 특성은 상승 시간을 감소시킨다. 상승 시간의 감소는 스트레스 (압력)에 대한 음속 및 입자 속도에 따른 결과이다. 스트레스가 증가됨에 따라, 음속 및 입자 속도 또한 증가한다. 이는 임펄스 트랜지언트의 선두 연부 (leading edge)를 보다 가파르게 만든다. 선형 감쇠의 상대적 강도, 비선형 계수 및 피크 스트레스는, 상승 시간을 실질적으로 가파르게 증가시키기 위해 파가 얼마나 오래 전파되어야 하는지를 결정해준다.

임펄스 트랜지언트의 상승 시간, 크기 및 지속 기간은 일시적으로 상피 조직층의 투과성을 증가시키는 비파괴성 (즉, 비쇼크파 (non-shock wave)) 임펄스 트랜지언트를 생성하도록 선택된다. 일반적으로, 상승 시간은 1 ns 이상, 더욱 바람직하게는 약 10 ns이다.

임펄스 트랜지언트의 피크 스트레스 또는 압력은 상이한 상피 조직 또는 세포층에 따라 달라진다. 예를 들어, 각질층을 통해 화합물을 수송하기 위해, 임펄스 트랜지언트의 피크 스트레스 또는 압력은 400 bar 이상, 더욱 바람직하게는 1,000 bar 이상, 약 2,000 bar 미만으로 설정되어야 한다. 상피 점막층의 경우, 피크 압력은 300 bar 내지 800 bar, 바람직하게는 300 bar 내지 600 bar로 설정되어야 한다. 임펄스 트랜지언트는 바람직하게는 수십 ns 정도의 지속 기간을 가지며, 따라서 매우 단시간 동안 상피 조직과 상호작용한다. 임펄스 트랜지언트와의 상호작용 후, 상피 조직은 영구 손상되지는 않고, 약 3분 동안 투과성으로 유지된다.

또한, 이러한 방법은 단지 약간 구분되는 고진폭 펄스들을 환자에게 인가하는 것과 관련이 있다. 환자에게 투여되는 임펄스 트랜지언트의 수는 전형적으로 100개 미만, 더욱 바람직하게는 50개 미만, 가장 바람직하게는 10개 미만이다. 다수의 광학 펄스를 사용하여 임펄스 트랜지언트를 생성시키는 경우, 연속 펄스들 사이의 지속 시간은 10 내지 120초이며, 이는 상피 조직의 영구 손상을 방지하기에 충분히 긴 시간이다.

임펄스 트랜지언트의 특성은 선행 기술의 표준 방법에 의해 측정할 수 있다. 예를 들면, 피크 스트레스 또는 압력, 및 상승 시간은 문헌 [Doukas et al., Ultrasound Med. Biol., 21:961 (1995)]에 기재된 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 변환기 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

임펄스 트랜지언트는 다양한 에너지원에 의해 생성된다. 임펄스 트랜지언트의 개시에 관여하는 물리적 현상은 일반적으로 (1) 열탄성 발생, (2) 광학적 절연파괴 또는 (3) 절제의 세가지 상이한 메카니즘으로부터 선택된다.

예를 들어, 임펄스 트랜지언트는 표적 물질을 절제하기 위해 고에너지원을 인가시킴으로써 개시될 수 있고, 이어서 커플링 매질에 의해 임펄스 트랜지언트가 상피 조직 또는 세포층과 커플링된다. 커플링 매질은 비선형인 한, 예를 들어 액체 또는 겔일 수 있다. 따라서, 물, 캐스터유와 같은 오일, 인산염 완충 염수 (PBS)와 같은 등장성 매질, 또는 콜라겐성 겔과 같은 겔이 커플링 매질로서 사용될 수 있다.

또한, 커플링 매질은 예를 들어 임펄스 트랜지언트의 생성 후 각질층이 화합물에 대해 투과성으로 유지되는 시간을 연장시킴으로써 수송을 개선시키는 계면활성제를 포함할 수 있다. 계면활성제는 예를 들어 이온성 세제 또는 비이온성 세제일 수 있고, 따라서 예를 들어 소듐 라우릴 술페이트, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 및 라우릴 디메틸 아민 옥시드를 포함할 수 있다.

흡수 표적 물질은 광유발 변환기로서 작용한다. 광을 흡수한 후, 표적 물질은 급속히 열 팽창 또는 절제되어, 임펄스 트랜지언트를 개시한다. 전형적으로, 금속 및 중합체 필름은 가시광선 및 자외선 스펙트럼 영역에서 높은 흡광 계수를 갖는다.

여러 유형의 물질은 사용된 레이저 파장에서 광을 충분히 흡수하는 한, 레이저 빔과 함께 표적 물질로서 사용될 수 있다. 표적 물질은 알루미늄 또는 구리와 같은 금속, 폴리스티렌, 예를 들어 블랙 폴리스티렌과 같은 플라스틱, 세라믹, 또는 고농축 염료 용액으로 구성될 수 있다. 표적 물질은 인가된 레이저 에너지의 횡단면적보다 넓은 치수를 가져야 한다. 또한, 표적 물질은 광이 피부 표면에 전혀 타격을 주지 않도록 광투과 깊이보다 두꺼워야 한다. 표적 물질은 또한 기계적 지지를 제공하기 위해 충분히 두꺼워야 한다. 표적 물질은 또한 금속으로 제조될 수 있고, 전형적 두께는 1/32 내지 1/16 인치일 것이다. 플라스틱 표적 물질의 경우, 두께는 1/16 내지 1/8 인치일 것이다.

임펄스 트랜지언트는 또한 제한 절제 (confined ablaition)를 이용하여 개선시킬 수 있다. 제한 절제에서, 레이저 빔 투명 물질, 예컨대 석영 광학창은 표적 물질과 근접하게 위치한다. 투명 물질을 이용한 표적 물질의 절제에 의해 생성된 플라즈마의 제한은 크기에 따라 커플링 계수를 증가시킨다 (문헌 [Fabro et al., J. Appl. Phys., 68: 775,1990] 참조). 투명 물질은 석영, 유리 또는 투명 플라스틱일 수 있다.

표적 물질과 제한 투명 물질 사이의 틈은 플라즈마를 팽창시켜서 표적에 부여된 운동량을 감소시킬 수 있기 때문에, 바람직하게는 초기에 액체 접착제, 예컨대 탄소 함유 에폭시를 사용하여 표적 물질과 투명 물질을 결합시켜 그러한 틈을 방지할 수 있다.

레이저 빔은 당업계에 공지된 표준 광변조 기술에 의해, 예를 들어 전자- 또는 음향-광학 장치에 의한 Q-스위칭 (Q-switched) 또는 모드-록킹 (mode-locked) 레이저를 이용하여 생성시킬 수 있다. 적외선, 가시광선 및(또는) 적외선 스펙트럼에서 펄스 모드로 작동할 수 있는 시판되는 표준 레이저로는 Nd : YAG, Nd : YLF, C0₂, 엑시머, 염료, Ti : 샤파이어, 다이오드, 홀뮴 (및 다른 토류 물질), 및금속-증기 레이저가 포함된다. 이들 광원의 펄스폭은 조정가능하며, 수십 피코초 (ps) 내지 수백 마이크로초로 다양할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 경우, 광 펄스폭은 100 ps 내지 약 200 ns로 달라질 수 있으며, 바람직하게는 약 500 ps 내지 40 ns이다.

임펄스 트랜지언트는 또한 체외 쇄석기 (한 예는 문헌 [Coleman et al., Ultrasound Med. Biol., 15: 213-227,1989]에 기재되어 있음)에 의해 생성될 수 있다. 이러한 임펄스 트랜지언트는 30 내지 450 ns의 상승 시간을 가지며, 이는 레이저에 의해 생성된 임펄스 트랜지언트에 비해 긴 시간이다. 체외 쇄석기를 이용한 새로운 방법에 적절한 상승 시간을 갖는 임펄스 트랜지언트를 형성하기 위해서는, 임펄스 트랜지언트를 상기 수학식 1에 의해 결정된 거리로 비선형 커플링 매질 (예를 들어, 물)에서 전파시킨다. 예를 들어 상승 시간이 100 ns이고 피크 압력이 500 bar인 임펄스 트랜지언트를 생성시키는 쇄석기를 이용하는 경우, 임펄스 트랜지언트가 상피 세포층과 접촉하기 전에 커플링 매질을 통과해야 하는 거리는 대략 5 mm이다.

쇄석기에 의해 생성된 임펄스 트랜지언트를 정형화하는 이 접근법의 추가 이점은 파의 신장부 (tensile component)가 비선형 커플링 매질을 통해 전파된 결과 넓어지거나 감쇠될 것이라는 점이다. 이 전파 거리는 신장부의 압력이 파의 수축부 (compressive component)의 피크 압력의 단지 약 5 내지 10％인 임펄스 트랜지언트를 생성하도록 조정되어야 한다. 따라서, 정형화된 임펄스 트랜지언트는 조직을 손상시키지 않을 것이다.

사용된 쇄석기의 유형은 중요하지 않다. 전기수력학적, 전자기적 또는 압전 쇄석기가 사용될 수 있다.

임펄스 트랜지언트는 또한 변환기, 예컨대 압전 변환기를 이용하여 생성될 수 있다. 바람직하게는, 변환기는 커플링 매질과 직접 접촉하고, 광학장, 열장 또는 전기장 인가 후 급속 전환되어, 임펄스 트랜지언트를 생성한다. 예를 들어, 유전 절연파괴법을 이용할 수 있고, 이는 전형적으로 고전압 스파크 또는 압전 변환기 (특정 체외 쇄석기에서 사용되는 것과 유사함, 문헌 [Coleman et al., Ultrasound Med. Biol., 15: 213-227,1989])에 의해 유도된다. 압전 변환기의 경우, 변환기는 전기장 인가 후 급속 팽창되어, 커플링 매질에서 급속 전환을 일으킨다.

또한, 임펄스 트랜지언트는 광섬유에 의해서도 생성될 수 있다. 광섬유 전달 시스템은 특별히 조정가능하고, 상피 조직층에 인접하여 위치한 표적 물질에 조사하여 도달하기 어려운 곳에서 임펄스 트랜지언트를 생성시키는 데 이용될 수 있다. 이러한 유형의 전달 시스템이 레이저와 광학적으로 커플링되는 경우, 카테터 및 관련 가요성 장치와 일체될 수 있고, 인체의 대부분의 기관에 조사하기 위해 사용될 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 목적하는 상승 시간 및 피크 스트레스를 갖는 임펄스 트랜지언트를 개시하기 위해, 광원의 파장을 용이하게 조정하여 특정 표적 물질에서 적절하게 흡수되게 할 수 있다.

별법으로, 에너지 물질은 제공된 임펄스에 응답하여 임펄스 트랜지언트를 생성할 수 있다. 제공자는 전기 방전 또는 스파크를 일으킴으로써 에너지 물질을 제공할 수 있다.

임펄스 트랜지언트와 함께 정수압을 이용하여 상피 조직층을 통한 화합물의 수송을 개선시킬 수 있다. 임펄스 트랜지언트에 의해 유도된 효과는 수분 동안 지속되기 때문에, 농도 구배에 따라 상피 세포층을 통해 수동 확산되는 약물의 수송 속도는 임펄스 트랜지언트를 인가한 후 상피 조직층, 예를 들어 피부의 각질층의 표면에 정수압을 인가함으로써 증가시킬 수 있다.

허용의 유도

개체의 T 세포 집단은 본 발명의 방법에 의해 변경될 수 있다. 특히, 동일하지 않은 이식체에 대한 허용능을 생성하도록 변화가 유도될 수 있다. 임상적인 이식 상황에서 외인성 항원, 특히 비-자가 공여자에 대한 허용의 확립은, 공여자 기원의 수상돌기 세포가 흉선에 혼입되는 경우에 가장 잘 성취될 수 있다. 이러한 형태의 허용은 억제성 면역조절 세포를 사용하여 보다 효과적으로 만들어질 수도 있다. 그러나, 후자의 발전에 대한 근본적인 메커니즘은 잘 이해되지 않은 상태이지만, 다시 수상돌기 세포가 관여할 수 있다.

자가 항원에 대한 T 세포의 반응을 저해하는 근본적인 주요 메커니즘이 흉선 수상돌기 세포에 의한 그러한 세포들의 네가티브 선별 (클론 결실에 의해)로 인한 것이라면, 잠재적 기관 또는 조직 공여자로부터 수상돌기 세포를 갖는 흉선을 생성하는 능력은 이식 거부의 예방에 있어서 매우 중요한 것이다. 이는 잠재적으로 이식체를 거부할 수 있는 T 세포가 흉선에서 공여자의 수상돌기 세포와 접촉하여 이들이 혈류로 들어가는 기회를 갖기 전에 결실될 것이기 때문이다. 수상돌기 세포를 발생시키는 혈액 전구체 세포는 T 세포 자체를 발생시키는 것들과 동일하다.

본 개시 내용은 외래 수상돌기 세포를 환자의 흉선에 혼입시키는 방법을 제공한다. 이는 공여자 세포를 수용자에 투여하여 수용자에서 허용능을 생성시킴으로써 달성된다. 공여자 세포는 조혈 간세포 (HSC), 상피 간세포 또는 조혈 전구 세포일 수 있다. 바람직하게는, 공여자 세포가 CD34⁺HSC, 림프양 전구 세포, 또는 골수양 전구 세포이다. 가장 바람직하게는, 공여자 세포가 CD34⁺HSC이다. 공여자 세포는 수용자에 투여되어 말초 혈액계를 통해 흉선으로 이동한다. 조혈 전구체 세포의 흉선으로의 흡수는 성 스테로이드의 부재시 실질적으로 증가한다. 조혈 전구체 세포는 흉선으로 통합되어, 수용자의 세포가 하는 것과 동일한 방식으로 수상돌기 세포 및 T 세포를 생성한다. 그 결과, 수용자의 말초 혈액에서 순환하는 T 세포의 키메라가 생겨나고, 여기에 수용자의 면역계에 의해 자가로서 인식되는 세포, 조직 및 기관의 집단이 증가하는 현상이 수반된다.

소형 동물 연구

재료 및 방법

동물

CBA/CAH 및 C57B16/J 수컷 마우스를 센트럴 애니멀 서비시스 (Central Animal Services, Monash University)로부터 구입하여 통상적인 조건하에 사육하였다. 마우스의 연령은 4-6주 내지 26개월 범위었으며, 관련된 위치에 표시하였다.

거세

염수 중 자일라진 (롬펀 (Rompun); 오스트레일리아 보타니 엔에스더블유에 소재하는 바이엘 오스트레일리아 리미티드 (Bayer Australia Ltd.) 제품) 0.3 mg 및 케타민 염산염 (케탈라 (Ketalar); 오스트레일리아 보타니 엔에스더블유에 소재하는 파케-데이비스 (Parke-Davis) 제품) 1.5 mg의 용액 0.3 ml를 복강내 주사하여 동물을 마취시켰다. 음낭을 절개하여 고환을 노출시켜 이를 봉합사로 묶은 후, 주변의 지방 조직과 함께 제거하는 외과술로 거세를 수행하였다.

브로모데옥시우리딘 (BrdU)의 혼입

BrdU (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chemical Co.) 제품) (PBS 100 ㎕ 중, 100 mg/kg 체중)를 마우스에 4시간 간격으로 2회 복강내 주사하였다. 대조군 마우스에는 비히클만을 주사하였다. 제2회 주사 1시간 후, 흉선을 절개하여 FACS 분석용 세포 현탁액을 제조하거나 즉시 티슈 테크 (Tissue Tek) (오.씨.티. (O.C.T.) 화합물, 미국 인디애나주에 소재하는 마일스 인크 (Miles INC) 제품)에 묻어 액체 질소 중에서 급속 냉동시키고, 사용시까지 -70℃에서 보관하였다.

유식 세포 분석 (Flow Cytometric analysis)

C0₂로 질식시켜 마우스를 죽이고 흉선, 비장 및 장간막 림프절을 절개해 냈다. 상기 기관을 차가운 PBS/1％ FCS/0.02％ 아지드 용액 중에서 200 ㎛ 체에 완만하게 거르고 원심분리 (650 g, 5분, 4℃)시켜, PBS/FCS/Az 중에 재현탁시켰다. 비장 세포를 적혈구 용해 완충액 (8.9 g/L 염화암모늄) 중에서 4℃에서 10분 동안인큐베이션하여 세척한 후에 PBS/FCS/Az 중에 재현탁시켰다. 세포 농도 및 생존력은 혈구계 및 브롬산에티디움/아크리딘 오렌지를 사용하고 형광현미경 (액시오스콥 (Axioskop); 독일 오베르코헨에 소재하는 카를 자이스 (Carl Zeiss) 제품) 하에서 2벌로 측정하였다.

3색 면역형광법을 위하여, 흉선세포를 항-αβTCR-FITC 또는 항-γδTCR-FITC, 항-CD4^-PE 및 항-CD8^-APC (모두 미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 파밍젠 (Pharmingen) 제품)으로 통상적으로 표지한 후, 유식 세포 분석을 수행하였다. 비장 및 림프절 현탁액을 αβTCR-FITC/CD4^-PE/CD8^-APC 또는 CD4^-PE 및 CD8^-APC를 포함하는 B220-B (시그마 제품)로 표지하였다. B220-B는 미국 캘리포니아주 버링검에 소재하는 칼태그 래버러토리즈, 인크. (Caltag Laboratories, Inc.)로부터 구입한 스트렙타비딘-트리-칼라 접합체로 검출하였다.

BrdU 검출을 위하여, 세포에 CD4^-PE 및 CD8^-APC로 표면 표지한 후, 앞서 기재한 바 [Carayon and Bord, 1989]와 같이 고정시키고 침투시켰다. 요약하면, 염색된 세포를 4℃에서 1％ PFA/0.01％ 트윈-20 중에서 밤새 고정시켰다. 세척한 세포를 DNase (100 쿠니츠 유닛 (Kunitz unit), 서독에 소재하는 베링거 만하임 (Boehringer Mannheim) 제품) 500 ㎕ 중에서 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 DNA를 변성시켰다. 최종적으로, 세포를 항-BrdU-FITC (벡톤-디킨슨 (Becton-Dickinson) 제품)과 함께 배양하였다.

4색 면역형광법을 위하여, 흉선세포에 CD3, CD4, CD8, B220 및 Mac-1에 대해표지하고, 전체를 항-래트 Ig-Cy5 (영국 아멀샴 (Amersham) 제품)로 검출하였고, TN (negative cell)은 분석을 위해 게이팅시켰다. 전술한 바와 같이 [Godfrey and Zlontnik, 1993], 세포를 CD25-PE (파밍젠 제품) 및 CD44-B (파밍젠 제품)으로 염색한 후에 스트렙타비딘-트리-칼라 (미국 캘리포니아주에 소재하는 칼태그 제품)로 염색하였다. 이어서, 상기 설명한 바와 같이 BrdU 검출을 수행하였다.

팩스칼리버 (FacsCalibur) (벡톤-디킨슨 (Becton-Dickinson) 제품)상에서 샘플을 분석하였다. 0°및 90°광 산란 프로필에 따라, 생존가능한 림프구를 게이팅시키고, 셀 퀘스트 소프트웨어 (Cell quest software) (벡톤-디킨슨 제품)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

면역조직학

냉동미세절단기 (라이카 (Leica) 제품)를 이용하여 냉동된 흉선 절편 (4 ㎛)을 절단한 직후에 100％ 아세톤 중에서 고정시켰다.

2색 면역형광법을 위하여, 이 연구소에서 제조한 MTS6, 10, 12, 15, 16, 20, 24, 32, 33, 35 및 44 모노클로날 항체 패널 [Godfrey et al., 1990; Table 1]로 상기 절편을 이중 표지하였고, 다가 토끼 항-사이토케라틴 항체 (미국 캘리포니아주 카르핀테리아에 소재하는 다코 (Dako) 제품)를 사용하여 상피 세포 결정부위들의 동시 발현을 평가하였다. 결합한 mAb는 FITC-접합된 양 항-래트 Ig (시레누스 래버러토리즈 (Silenus Laboratories) 제품)에 의해 밝혀졌고, 항-사이토케라틴은 TRITC-접합된 염소 항-토끼 Ig (시레누스 래버러토리즈 제품)에 의해 밝혀졌다.

BrdU 검출을 위해, 절편을 항-사이토케라틴으로 염색한 후에 항-토끼-TRITC또는 특이적 mAb로 염색한 후에 항-래트 Ig-Cγ3 (아멀샴 제품)으로 밝혀냈다. 이어서, 전술한 바와 같이 [Penit et al., 1996] BrdU 검출을 수행하였다. 요약해서, 절편을 70％ 에탄올 중에서 30분 동안 고정시켰다. 반건조된 절편을 4 M HCl 중에서 배양하고, 붕산염 완충액 (시그마 제품)으로 세척하여 중화시킨 후에 PBS 중에서 2회 세척하였다. 항 BrdU-FITC (벡톤-디킨슨 제품)를 이용하여 BrdU를 검출하였다.

3색 면역형광법을 위하여, 절편을 특이적 MTS mAb 및 항-사이토케라틴에 대하여 표지하였다. 이어서, 앞서 기재한 바와 같이 BrdU 검출을 수행하였다.

절편을 라이카 형광물질 및 니콘 (Nikon) 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다.

이동 연구

염수 중 자일라진 (롬펀; 오스트레일리아 보타니 엔에스더블유에 소재하는 바이엘 오스트레일리아 리미티드 제품) 0.3 mg 및 케타민 염산염 (케탈라: 오스트레일리아 보타니 엔에스더블유에 소재하는 파케-데이비스 제품) 1.5 mg의 용액 0.3 ml를 복강내 주사하여 동물을 마취시켰다.

흉선세포의 FITC 표지 기술에 관한 상세한 사항은 다른 문헌 ([Scollay et al., 1980], [Berzins et al., 1998])에 기재되어 있는 바와 유사하였다. 요약하면, 흉선엽을 노출시키고 각각의 엽에 350 ㎍/ml FITC (PBS 중) 약 10 ㎕을 주사하였다. 상처를 외과술에 사용되는 스테이플로 봉합하고, 마취에서 완전히 깨어날때까지 마우스를 가온시켰다. 주사 후 24시간 후에 C0₂로 질식시켜 마우스를 죽이고, 림프양 기관을 절개해 내 분석하였다.

세포를 계수한 다음에 샘플을 항-CD4^-PE 및 항-CD8^-APC로 염색한 후, 유식 세포 분석법으로 분석하였다. 이동 세포는 CD4 또는 CD8을 발현하는 라이브-게이팅된 (live-gated) FITC⁺세포 (자가형광 세포 및 이중선의 누락)로서 확인되었다. FITC⁺CD4 및 CD8 세포의 백분율을 각각 림프절 및 비장에 대한 전체 이동 백분율을 제공하기 위하여 더하였다. 1일 방출 속도에 대한 계산은 문헌 [Berzins et al. (1998)]에 기재된 바와 같이 수행되었다.

짝을 이루지 않은 스투덴트 't' 검정법 (unpaired student't' test) 또는 파라미터 없는 만 휘트니 검정법 (nonparametrical Mann Whitney test)을 사용하여 분석한 데이타를 사용하여 대조군과 3벌 이상 수행된 실험의 검정법 결과물 사이의 통계학적 유의성을 결정하였다. 대조값과 유의미하게 상이한 실험적 수치는 다음과 같이 나타내었다: *p ≤ 0.05, **p ≤0.01 및 ***p ≤ 0.001.

결과

흉선세포 모집단에 대한 연령의 영향

(i) 흉선 중량 및 흉선세포 수

연령이 증가함에 따라, 흉선 중량 (도 1A) 및 총 흉선 세포 (도 1B) 모두에서 매우 유의한 (p ≤0.0001) 감소가 있었다. 어린 성숙 마우스에서 흉선의 상대적인 중량 (mg 흉선/g 체중)은 평균 수치가 3.34로서, 생후 18 내지 24개월 후에는 0.66으로 감소한다 (지방 누적으로 인해, 정확한 계산이 제한됨). 흉선 중량의 감소는 흉선세포의 총 수 감소로 인한 것이라고 할 수 있다: 1 내지 2개월 된 흉선은 약 6.7 ×10⁷개 흉선세포를 함유하고, 24개월이 되었을 때 약 4.5 ×10⁶개 세포로 감소한다. 거세를 통해 흉선에 대한 성 스테로이드의 영향을 없앨 경우에는 재생이 일어나고, 거세 4주 후의 흉선은 중량 및 세포충실성 모두에서 어린 성숙 마우스의 수준과 동등해진다 (도 1A 및 1B). 흥미롭게도, 거세 2주 후에는 흉선세포의 수가 유의하게 (p ≤0.001) 증가하고 (약 1.2 ×10⁸), 이는 거세 4주 후에 정상적인 어린 성숙 마우스 수준으로 회복된다 (도 1B).

흉선에 의해 생성된 T 세포의 수 감소는 말초부에 반영되지 않고, 비장 세포수는 연령에 무관하게 일정하게 유지된다 (도 2A). 말초부의 항상성 메카니즘은 뚜렷한데, 이는 비장 및 림프절에서의 B 세포 대 T 세포의 비율이 연령 및 말초부에 도달하는 T 세포수의 후속적인 감소에 영향을 받지 않기 때문이다 (도 2B). 그러나, CD4⁺대 CD8⁺T 세포의 비율은 생후 2개월의 2 : 1에서 생후 2년의 1 : 1로 연령에 따라 유의하게 (p ≤0.001) 감소한다 (도 2C). 거세 및 말초부에 도달하는 T 세포수의 후속적인 증가 후, 말초부 T 세포수에서는 변화가 관찰되지 않는다: 비장 T 세포수 및 비장 및 림프절 모두에서 B : T 세포의 비율은 거세 후 달라지지 않는다 (도 2A 및 B). 연령에 따른 말초부에서의 감소된 CD4 : CD8의 비율은 거세 2주후에도 여전히 뚜렷하지만, 거세 4주 후에는 완전히 역전된다 (도 2C).

(ii) αβTCR, γδTCR, CD4 및 CD8 발현

연령의 증가에 따라 나타나는 흉선세포 수의 감소가 특이적 세포 집단 고갈의 결과인지를 결정하기 위해서, 특징적인 마커로 흉선세포를 표지하여 별개의 아집단을 분석하였다. 또한, 이를 통해 거세 후 흉선 재증식에 대한 동력학 분석도 할 수 있었다. 주요 흉선세포 아집단의 비율을 정상적인 어린 성숙 마우스 흉선에서와 비교하였으며 (도 3), 연령과 무관하게 일정하게 유지됨을 알아냈다. 또한, αβTCR 및 γδTCR의 발현에 의한 흉선세포의 추가적인 세분화는 연령의 증가에 따른 이들 집단의 비율에 변화가 없음을 밝혔다 (데이타는 나타내지 않음). 거세 2 주 및 4주 후에, 흉선세포 아집단은 동일한 비율로 유지되었으며, 흉선세포 수가 거세 후 최대 100배까지 증가하였으므로, 이는 발생학적인 증대의 진행이 아니라 모든 흉선세포의 서브세트들의 동시 증대를 나타낸다.

따라서, 나이든 동물의 흉선에서 나타나는 세포 수의 감소는 모든 세포의 표현형에서 균형잡힌 감소의 결과인 것으로 여겨지며, T 세포 집단에서 유의적인 변화는 검출되지 않았다. 흉선 재생은 동시적인 방식으로 일어나고, 모든 T 세포 아집단을 순차적인 것이 아니라 동시적으로 보충한다.

흉선세포의 증식

도 4에 나타난 바와 같이, 4 내지 6주 된 마우스에서는 흉선세포의 15 내지 20％가 증식하고 있다. 이들의 대부분 (약 80％)은 약 6％의 두번째로 큰 집단을 이루는 TN 서브세트를 가진 DP이다 (도 5A). 따라서, 대부분의 분획이 면역조직학에 의해서 서브캡슐 및 피질에서 나타난다 (데이타는 나타내지 않음). FACS 분석에 의해 수질 영역에서 나타나는 일부 분획은 분열하는 SP 세포의 비율 (CD4 T 세포의 9％ 및 CD8 T 세포의 25％)을 나타내는 것이다 (도 5B).

나이든 마우스의 흉선에서는 세포수가 유의하게 감소되지만, 흉선세포의 증식은 일정하게 유지되고, 생후 2년에 12-15％로 감소하고 (도 4), 증식하는 집단의 표현형은 2개월된 흉선과 유사하다 (도 5A). 면역조직학은 생후 1년 된 분획을 밝혀 냈고, 어린 성숙 마우스에서 나타나는 분획을 반영한다; 그러나, 생후 2년 된 경우의 증식은 주로 외부 피질 및 주변의 혈관부에서 나타난다 (데이타는 나타내지 않음). 거세 2주 후에, 흉선세포 수는 유의하게 증가하지만, 증식하는 흉선세포의 비율에 있어서는 변화가 없고, 이는 다시 한 번 세포의 동시 증대를 나타낸다 (도 4). 면역조직학은 흉선세포 증식의 국소화 및 거세 2주 후의 2개월 된 마우스의 흉선에서와 유사한 상황의 세포의 분열 정도를 밝혀 냈다 (데이타는 나타내지 않음). 증식하는 집단을 나타내는 각각의 아집단의 비율을 분석할 때, 증식하는 집단 내의 CD8 T 세포의 비율에서 유의한 (p ≤0.001) 증가가 있었다 (생후 2개월 및 2년 된 경우 1％, 거세 2주 후 약 6％로 증가) (도 5A).

도 5B는 어린 마우스, 나이든 마우스 및 거세된 마우스 각각의 서브세트 내 증식의 정도를 예시한다. DN 서브세트 (2개월 된 경우의 35％에서 2년된 경우의 4％)에서 증식에서 유의한 (p ≤0.001) 감소가 있다. 또한, CD8⁺T 세포의 증식이 유의하게 (p ≤0.001) 감소하였으며, 이는 나이든 흉선의 수질에서 분획이 명백하지 않은 면역조직학에서 얻은 결과를 반영한다 (데이타는 나타내지 않음). 거세 4주 후의 DN 증식 감소는 정상적인 어린 성숙 마우스 수준으로 회복되지 않는다. 그러나, CD8⁺T 세포 서브세트 내의 증식은 거세 2주 후 유의하게 (p ≤0.001) 증가하고, 거세 4주 후에는 정상적인 어린 성숙 마우스 수준으로 회복된다.

DN 서브세트 내에서의 증식 감소를 마커 CD44 및 CD25를 사용하여 추가로 분석하였다. 흉선세포 전구체 뿐 아니라 DN 아집단은 αβTCR⁺CD4^-CD8^-흉선세포를 함유하고, 이는 SP 세포로의 전이에서 양쪽 공동 수용체에서 하향 조절된다 [Godfrey ＆ Zlotnik, 1993]. 이들 성숙한 세포를 게이팅시켜, 진정한 TN 구획 (CD3^-CD4^-CD8^-)을 분석하는 것이 가능하였고, 연령에 따라 또는 거세 후, 증식 비율에는 차이가 나타나지 않았다 (도 5C). 그러나, CD44 및 CD25를 발현하는 아집단의 분석은 TN1 서브세트 (CD44⁺CD25^-)의 증식에서 유의한 (p <0.001) 감소를 나타내었으며 (정상적인 어린 성숙 마우스의 20％에서 18개월 된 경우에는 약 6％로 감소함) (도 5D), 이는 거세 4주 후에 회복되었다. TN1 서브세트의 증식 감소는 거세 2주 후에 정상적인 어린 성숙 마우스 수준으로 회복되는 TN2 아집단 (CD44⁺CD25⁺)의 증식에서 유의한 (p ≤0.001) 증가로 상쇄되었다.

흉선 미세환경에 대한 연령의 영향

연령에 따른 흉선 미세환경에서의 변화를 광범위한 패널의 MAb (MTS 시리즈, 폴리클로날 항-사이토케라틴 Ab로 이중 표지함)을 사용하여 면역형광법으로 조사하였다.

이들 MAb에 의해 인식되는 항원을 3개의 군으로 하위분류하였다: 흉선 상피 서브세트, 혈관-연관된 항원 및 기저 세포 및 흉선세포 둘다에 존재하는 항원.

(i) 상피 세포 항원

2년 된 마우스 흉선의 항-케라틴 염색 (전-상피)은 상피 세포의 심각한 탈조직화 (disorganization) 및 뚜렷한 피질-수질 접합부가 부재하는 일반적인 흉선 구조가 소실되었음을 밝혀냈다. MAb, MTS 10 (수질) 및 MTS44 (피질)을 사용한 추가적인 분석은 연령에 따라 피질 크기가 뚜렷하게 감소된다는 사실과 함께 수질 상피에서 실질적으로 덜 감소한다는 것을 나타내었다 (데이타는 나타내지 않음). 항-사이토케라틴 표지에서 명백한 것과 같이 상피 세포가 부재한 영역 또는 케라틴 음성 영역 ([KNA's, van Ewijk et al., 1980], [Godfrey et al., 1990], [Bruijntjes et al., 1993])이 보다 명백하였고, 나이든 마우스의 흉선에서 크기가 증가하였다. 또한, 흉선 상피의 "포낭-유사" 구조의 외관이 나이든 마우스의 흉선에 나타났고, 특히 수질 영역에서 두드러졌다 (데이타는 나타내지 않음). 지방 누적, 흉선 크기의 심각한 감소 및 피질-수질 접합부의 통합성 쇠퇴가 항-사이토케라틴 염색에서 결정적으로 드러났다 (데이타는 나타내지 않음). 흉선은 거세 2주 후에 재생되기 시작한다. 이는 흉선 엽 크기, MTS 44로 나타난 피질 상피의 증가 및 수질 상피의 국소화로 분명하다. 수질 상피는 MTS 10으로 검출되고, 2주 후 피질 전체에서 MTS 10으로 염색된 상피의 서브주머니가 여전히 분산되어 있다. 거세 4주 후, 뚜렷한 피질 및 수질 및 식별가능한 피질-수질 접합부가 있다 (데이타는 나타내지 않음).

마커 MTS 20 및 24가 원시 상피 세포를 검출하는 것으로 가정되며 [Godfrey, et al., 1990], 추가적으로 나이든 흉선의 퇴화를 예시한다. 이들은 E14에 풍부하고, 4 내지 6주 된 마우스에서 단리된 수질 상피 세포 집단을 검출하지만, 나이든 흉선에서도 강도가 증가한다 (데이타는 나타내지 않음). 거세 후, 이들 모든 항원은 어린 성숙 마우스 흉선과 동등한 수준으로 발현되었고 (MTS 20 및 MTS 24 사용, 데이타는 나타내지 않음), 피질-수질 접합부에 존재하는 별개의 서브주머니로 되돌아간다.

(ii) 혈관-연관된 항원

혈액-흉선 장벽은 T 세포 전구체가 흉선으로 들어가는 것 및 성숙한 T 세포가 흉선으로부터 나와 말초부로 들어가는 것을 담당하는 것으로 여겨진다. MAb MTS 15는 흉선 혈액 혈관의 내피에 특이적이고, 구상의 확산 염색 패턴을 나타낸다 [Godfrey, et al., 1990]. 나이든 흉선에서 MTS 15 발현은 크게 증가하고, 증가된 혈관 빈도 및 크기 및 전혈관 공간을 나타낸다 (데이타는 나타내지 않음).

콜라겐, 라미닌 및 피브리노겐 등과 같은 중요한 구조적 및 세포 부착 분자를 함유하는 흉선의 세포외 매트릭스는 MAb MTS 16으로 검출된다. 정상적인 어린 마우스 흉선 전체에 분산되어 있는 MTS 16의 발현 특성은 나이든 흉선에서 보다 넓게 펼쳐지고 상호연결되게 된다. MTS 16의 발현은 거세 2주 후에 추가적으로 증가하지만, 거세 4주 후에는 이 발현이 2개월된 흉선의 상황을 나타낸다 (데이타는 나타내지 않음).

(ii) 공유 항원

MAb MTS 6으로 검출된 정상적인 어린 흉선에서 MHC II 발현은 피질 상피 상에서 매우 포지티브 (과립)하고, 수질 상피에서 약하게 염색된다 [Godfrey et al., 1990]. 나이든 흉선은 MHC II 발현의 감소를 나타내고, 상기 발현은 거세 2주 후에 실질적으로 증가한다. 거세 4주 후에는 발현이 다시 감소되고, 2개월된 흉선과 비슷하게 나타난다 (데이타는 나타내지 않음).

흉선세포의 이동

어린 마우스에서 약 1％의 T 세포가 매일 흉선으로부터 이동한다 [Scollay et al., 1980]. 본 발명자들은 이동이 14개월된 정상적인 어린 마우스와 동등한 비율로 심지어 생후 2년까지 일어나지만 (도 5), 그 수는 유의하게 (p ≤0.0001) 감소한다는 것을 발견하였다. 새롭게 흉선으로 들어오는 세포의 CD4 : CD8 비율은 2개월 된 경우의 약 3 : 1에서부터 26개월 된 경우의 약 7 : 1로 증가한다. 거세 1주 후, 말초부로 이동하는 세포수는 유의하게 증가하고, 이동의 전체적인 비율은 1 내지 1.5％로 일정하게 유지된다.

하기 실시예는 본 발명의 방법의 특정 실시예를 제공하지만, 본 발명을 그 내용으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

<실시예 1>

T 세포 고갈

잠재적 이식체 수용 환자에서 기존의 T 세포에 의한 이식체의 방해를 예방하기 위해, 환자의 T 세포를 고갈시켰다. 이 단계를 위한 한 표준 방법은 다음과 같다. 환자에게는 항-T 세포 항원으로서 매일 Atgam (이종 항-T 세포 글로불린, 파마샤 업존 (Pharmacia Upjohn) 제품) 15 mg/kg을 주사 형태로 T 세포 활성화 억제제인 시클로스포린 A 3 mg/kg와 함께 10일 동안 주사하였고, 필요하다면, 이어서 매일 9 mg/kg의 정제물을 3 내지 4주 동안 연속 주사하였다. 이러한 처치는 환자의 흉선에서 초기 T 세포 발생에는 영향을 주지 않았는데, 이는 인간 흉선의 크기 및 형태로 인해 이 같은 영향을 주기에 충분한 항체량이 전달될 수 없기 때문이다. 성 스테로이드가 소실될 수 있도록 상기 처치를 약 4 내지 6주 동안 지속한 후, 흉선을 재구성하였다. 또한, T 세포 제거를 증강시키기 위해서, T 세포 반응성의 저해를 인터루킨 또는 세포 부착 분자 등과 같은 2차 수준의 신호 억제제와 병용하여 사용할 수도 있다.

말초부에서의 T 세포 고갈은 이식 거부반응의 위험을 최소화시키는데, 이는 이것이 외래 공여자에 대해 잠재적으로 반응할 수 있는 것들을 포함한 모든 비특이적 T 세포를 고갈시키기 때문이다. 그러나, 동시에, 이 과정은 T 세포의 결핍으로 인해 일반화된 면역결핍 상태를 유도하는데, 이는 환자가 감염, 특히 바이러스 감염에 매우 민감해진다는 것을 의미한다. 적절한 T 세포의 도움 없이는 B 세포 반응도 정상적으로 기능할 수 없다.

<실시예 2>

성 스테로이드 절제 요법

LHRH-아고니스트의 전달 형태로 성 스테로이드 절제 요법을 환자에게 제공하였다. 이는 류크린 (Leucrin) (데포 주사; 22.5 mg) 또는 졸라덱스 (Zoladex, 삽입물; 10.8 mg) 형태로 주어지고, 이은 3개월 동안 유효한 단일 투여량이다. 이들은 성 스테로이드 수준을 감소시키는데 충분히 효과적이어서 흉선을 재활성화시킨다. 또한, 몇몇 경우, 성 스테로이드 절제 요법 동안 성 스테로이드의 부신 생산의 저해제, 예를 들어, 코수덱스 (Cosudex, 5 mg/일)를 매일마다 정제 한 개씩으로 전달하는 것이 필요하다. 성 스테로이드의 부신 생성은 인간 스테로이드의 약 10 내지 15％를 차지한다.

혈중 성 스테로이드가 최소치로 감소되는데는 약 1 내지 3주 소요되었고, 흉선의 재활성화도 이와 일치하였다. 어떤 경우에는, 처치를 제2의 3개월 주입/이식으로 연장할 필요가 있다.

<실시예 3>

별법의 전달 방법

LHRH-아고니스트의 3개월 데포 또는 이식체 투여 대신, 별법의 방법을 사용할 수 있다. 한 예에서, 환자의 피부를 Er : YAG 레이저와 같은 레이저로 조사하여 피부를 절제 또는 변경함으로써 각질층의 장애 효과를 감소시킬 수 있다.

A. 레이저 절제 또는 변경: 2개의 평평한 공명기 거울, 활성 매체로서 Er : YAG 결정, 전원 및 레이저 빔 초점 조절 수단으로 구성된 고체 상태의 펄스화 Er : YAG 레이저를 사용하여, 적외선 레이저 방사선 펄스를 형성하였다. 레이저 빔의 파장은 2.94 미크론이었다. 단일 펄스를 사용하였다.

작동 파라미터는 다음과 같았다: 펄스 당 에너지는 40, 80 또는 120 mJ이었고, 초점에서의 빔 크기를 2 mm로 하여 1.27, 2.55 또는 3.82 J/cm²의 에너지 플루언스를 생성하였다. 펄스 시간폭은 300 ㎲였고, 0.42, 0.85 또는 1.27 ×10⁴W/cm²의 에너지 플루언스를 생성하였다.

이어서, LHRH-아고니스트 임의량을 피부에 적용하고, 조사 부위 상에 펴발랐다. LHRH-아고니스트는 조사 부위 상에 잔류하도록 연고 형태일 수 있다. 임의로, 밀봉 패치 (occlusive patch)를 아고니스트 상에 두어, 이것을 조사 부위 상에 유지시킨다.

임의로 빔 분할기를 사용하여 레이저 빔을 분할하고, 복수개의 절제 또는 변경 부위를 생성한다. 이로써, LHRH-아고니스트가 피부를 통해 혈류로 더 빨리 유입된다. 부위의 수는 아고니스트를 환자의 계 내에 약 30일 동안 유지하도록 미리 결정할 수 있다.

B. 기압파 (Pressure Wave): 기압파가 생성될 부위에서, LHRH-아고니스트 임의량을 플라스틱 신축성 세척기 (직경, 약 1 인치; 두께, 약 1/16 인치)와 같은 적당한 용기에 담아 피부 상에 두었다. 상기 부위를 약 1 mm 두께의 흑색 폴리스티렌 시트와 같은 표적 물질로 덮었다. Q-스위칭된 고체 상태의 루비 레이저 (20 ns 펄스 지속, 펄스 당 2 J까지 생성 가능함)를 사용하여 레이저 빔을 발생시키고, 이 레이저 빔이 표적 물질과 충돌하여 1회의 임펄스 트랜지언트를 생성하게 했다. 흑색 폴리스티렌 표적은 레이저 방사선을 완전히 흡수하여, 피부가 레이저 방사선이 아닌, 임펄스 트랜지언트에만 노출되게 하였다. 이 과정으로 인한 통증은 없었다.아고니스트의 혈중 수준을 유지하기 위해, 상기 과정을 매일, 또는 요구되는 횟수만큼 반복할 수 있다.

<실시예 4>

공여자 세포의 투여를 통한 허용능의 생성

실제적으로, 공여자 혈액에서 조혈 간세포 (HSC)의 양을, 세포 수거 이전에 공여자에게 과립구-콜로니 자극 인자 (G-CSF) 10 ㎍/kg을 2 내지 5일 동안 주사함으로써 증진시켰다. CD34⁺공여자 세포를 공여자의 혈액 또는 골수로부터, 바람직하게는 유식 세포분석기 또는 면역자기 비이딩 (immunomagnetic beading)을 이용하여 정제하였다. 공여자 유래의 HSC는 유식 세포 분석에 의해 CD34⁺임을 확인하였다. 임의로, 이들 HSC를 간세포 인자로 생체외에서 증대시켰다. LHRG 아고니스트를 전달한지 약 1 내지 3주째, 흉선이 재생되기 직전 또는 재생 기간에 환자에게 공여자 HSC를, 최적으로는 약 2 내지 4×10⁶세포/kg의 투여량으로 주사하였다. 임의로, G-CSF를 수용자에게 주사하여 HSC의 증대를 보조할 수도 있다.

수용자의 HSC를 수용자형 T 세포 및 수상돌기 세포로 전환시키는 동안, 재활성화된 흉선은 정제된 SHC를 흡수하여 이들을 공여자형 T 세포 및 수상돌기 세포로 전환시켰다. 세포 사멸에 의해 결실을 유도함으로써, 또는 면역조절 세포를 통해 허용을 유도함으로써, 공여자 수상돌기 세포는 잠재적으로 수용자와 반응하는 임의의 T 세포를 허용할 것이다.

<실시예 5>

이식체의 이식

수용자가 여전히 지속적인 T 세포 고갈 면역억제 요법을 처치받고 있는 동안, 적어도 부분적으로 공여자 T 세포가 고갈된 기관, 조직 또는 세포군을 공여자로부터 수용 환자로 이식하였다.

LHRH 요법을 시행한지 약 3 내지 4주 이내에, 첫번째 새로운 T 세포가 수용자의 혈액에 나타날 것이다. 그러나, 숙주와 공여자 조혈세포의 안정한 키메라를 생성하기 위해서는 면역억제 요법을 약 3 내지 4개월 동안 유지하는 것이 바람직하다. 재활성화 흉선에 공여자와 숙주 둘 다의 DC가 존재하기 때문에, 새로운 T 세포에서는 잠재적인 공여자 반응성 세포 및 숙주 반응성 세포가 제거될 것이다. 숙주의 흉선 상피에 의해 포지티브 선별된 T 세포는 수용자의 말초 혈액에서 숙주 APC에 의해 표출된 펩티드를 인식함으로써 정상적인 감염에 반응하는 능력을 보유할 것이다. 공여자의 수상돌기 세포를 수용자의 림프양 기관에 혼입시키면, 공여자 세포, 조직 및 기관의 허용이 아니라, 숙주 단독의 면역계와 거의 동일한 면역계 상황이 확립된다. 따라서, 정상적인 면역조절 메커니즘이 존재한다.

<실시예 6>

별법의 프로토콜

공여자의 세포, 조직 또는 기관을 이식하는데 이용가능한 시간이 단축된 경우, 실시예 1 내지 5에 사용된 타임라인 (timeline)을 변경한다. T 세포 절제 및 성 스테로이드 절제를 동시에 시작할 수 있다. T 세포 절제를 약 10일 동안 유지하고, 성 스테로이드 절제를 약 3 개월 동안 유지했다. 이식체의 이식은, 바람직하게는 복합 처치를 개시한지 약 10 내지 12일 후에 흉선이 재활성화되기 시작할 때 수행한다.

훨씬 더 짧은 시간표에서, 절제 및 이식체 이식의 2가지 유형을 동시에 시작할 수도 있다. 이 경우, T 세포 절제는 바람직하게는 3 내지 12개월, 보다 바람직하게는 3 내지 4개월 유지된다.

<실시예 7>

면역억제의 종결

흉선 키메라가 확립되고 새로운 무리의 성숙 T 세포가 흉선을 떠나기 시작할 때, 환자로부터 혈액을 채취하고, T 세포를 표준 혼합 림프구 반응에서 공여자 세포에 대한 반응성의 결핍에 대해 시험관외 시험하였다. 반응이 없을 경우, 면역억제 요법을 점진적으로 감소시켜 감염에 대한 방어를 허용했다. 혈중 활성화된 T 세포의 존재에 의해 부분적으로 지시되는 것과 같은 거부의 징후가 없을 경우, 면역억제 요법을 최종적으로 완전히 종결했다. HSC는 강한 자기-부활능을 가지므로, 형성된 조혈 키메라는 이론적으로 환자 (정상의 비허용되고 비이식된 인간에 대한 경우)의 수명 동안 안정할 것이다.

<실시예 8>

인간의 흉선을 재활성화시키기 위한 LHRH-아고니스트의 사용

본 발명의 방법을 통해 인간의 흉선을 재활성화시킬 수 있음을 밝혀 내기 위해, 전립선 암에 대해 화학요법을 투여받았던 환자에 대해 상기 방법을 사용하였다. 성 스테로이드 절제 요법 전 및 4개월 후 전립선암 환자를 평가하였다. 결과를 도 23 내지 27에 요약하였다. 총괄하면, 데이타는 다수의 환자에서 T 세포의 상태가 질적 및 양적으로 개선되었음을 나타낸다.

림프구 및 그의 T 세포 아집단의 총 수에 대한 LHRH 요법의 영향

전립선 암에 대해 LHRH-아고니스트 처치 중인 환자 (모두 60세 초과임)에서 말초혈 림프구의 표현형 조성을 분석하였다 (도 23). LHRH-아고니스트 처치 전 및 처치 개시 4개월 후에 환자 샘플을 분석하였다. 모든 환자에 있어서 처치 전에 혈액 ml 당 총 림프구 세포 수는 대조치의 최하위 수치였다. 처치 후, 9명 중 6명의 환자는 총 림프구 수의 실질적인 증가를 나타내었다 (어떤 경우에는, 총 수의 2배 증가가 관찰되었음). 이와 일치하게, 9명 중 6명의 환자에서 총 T 세포수가 증가하였다. CD4⁺아집단에서, 이 증가가 훨씬 더 뚜렷하였고, 9명 중 8명의 환자가 CD4⁺T 세포 수준의 증가를 나타내었다. CD8⁺아집단에서는 덜 뚜렷한 경향이 관찰되었고, 9명 중 4명의 환자는 비록 CD4⁺T 세포보다 더 적은 정도이기는 하나 증가된 수준을 나타내었다.

T 세포 아집단 비율에 대한 LHRH 요법의 영향

LHRH-아고니스트 처치 전후 환자 혈액의 분석은 T 세포, CD4⁺또는 CD8⁺T 세포의 전반적인 비율에 실질적인 변화가 없었고, 처치 후 CD4⁺: CD8⁺비율에 가변적인 변화가 있었음을 나타내었다 (도 24). 이것은 처치 후 전반적인 T 세포수의 실질적인 증가에도 불구하고, T 세포 아집단의 항상성 유지에 대한 처치의 미미한 영향을 나타낸다. 모든 수치는 대조군의 수치와 비교한 것이었다.

B 세포 및 골수양 세포의 비율에 대한 LHRH 요법의 영향

LHRH-아고니스트 처치 중인 환자의 말초혈 내의 B 세포 및 골수양 세포 (NK, NKT 및 대식세포)의 비율을 분석한 결과, 아집단 내의 상이한 변화를 나타내었다 (도 25). NK, NKT 및 대식세포의 비율은 치료 후 비교적 일정하게 유지된 반면, B 세포의 비율은 9명 중 4명의 환자에서 감소하였다.

B 세포 및 골수양 세포의 총 수에 대한 LHRH-아고니스트 요법의 영향

처치 후 말초혈 내의 B 세포 및 골수양 세포의 총 세포수를 분석한 결과, NK (9명 중 5명), NKT (9명 중 4명) 및 대식세포 (9명 중 3명) 세포수가 분명하게 증가하였다 (도 26). B 세포수는 뚜렷한 경향을 보이지 않았고, 9명 중 2명은 증가된 수준을, 9명 중 4명은 어떠한 변화도 보이지 않았고, 9명 중 3명은 감소된 수준을 나타내었다.

기억 세포에 대한 고유 세포 수준에 대한 LHRH 요법의 영향

말초혈의 T 세포 집단에서 LHRH-아고니스트 처치 후 주요한 변화가 관찰되었다. 특히, 고유 (CD45RA⁺) CD4⁺세포의 비율이 선택적으로 증가하였고, CD4⁺T 세포 아집단에서 고유 (CD45RA⁺) 대 기억 (CD45RO⁺) 비율이 9명 중 6명의 환자에서 증가하였다 (도 27).

결론

따라서, 위축된 흉선을 갖는 인간과 같은 동물의 LHRH-아고니스트 처치는 흉선의 재활성화를 유도할 수 있다고 결론지을 수 있다. 성 스테로이드 절제 요법을 투여받은 전립선 암 환자에서 혈액 T 림프구의 상태가 일반적으로 개선됨이 관찰되었다. 상기 세포가 흉선으로부터만 유래되었는지 정확하게 결정하는 것은 매우 곤란하지만, 주류 (CD8 αβ쇄) T 세포의 다른 공급원이 기술되지 않았으므로, 이것이 논리적인 결론일 것이다. 위장관 T 세포는 주로 TCR γδ또는 CD8 αα 쇄이다.

참고문헌

Claims (18)

1. T 세포를 절제하는 단계,

   흉선을 재활성화시키는 단계, 및

   조혈 간세포, 상피 간세포, 전구 세포 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 세포들을 이식체 공여자로부터 환자에게 투여하는 단계

   를 포함하는, 미스매치된 (mismatched) 공여자로부터의 이식체에 대한 환자의 허용을 유도하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 환자의 흉선이 적어도 부분적으로 불활성화된 상태인 방법.
3. 제2항에 있어서, 환자가 사춘기 후 연령인 방법.
4. 제2항에 있어서, 환자가 환자의 흉선이 적어도 부분적으로 불활성화된 질환을 앓고 있거나 앓은 적이 있거나 또는 이러한 질환에 대한 치료를 받고 있거나 받은 적이 있는 환자인 방법.
5. 제3항에 있어서, 질환의 치료가 화학요법을 통한 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 공여자 조혈 간세포가 CD34⁺인 방법.
7. 제1항에 있어서, 조혈 간세포를 흉선이 재생되기 시작할 즈음 또는 그 직후에 제공하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 조혈 간세포를 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달이 파괴되기 시작할 즈음에 제공하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달을 파괴하는 방법이 외과술에 의한 거세를 통해 환자의 생식선을 제거하는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 성 스테로이드에 의해 매개되는 흉선으로의 신호전달을 파괴하는 방법이 1종 이상의 의약품 투여를 통한 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 의약품이 LHRH 아고니스트, LHRH 길항제, 항-LHRH 백신 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, LHRH 아고니스트가 유렉신 (Eulexin), 고세렐린 (Goserelin), 류프롤라이드 (Leuprolide), 디옥살란 (Dioxalan) 유도체, 트리프토렐린 (Triptorelin), 메테렐린 (Meterelin), 부세렐린 (Buserelin), 히스트렐린 (Histrelin), 나파렐린 (Nafarelin), 루테렐린 (Lutrelin), 류프로렐린 (Leuprorelin) 및 데슬로렐린 (Deslorelin)으로 구성된 군에서 선택된 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, LHRH 길항제가 아바렐릭스 (Abarelix)인 방법.
14. LHRH 유사체, 및 이식체의 공여자로부터 유래한 일군의 간세포 또는 전구 세포를 포함하는, 환자에서 이식체의 수용능을 개선시키기 위한 킷트.
15. 제14항에 있어서, LHRH 유사체가 1종 이상의 LHRH 아고니스트, 1종 이상의 LHRH 길항제 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것인 킷트.
16. 제14항에 있어서, 간세포 또는 전구 세포가 조혈 간세포, 상피 간세포 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것인 킷트.
17. 제14항에 있어서, 사이토킨을 더 포함하는 킷트.
18. 제17항에 있어서, 사이토킨이 인터루킨 7, 간세포 인자, 인터루킨 2, 인터루킨 15, 과립구 콜로니 자극 인자, 각질세포 성장 인자 및 이들의 조합물로 구성된 군에서 선택된 것인 킷트.