KR20030088315A - Bacterial biosensor bearing gene fusion constructed with dnaK promoter of Psudomonas sp. DJ-12, and detection method of aromatic pollutants with the same - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 슈도모나스속 균주의 dnaK 프로모터를 포함하는 유전자 구조체, 상기 유전자 구조체로 형질전환된 세포를 포함하는 바이오센서, 더욱 자세하게는 더욱 자세하게는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터와 리포터 유전자인luxCDABE의 유전자 구조체를 포함하는 미생물 바이오센서 및 이를 이용한 방향족 화합물을 검색하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a gene construct comprising a dnaK promoter of the Pseudomonas strain, a biosensor comprising the cells transformed with the gene construct, and more specifically, the dnaK promoter and reporter gene of Pseudomonas strain DJ-12, lux CDABE. The present invention relates to a microbial biosensor comprising a genetic structure of and an aromatic compound using the same.
복잡한 환경계에서 상기 화학적 오염물질을 탐지하기 위해서는, 바이오센서가 널리 사용되어 왔다. 환경 바이오센서는 전세포 바이오센서(whole-cell biosensor)의 한 일환으로 환경 오염물질로 인한 독성에 특이적으로 반응할 수 있는 여러 가지 종류의 스트레스 프로모터와 생물학적 빛 (Bioluminescence), 녹색형광빛 (Green Fluorescence)을 리포터 시스템으로 구성된 유전공학적으로 변형된 세포를 이용하여 강/호수 및 상·하수원, 토양, 그리고 대기에 쉽게 응용될 수 있는 첨단 바이오모니터링 기술이다.Biosensors have been widely used to detect chemical pollutants in complex environments. Environmental biosensors are part of the whole-cell biosensor, which have several types of stress promoters, bioluminescence and green fluorescence that can specifically react to the toxicity of environmental pollutants. Fluorescence is an advanced bio-monitoring technology that can be easily applied to rivers / lakes, water and sewage sources, soil, and the atmosphere by using genetically modified cells composed of reporter systems.
독성 물질로 인한 생물체의 반응은 유전자 수준에서의 대응을 준비하게 되는데 독성 물질과 접촉 시 그 피해 정도에 따라 이를 회복하거나 대응하기 위한 요소 유전자들의 발현이 진행되며 이를 유도하는 유전자를 스트레스 프로모터라 하며, 이들 스트레스 프로모터는 독성 물질로 인한 특정 스트레스에 특이적 반응을 나타내며 유전자 재조합 기술의 발전으로 이러한 스트레스 프로모터와 발광유전자(lux,luc)/형광(GFP) 유전자의 결합을 통하여 세포에 특이적인 스트레스를 유도하는 독성 물질을 탐지 할 수 있는 유전자 재조합 발광/형광 세포주의 제작이 가능하다. 해저 미생물이나 반딧불의 발광 유전자를 이용하여 E. coli, 혹은 바실러스(Bacillus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella) 등의 스트레스 프로모터를 결합하여 유전자 재조합된 플라스미드를 만들고 이를 새로운 미생물에 전달하면 특정 독성에 대한 발광량의 변화를 유도하도록 할 수 있는 유전자 재조합 발광 미생물들이 만들어지게 된다.The response of organisms due to toxic substances prepares for response at the gene level. When contacted with toxic substances, the expression of elemental genes to recover or respond according to the degree of damage is called a stress promoter. These stress promoters have specific responses to specific stresses caused by toxic substances, and the development of genetic recombination technology induces cell-specific stress through the combination of these stress promoters and luminescent genes ( lux , luc ) / fluorescence (GFP) genes. It is possible to manufacture a recombinant luminescent / fluorescent cell line capable of detecting toxic substances. Genetically recombined plasmids by combining stress promoters such as E. coli or Bacillus, Pseudomonas, Salmonella, etc. Genetically modified luminescent microorganisms are made that can induce a change in the amount of luminescence for.
방향족 화합물, 특히 염화 방향족 화합물은 이들의 친지성, 지속성 및 독성으로 인해 심각한 환경 오염물질이다. 여러 나라에서 상기 방향족 화합물의 사용을 엄격히 제한하고 있지만, 자연계에 분포는 여전히 환경오염의 주요한 원인중 하나이다. 몇몇 바이오센서는 BTEX 화합물, 나프탈렌, 염화바이페닐, 및 수은과 같은 다양한 화합물을 탐지하고 정량할 수 있다. 이들 바이오센서는 살리실화 히드록실레이즈를 코딩하는 nahG(Heitzer, A, et al., Appl. environ. Microbiol. vol 60, pp.1487-1494, 1994), 바이페닐 디옥시제네이즈를 코딩하는 bphA(Lyaton,A.C., e t al., Appl. Environ. Microbiol. vol. 64, pp.5023-5026, 1998), 및 톨루엔을 분해하는 todR(Applegate, B.M., et al., Appl. Environ. Microbiol. vol. 64, pp.2730-2735, 1998)의 프로모터를 포함하는 유전자 구조체로 이루어진다.Aromatic compounds, in particular chlorinated aromatic compounds, are serious environmental pollutants due to their lipophilic, persistence and toxicity. Although the use of such aromatic compounds is severely restricted in many countries, distribution in nature is still one of the major causes of environmental pollution. Some biosensors can detect and quantify various compounds such as BTEX compounds, naphthalene, biphenyl chloride, and mercury. These biosensors include nahG (Heitzer, A, et al., Appl. Environ. Microbiol. Vol 60, pp. 1487-1494, 1994), which encodes salicylation hydroxylase, bphA, which encodes biphenyl deoxygenase. (Lyaton, AC, et al., Appl. Environ. Microbiol. Vol. 64, pp. 5023-5026, 1998), and todR that degrades toluene (Applegate, BM, et al., Appl. Environ. Microbiol.vol 64, pp. 2730-2735, 1998).
Tauriainen등(Tauriainen, S. M. et al, Appl. Environ. Microbiol. vol. 63, pp.4456-4461, 1997; Tauriainen, S. M. et al., Anal. Biochem. vol.272, pp.191-198, 1999)의 arsenite, antimonite, 카드뮴과 같은 독성 중금속을 측정하기 위한 마커 유전자로luc유전자를 사용한 바이오센서를 제조하였다. 상기luc유전자는 또한 슈도모나스 푸티다 mt-2의 TOL 플라스미드로부터 얻는 xylR의 Pu프로모터를 갖는 구조체로 제조된 바이오센서를 제조하기 위해서도 사용되었다(Willardson,B.M., Appl. Environ. Microbiol. vol. 64, pp.1006-1012, 1998). 이 바이오센서는 BTEX와 톨루엔 유사 분자에 대한 발광반응을 조사하였으나, 발광도는 그다지 크지 않았다.Tauriainen et al. (Tauriainen, SM et al, Appl. Environ.Microbiol.vol. 63, pp.4456-4461, 1997; Tauriainen, SM et al., Anal.Biochem.vol.272, pp.191-198, 1999) A biosensor using luc gene as a marker gene for measuring toxic heavy metals such as arsenite, antimonite and cadmium was prepared. The luc gene was also used to prepare biosensors made of constructs with the Pu promoter of xylR obtained from the TOL plasmid of Pseudomonas putida mt-2 (Willardson, BM, Appl. Environ. Microbiol. Vol. 64, pp. 1006-1012, 1998). The biosensor investigated the luminescence of BTEX and toluene-like molecules, but the luminescence was not very high.
Cha 등은(Cha, H.J., Appl. Environ. Microbiol. vol 65, pp.409-41, 1999) E.coli dnaK 프로모터를 이용한 dnaK::gfpuv 구조체에 의한 발광이 2 내지 4% 에탄올 농도에서 측정되었으며, 4시간 노출후에 증가되었음을 보고하고 있으나, 발광강도가 약하다는 문제점이 있다.Cha et al. (Cha, HJ, Appl. Environ. Microbiol. Vol 65, pp. 409-41, 1999). Luminescence by the dnaK :: gfpuv construct using the E. coli dnaK promoter was measured at 2-4% ethanol concentration. In addition, it is reported that after 4 hours of exposure, the luminous intensity is weak.
Van Dyk등(Van Dyk,T.K., Appl. Environ. Microbiol. vol.60, pp.4124-4127,1994) 및 Belkin등(Belkin,S., et al., Appl. envrion. Microbiol. vol.62, pp.2252-2256, 1996)은 발광유전자인luxCDABE와 E.coli의 dnaK, grpE, uspA 및 katG를 포함하는 스트레스 쇼크 유전자의 프로모터와 융합하여 바이오센서를 제조하였다. 에탄올, 페놀, 및 중금속과 같은 다양한 종류의 독성물질을 모니터링하는데 이 바이오센서를 사용하였다. 상기 바이오센서중에서 dnaK 프로모터를 포함하는 유전자 구조체가 다른 프로모터를 포함하는 유전자 구조체에 비해 독성물질에 더 큰 민감성을 가지고 있음이 보고되었다. 그러나, dnaK 프로모터와luxCDABE의 구조체를 갖는 바이오센서는 펜타클로로페놀, 2-니트로페놀 및 페놀과 같은 방향족 오염물질보다는 에탄올에 더 잘 반응하는 것으로 나타났다(Van Dyk,T.K., et al., Appl. Environ. Microbiol. vol.61, pp.1414-1420, 1994). 더욱이, 4,170 ppm이상 농도의 페놀에 의해 상기 구조체의 발광이 저해되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 다양한 방향족 오염물질을 더욱 민감하게 탐지할 수 있는 바이오센서에 대한 필요성은 여전히 존재한다.Van Dyk et al. (Van Dyk, TK, Appl. Environ. Microbiol. Vol. 60, pp. 4124-4127, 1994) and Belkin et al. (Belkin, S., et al., Appl. Envrion. Microbiol. Vol. 62, pp.2252-2256, 1996) produced biosensors by fusion with lux CDABE, a luminescent gene, and promoters of stress shock genes including dnaK, grpE, uspA and katG of E. coli. The biosensor was used to monitor various types of toxic substances such as ethanol, phenol, and heavy metals. Among the biosensors, gene constructs containing dnaK promoters have been reported to have greater sensitivity to toxicants than gene constructs containing other promoters. However, biosensors with the structure of the dnaK promoter and lux CDABE have been shown to respond better to ethanol than aromatic contaminants such as pentachlorophenol, 2-nitrophenol and phenol (Van Dyk, TK, et al., Appl. Environ.Microbiol.vol. 61, pp.1414-1420, 1994). Moreover, it has been found that luminescence of the structure is inhibited by phenol at a concentration of 4,170 ppm or more. Thus, there is still a need for biosensors that can detect various aromatic pollutants more sensitively.
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 슈도모나스속 균주의 dnaK 프로모터와 루시퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이오센서용 유전자 구조체를 제공하는데 그 목적이 있다.In order to solve the problems of the prior art as described above, an object of the present invention is to provide a gene structure for a biosensor comprising a gene encoding the dnaK promoter and luciferase of the Pseudomonas strain.
본 발명의 또다른 목적은 방향족 환경오염물질에 대해 고민감도 및 높은 발광도를 갖는, 상기 유전자 구조체로 형질전환된 바이오센서 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a biosensor transformed with the genetic construct having a high sensitivity and high luminescence to aromatic environmental pollutants, and a method of manufacturing the same.
본 발명의 또다른 목적은 상기 바이오센서를 이용하여 방향족 환경오염물질을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention to provide a method for detecting aromatic environmental pollutants using the biosensor.
도 1은 E.coli W3101와 슈도모나스속 균주 DJ-12로부터 디자인된 프라이머와 DNA를 이용한 PCR반응을 이용하여 dnaK 프로모터의 제조를 나타내는 개략도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the preparation of the dnaK promoter using a PCR reaction using primers and DNA designed from E. coli W3101 and Pseudomonas strain DJ-12.
도 2a는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터와luxCDABE 리포터 유전자를 포함하는 유전자 구조체이고, 도 2b는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터와 반딧불이(firefly)의luc리포터 유전자를 포함하는 유전자 구조체이고, 도 2b는 E.coli의 dnaK 프로모터와luxCDABE 리포터 유전자를 포함하는 발광 유전자 구조체이다.Figure 2a is a gene construct comprising the dnaK promoter and lux CDABE reporter gene of Pseudomonas strain DJ-12, Figure 2b is a gene construct comprising the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 and the luc reporter gene of firefly 2B is a luminescent gene construct comprising a dnaK promoter of E. coli and a lux CDABE reporter gene.
도 3a 내지 3c는 여러 가지 농도의 에탄올에 180분간 노출시 바이오센서dnaKp-EC::luxCDEAB(3a), dnaKp-DJ::luxCDEAB(3b), dnaKp-DJ::luc(3c)에 의한 발광도를 나타내는 그래프이다.Figures 3a to 3c is shown by biosensor dnaKp-EC :: lux CDEAB (3a), dnaKp-DJ :: lux CDEAB (3b), dnaKp-DJ :: luc (3c) when exposed to various concentrations of ethanol for 180 minutes It is a graph showing luminescence.
도 4는 슈도모나스속 균주 DJ-12와 E.coli(GeneBank accession No.M10420)의 dnaK 프로모터의 핵산서열을 배열한 것이며, 별표(*)는 상기 두균주간 서열차이를 나타낸다.Figure 4 shows the sequence of the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 and E. coli (GeneBank accession No. M10420), and an asterisk (*) shows the sequence differences between the two strains.
도 5a 내지 5d는 바이페닐(5a), 4CB(5b), 4HBA(5c), 및 카테콜(5d)에 노출시 danKp-DJ::luxCDABE 구조체를 포함하는 바이오센서 의한 발광정도를 나타내는 그래프이다.5A to 5D are graphs showing the degree of luminescence by a biosensor comprising danKp-DJ :: lux CDABE structure when exposed to biphenyl (5a), 4CB (5b), 4HBA (5c), and catechol (5d). .
도 6a 내지 6c는 바이페닐(6a), 4CB(6b), 및 4HBA(6c)에 노출시 dnaKp-DJ::luc유전자 구조체에 의한 발광정도를 나타내는 그래프이다.6A-6C are graphs showing the extent of luminescence by the dnaKp-DJ :: luc gene construct upon exposure to biphenyl (6a), 4CB (6b), and 4HBA (6c).
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스속 균주 DJ-12(KCTC 8967P)의 dnaK 프로모터와 상기 dnaK 프로모터에 작동가능하도록 연결된 루시퍼라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 바이오센서용 유전자 구조체(genetic construct)에 관한 것이다.In order to achieve the above object, the present invention is a gene construct for biosensor comprising a gene encoding a luciferase operably linked to the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 (KCTC 8967P) and the dnaK promoter (genetic It is about construct.
또한 본 발명은 상기 유전자 구조체로 형질전환된 세포를 포함하며, 상기 세포가 방향족 화합물에 노출시 세포내 루시퍼라제에 의한 발광도를 측정하여 방향족 화합물을 탐지하기 위한 바이오센서에 관한 것이다.The present invention also relates to a biosensor comprising a cell transformed with the gene construct and detecting the aromatic compound by measuring the luminescence by intracellular luciferase when the cell is exposed to the aromatic compound.
또한 본 발명은 상기 바이오센서를 루시퍼라제의 발현을 유도하는 방향족 화합물에 노출시키고, 루시퍼라제에 의한 발광도를 측정하는 것을 포함하는 방향족 화합물을 탐지하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a method for detecting an aromatic compound comprising exposing the biosensor to an aromatic compound that induces the expression of luciferase and measuring the luminescence by luciferase.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명에서는, 스트레스 프로모터로서 슈도모나스속 균주 DJ-12 (KCTC 8967P)의 dnaK 프로모터를 사용하고 있다. 상기 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터는 서열번호 1 및 2에 나타난 프라이머쌍으로 PCR 증폭된 폴리뉴클레오타이드인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3에 나타난 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드이다. 본 발명의 슈도모나스속 균주 DJ-12는 대전 생명공학연구소에 기탁되어 있으며 기탁번호 KCTC 8967P를 수여받았다. 상기 균주에 대한 자세한 배양조건 및 배지에 관한 사항은 본 발명자의 대한민국 등록특허공보 제0316975호에 기재되어 있다.In the present invention, the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 (KCTC 8967P) is used as the stress promoter. The dnaK promoter of the Pseudomonas strain DJ-12 is preferably a polynucleotide amplified by PCR with the primer pairs shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, and more preferably a polynucleotide having a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3. Pseudomonas strain DJ-12 of the present invention has been deposited with the Daejeon Biotechnology Research Institute and was given the accession number KCTC 8967P. Details of the culture conditions and the medium for the strain is described in the Republic of Korea Patent No. 0316975 of the inventors.
본 발명의 일예에서, dnaK 프로모터(dnaKp)를 얻기 위한 PCR 프로모터는 dnaK 오페론의 프로모터 영역(Cowing,D.W., et al., Proc. Natl.Acad. Sci.USAvol.82((9), pp.2679-2683)에 기초하여 고안한 도 1, 서열번호 1 및 2, 아래에 표시한다.In one embodiment of the present invention, the PCR promoter for obtaining the dnaK promoter (dnaKp) is a promoter region of the dnaK operon (Cowing, DW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 82 ((9), pp.2679). 1, SEQ ID NOs: 1 and 2, designed below, are shown below.
정방향 프로모터 5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3'Forward promoter 5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3 '
역방향 프로모터5'-AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3'Reverse promoter 5'-AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3 '
상기 프로모터 쌍을 이용하여 바이페닐 및 4-클로로바이페닐을 탄소원 및 에너지원으로 이용 가능한 슈도모나스속 균주 DJ-12의 게놈 DNA를 PCR 증폭반응으로 증폭하여 제조한다.The promoter pairs are used to amplify the genomic DNA of Pseudomonas strain DJ-12 which can use biphenyl and 4-chlorobiphenyl as carbon and energy sources by amplification by PCR amplification.
본 발명의 프로모터는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터로서, 바이페닐, 4-클로로바이페닐(4-CB), 4-히드록시벤조에이트(4HBA), 벤조에이트 및 카테콜과 같은 여러 가지 방향족 화합물에 의해 슈도모나스 속 균주 DJ-12의 dnaK 유전자의 발현이 유도되는 것으로 보고되었다(King, E., et al., Appl.Environ.Microbiol. vol.62(1), pp.262-265, 1996; Park, S.H., et al., Curr.Microbiol. vol.43, pp.176-181, 2001; Park, S.H., et al., J.Microbiol. vol. 36, pp.93-98, 1998a). 다양한 방향족 오염물질은 슈도모나스속 균주 DJ-12 및 E.coli(Blom,A. et al., Appl.Environ.Microbiol.vol58, pp.331-334)의 DnaK와 같은 스트레스 쇼크 단백질의 생산을 위한 좋은 유도인자(inducer)로 작용한다고 보고하고 있다.The promoter of the present invention is the dnaK promoter of the Pseudomonas strain DJ-12, which has various aromatics such as biphenyl, 4-chlorobiphenyl (4-CB), 4-hydroxybenzoate (4HBA), benzoate and catechol. The compound has been reported to induce the expression of the dnaK gene of Pseudomonas sp. DJ-12 (King, E., et al., Appl. Environ. Microbiol. Vol. 62 (1), pp. 262-265, 1996 Park, SH, et al., Curr. Microbiol. Vol. 43, pp. 176-181, 2001; Park, SH, et al., J. Microbiol. Vol. 36, pp. 93-98, 1998a). Various aromatic contaminants are good for the production of stress shock proteins such as Pseudomonas strain DJ-12 and DnaK of E. coli (Blom, A. et al., Appl.Environ.Microbiol.vol58, pp.331-334). It is reported to act as an inducer.
종래에 바이오센서용 스트레스 프로모터로는 E.coli의 dnaK 유전자가 사용되었으며, 본 발명의 슈도모나스속 균주 DJ-12와 E.coli(GeneBank accession No.M10420)의 dnaK 프로모터의 핵산서열을 도 4와, 서열번호 3 및 4에 나타냈으며,도 4에서 별표(*)는 상기 두 균주간 서열차이를 나타낸다.Conventionally, the dnaK gene of E. coli was used as a stress promoter for a biosensor, and the nucleic acid sequence of the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 and E. coli (GeneBank accession No.M10420) of the present invention is shown in FIG. It is shown in SEQ ID NO: 3 and 4, the asterisk (*) in Figure 4 shows the sequence difference between the two strains.
Cha 등의 E.coli dnaK 프로모터를 이용한 dnaK::gfpuv 구조체에 비해 본 발명에 따른 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체에 의한 발광이 훨씬 강하였고, Van Dyk 등의 E.coli dnaK 프로모터를 이용한 dnaKp-EC::luxCDABE 구조체에 비해 슈도모나스 속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터로 제조한 dnaKp-DJ::luxCDABE에 의한 발광이 훨씬 강했다. 이러한 발광반응의 차이는 프로모터 염기서열의 차이에 의한 것으로 여겨진다. 슈도모나스 속 균주 DJ-12와 E.coli의 dnaK 프로모터의 염기서열(GeneBank accession No.: M10420)은 6개 염기쌍이 다르며, 이는 도 4에 나타낸다. 이러한 염기서열의 차이로 인해 dnaKp-DJ::luxCDABE와 dnaKp-EC::luxCDABE 유전자 구조체간에 에탄올에 대한 발광반응의 차이가 유래된다고 할 수 있을 것이다.Compared to the dnaK :: gfpuv structure using the E. coli dnaK promoter of Cha et al., The light emission by the dnaKp-DJ :: lux CDABE structure according to the present invention was much stronger, and the dnaKp- using the E.coli dnaK promoter of Van Dyk et al. The luminescence by dnaKp-DJ :: lux CDABE produced by the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 was much stronger than the EC :: lux CDABE construct. This difference in luminescence is believed to be due to differences in promoter sequences. The sequence of Pseudomonas genus DJ-12 and E. coli dnaK promoter (GeneBank accession No .: M10420) is 6 base pairs different, which is shown in FIG. The difference in nucleotide sequences may result in a difference in the luminescence response to ethanol between the dnaKp-DJ :: lux CDABE and dnaKp-EC :: lux CDABE gene constructs.
Van Dyk등은 dnaK 및 grpE 스트레스-쇼크 유전자의 프로모터와luxCDABE 리포터 유전자의 구조체는 각 화학적 독성물질, 예컨대 페놀, 2-니트로페놀, 구리, 설페이트, 및 에탄올을 탐지하는데 사용할 수 있다고 보고하고 있다. 그러나, 본 발명에 따른 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체는 E.coli 균주의 이화작용성 유전자(예, bphA 유전자) 또는 스트레스-쇼크 유전자를 이용한 구조체에 비해 방향족 화합물에 대해 훨씬 강하게 반응하는 것으로 나타났다.Van Dyk et al. Reported that the promoters of the dnaK and grpE stress-shock genes and the constructs of the lux CDABE reporter gene can be used to detect individual chemical toxins such as phenol, 2-nitrophenol, copper, sulfate, and ethanol. However, the dnaKp-DJ :: lux CDABE construct according to the present invention has been shown to respond much more strongly to aromatic compounds than constructs using catabolic genes (eg bphA gene) or stress-shock genes of E. coli strains. .
본 발명에서 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터와 작동가능하도록 연결된 루시퍼라제를 코딩하는 유전자는 루시퍼라제로 알려진 모든 발광유전자를 코딩하는 유전자를 포함한다. 예컨대, 발광미생물의 루시퍼라제를 코딩하는 lux CDABE 또는 이의 루시퍼라제 일부(luxAB, 이런 경우에는 알데히드 기질을 외부에서첨가하여 활성을 측정)를 포함할 수 있고, 진핵생물의 루시퍼라제를 코딩하는 luc 유전자일 수 있다. 상기 Lux 유전자는 모든 발광 미생물의 lux 오페론에서 얻을 수 있으며, 이중 대부분은 비브리오(Vibrio), 제노르하브두스(Xenorhabdus), 포토르하브두스(Photorhabdus), 및 포토박테리움(Photobacterium) 등을 포함한다.In the present invention, the gene encoding the luciferase operably linked with the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 includes genes encoding all luminescent genes known as luciferase. For example, it may include lux CDABE encoding luciferase of luminescent microorganisms or a portion of luciferase thereof (luxAB, in this case externally adding an aldehyde substrate to measure activity), and the luc gene encoding eukaryotes luciferase. Can be. The Lux gene can be obtained from the lux operon of all luminescent microorganisms, most of which include Vibrio, Xenorhabdus, Photorhabdus, Photobacterium, and the like. .
본 발명에 따른 바이오센서용 유전자 구조체를 이용하여 탐지가능한 물질로는, 방향족 화합물, 예컨대, 바이페닐, 4-클로로바이페닐(4CB), 4-히드록시벤조에이트(4-HBA), 및 카테콜을 포함할 수 있다.As a substance detectable using the biosensor gene construct according to the present invention, aromatic compounds such as biphenyl, 4-chlorobiphenyl (4CB), 4-hydroxybenzoate (4-HBA), and catechol It may include.
본 발명은 또한 상기 유전자 구조체로 형질전환된 세포를 포함하며, 상기 세포가 방향족 화합물에 노출시 세포내 루시퍼라제에 의한 발광도를 측정하여 방향족 화합물을 탐지하기 위한 바이오센서에 관한 것이다. 상기 세포는 박테리아, 효모, 식물세포, 또는 동물세포일 수 있으며, 바람직하게는 박테리아이고, 더욱 바람직하게는 E.coli이다.The present invention also relates to a biosensor comprising a cell transformed with the gene construct and detecting the aromatic compound by measuring the luminescence by intracellular luciferase when the cell is exposed to the aromatic compound. The cells may be bacteria, yeast, plant cells, or animal cells, preferably bacteria, more preferably E. coli.
본 발명의 바람직한 일례에서, 상기 프로모터 쌍을 이용하여 슈도모나스속 균주 DJ-12의 게놈 DNA를 PCR 증폭반응으로 증폭하고, 얻어진 PCR 산물을 제한효소로 절단하여 프로모터없는 리포터 유전자를 포함하는 플라스미드, 예를 들면 pUCD615 플라스미드에 도입하여 플라스미드 dnaKp-DJ::luxCDABE(도 2a)를 제조한다. 상기 플라스미드를 미생물에 형질전환시켜 미생물 바이오센서를 제조한다. 또는, 상기 dnaK 프로모터를 리포터 유전자에 연결하여 유전자 구조체를 제조하고, 이를 플라스미드에 도입하고, 미생물에 형질전환시킬 수도 있다. 상기 형질전환용 미생물은 E.coli가 바람직하다. 따라서, 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 플라스미드 제조 및 이를 미생물에 형질전환하는 통상의 방법을 모두 본 발명의 미생물 바이오센서를 제조하기 위해서 적용할 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, a plasmid comprising a reporter gene without a promoter by amplifying the genomic DNA of Pseudomonas strain DJ-12 by PCR amplification using the promoter pair, and digesting the obtained PCR product with a restriction enzyme, For example, the plasmid dnaKp-DJ :: lux CDABE (FIG. 2A) was prepared by introducing into a pUCD615 plasmid. The plasmid is transformed into a microorganism to prepare a microbial biosensor. Alternatively, the dnaK promoter may be linked to a reporter gene to prepare a gene construct, introduced into a plasmid, and transformed into a microorganism. The transforming microorganism is preferably E. coli. Therefore, both the plasmid preparation known to those of ordinary skill in the art and the conventional method of transforming the same into microorganisms can be applied to prepare the microbial biosensor of the present invention.
또한, 본 발명은 상기 바이오센서를 루시퍼라제의 발현을 유도하는 방향족 화합물에 노출시키고, 루시퍼라제에 의한 발광도를 측정하는 것을 포함하는 방향족 화합물을 탐지하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 바이오센서를 이용하여 방향족 화합물을 탐지하는 구체적인 방법은 본 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예컨대, dnaKp-DJ::luxCDABE 플라스미드로 형질전환된 미생물을 사용하는 경우에는, 바이오센서 세포와 접촉시키는 장치 및 세포의 광출력을 측정하는 장치를 사용하여 오염물질을 측정할 수 있다. 모든 알려진 광측정 장치를 모두 본 발명의 탐지방법에 사용할 수 있으며, 예를 들면 광전자증배기(photomultipliers), 전하결합장치(charge coupled devices), 발광측정기(luminometers), 광측정기(photometers), 광섬유케이블 또는 액체섬광 카운터(liquid scintillation counter) 등이 있다.The present invention also provides a method of detecting an aromatic compound comprising exposing the biosensor to an aromatic compound that induces the expression of luciferase and measuring the luminescence by luciferase. Specific methods for detecting aromatic compounds using the biosensor according to the present invention may be performed by those skilled in the art as appropriately selected. For example, when using microorganisms transformed with dnaKp-DJ :: lux CDABE plasmid, contaminants can be measured using a device for contacting the biosensor cells and a device for measuring the light output of the cells. All known optical measuring devices can be used in the detection method of the present invention, for example photomultipliers, charge coupled devices, luminometers, photometers, optical fiber cables Or a liquid scintillation counter.
분석대상인 방향족 화합물은 표면에 흡착되거나, 액체 매질중에 용해되거나, 기상으로 존재하는 경우에 바이오센서를 사용하여 측정할 수 있다. 입자에 부착되거나, 수성 시료에 용해되거나, 기상에 분산되어 있는 오염 물질을 검출하기 위하여 바이오센서를 사용할 수 있다. 그러나, 일반적으로는 액상에서 측정하는 것이 바람직하다. 상기 유전자 구조체를 포함하는 바이오센서가 확실히 기능을 할 수 있도록 충분한 수분을 이용할 수 있으면 되고, 시료를 분석 전에 적당한 완충 조성물로 희석하여, 이 용액 내에서 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 분석대상은 선택적 투과성 막이나 용매 등을 이용하여 분석 전에 시료로부터 분리할 수 있다. 예를 들면, 가스 시료를 액체를 통과시키거나, 적당한 고체 흡착제를 통과시켜 분석물을 분석전에 농축할 수도 있다.The aromatic compounds to be analyzed can be measured using biosensors when adsorbed on the surface, dissolved in a liquid medium, or present in the gas phase. Biosensors can be used to detect contaminants attached to particles, dissolved in aqueous samples, or dispersed in the gas phase. In general, however, it is preferable to measure in the liquid phase. It is preferable that sufficient moisture be used so that the biosensor including the gene construct can function reliably, and the sample is diluted with an appropriate buffer composition before the analysis and cultured in this solution. In addition, the analyte may be separated from the sample before analysis using a selective permeable membrane or a solvent. For example, the gas sample may be passed through a liquid or an appropriate solid adsorbent may be used to concentrate the analyte prior to analysis.
본 발명에 따른 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터와 luxCDEAB를 포함하는 미생물 바이오센서와 종래의 대장균 dnaK 프로모터와 lux유전자가 융합된 유전자(예, dnaKp-EC::luxCDABE)를 포함하는 미생물 바이오센서를 비교하면, dnaKp-DJ::luxCDABE 생물발광 구조체는 dnaKp-EC::luxCDABE에 비해 에탄올 대해 약 5배 이상 강한 반응을 나타냈다. 본 발명에 따른 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체를 포함하는 바이오센서는, 바이페닐, 4-클로로바이페닐(4CB), 4-히드록시벤조에이트(4-HBA) 및 카테콜과 같은 방향족 화합물에 노출시 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체에 의한 생물발광은 1mM 바이페닐 및 4CB에 대해 80분간 노출시 가장 민감하였고, 상기 발광반응은 또한 다른 방향족 화합물에 대해서도 매우 강하고, E.coli dnaK 프로모터을 포함하는 바이오센서에 비해 훨씬 강한 발광도를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 dnaKp-DJ를 포함하는 바이오센서는 방향족 오염물질 및 다른 오염물질을 탐지하는데 가장 유용한 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명에서는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 유전자를 사용하여 dnaK 프로모터와luxCDABE 또는 luc유전자를 융합하여 수중의 방향족 오염물질을 탐지하기 위한 미생물 바이오센서를 개발하는데 사용할 수 있다.Microbial biosensor comprising the dnaK promoter and luxCDEAB of the Pseudomonas genus strain DJ-12 according to the present invention, and a microorganism bios comprising a gene (eg, dnaKp-EC :: lux CDABE) in which a conventional E. coli dnaK promoter and a lux gene are fused. Comparing the sensors, the dnaKp-DJ :: lux CDABE bioluminescent construct showed a response that is about five times stronger than ethanol compared to dnaKp-EC :: lux CDABE. Biosensors comprising the dnaKp-DJ :: lux CDABE structure according to the present invention are directed to aromatic compounds such as biphenyl, 4-chlorobiphenyl (4CB), 4-hydroxybenzoate (4-HBA) and catechol. Upon exposure, bioluminescence by the dnaKp-DJ :: lux CDABE construct was most sensitive at 80 min exposure to 1 mM biphenyl and 4CB, and the luminescence was also very strong for other aromatic compounds, including the E. coli dnaK promoter. It exhibits much stronger luminescence than biosensors. Thus, biosensors comprising dnaKp-DJ according to the present invention are believed to be most useful for detecting aromatic and other contaminants. Therefore, the present invention can be used to develop a microbial biosensor for detecting aromatic contaminants in water by fusing the dnaK promoter with lux CDABE or luc gene using the dnaK gene of Pseudomonas strain DJ-12.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 단지 본 발명을 예시할 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는아니다.The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the following examples merely illustrate the present invention, and the protection scope of the present invention is not intended to be limited to the following examples.
실시예Example
실시예 1: dnaKp-DJ::Example 1: dnaKp-DJ :: luxlux CDABE를 포함하는 바이오센서 제조Biosensor Manufacturing Including CDABE
본 실시예에서 사용한 제한효소, DNA 변형 효소, T4 DNA 리가제는 포스코사(대한민국, 서울)에서 구입하였다.The restriction enzyme, DNA modification enzyme, and T4 DNA ligase used in this example were purchased from POSCO Corporation (Seoul, Korea).
dnaK 프로모터(dnaKp)를 얻기 위한 PCR 프로모터는 dnaK 오페론의 프로모터 영역(Cowing,D.W., et al., Proc. Natl.Acad. Sci.USA vol.82((9), pp.2679-2683)에 기초하여 고안하였으며, 도 1 및 아래에 표시하였다.The PCR promoter for obtaining the dnaK promoter (dnaKp) is based on the promoter region of the dnaK operon (Cowing, DW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 82 ((9), pp.2679-2683). It was designed, and is shown in Figure 1 and below.
정방향 프로모터 5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3'Forward promoter 5'-GTTAGCGGATCCAAAAGCACAAAAAAT-3 '
역방향 프로모터5'-AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3'Reverse promoter 5'-AGCAGTGAATTCCATCTAAACGTCTCCA-3 '
바이페닐 및 4-클로로바이페닐을 탄소원 및 에너지원으로 이용가능한 슈도모나스속 균주 DJ-12(KCTC 8967P)를 사용하였다. 상기 프로모터 쌍을 이용하여 슈도모나스속 균주 DJ-12의 게놈 DNA를 PCR 증폭반응으로 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 Bam H1 및 EcoR1으로 절단하여 얻는 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 유전자를 Bam H1 및 EcoR1으로 절단된 pUCD615에 연결하였다(18). 상기 pUCD615 플라스미드는 프로모터없는 V.fischeri의luxCDABE 오페론을 포함하고 있어 발광 유전자 구조체인 dnaKp-DJ::luxCDABE(도 2a)를 제조하였다.Pseudomonas strain DJ-12 (KCTC 8967P) was used in which biphenyl and 4-chlorobiphenyl were available as carbon and energy sources. Genomic DNA of Pseudomonas strain DJ-12 was amplified by PCR amplification using the promoter pair. The dnaK gene of Pseudomonas strain DJ-12 obtained by cleaving the obtained PCR product with Bam H1 and EcoR1 was linked to pUCD615 cleaved with Bam H1 and EcoR1 (18). The pUCD615 plasmid contained lux CDABE operon of V.fischeri without promoter to prepare dnaKp-DJ :: lux CDABE (FIG. 2A), a luminescent gene construct.
상기 유전자 구조체의 발광을 측정하기 위해서, 유전자 구조체를 E.coli XL1-Blue에 형질전환시켰다.In order to measure the luminescence of the gene construct, the gene construct was transformed into E. coli XL1-Blue.
실시예 2: dnaKp-DJ::luc 구조체를 포함하는 균주제조Example 2: Strain Preparation Including dnaKp-DJ :: luc Structure
상기 실시예 1에서 고안한 프라이머쌍을 이용하여 슈도모나스속 균주 DJ-12의 게놈 DNA를 PCR 증폭반응으로 증폭하였다. SambrooK등의 (19)기재방법에 따라, 상기 PCR산물을 pBluescript SK(+/-) 벡터(스트라타진, 라졸라, 캘리포니아, 미국)에 도입하였다. SacI 및 XhoI으로 절단한 dnaK 프로모터 영역을luc유전자를 운반하는 pGL3-기본 벡터(Promega Co., 메디슨, 미국)에 삽입하여 dnaKp-DJ::luc유전자 구조체를 제조하였다(도 2c).The genomic DNA of Pseudomonas strain DJ-12 was amplified by PCR amplification using the primer pair designed in Example 1. According to the (19) method described in SambrooK et al., The PCR product was introduced into the pBluescript SK (+ /-) vector (stratazine, Lazola, California, USA). The dnaK promoter region cleaved with SacI and XhoI was inserted into a pGL3-based vector carrying a luc gene (Promega Co., Madison, USA) to prepare a dnaKp-DJ :: luc gene construct (FIG. 2C).
상기 유전자 구조체의 발광을 측정하기 위해서, 유전자 구조체를 E.coli XL1-Blue에 형질전환시켰다.In order to measure the luminescence of the gene construct, the gene construct was transformed into E. coli XL1-Blue.
비교예 1: dnaKp-EC::Comparative Example 1: dnaKp-EC :: luxlux CDABE를 포함하는 바이오센서 제조Biosensor Manufacturing Including CDABE
상기 실시예 1에서 고안한 프라이머쌍을 이용하여 E.coli W3101(8)의 게놈 DNA를 PCR 증폭반응으로 증폭하였다. 얻어진 PCR 산물을 Bam H1 및 EcoR1으로 절단하여 얻는 E.coli W3101의 dnaK 유전자를 Bam H1 및 EcoR1으로 절단된 pUCD615에 연결하였다(18). 상기 pUCD615 플라스미드는 프로모터없는 V.fischeri의luxCDABE 오페론을 포함하고 있어 발광 유전자 구조체인 dnaKp-EC::luxCDABE(도 2b)를 제조하였다.The genomic DNA of E. coli W3101 (8) was amplified by PCR amplification using the primer pair designed in Example 1. The dnaK gene of E. coli W3101 obtained by cleaving the obtained PCR product with Bam H1 and EcoR1 was linked to pUCD615 cleaved with Bam H1 and EcoR1 (18). The pUCD615 plasmid contained lux CDABE operon of V.fischeri without promoter to prepare a luminescent gene construct dnaKp-EC :: lux CDABE (FIG. 2B).
상기 유전자 구조체의 발광을 측정하기 위해서, 유전자 구조체를 E.coli XL1-Blue에 형질전환시켰다.In order to measure the luminescence of the gene construct, the gene construct was transformed into E. coli XL1-Blue.
실시예 3 및 비교예 2: 에탄올에 노출시 발광도 측정Example 3 and Comparative Example 2: Measurement of Luminescence upon Exposure to Ethanol
슈도모나스속 균주 DJ-12로부터 제조된 dnaKp-DJ::luxCDABE를 갖는 미생물 바이오센서가 여러 가지 농도의 에탄올에 노출시 발광도를 측정하였다. 실험결과를도 3a에 나타냈다.Microbial biosensors with dnaKp-DJ :: lux CDABE prepared from Pseudomonas strain DJ-12 were measured for luminescence upon exposure to various concentrations of ethanol. The experimental results are shown in Figure 3a.
상기 실시예와 동일한 방법으로 실시예 1 및 2에서 제조한 바이오센서와, 비교예 1의 dnaKp-EC::luxCDABE을 포함하는 바이오센서의 dnaKp-DJ::luc의 에탄올 농출시 발광도를 측정하고, 그 결과를 도 3b 및 3c에 나타냈다.The luminescence of the biosensors prepared in Examples 1 and 2 and dnaKp-EC :: lux CDABE of Comparative Example 1 and dnaKp-DJ :: luc in ethanol concentration was measured in the same manner as in Example. The results are shown in FIGS. 3B and 3C.
상기 실험결과를 도 3a 내지 3c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 dnaKp-DJ::luxCDABE를 포함하는 바이오센서에 의해 생성된 빛이 비교예 1의 dnaKp-EC::luxCDABE에 의해 생성된 빛보다 훨씬 강하였다. 즉, 3% 에탄올에 100분간 노출시, 본 발명의 dnaKp-DJ::luxCDABE에 의한 발광도는 비교예 1의 dnaKp-EC::luxCDABE 구조체보다 약 5배나 더 밝았다. 에탄올에 대한 실시예 2의 dnaKp-DJ::luc구조체의 발광도는 상기 두 구조체보다 훨씬 약했다. 에탄올에 대한 상기 바이오센서의 발광 반응 정도는 dnaKp-DJ::luxDCABE > dnaKp-EC::luxCDABE > dnaKp-DJ::luc순으로 작아졌다.3A to 3C, the light generated by the biosensor including the dnaKp-DJ :: lux CDABE of the present invention is generated by the dnaKp-EC :: lux CDABE of Comparative Example 1. Much stronger than That is, when exposed to 3% ethanol for 100 minutes, the luminescence by dnaKp-DJ :: lux CDABE of the present invention was about 5 times brighter than the dnaKp-EC :: lux CDABE structure of Comparative Example 1. The luminescence of the dnaKp-DJ :: luc structure of Example 2 for ethanol was much weaker than the two structures. The luminescence response of the biosensor to ethanol decreased in the order of dnaKp-DJ :: lux DCABE> dnaKp-EC :: lux CDABE> dnaKp-DJ :: luc .
Cha 등의 (4)은 E.coli dnaK 프로모터를 이용한 dnaK::gfpuv 구조체에 의한 발광이 에탄올에 대한 측정과 비교하여, dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체에 의한 발광이 훨씬 강하였다. 슈도모나스 속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터로 제조한 dnaKp-DJ::luxCDABE에 의한 발광은 E.coli dnaK 프로모터로 제조된 dnaKp-EC::luxCDABE보다 훨씬 강했다. 이러한 발광반응의 차이는 프로모터 염기서열의 차이에 의한 것으로 여겨진다. 슈도모나스 속 균주 DJ-12와 E.coli의 dnaK 프로모터의 염기서열(GeneBank accession No.: M10420)은 6개 염기쌍이 다르며, 이는 도 4에 나타냈다. 이러한 염기서열의 차이로 인해 dnaKp-DJ::luxCDABE와 dnaKp-EC::luxCDABE구조체간의 에탄올에 대한 반발광반응의 차이가 유래된다고 할 수 있을 것이다.Cha et al. (4) showed that luminescence by the dnaK :: gfpuv construct using the E. coli dnaK promoter was much stronger than luminescence by the dnaKp-DJ :: lux CDABE construct compared to the ethanol measurement. Luminescence by dnaKp-DJ :: lux CDABE made with the dnaK promoter of Pseudomonas strain DJ-12 was much stronger than dnaKp-EC :: lux CDABE made with the E. coli dnaK promoter. This difference in luminescence is believed to be due to differences in promoter sequences. The sequence of Pseudomonas genus DJ-12 and E. coli dnaK promoter (GeneBank accession No .: M10420) is 6 base pairs different, which is shown in FIG. This difference in the nucleotide sequence may lead to the difference in the semi-luminescent response to ethanol between the dnaKp-DJ :: lux CDABE and dnaKp-EC :: lux CDABE structures.
실시예 4: 방향족 화합물에 대한 발광도 측정Example 4 Measurement of Luminescence for Aromatic Compounds
Tauiainen등(21)의 방법에 따라, 상기 실시예 1 및 2, 비교예 2에서 얻어진 세 가지 바이오센서의 발광정도를 측정하였다. 본 발명에서 사용한 모든 방향족 화합물은 시그마사(세인트루이스, 미국)에서 구입하였다. 멸균 증류수를 이용하여 4-히드로벤조에이트(4HBA) 또는 카테콜의 스톡용액(100 mM)을 제조하였고, 에탄올을 이용하여 바이페닐 또는 4-클로로바이페닐의 스톡용액(100 mM)을 제조하였다.According to the method of Tauiainen et al. (21), the degree of emission of the three biosensors obtained in Examples 1 and 2, Comparative Example 2 was measured. All aromatics used in the present invention were purchased from Sigma (St. Louis, USA). A stock solution of 4-hydrobenzoate (4HBA) or catechol (100 mM) was prepared using sterile distilled water, and a stock solution of biphenyl or 4-chlorobiphenyl (100 mM) was prepared using ethanol.
발광을 측정하기 위한 유전자 구조체를 포함하는 바이오센서를 LB배지(1% 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % NaCl)에서 25 ℃에서 로그 상까지 배양하였다. 배지의 초기 pH를 멸균전에 pH 7.0으로 조절하였다.Biosensors containing gene constructs for measuring luminescence were incubated in LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) at 25 ° C. up to the log phase. The initial pH of the medium was adjusted to pH 7.0 before sterilization.
180 ul의 미생물 바이오센서 배양물(106 CFU/ml 세포)를 96-웰 플레이트로 옮기고, Van Dyk등(23)의 방법에 따라 상기 웰에 0.1 내지 5 mM의 스톡 용액을 직접 첨가하였다. 그런 후 25 ℃에서 배양함으로써 Berthold 발광계(Autolumat LB935, EG&G Berthold Analytical Instruments, Oak Rige, TN, USA)를 이용하여 발광을 측정하였다. 각 농도의 방향족 화합물에 대해서 동일한 실험을 3회 실시하고, 미처리 바이오센서의 발광도에서 방향족 화합물에 노출된 바이오센서에 의한 발광도를 뺀 수치를 상대적인 발광 단위로 결정하였다. 에탄올중 바이페닐과 4CB의 경우에는, 에탄올에 의해 유도된 바이오센서의 발광도에서 각 방향족 화합물을 처리한 바이오센서에서 얻은 발광도를 뺀 값을 사용하였다. 몇가지 방향족화합물에 대한 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체를 갖는 바이오센서의 발광반응을 조사하였으며, 그 결과를 도 5a 내지 5d에 나타냈다.180 ul of microbial biosensor cultures (106 CFU / ml cells) were transferred to 96-well plates and 0.1-5 mM stock solution was added directly to the wells according to the method of Van Dyk et al. (23). Thereafter, the luminescence was measured using a Berthold luminometer (Autolumat LB935, EG & G Berthold Analytical Instruments, Oak Rige, TN, USA) by incubation at 25 ℃. The same experiment was carried out three times for the aromatic compounds of each concentration, and the value obtained by subtracting the luminescence by the biosensor exposed to the aromatic compound from the luminescence of the untreated biosensor was determined as the relative luminescence unit. In the case of biphenyl and 4CB in ethanol, the luminescence of the biosensor induced by ethanol was used by subtracting the luminescence obtained from the biosensor treated with each aromatic compound. The luminescence reaction of biosensors with dnaKp-DJ :: lux CDABE structures for several aromatic compounds was investigated, and the results are shown in FIGS. 5A to 5D.
본 발명에 따른 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체를 바이페닐, 4CB, 및 4HBA 1 mM 농도에 노출하였을 때, 발광이 시작되었다. 1mM 4CB 또는 0.2 mM 카테콜에 90분간 노출하였을 때 발광반응이 가장 높았다. 바이페닐, 4CB, 및 4HBA에 대한 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체의 발광반응은 각 방향족 화합물 1 mM농도에서 가장 강했으나, 더 높은 농도에서는 발광반응이 없었다.Luminescence started when the dnaKp-DJ :: lux CDABE construct according to the invention was exposed to biphenyl, 4CB, and 4HBA 1 mM concentrations. The luminescence was highest when exposed to 1 mM 4CB or 0.2 mM catechol for 90 minutes. The luminescence of the dnaKp-DJ :: lux CDABE constructs against biphenyl, 4CB, and 4HBA was the strongest at 1 mM concentration of each aromatic compound, but no luminescence at higher concentrations.
Lay 등(12)의 Ralstonia eutropha ENV307의 bph A 유전자 프로모터로 제조한 bphAp::luxCDABE 구조체에 의한 결과, 및 Van Dyk등(23,24)의 dnaK 및 grpE 스트레스-쇼크 유전자의 프로모터와luxCDABE 리포터 유전자의 구조체가 보고되고 있으나, 본 발명에 따른 dnaKp-DJ::luxCDABE 구조체는 E.coli 균주의 이화작용성 유전자(예, bphA 유전자) 또는 스트레스-쇼크 유전자(dnaK 및 grpE)를 이용한 구조체에 비해 방향족 화합물에 대해 훨씬 강하게 반응하는 것으로 나타났다.BphAp :: lux CDABE construct produced by the bph A gene promoter of Ralstonia eutropha ENV307 of Lay et al. (12), and the promoters of the dnaK and grpE stress-shock genes of Van Dyk et al. (23,24) and the lux CDABE reporter Although the structure of the gene has been reported, the dnaKp-DJ :: lux CDABE construct according to the present invention is used in a structure using a catabolic gene (eg, bphA gene) or a stress-shock gene (dnaK and grpE) of an E. coli strain. It has been shown to react much more strongly to aromatic compounds.
실시예 5: 방향족 화합물에 대한 발광도 측정Example 5 Measurement of Luminescence for Aromatic Compounds
실시예 2의 dnaKp-DJ::luc를 포함하는 바이오센서의 방향족 오염물질에 대한 발광반응을 조사하였으며, 그 결과를 도 6a 내지 6c에 나타냈다. 일반적으로, 0.8 mM 내지 3 mM의 바이페닐, 4CB, 4HBA는 80분내지 120분간 배양한 경우에 dnaKp-DJ::luc바이오센서 의한 발광을 유도하였다. 그러나, dnaKp-DJ::luc바이오센서는 dnaKp-DJ::luxCDABE 바이오센서와 동일한 프로모터를 사용하였음에도 불구하고, dnaKp-DJ::luxCDABE 바이오센서에 비해 dnaKp-DJ::luc을 포함하는 바이오센서의 발광정도는 낮았다.The luminescence reaction of the aromatic sensor of dnaKp-DJ :: luc in Example 2 was investigated, and the results are shown in FIGS. 6A to 6C. In general, 0.8 mM to 3 mM biphenyl, 4CB, and 4HBA induced luminescence by dnaKp-DJ :: luc biosensor when incubated for 80 to 120 minutes. However, dnaKp-DJ :: luc biosensor dnaKp-DJ :: lux CDABE despite using the same promoter as biosensors and bio that includes dnaKp-DJ :: luc compared to dnaKp-DJ :: lux CDABE biosensor The emission level of the sensor was low.
본 발명은 슈도모나스속 균주 DJ-12의 dnaK 프로모터와 리포터 유전자인luxCDABE의 유전자 구조체를 포함하는 미생물 바이오센서 및 이의 이용방법을 제공함으로써, 종래의 미생물 바이오센서에 비해 발광강도 및 민감도가 훨씬 높아 환경오염물질의 검색에 매우 유용하한 바이오센서를 제공하고, 오염물질을 더욱 민감하고 정확하게 검색할 수 있는 장점이 있다.The present invention provides a microbial biosensor comprising a gene structure of the dnaK promoter of the Pseudomonas strain DJ-12 and a reporter gene, lux CDABE, and a method of using the same, thereby providing much higher luminescence intensity and sensitivity compared to conventional microbial biosensors. It provides a biosensor that is very useful for the detection of contaminants, and has the advantage of detecting contaminants more sensitively and accurately.
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KR1020020026423A KR20030088315A (en) | 2002-05-14 | 2002-05-14 | Bacterial biosensor bearing gene fusion constructed with dnaK promoter of Psudomonas sp. DJ-12, and detection method of aromatic pollutants with the same |
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KR1020020026423A KR20030088315A (en) | 2002-05-14 | 2002-05-14 | Bacterial biosensor bearing gene fusion constructed with dnaK promoter of Psudomonas sp. DJ-12, and detection method of aromatic pollutants with the same |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR101224218B1 (en) * | 2012-10-18 | 2013-01-23 | 강병욱 | Novel vector for use detecting aromatic hydrocarbon and the use thereof |
-
2002
- 2002-05-14 KR KR1020020026423A patent/KR20030088315A/en not_active Application Discontinuation
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