KR20040002905A - 세포내 세균으로부터 단백질을 동정하는 방법 - Google Patents

세포내 세균으로부터 단백질을 동정하는 방법 Download PDF

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브라이언 베르그 반달
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Abstract

본 발명은 분비 경로와 무관하게 세포내 세균으로부터 분비된 단백질을 동정할 수 있게 해주는 신규한 병용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에 의해 동정된 단백질을 제공한다. 분비 단백질은 면역원성 조성물에 봉입시킬 용도 및/또는 진단 용도에 적합한 후보물질인 것으로 공지되어 있다. 또한, 본 발명은 동정된 분비 단백질로부터의 펩티드 에피토프 (T-세포 에피토프) 뿐만 아니라 이러한 단백질을 엔코딩하는 핵산 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적 응용 및 진단적 응용과 같은 단백질 또는 이의 단편의 다양한 응용을 포함한다.

Description

세포내 세균으로부터 단백질을 동정하는 방법 {METHOD FOR IDENTIFICATION OF PROTEINS FROM INTRACELLULAR BACTERIA}
본 발명은 분비 경로와 무관하게 세포내 세균으로부터 분비된 단백질을 동정할 수 있게 해주는 신규한 병용 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 방법에 의해 동정된 단백질을 제공한다. 분비 단백질은 면역원성 조성물에 봉입시킬 용도 및/또는 진단 용도에 적합한 후보물질인 것으로 공지되어 있다. 또한, 본 발명은 동정된 분비 단백질로부터의 펩티드 에피토프 (T-세포 에피토프) 뿐만 아니라 이러한 단백질을 엔코딩하는 핵산 화합물을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적 응용 및 진단적 응용과 같은 단백질 또는 이의 단편의 다양한 응용을 포함한다.
클라미디아 (Chlamydia)는 편성 세포내 세균으로서, 진핵 숙주 세포 내부에서 증식하는 중요한 사람 병원체이다. 클라미디아목은 하기 4가지 종으로 분류되는 하나의 속 (Chlamydia)을 함유하는 하나의 과 (Chlamydiaceae)를 포함한다: 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 시타씨 (Chlamydia psittaci) 및 클라미디아 페코룸 (Chlamydia pecorum).
클라미디아 트라코마티스의 사람 병원체 혈청형변이주는 안구 질환을 일으키는 A 내지 C; 성적 접촉으로 전파되어 요도염 또는 합병증, 예를 들어 난관염, 부고환염 및 자궁외임신을 일으키는 D 내지 K; 및 성병성 림프육아종 (LGV)과 같은 중증 전신성 감염을 일으키는 L1 내지 L3으로 분류된다. 사람 병원체인 클라미디아 뉴모니애는 기관지염 및 뉴모니애를 일으키는 기도 감염을 초래하고, 최근에는 아테롬성 동맥경화증의 발생과 관련되어 왔다 (Saikku et al, 1988[1.], Shor et al, 1992[2.]).
치료되지 않은 경우, 클라미디아 감염은 만성이 되어, 불임, 실명 및 잠재적으로 혈전증과 같은 심각한 합병증을 동반할 수 있다.
세포내 발생 주기로 인해, 지속성 클라미디아 감염은 비정상적 면역 반응을 일으켜서, 유기체를 정화할 수 없게 한다. 다수의 면역원성 클라미디아 단백질이 백신 후보물질로서 고려되어 왔는데, 특히 클라미디아 트라코마티스에서 면역지배적인 주요 외막 단백질 (MOMP)과 같은 표면 노출 단백질 [7.] 뿐만 아니라 Hsp60과 같은 스트레스 반응 단백질 [8.]이 있다. 그러나, 이러한 후보물질 중 어느 하나도 백신 실험에서 효율적인 것으로 입증되지 않았다.
제한된 체액성 반응 및 미비한 방어 면역에 대한 알맞은 설명은 유기체의 세포내 특성이다. 따라서, 대안적인 방법은 세포 매개성 면역계에 의해 인식되는 단백질을 찾아내는 것인데, 이는 주로 세포독성 T-림프구 (CTL)의 작용을 통해 클라미디아 감염을 해결하는 데에 중추적인 것으로 밝혀졌다 (Iguitseme et al 1994 [9.]).
분비 단백질이 크게 주목을 받아왔는데, 이는 이러한 단백질이 숙주 세포 프로테아좀에서 프로세싱되어 세포의 표면상에서 MHC 클래스 I 항원으로서 제시됨으로써 명백한 백신 표적을 나타내기 때문이다 (Hess 및 Kaufmann, 1993 [45]). 이의 한 가지 예가 예르시니아 (Yersinia) 감염된 세포에 대해 제시되었는데, 이는 YopH 이펙터의 에피토프를 MHC 제한된 세포독성 T-림프구 (CTL)에 제시한다 (Starnbach & Bevan, 1995 [14.]). 클라미디아 및 숙주 세포 사이의 상호작용은 세포내 생존 및 세균의 전파를 위해 필수적이다.
완전하고 검색가능한 클라미디아 게놈이 클라미디아 트라코마티스 혈청형변이주 D (Stephens et al, 1998[4.]) (894개의 예측된 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함함) 및 클라미디아 뉴모니애 VR1310 (1073개의 ORF를 포함함)에 대해 존재한다 (Kalman et al 1999[5.]). 또한, 클라미디아 트라코마티스 MoPn (Read et al, 2000 [12.]), 클라미디아 뉴모니애 AR39 (Read et al[12.]) 및 클라미디아 뉴모니애 J128 (Shirai et al 2000 [13.])의 완전한 게놈은 공개적으로 입수할 수 있다. 게놈 서열로부터, 클라미디아가 그 밖의 유기체로부터의 타입 III 분비 유전자와 상동인 다수의 유전자를 포함하는 분비 메커니즘에 관여하는 유전자를 지닌다는 것이 알려졌다 (Stephens et al., 1998[4.] 및 Kalman et al., 1999 [5.]).
분비된 이펙터 단백질에 대한 후보물질은 타입 III 분비 서브클러스터에 존재하는 것으로 여겨진다 (Subtil et al., 2000) [10.]. 이러한 견해는 CopN의 타입 III 분비 특성의 발견에 의해 최근에 대두되었다 (Fields & Hackstadt 2000) [11.]. 그러나, 타입 III 분비 단백질은 인식가능한 시그날 펩티다아제 절단 부위가 없고, 클라미디아에서 이러한 시스템에 의해 분비된 단백질에 대한 컨센서스 서열이 인식되지 않았는데, 이러한 것들은 당해 특정 유기체로 제한될 수 있다. 더욱이, 분비 단백질은 게놈의 예측불가능한 위치에 존재하는 기능적으로 다양한 군의 단백질일 수 있다 (Subtil, 2000) [10.].
분비된 클라미디아 이펙터 단백질에 관한 현재의 지식 상태는 Inc 족의 구성원을 포함하는 봉입 막에 존재하는 단백질로 제한된다 (Rockey et al. 1995)[15.][16], CopN (Fields & Hackstadt, 2000[11.]) 및 CT529 (Fling et al, 2001)[37.].
클라미디아에 특이적인 CD8+ T-세포는 감염 도중에 발생하는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 클라미디아 단백질이 숙주 세포 원형질에 노출됨을 의미하며, 이는 MHC 클래스 I 항원의 제시를 위한 필요조건이다. CT529는 진핵 세포에서의 발현 및 클라미디아 특이적 T-세포주에 의한 인식에 의해 게놈 라이브러리로부터 동정되었다 (Probst) [41]. CT529는 마우스 백신 실험에서 감염에 대해 약간의 방어를 제공하는 에피토프를 함유하는 것으로 밝혀졌다.
바이러스 벡터로 형질감염시킴으로써 게놈성 클라미디아 트라코마티스 혈청형변이주 L2 라이브러리를 진핵 세포에서 발현시킨 후, MHC 클래스 I 제한된 에피토프를 포함하는 단백질을 검출하기 위해 클라미디아 특이적 T-세포로 스크리닝하는 것은 국제 특허 출원 WO 00/34483에 기재되어 있다 (Probst) [41]. 이러한 방법은 5개의 포지티브 클론을 동정해주었는데, CT529는 이러한 클론 중 하나에 함유되어 있었고, 또 다른 클론은 3개의 오픈 리딩 프레임을 함유하였지만, 나머지 3개의 클론은 추가로 설명되지 않았다. 이러한 스크리닝의 결점은 세균 단백질의 진핵생물성 발현이 프로테아좀에서의 프로세싱의 확률 및 MHC 항원으로서의 제시를변경시키는 방식으로 세균성 발현과 달라질 수 있고, T-세포 클론의 유지 및 자극이 생체내 환경과 다르고, 정상 감염 동안 이용할 수 없는 클론 인식 단백질이 허위 포지티브를 발생시킬 수 있다는 것이다. 상기 특허 출원에 기재되는 그 밖의 방법은 체액성 면역 방어에 대한 백신을 위한 후보물질을 동정하는 것에 관한 것이다.
세포내 세균으로부터 분비되는 단백질을 탐색하는 경우, 직선적인 관념은 감염된 숙주 세포로부터 원형질을 단리하여 세균 단백질을 찾아낸다는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 클라미디아 망상체의 취약성으로 인해 클라미디아에 대해서는 이용될 수 없다. 또 다른 방법은 종종 분비 단백질인 병원성 인자를 트랜스포존 분석에 의해 동정하는 것이다. 그러나, 클라미디아를 형질감염시키는 것은 가능하지 않다. 어떠한 단백질이 분비되는 지와 백신 개발에 적합한 이펙터 단백질을 엔코딩하는 유전자가 게놈의 예측불가능한 위치에 존재할 수 있는지를 예측할 수 있는 방법은 존재하지 않는다.
따라서, 비용 효율적인 방법으로 백신 후보물질의 수를 제한할 수 있으며 최소 실험 단계를 포함하는 신뢰할 만한 시스템이 필요하다.
[18]에서, IFN-γ클라미디아 트라코마티스 A 및 L2 단백질 발현의 효과가 2D-겔 전기영동 후에 자동방사선사진법과 함께 클라미디아 트라코마티스 단백질의 [35S]-메티오닌/시스테인 라벨링에 의해 조사되었다. HeLa 세포 배양물의 클라미디아 트라코마티스 A에 의한 감염 동안에 첨가된 IFN-γ는 다수의 클라미디아 트라코마티스 A 단백질의 현저한 하향 조절을 일으킨 반면, 이러한 효과는 클라미디아L2에 대해서는 분명하지 않았다. 클라미디아 트라코마티스 A 및 L2 둘 모두에서 약 30 및 약 40 kDa 단백질의 IFN-γ-의존성 유도가 관찰되었다. 이러한 단백질의 유도는 과생리학적 양의 L-트립토판을 성장 배지에 첨가함으로써 길항되었다. 이는 이러한 클라미디아 트라코마티스 단백질의 IFN-γ매개성 유도능이 숙주 세포 효소인 인돌아민 2,3 디옥시게나아제를 분해하는 트립토판의 IFN-γ매개성 상향조절과 관련됨을 나타내주었다. IFN-유도된 클라미디아 트라코마티스 단백질 중의 하나는 클라미디아 트라코마티스 L2와 비교하여 클라미디아 트라코마티스 A에서 현저하게 작은 분자량으로 이동하였다.
[19]에서, 이미 공지된 IFN-γ유도성 클라미디아 트라코마티스 A 및 L2 단백질 (Shaw et al. 1999)이 추가로 특징화되었다. MALDI-TOF 질량 분광법을 수행한 후 데이터베이스 검색을 이용한 결과, 단백질이 제조용 2D-겔로부터 클라미디아 트라코마티스 트립토판 신타아제 알파 (TrpA) 및 베타 (TrpB) 서브유닛으로서 동정하되었다. 또한, 이러한 단백질은 클라미디아 트라코마티스 D에서 IFN-γ에 의해 유도되었고, 이 유도는 모든 3가지 혈청형변이주에서 과생리학적 양의 L-트립토판을 첨가함으로써 억제되었다. 클라미디아 트라코마티스 A 중의 TrpA는 클라미디아 트라코마티스 D 및 L2와 비교하여 클라미디아 트라코마티스 A에서 저분자량으로 이동하였다. 클라미디아 트라코마티스 A 및 C TrpA는 이러한 클라미디아 트라코마티스 혈청형변이주로부터의 trpA 유전자의 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 클라미디아 트라코마티스 D 및 L2 TrpA와 비교하여 약 7.7 kDa 만큼 절단되어 있다. 혈청형변이주 (클라미디아 트라코마티스 A, B 및 C)를 초래하는 트라코마 중의 트립토판 신타아제의 절단 또는 부재는 트립토판 합성 능력을 손상시킬 수 있고, 이러한 혈청형변이주를 IFN-γ매개성 트립토판 결실에 더욱 민감하게 한다. 이는 사람 클라미디아 트라코마티스 혈청형변이주 사이의 발병기전에서 나타나는 차이를 설명할 수 있다.
[43]에서는, 세포내 세균인 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes)의 이미 공지된 분비 단백질 (p60)의 숙주 세포 프로테아좀 분해가 조사되었다. 이용된 일반적인 방법은 진핵생물 프로테아좀의 단백분해 활성을 억제하는 N-아세틸-Leu-Leu-노르루시날 (LLnL) 및 (벤질옥시카르보닐)-Leu-Leu-페닐알라니날 (Z-LLF)의 2개의 펩티드알데히드의 존재 또는 부재하에 [35S]-메티오닌/시스테인 라벨링을 이용하는 펄스 추적 검정을 기초로 하였다. p60에 대해 생성된 폴리클로날 항체를 사용하여 리스테리아 모노사이토제네스-감염된 J774 세포의 프로테아좀 억제제 처리된 용해물 및 처리되지 않은 용해물로부터의 p60을 면역침전시켰다. 1차원 SDS PAGE에 의해 분리된 면역침전된 라벨링된 p60의 자동방사선사진을 평가한 결과, 프로테아좀 억제제가 p60의 프로테아좀 분해를 억제할 수 있는 것으로 암시되었다. 감염된 세포 당 p60-CTL 에피토프의 수는 LLnL 및 Z-LLF로 처리시에 감소하였다. 이는 p60의 프로테아좀 분해의 억제 및 p60-CTL 에피토프 생성 사이의 연계를 암시하였다.
[44]에는, 방어 면역 이면의 메커니즘 및 세포내 미생물에 대한 세포성 면역반응의 전반적인 특징이 세포내 미생물에 대한 생육성 재조합 백신의 개발에 초점을 맞추어 기술되었다. 항원 전달 시스템을 개발하기 위한 방법은 미코박테리움보비스(Mycobacterium bovis) BCG 및 살모넬라 티피(Salmonella typhi) aroA-에 중점을 두면서 검토되었다. 이러한 비유독성 세포내 세균은 항원을 전달하도록 유전학적으로 변형될 수 있으며, 면역 인식에 의해 백신용 표적으로서 기능할 수 있다. 상기 문헌의 저자들은 백신의 개발을 위한 표적으로서 분비 단백질을 사용하는 것과 관련된 잇점을 지적하였는데, 이는 세균이 여전히 숙주 세포내부에서 복제하는 동안 이러한 단백질이 프로세싱되어 세포 매개성 면역계에 제시된다는 이유로 인한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 병용 방법에 의해 분비 단백질을 동정하는 것을 포함한다. 기술된 병용 방법은 감염된 세포에 존재하는 세균 단백질의 전체 프로테아좀으로부터 세포내 세균 단백질의 프로테아좀을 감산함으로써 세크레톰 (secretome)(분비 단백질의 집합물)을 구성한다.
세균 단백질은 진핵생물 단백질 합성의 억제제의 존재하에서 펄스 라벨링한 후, 2차원 전기영동과 자동방사선사진법을 수행함으로써 선택적으로 가시화된다. 정제된 세균의 단백질 프로파일은 감염된 세포의 전체 용해물의 단백질 프로파일과 비교되고, 차별적 이미지에 존재하는 단백질 반점, 즉, 세크레톰은 어드밴스드 질량 분광법에 의해 감염된 세포의 전체 용해물이 로딩된 겔로부터 동정된다.
동정된 분비 단백질은 어드밴스드 인공신경망에 의해 추가로 분석되어, 양호한 T-세포 에피토프인 것으로 예측되는 펩티드 서열을 제공한다.
또한, 숙주 세포 프로테아좀의 억제제에 의해 턴오버 (turnover)가 지연되는 단백질이 선택되는데, 이는 이러한 단백질이 특히 숙주 세포 프로테아좀에서 분해되어 숙주 세포 표면상에서 MHC 클래스 I 항원으로서 제시되는 것으로 여겨지기 때문이다.
백신 후보 단백질 및 에피토프를 동정하기 위한 그 밖의 방법과 비교하여, 본 발명은 후보물질의 수를 제한하는데, 이는 신규한 병용 방법에 의해서만 수득될 수 있다.
본 발명은 하기 관찰을 기초로 한다:
· 세포내 세균으로부터 숙주 세포내로 분비되는 단백질은 정제된 세균에는 존재하지 않지만 감염된 세포의 전체 용해물에는 존재한다.
· 정제된 세균 뿐만 아니라 감염된 세포의 전체 용해물의 2D 단백질 프로파일은 세균 단백질의 특이적 펄스-라벨링을 사용하는 2차원 전기영동에 의해 가시화될 수 있다.
· 숙주 세포에 존재하는 세균 단백질의 2D 단백질 프로파일에서 정제된 세균의 2D 단백질 프로파일을 감산하면 질량 분광법에 의한 분비 단백질의 동정이 가능해진다.
· 숙주 세포 프로테아좀에 의해 프로세싱되는, 세포내 세균으로부터 분비된 단백질은 T-세포를 활성화시킬 수 있는 MHC 클래스 I 항원을 발생시키는 것으로 여겨진다.
· 진핵생물 프로테아좀의 억제제의 첨가에 반응하여 장기간의 턴오버를 나타내는 분비된 단백질은 숙주 세포 표면에서 제시되는 것으로 여겨진다. 이러한 단백질의 동정은 2D 단백질 프로파일의 분석에 의해 가능해진다.
· MHC 클래스 I 복합체에 대해 고친화성을 지닌 펩티드를 인식하도록 트레이닝된 인공신경망에 의해 예측될 수 있다.
하기 정의가 본 발명과 관련하여 사용된다.
정의
세크레톰(secretome)
세포내 세균으로부터 분비되는 것으로 보이는 단백질
(타입 III) 분비 서브클러스터
다른 유기체의 타입 III 분비 유전자에 상당한 상동성을 보이는 클라미디아 유전자 클러스터. 분비 클러스터는 다른 세균(예를 들어 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (Shigella), 예르시니아 (Yersinia))의 타입 III 분비에 관련된 유전자와 공지된 상동성을 보이는 임의의 유전자로부터 떨어진 4개의 유전자까지 위치하는, 공지되거나 공지되지 않은 기능을 가지는 ORF(오픈 리딩 프레임)의 집합체를 의미한다.
프로테아좀 억제제
활성화된 26S 진핵세포 프로테아좀의 단백질 분해 활성을 가역적으로 또는 비가역적으로 억제할 수 있는, 화학적으로 합성되거나 천연에 존재하는 화합물. 당업자는 프로테아좀의 단백질 분해 활성이 수개의 상이한 활성(예를 들어, 거대 소수성 잔기 뒤쪽을 절단하는 키모트립신 유사 활성, 염기성 잔기 뒤쪽을 절단하는트립신 유사 활성, 산성 잔기 뒤쪽을 절단하는 글루타밀 사후(post-glutamyl's) 가수분해효소 활성, 분지쇄 아미노산 뒤쪽을 선택적으로 절단하는 BrAAP, 서브유닛의 작은 중성 아미노산 뒤쪽을 절단하는 SNAAP)을 함유함을 인지할 것이다. 프로테아좀을 억제하는 것으로 알려진 수개 화합물은 구입가능하거나 대개 세포 투과 펩티드 기재 억제제(예를 들어, 펩티드 알데하이드, 펩티드 비놀 설폰)를 포함한다. 펩티드 기재 억제제는 전이 상태 유사체로서 작용하고, 천연에 존재하는클래스토-락타시스틴-β-락톤은 프로테아좀의 활성 위치의 비가역적인 개질에 의해 프로테아좀 억제 효과를 보인다. 이러한 화합물 또는 이들의 배합물은 잠재적으로 프로테아좀 기능 및 MHC 클래스 I 항원 프로세싱(예를 들어, MG115, MG132, MG262, PSI, 클래스토-락타시스틴-β-락톤, 에폭시마이신)을 성공적으로 억제하는 데 사용될 수 있다. 프로테아좀 억제제는 펄스 라벨링 또는 추적(chase)이 수행되기 전, 이들이 수행되는 동안, 또는 이들이 수행된 후에 클라미디아(Clamydia)의 발생 주기 중 임의의 시간에 적용될 수 있다.
숙주 세포
숙주 세포는 세포내 세균으로 감염될 수 있는 임의의 진핵 세포이다. 당업자는 광범한 불멸화된 세포주가 상피세포주(예를 들어 HeLa, Hep-2, BHK 세포) 또는 불멸화된 단핵구 세포주 예를 들어 U-937을 포함하는, 클라미디아로 감염되기에 적합한 숙주라는 것을 인지할 것이다. 불멸화된 숙주 세포는 제한되지 않은 세포 분열 및 증식(예를 들어 SV40)을 유발하는 종양유전자를 운반하는 바이러스로 1차 세포를 형질전환시켜 얻어지거나 천연에 존재하는 암종으로부터 얻어질 수 있다.숙주 세포의 정의에는 또한 시험관내 및 기관 세포 배양에 의해 한정된 시간동안 증식될 수 있거나 살아있는 포유동물로부터 또는 검시에 의해 얻어질 수 있는 포유동물 상피 세포주 또는 내피 1차 세포주가 포함될 수 있다.
유전적으로 개질된 숙주 세포
당업자는 적절한 숙주 세포가 또한 클라미디아 백신 개발과 관련하여 적절한 유전자, 예를 들어, 프로테아좀 서브유닛 또는 MHC 클래스 I 제시에 포함되는 기능적으로 중요한 단백질을 엔코딩하는 다른 유전자를 과발현하거나 억제하도록 유전적으로 개질된 숙주 세포를 포함함을 인식할 것이다.
프로테아좀
프로테아좀은 다수의 속도 한정 효소, 전사 조절제, 및 중요한 조절 단백질의 빠른 분해를 촉매하는 ATP 의존성 단백질 분해 경로의 필수 요소인 비리소좀 단백질 분해의 주효소복합체이다. 진핵 세포에서, 이는 숙주 세포에 위치하는 새포내 세균의 단백질 뿐만 아니라 비정상적인 단백질, 응집되거나, 폴딩되지 않거나 정상 숙주 단백질의 신속한 제거에 중요하다. 고등 진핵 세포의 프로테아좀은 T 세포 에피토프로서 제시되기 위해 숙주 세포 표면에 전달되는 펩티드로 단백질을 분해시킴으로써 MHC 클래스 I 항원 프로세싱에 중요한 역할을 한다.
펄스-라벨링
단백질 라벨링은 숙주 세포 단백질 합성이 충분한 농도의 진핵 세포 단백질 합성 억제제를 사용하여 억제되는 시간 동안(예를 들어 0.5 시간, 1 시간, 2 시간,4 시간, 6 시간) 세균 단백질에 방사성 동위원소(예를 들어, L-[35S]-메티오닌, L-[메틸-3H]-메티오닌, L-[메틸-14C]-메티오닌, [35S]-시스테인, [3H]-트립토판 또는 이들의 배합물) 함유 아미노산이 혼입되는 것을 의미한다. 라벨링은 클라미디아 발생 주기를 통해 수행될 수 있다. 라벨링 배지는 감염된 세포가 증식되는 동안 병원체 및 숙주 세포 둘 모두의 증식을 가능하게 하는 영양분으로 충분히 보강되어야 한다. 숙주 세포 단백질 합성의 억제는 단백질 합성 세포내 세균에서만 반응성 아미노산의 혼입을 가능하게 하는 효과를 보이며, 시클로헥사미드 또는 숙주 세포 단백질 합성(에머틴: emetine)의 다른 억제제의 첨가를 통해 수행될 수 있다. 단백질 분해는 라벨링 기간 동안 증식 배지에 단백질 분해의 세포 투과성 억제제를 첨가함에 의해 연장될 수 있다. 본 발명은 반응성 라벨링의 사용에 한정되지 않는다는 것을 숙지하여야 한다.
펄스-추적(Pulse-Chase)
합성 후에 라벨링된 단백질을 추적함에 의해 턴오버 시간, 예를 들어, 라벨링 동안 합성된 단백질의 양이 바람직하게는 75%(예를 들어 80%, 90%, 95%, 99%, 100%) 이상 분해되는 데 걸리는 시간이 예측될 수 있다. 이러한 예측은 추적 시간 전후의 겔 상의 소정 단백질 스팟의 광학 밀도를 측정함에 의해 수행되고 단백질이 얼마나 오래 감염된 세포에 존재하는지를 알려준다. 추적은 방사성 아미노산 비함유 배지를 라벨링 배지로 교환하고 라벨링 후 상이한 시점에 감염된 세포를 회수함에 의해 수행된다. 추적은 단백질이 감염된 세포에 얼마나 오래 존재하는지를 결정하기 위하여 라벨링한 후 다양한 시간 경과 후(예를 들어 0.5시간, 1시간, 1.5시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 72시간) 및 라벨링 후 다양한 시점에 수행될 수 있다. 특정 단백질의 성숙 형태는 펩티드로부터 프로세싱되어 양이 감소되는 대신에 추적 기간 동안 축적될 수 있다. 이러한 환경 하에서, 성숙한 단백질은 분해가 추적 기간 동안 가시화될 수 있기 전에 축적될 수 있다. 단백질이 분해되는 시간은 추적 동안 증식 배지에 세포 투과 단백질 분해 억제제를 첨가함에 의해 연장될 수 있다.
용해 완충액
본 발명에 사용되는 용해 완충액은 감염된 세포를 용출시키고 2차원 겔 전기영동 전에 단백질을 용해시키는데 사용되는 완충액이다.
용해 완충액은 9M 우레아, 4% w/v 3-[(3-콜아미도프로파일)디메틸암모늄]-1-프로판술포네이트(CHAPS; Roche, Germany), 40mM 트리스 염기, 65mM DTE 및 2% vol/vol 파말라이트 3-10(Amersham Pharmacia Biotech). 고분자량 및 소수성 단백질의 강화를 위하여 용해 완충액은 대안적으로 7M 우레아, 2M 티오우레아, 4% w/v 3-[(3-콜아미도프로파일)디메틸암모늄]-1-프로판술포네이트(CHAPS; Boehringer Mannheim, Germany), 40mM 트리스 염기, 65mM 디티오에리트레티올(DTE) 및 2% vol/vol 파말라이트 3-10(Amersham Pharmacia Biotech)를 함유한다.
특정 단백질의 용해도를 증가시키기 위하여 용해 완충액을 변경하는 것(예를 들어, 티오우레아는 소수성 및 고분자량 단백질의 용해도를 증가시킬 것이다)이 가능함을 인지할 것이다.
분비된 이펙터 단백질
분비된 이펙터 단백질은 세균에 의해 숙주 세포 원형질 또는 임의의 세포내 기관으로 분비되는 임의의 단백질을 의미한다. 분비된 이펙터 단백질은 숙주/병원체 관계에 중대한 영향을 미치며 숙주 세포 원형질에 존재함으로 인해 프로테아좀에 표적화될 수 있고 숙주 세포의 표면에 MHC 클래스 I 항원으로 제시될 수 있다. 분비된 이펙터 단백질은 문헌에 설명된 수개의 Sec-의존성 또는 비의존성 시스템(예를 들어, 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV) 중 하나에 의해 분비될 수 있다.
세포내 세균
진핵 숙주 세포 내부를 감염시키고 여기에서 증식될 수 있는 능력을 가지는 임의의 세균(예를 들어, 클라미디아 (Chlamydia), 살모넬라 (Salmonella), 시겔라 (Shigella), 리스테리아 (Listeria), 레지오넬라 (Legionella), 예르시니아 (Yersinia)). 상기 정의는 진핵 숙주 세포를 사용하여서만 생존할 수 있고 증식할 수 있는 편성 세포내의 의미와, 세포내 환경 뿐만 아니라 세포외 환경 둘 모두에서 생존할 수 있는 통성 세포내의 의미를 포함한다.
기본 소체(EB)
지름이 약 300nm이고 응축된 핵을 가지는 것으로 전자 현미경에 의해 특징화되고 초원심분리에 의해 여과되는 클라미디아 세균의 집합체.
망상체(RB)
지름이 약 1000nm이고 정상 세균 핵을 가지는 것으로 전자 현미경에 의해 특징화되고 초원심분리에 의해 여과되는 클라미디아 세균의 집합체.
분석용 겔
단백질을 가시화하는 데 필요한 단백질 샘플 양으로 로딩된 임의의 2D-PAGE 겔. 본원에 기술된 실시예에서 분석 목적으로 적용된 양은 통상적으로 염색된 겔(예를 들어 은 염색, 쿠마시 염색)에 대해 100㎍ 초과의 단백질 또는 분당 200,000 내지 300,000 카운트이다.
유효하게 감소된 강도/양
2D-PAGE 겔에 분산된 소정의 스팟의 전체 면적에 대해 적분된 광학 밀도로 바람직하게는 10% 초과(예를 들어, 20%, 35%, 50%, 65%, 80%, 90%, 100%)의 재현 가능하고 검출 가능한 감소.
유효하게 증가된 강도/양
2D-PAGE 겔에 분산된 소정의 스팟의 전체 면적에 대해 적분된 광학 밀도로 바람직하게는 10% 초과(예를 들어 20%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%, 100%, 150%, 200%, 300% 초과)의 재현가능하고 검출가능한 증가.
제조용 겔
본원에 기술된 동정 방법(예를 들어 MALDI-MS, ESI-Q-TOF, 에드만 분해) 중 하나에 의해 특정 단백질 스팟의 동정을 가능하게 하는데 필요한 양의 단백질 샘플이 로딩된 2D-PAGE 겔. 사용된 고정 pH 구배에 따라 제조용 목적으로 통상적으로 500㎍ 초과의 양이 겔에 적용된다. 본 발명에 사용된 제조용 겔의 정의는 고정되지 않거나, 염색 프로토콜(예를 들어, 은 염색, 쿠마시 염색)을 사용하여 고정되거나 PVDF 막 상에 전기블롯팅된 단백질 함유 겔을 포함한다. 라벨링 되지 않은 단백질과 함께 분리되는, 제조용 겔에 라벨링된 단백질의 배경을 적용함에 의해 제조용 겔 상에 단백질을 가시화하는 것이 가능하다. 또한, 정확한 대상 단백질을 절단하기 위하여 분석 겔과 상기 겔을 비교하는 것이 가능하다.
백신 후보물질
본 발명의 방법에 의해 수득된 결과에 기초하여 세포내 세균으로부터 잠재적으로 분비되는 단백질. 분비된 단백질은 숙주 세포 프로테아좀에 의한 분해를 위해 이용될 수 있고, 따라서 상기 단백질로부터 유래된 펩티드는 감염 세포의 표면에 MHC 클래스 I 항원으로 제시되어 T 세포에 의해 인지될 수 있다. 따라서, 이러한 단백질은 세포내 세균에 대한 백신의 개발을 위한 명확한 표적일 것이다. 백신 후보물질로서 설명되는 단백질은 또한 진단 시험의 성분으로서 유용한 역할을 할 수 있다.
백신
본 발명에서, 백신이라는 용어는 후천성 면역 반응(체액성 또는 세포성)을 유발할 수 있는 면역 조성물로서 광범한 의미로 이해되어야 할 것이다. 후천성 면역 반응을 유발할 수 있는 백신 후보물질은 용액, 현탁액의 형태 또는 에멀젼으로서의 주사가능물질로서 동물 또는 사람 수용체에 투여될 수 있다. 면역 조성물의 활성 조성물인 백신 후보물질은 수용체에 주사되기 전에 물, 염수, 글리세롤, 및 에탄올과 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있다. 주사는 여러 방법(피하 또는 근육내 주사)으로 수행될 수 있다. 백신 후보물질은 i) 전장, 또는 ii) 면역 단편을 제공하는 공급원(예를 들어, T-세포 에피토프)으로 백신으로서 역할할 수 있다. 특정 단백질 또는 펩티드는 단독으로 또는 다른 단백질 또는 펩티드와 배합하여 동물 또는 사람 수용체에 투여되고 백신으로서 역할할 수 있다.
또한, 백신 후보 단백질을 엔코딩하는 DNA 단편은 동물 또는 사람 수용체로 주사에 의해 도입될 수 있는 벡터에 클로닝될 수 있다. DNA 단편은, 예를 들어 근육 세포에 의해 흡수되고 진핵생물에서 활성인 프로모터의 조절 하에 발현된다. 이러한 소위 DNA 백신에서 발현되는 DNA 단편은 면역 시스템을 증강시킬 수 있다.
MHC 클래스 I 항원
주 조직 적합성 클래스 I 항원은 내부원형질 망상에서 이형이합체 MHC 클래스 I 분자에 컨쥬게이션되고, T 세포 에피토프로서 역할할 수 있는, HLA 복합체(사람)의 그루브에 결합된 세포의 표면에서 제시되는 숙주 세포 원형질에 노출된 단백질로부터 분기된 펩티드를 포함한다. MHC 클래스 I 제시된 펩티드의 대다수는 활성화된 26S 프로테아좀에 의해 숙주 세포의 원형질에서 프로세싱된 단백질로부터 분기된다.
HLA
사람 주 조직적합성 복합체의 이름인 사람 백혈구 항원.
T-세포 에피토프
세포의 표면에서 이합체 MHC 클래스 I 분자에 결합된 짧은 길이의 펩티드는 예를 들어 통상적으로 8개 내지 10개의 아미노산으로 구성되고, 특정 세포독성 T-세포의 수용체에 의해 인지될 수 있다.
전체 세포 용해물
사전 정제 또는 분획화 없이 용해 완충액에서 직접 회수된 감염된 숙주 세포. 전체 세포 용해물은 클라미디아 발생 주기를 통하여 임의의 시점에 얻어질 수 있고, 전체 세포 용해물이 세균의 단백질을 포함하여 감염된 숙주 세포에 존재하는 모든 단백질 혼합물을 함유할 것이라는 것은 인지될 것이다.
정제 세균
감염된 세포로부터 정제되는 세균. 예로서 클라미디아를 사용하여, 밀도 구배 한외 원심 분리 방법에 의하여 클라미디아의 중간체 형태 뿐만 아니라 RB 및 EB 둘 모두를 정제하는 것이 가능하다. 순도는 전자 현미경에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에서 순도는 또한 겔 상에 존재하는 모든 단백질의 전체 광학 밀도에 대해 매우 풍부한 숙주 세포 오염 단백질(예를 들어, 악틴, 베타-투불린, 알파-투불린, 칼레티큘린) 분포를 예측하여 은 염색된 2D 겔 상에서 용이하게 증명된다.
동정된 단백질
질량 분광법 또는 에드만 분해법에 기초한 동정 방법을 사용하여 동정된 단백질에 대한 명칭은,http://socrates.berkeley.edu:4231/에서 입수가능하고 문헌[i) Stephens, R.S., Kalman, S., Lammel, 클라미디아, Fan, J., Marathe, R., Aravind, L., Mitchell, W., Olinger, L., Tatusov, R.L. Zhao, Q., Koonin, E.V., Davis, R.W. (1998) Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis, Science 282: 754-759; ii) Kalman, S., Mitchell, W., Marathe, R., Lammel, 클라미디아, Fan, J., Hyman, R. W., Olinger, L., Grimwood, J., Davis, R.W., Stephens, R.S., 1999, Comparativegenomes of Chlamydia pneumoniae and 클라미디아 trachomatis. Nat Gent. 21: 385-389]에 공개된 클라미디아 게놈 프로젝트의 유전자에 사용된 것에 따라 이에 필적하게 나타낸다.
ELISPOT
ELISPOT 방법에서, 시험관내에서 항원으로 자극된 T-세포는 항시토카인(예를 들어 IFN-g, IL-6, TNF-a)로 사전 코팅된 마이크로역가 웰 중에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 후에 활성화된 T-세포 주변의 시토카인의 국소적 생성은 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 알칼리성 퍼옥시다아제와 같은 효소에 컨쥬게이션된 2차 항체를 첨가함에 의해 가시화될 수 있다. 시토카인의 생성의 측정은 최종적으로 효소적으로 색을 띤 생성물로 전환되는 기질을 첨가하여 시토카인 생성 세포가 가시화되도록 함에 의해 수행된다.
애쥬번트
애쥬번트는 동물 수용체에서 면역반응을 유발할 수 있는 특정 면역원을 함유하는 에멀젼(예를 들어 프로인트 애쥬번트)을 의미한다. 면역원과 함께 애쥬번트는 면역화된 포유동물에서 면역 반응을 증강시키는 건조 세균 또는 세균 생성물과 같은 성분으로 보강될 수 있다는 것은 인지될 것이다. 대안적으로, 림포카인(예를 들어 IFNg, IL12) 또는 폴리 I:C와 같은 면역 조절 성분은 또한 면역원 및 애쥬번트와 함께 투여될 수 있다.
혈청 전환(Seroconversion)
항원에 반응하는 항체의 상이한 클래스 또는 서브클래스의 발생.
마이크로 면역 형광분석(MIF 또는 마이크로-IF)
면역 형광 현미경에 의한 고정된 세균 또는 단백질에 대한 항체를 측정하는 검정.
면역원성
단백질 또는 펩티드를 사람 또는 동물에게 주입시. 적합한 면역 반응을 유발시킬 수 있는 단백질 또는 펩티드는 면역원성이다.
도면의 설명
도 1a는 감염 후 22-24 시간(hours post infection: h.p.i.)에 라벨링되고, 라벨링 직후에 수거되며, 2D-PAGE에 의해서 분리된 전체 세포 용해물[35S]로부터의 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 겔 이미지의 예를 도시하고 있다. 검은색 화살표는 22-24 h.p.i에서 라벨링되고 72 h.p.i.에서 정제된 EP(elementary body: 기본 소체)로부터의 단백질로서 겔 상에서 세기가 현저하게 감소된 단백질을 표시한다. 표시된 스팟(DT1-77)의 pi 및 Mw 특징을 표 I에 수록한다.
도 1b-e는, 도 1a의 소정의 영역을 확대하여 나타내고 있는, 합성 후 상이한 시간에서의 클라미디아 트라코마티스 D에서 동정된 백신 후보물질 및 이들의 존재에 대한 예를 나타낸다. 라벨링 후, 단백질 턴오버 시간을 상이한 시간에서 EB가 정제될 때까지 발생 주기 전체를 추적함으로써 측정하였다. 상부 스케일은 제로에서 출발하는 라벨링 후의 시점을 나타내며; 하부 스케일은 24 시간에서 출발하는 감염후의 시점을 나타낸다.도 1b: DT1 및 DT2(CT668).도 1c: DT8.도 1d: DT7(상부 화살표) 및 DT11(하부 화살표)(둘 모두 CT610으로 동정됨).도 1e: DT3(하부 화살표, CT783), DT4(상부 화살표, CT858).
도 2a는 55-57 h.p.i.에 라벨링되고, 라벨링 직후에 수거되며, 2D-PAGE에 의해서 분리된 전체 세포 용해물[35S]로부터의 클라미디아 뉴모니애 VR1310 단백질의 겔 이미지의 예를 도시하고 있다. 검은색 화살표는 발생 주기, 즉, 6, 12, 24, 36, 42, 48, 54, 60 h.p.i에 걸쳐 두 시간 기간으로 라벨링되고 72 h.p.i.에서 정제된 EB로부터의 단백질 겔 상에서 세기가 현저하게 감소된 단백질을 표시한다. 화살표는 정제된 EB로부터의 겔 상에서의 세기가 감소된 단백질을 표시한다. 표시된 스팟(CP1-91)의 pi 및 Mw 특징을 표 II에 수록한다.
도 2b는 도 2a의 확대부를 나타낸다.
도 2c는 상기된 바와 같이 라벨링된 2D-PAGE 분리된 EB 단백질의 이미지에 상응하는 확대도이다. 도 2b 및 도 2c에서 확대된 부분은 전체 세포 용해물에는 존재하지만 EB에는 존재하지 않는 CP63(CPN1016으로 동정됨) 및 CP65의 예를 나타낸다. 원으로 표시된 스팟은 EB 및 전체 세포 용해물 둘 모두에 존재하며, 폴리펩티드 데포르밀라제로 동정되었다.
도 3a는 가상적인 CT668로서 스팟 번호 DT1을 동정하는데 사용된 펩티드 질량 지문을 나타낸다. 공간이 빈 화살표는 트립신의 자가분해로부터 발생되는 펩티드를 나타낸다. 이들 피크는 스펙트럼의 내부 조정을 위해서 사용된다. 검은색 화살표는 CT668 서열에 매칭되는 펩티드 질량을 나타낸다. 이중 화살표는 사람 오염성 단백질로부터 발생된 펩티드를 나타낸다.
도 3b는 도 3a로부터 얻은 펩티드 질량에 대한 동정 소프트웨어 MS-Fit를 사용하여 얻은 결과를 나타내는 것으로, 최상-순위 클라미디아 트라코마티스 단백질이 CT668임을 나타낸다.
도 4a는 이중 하전된 1744.9 Da 모 이온 (R)KIVDWVSSGEEILNR(A)(검은색 화살표)를 포함한 스팟 DT1의 ESI-Q-TOF MS에 의해서 생성된 펩티드 질량 스펙트럼을 나타내며, 이 서열은 CT668 아미노산 서열과 매칭된다. 점선은 모 이온의 단편으로부터 생성된 Y-펩티드 이온을 나타내고 있다. 예측된 아미노산 서열을 진한 단일문자 코드로 나타낸다.
도 4b는 스팟 CP63의 PSD MALDI MS에 의해서 생성된 펩티드 질량 스펙트럼을 나타낸다. 1919.8 Da 모 이온 (K)ELLFGWDLSQQTQQAR(L)을 분해하고, 서열을 드러내는 몇 개의 펩티드를 생성시켰다. 이들 중 둘은 류신(113Da)의 질량에 의해서 질량이 다른 243.35 Da b2-이온(EL) 및 356.34 Da b3-이온(ELL)에 의해서 예시된다.
도 5는 신규한 클라미디아 트라코마티스 특이적 백신 단백질 후보물질 DT8 및 단일문자 코드로 나타낸 상응하는 아미노산 서열의 누클레오티드 서열을 나타낸다. 진한 아미노산 서열은 ESI-Q-TOF MS에 의해서 얻은 서열 태그를 나타낸다.
도 6은 프로테아좀 억제제 MG-132와 함께 펄스 추적 연구를 나타낸다.도 6.1: 22-24h.p.i.에서 라벨링되고 20μM MG132의 존재 하에 추가로 4 시간 동안 추적된 클라미디아 트라코마티스 D 단백질을 부하시킨 2D-겔의 전체 겔 이미지.도 6a, 6b 및 6c: (추적된+MG-132)로 수행되거나 (추적된) MG-132 없이 수행된 추적 연구와 비교할 경우, MG-132에 의한 처리에 기인된 연장된 턴오버 시간을 나타내는클라미디아 트라코마티스 D 단백질을 함유한 영역의 확대도. 첫 번째 열은 2-시간 라벨링 기간 직후에 회수된 감염된 세포의 단백질 프로파일을 나타낸다. DT9, DT10 및 DT11의 세기는 MG132 없이 라벨링 직후에 회수된 전체 세포 용해물을 지닌 겔에 비하여, MG132의 존재 하에 라벨링되고 추적되는 전체 세포 용해물을 지닌 겔 상에서 현저하게 더 세다는 것을 주지해야 한다.
도 7a는 PAb245를 사용한 전체 세포 용해물의 IMB의 전체 겔 이미지를 나타낸다.a1: 각각 CT858의 C-말단 및 N-말단 단편인 스팟 번호 DT4 및 DT48과의 반응을 나타내는 IMB. A2: IMB의 상응하는 방사성 라벨링된 배경.
도 7b: YscN에 대한 PAb241(B1) 및 CT668(스팟 DT1 및 DT2)에 대한 PAb238(B4)에 의한 IMB.B2: YscN 및B5: CT668로의 공동-편재화를 나타내는 IMB의 상응하는 자동방사선사진법 그래프. 분석 2D-겔 상의 YscN(B3) 및 CT668(B6)의 편재화.
도 7c는 CT610에 대한 PAb255로의 IMB를 나타낸다.C1: PAb 255가 스팟, 즉, DT7을 나타내는 상부 및 DT9, 10, 11 및 12를 나타내는 하부의 열에 염색됨을 나타내는 2D-겔 블롯의 확대도.C2: 30 h.p.i.에서 세포를 회수하기 전에 6시간 동안 감염된 세포를 MG132로 처리한 효과를 나타내는 확대도. MG132 처리는 DT7을 나타내는 열에 비해서, 명백하게 증가된 상태로 DT9, DT10 및 DT11를 증가시킨다는 것을 주지해야 한다.C3: 상응하는 라벨링된 분석 겔. C4: PAb255에 의한 SDS-PAGE IMB: 레인 a 및 c: (각각) 20㎍ 및 10㎍의 30 h.p.i.에서 회수된 전체 감염된 세포 용해물. 레인 b 및 d: 30 h.p.i.에서의 세포 회수 전에 (각각) 50μM MG132로6 시간 동안 처리된 10ug 및 5ug의 감염된 전체 세포 용해물.
도 8은 백신 후보물질의 서브-세포 편재화를 나타내는 간접 면역 형광 현미경분석을 나타낸다.A 및 B: 클라미디아 트라코마티스 D로 감염되고 24 h.p.i.에 포르말린으로 고정된 HeLa 229 세포.C: 클라미디아 뉴모니애로 감염되고 72 h.p.i.에서 포르말린으로 고정된 HEp-2 세포.열 1은 노르마스키(Normasky) 이미지를 나타낸다.열 2는 로다민 컨쥬게이션된 GAM IgG 항체에 의해서 가시화된 클라미디아 트라코마티스 MOMP에 대한 MAb 32.3과의 반응을 나타낸다.열 3은 FITCH-컨쥬게이션된 GAR IgG 항체에 의해서 가시화된 주목되는 백신 후보물질에 특이적인 토끼 폴리클로날 항체와의 반응을 나타낸다. 조사된 백신 후보물질은A: DT8,B: CT858,C: CPN1016(클라미디아 뉴모니애중의 CT858 동족체)이다. 백색의 단일 머리 화살표는 감염된 세포내의 클라미디아(Chlamydia) 함유물의 경계를 나타낸다. 속이 빈 화살표는 감염되지 않은 세포를 나타낸다. CPN1016이 CT858과 동일한 서브-세포 편재화 및 분비 특성을 나타냄을 주지해야 한다.
도 9는 타입 III 분비 서브클러스터 1, 2 및 3에 위치하는, 동정된 단백질을 포함한 클라미디아 트라코마티스 D로부터의 동정된 백신 후보물질 예들의 게놈성 편재화를 나타낸다.
도 10은 22-24 h.p.i.에서 라벨링된 감염 세포의 전체 용해물로부터의 2D-겔 이미지에서 클라미디아 트라코마티스 D 분비 후보물질의 위치를 나타내며, RB는 시간상 동일한 시점에서 라벨링되고 정제되며, EB는 72 h.p.i.에서 정제된다. 모든 겔은 비선형 pH 3-10 이모빌라인 드라이스트립(Immobiline Drystrip)을 사용하여제조된다. 22-24 hpi: 22-24 h.p.i.에서 라벨링되고, 라벨링 직후에 수거되며, 2D-PAGE에 의해서 분리된 감염 세포 [35S]의 전체 용해물로부터의 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 도 1a에 나타낸 겔 이미지의 확대도.
정제된 RB: 22-24 h.p.i.에서 라벨링된 직후에 24 h.p.i.에서 RB로서 정제된 세균으로부터의 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 겔 이미지로부터의 상응하는 영역.
정제된 EB: 22-24 h.p.i.에서 라벨링되고 EB 72 h.p.i.로서 정제된 세균으로부터의 단백질의 겔 이미지로부터의 상응하는 영역.
열 A-G에서 분비 후보물질 DT4, DT48, DT23, DT76, DT77, DT47 및 DT75가 원 안에 들어있다.
도 11은 55-57 h.p.i.에서 라벨링된 감염 세포의 전체 용해물, 정제된 EB, 34-36 h.p.i.에서 라벨링된 감염 세포의 전체 용해물, 및 동일한 시점에서 라벨링되고 정제된 RB로부터의 2D-겔 이미지에서 클라미디아 뉴모니애 VR1310 분비 후보물질의 위치를 나타낸다:
55-57 hpi.: 55-57 h.p.i.에서 라벨링되고, 라벨링 직후에 수거되며, 비선형 pH 3-10 이모빌라인 드라이스트립을 사용한 2D-PAGE에 의해서 분리된 세포[35S]의 전체 용해물로부터의 클라미디아 뉴모니애 VR1310 단백질의 도 2a에 도시된 겔 이미지의 확대도.
정제된 EB: 발생 주기를 통털어 2시간 기간에서, 즉, 6, 12, 24, 36, 42, 48, 54, 60 h.p.i.에서 라벨링되고, 72 h.p.i.에서 EB로서 정제된 세균으로부터의단백질의 겔 이미지(비선형 pH 3-10 이모빌라인 드라이스트립)로부터의 상응하는 영역.
34-36 hpi: 34-36 h.p.i.에서 라벨링되고, 라벨링 직후에 회수된 감염 세포의 전체 용해물로부터의 클라미디아 뉴모니애 VR1310 단백질의 겔 이미지(선형 pH 4-7 이모빌라인 드라이스트립)로부터의 상응하는 영역.
RB 36hpi: 34-36h.p.i.에서 라벨링 직후에 36 h.p.i.에서 RB로서 정제된 세균으로부터의 클라미디아 뉴모니애 VR1310 단백질의 겔 이미지(선형 pH 4-7 이모빌라인 드라이스트립)로부터의 상응하는 영역.
A-F에서 분비 후보물질 CP34, CP37, CP46, CP47, CP52, CP63 및 CP75는 원안에 들어있다.
G는 분비 후보물질을 함유하지 않는 A-F 영역의 모 이미지로부터의 영역을 나타낸다.
전체 세포 용해물 및 정제된 세균으로부터의 2D-PAGE 단백질 프로파일의 비교
정제된 세균에는 부재하나, 전체 감염 세포에는 존재하는 단백질은 세균, 예를 들어, 클라미디아로부터 분비된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 개시 방법은 발생 주기의 상이한 시점에 라벨링된 감염 세포의 전체 세포 용해물로부터의 [35S]-라벨링된 클라미디아 단백질의 2D-PAGE 단백질 프로파일을 상응하는 시점에 [35S]-라벨링된 정제된 세균의 2D-PAGE 단백질 프로파일과 비교하는 것이다. 이러한 방법은 전체 세포 용해물의 단백질 프로파일에는 명확하게 존재하지만, 정제된 세균의 단백질 프로파일에서는 거의 검출할 수 없거나 존재하지 않는 몇 가지 단백질을 검출할 수 있게 한다.
고해상도 2D-PAGE(IPG)에 의한 22-24 h.p.i.에서의 전체 세포 용해물을 가시화한 전체 약 600개의 단백질 스팟으로부터, 이러한 연구는 기본 소체(EB)에서 세기가 현저하게 감소되는 77개의 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 존재를 밝혀냈다. 유사하게, 91개의 단백질은 정제된 EB에 대하여 55-57 h.p.i.에서 라벨링된 전체 세포 용해물을 비교하는 경우에 클라미디아 뉴모니애 VR1310에서 세기가 현저하게 감소되었다.
검출되고 주석을 붙인 단백질은 표 I에 수록된 클라미디아 트라코마티스 D에 대한 단백질 번호 DT1-DT77 및 표 II에 수록된 클라미디아 뉴모니애 대한 CT1-CP91에 대하여 제시된 Mw 및 pi를 지닌다.
본 발명의 방법은 추가의 조사에 필요한 잠재적으로 분비된 단백질를 개관하고 있다. 이러한 예는 전제 세포 용해물을 i) 전체 세포 용해물(클라미디아 트라코마티스, 도 1)의 라벨링에 상응하는 시점 또는 ii)전체 발생 주기(클라미디아 뉴모니애, 도 2) 전체에 걸친 시점에서 라벨링된 정제 EB와 비교하고 있다.
RB의 정제는 분비된 단백질과 RB-특이적 단백질을 식별하게 해준다. 감염 세포의 단백질 프로파일은 분비된 단백질을 동정하도록 시간상 동일한 시점에서 정제된 RB의 단백질 프로파일에 비교될 수 있다. 이러한 연구에서, RB 특이적 단백질은 허위 포지티브로 검출되지 않을 것이다. 조사 시점에서 합성되고 분비된 단백질이 검출될 것이다. 단백질은 다른 시점에서 합성되고 분비될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 선행하는 발생 주기에서 합성될 수 있는 감염 직후에 분비된 단백질의 검출을 포함한다. 이들 단백질은 선행하는 발생 주기에서 라벨링되고 전체 세포 용해물의 2D-PAGE를 거친 EB로 감염시킴으로써 가시화된다. RB로의 EB 분화 전의 발생 주기의 초기 단계에서, 숙주 세포 원형질은 세포막[30, 31]의 사포닌 투과에 의해서 얻어진다. 이러한 결과는 이 시점에서 RB를 파괴함으로써 클라미디아 단백질의 오염이 없을 수 있기 때문에 유일하게 가능할 수 있다.
백신 후보물질의 동정
제조 2D-겔로부터 절단된 백신 후보 단백질을 진보된 질량분광법으로 동정하였다.
절단한 스팟을 트립신 등의 효소로 분해하여 수많은 트립신 펩티드를 생성하였다. MALDI-MS 또는 그 밖의 수단으로, 이들 펩티드의 질량을 100ppm 보다 우수한 정확도로 측정하였다. 얻은 질량은, 통계학적 기준으로 분석 단백질을 동정시키는 MS-Fit 또는 펩티드서치 소프트웨어(Peptidesearch software)를 사용한 데이터베이스에 존재하는 모든 단백질의 이론적인 트립신 분해 생성물과 매칭된다.
단백질 스팟이 전체 세포 용해물로 부하된 겔로부터 절단되는 경우에, 오염 숙주 세포 단백질은 세균의 위치와 동일한 위치에 위치하며, 더 복잡하게는, 하나의 스팟은 하나 이상의 세균 단백질을 함유할 수 있다. 명료한 동정을 유도할 수 있는 오염물에 의한 간섭을 피하기 위해서, ESI-Q-TOF 또는 포스트 소스 디케이(post source decay: PSD)는 필요한 세균 단백질(들)의 서열 정보를 얻는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 표 III(각각 A 및 B)에서 클라미디아 트라코마티스 D 및 클라미디아 뉴모니애 VR1310의 예에 의해서 지적된 질량분광법으로 동정되는 단백질을 포함한다.
따라서, 본 발명은, 첫 번째 양태에서,
1) 세포내 세균에 의해 숙주 세포를 감염시키고,
2) 감염된 세포에 존재하는 세포내 세균을 라벨링하고,
3) a) 감염된 세포의 전체 세포 용해물 및 b) 감염된 세포로부터 정제되고 용해된 세균을 제조하고,
4) i) 단계 3a)로부터의 전체 세포 용해물과 ii) 단계 3b)로부터의 정제되고 용해된 세균의 2D-겔 전기영동 단백질 프로파일을 비교하고,
5) 전체 세포 용해물에는 존재하지만, 정제된 세균에는 존재하지 않거나 현저하게 감소된 양으로 존재하는 단계 4)로부터의 단백질 스팟을 검출하고,
6) 단계 5)에서 선택된 스팟중의 단백질을 동정하는 단계를 포함하는, 세포내 세균으로부터 분비된 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.
백신 후보물질의 펄스/추적
본 발명의 목적은 숙주 세포에서 분해되는 분비 단백질을 검출하는데 있다. 동정된 백신 후보 단백질이 숙주 세포내부에 존재하는 시간을 측정하기 위해서, 일련의 펄스/추적 연구가 수행된다. [35S]-라벨링된 단백질의 턴오버 시간이 라벨링 후에 다양한 기간 동안 단백질을 추적함으로써 2D-겔 상에서 모니터링된다. 턴오버 시간은 단백질이 얼마나 빠르게 변화되어서 얼마나 오랜 시간 동안 감염된 세포내에 존재하는가에 대한 유용한 정보를 제공한다.
본 발명은 표 I에 예시된 잠재적으로 분비된 클라미디아 트라코마티스 단백질의 턴오버 시간을 측정한다.
본 발명의 이러한 대안적인 양태에서, 본 발명은,
1) 세포내 세균에 의해 숙주 세포를 감염시키고,
2) 감염된 세포에 존재하는 세포내 세균을 펄스 라벨링하고,
3) 단계 2) 후의 상이한 추적 기간 후에 감염된 세포의 전체 세포 용해물을 제조하고,
4) 단계 3)에서의 상이한 추적 기간 후에 제조된 전체 세포 용해물의 2D-겔 전기영동 단백질 프로파일을 비교하고,
5) 단계 3)에서 추적 기간의 증가에 따라 감소된 양으로 존재하는 단계 4)로부터의 단백질 스팟을 검출하고,
6) 단계 5)에서 선택된 스팟 중의 단백질을 동정하는 단계를 포함하는, 세포내 세균으로부터 분비된 단백질을 동정하는 방법에 관한 것이다.
프로테아좀 억제제가 병용된 펄스 추적
백신에 적합한 후보물질의 수를 제한하기 위해, 본 발명은 펄스 추적 연구와 병용되는 프로테아좀 억제제 방법을 포함한다. 이러한 실험은 분비된 클라미디아 단백질(Chlamydial protein)의 전환 시간에 대한 숙주 세포 프로테아좀의 효과를 모니터링하는 탁월한 도구이다.
MHC 클래스 I 항원으로서 진핵 세포의 표면 상에 제시된 면역원성 단백질은다중-촉매적 단백질 복합체, 즉, 프로테아좀의 단백질 분해에 의해 우비퀴티닐화(ubiquitinylated)되고, 분해되어야 한다. 프로테아좀은 면역원성 단백질을 통상 길이가 8개 내지 10개의 아미노산인 펩티드로 분해한다. 이러한 펩티드는 ER(소포체)로 운반되어, 여기에서 헤테로이량체 MHC 클래스 I 분자와 결합되고, MHC 항원 복합체는 이후 세포 표면으로 운반된다. 세포 표면 상에서, MHC 항원 복합체는 세포독성 T-림프구에 대한 특이적 수용체에 의해 인지될 수 있다[참조: Rock and Goldberg[6]].
펩티드 알데히드와 같은 세포 투과성 프로테아좀 억제제를 세포 배양물에 첨가함으로써 진핵 프로테아좀의 활성을 억제하고, MHC 클래스 I의 제시를 억제하는 것이 가능하다[참조: Rock et al. 1994[36]]. 턴오버 시간이 프로테아좀 억제제의 첨가에 의해 연장되는 클라미디아 단백질은 세균으로부터 분비되고, 이어서 프로테아좀에 의해 처리되는 듯하다. 또한, 본 발명의 이러한 면은 숙주 세포로 방출된 직후에 프로테아좀에서 분해되는 클라미디아 단백질의 검출을 가능하게 하며, 따라서 이들 단백직은 프로테아좀 억제제의 존재하에서만 검출가능하다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스 D 및 클라미디아 뉴모니애 VR1310 백신 후보물질을 포함하며, 이들 물질은 프로테아좀 억제제에 의한 영향을 받는다.
단백질 DT1, DT2, DT3, DT5, DT9, DT10, DT11, DT13, DT14, DT36, DT47, DT59, DT60, DT61, DT62(하기 표 IV에 기재된 바와 같음)은 턴오버 시간이 추적 기간 동안에 프로테아좀 억제제의 첨가에 의해 연장되는 클라미디아 트라코마티스 D 백신 후보물질의 예이다.
또한, 본 발명은, 회수 이전에, 라벨링 기간 동안 프로테아좀 억제제로 처리된 RB를 정제하는 방법이 제공된다. 프로테아좀 억제제로 처리되고 정제된 RB와 동시에 라벨링된 프로테아좀 처리된 전체 세포 용해물의 비교는, 추가로 어느 단백질이 숙주 세포 원형질로 분비되어 상기 프로테아좀에서 분해되는 가를 규명할 것이다. 추가로, 이러한 실험에서 숙주 세포주는 유전자 변형되어 유전자를 과발현시키는데, 이는 MHC 클래스 I 제한된 T-세포 에피토프[38.39,40]의 처리에 있어서 매우 중요하다[참조: Sijts, 2000, Van Hall, 2000, Shockett, 1995]. 이러한 세포주의 사용에 의해 프로테아좀 억제제의 효과는 보다 명백해질 것이다. 그러므로, 본 발명은 또한 MHC 클래스 I 항원의 제시에 관여하는 유전자에 있어서 유전자 변형된 구입가능한 숙주 세포주의 용도를 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 세포내 세균으로부터 분비된 단백질을 동정하는 방법과 관련되며, 이 방법은
1) 세포내 세균에 의해 숙주 세포를 감염시키는 단계;
2) 프로테아좀 억제제의 존재 및 부재하에 각각 숙주 세포를 배양시키는 단계;
3) 프로테아좀 억제제의 존재 및 부재하에 각각 배양된 감염된 세포에 존재하는 세포내 세균을 라벨링하는 단계;
4) 감염된 세포의 전체 세포 용해물을 제조하는 단계;
5) 프로테아좀 억제제의 존재 및 부재하에 각각 배양된 감염된 세포의 전체 세포 용해물의 2D-겔 전기영동 단백질 프로파일을 비교하는 단계;
6) 프로테아좀 억제제의 존재하에 배양된 전체 세포 용해물에는 존재하나, 프로테아좀 억제제의 부재하에 배양된 전체 세포 용해물에는 부재하거나 현저히 감소된 양으로 존재하는 단계 5)로부터의 단백질 스팟을 검출하는 단계 및
7) 상기 단계 6)에서 선택된 스팟에서 단백질을 동정하는 단계를 포함한다.
폴리클로날 항체의 일반화
본 발명은 백신 후보물질에 특이적인 폴리클로날 항체를 제공한다. 백신 후보 단백질을 엔코딩하는 유전자는, 예를 들어 결찰(ligation) 의존성 클로닝(LIC)-시스템을 사용하여 클로닝된다. 백신 후보물질의 서열을 포함하는 발현된 융합 단백질은 백신 후보물질 특이적 폴리클로날 항체(PAb)를 함유하는 혈청을 얻기 위해 토끼를 면역화시키는데 사용된다. 본 발명은 공동-편재화(co-localization)에 의해 항체의 올바른 특이성을 동정하거나, 백신 후보 물질의 인지되지 않은 이소형을 동정하기 위한 2D-PAGE 면역 블롯팅에 PAb를 사용한다. 본 발명은 표 III에 예시된 바와 같이 면역블롯팅 및 공동-편재화에 의해 백신 후보물질을 검증/동정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 PAb를 사용하여 예를 들어 간접적 면역형광 현미경법에 의해 백신 후보물질의 아세포 편재화를 결정한다.
그러므로, 본 발명은 또한 하기 단계를 추가로 포함하는 상기 방법에 대한 하나의 대안을 제공한다:
1) 상기 방법 중 어느 하나에 따라 동정된 세포내 세균으로부터의 단백질에 대한 항체를 수득하는 단계,
2) 단계 1)에서 수득된 항체를 사용하여 세균으로 감염된 세포의 전체 세포용해물에 대해 2D-PAGE 면역블롯팅시키는 단계,
3) 단계 2)에서 반응하는 단백질 스팟을 검출하는 단계, 및
4) 단계 3)에서 선택된 단백질 스팟 중에서 단백질을 동정하는 단계.
4가지 대안적인 방법의 조합 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명의 방법의 바람직한 구현에서, 세포내 세균의 라벨링은 [35S]시스테인, [35S]메티오닌, [14C]라벨링된 아미노산 또는 이들의 조합과 같은 방사성 수단에 의해 수행된다.
선택된 단백질 스팟 중에서 단백질을 동정하기 위한 방법은 MALDI TOF MA(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry), ESI Q-TOF MS(Electrospray Ionisation Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry), PSD-MALDI MS(Post Source Decay MALDI Mass Spectrometry) 또는 이러한 방법의 조합과 같은, 에드만 분해(Edman degradation) 또는 질량 분광법을 기초로 할 수 있다. 추가로, 상기 단백질은 동정 전에 브롬화 시아노겐 처리 또는 히드록실아민 처리와 같은 화학적 방법, 또는 트립신, 슬리모트립신, 키모트립신, 또는 펩신 등의 적합한 효소를 사용하는 효소적 방법 또는 이들의 조합에 의해 절단될 수 있다.
세포내 세균은 통성 세포내 세균 또는 편성 세포내 세균일 수 있으며, 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pnumoniae). 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미디아 시타씨(Chlamydia psitacci) 또는 클라미디아 페코룸(Chlamydia pecorum)과 같은 클라미디아 종으로부터의 세균(이들의 특이 혈청형변이주 또는 균주 포함)이 특히 주목된다. 그러나, 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 예르시니아(Yersinia) 또는 리스테리아(Listeria)와 같은 다른 세포내 세균 역시 본 발명과 관련하여 주목된다.
본 발명에 따라 사용되는 숙주 세포는 무한증식 세포주, 예컨대, HeLa, Hep2, McCoy 또는 U937, 포유 동물 공여체로부터 또는 부검에 의해 얻은 일차 세포주, 또는 유전성 변형된 세포주 또는 기관 세포 배양물, 또는 세균이 성장할 수 있는 그 밖의 세포와 같은 당해 공지된 통상의 숙주 세포일 수 있다. 이러한 숙주 세포는 세포내 세균으로 감염되기 전에 또는 그 동안에 IFN-γ로 처리되고/되거나 유전자 변형되어 클라미디아 백신 개발에 관련되는 것으로 인식되는 유전자를 과발현하거나 억제할 수 있다.
본 발명의 방법이 하나 이상의 프로테아좀 억제제를 사용하는 경우, MG132, MG262, MG115, 에폭시마이신, PSI 및 클래스토-락타시스틴-β-락톤과 같은 임의의 공지된 억제제가 사용과 관련된다.
본 발명의 방법은 전장으로 또는 이의 면역원성 단편으로 면역원성 조성물에 봉입시킬 용도 및/또는 진단 용도에 적합한 단백질, 특히, 면역원성 조성물에 봉입되기에 적합한 제한된 항원인, MHC 클래스 I 또는 클래스 II, 보다 바람직하게는 클래스 I로서 제시되기 위한 후보물질인 T-세포 에피토프를 포함하는 단백질을 동정하는데 특히 가치가 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 중요한 양태는 면역원성 조성물에 봉입시킬 용도 및/또는 진단 용도로 적용될 수 있는 상기 청구되는 방법 중 하나에 의해 동정될수 있는 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 관한 것이다.
본 발명의 단백질은 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니애로부터 분비된 단백질일 수 있다. 이러한 단백질은 및 이의 면역원성 단편은, 예를 들어 하기 표 I에 기재된 바와 같은 DT1-77 뿐만 아니라 하기 표 II에 기재된 CP1-CP69을 특징으로 하며, 표 I 및 II에는 각각 평균 오차가 +/- 10%로 측정된 pi 및 Mw 값이 기재된다.
표 I
24 h.p.i에서 전체 세포 용해물에는 존재하나 EB에서는 현저하게 감소되는 클라미디아 트라코마티스 D로부터의 분비 가능한 단백질의 리스트 및 이들의 예측된 pi/Mw( +/- 10% 평균 오차).
표 II
55 h.p.i에서 전체 세포 용해물에는 존재하나 EB에서는 현저하게 감소되는 클라미디아 뉴모니애로부터의 분비 가능한 단백질의 리스트 및 이들의 예측된 pi/Mw( +/- 10% 평균 오차).
본 발명의 보다 바람직한 단백질은 CT017(유전자명 CT017), CT044(유전자명 CT ssp), CT243(유전자명 lpxD), CT263(유전자명 CT263), CT256(유전자명 accA), CT286(유전자명 clpC), CT292(유전자명 dut), CT407(유전자명 dksA), CT446(유전자명 euo), CT460(유전자명 SWIB), CT541(유전자명 mip), CT610(유전자명 CT610), CT650(유전자명 reaA), CT655(유전자명 kdsA), CT668(유전자명 CT668), CT691(유전자명 CT691), CT734(유전자명 CT734), CT783(유전자명 CT783), CT858(유전자명 CT858), CT875(유전자명 CT875) 또는 ORF5(유전자명 ORF5)로서 클라미디아 게놈 프로젝트에서 상응하는 유전자 번호에 의해, 또는 표 IIIA에 제시된 단백질명 DT8에 의해 동정된 것들과 같은 클라미디아 트라코마티스 단백질, 및 표 IIIB에 의해 기재된 바와 같은 CPN0152(유전자명 CPN0152), CPN0702, CPN0705(유전자명 CPN0705), CPN0711(유전자명 CPN0711), CPN0998(유전자명 ftsH), CPN0104(유전자명 CPN0104), CPN0495(유전자명 aspC), CPN0684(유전자명 parB), CPN0796(유전자명 CPN0796),CPN0414(유전자명 accA), CPN1016(유전자명 CPN1016), CPN1040(유전자명 CPN01040), CPN0079(유전자명 RI10), CPN0534(유전자명 dksA), CPN0619(유전자명 ndk), CPN0711(유전자명 CPN0711), CPN0628(유전자명 rs13), CPN0926(유전자명 CPN0926), CPN1063(유전자명 tpiS) 또는 CPN0302(유전자명 lpxD)로서 상응하는 유전자 번호에 의해 동정된 것들과 같은 클라미디아 뉴모니애 단백질 및 이의 면역원성 단편이다.
표 ⅢA
표 ⅢB
동정된A의 예 : 클라미디아 트라코마티스 D
동정된B의 예 : 클라미디아 뉴모니애 백신 후보물질.
M: MALDI-MS, Q: ESI-Q-TOF MA, P: PSD-MALDI MS, I: 웨스턴 블롯
*: DT8은 신규한 오픈 리딩 프레임에 의해 엔코딩되는 발현된 단백질을 나타내며, 클라미디아 트라코마티스 D 게놈에서 주석을 달지 않았음.
도 10에 도시된 단백질 DT4, DT23, DT47, DT48, DT75, DT76 및 DT77, 및 도 11에 도시된 단백질 CP34, CP37, CP46, CP47, CP52, CP63 및 CP75가 특히 적절하다.
또한, 본 발명의 바람직한 단백질은 클라미디아 트라코마티스 단백질이며, 이는 프로테아좀 억제제의 존재하에 연장된 턴오버 시간을 가지며, 표 Ⅳ에 제시된 바와 같은 단백질 DT1, DT2, DT3, DT5, DT9, DT10, DT11, DT13, DT14, DT17, DT47, DT59, DT60, DT61 또는 DT62중 하나의 pi 및 Mw 특성(평균 오차 +/- 10%)에 의해 특징화된다. 동일한 방식으로 프로테아좀 억제제에 의해 조절되는 클라미디아 뉴모니애로부터의 단백질 또한 본 발명의 바람직한 구체예에 속한다.
표 Ⅳ
라벨링 및 추적 동안 상이한 프로테아좀 억제제의 처리에 의해 연장된 턴오버 시간을 갖는 동정된 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 예.
본 발명의 또 다른 바람직한 단백질은 클라미디아 트라코마티스 폴리펩티드 DT8이며, 이는 청구범위에서 동정된 바와 같은 서열 SEQ ID NO:1 및 이의 면역원성 단편을 포함한다.
본 발명의 이러한 양태의 또 다른 바람직한 구체예에서, 단백질은 본 발명의 단백질 또는 이의 단편에 대하여 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 추가로 바람직하게는 90% 이상,가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖거나, 본 발명의 단백질의 7개 이상의 연속 아미노산을 포함한다.
본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 단백질 또는 이들의 면역원성 단편을 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 화합물에 관한 것이다.
바람직한 핵산 화합물은 서열 SEQ ID NO:1을 포함하는 폴리펩티드 DT8을 엔코딩하는 서열(SEQ ID NO:2)을 포함하는 핵산 화합물이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 화합물을 포함하는 벡터 및 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단백질에 대한 항체를 생성시키기 위한 단백질 또는 이의 면역원성 단편의 용도, 본 발명의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 생산 동물(producing animal)에 투여하고, 이로부터 항체를 분리하여, 세포내 세균에 대한 항체를 생성시키는 방법, 및 이러한 방법에 의해 수득가능한 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 또 다른 양태에서 본 발명의 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 약제학적 또는 진단용 조성물, 본 발명의 항체 또는 핵산 화합물, 및 진단 시약 제조시 상기 단백질 또는 이들의 단편, 상기 항체 또는 핵산 화합물의 용도를 제공한다.
백신 후보물질로부터 T-세포 에피토프의 동정
본 발명은 본 발명에서 동정된 단백질 서열로부터 컴퓨터를 이용한 방법에 의해 예측되거나, 실시예에 추가로 설명된 검정에 의해 실험적으로 측정되는, T-세포 자극 효과를 가지며, MHC 클래스 I 항원으로서 발현되는 표면일 수 있는 T-세포 에피토프를 제공한다.
따라서, 본 발명의 중요한 또 다른 양태는 T-세포 자극 효과를 가지며, MHC 클래스 I 항원으로서 제시되는 표면의 역할을 하는 펩티드 에피토프에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 동정된 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대한 컴퓨터 예측, MHC 클래스 분자 결합 검정 및/또는 ELISPOT 검정과 같은 단계를 포함하여, 세포내 세균으로부터 분비된 단백질상의 T-세포 에피토프 및 펩티드 에피토프를 동정하는 방법이 제공된다. 본 발명의 이러한 양태의 일부로서, 또한 상기 펩티드 에피토프를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 화합물 뿐만 아니라 상기 핵산 화합물을 포함하는 벡터 및 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 바람직한 펩티드 에피토프는 본 발명의 단백질의 4개 내지 25개, 바람직하게는 6개 내지 15개, 더욱 바람직하게는 7개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, 에피토프는 클라미디아 트라코마티스 또는 클라미디아 뉴모니애 단백질의 7개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 펩티드 에피토프는 서열 SEQ ID NO:1을 포함하는 폴리펩티드의 4개 내지 25개, 더욱 바람직하게는 6개 내지 15개, 가장 바람직하게는 7개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 에피토프이다.
서열 SEQ ID NO.3 - SEQ ID NO.45로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는클라미디아 트라코마티스 펩티드 에피토프, 서열 SEQ ID NO.46 - SEQ ID NO.121로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 뉴모니애 펩티드 에피토프, 서열 SEQ ID NO.122 - SEQ IN NO.148로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 뉴모니애 펩티드 에피토프, 및 서열 SEQ ID NO.149 - SEQ ID NO.194로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 트라코마티스 펩티드 에피토프가 특히 적합하다. 본 발명에서 동정된 에피토프는 표 Ⅴ-Ⅷ에서 추가로 특징화된다.
표 Ⅴ
동정된 클라미디아 트라코마티스 단백질로부터 예측된 에피토프.
표 Ⅵ
동정된 클라미디아 뉴모니애 단백질로부터 예측된 에피토프.
표 Ⅶ
동정된 클라미디아 트라코마티스 단백질에 상동인 클라미디아 뉴모니애로부터의 예측된 에피토프.
표 Ⅷ
동정된 클라미디아 뉴모니애 단백질과 상동인 클라미디아 트라코마티스로부터 예측된 에피토프.
펩티드 에피토프는 융합 단백질의 일부이거나 담체 부분에 결합될 수 있다.
MHC에 결합되는 펩티드를 예측하는데 빈번하게 사용되는 방법에는 모티프 서치가 포함된다. 가장 정교한 모티프 서치는 MHC의 확장된 모티프를 나타내는 전체 매트릭스를 사용한다. 서열의 독립적인 조합 특이성이 평균 참작도(average consideration)로서 교정될 수 있다 하더라도, 이는 개별 펩티드에 대해서는 잘못된 것으로 명확하게 공지되어 있다. 또한, 결정 구조로부터, 하나의 부위치(sub-site)에서의 상호작용력이 다른 부위치에서의 상호작용력에 영향을 미치는 것으로입증되었다.
인공신경망(ANN)은 임의의 이러한 비선형의 서열 정보를 관리하고 인지하는데 특히 적합하다. 정보는 칭량된 연결부를 통해 특정 구조로 모두 연결된 입력층, 은익층(hidden layers) 및 출력층을 구비한 컴퓨터 네트워크로 트레이닝되어 분배될 수 있다. 이러한 ANN은 소정 출력값(이를 MHC 결합이라고 함)에 관련된 입력값(펩티드)을 인지하도록 트레이닝될 수 있다. 일단 트레이닝되기만 하면, 상기 네트워크는 결합과 친화성이 있는 복잡한 펩티드 패턴을 인지해야 한다. ANN 접근법이 사용되면, 트레이닝되는 세트의 사이즈와 품질이 주로 중요하게 작용할 것이다. 이는 특히 HLA에 적용되는데, 그 이유는 펩티드의 랜덤 세트의 약 1%만이 임의의 소정 HLA에 결합될 것이기 때문이다.
따라서, 최소 100개의 펩티드 바인더를 발생시키기 위해서는, 랜덤한 펩티드가 스크리닝될 경우, 약 10,000개의 펩티드를 합성시키고 시험해야 한다. 이는 트레이닝되는 세트 내에 최적수의 바인더를 사용하여 시험하는 경우에조차도 상당한 자원 및 인력을 요하는 제안일 뿐만 아니라 이는 시험할 모든 HLA에 대해서 반복적으로 실시되어야 한다.
따라서, 본 발명과 연계하여 매트릭스 예측법은 잠재적으로 고친화도로 결합하는 에피토프에 대한 SWISS-PROT(http://www.expasy.ch/sprot/) 데이터를 스캐닝하는데 사용되었다. 이들 다수가 합성되고 생화학적인 결합 검정법으로 시험되어 왔다. 예측된 바와 같이, 보다 높은 대표도(약 80%)의 고친화도 바인더가 수득되었다. 후속적으로 이러한 데이터가 ANN을 트레이닝시키는데 사용되었다.
시험된 4개의 MHC 클래스 I 분자 중의 4개에 대해서, 매트릭스로부터 유래한 예측보다 더 양호하게 ANN이 수행되었다. 상기 예측들은 일정한 방식으로 발생되었다 - 이로부터 바인더 대 비-바인더로의 임의 분류보다 더 실제적인 결합 IC50값이 예측된다. 실제로, 고친화도와 저친화도의 바인더 뿐만 아니라 비-바인더의 동정으로 이어지는 넓은 범위에 대해 바인더를 예측할 수 있었다.
본 발명은 백신을 제조하기 위한 본 발명의 펩티드 에피토프의 용도 뿐만 아니라 본 발명의 펩티드 에피토프를 포함하는 백신(이러한 백신은 허용가능한 부형제를 임의로 포함한다)의 용도를 추가로 포함한다.
본 발명의 추가 양태는, 클라미디아 감염과 같은 세포내 세균으로 인한 감염의 치료 또는 예방용 약제 조성물의 제조, 또는 대안적으로 클라미디아와 같은 세포내 세균의 존재를 검출하기 위한 진단 시약 또는 세포내 세균에 대해 생성되는 항체를 제조하는데 있어서의, 본 발명의 단백질, 본 발명의 항체, 본 발명의 핵산 화합물 또는 본 발명의 펩티드 에피토프의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 사람에게서 면역 반응을 유도하는 방법, 특히 클라미디아 뉴모니애 또는 클라미디아 트라코마티스와 같은 세포내 세균에 의한 사람의 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 사람에게 면역학적 유효량의 본 발명의 단백질, 항체, 핵산 화합물 또는 펩티드 에피토프를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
종국적으로, 본 발명은, 각각 본 발명의 단백질 또는 이들의 단편, 또는 본 발명의 펩티드 에피토프를 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 숙주 세포를,상기 단백질 또는 펩티드 에피토프를 엔코딩하는 핵산 화합물을 포함하는 벡터를 사용하여 형질전환시키고, 형질감염시킨 다음, 상기 숙주 세포에 의해 상기 단백질 또는 이의 단편이 발현되도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함한다.
본 발명을 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명한다.
실시예 1:
포유동물 세포 배양액의 감염
반-융합성 HeLa, HEp-2 또는 McCoy(미국 메릴랜드 록빌 ATCC) 세포 단층을 상기 [19.] 및 [17.]에 기술된 바와 같이 클라미디아 뉴모니애 VR 1310, 클라미디아 트라코마티스 혈청형변이주 A (HAR-13), D(UW-3/Cx) 또는 L2.(434/Bu)(ATCC)의 세포함유물 형성 유닛(IFU)을 사용하여 감염시켰다. 감염용 배지는 클라미디아 트라코마티스 A 및 D에 대해서는 RPMI 1640, 25 mM의 HEPES, 10%의 FCS. 1% w/v의 글루타민, 10 mg/ml의 젠타마이신이고, 클라미디아 트라코마티스 L2에 대해서는 RPMI 1640, 25 mM HEPES, 5%의 FCS, 1% w/v의 글루타민, 10 mg/ml의 젠타마이신으로 구성되어 있었다.
실시예 2:
펄스 라벨링/추적
2시간 동안 클라미디아 단백질을 라벨링시키기 위해서, 감염된 세포 배양물을 상기 문헌(Shaw et al., 1999, 2000)[18.][19.]에 기술된 바와 같이 RPMI 1640, 10 mg/ml의 젠타마이신, 40 ㎍/ml 시클로헥시미드, 100 μCi/ml[35S]-메티오닌/시스테인(스웨덴 웁살라에 소재한 아머샴 파마시아 바이오테크의 프로믹스)를 함유하는 배지 내에서 인큐베이션하였다. 라벨링 후에, 라벨링된 배지를 정상 성장 배지, 이어서 정상 성장 세포 배지 내의 2개의 워시로 교환시킨 다음, 감염된 세포를 라벨링시킨 후의 적합한 상이한 시점에서 수집하였다. 마찬가지로, 클라미디아를 2시간의 라벨링 기간이 경과한 후에 72 h.p.i.까지 성장시킴으로써, 라벨링된 EB 단백질을 수득하였다. 이후, 라벨링된 EB를 수집하고, 이를 클라미디아 트라코마티스(참조: Schacter and Wyrick, 1994)[22.]) 및 클라미디아 뉴모니애(참조: Knudsen et al. 1999 [17.])에 대해서 본질적으로 기술된 바와 같이 밀도 구배 원심분리의 연속적인 2단계를 사용하여 정제하였다. EB의 제조 및 펄스 추적 제조시의 단백질을 정확한 2D-PAGE 단백질 프로파일 비교를 용이하게 하도록 전체 세포 용해물로부터 제조된 단백질과 동일한 간격으로 라벨링하였다.
실시예 3:
샘플 제조
후속하는 [35S]-라벨링 세포를 PBS로 2회 세척하고, 이를 9M의 우레아, 4% w/v의 3-[(3-콜아미도프로파일)디메틸암모늄]-1-프로판술포네이트(CHAPS; 독일 로셰), 40 mM의 트리스 염기, 65 mM의 DTE 및 파말라이트 3-10(아머샴 파마시아 바이오테크)을 함유하는 표준 세포용해 완충액 중에 가용시켰다. 고분자량 및 소수성 단백질을 풍부하게 존재시키기 위해서, 7M의 우레아, 2 M의 티오우레아, 4% w/v의 3-[(3-콜아미도프로파일)디메틸암모늄]-1-프로판술포네이트(CHAPS; 독일 뵈링거만하임), 40 mM의 트리스 염기, 65 mM의 디티오에리트레티올(DTE) 및 2% v/v의 파말라이트 3-10(아머샴 파마시아 바이오테크)을 하기 문헌(참조:Harder et al. 1999[23.])에 기술된 바와 같이 사용하였다. 전체 세포 용해물 또는 정제된 EB를 함유하는 샘플을 초음파처리하고, 이를 10분 동안 10,000 ×g에서 원심분리하였다. 샘플을 사용시까지 -70℃에서 저장하였다.
실시예 4:
클라미디아 단백질의 제조
전체 세포 용해물 및 정제된 EB로부터의 클라미디아 단백질을, 문헌(참조: Shaw et al., 1999, 2000)에 기술된 바와 같이 2차원 겔 전기영동법으로 분리하였다.
1차원 등전 포커싱(isoelecric focusing)을 위하여, 18cm 길이의 pH 3-10 NL(비선형), 4-7 L(선형) 또는 6-11(선형)의 부동화된 pH-구배의 드라이스트립(아머샴 파마시아 바이오테크)을 IPGphorTM을 사용하여 20℃에서 12시간 동안 350㎕의 세포용해 완충액 중에서 샘플량의 200,000 분당 카운트(counts per minute, cpm)의 라벨링된 단백질을 사용하여 재팽윤시켰다. 본 발명에 사용된 그 밖의 스트립에는 매우좁은 IPG 스트립이 포함된다. 상기 스트립은 표 IX에 기술되어 있다. 이들에 의해 실험자들이 필요에 따라 당해 단백질을 함유하는 특이적인 pH 간격 상에서 포커싱할 수 있게 된다. 20℃에서 실시되는 등온 포커싱 동안의 전압을 하기한 대로 프로그래밍하였다: 3-10 NL, 4-7 L 및 6-11 L의 드라이스트립을 사용하는 경우에, 300V에서 1시간, 300 내지 500V에서 2시간(선형적으로 증가함), 1000V에서 1시간,2000V에서 1시간, 3500V에서 3시간 및 24시간에서 5000V.
표 IX:
IPG 스트립명 선형성 포함된 pH 간격 스트립 길이
이모빌라인 드라이스트립 pH 3-10 비선형 3-10 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 3-10 선형 3-10 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 4-7 선형 4-7 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 6-11 선형 6-11 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 6-9 선형 6-9 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 3.5-4.5 선형 3.5-4.5 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 4-5 선형 4-5 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 4.5-5.5 선형 4.5-5.5 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 5-6 선형 5-6 18cm
이모빌라인 드라이스트립 pH 5.5-6.7 선형 5.5-6.7 18cm
시판되는 IPG 드라이스트립의 샘플 리스트가 본 발명에 유용함.
제 1 디멘션 후에, 드라이스트립을 6 M의 우레아, 30% v/v의 글리세롤, 2% w/v의 DTE, 2% w/v의 SDS, 0.05 M의 트리스-HCl(pH 6.8)을 함유하는 완충액 중에서 15분 동안 평형화시켰다. 이후, 이 스트립을 DTE가 2.5% w/v의 요오드아세트아미드로 대체된 완충액 중에서 추가 15분 동안 평형화시켰다. 제 2 디멘션에 대해서는, 9-16%의 선형 구배의 SDS-PAGE 겔(18 cm ×20 cm ×1 mm) 상에서 단백질을 분리시키는데 프로테인 II xi 멀티셀 시스템(미국 캘리포니아 리치몬드 바이오-라드)을 사용하였다. 분석용 겔을 10%의 아세트산 및 25%의 2-프로판올을 함유하는 용액 중에서 30분 동안 고정시키고, 이를 30분 동안 앰플리파이(Ampiify: 아머샴 파마시아 바이오테크)로 처리하였다. 라벨링된 단백질을 -70℃에서 코닥 바이오맥스-엠알 필름(아머샴 파마시아 바이오테크)에 8일 내지 10일 동안 노출시킨 후에 방사선 사진으로 가시화시켰다.
도 1a는, 22-24 h.p.i.로부터 라벨링된 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 고해상도 분석용 3-10 IPG 2D-겔(표준 세포용해 완충액을 사용하였음)의 방사선 사진의 일 실시예를 나타낸다. 도 2a는 55-57 h.p.i.로부터 라벨링된 클라미디아 뉴모니애 단백질의 3-10 IPG 2D-겔(티오우레아를 함유하는 세포용해 완충액을 사용하였음)의 방사선 사진의 일 실시예를 나타낸다. 전체 대략 600개의 단백질 스팟을 멜라니 II 소프트웨어에 의해 예측된 바와 같이 각 겔 상에서 가시화시킬 수 있었다.
질량 분광법에 의한 분석용 샘플을 제조하기 위해, 2D 겔을 500 내지 1000 ㎍의 전체 세포 용해물과 함께 러닝시켰다. 라벨링되지 않은 샘플과 나란히 성장시킨 세포로부터의 [35S]-단백질 라벨링된 단백질의 X선 필름 2 ×106cpm 상에서 제조용 겔 상의 단백질을 가시화시키기 위해, 동일한 겔 상에서 러닝시켰다. 제조용 겔을 dd H2O중에서 10분 동안 세척하고, 고정되지 않은 상태로 건조시켰다. 방사선활성의 잉크를 겔 측면 상의 앵커(anchor) 스팟을 마킹하는데 사용함으로써, 노출후에 건조된 겔 및 이에 상응하는 X선 필름의 정확한 매칭이 실시될 수 있었다. 해당 당백질을 절단하고, 이를 최소 3개의 동일한 겔로부터 함께 풀링하였다. 숙주 세포의 오염이 질량 분광분석에 의한 동정시에 문제가 되는 경우, 분리 거리를 더욱 넓히는데 좁거나 매우 좁은 드라이스트립(표 4)을 사용하는 겔을 사용하였다.
실시예 5:
MALDI MS, ESI-Q-TOF MS, PSD MALDI MS 및 에드맨 분해를 사용한 백신 후보물질의 동정
백신 후보물질을 나타내는 전체 세포 용해물의 제조용 겔로부터의 단백질 스팟을 트립신과 함께 겔내 소화시켰다. 생성되는 펩티드는 역상 컬럼(참조: Gobom et al., 1999, [20.]), 또는 프로스 R2 물질(참조: Gevaert et al., 1997[21.])로 구성된 비드를 사용하여 정제하였다. 후속적으로, 샘플을, 반사 모드로 작동되는 브루커 리플렉스 말디(REFLEX MALDI) 비행시간 질량 분광분석계(독일 브레멘 브루커-달토니크 게엠베하)를 사용하여 검정하였다. 생성되는 질량을, 상기 기술(참조: Schev-chenko 1996 [24.])된 바와 같이 펩티드 맵핑에 의한 데이터베이스로 존재하는, 이론적인 트립신 작용에 의한 단백질의 분해에 의해 발생된 펩티드 질량과 비교하였다.
MALDI MS를 사용하여 DT1을 CT668로서 동정하는 것에 대한 실시예가 도 3에 도시되어 있다. 도 3a는, MALDI 질량 분광계에 의해 수득된 펩티드 질량 지문을 나타낸다. 수득된 질량을, 프로스펙터 소프트웨어 MS-Fit을 사용하여 데이터베이스로 존재하는 모든 단백질의 이론적인 트립신작용에 의한 분해 생성물에 매칭시켰다. 이러한 서치를 겔 상에서 동정된 단백질에 근접한 pi/Mw 영역으로 제한시키는 경우, 최고로 랭크되는 단백질은 CT668(도 3B)이었다. 그러나, 숙주 세포로부터의 단백질이 때때로 전체 세포 용해물과 함께 겔로부터의 스팟으로 존재하기 때문에, 동정 결과가 모호해질 수 있다. 따라서, 필요에 따라 탄뎀 질량분석계 및PSD(post source decay) 검정법을 사용하여 결과를 확인하였다[참조: Reviewed in Mann and Wilm, 1995[25.], Gevaert, 1997[21.]].
겔내 소화에 의해 발생된 펩티드의 탄뎀 질량 분광분석은 전기분무 이온화 4극 비행시간(ESI-Q-TOF) 질량 분광분석계(영국 맨체스터 마이크로매스) 상에서 실시되었다. 이 방법을 사용하여 단일의 이온화된 펩티드가 샘플로부터 분리되었다. 기체상 대기와의 충돌에 의한 이러한 모 이온의 분획화를 통해서, 신규한 다수 이온이 발생되어 이것이 신규한 펩티드 질량 지문으로 기록되었다. 이러한 신규한 이온을 단 하나의 아미노산에 의해 그 크기를 구별하고, 이로써 고유 펩티드의 아미노산 서열의 상세 부분이 제공된다[참조: Mann and Wilm, 1995, ]25.]].
도 4a는 서열을 형성하는, DT1로부터의 분획화된 펩티드 모 이온의 일예를 나타내는데, BLAST 또는 MS-Tag를 사용하는 데이터베이스 서치를 통해서 이것이 CT668 단편에 상응하는 것으로 동정되었다. 사람의 프로게스테론에 결합하는 단백질로부터 비롯되는 서열 태그가 또한 CT668 샘플로부터 동정되었다.
또한, 상기 서치가 사람 단백질에 제한되는 경우에, 이러한 단백질로부터의 펩티드는 MALDI MS 펩티드 질량 지문(2 헤드의 화살, 도 3A)으로 검출될 수 있었다. 이로부터, 하나 이상의 단백질을 함유하는 문제되는 스팟이 ESI-Q-TOF에 의해 모호하게 동정될 수 있고, 이로써 문제되는 MALDI MS 동정에 부합된다.
MALDI 결과를 확인하기 위해 본 발명에 사용된 또 다른 접근법은 PSD이었다. PSD는, 동일한 속도의 펩티드 단편이 상이한 질량을 가짐으로 해서 상이한 운동 에너지를 갖도록 의도되는 이온화 후에, 준안정한 감쇠가 일어나는 펩티드를 사용한다. 운동 에너지 차는 상기 단편들을 자기장내에서 반사시킴으로써 얻어질 수 있다. 에너지가 높은 단편들은 에너지가 낮은 단편들보다 자기장 내로 추가로 관통하여 감쇠될 것이다. 분획화가 펩티드 결합에서 주로 일어남에 따라, 단일 펩티드 분류로부터 비롯되는 스펙트럼을, 펩티드 서열 태그(PST)의 아미노산 서열을 추론하는데 사용할 수 있다[참조: Mann et al., 1999, (28.)]. PST를 단백질 데이터베이스에 대해 매칭시켜서 이들이 유래하는 단백질을 동정할 수 있다[참조: Wilkins et al., 1996 [27.]].
CPN 1016 내지 PSD MALDI MS로서 스팟 번호 CP63의 동정에 대한 일예가 도 4b에 도시되어 있다. PSD내에서의 전체 36개의 동정된 질량으로부터, 스펙트럼 16이 하나의 질량 유닛 내에서 1919.80 Da의 모 이온 (R)ELLFGWDLSQQTQQAR(L)의 서열을 갖는 펩티드의 이론적인 분획화로부터 유래하는 질량에 매칭될 수 있었는데, 이는 클라미디아 뉴모니애로부터의 CPN 1016 단백질에 매칭되었다.
질량 분광법을 사용하여, 클라미디아 트라코마티스 D(표 3a) 및 클라미디아 뉴모니애(표 3b) 백신 후보물질의 동정에 대한 예가 제공된다. Mw 및 Pi값이 ±10%의 평균 오차로서 전기영동으로 측정되었다.
CT858은 이론적으로 67 kDa의 Mw를 가짐으로써 동정된 단백질이 보다 큰 단백질의 가공된 단편이라는 것을 나타낸다. 사실 DT4의 ESI-Q-TOF 분석으로부터의 모든 3개 펩티드는 단백질의 C-말단 부분에 위치된다.
또다른 스팟에서, 겔의 기저 영역에 위치하는 DT48은 CT858을 또한 함유한다. DT48을 CT858로 동정하는 모든 펩티드는, DT48이 CT858의 N-말단 단편을 표현하는 것으로 암시하는 단백질의 N-말단 부분에 매칭된다.
CT610은 클라미디아 트라코마티스 D 및 L2 양자에서 MALDI MS 및 에드만 분해법 양자에 의해 동정되었다. 그러나, 단백질은 전체 세포 용해물와 비교하여 EB내에서 상당히 감소되었고 그리하여 여전히 백신 후보물질로서 고려되었다. 에드만 분해법에 의한 CT610의 동정은 클라미디아 트라코마티스 L2 CT610으로부터 수행되었다. N-말단은 MNFLDQ로서 결정되었고, 이것은 클라미디아(Chlamydia) 게놈 프로젝트(Stephens et al 1998b)[35.]에 의해 예상되는 MMEVFMNFLDQ 서열과는 상이하다.
DT8은 ESI TOF MS에 의해 생성되는 4개의 서열 태그에 기초하여 동정된다. 이들 서열은 클라미디아 트라코마티스 D 게놈[35.]내의 예상되는 임의의오픈 리딩 프레임에 대응되지 않는다. 그러나, 모든 6개의 리딩 프레임에서 BLAST로 클라미디아 게놈을 탐색함으로써, 모든 4개의 서열 태그에 대하여 상당한 매칭이 생성될 수 있었다. 펩티드 및 그 주변을 엔코딩하는 DNA 서열의 분석은 리보솜 결합 위치를 포함하는 신규한 오픈 리딩 프레임을 명확히 하였고, 이것은 7.2 kDa 단백질을 포함하였다. DT8의 번역된 DNA 서열이 도 5에 도시되었다. 이러한 발견은, 본 발명에서 사용된 질량 분광적인 접근이 어떻게 거대 게놈 서열화 프로젝트에서는 무시될 수 있는 유망하고 중요한 ORFs 엔코딩 백신 후보물질을 동정할 수 있는가를 설명한다.
클라미디아 뉴모니애로부터의 스팟 CP63은 두 가지 모두의 클라미디아 종내에서 이들 단백질을 처리하는 것을 의미하는 CT858의 클라미디아 뉴모니애 동족체(도 2B 및 C, 표 Ⅲb)인 CPN1016의 N-말단 단편으로서 동정되었다.
하기 실시예에서 동정된 단백질의 구체적인 특성에 대한 보다 상세한 조사가 제공될 것이다.
실시예 6
감염된 세포의 전체 용해물과 정제된 RB의 비교
클라미디아 트라코마티스 또는 클라미디아 뉴모니애 감염된 세포를 실시예 2에 설명된 바와 같이 시클로헥스이미드의 존재하에 2시간 기간 동안 [35S]-메티오닌/시스테인으로 라벨링하였다. 라벨링 기간 마지막에, 감염된 세포는 실시예 3에 설명된 바와 같이 세포용해 완충물내에서 직접 채취되거나 클라미디아 RB의 중간 정제를 위해 사용되었다. RB의 정제는 본질적으로 참고문헌(Schachter and Wyrick, 1994)[22.]에 개시된 바와 같이 밀도 구배 초원심분리에 의해 수행되었다.
도 10에서, 22-24 h.p.i.로부터 라벨링된 감염된 HeLa 세포의 전체 세포 용해물로부터 수득된 클라미디아 트라코마티스 D. 단백질의 겔 이미지에서의 영역의 예들이, 22-24 h.p.i.로부터 라벨링된 클라미디아 트라코마티스 D 감염된 HeLa 세포로부터 정제된 RB 및 EB의 겔 이미지에서의 대응 영역과 비교되었다. 질량 분광법에 의한 동정이 표 Ⅲ에 열거된 바와 같이 DT4(CT858의 C-말단 단편), DT48(CT858의 N-말단 단편) DT23(Mip), DT76(가설적 단백질 CT691)에 대하여 수득되었다.
도 11에서, 55-57 h.p.i.에서 라벨링된 클라미디아 뉴모니애 감염된 HEp-2 세포 및 발생 주기에 걸쳐 특정 시점에 라벨링된 정제된 EB로부터의 겔 이미지에서의 영역의 예들이, 34-36 hpi에서 라벨링되고, 36 h.p.i.에서 라벨링된 감염된 세포의 전체 세포 용해물로서 채취되거나 또는 36 h.p.i.에서 RB로서 정제된 클라미디아 뉴모니애 감염된 세포 배양물의 이미지에서의 대응 영역과 비교되었다.
도 11에서 원이 그려진 단백질 스팟은 다음과 같이 동정되었다. 도 11A 및 E는 CP34 및 CP63을 도시하고, 이들은 CPN1016의 2개 단편으로서 동정되었다. 도 11B는 CP37을 도시하고, 이것은 CPN0998로서 동정되었다. 도 11C는 CP46 및 CP47을 도시하고, 이들은 각각 CPN0796 및 CPN0705로서 동정되었다. 도 11D는 CP52를 도시하고, 이것은 CPN0152로서 동정되었다. 도 11F는 CP75를 도시하고 이것은 CPN0619로서 동정되었다.
실시예 7
타입 Ⅲ 분비 유전자 서브클러스터내에 위치한 단백질의 검출 및 동정
대부분의 세포내 세균내의 타입 Ⅲ 분비 유전자가 병원성 아일랜드로서 하나의 유전자 클러스터에서 발견되는 반면, 클라미디아 타입 Ⅲ 분비 유전자는 클라미디아 트라코마티스 및 클라미디아 뉴모니애 양자의 게놈내의 상이한 부위에 위치하는 3개의 상이한 서브클러스터내에서 동정되었다(Stephens et al., 1998[4.] 및 Kalman et al., 1999 [5.]). 클라미디아 트라코마티스 A, D 및 L2, 및 클라미디아 뉴모니애 VR1310의 광역 단백질학적 분석의 일부로서, 타입 Ⅲ 분비 클러스터내에 존재하는 단백질이 정제된 EB에 의해 수행된 겔로부터 동정되었다.
클라미디아 트라코마티스로부터 동정된 타입 Ⅲ 분비 단백질은, 세균 원형질로부터 분비 조직으로 단백질을 전달하는데 필요한 Yop 분비 ATPase(yscN), Yop 전위기(translocator) 단백질 L(YscL), 및 분비 샤프론(SycE)을 포함한다. 추가로 동정된 클라미디아 트라코마티스 D 단백질은 그 기능이 알려져 있지 아니하며 타입 Ⅲ 분비 서브클러스터내에 위치하고 있는데, CT560 및 풍부한 CT577 및 CT579를 포함한다. CT668은 전체 세포 용해물내에 분명히 존재하지만, 정제된 EB에는 부재하며, YscN 다음에 위치하기 때문에 이 단백질이 분비될 수 있다. 그 단백질의 게놈 위치는 도 9에 도시되어 있다.
클라미디아 뉴모니애에 대하여, 타입 Ⅲ 분비 기구 단백질 LcrE(CPN0324), YscC(CPN0702), YscN(CPN0707) 및 YscL(CPN0826)은 내포 막에 위치하기 때문에 정제된 EB에는 부재하며, 이것은 숙주 세포의 원형질에 노출되어 있다. YscC(CPN0702) 및 YscN(CPN0707) 주위에 위치한 타입 Ⅲ 클러스터에 존재하는 2개의 단백질이 정제된 EB에서보다는 전체 세포 용해물내에서 상당히 높은 양으로 검출되었다. 이들은 CPN0705(CP90, 도 2, 표 Ⅱ) 및 CPN0711(CP76, 도 2, 표 Ⅱ)이다. 이들 단백질은 또한 내포 막내에 위치하거나 숙주 세포의 원형질내에 존재할 수 있으며, 양자의 경우에 이들 단백질은 프로테아좀에 접근가능하다.
실시예 8
분비된 단백질에 대한 후보물질의 펄스 추적 연구
동정된 후보 단백질이 감염된 세포내에 존재할 수 있는 시간을 측정하기 위하여, 본 발명은 일련의 펄스 추적 연구법을 제공한다. 하기 실시예에서, 감염된 세포 배양물은 22-24 시간으로부터 라벨링된 [35S]이다. 라벨링 기간 이후에, 매질을 [35S]-메티오닌이 없는 정상 RPMI 성장 매질로 전환하고, 세포를 라벨링 후상이한 시점에서 회수하였다. 여러 독립적인 연구에서 수득된 결과는 적은 변화를 나타내었는데, 아마도 숙주 세포 밀도 및/또는 감염 효율에서의 적은 차이 때문일 것이다.
도 1 B, C, D 및 E는 펄스/추적 시험의 예를 제공한다. CT668 및 DT8(각각 도 1: A, B)의 강도는 합성 후 1.5 시간에 상당히 감소되었고, 4.5 시간에서 및 EB 단계까지는 겔로부터 실질적으로 없었다. CT610 및 CT783(도 1: C, D)는 상당히 감소되었으나, 4.5 시간에서 및 EB 단계까지는 여전히 검출할 수 있었다.
CT858(D)의 C-말단 단편(및 CT858의 N-말단 단편)은 제 1 추적 기간 동안에 점진적으로 증가하였으나, EB에서 부재하였고, 이것은 클라미디아의 발생 동안에 절단 생성물이 축적되었다는 것을 의미한다. CT858, CPN1016의 클라미디아 뉴모니애 동족체의 N-말단 단편도 EB에서 부재하였다(도 2).
실시예 9
프로테아좀 억제제가 병용된 펄스 추적 연구
이 실시예는, 프로테아좀에서 프로세싱되는 백신 후보물질을 어떻게 결정할 것인가를 보여준다. 세포 투과성 프로테아좀 억제제를 라벨링 및 추적 기간 동안에 감염된 세포 배양물로 첨가하고 이것을 프로테아좀 억제제를 첨가하지 않은 라벨링/추적에서 관찰된 단백질의 턴오버 시간과 비교하였다. 이러한 접근법의 중요한 예가 도 6에 도시되었다. 단백질은 22-24 h.p.i.로부터 프로테아좀 억제제 MG-132의 10-100μM의 존재 또는 부재하에 라벨링되었다. 그 후, 라벨링 매질은 정상 성장 매질내에서 2회 워시 후에 M132의 존재 또는 부재하에 성장 매질로 대체되었고, 24 h.p.i. 내지 28 h.p.i.로 추적되었다. 세포 용해물은 2D-PAGE(IPG) 상에서 러닝되고, MG-132 부재의 대조군 및 라벨링 직후 회수된 단백질을 가진 겔과 비교되었다(도 6A, B 및 C). 본 발명은 15개의 클라미디아 트라코마티스 D 단백질의 예를 제시하며, 이들은 프로테아좀 억제제로 처리되었기 때문에 턴오버 시간이 증가되었다.
DT9, DT10 및 DT11의 수준은, 라벨링 기간 직후 회수된 대조군에서 보다 추적된 +MG132 겔에서 실질적으로 높았다. 이것은 DT9, DT10 및 DT11이 프로테아좀에 의해 급속히 분해됨을 나타낸다. 대조적으로, DT7의 수준은 프로테아좀 억제제의 첨가에 의한 영향을 별로 받지 않았다.
본 발명은 프로테아좀의 촉매 작용 중 상이한 부분을 억제하는 기타 여러 프로테아좀 억제제(예를 들어, MG115, MG262, PSI 및 락토시스테인)의 용도를 포함하며, 이에 의해 프로테아좀내에서 분해되는 다른 단백질을 명료히 할 수 있다(표 Ⅳ).
실시예 10
유전적으로 변경된 세포주를 사용하여 클라미디아 단백질의 턴오버 시간에 대한 프로테아좀 억제제의 효과를 검정
본 발명은 또한 시판되는 마우스 태아 세포주 MEC-PA28 세포주 PW8875의 용도를 제공한다. MEC-PA28은 프로테아좀의 IFN-γ 유도성 PA28 알파 및 베타 서브유닛으로 형질감염되었고, MEC217 세포주는 프로테아좀의 LMP2, LMP7 및 MECL로 형질감염되었다. MEC-PA28 및 MEC217은 준 집단(semi confluence)으로 성장하였고,클라미디아 트라코마티스 또는 클라미디아 뉴모니애로 감염되었다. 대조군 마우스 태아 세포주는 프로테아좀 서브유닛으로 형질감염되지 않았고, 병행 감염되었다.
세포주 MEC-PA28 및 MEC217로부터 과발현된 서브유닛을 엔코딩하는 형질감염된 유전자가 MHC 클래스 I의 프로세싱 및 제시에 필수적이므로, 펄스 라벨링/추적과 병용하여 프로테아좀 억제제를 사용하는 시험 절차는 이전에 언급된 바와 같이 이들 숙주 세포를 이용하여 수행되었다.
실시예 11
백신 후보물질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 클로닝 및 발현
백신 후보물질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 클로닝 및 발현은 제조업자의 지시에 따라 pET-30 LIC 벡터 키트(Novagen, Madison, USA)를 이용하여 수행되었다.
유전자의 PCR에 사용된 프라이머는 하기 5'-말단 및 3'-말단 LIC 오버행을 가졌다.
포워드 프라이머: 5' GACGACGACAAGATX-유전자 특이적 서열 3'
리버스 프라이머: 5' GAGGAGAAGCCCGGT-유전자 특이적 서열 3'.
(X: 삽입 특이적 서열의 제 1 누클레오티드)
전장 유전자 또는 리더 서열이 없는 유전자가 엑스팬드TM고정밀 PCT(Roche, Germany)을 이용하여 PCT에 의해 증폭되었다. 하기와 같이 DNA 말단 사이클러(GeneAmp PCR 시스템 9600, Perkin Elmer) 상에서 35회 PCR-사이클이 수행되었다: 92℃에서 15초(변성), 55℃에서 15초(프라이머 어닐링) 및 68℃에서 4분(연장). 수득된 PCR 생성물은 유전자 특이적 서열에 인접한 LIC-오버행을 포함하였다. PCR 생성물은 위저드(Wizard: Promega, Madison, USA) 정제되었고, p-ET-30 벡터로 결찰되었다. pET-30 벡터는 카나마이신 내성 및 LIC 클로닝 위치 상류의 히스티딘 태그을 엔코딩하는 유전자를 함유한다.
후보 유전자를 함유하는 pET-30 벡터는 컴피턴트 이.콜라이(E. coli) 노바 블루(Nova Blue) 균주로 형질전환되었다. 카나마이신 한천 플레이트 상에서 콜로니가 선별되었고, 선택된 콜로니상에서 벡터 특이적 프라이머 및 삽입 특이적 프라이머를 사용하여 대조군 PCR이 수행되었다. 플라스미드 DNA가 후보 유전자 특이적 삽입물을 함유하는 양성 콜로니로부터 정제되었다. 후속하여 플라스미드 DNA가 이.콜라이(BL21)로 형질전환되었다. 삽입 양성 콜로니가 카나마이신 한천 플레이트 상에서 선택되었다. N-말단 위치된 히스티딘 태그를 포함하는 유전자 특이적 삽입물을 포함하는 융합 단백질의 발현이 1 mM IPTG(Apollo Scientific, GB)의 첨가로 500 ml LB-매질에서 유도되었다.
클라미디아 트라코마티스 D로부터의 CT668, CT858, CT783, CT610, YscN 및 DT8의 재조합 융합 단백질 및, 클라미디아 뉴모니애 VR1310으로부터의 CPN1016 및 YscC의 재조합 융합 단백질을 발현시키는 이.콜라이(BL21)가 생성되었다.
재조합 융합 단백질은 이전에 설명된 바와 같이 니켈 수지 칼럼(High Trap Sepharose, Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여 용해 세균으로부터 정제되었다. 정제된 단백질의 쿠마지(coomassie) 염색된 SDS-PAGE 겔을 러닝시켰다. 융합단백질을 나타내는 쿠마지 염색 밴드는 MALDI MS에 의해 뚜렷하게 동정되었고, 정확한 융합 단백질이 생성되었음을 확인시켜 주었다. 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청은, 누젠(Knudsen et al)에 의한 [17]에 설명된 바와 같이 뉴질랜드 화이트래빗에 프로인트 애쥬번트에 용해된 융합 단백질 50㎍을 근육내 3회 투여하고 PBS에 용해된 융합 단백질 50㎍을 정맥내 2회 투여하여 면역시킴으로써 수득되었다.
실시예 12
백신 후보물질에 대하여 PAbs를 이용한 웨스턴 블롯팅
PAbs가 정확한 백신 후보물질을 인식하고 있음을 확인하고 유효한 사후 번역적 변형 및 프로세싱을 가시화하기 위하여, 2D-PAGE 면역블롯팅이 수행되었다. 500㎍의 비라벨링체 및 2×106cpm의 라벨링된 클라미디아 트라코마티스 D 또는 전체 세포 용해물로부터의 클라미디아 뉴모니애 단백질을 2D-PAGE로 분리하고, 단백질을 PVDF 막상에 일렉트로블롯팅하였다. 150 mM NaCl(또는 고염내, 400 mM), 20 mM 트리스(트리스), 0.2% w/v 젤라틴, 0.05% v/v 트윈(Tween) 20 (Bio-Rad) 및 2% v/v 정상 염소 혈청(Dako, Glostrup Denmark)을 포함하는 완충액 내의 PAbs 1/500 - 1/1000 희석액을 이용하여 면역염색을 수행하였다.
사용된 2차 항체는 항체 완충액내에서 1/2000 희석된 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이션된 염소 항-래빗 IgG(Bio-Rad)이었다. 분명한 반응이 검출될 때까지 블롯을 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트 톨루이듐(BCIP)/니트로블루 테트라졸륨(NBT) (Bio-Rad)으로 염색하였다. 면역블롯을 컴퓨터 스캔하고, 후속하여 약 8일 동안 X-선 필름에 노출시켰다. 멜라니(Melanie) Ⅱ 소프트웨어를 사용하여 면역염색된 단백질을 이것의 [35S]-라벨링된 대응물과 비교하였다.
도 7a1 및 7a2에서, PAb245를 가진 총 2D-PAGE IMB 이미지의 CT858에 대한 예가 도시되었다. PAb245는 대응 라벨링된 배경(도 7A2)으로부터 확인되듯이, DT4(CT858 C-말단 단편) 및 DT48(CT858 N-말단 단편)과 재생적으로 반응한다.
도 7b1 및 7b4는 CT668 및 YscN을 가진 IMB를 도시한다. 겔 상의 면역반응성 단백질 스팟과 라벨링된 배경(도 7b2 및 b5)에 기초한 이들의 편재화는 분석적 겔상의 단백질의 위치에 대응하며(도 7b3 및 b6), 따라서 PAb가 정확한 단백질과 반응함을 확인시켜 준다.
본 발명은 비처리된 대조군과 비교하여 MG132로 감염 처리된 세포내에서 CT610의 특정 이소형의 수준이 분명하게 증가함을 나타내는 IMB의 예를 제공한다. DT7은 CT610으로 동정되었고, DT9, DT10, DT11 및 DT12(도 6A) 상에 위치하였다. 전체 세포 용해물의 2D-겔 블롯(도 7C1) 상의 CT610에 대한 PAb255를 가진 IMB는 2개 열의 스팟과 분명하게 반응하였고, 하나의 열은 DT7을 나타내고, 다른 열은 DT9, DT10, DT11 및 DT12를 나타내었다. 따라서, CT610은 아마도 상이한 사후 번역적 변형 및 프로세싱에 기인하여 상이한 이소형에 존재한다. 과량의 DT9, DT10 및 DT11은, 세포를 프로테아좀 억제제 MG132로 처리할 때 분명하게 증가하였다(도 7c2).
MG132의 존재 또는 부재하에 각각 6시간 동안 처리된 전체 세포 용해물로부터의 단백질을 이용하여 통상의 SDS-PAGE PVDF 블롯상에서 PAb255를 이용한 IMB를수행하였다. 도 7c4는 비처리된 대조군(레인 a 및 c)에 비교하여 MG132 감염 처리된 세포(레인 b 및 d)로부터의 단백질을 함유하는 레인내에서 DT7 열의 스팟을 나타내는 밴드 아래로 여분의 밴드를 분명하게 나타내었다. DT7 열을 나타내는 위쪽 밴드의 수준은 프로테아좀 억제제 처리에 의해 현저히 변경되지 않았다.
실시예 13:
상이한 클라미디아 트라코마티스( Chlamydia trachomatis ) 혈청형변이주 및 여러 숙주 세포에서 증식시 후보물질의 발현
본 발명은, 숙주 세포/클라미디아 상호작용이 기타 혈청형변이주에 대하여, 또는 기타 숙주 세포에서의 배양에 따라 상이할 수 있기 때문에, 잠재적으로 발현되는 단백질의 발현 수준에서 혈청형변이주/숙주 세포 특이차를 고려하였다. 이것은 통상적인 클라미디아 트라코마티스 백신에 대해 가능성이 가장 큰 백신 후보물질의 선택과 관련이 있다.
CT668, CT858, CT783 및 CT610은 모두 클라미디아 트라코마티스 A, D 및 L2의 동일한 위치에서 검출되었다. 이는 이들 단백질을 엔코딩하는 유전자가 클라미디아 트라코마티스 D와 L2간에 매우 고도로 보존된다는 것과 일치한다. 부가로, 모든 단백질이, 클라미디아 트라코마티스 A, D 및 L2가 HeLa 세포 대신에 McCoy 또는 Hep-2 세포에서 배양된 경우 발현되었고, 이는 이들 단백질의 발현이 사용된 세포 타입과는 무관하다는 것을 의미한다. 그러나, 22-24 h.p.i. 또는 34-36 h.p.i.로부터 라벨링된 클라미디아 단백질을 갖는 겔을 기준으로, DT8은 혈청형변이주 A 및 D에서 pI 5.1 및 Mw 7.5로 검출되었다. 그러나, 혈청형변이주 L2 DT8 은 단백질의 순전하량 및 등전점을 변화시키는 소수의 아미노산 치환으로 인해 pi 6.4 및 Mw 7.5에서 검출되었다.
실시예 14:
백신 후보물질의 간접적인 면역형광 현미경법
세미컨플루언트(semiconfluent) HeLa 세포 단층을 함유하는 유리 커버 슬립을 함유한 웰을 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) D로 감염시켰다. 세포의 약 50%만이 감염되어, 감염 및 비감염 세포간에 명확한 구별이 가능하도록, 낮은 역가의 클라미디아를 사용하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 상이한 h.p.i.에서 포름알데히드 또는 메탄올에 고정시키고, 간접적인 면역형광 현미경법으로 처리하였다. 필요에 따라, PAb를 아세톤으로 침전시킨 HeLa 단백질로 사전흡착시켜 사람 단백질에 대한 교차 반응을 최소화하였다.
도 8에 도시된 예에서, 사전흡착된 토끼 PAb의 1/200 희석액 및 클라미디아 트라코마티스에 대해 유도된 마우스 모노클로날 항체 MOMP (MAb 32.3) 또는 클라미디아 뉴모니애에 대해 유도된 항체 MAb18.3의 1/25 희석액을 사용하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트-컨쥬게이션된(FITC) 염소 항-토끼 (GAR) IgG 항체 및 로다민 컨쥬게이션된 염소 항-마우스(GAM) IgG 항체 (Jackson, Trichem, Denmark)를 2차 항체로서 사용하였다. 클라미디아 봉입체에 대하여 백신 후보물질의 아세포 편재화를 결정하기 위하여 이중 면역염색을 수행하였다.
DT8에 대해 유도된 PAb 249는 짧은 턴오버 시간을 가졌고, 클라미디아 봉입체내에서 RB와 약하게 반응하였다(Figure 8 A3). HeLa 세포 단백질과의 최소의 교차 반응에도 불구하고, 봉입체 이외의 숙주 세포 구조물에 대한 현저한 반응은 검출되지 않았다.
대조적으로, CT858은 비감염 세포가 아니라 감염 세포에서 숙주 세포 원형질을 뚜렷이 염색시켰다(도 8 B3). 일반적으로, 염색은 봉입체의 경계에서 보다 강했다. 숙주 세포 원형질의 염색은 펄스 추적 연구에 의해 예측된 긴 턴오버 시간과 일치하여 12 h.p.i 내지 72 h.p.i에서 가시화될 수 있었다. CT858에 상동인 클라미디아 뉴모니애 CPN1016에 대해 생성된 PAb가 클라미디아 뉴모니애에 감염된 Hep-2 세포와 반응한 경우 반응의 동일한 특성이 관찰되었다.
동정된 단백질에 대한 실시예의 설명
실시예 15:
스팟 번호 CT668 (DT1 및 DT2)
CT668은 타입 III 분비 유전자에 대해 상동인 유전자를 함유하는 서브클러스터의 하나에서 YscN ATPase의 바로 업스트림에 위치하였고 예측된 인식가능한 시그날 펩티다아제 절단 부위를 함유하지 않았다. CT668은 약 4 내지 6시간 동안 클라미디아 트라코마티스 D에 존재하였을 뿐이며, 그 동안 다량이 꾸준히 감소하였다. CT668에 대한 PAb는 단지 IMF중의 봉입체에서 RB와 약하게 반응하는 것으로 보일 뿐이지만, 이 단백질의 짧은 턴오버 시간을 고려하면, 이것은 숙주 세포에서 신속한 분해에 의해 설명될 수 있다. CT668은 12-40 h.p.i.로부터 검출되었고, 이는 단백질이 대부분의 세포내 발생 동안 생성된다는 것을 시사한다. 따라서, 클라미디아 트라코마티스는 숙주 세포에 연속적으로 CT668를 전달하며, 숙주 세포에서 작용을 나타내고 신속하게 분해될 수 있다.
CT668의 두가지 변종을 동정하였다. 염기성 변종이 22-24 h.p.i로부터 라벨링된 클라미디아 트라코마티스 단백질을 갖는 겔상에 가장 풍부하였고, 이를 후속하여 수집하였다. 흥미롭게도, 수행된 모든 연구에서 시간에 따라 산성 변종의 강도는 증가하였고, 염기성 변종은 감소하였다. CT668를 30분 간격으로 추적하였을 때, 산성 변종의 증가는 1시간째에 검출되었다(도 1b).
이러한 발견은 상기 변형이, 카르바밀화 또는 아미드화와 같은 변형을 초래할 수 있는 겔의 시험 조건에 기인하는 것이 아님을 시사할 수 있다. 대신, 상기 변형은 전적으로 단백질을 변형시키는 미지의 효소에 의해 일어나는 듯하다.
분비된 단백질의 변형은 클라미디아 시타씨에서 설명된 바 있으며, 여기서는 IncA가 봉입체막에 이동한 후 숙주 세포 Ser/Thr 키나아제에 의해 인산화된다(Rockey et al., 1997) [29.]. CT668의 턴오버 시간은 프로테아좀 억제제로 처리시 연장되었고, 이는 생산된 CT668중 적어도 한정된 량이 프로테아좀내에서 프로세싱될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 16:
스팟 번호 DT8 (DT8)
DT8은 신규한 7.2 kDa 단백질이며, 상동성 연구를 기준으로 하면, 클라미디아 트라코마티스 특이적 단백질이다. PSORT 분석 결과 이 단백질에 대해 인식가능한 리더 서열은 나타나지 않았다. 이론적 코디네이트 pI 5.21/7.2 kDa은 실험적으로 측정된 것과 매우 잘 일치하였다. CT668에 대해 인정된 많은 특성들은 또한 DT8에 대해서도 관찰되었다. 6시간 미만의 짧은 턴오버 시간이 관찰되었고 IMF는 RB와의 약한 반응만을 나타내었다.
DT8에서 정지 코돈 이후에, 단백질의 Rho-독립적인 전사 종결을 나타내는 가능한 스템-루프 영역이 예측될 수 있다.
실시예 17:
스팟 번호 DT7, DT9, DT10, DT11, DT12 (CT610)
CT610은 다른 유기체에서 분비와 관련된 유전자와 상동성을 갖는 유전자에 가까이 위치하지 않았다. 단백질은 전체 세포 용해물 및 EB 둘 모두로부터 동정되었으나, 멜라니 II 소프트웨어(Melanie II Software)에 의해 전체 세포 용해물에서 적어도 30분 이상 다량 존재하는 것으로 예측되었다. 단백질은 CT610에 대해 생성된 Pab255에 의해 측정된 바와 같이, 2개의 분자량 다형에 의해 설명되는 여러 이소형으로 검출되었다. 스팟의 열들은 DT7 (상부열) 및 DT9, 10, 11, 12 (하부열)을 나타내었다. 이러한 두 열 모두는 펄스 추적 연구에서 짧은 턴오버 시간을 가졌다. 흥미롭게도, 다량의 DT9, DT10 및 DT11은 펄스 추적/MG132 연구에 기초하여 프로테아좀 억제제로 처리시 현저히 증가하였다. 펄스 추적 연구는 Pab255를 사용한 SDS PAGE IMB에 의해 입증되었다.
따라서, 본 발명은 프로테아좀에서 CT610의 특정 이소형이 분비되고 프로세싱된다는 증거를 제공한다. CT610 이소형의 상이한 운명은 백신 후보물질에 대해 생성된 Pab를 이러한 이소형의 검출에 사용하는 것이 적절함을 보여준다.
실시예 18:
스팟 번호 DT3 (CT783)
CT783은 클라미디아 트라코마티스 단백질 이황화물 결합 이소머라아제인 것으로 제안되었다. CT783은 티오레독신 이황화물 이소머라아제(CT780) 및 메타노박테리움 써모오토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)의 단백질 이황화물 이소머라아제에 상동성을 나타낸다. 33개 아미노산 리더 서열은 PSORT 및 SignalP에 의해 예측될 수 있고 분해된 단백질의 이론적인 pi 및 분자량은 실험적으로 측정된 것과 일치하였다. 또한, CT783에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 4-7 L IPG를 사용한 2D-PAGE IMB에서 정확한 스팟을 염색시켰다.
N-말단 리더 서열의 분해로 인해, 이 단백질은 아마도, 타입 I 또는 III 시스템에 의해 분비되는 것이 아니라, 타입 II 시스템에 의해 분비되는 것 같다. 대부분의 PDI는 정상적으로 원형질막 주위공간에 위치하지만, 약한 PSORT 예측 결과 세균 내막에서 아세포 편재화가 제시되었다. CT783은 매우 짧은 턴오버 시간을 가졌고 합성후 약 4-6시간 추적후에 클라미디아에 실질적으로 존재하지 않았다.
CT783의 턴오버 시간은 프로테아좀 억제제에 의해 연장되었고 이는 프로테아좀에서의 유효한 프로세싱을 시사한다.
실시예 19:
스팟 번호 DT4 및 DT48 (CT858) 및 CP63 (CPN1016)
CT858은 분해가능한 N-말단 리더 서열을 가졌고, 67 kDa 원형질막 주위공간 단백질인 것으로 예측되었으나, 겔상에서 2개의 상이한 위치에서 동정되었다. DT4를 CT858로서 동정한 서열 태그는 모두 CT858의 C-말단 부분과 일치하였다. 전체 세포 용해물을 갖는 2D-PAGE PVDF 막상의 IMB에서, PAb245는 명백히 그리고 재현가능하게 이러한 C-말단 단편과 반응한다. 또한, Pab245는 DT4에 대해 나타난 바와 같이 펄스 추적 연구에서 긴 턴오버 시간을 갖는 단백질 스팟 DT48과 반응하였다.
DT48은 또한 MALDI MS에 의해 CT858의 N-말단 단편으로서 동정되었다. DT48의 분자 코디네이트는 pI 7.3/ Mw 25.8이었다. CT858 의 N-말단 부분은 상이한 길이의 N-말단(시그날 펩티드 없이)상의 pi/Mw 툴을 이용하여 실험적으로 측정한 것과 일치가능한 코디네이트를 갖는 펩티드를 생성한다. 이러한 분석은 K233S234M235부근의 분해 부위를 시사하는 것이다.
CT858의 N-말단 및 C-말단 단편이 EB 단계(72h.p.i.)까지 내내 2D-겔 상에서 검출될 수 있으나, 정제된 EB에서는 검출되지 않는다는 사실은 숙주 세포 원형질에서의 긴 턴오버 시간을 나타낸다. 이것은 IMF 연구에 의해 CT858이 숙주 세포 원형질내에서 72시간까지 매우 명백히 검출된다는 것과 일치한다. CT858은 페니실린 결합 단백질의 프로세싱과 관련이 있고 소수성 리간드와 결합하는 사람 인터포토리셉터 레티노이드 결합 단백질의 IRBP 도메인을 포함하는 대장균의 테일-특이적 프로테아제(tsp)와 약한 상동성을 나타내었다(Silber et al., 1992) [32.]. 타입 II 분비는 P. 에어로지노사(P. aeroginosa) 및 에어로모나스 히드로필라(Aeromonas hydrophila)를 포함하는 몇가지 그램 음성 세균에서 분해 단백질의 외부 전달과 관련이 있다(Reviewed in Hobbs and Mattick, 1993) [33.] 에어로지노사히드로필라(Aerosiginosa hydrophila)에서, 분비된 엘라스타아제(ahpB)는 최근 유기체의 독성에 중요한 것으로 제안되었다(Cascon et al., 2000) [34.].
이러한 단백질은 CT858과 유사한 양태를 갖는다. 이들은 대부분 분해가능한 시그날 펩티드를 갖는 프로펩티드로서 합성된 후, 프로세싱되어 성숙한 단백질로 된다. 또한 테일-특이적 프로테아제에 상동성을 나타내는 또다른 클라미디아 트라코마티스 단백질은 가상 단백질 CT441이다. 이러한 단백질이 CT858과 동일한 분비 특성을 나타낼 수 있는지 여부는 측정되어야 한다.
CT858의 동일한 아세포 편재화는 클라미디아 뉴모니애 상동물 CPN1016와 함께 CPN1016에 대한 Pab253에 대해 관찰되었고, 이는 두가지 클라미디아종간에 이러한 유전자의 기능적 보존을 의미한다.
실시예 20:
유전자 번호로 동정되는, 분비된 클라미디아 트라코마티스 D 및 클라미디아 뉴모니애 단백질을 사람 HLA-A2에 대한 친화성을 갖는 펩티드를 인식하도록 훈련된 ANN에 의해 분석하였다. 표 V-VIII에, HLA-A2와의 예측된 결합에 대하여 ANN에 의해 선택된 펩티드가 열거되어 있고, 친화도(Kd)는 nM로 표시되어 있다. 이 값이 낮을수록 좋다. Kd가 50nM미만인 대부분의 펩티드는 면역원성이다. Kd가 500 nM미만(단, 50 nM 초과)인 펩티드는 잠재적으로 면역원성이다. 주어진 펩티드의 결합은 앵커 위치 P2 또는 P9에서 차선(suboptimal) 아미노산의 치환에 의해 개선될 수 있다 - 종종 천연 펩티드에 대해 특이성을 보유시키는 전략임.
실시예 21:
실험적 동물 모델에서 백신 후보물질의 특이적 세포독성 CD8+ T 세포 생성능의 측정
한 방법에서, 백신 후보물질은 사람 HLA 클래스 I 분자를 발현하는 유전자이식 A2 마우스를 포함하는 실험 동물(마우스 또는 기냐피그)을 면역시키기 위해 전장 재조합 단백질로서 사용된다.
또다른 방법에서, 백신 후보물질이 컴퓨터 알고리즘에 의해 T 세포 에피토프에 대해 스크리닝된 후, 이들 에피토프를 포함하는 펩티드가 합성되어 전장 백신 후보물질에 대해 기술된 바와 같이 면역접종에 사용된다.
세번째 방법에서, 백신 후보물질의 전체 서열을 포함하도록 중복되는 방식으로 8개 내지 10개 아미노산 길이의 펩티드가 합성되고, 방사능 라벨링된 중간 결합물질과 경합하는 MHC 클래스 I 결합 검정에 사용된다. 양호한 결합물질인 펩티드는 전장 백신 후보물질에 대해 기술된 바와 같이 면역접종에 사용된다.
백신 후보물질은 펩티드/단백질의 조합물로서 또는 애쥬번트중의 단일 펩티드/단백질로서 투여된다. 백신 후보물질은 또한, DNA-백신으로서, 또는 백신 후보물질을 발현하는 바이러스에 의해 투여될 수 있다.
면역된 동물로부터의 말초혈 단핵구(PBMC)를 밀도 구배 원심분리에 의해 정제하고 CD8+ 세포를 자석 비드에 결합된 항체를 사용하거나 또는 다른 방법으로 정제한다. CD8+ T-세포 활성은 ELISPOT 및 삼중수소화된 티미딘의 혼입과 같은 증식 검정 및 특이적 용해 검정(크롬 유리)에 의해 측정한다.
면역된 동물의 정제된 PBMC 또는 CD8+ 세포를, 제한된 희석도로, 방사선 조사된 항원 제시 세포, 성장 인자 및 특이적 또는 비특이적 자극제와 함께 마이크로역가 플레이트에 평판한다. 특이적 자극을 위해, 양호한 T 세포 에피토프로서 예측되거나 MHC 클래스 I 분자에 대한 양호한 결합물질로 밝혀진 단일 백신 후보물질을 사용한다. 비특이적 자극을 위해, 클라미디아 감염 세포를 사용한다. 세포를 9일 내지 14일 동안 배양하여 항원 특이적 세포를 증식시킨다. 특이적 세포독성 CD8+ T 세포의 생성은 자극된 세포로부터의 시토카인 분비를 ELISPOT 검정에 의해 측정하여 결정된다. T 세포의 증식은 삼중수소화된 티미딘의 혼입후 섬광 계수에 의해 측정한다. 증식된 세포의 세포독성은 클라미디아 감염 세포 또는 백신 후보 단백질/펩티드를 발현하는 재조합 세포를 표적 세포로 사용하여 크롬 유리 검정과 같은 세포독성 검정을 사용하여 측정한다[42].
실시예 21
클라미디아 감염에 대한 마우스 및 기냐 피그 보호능에 대한 백신 후보물질의 시험
실험 동물을 단일 단백질/펩티드로서 백신 후보물질을 사용하거나 백신 후보물질의 조합물을 사용하여 (상기 기술된 바와 같이) 면역시켰다. 면역후에, 동물을 클라미디아로 실험적으로 감염시켰다(클라미디아 뉴모니애에 대해서는 비강 감염 및 클라미디아 트라코마티스에 대해서는 생식기 감염). 감염에 대한 보호를 클라미디아의 배양, 면역조직화학, 정량적 PCR에 의해, 그리고 감염시의 혈청전환의 조사에 의해 측정하였다.
실시예 23:
사람에서 클라미디아 감염이 백신 후보물질 특이적인 세포독성 CD8+ T 세포를 생성하는 능력의 측정
사람 혈청 샘플을 클라미디아에 대한 항체의 존재에 대해 ELISA (Medac)에 의해 검사한다. 혈청-양성 개체를 백신 후보물질 특이적 세포독성 CD8+ T 세포의 존재에 대해 선택한다.
클라미디아에 대해 항체 양성인 것으로 시험된 사람으로부터 말초혈 단핵구(PBMC)를 밀도 구배 원심분리로 정제하고, CD8+ 세포를 항체 및 자석 비드를 사용하거나 다른 방법에 의해 정제한다. 백신 후보 단백질/펩티드에 대해 특이적으로 유도된 CD8+ T 세포 활성을 실시예 19에서 설명한 방법으로 측정한다.
실시예 24
진단 용도의 ELISA 검사의 개발을 위한 백신 후보물질의 사용
본 발명에서 분비된 단백질이 정제된 미생물에 존재하지 않거나 현저히 감소되기 때문에, 정제된 기본 소체를 기준으로 한 면역검정은 이러한 단백질에 대한 항체를 검출할 수 없다. 따라서, 분비된 단백질은 체액성 면역 반응에도 관여하는 인식되지 않은 주항원을 나타낼 수 있다. 또한, 분비된 클라미디아 단백질에 기초한 ELISA는, 분비된 단백질이 클라미디아 발생의 세포내 단계 동안 발현될 뿐이므로 클라미디아에 의한 지속적 감염을 검출할 수 있다.
1) 분비된 단백질은 재조합 단백질로 생성되어 정제된다. 대안적으로, 분비된 단백질을 나타내는 중복되는 합성 펩티드도 생성된다.
2) 분비된 단백질(또는 분비된 단백질 유래의 합성 펩티드)을 나타내는 정제된 재조합 단백질로 ELISA 플레이트를 코팅한다. 비특이적 결합을 회피하기 위하여 15% 우태아 혈청으로 ELISA 플레이트를 블로킹시킨다.
3) 환자 혈청을 클라미디아 트라코마티스 또는 클라미디아 뉴모니애에 대한 항체에 대해 마이크로-IF 또는 ELISA (Medac)를 사용하여 스크리닝한다. 분비된 단백질을 나타내는 재조합 항원으로 코팅된 ELISA 플레이트상에서 양성 혈청을 검사한다.
4) 항체 결합을 검출하기 위하여, 항-사람 IgG, IgA 또는 IgM을 사용한다. 양성 대조군으로서 감염 마우스의 혈청을 사용한다.
5) 마이크로-IF 또는 ELISA (Medac)로부터의 결과를, 분비된 단백질을 나타내는 재조합 단백질에 기초한 ELISA와 비교한다.
참고문헌

Claims (72)

1) 세포내 세균에 의해 숙주 세포를 감염시키고,
2) 감염된 세포에 존재하는 세포내 세균을 라벨링하고,
3) a) 감염된 세포의 전체 세포 용해물 및
b) 감염된 세포로부터 정제되고 용해된 세균을 제조하고,
4) i) 단계 3a)의 전체 세포 용해물을 ii) 단계 3b)의 정제되고 용해된 세균의 2D-겔 전기영동 단백질 프로파일과 비교하여,
5) 전체 세포 용해물에는 존재하나 정제된 세균에는 존재하지 않거나 현저히 감소된 양으로 존재하는 단계 4)로부터의 단백질 스팟을 검출하고,
6) 단계 5)에서 선택된 스팟에서 단백질을 동정하는 단계를 포함하는, 세포내 세균으로부터 분비되는 단백질의 동정 방법.
1) 세포내 세균에 의해 숙주 세포를 감염시키고,
2) 감염된 세포에 존재하는 세포내 세균을 펄스 라벨링하고,
3) 단계 2)에 이어서 상이한 기간의 추적 이후 감염된 전체 세포 용해물을 제조하고,
4) 단계 3)으로부터 상이한 기간의 추적 이후 제조된 전체 세포 용해물의 2D-겔 전기영동 단백질 프로파일을 비교하여,
5) 단계 3)에서의 추적 기간이 증가함에 따라 감소된 양으로 존재하는 단계4)로부터의 단백질 스팟을 검출하고,
6) 단계 5)에서 선택된 스팟에서 단백질을 동정하는 단계를 포함하는, 세포내 세균으로부터 분비되는 단백질의 동정 방법.
1) 세포내 세균에 의해 숙주 세포를 감염시키고,
2) 프로테아좀 억제제의 존재 및 부재하에 각각 숙주 세포를 배양하고,
3) 프로테아좀 억제제의 존재 및 부재하에 각각 배양된 감염된 세포에 존재하는 세포내 세균을 라벨링하고,
4) 감염된 세포의 전체 세포 용해물을 제조하고,
5) 프로테아좀 억제제의 존재 및 부재하에 각각 배양된 감염된 세포의 전체 세포 용해물의 2D-겔 전기영동 단백질 프로파일을 비교하여,
5) 프로테아좀 억제제의 존재하에 배양된 전체 세포 용해물에는 존재하나 프로테아좀 억제제의 부재하에 배양된 전체 세포 용해물에는 존재하지 않거나 현저히 감소된 양으로 존재하는 단계 5)로부터의 단백질 스팟을 검출하고,
6) 단계 6)에서 선택된 스팟에서 단백질을 동정하는 단계를 포함하는, 세포내 세균으로부터 분비되는 단백질의 동정 방법.
제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 있어서,
1) 제 1항 내지 제 3항 중의 어느 한 항에 따라 동정된, 세포내 세균으로부터의 단백질에 대한 항체를 수득하고,
2) 단계 1)에서 수득된 항체를 이용하여 상기 세균으로 감염된 세포의 전체 세포 용해물에 대해 2D-PAGE 면역블롯팅하고,
3) 단계 2)에서 반응하는 단백질 스팟을 검출하고,
4) 단계 3)에서 선택된 스팟에서 단백질을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제 1항 내지 제 4항에 따른 방법의 병용을 포함하는, 세포내 세균으로부터 분비되는 단백질을 동정하는 방법.
제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 라벨링이 [35S]시스테인, [35S]메티오닌, [14C]라벨링된 아미노산 또는 이들의 조합과 같은 방사성 수단에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 있어서, 전장 단백질 또는 이의 면역원성 단편이 면역원성 조성물에 봉입시킬 용도 및/또는 진단 용도에 적합함을 특징으로 하는 단백질의 동정 방법.
제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 있어서, 동정 방법이 에드만 분해 또는, MALDI TOF MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry), ESIQ-TOF MS(Electrospray Ionisation Quadrupole Time-Of-Flight Mass Spectrometry), PSD-MALDI MS(Post Source Decay MALDI Mass Spectrometry) 또는 이러한 방법의 조합을 포함하는 여하한 질량 분광법에 기초함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질을 동정함에 앞서, 브롬화 시아노겐 처리 또는 히드록실아민 처리 등의 화학적 방법, 또는 트립신, 슬리모트립신, 키모트립신 또는 펩신 등의 여하한 적절한 효소를 이용하는 효소적 방법, 또는 이들의 조합에 의해 절단함을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포내 세균이 통성 세포내 세균이거나 편성 세포내 세균임을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 세균이 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis). 클라미디아 시타씨(Chlamydia psittaci) 및 클라미디아 페코룸(Chlamydia pecorum)과, 이들의 여하한 특이 혈청형변이주 및 균주를 포함하는 클라디미아(Chlamydia) 속으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 세포내 세균이 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)임을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 세포내 세균이 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 HeLa, Hep2, McCoy 및 U937을 포함하는 무한증식 세포주, 포유동물 공여체 또는 검시에 의해 수득되는 일차 세포주, 유전성 변형 세포주 또는 기관 세포 배양물임을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 숙주 세포가, 프로테아좀 서브유닛을 엔코딩하는 유전자 또는 MHC 클래스 I 제시에 수반되는 기능적으로 중요한 단백질을 엔코딩하는 그밖의 유전자를 포함하는, 클라미디아 백신 개발에 적절한 과발현 유전자 또는 억제 유전자로 유전성 변형됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 15항 중의 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 세포내 세균으로 감염되기 전에 또는 그 동안에, IFN-γ로 처리됨을 특징으로 하는 방법.
제 2항 및 제 4항 내지 제 16항 중의 어느 한 항에 있어서, 사용된 프로테아좀 억제제가 MG132, MG262, MG115, 에폭시마이신, PSI 또는 클래스토(clasto)-락타시스틴-β-락톤, 또는 이들의 조합물임을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 동정가능한 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항에 있어서, 면역원성 조성물에 봉입시킬 용도 및/또는 진단 용도로 응용될 수 있는 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 19항에 있어서, 면역원성 조성물에 봉입되기에 적절한 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 제한된 항원 제시용 후보물질이 되는 T-세포 에피토프를 포함함을 특징으로 하는 단백질.
제 20항에 있어서, 면역원성 조성물에 봉입되기에 적절한 MHC 클래스 I 제한된 항원 제시용 후보물질이 되는 T-세포 에피토프를 포함함을 특징으로 하는 단백질.
제 18항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 표 I에 제시된 단백질 DT1 내지 DT77 중의 어느 하나로서, 평균 오차가 +/- 10%가 되도록 측정된 pi 및 Mw 특성을 갖는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, CT017(유전자명 CT017), CT044(유전자명 ssp), CT243(유전자명 lpxD), CT263(유전자명 CT263), CT265(유전자명 accA), CT286(유전자명 clpC), CT292(유전자명 dut), CT407(유전자명 dksA), CT446(유전자명 euo), CT460(유전자명 SWIB), CT541(유전자명 mip), CT610(유전자명 CT610), CT650(유전자명 recA), CT655(유전자명 kdsA), CT668(유전자명 CT668), CT691(유전자명 CT691), CT734(유전자명 CT734), CT783(유전자명 CT783), CT858(유전자명 CT858), CT875(유전자명 CT875), 또는 ORF5(유전자명 ORF5)에 상응하는 유전자 번호로 동정되거나, 또는 표 IIIA에 제시된 유전자명 DT8에 의해 동정된 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 표 IV에 제시된 단백질 DT1, DT2, DT3, DT5, DT9, DT10, DT11, DT13, DT14, DT17, DT47, DT59, DT60, DT61 및 DT62 중의 어느 하나로서, 평균 오차가 +/- 10%가 되도록 측정된 pi 및 Mw 특성을 갖는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 22항에 있어서, 단백질 DT4(유전자명 CT858), DT23(유전자명 mip), DT47, DT48(유전자명 CT858), DT75, DT76(유전자명 CT691) 및 DT77(유전자명 CT263)로부터 선택되는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 표 II에 제시된 단백질 CP1 내지 CP91 중의 어느 하나로서, 평균 오차가 +/- 10%가 되도록 측정된 pi 및 Mw 특성을 갖는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 있어서, 표 IIIB에 제시된 CPN0152(유전자명 CPN0152), CPN0702, CPN0705(유전자명 CPN0705), CPN0711(유전자명 CPN0711), CPN0796(유전자명 CPN0796), CPN0998(유전자명 ftsH), CPN0104(유전자명 CPN0104), CPN0495(유전자명 aspC), CPN0684(유전자명 parB), CPN0414(유전자명 accA), CPN1016(유전자명 CPN1016), CPN1040(유전자명 CPN1040), CPN0079(유전자명 rl10), CPN0534(유전자명 dksA), CPN0619(유전자명 ndk), CPN0711(유전자명 CPN0711), CPN0628(유전자명 rs13), CPN0926(유전자명 CPN0926), CPN1016(유전자명 CPN1016), CPN1063(유전자명 tpiS), 또는 CPN0302(유전자명 lpxD)에 상응하는 유전자 번호로 동정된 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 26항에 있어서, 단백질 CP34(유전자명 CPN1016), CP37(유전자명 CPN0998), CP46(유전자명 CPN0796), CP47(유전자명 CPN0705), CP52(유전자명 CPN0152), CP63(유전자명 CPN1016) 및 CP75(유전자명 ndk)로부터 선택되는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
하기 서열(SEQ ID NO:1)을 포함하며 DT8임을 특징으로 하는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 단편:
MQHTIMLSLENDNDKLASMMDRVVAASSSILSASKDSESNRQFTISKAPDKEAPCRVSYVAASALSE
제 18항 내지 제 29항 중의 어느 한 항에 따른 단백질에 대해 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항 내지 제 30항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 7개 이상의 연속 아미노산을 포함하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
제 31항에 있어서, 서열 SEQ ID NO.3 내지 SEQ ID NO.45로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
서열 SEQ ID NO.122 내지 SEQ ID NO.148로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함하는, 제 32항의 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 단백질에 상동인 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 또는 이의 면역원성 단편.
제 31항에 있어서, 서열 SEQ ID NO.46 내지 SEQ ID NO.121로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 단백질 또는 이의 면역원성 단편.
서열 SEQ ID NO.149 내지 SEQ ID NO.194로부터 선택된 아미노산 서열을 포함함하는, 제 34항의 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 단백질에 상동인 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 또는 이의 면역원성 단편.
제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 화합물.
제 29항의 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 화합물.
제 37항에 있어서, 하기 서열(SEQ ID NO:2)을 포함함을 특징으로 하는 핵산 화합물 또는 이의 단편 또는 변성 서열:
제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 화합물을 포함하는 벡터.
제 39항에 따른 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
단백질 또는 단편에 대한 항체 생성을 위한 제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편의 용도.
제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 생산 동물에 투여하고, 그것으로부터 항체를 정제하는 것을 포함하는 세포내 세균에 대한 항체의 제조 방법.
제 42항의 방법에 의해 수득가능한 항체.
제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 단편, 제 43항에 따른 항체 또는 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 화합물을 포함하는 약제학적 또는 진단용 조성물.
진단 시약의 제조에서 제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질또는 이의 단편, 제 43항에 따른 항체 또는 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항에 따른 핵산 화합물의 용도.
제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 따른 방법으로 동정된 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대한 컴퓨터 예측, MHC 클래스 분자 결합 검정 및/또는 ELISPOT 검정 등의 단계를 포함하여, 세포내 세균으로부터 분비된 단백질에 대한 T-세포 에피토프를 동정하는 방법.
제 46항의 방법에 의해 수득가능한 펩티드 에피토프로서, 펩티드 에피토프가 표면 제시되는 펩티드 에피토프.
제 18항 내지 제 31항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 4개 내지 25개의 연속 아미노산, 바람직하게는 6개 내지 15개의 연속 아미노산, 가장 바람직하게는 7개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드 에피토프.
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 또는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae)의 7개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드 에피토프.
서열 SEQ ID NO:1을 포함하는 폴리펩티드의 4개 내지 25개의 연속 아미노산,바람직하게는 6개 내지 15개의 연속 아미노산, 가장 바람직하게는 7개 내지 10개의 연속 아미노산을 포함하는 펩티드 에피토프.
제 47항에 있어서, 서열 SEQ ID NO.3 내지 SEQ ID NO.45으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 펩티드 에피토프.
서열 SEQ ID NO.122 내지 SEQ ID NO.148로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 51항의 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 펩티드 에피토프의 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 펩티드 에피토프.
제 47항에 있어서, 서열 SEQ ID NO.46 내지 SEQ ID NO.121로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 펩티드 에피토프.
서열 SEQ ID NO.149 내지 SEQ ID NO.194로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 제 53항의 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumoniae) 펩티드 에피토프의 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 펩티드 에피토프.
제 47항 내지 제 54항 중의 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질의 일부임을특징으로 하는 펩티드 에피토프.
제 47항 내지 제 54항 중의 어느 한 항에 있어서, 담체 부분에 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 펩티드 에피토프.
제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프를 엔코딩하는 서열을 포함하는 핵산 화합물.
제 57항의 핵산 화합물을 포함하는 벡터.
제 58항에 따른 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
면역원성 조성물의 제조를 위한 제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항의 펩티드 에피토프의 용도.
제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 면역원성 조성물.
세포내 세균에 의한 감염 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질, 제 43항의 항체, 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항 또는 57항에 따른 핵산 화합물 또는 제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프의 용도.
클라미디아(Chlamydia)에 의한 감염 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 제 22항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질, 제 43항의 항체, 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항 또는 57항에 따른 핵산 화합물 또는 제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프의 용도.
세포내 세균 또는 세포내 세균에 대해 생성된 항체의 존재를 검출하기 위한 진단 시약의 제조에서 제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질, 제 43항의 항체, 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항 또는 57항에 따른 핵산 화합물 또는 제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프의 용도.
클라미디아(Chlamydia) 또는 클라미디아(Chlamydia)에 대해 생성된 항체의 존재를 검출하기 위한 진단 시약의 제조에서 제 22항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질, 제 43항의 항체, 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항 또는 57항에 따른 핵산 화합물 또는 제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프의 용도.
사람에게 면역적 유효량의 제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질, 제 43항의 항체, 제 36항 내지 제 38항 중의 어느 한 항 또는 57항에 따른 핵산 화합물 또는 제 47항 내지 제 56항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프를 투여하는 것을 포함하는 사람에게서 면역 반응을 유도하는 방법.
제 66항에 있어서, 세포내 세균에 의한 사람 또는 동물의 감염을 치료하거나 예방하기 위한 방법.
제 66항 또는 제 67항에 있어서, 세포내 세균이 클라미디아(Chlamydia) 속임을 특징으로 하는 방법.
제 68항에 있어서, 세포내 세균이 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)임을 특징으로 하는 방법.
제 68항에 있어서, 세포내 세균이 클라미디아 뉴모니애(Chlamydia pneumonia)임을 특징으로 하는 방법.
제 39항에 따른 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고 형질감염시킨 다음, 숙주 세포에 의해 단백질 또는 이의 단편이 발현되도록 하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 제 18항 내지 제 35항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 단편의 제조 방법.
제 58항에 따른 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고 형질감염시킨 다음, 숙주 세포에 의해 펩티드 에피토프를 발현시킬 수 있는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 제 47항 내지 제 54항 중의 어느 한 항에 따른 펩티드 에피토프의 제조 방법.
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