KR20040016954A - 광합성 세균의 고정화 방법 - Google Patents

광합성 세균의 고정화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 광합성 세균의 고정화 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 고농도의 광합성 세균을 함유하는 배양액 1∼99%(v/v)에 1∼10% 알지네이트 분말 수용액을 1∼99%(v/v)로 혼합 교반한 후 담체를 형성시킴으로써 고농도의 광합성 세균 균체를 고정화시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에 따르면, 고농도의 광합성 세균 균체를 경제적 및 효율적으로 사용할 수 있고, 미관상 또는 수질상 나쁜 영향을 주지 않으면서, 수족관의 수질을 깨끗하고 안정하게 할 뿐 아니라, 수족관 물의 교체 빈도를 줄여 물의 낭비도 줄일 수 있는 장점이 있다.

Description

광합성 세균의 고정화 방법{Method for immobilizing photosynthetic bacteria}
본 발명은 광합성 세균의 고정화 방법에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 고농도로 순수 배양된 광합성 세균과 갈조류로부터 추출한 수용성 알지네이트(Alginate)를 혼합한 후 이를 구형의 겔로 형성시켜 광합성 세균을 고정화시키는 방법에 관한 것이다.
각종 관련분야에서 주로 사용되고 있는 광합성 세균으로는 로도박터 캡슐라타(Rhodobacter capsulata), 로도박터 스페로이드에스(Rhodobacter shpaeroides)등이 있으며, 상기 광합성 세균은 일반적으로 호기암 또는 혐기명의 어느 한 조건 또는 병합된 조건에서도 증식이 모두 가능하고, 질소 고정능도 가지고 있다.
또한, 광합성 세균은 양식, 축산사료의 첨가제, 유기질 비료의 기능 개선제, 단세포 단백질, 유용물질 생산 및 폐수처리 등에 광범위하게 이용되고 있는 균주로서, 특히, 수질 및 기타 환경 오염방지, 오염정화의 목적으로 널리 이용되고 있다.
광합성 세균은 수중의 다른 유익균의 증식을 도우며 수조 내의 각종 사료찌꺼기와 어류의 배설물 등의 유기 오염물을 분해 시킨다. 또한 어류가 광합성 세균을 섭취하게 되면, 광합성 세균이 어류의 장내에서 황화수소나 암모니아와 같은 유해가스 성분을 제거하고 다른 장내 유익 세균의 증식을 도와주기 때문에 어류건강에 도움을 준다.
광합성 세균의 균체는 풍부한 단백질 함량, 균등하게 함유된 필수 아미노산 등의 이상적인 영양원으로서 어체를 튼튼하게 하며, 균체에 함유된 많은 비타민과 생리 활성물질은 어류의 내병성을 높인다. 광합성 세균의 균체에 다량으로 축적된 홍색색소는 어류가 광합성 세균을 먹었을 경우 어체에 축적되어 어류의 색을 좋게 한다.
광합성 세균이 환경오염 방지 또는 정화의 목적으로 사용될 경우에는, 광합성 세균을 배양후 액상으로 포장하거나, 또는 현장에서 배양하여 액상으로 사용되고 있었으나, 이러한 액상 형태의 광합성 세균제품은 유통기간이나 사용기간 중 광합성 세균의 사멸율이 높아져 효율성이 떨어지고, 부패가 진행되어 악취가 심하게 발생하는 등, 유통 또는 보관 중에 쉽게 품질이 저하되고 악취가 발생하는 문제점이 있다. 또한, 소비자가 5∼10일 주기로 지속적으로 액상제품을 투입해야 하는 번거로움과 함께 수조 내에 광합성 세균의 수를 일정하게 유지시키지 못하는 단점이있다.
상기 액상 제품의 문제점을 해결하기 위해, 겔을 이용한 균체의 고정화 방법이 개발되어 지고 있다.
일본 특개소 제60-202794호는 미생물의 고정화 균체를 이용하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 특허에서는 배양한 미생물 배양액을 고정화시킨 후에, 고정화 담체내부에 있는 미생물의 농도를 높이기 위해, 일정한 설비와 조건, 30℃ 온도와 조도에서 약 10일 정도 2차 배양한 후 사용한 것을 특징으로 하고 있어, 제2차 배양을 위한 일정한 설비와 배양을 필요로 하며, 배양도중 2차 오염 가능성이 있어 미생물 고정화 균체의 제조와 활용에 어려움이 있었다.
한국 등록특허 제100912호는 상기 문제점을 해결하고, 경제적 및 효율적으로 균체를 고농도로 유지하여 사용할 수 있도록, 고농도 광합성 세균과 수용성 규산나트륨을 혼합하여 겔을 형성시켜 광합성 세균을 고정화하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 규산나트륨을 이용하여 광합성 세균을 고정화할 경우 제조 과정이 고정된 틀을 사용해서 제조해야 하는 한정성과 제조 후 제품 유통과정 중 파손으로 인해 그 가치가 떨어진다는 문제점과 공정상 수소이온지수(pH 10 ∼ 12)로 인해 광합성 세균의 활성이 저해되는 문제점을 가지고 있다. 또한 규산나트륨은 어독성, 무척추 동물 독성과 해조류 독성을 지니고 있으며 유해성 분류에도 보건 2등급으로 되어 있다.
전술한 문제점을 극복하기 위해 고농도의 광합성 세균 균체를 경제적 및 효율적으로 사용할 수 있으면서, 미관상 또는 수질상 나쁜 영향을 주지 않는 고정화균체의 개발이 계속적으로 요구되어 지고 있다.
이에 본 발명에서는 갈조류로부터 추출한 수용성 알지네이트가 독성이 없고 2차 오염도 없을 뿐 아니라, 저장 및 보관 중에 미생물 등의 반응에 의한 변질될 가능성이 다른 재료보다 낮고, 일정시간이 지난 후에는 물에 완전히 용해될 수 있다는 점에 착안하여, 이를 이용하여 담체를 형성시킴으로써 고농도로 순수 배양된 광합성 세균을 고정화시켰다. 상기 알지네이트 담체는 미관상 또는 수질상 나쁜 영향을 주지 않으면서, 광합성 세균이 오랫동안 사멸하지 않고 안정되게 활성을 유지시킬 수 있었고, 상기 담체를 수족관 등의 여과기에 충진 시키거나 그물망등을 사용하여 수조 내 직접 설치할 경우, 광합성 세균이 담체에서 일정한 속도로 용출되어 나와 장기간에 걸쳐 수질을 정화시킬 수 있었으며, 본 발명은 이에 기초하여 완성되었다.
따라서 본 발명의 목적은 고농도의 광합성 세균 균체를 경제적 및 효율적으로 사용할 수 있고, 미관상 또는 수질상 나쁜 영향을 주지 않는 광합성 세균의 고정화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은 고농도로 배양한 광합성 세균을 함유하는 배양액 1∼99%(v/v)에 1∼10% 알지네이트 분말 수용액을 1∼99%(v/v)로 첨가시켜 교반한 후 0.01∼2㏖의 CaCl2수용액에 적하하여 담체를 형성시키는 것으로 구성된다.
도 1은 시간에 따른 수족관 내 수질의 NH3-N 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 시간에 따른 수족관 내 수질의 NO3-N 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 시간에 따른 수족관 내 수질의 NO2-N 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명의 방법을 좀 더 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
먼저, 수질정화 능력이 뛰어난 고농도의 광합성 세균 균체를 제조하기 위해, 예를 들어, 배지 1ℓ당 KH2PO4및 K2HPO4각 0.5g, MgSO4·7H2O 0.2g, CaCl2·2H2O 0.053g, 효모추출물 2.0g, 트립톤 1.0g, 초산소다 1g, MnSO4·5H2O 1.2×10-3g, 구연산철 2.5×10-3g, CoCl2·6H2O 1×10-3g, 니코틴산 1×10-3g, 염산티아민 1×10-3g 및 비오틴 4×10-5g으로 이루어진 스크린(screen)용 배지 10㎖를 100㎖용 플라스크에 주입하고, 토양 또는 연못에서 채취한 시료를 약간 첨가시킨 후, 플라스크의 기체층을 질소 가스로 치환 충전시킨 다음, 26∼35℃, 및 1,800∼2,200룩스(lux)의 조건 하에서 수일간 배양시킨다. 상기 배양된 배양액을 페트리디쉬(petridish)의 평판 배지에 도말 및 배양시켜 형성된 모노 콜로니(mono colony)를 분리시킴으로써 광합성 세균을 얻는다.
상기 광합성 세균을 스크린용 배지에 (NH4)2HPO40.8g 및 글루탐산소다 3.4g을 첨가시킨 기초배지에 접종시킨 후 공기 공급량 20∼60ℓ/min, 교반속도 70∼200rpm, 온도 26∼35℃, 용존산소 0.1∼5ppm의 호기암 조건 하에서 산업용 발효기를 이용하여 고농도의 광합성 세균 균체를 24∼40시간 순수 조건 배양시킴으로써, 고농도의 광합성 세균 균체를 함유하는 배양액을 제조한다.
본 발명에 사용가능한 질소원은 효모추출물, 트립톤, 인산암모늄 또는 글루탐산소다 등이고, 비타민으로는 니코틴산, 염산티아민 또는 비오틴 등이 사용될 수 있으며, 무기질로는 황산마그네슘 또는 염화칼슘이 사용될 수 있고, 미량 원소로는 황산망간, 구연산철 또는 염화코발트 등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 광합성 세균은 환경오염 방지, 정화시설 또는 자연계의 일정지역, 예를 들어, 각종 수계, 인공 또는 천연담수, 해수호 또는 이를 이용한 위락 또는 생산시설의 오염방지 목적으로 사용될 수 있다.
고농도의 광합성 세균의 고정화 균체는 상기 제조된 고농도의 광합성 세균 균체를 함유하는 배양액 1∼99%(v/v)에 1∼10% 알지네이트 분말 수용액을 1∼99%(v/v)로 교반시킨 다음, 0.01∼2㏖의 CaCl2수용액에 적하하여 담체를 형성시켜 얻을 수 있다.
상기 수용성 알지네이트로는 알긴산 나트륨, 알긴산칼륨, 또는 알긴산 칼슘 등이 바람직하며, 이의 농도가 1% 미만이면 담체가 형성되지 않아 비정형으로 형성되는 문제점이 있고, 10%를 초과하면 담체의 경도가 높아져 고정화된 균체의 용출이 잘 안되며, 담체의 형성도 균일적으로 이뤄지지 않는 문제점이 있다.
상기 담체로 이용되는 수용성 알지네이트는 광합성 세균을 혼합 고정화시키는 고정화 재료로써, 갈조류로부터 추출한 천연물질이고, 독성이 없어 인체나 어류에 무해하며, 2차 오염이 없다. 또한, 저장 및 보관 중에 미생물 등의 반응에 의한변질의 가능성이 다른 재료보다 낮은 특징이 있다.
한편, 본 발명에 따르면, 고농도의 광합성 세균 배양액를 수용성 알지네이트 분말과 혼합시킨 다음, 알지네이트 수용액과 CaCl2수용액의 2가 양이온의 교환으로 광합성 세균 균체를 고정화하기 위하여 0.01∼2㏖의 CaCl2수용액에 적하하여 담체를 형성시킨다.
상기 CaCl2수용액에서 CaCl2의 농도가 0.01㏖ 미만이면 광합성 세균 균체를 고정화할 수 있는 담체를 형성시킬 수 없으며, 2㏖을 초과하면 알지네이트 수용액의 전자포화도를 다량 초과하므로 경제성이 없다.
이와 같이 제조된 본 발명의 알지네이트 담체는 시간이 지남에 따라 조금씩 와해되어 일정시간이 지난 후에는 물에 완전히 용해되므로 미관상 또는 수질상으로 나쁜 영향을 주지 않는다. 또한, 광합성 세균이 오랫동안 사멸하지 않고 안정되게 활성을 유지할 수 있도록 도와준다. 알지네이트가 수용성이기 때문에, 시간이 경과함에 따라 여과기 내의 물의 흐름에서 광합성 세균이 일정하게 용출되어 수질정화 작용을 하게 된다. 따라서, 본 발명의 고정화 균체의 사용은 수족관의 수질을 깨끗하게 유지시킬 수 있으며, 어류의 건강에도 도움을 줄 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 알지네이트 담체에 고정화된 광합성 세균을 소비자가 이용할 경우, 액상 제품을 사용함으로써 야기되는 악취 발생, 제품내에서 오염균의 증식 그리고 균체의 자연 침강으로 인한 부패를 배제할 수 있으며, 여과기에 1회 충진으로 30일 이상의 지속적인 효과가 있고, 광합성 세균 고정화 담체를 재 충진할 경우 수질정화효과가 3개월 이상 지속되므로 수족관 물의 교체 빈도를 줄여 물의 낭비도 줄일 수 있는 장점이 있다.
이하, 실시예 및 비교예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 살펴보지만, 하기 예는 본 발명의 범주가 한정되는 것이 아니다.
본 발명의 광합성 세균의 고정화 균체와 시중에서 시판되고 있는 광합성 세균 배양액의 보존성 및 수질 정화 능력을 비교 분석하였다.
실시예 1
광합성 세균의 고정화 균체의 보존액 내에서의 저장성 측정
공기 공급량 45ℓ/min, 교반속도 150rpm, 온도 30℃의 호기암 조건 하에서, 로도박터 캡슐라타를 (NH4)2HPO40.8g 및 글루탐산소다 3.4g을 스크린용 배지에 첨가시킨 기초 배지에 종배양시켰다. 그런 다음, 용량이 150ℓ이고 pH조절기가 부착된 산업용 발효기에 기초배지 120ℓ를 넣고 살균한 후, 종배양된 광합성 세균배양액을 5%(v/v)가 되게 접종시킨 후 호기암 조건 하에서 38시간 동안 배양시켰다. 배양에 요구되는 적정 pH는 산업용 발효기에 연동된 pH조절기의 상한 설정치를 6.8∼7.4로 설정함으로써 적정 pH를 유지하되, 배양 도중에 기질의 소모에 의해 pH가 상승되면 pH조절기에 의해 초산용액이 공급되어 pH가 조절되도록 하고, 기질공급도 동시에 이루어지도록 하였다. 상기 배양시킨 배양액을 용적비율로 50%로 하고, 여기에 6%의 알지네이트 분말 수용액을 50%의 용적비로 첨가 및 교반하여 담체를 형성시켜 고농도의 광합성 세균의 고정화 균체를 얻었다.
상기 고정화 균체를 증류수 1ℓ에 KH2PO4및 K2HPO4각 0.5g, MgSO4·7H2O 0.2g, CaCl2·2H2O 0.053g, 효모추출물 2.0g, 트립톤 1.0g, 초산소다 1g, MnSO4·5H2O 1.2×10-3g, 구연산철 2.5×10-3g 및 CoCl2·6H2O 1×10-3g으로 이루어진 보존액에 넣어 6개월 동안 각각 실온(20℃)과 저온(4℃)의 조건 하에서 보관하였다. 6개월간 15일씩 진행된 저장 샘플은 외부 인자로부터의 영향을 피하기 위해 각기 다른 용기에 저장하였다. 저장 기간 동안의 생존율 측정은 시료에서 10개의 고정화 담체를 꺼내어 0.1㏖의 CaCl2용액으로 세척한 다음, 10진 희석하여 평판배지에 도말한 후, 생성된 콜로니(colony)를 계수하여 생존율로 산정하였으며, 이의 결과를 하기 표 1(실온) 및 표 2(저온)에 각각 나타내었다.
실시예 2
광합성 세균의 고정화 균체의 증류수 내에서의 저장성 측정
실시예 1과 같은 방법으로 제조된 광합성 세균의 고정화 균체를 보존액이 아닌 증류수에 넣어 보관하였고, 저장성 측정은 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 이의 결과를 하기 표 1(실온) 및 표 2(저온)에 각각 나타내었다.
비교예 1
시판되고 있는 고정화 균체의 저장성 측정
시중에서 판매되고 있는 광합성 세균 배양액 제품을 6개월간 그대로 보관하였고, 저장성 측정은 광합성 세균의 생체 균수를 대상으로 하여 10진 희석을 통해 적절하게 희석한 후 페트리디쉬의 평판 배지에 도말 및 배양하여 생성된 콜로니를 계수하여 생존율로 산정하였으며, 이의 결과를 하기 표 1(실온) 및 표 2(저온)에 각각 나타내었다.
실온(20℃) 저장 기간 중 광합성 세균의 생균수와 생존율
초기 1개월 2개월 3개월 4개월 5개월 6개월
실시예 1 생균수 2.62×1010 2.60×1010 1.10×1010 9.60×109 6.90×109 2.60×109 9.70×108
생존율 100 99.2 42.0 36.6 26.3 9.9 3.7
실시예 2 생균수 2.62×1010 1.90×1010 9.80×109 8.10×109 2.10×109 9.15×108 1.20×108
생존율 100 72.5 37.4 30.9 8.0 3.5 0.5
비교예 1 생균수 1.01×109 1.20×108 1.20×106 - - - -
생존율 100 11.9 0.1 - - - -
* 생균수(cfu/ml), 생존율(%)
저온(4℃) 저장 기간 중 광합성 세균의 생균수와 생존율
초기 1개월 2개월 3개월 4개월 5개월 6개월
실시예 1 생균수 2.62×1010 2.57×1010 2.15×1010 2.17×1010 1.87×1010 1.50×1010 1.23×109
생존율 100 98.1 82.1 82.8 71.4 57.3 46.9
실시예 2 생균수 2.62×1010 1.89×1010 1.51×1010 1.40×1010 1.17×1010 9.80×109 5.10×109
생존율 100 72.1 57.6 53.4 44.7 37.4 19.5
비교예 1 생균수 1.01×109 6.05×108 4.00×108 2.40×108 6.80×107 1.92×106 9.92×105
생존율 100 60 39.7 23.8 6.7 0.2 0.1
* 생균수(cfu/ml), 생존율(%)
실시예 3 및 비교예 2
수족관 수질 정화 능력 측정
측면 여과기가 설치된 45ℓ의 수조 3개에 양어 100마리를 각각 넣고, 하나의 수조에는 실시예 1의 고정화 균체를 여과기에 충전시켰으며(실시예 2), 다른 수조에는 10일 간격으로 고농도로 순수 배양된 광합성 세균을 투여하였고(비교예 3), 또 다른 수조에는 스폰지 여재만을 설치하였다(대조구). 각 수조의 수질에 대해 NH3-N, NO3-N, NO2-N 및 양어의 사망개체수를 2일 간격으로 총 50일 동안 측정하였다.
NH3-N, NO3-N 및 NO2-N의 측정은 HACH사의 DR-2000을 사용하여, NITROGEN AMMONIUM 법, NITRITE; LR 법 및 NITRITE; HR 법으로 각각 측정하였다.
또한, 양어 사육시 사망 개체는 즉시 수거하였으며, 그 개체수에 해당하는 새로운 양어를 수조에 보충해 주었다.
이에 대한 결과를 하기 표 3 및 도 1 내지 3에 각각 나타내었다.
수족관내 양어의 사망 개체수 비교
수조/시간(days) 1∼10 11∼20 21∼30 31∼40 41∼50 사멸율(%)
대조구 1 - 2 - 2 5
비교예 2 - 1 - - 1 2
실시예 3 - 1 - - - 1
결과
1. 저장성
상기 표 1 및 2를 통해 알 수 있는 바와 같이, 6개월간 실온과 저온에서 보관하면서 각 시료의 생균수와 생존율을 측정한 결과, 광합성 세균을 수용성 알지네이트 담체에 고정화 시킨 후 수용액 상에 침지시켜 보관한 것이 단지 광합성 세균 배양액만을 저장한 것 보다 생존율 유지에 있어서 우수하게 나타났다. 또한, 증류수에 침지한 것 보다는 보존액서의 생존율이 우수하였으며, 저장 온도 또한 실온보다 저온에서의 저장이 6개월 후에도 50% 이상의 생존율을 나타냈다.
2. 수질정화 능력
도 1 내지 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 대조구의 경우, 시험 시작일로부터 종료일까지 50여일 동안 NH3-N, NO3-N 및 NO2-N의 제거가 거의 이뤄지지 않음을 알 수 있다. 반면, 광합성 세균 배양액을 넣은 비교예 2의 경우, 투입시기에 따라 NH3-N, NO3-N 및 NO2-N가 제거됨이 나타났지만, 그 효과가 지속적이지 못하며, 투입시 광합성 미생물 특유의 냄새가 발생함과 동시에 수색이 붉어지는 것을 볼 수 있었다. 본 발명의 방법에 따라 수용성 알지네이트를 이용하여 광합성 세균을 고정화시킨 담체를 여과기에 충진시킨 실시예 3의 경우, 10여일을 시점으로 꾸준한 제거율을 보였으며, 종료 50일째가 되어서는 NH3-N의 제거율이 100%에 달하는 것을 볼 수 있었다. 또한 NO3-N 및 NO2-N의 경우도 시간의 경과에 따라 감소되는 것을 볼 수 있었다. 실시예 3은 대조구 및 비교예 2의 수질에서 NH3-N, NO3-N 및 NO2-N의 변화와 비교하였을 때 탁월한 정화효과를 나타냄을 알 수 있었다.
또한, 표 3을 통해 알 수 있는 바와 같이, 사육 양어의 활력 또는 사망개체수를 측정한 결과, 대조구의 양어 활력이 좋지 못하였으며, 초기 100마리에 5%에 해당하는 개체수가 사망했다. 반면, 비교예 2 및 실시예 3의 양어는 체색이 좋았을 뿐 아니라, 활력이 우수하였으며, 사망 개체수도 각각 2%, 1%로 안정적으로 나타났다. 이는 수질이 안정적이지 못한 경우에 양어의 사망이 발생하며, 수질이 안정적으로 유지될 때 양어의 활력과 개체유지가 잘 되는 것으로 보여진다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 수용성 알지네이트를 이용한 광합성 세균의 고정화 균체는 독성이 없고, 2차 오염이 없으며, 미관상 또는 수질상으로 우수할 뿐 아니라, 제품 사용시 악취가 나지 않고, 장기간에 걸쳐 수질을 정화할 수 있기 때문에 수족관의 수질을 깨끗하게 유지할 수 있으며, 어류의 건강에도 도움을 줄 수 있어 광합성 세균 균체를 경제적 및 효율적으로 사용할 수 있다. 또한, 수족관 물의 교체 빈도를 줄여 물의 낭비도 줄일 수 있는장점이 있다.
본 발명의 고정화 균체는 관상용 양어 또는 양식장 양식어에 있어 수질 중 문제가 되는 암모니아성 질소를 포함한 물질의 처리에 매우 효과적이며, 그 밖의 다양한 분야에서도 적용 될 수 있다. 예를 들면 질소를 과량 함유하는 도시하수, 축산폐수, 양식수, 고농도의 유기성 물질을 함유하는 식품공장폐수 등의 폐수처리에 적용하면 미생물에 의한 유기물질과 수질정화의 효과가 동시 처리가 가능하다.

Claims (3)

  1. 광합성 세균의 고정화 방법에 있어서,
    고농도로 배양한 광합성 세균을 함유하는 배양액 1∼99%(v/v)에 1∼10% 알지네이트 분말 수용액을 1∼99%(v/v)로 첨가시켜 교반한 후 0.01∼2㏖의 CaCl2수용액을 적하하여 담체를 형성시키는 것을 특징으로 하는 광합성 세균의 고정화 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 광합성 세균은 호기암 조건 하에서 초산염을 주탄소원으로 한 배지 또는 초산염 및 프로피온산염을 함유한 배지에서 고농도로 배양된 것을 특징으로 하는 광합성 세균의 고정화 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 알지네이트 분말이 알긴산 나트륨, 알긴산 칼륨, 또는 알긴산 칼슘인 것을 특징으로 하는 광합성 세균의 고정화 방법.
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